JPH01196294A - スーパーオキサイド・ジムスターゼから発熱性物質を除去する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はスーパーオキサイド・ジスムターゼ（ｓｕｐｅ
ｒｏｘｌｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、Ｅｃ　ｌ１５．１
．ｌ；超酸化物不均化酵素、以下、ＳＯＤと略記する。

）から発熱性物質を除去する方法に関するものであり、
更に詳しくは発熱性物質を含むＳＯＤ溶液をポリビニル
アルコールを分子内ホルマール化した限外濾過膜で濾過
する工程、次いで脱パイロジエン吸着体に接触させる工
程により、発熱性物質を含まないＳＯＤ水溶液を得るこ
とを特徴とする蛋白質回収率、迅速性、再現性、安全性
及び経済性に優れた発熱性物質の除去方法に関する。

この方法はＳＯＤを医薬用即ち注射用の生物学的製剤と
して精製するために有用な方法である。

［従来の技術及びその問題点］ 酸素は生体必須のものであるにもかかわらず、紫外線照
射や生化学的反応により活性酸素即ちスーパーオキサイ
、ドラジカル（０２τ）（活性ラジカル又は超酸化物イ
オン）及び、それから派生する過酸化水素（ｌｌ、０．
）、　　ヒドロキシラジカル（・０１ｌ）　。

−重項酸素（１０）、ハイポクロライド（００１−）等
が産生される。また、これら活性酸素が白血球などの殺
菌作用、酵素反応、脂質の酸化。

放射線障害、炎症、免疫２発癌、白内症、動脈硬化等に
深く関係していることが明らかになってきた。

この様な生体に生ずる活性酸素を処理する役目をになっ
ているものの一つがＳＯＤである。ＳＯＤはこれら活性
酸素のうち、スーパーオキサイドラジカルを基質として
、これを不均化（ｄ　１ｓｌｌｌｕｔａｔ　ｔｏｎ）す
る酵素（超酸化物イオン分解酵素又は超酸化物干 不均化酵素；２０ｂ＋２Ｈ−０２十Ｈ２Ｏ２）である［
ジエイ　エム　マコード（Ｊ、Ｍ、ＭｃＣｏｒｄ）。

アイ　フリドヴイッチ（１、Ｐｒ１ｄｏｖｉｃｈ）　、
ジャーナルオブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、
ＢＩｏｌ。

Ｃｔ１ｃｏ＋、）、　２４４．８０４９−６０５５．（
１９６９）］。

ＳＯＤは今日まで多（の生物種より単離され、そのアミ
ノ酸配列、さらには立体構造も明らかになってきている
。

現在すでにＳＯＤは安全性の高いリュウマチ剤［ダブリ
ュー　ヒユーバー（Ｗ、１ｌｕｂｅｒ）ら　パースペク
ティブス　イン　インフラメーション（Ｐｅｒ−ｓｐ’
ｃｅｔｉｖｃｓ　Ｉｎ　１ｎＮａＬＩ１ｍａｔｉｏｎ）
、　　レッドウッド　バーン　リミテッド（Ｒｅｄｗｏ
ｏｄ　Ｂｕｒｎ　Ｌｔｄ、）、１９７７゜５２７−５４
４１やベーチェット病への治療剤［Ｙ、Ｎ１ｖａａｔ　
ａｌ、、クリニカル　アンド　エクスペリメンタル　イ
ムノロジー（ＣＩＩｎ、ＥＸｐ、１ｍｓ＋ｕｎｏ１．）
、４９，２４７−２５５、　（１９８２）］としての報
告や放射線療法の副作用防止効果［エフ　エドスマイヤ
−（Ｐ、Ｅｄｓｍｙｒ）、パソロジー　オブ　オキシジ
エン（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｒＯｘｙｇｅｎ）、Ａｃ
ａｄ、Ｐｒｃｓｓ、３１５−３２１３（１９８２）コ等
の報告がされている。

活性ラジカルが関与している疾患は広範で多岐にわたっ
ており、上記以外にも炎症、汎発性血管内凝固症候群（
ＤＩＧ）　、発癌抑制、老化防止、さらには虚血性疾患
、臓器保存などへの適用にも期待されている。

ＳＯＤは上記リュウマチ剤（オルゴテイン；　ｏｒ　−
ｇｏｔｃｉｎ）が牛血法由来のＣｕ　、　Ｚｎ−８ＯＤ
であるほか、遺伝子組み替え法による大腸菌産生ヒト由
来のＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ又はＭｎ−８ＯＤ等が知られ
ている。

ところで、このような注射薬製品からの発熱性物質の除
去の問題は重要である。発熱性物質は低分子発熱物質（
パイレティクス；　Ｐｙｒｃｔｌｃｓ）とパイロジエン
（Ｐｙ　ｒｏｇａｎ　Ｈ高分子発熱物質）に大別され、
このうちパイロジエンはさらに外因性（Ｅｘｏ−ｇｅｎ
ｉｏｕｓ）のものと内因性（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の
ものがあり、この外因性の中に細菌性のエンドトキシン
（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ：内毒素）、外毒素（Ｅｘｏｔｏ
ｘｉｎ）などがある。特にこのエンドトキシンはＬｏｎ
ｇ／　ｋｇの微量でウサギに明確な発熱をもたらすほど
強い活性を有する。

一般にパイロジエンといえば、細菌性発熱物質を指し、
ダラム陰性菌の細胞壁外膜構成成分であるエンドトキシ
ンは医薬品に混在する確率が高く微量で発熱を引き起こ
すことから特に注目されている。

更に詳しくは、エンドトキシンがグラム陰性桿菌の夾膜
構成成分であるリポ多糖類（Ｌｉｐｏｐｏｌｙ　−５ａ
ｃｃｈａｒｌｄｃ；以後ＬＰＳと略す）を主成分とし、
発熱性物質の活性本体がこのｔ、ｐｓを構成する多糖（
ＰＳ）及び糖脂質部（Ｌｌｐｌｄ　Ａ）であることが確
認されている（Ｍ、ｌ＊ｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ
ｃ、Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、、８０、Ｓｃｒ　　Ｂ）　
　。

ＬＰＳは水溶液中では会合体ミセルをつくる性質がある
。その分子量はサブユニットとしては１〜２．５万だが
ミセル形成時は５０〜１００万、さらにベシクルになる
と数百万になって安定化しているとされている。

ＬＰＳを失活させるには２５０℃で３０分以上、２００
℃で６０分以上、１８０℃では１２０分以上の加熱が必
要とされている。ＬＰＳのこのような耐熱性や化学的安
定性のために、ＬＰＳが混入した製剤からの生理的条件
下での不活化や除去は極めて困難である。

ダラム陰性菌を使用して製造する遺伝子組替え菌体産生
薬さらには生物学的製剤などには、このＬＰＳを主成分
とするエンドトキシンの混入が問題となってくる。ＳＯ
Ｄは上記のごとく、生体抽出物または遺伝子組替え菌体
産生物であるため、エンドトキシン除去の問題は重要で
あり、また生物学的製剤であるため、その生体への投与
量、投与回数などの観点からもエンドトキシンを完全に
除去することが必須となってくる。

しかしながら、このような酵素やさらには抗体を含有す
る溶液や製剤、また血液製剤からエンドトキシンを充分
に除去できる、簡便で安全確実、再現性の良い方法はい
まだ確立されておらず、多くの問題を抱えているのが現
状である。

例えば、タンパク質溶液などからの発熱性物質除去につ
いて従来の方法を大別してみると、次のような方法が報
告されている。

（１）膜イ点過による除去（例えば、特開昭５９−１４
９９０１号公報等） （２）吸着体による発熱性物質の板管除去、目的物質の
溶出分離（例えば特開昭ｓｙ−１ｇｏ＋２号公報等）（
３）吸着体による目的物質の吸着９発熱性物質の溶出分
Ｉ４（例えば特開昭５０−８９２２０号公報、特開昭５
２−９９２８６号公報等） （４）その他、界面活性剤を用いる方法（例えば特開昭
８１−９３１１１号公報、米国特許４，４１２．９８５
等）しかしながら、（１）の方法では、前記のごとくＬ
ＰＳが溶液中で種々の分子集合状態（会合体等）をとる
ので、溶液組成によっては、低分子量のＬＰＳが膜を通
過してしまい、完全には目的物質と濾別することはでき
ない。低分子物質からの発熱性物質の除去例としては、
分画分子量約１万の限外濾過膜を用い、注射液などから
パイロジエンを除去する方法が知られている［（Ｇ、Ｋ
ｏｐｐｃｎｓｔｃｉｎｃｒｏｔ　ａｌ、、ＰｈａｒＩｌ
、ｌｎｄ、、３８，１９．８２７−９３１．１９７８）
　］　、しかし、大大腸由由のエンドトキシン含有溶液
を濾過する場合、その溶液組成（例えばイオン強度等）
によっては、はとんどが膜を透過してしまう。また、溶
液組成によっては、目的物質の膜への吸着等により回収
率が極めて悪くなる。さらに方法によっては、目的物質
が希釈されることが多く、後の工程で濃縮操作等が必要
になる等の欠点がある。

（２）の方法では、溶出条件によっては目的物質の吸着
体への非特異的吸着が起こり、その回収率が悪くなった
り、吸着体の吸着容量や選択性によっては十分には発熱
性物質の吸着除去ができなくなることが多い。

（３）の方法では、（２）の方法とは逆に発熱性物質の
吸６体への非特異的吸着が起こり、発熱性物質の除去が
十分にできなくなることが多い。また、目的物質の吸着
体からの分離は被吸着原液より高い電気伝導度ををする
溶液を用いる。即ち、溶離用の溶液の塩濃度を高めるな
どして行うため、目的物質を含む溶出液が高濃度の塩も
含むことになり、後の工程で脱塩（濃縮）等の必要があ
るなどの欠点かある。さらには、このような溶液組成の
異なるものが必要となったり、目的物質の溶出には塩の
濃度勾配をかける必要があったりして、その操作か煩雑
となることが多い。

り４）の方法では界面活性剤と目的物質とを混合撹拌処
理するため、目的物質変性や界面活性剤の回収不全によ
る残留等の安全性が問題となる。。

このように従来のタンパク質溶液などからの発熱性物質
の除去法には多くの困難が伴ない、これらの諸問題点を
改善するための技術の開発が強く要望されているのが現
状である。

本発明は以上の観点からなされたもので、その目的は簡
便、迅速で、再現性、安全性に優れ、経済的、効率的で
あると共にタンパク回収率が極めて高く、確実で実用的
なＳＯＤからの発熱性物質の除去方法を提供するもので
ある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は発熱性物質を含むＳＯＤ溶液をポリビニ（ｎ−
６５Ｑ〜９００） で表される構造の反復単位を基本とする重合体よりなる
限外濾過膜で濾過する工程、次いで脱パイロジエン吸着
体に接触させる工程からなることを特徴とするＳＯＤか
ら発熱性物質を除去する方法を提供するものであり、本
発明の方法によれば、タンパク回収率が極めて高く短時
間で効率よく安全確実にＳＯＤ溶液から発熱性物質を除
去することができる。

以下、本発明の詳細な説明する。

第１工程で用いる限外濾過膜は例えば以下の方法で製造
される。

すなわち、ポリビニルアルコールにホルムアルデヒドを
常法に従って作用させて、分子内ホルマール化された好
ましくは重合度６５０〜９００程度のポリビニルホルマ
ール樹脂を、得、これを水と相溶性のある極性溶媒好ま
しくはＮ−メチル−２−ピロリドン（あるいはこれにア
セトンを該ピロリドンに対し７：３〜８：２の割合で添
加）で溶解してドープを作り、これを例えばポリエステ
ル不織布上に均一に塗布し、５〜４５℃の水を入れた凝
固浴に導入して凝固させる湿式製膜法に従って製膜する
ことができる。このときの製膜溶液のポリマー濃度は１
．０〜３０重量％であることが好ましい。このようにし
て−殺伐 ％式％） で表される構造の反復単位を基本とする重合体よりなる
限外濾過膜を得る。該ポリビニルアルコールの分子内ホ
ルマール化度は好ましくは６ｏ〜８５モル％であり、該
限外濾過膜の分画分子量は１０万〜３０万であることが
好ましい。

限外濾過膜の分画分子量とは、その膜を用いて、限外濾
過を行った時、９５％以上が阻止される溶質分子の分子
量の下限を意味する。この場合、標準物質としてタンパ
ク質分子が用いられる。分画分子量は、その決定法によ
って変化する場合が多いので、ここでは標準物質として
ヒト血清γ−グロブリン（分子１１ｕ１．６　Ｘｌ０５
）とヒト血清アルブミン（分子ｍ８．７　Ｘ　１０’　
）を用い、膜性能を示す。

例えば、膜面ずり速度６×１ｏ３／秒前後で、膜透過速
度が１５１／ｒｒ？・時間であるとき、ヒト血清アルブ
ミン（濃度０．１％、生理食塩水溶液）に対する阻止率
が６０〜８０％で、ヒト血清γ−グロブリン（濃度　０
．１％、生理食塩水溶液）に対する阻止率が９６％以上
であるため通常、この限外濾過膜の分画分子量は約１０
Ｘ　１０’と考えられる。本発明で用いる限外濾過膜は
ヒト血清γ−グロブリン（濃度０．１％、生理食塩水溶
液）に対するド■止率が９５〜９８％で、かつヒト血清
アルビミン（濃度０．１％、生理食塩水溶液）に対する
阻止率が７５％・以上であることが好ましい。本発明で
用いる限外濾過膜は従来のポリスルホン系やポリエーテ
ルスルホン系の膜に比べ、純粋透過量が１．２〜２倍程
度大きく、また通常の方法による膜の吸着試験（ａ度０
．１重Ｗ　９６　）７−グロブ’Ｊ　ン、　２００　ｍ
ｌを試料溶液とし、装置ｒＵＦ−ＬａｂｏＪ　：東ソー
■製；商品名を用い、循環時間は５時間）の結果も従来
の膜の約半分の吸着しか示さないという特徴を有する。

従って、ＳＯＤを試料溶液とした場合でも、この限外濾
過膜を用いた濾過処理工程でのタンパク回収率は９８％
以上であり、従来の膜を用いた場合の回収率９０９６〜
９４％程度に比べて、極めて優れており、しかも同一の
濾過圧下での処理時間は従来の膜を用いた場合の約１／
２である。

すなわち本発明におけるポリビニルアルコールを分子内
ホルマール化した限外濾過膜を用いたＳＯＤ溶液からの
発熱性物質除去処理は、従来法に比べ、ＳＯＤタンパク
回収率に優れ、短時間（迅速）に行えることになる。ま
た、この膜による濾過は除菌、除粒子等、有害物質の除
去操作も兼ねる利点がある。

濾過条件は試料の処理量により決定すれば良いか、通常
試料溶液５０〜２００　ｒ！ｔ１に対して、濾過膜面積
は１１．５〜２７ｃシが最適であり、濾過圧は２．０〜
４．５ｋｇ重／Ｃシが最適である。

ＬＰＳの会合状態の変化や膜へのタンパクの付着ロスに
関して前記したごとく、この場合のＳＯＤ溶液の組成は
ＳＯＤの回収率や脱エンドトキシンの効率に微妙に影響
する。ここでは、次の第２工程の脱パイロジエン吸着体
への接触工程を考慮して脱パイロジエン吸着体への接触
時の最適溶液組成、即ち２０−１００ｍｍｏｊｌ　／　
ｉのカリウム又はナトリウム（Ｋ−又はＮａ−）リン酸
緩衝液（ｐＨ５，０〜７．５）が望ましい。さらに好ま
しくは約２０ｍｍｏｊ２　／　１２で　ｐＨ約５．５程
度である。注射剤の精製という観点からも、このリン酸
緩衝液が最もよい。又ＳＯＤは精製途中の部分精製品で
も良いが、本発明の方法ではＳＯＤ精製の最終二［程で
脱パイロジェンできるという大きな利点があり、従来の
精製工程では除去できなかった、又はコンタミしたパイ
ロジエンを除去することか可能となることから、従来の
精製の最終工程品にこの方法を適用するのが最善である
。数％　（Ｗ／Ｖ）のタンパク濃度で数千〜数万ｎｇ／
−程度のエンドトキシンを含有する精、製ＳＯＤ溶液（
例えば、比活性３０００単位／　ａ＋ｇ以上の牛又はヒ
ト由来Ｃｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤ）は本発明の第１工程の
膜処理で回収率が９８％以上でエンドトキシン濃度が１
〜ｌｏｎｇ／　ｍｉ程度に低減され、変性や失活も無い
（タンパク定量はローリ−（Ｌｏｗｒｙ　）法；活性測
定はＮＢＴ法またはチトクロームＣ法による。）。

第２工程の脱パイロジエン吸着体への接触工程は上記の
溶液組成のまま連続的に行える。この接触はバッチ法ま
たはカラム法またはその両者の組合わせでもできる。

バッチ法は試料溶液に脱パイロジエン吸着体を（約１ハ
０〜１　／１０００容量程度）懸濁混合し撹拌後、濾別
や遠心分離などにより、吸着体と試料溶液を分離する方
法である。また、カラム法は例えば試料を溶解させる溶
液で脱パイロジエン吸着体を懸濁し、適当なカラムに充
填し、同溶液で平衡化することにより脱パイロジエン吸
着体カラムを調製し、これに試料溶液を（空間速度：　
ｓｖ−ｉ〜３程度）流し、その溶出液として脱パイロジ
エン化された試料溶液を得る方法である。試料溶液中の
タンパク量と吸着体量（湿潤品換算）との比は吸着体の
リガンド含量やその種類によるが０，４〜０．５が最適
である。同じく、試料溶液中のエンドトキシン含量と吸
着体量（湿潤品換算）との比は２×ｌＯ〜２　Ｘ　１０
−７が最適である。

本発明で用いる吸着体は、含窒素複素環式化合物を水不
溶性担体に直接またはスペーサーを介して結合させたも
のを用いる。含窒素複索環式化合物は、−殺伐Ｒ−Ａ−
Ｘで表され、Ｒがイミダゾール骨格、ピラゾール骨格、
ピリミジン骨格、ピリダジン骨格、ピラジン骨格、プリ
ン骨格、アクリジン骨格、トリアゾール骨格、オキサジ
アゾール骨格、テトラゾール骨格、インダゾール骨格。

ベンゾトリアゾール骨格、ベンゾピリダジン骨格。

ベンゾピリミジン骨格、ベンゾピラジン骨格またはナフ
チリジン骨格を有する複素環式基であり、Ａが単結合手
、炭素数１〜１２のアルキレン基または炭素数２〜１２
のアルケニレン基であり、Ｘが水素原子、アミノ基、水
酸基またはカルボキシル基であるもので、特にヒスチジ
ン、・ヒスタミン、ウロカニン酸等が好ましい。水不溶
性担体としては、セルロース、アガロース、架橋デキス
トランなどの多糖類、アミノアルキル化多糖類、または
カルボキシアルキル化多糖等が好適に挙げられる。さら
にスペーサーとしては炭素数１〜１２程度のアルキル鎖
の両端にアミノ基やカルボキシル基や水酸基またはそれ
らを組合わせたものを持つものが挙げ５られる。

パイロジエン除去効率はバッチ法よりカラム法の方が優
れている。特に、エピクロルヒドリンで活性化したアミ
ノへキシルセファロースにヒスチジンを共有結合させる
ことにより調製した固定化ヒスチジン脱パイロジエン吸
着体を用いたカラム法による結果では、第１工程の膜処
理で回収率が９８％以上でエンドトキシン濃度が１〜Ｌ
ｏｎｇ／ｍｊ！程度に低減されたＳＯＤ試料溶液をその
ままこのカラムに導通したところ、はとんど希釈される
ことなく、回収率９６％以上で、エンドトキシン含量度
が高感度リムラステスト（例えば、エンドトキシン検出
用リムラスｌｌ５−シングルテストワコー；和光純薬■
製）で検出限界（０，０１ｎｇ／ｒＲ１）以下に低減さ
れたＳＯＤ試料溶液を得た。この試料溶液はまた、公定
法であるウサギの体温上昇値で判定する日本薬局方発熱
性試験（第八改正日本薬局方第一部第８３項記載の方法
によった。）でも陰性であった。

ところで、リムラステストは米国薬局方ｒｕ、ｓ。

Ｐｈａｒａ＋ａｃｏｐａｌａ　ＸＸ、８８８（１９８０
）］にはすでに採用されているが、我国でも放射性医薬
品基準一般試験中には採用されている。

このリムラステストとウサギによる発熱試験との相関関
係はｉｎ　ｖｉｔｒｏとｉｎ　ｖｌｖｏでの結果の比較
となり難しいが、ＬＰＳ（Ｈ，Ｃｏ１１０１１１：Ｂ４
）を用いたウサギによる発熱性試験の検討では日本薬局
方に基づき再試験にかかる体温上昇をもたらすエンドト
キシン濃度は約５ｎｇ／ｍｊであった［Ｉｌ、Ｕｓａｌ
ｌＩｌ。

Ａｎｎ、　Ｒｃｐ、ＴｏｋｙｏＭｃｔ　ｒ　、Ｒｃｓ　
、Ｌａｂ、　Ｐ、］（、、３３、１００−１０４。

（１９８２）］　、即ち、５　ｎｇ／　ｄ　濃度は５０
ｎｇ／　ｋｇ用量に相当し、この濃度で最高体温上昇値
が同法基準値の　０．８℃を示した。人の発熱感受性は
一般的にウサギの約３倍であるので、さらに高い体温上
昇値を示す可能性があるといわれる［玉熊正悦ら。

「エンドトキシンショックコ、中外医学社（１９７７）
］。

これらのことから判断しても、ＳＯＤの人臨床量（例え
ば通常、数〜数十１１１ｇ　ｓ即ち数十〜数百ｎｇ／聴
。ＳＯＤを例えばリポソーム化することでＳＯＤ単独で
の投与量の数十分の−に低減もできる。）では、前記の
方法による発熱性物質除去で十分にその目的を達成して
いることが確認されている。

以上のようにして得られたＳＯＤ溶液は一般的には低イ
オン強度、高タンパク量のものとして得られるが、必要
があれば脱塩や濃縮を行い、それに糖類などを適当量添
加するなどして凍結品や凍結乾燥品にすることにより、
長期に安定かつ安全。

高純度なＳＯＤ製剤にすることが可能である。

上記の一連の発熱性物質除去操作は０〜３０℃程度で行
えるが、必ずしも低温で行う必要はなく、室温で十分行
える。また、使用する器具類の洗浄滅菌も通常の方法で
良く、なんら特殊な処理の必要はない。

また、使用する限外濾過膜の再生はＩＮ程度のＮａ０Ｉ
Ｉへの浸漬処理等、通常の方法で十分である。

脱パイロジエン吸管体の再生はカラムに詰めたままでも
可能であり、−例として上記ヒスチジン固定化吸着体等
の場合は吸着体容量の１０倍量の０．２Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液（１０〜３０％、好ましくは２０％のエタノ
ールを含む）、３０倍量の１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶
液及び１０倍量のパイロジエンフリー水で順次再生し、
次いで試料を溶解する溶液で平衡化すればよい。このよ
うにして、少なくとも数千回程度の反復使用が可能であ
り、再現性も良好であった。

上記の発熱性物質除去法は牛血法由来のＣｕ、Ｚｎ−８
ＯＤ　、ヒト由来のＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ、またはヒト由
来もしくは細菌由来のＭｎ−８ＯＤ、さらにはこれらの
遺伝子組替え（大腸菌）菌体産生のＳＯＤ等、ＳＯＤの
種類や由来によらず適用できる。

［発明の効果］ 以上の説明から明らかなように、本発明によれば、次の
ような効果が得られる。

（１）高濃度（数ｗ／ｖ％）のＳＯＤ溶液に含有された
高濃度（数千〜数万ｎｇ／ｒＲ１）のエンドトキシンを
少なくとも０．１ｎｇ　／ｖｄｌ以下から高感度リムラ
ステストの検出限界（０，０１ｎｇ／　ｖｒｉ　）以下
のエンドトキシン濃度まで低減でき、医薬用としては十
分にエンドトキシン除去されたＳＯＤを得ることができ
る。

（２）Ｓｏｌ）の比活性、ｉ度等の変化もな（、少なく
とも全工程で９６％以上という高回収率で、はとんど希
釈されることなく　ＳＯＤ溶液を得ることができる。

（３）迅速、簡便に発熱性物質の除去ができる。試料溶
液の組成変更やカラム処理で濃度勾配など煩雑な操作を
する必要がなく、全工程、同一の溶液組成でしかも室温
での連続的処理ができる。

（４）再現性に優れ、安全確実に発熱性物質除去ができ
る。複数回処理によるバラツキはなく、吸着体のリガン
ド等の漏出による試料溶液の汚染がない。

（５）経済的、効率的に発熱性物質除去ができる。

使用する膜や吸着体を低コストで製造でき、膜の処理量
や吸着体のパイロジエン吸着量が大きく、短時間に多量
の試料溶液の処理ができる。またこれらの膜や吸着体の
簡単な再生処理により、少なくとも十〜数十回の反復使
用が可能である。

（６）スケールアップが容易で、大量の試料溶液の発熱
性物質除去ができる。大規模（工業的）大量精製のため
の実用的プロセスとしても採用できる。

（７）完全に近い発熱性物質除去によって、医薬用とし
てのＳＯＤの安全性を著しく高めることができる。

［実施例］ 以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 牛血法から精製したＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ溶液（ＳＯＤ比
活性３５００単位／　ｍｇ　：　ＮＢＴ法、以下も同様
；タンパク濃度３５ｍｇ　／　ｒｒｌｌ　：　Ｌｏｖｒ
ｙ法、以下も同様）に含をされるエンドトキシン濃度は
リムラステスト（「エンドトキシン検出用リムラスＩｔ
ｓ−シングルテストワコー」和光純薬玉業■製、商品１
名、以下同様）で約１万ｎｇ／−であった。この溶液を
０．０２Ｍカリウム（Ｋ−）リン酸緩衝液（ｐＨ５，５
＞濃度となるように調製し、その１００１Ｒ１を通常の
方法でよく洗浄したポリビニルアルコール系の重合体の
誘導体よりなる限外濾過膜（分画分子量約１０万）に通
し濾過した。濾過膜面積は２７ｃｊ、濾過圧は　２．５
　ｋｇ重／Ｃシであり、濾過装置はｒＵＩＩＰ−４５Ｊ
　　（東洋ろ紙■製。

商品名）を用い、Ｎ２ガスで加圧して行った。この膜透
過液のエンドトキシン濃度は１〜ｌＯｎｇ／ｍｊ！とな
り、タンパク定量値から求めた８００回収率は９８％で
あった。次にヒスチジンをリガンドとし、アミノへキシ
ルセルロース担体に固定化させた脱パイロジエン吸着体
（粒径６０〜１２０ミクロン、リガンド含量０．０１４
〜０．０２０　ｍＭ／　ｇ　［吸着体コ湿潤品、パイロ
ジエン吸着容ｆｆ１０．５ｍｇ以上／ｇ［吸着体］湿潤
品；　「パイロセップ」　；ダイセル化学工業■製、商
品名）８ｄ（吸着体０．７ｇ湿重量で１−となる。）を
１．５　Ｍ塩化ナトリウム水溶液に懸濁後、滅菌したカ
ラム（内径８韻、長さＬｏｏｍｍ）に充填し、パイロジ
エンフリー水からなる１、５　Ｍ塩化ナトリウム水溶液
２５０ｄ、純水１００　ｄで洗浄した。０．０２Ｍ　Ｋ
−リン酸緩衝液（ｐＨ５，５）１００戴で洗浄し、この
カラムに上記の膜透過液を５Ｖ−１の流速で流下させた
。

これら一連の操作はすべて室温下で行った。この溶出液
のタンパク濃度は２９１Ｉ１ｇ／ｒ！Ｔ１であり、はと
んど希釈されておらず、８００回収率は９８％以上であ
った。また高感度リムラステストによるエンドトキシン
濃度は検出限界（０，Ｏ１ｎｇ／　ｍｌ　）以下であっ
た。

これら一連の脱パイロジエン処理工程において、試料溶
液中のＳＯＤの比活性は変化しなかった。また、ＳＤＳ
　’Ｍ気気泳動法高速液体クロマトグラフィー　（ｒＤ
ＥＡＥ　５ＰＷＪ　、東ソー■製、商品名）等ノＳＯＤ
純度分析によっても上記の脱パイロジエン処理前後で変
化がないことを確認した。

さらに、上記の脱パイロジエン処理したＳＯＤ溶出液を
無菌的に生理食塩水で０．１０．１００倍にそれぞれ希
釈し肢験物質とし、日本薬局方発熱性物質試験（第八改
正ロ本薬局方第一部第８３項記載の方法によった）に従
い、検液１０ｄ／ｋｇ（ウサギ体重）を試験容量とし、
発熱性物質試験を実施したところ、３羽とも体温上昇値
が０゜６℃を越えるものはなく、発熱性物質陰性と判断
した。

実施例２ 牛血法から精製したＣｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤ溶液ＣＳＯ
Ｄ比活性３５００単位／　ｍｇ　；タンパク濃度（ｉ５
ｍｇ　／　ｒｒｄｌ　）を０．０２ＭＫ−リン酸緩衝液
（ｐｌ！５．５　）濃度となるように調製した。この溶
液に含有されるエンドトキシン濃度はリムラステストで
約１万ｎｇ／　ｒｔｄｌであった。

これを試料溶液とし、実施例１と同様にして脱パイロジ
エン処理を行った。第１工程での膜透過液のエンドトキ
シン濃度は１０〜１１００ｎ／ｍＡで、８００回収率は
９８％であった。第２工程での脱パイロジエンカラムの
溶出液のエンドトキシン濃度は０．ｌｎｇ／ｍｌ以下で
、タンパク濃度は５３＋ｎｇ／滅であり、８００回収率
は９８％であった。実施例１と同様のＳＯＤ比活性測定
及びＳＯＤ純度分析の結果、脱パイロジエン処理前後で
、なんら変化がないことを確認した。さらに、実施例１
と同様の発熱性物質試験結果も陰性であった。

実施例３ ヒト血球由来のＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ溶液（Ｓｉｇｍａ社
製）及び遺伝子組替え大腸菌菌体産生ヒト型Ｃｕ、Ｚｎ
−８゜Ｄ溶液をそれぞれ、タンパク濃度３０ａｇ／ｍｊ
！で、０．０２Ｍ　Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５，５）濃
度となるように調製した。これらの溶液を試料溶液とし
て実施例１と同様にして脱パイロジエン処理を行った。

いずれも、全工程で９６％以上のタンパク回収率で、は
とんど希釈されず、エンドトキシン濃度０．０１ｎｇ／
−以下のものが得られた。また、実施例１と同様の分析
の結果、処理前後での純度や物性上の変化もなかった。

実施例４ 細菌由来の２種類のＭｎ−８ＯＤ　［バチルス　ステア
ロサーモフィルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　Ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｂｌｌｌＳ）由来のＭｎ−８ＯＤ　（ユニ
チカ社製）及び大腸菌由来のＭｎ−８ＯＤ　（５１ｇ１
ｉａ社製）］から試料溶液（タンパク濃度１％）をそれ
ぞれ調製し、実施例１と同様にして脱パイロジエン処理
を行った。いずれも全工程で９８％以上のタンパク回収
率で、はとんど希釈されず、エンドトキシン濃度０．０
１ｎｇ／ｍｊ以下のものが得られた。また処理前後での
純度や物性上の変化も認められなかった。

実施例５ 牛血法から精製し、脱パイロジエン処理を行ったＣｕ、
ＺｒｒＳＯＤ溶液Ｃ３ＯＤ比活性３５００単位／　ｍｇ
　＋　タンパク濃度３５ｍｇ／　ｍｉ’、０．０２　Ｍ
Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５，５）濃度含を）に大腸菌由
来のエンドトキシン（Ｅ、ｃｏｌｌ　０１１１：Ｂ４；
Ｅ、ｃｏｌＩ　ＵＫＴ−３株の培養菌体からの精製物、
和光純薬玉業■製、米国食品医薬局（Ｕ、Ｓ、、ＦＤＡ
）のレフ７ランス　エンドトキシンＥＣ−２相当）を１
Ｍｎｇ／ｍｊ！の濃度となるように添加し、これを試料
溶液とし、実施例１と同様にして脱パイロジエン処理を
行った。得られた結果は実施例１と同様であった。

参考例１ 実施例１等で用いた、繰返しの使用によりパイロジエン
吸着能の低下したカラムは０．２　Ｍ水酸化ナトリウム
水溶液８０ｍｊ　（２０％エタノール含有）。

１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液２５０ｄ、パイロジエン
フリー水ＩＱＯｍｊ！で順次洗浄して、再生した。その
後、実施例１〜５と同様の操作を繰り返した結果、少な
（とも１０回以上の繰返し使用でも同一の再現性のある
結果が得られた。

比較例１ 実施例１の脱パイロジエン処理工程において、第１工程
の膜濾過工程を行わなかった以外は、実施例１と同様の
処理操作を行った。即ち、実施例１における第２工程の
脱パイロジエン吸着体カラム処理のみを行った結果、得
られた溶出液のエンドトキシン濃度は１０〜１１００ｎ
／−であり、不十分なエンドトキシン除去に終わった。

実施例２〜５の試料溶液についても同様の結果が得られ
た。

実施例１と同一の試料溶液を用いて、本発明による発熱
性物質除去処理を行った場合と本発明による発熱性物質
除去処理のうち第１工程の膜濾過処理のみを行った場合
及び第２工程の脱パイロジエン吸着体との接触のみを行
った場合の３通りについて、それぞれ処理の前後での試
料溶液のエンドトキシン濃度を比較した結果を表１に示
す。

表１ 比較例２ 実施例１の脱パイロジエン処理工程において、本発明で
用いた膜の代わりに従来品であるポリエーテルスルホン
系の限外濾過膜（１分画分子量約３０４゜ ＸＩＯ、ｒＵＦ−３００ＰＳＪ　：東ソー■製、商品名
）を用いる以外は、全〈実施例１と同様の試料溶液を用
い、同様の処理操作を行った。第１工程の膜処理工程ま
での８００回収率は９４％であり、また全処理工程を終
えて得られた溶液のタンパク回収率は９２％であった。

なお、エンドトキシン除去率は各工程でそれぞれ、実施
例１とほぼ同様の結果を示した。

実施例１と比較例２の各段階における８００回収率を比
較した結果を表２に示す。なお、表中第２工程の脱パイ
ロジエンカラム処理終了時の回収率の値は第１工程の膜
濾過処理も含めた全処理工程終了時のＳＯＤの回収率の
値を示す。

表２ 表１及び表２から明らかなように、膜濾過処理のみまた
は脱パイロジエン吸着体カラム処理のみでは、エンドト
キシンの除去は不十分であり、また従来のポリエーテル
スルホン系の限外濾過膜を用いた場合、ＳＯＤのタンパ
ク回収率が低下する。

本発明による発熱性物質除去方法を行った場合には、高
感度リムラステストの検出限界以下までエンドトキシン
濃度を低減することができ、更にＳＯＤのタンパク回収
率も良好であり、特に医薬用として宵月なＳＯＤ溶液が
得られることが明らかであΦ　Ｏ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）発熱性物質を含むスーパーオキサイド、ジスムタ
   ーゼ溶液をポリビニルアルコールを分子内ホルマール化
   した一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ｎ＝８５０〜９００） で表される構造の反復単位を基本とする重合体よりなる
   限外濾過膜で濾過する工程、次いで脱パイロジエン吸着
   体に接触させる工程からなることを特徴とするスーパー
   オキサイド・ジスムターゼからの発熱性物質除去方法。