JPH0782019B2 - 免疫測定法及び免疫測定試薬 - Google Patents
免疫測定法及び免疫測定試薬Info
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- JPH0782019B2 JPH0782019B2 JP3254363A JP25436391A JPH0782019B2 JP H0782019 B2 JPH0782019 B2 JP H0782019B2 JP 3254363 A JP3254363 A JP 3254363A JP 25436391 A JP25436391 A JP 25436391A JP H0782019 B2 JPH0782019 B2 JP H0782019B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、クラス又はサブクラス
の異なるモノクローナル抗体を使用して被検試料液中の
抗原性物質を測定する方法及びこの方法に用いる免疫測
定試薬に関し、種々の身体的疾患に伴い、例えば血清も
しくは他の体液中に発生する抗原性物質の濃度を測定す
るのに好適な方法及び測定試薬を提供するものである。
の異なるモノクローナル抗体を使用して被検試料液中の
抗原性物質を測定する方法及びこの方法に用いる免疫測
定試薬に関し、種々の身体的疾患に伴い、例えば血清も
しくは他の体液中に発生する抗原性物質の濃度を測定す
るのに好適な方法及び測定試薬を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】本発明者は、クラス又はサブクラスの異
なるモノクローナル抗体を使用した免疫測定法として特
開平２−２０５７７４号公報記載方法、即ち測定の対象
となる抗原性物質に、不溶性固体と結合しており、且つ
この抗原性物質を認識するモノクローナル抗体（第一抗
体）、この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異な
るクラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗
体）及び標識物質により標識されており、且つ第二抗体
のクラス又はサブクラスを認識する標識抗体（第三抗
体）を結合させて得た免疫複合体の標識物質量を測定す
ることにより、抗原性物質を測定する測定法を得てい
る。この方法では、第三抗体として、具体的には第一抗
体及び第二抗体とは異なる種の動物由来のポリクローナ
ル抗体を使用している。
なるモノクローナル抗体を使用した免疫測定法として特
開平２−２０５７７４号公報記載方法、即ち測定の対象
となる抗原性物質に、不溶性固体と結合しており、且つ
この抗原性物質を認識するモノクローナル抗体（第一抗
体）、この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異な
るクラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗
体）及び標識物質により標識されており、且つ第二抗体
のクラス又はサブクラスを認識する標識抗体（第三抗
体）を結合させて得た免疫複合体の標識物質量を測定す
ることにより、抗原性物質を測定する測定法を得てい
る。この方法では、第三抗体として、具体的には第一抗
体及び第二抗体とは異なる種の動物由来のポリクローナ
ル抗体を使用している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、本発明
者の得たその後の知見では、第三抗体にポリクローナル
抗体を使った場合は、第三抗体の特異性が不十分なこと
から、一部第二抗体以外の物質との結合がおき、十分な
感度が得られないこともあることが次第に判ってきた。
者の得たその後の知見では、第三抗体にポリクローナル
抗体を使った場合は、第三抗体の特異性が不十分なこと
から、一部第二抗体以外の物質との結合がおき、十分な
感度が得られないこともあることが次第に判ってきた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく鋭意検討した結果、第三抗体としてポリ
クローナル抗体に代えて、第一抗体及び第二抗体と同じ
種の動物由来のモノクローナル抗体を用いることによ
り、更に感度が向上することを見いだし、本発明に到達
した。
点を解決すべく鋭意検討した結果、第三抗体としてポリ
クローナル抗体に代えて、第一抗体及び第二抗体と同じ
種の動物由来のモノクローナル抗体を用いることによ
り、更に感度が向上することを見いだし、本発明に到達
した。
【０００５】即ち本発明は、測定の対象となる抗原性物
質に、 不溶性固体と結合しており、且つこの抗原性物質を認
識するモノクローナル抗体（第一抗体）、 この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異なるク
ラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）
及び 標識物質により標識されており、且つ第二抗体のクラ
ス又はサブクラスを認識するモノクローナル抗体（第三
抗体） を結合させて得た免疫複合体中の標識物質量を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法であり、且つ
第一抗体、第二抗体及び第三抗体が同じ種の動物由来の
モノクローナル抗体であることを特徴とする抗原性物質
の免疫測定法；並びに、 不溶性固体と結合しており、且つ測定の対象となる抗
原性物質を認識するモノクローナル抗体（第一抗体）、 この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異なるク
ラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）
及び 標識物質により標識されており、且つ第二抗体のクラ
ス又はサブクラスを認識する標識モノクローナル抗体
（第三抗体） の組合せからなる免疫測定試薬において、第一抗体、第
二抗体及び第三抗体が同じ種由来の動物のモノクローナ
ル抗体であることを特徴とする免疫測定試薬である。
質に、 不溶性固体と結合しており、且つこの抗原性物質を認
識するモノクローナル抗体（第一抗体）、 この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異なるク
ラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）
及び 標識物質により標識されており、且つ第二抗体のクラ
ス又はサブクラスを認識するモノクローナル抗体（第三
抗体） を結合させて得た免疫複合体中の標識物質量を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法であり、且つ
第一抗体、第二抗体及び第三抗体が同じ種の動物由来の
モノクローナル抗体であることを特徴とする抗原性物質
の免疫測定法；並びに、 不溶性固体と結合しており、且つ測定の対象となる抗
原性物質を認識するモノクローナル抗体（第一抗体）、 この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異なるク
ラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）
及び 標識物質により標識されており、且つ第二抗体のクラ
ス又はサブクラスを認識する標識モノクローナル抗体
（第三抗体） の組合せからなる免疫測定試薬において、第一抗体、第
二抗体及び第三抗体が同じ種由来の動物のモノクローナ
ル抗体であることを特徴とする免疫測定試薬である。
【０００６】本発明において測定の対象となる抗原性物
質としては、特開平２−２０５７７４号公報記載の被測
定抗原性物質があげられる。これらのうち、特に高感度
の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイ
ルスの測定に本発明の方法は好適である。
質としては、特開平２−２０５７７４号公報記載の被測
定抗原性物質があげられる。これらのうち、特に高感度
の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイ
ルスの測定に本発明の方法は好適である。
【０００７】第一抗体としては、測定の対象となる抗原
性物質を認識するモノクローナル抗体を用いることがで
きる。モノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を文献に
記載の方法［たとえば、ジー・ケラー、シー・ミルスタ
イン;ネイチャー (G.Kohler,C.Milstein;Natur) Vol.2
56,PP.495(1975)］によって融合させた細胞由来の抗体
であり、同一クローンの抗体産生細胞から産生された抗
体であるので、測定の対象となる抗原性物質に対する特
異性及び抗体のクラス、サブクラスは完全に同一であ
る。
性物質を認識するモノクローナル抗体を用いることがで
きる。モノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を文献に
記載の方法［たとえば、ジー・ケラー、シー・ミルスタ
イン;ネイチャー (G.Kohler,C.Milstein;Natur) Vol.2
56,PP.495(1975)］によって融合させた細胞由来の抗体
であり、同一クローンの抗体産生細胞から産生された抗
体であるので、測定の対象となる抗原性物質に対する特
異性及び抗体のクラス、サブクラスは完全に同一であ
る。
【０００８】不溶性固体としては、特開平２−２０５７
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管など）、及びプラスチック（プラスチックチュー
ブ、プラスチックトレイなど）である。
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管など）、及びプラスチック（プラスチックチュー
ブ、プラスチックトレイなど）である。
【０００９】不溶性固体上に第一抗体を結合させる方法
は、特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様で
よい。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結
合させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号
明細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラス
チックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・
エングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマ
ン；バイオキム．バイオフィス．アクタ(E.Engvall,J.J
ons-son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta),251(1971)4
27〜434）がある。
は、特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様で
よい。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結
合させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号
明細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラス
チックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・
エングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマ
ン；バイオキム．バイオフィス．アクタ(E.Engvall,J.J
ons-son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta),251(1971)4
27〜434）がある。
【００１０】第二抗体としては、測定の対象となる抗原
性物質を認識し、且つ第一抗体と異なるクラス又はサブ
クラスのモノクローナル抗体を用いることができる。た
とえば、第一抗体がＩｇＡクラスのモノクローナル抗体
なら第二抗体はＩｇＧクラスのモノクローナル抗体、第
一抗体がＩｇＧ２ａサブクラスのモノクローナル抗体な
ら第二抗体はＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体
を用いることができる。
性物質を認識し、且つ第一抗体と異なるクラス又はサブ
クラスのモノクローナル抗体を用いることができる。た
とえば、第一抗体がＩｇＡクラスのモノクローナル抗体
なら第二抗体はＩｇＧクラスのモノクローナル抗体、第
一抗体がＩｇＧ２ａサブクラスのモノクローナル抗体な
ら第二抗体はＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体
を用いることができる。
【００１１】第三抗体としては、第二抗体のクラス又は
サブクラスを特異的に認識するモノクローナル抗体（た
とえば、第一抗体がマウスＩｇＡで第二抗体がマウスＩ
ｇＧならば抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体、あるい
は第一抗体がマウスＩｇＧ２ａで第二抗体がマウスＩｇ
Ｇ１なら抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体など）を
用いることができる。
サブクラスを特異的に認識するモノクローナル抗体（た
とえば、第一抗体がマウスＩｇＡで第二抗体がマウスＩ
ｇＧならば抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体、あるい
は第一抗体がマウスＩｇＧ２ａで第二抗体がマウスＩｇ
Ｇ１なら抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体など）を
用いることができる。
【００１２】第三抗体に標識する標識物質としては、特
開平２−２０５７７４号公報記載の標識物質（酵素、放
射線同位元素、蛍光物質、化学発光物質など）を用いる
ことができる。このうち好ましいものは、抗体標識が容
易で、且つ高い感度が得られるペルオキシダーゼ及び
125Ｉである。
開平２−２０５７７４号公報記載の標識物質（酵素、放
射線同位元素、蛍光物質、化学発光物質など）を用いる
ことができる。このうち好ましいものは、抗体標識が容
易で、且つ高い感度が得られるペルオキシダーゼ及び
125Ｉである。
【００１３】第一抗体、第二抗体及び第三抗体は、同じ
種の動物由来のモノクローナル抗体を用い、同じ種の動
物としては、マウス、ラット、ヒトをあげることができ
る。このうち好ましいものは、抗体同志の非特異的結合
が小さく、且つ抗原性物質との親和力が強いモノクロー
ナル抗体を作製できるマウスである。
種の動物由来のモノクローナル抗体を用い、同じ種の動
物としては、マウス、ラット、ヒトをあげることができ
る。このうち好ましいものは、抗体同志の非特異的結合
が小さく、且つ抗原性物質との親和力が強いモノクロー
ナル抗体を作製できるマウスである。
【００１４】該免疫複合体は、特開平２−２０５７７４
号公報記載の方法によって得ることができる。即ち、
（１）不溶性固体上の第一抗体と測定の対象となる抗原
性物質を結合させたのち、洗浄し、この抗原性物質と第
二抗体を結合させたのち、再び洗浄し、さらにこの第二
抗体と第三抗体を結合させる方法、（２）不溶性固体上
の第一抗体、測定の対象となる抗原性物質、第二抗体を
同時に結合させたのち、洗浄し、さらにこの第二抗体と
第三抗体を結合させる方法、（３）不溶性固体上の第一
抗体、測定の対象となる抗原性物質、第二抗体、第三抗
体を同時に結合させる方法、及び（４）不溶性固体上の
第一抗体と測定の対象となる抗原性物質を結合させたの
ち、洗浄し、この抗原性物質と第二抗体、第三抗体を同
時に結合させる方法によって得ることができる。
号公報記載の方法によって得ることができる。即ち、
（１）不溶性固体上の第一抗体と測定の対象となる抗原
性物質を結合させたのち、洗浄し、この抗原性物質と第
二抗体を結合させたのち、再び洗浄し、さらにこの第二
抗体と第三抗体を結合させる方法、（２）不溶性固体上
の第一抗体、測定の対象となる抗原性物質、第二抗体を
同時に結合させたのち、洗浄し、さらにこの第二抗体と
第三抗体を結合させる方法、（３）不溶性固体上の第一
抗体、測定の対象となる抗原性物質、第二抗体、第三抗
体を同時に結合させる方法、及び（４）不溶性固体上の
第一抗体と測定の対象となる抗原性物質を結合させたの
ち、洗浄し、この抗原性物質と第二抗体、第三抗体を同
時に結合させる方法によって得ることができる。
【００１５】該免疫複合体中の標識物質量は、特開平２
−２０５７７４号公報記載の方法により測定できる。即
ち、標識物質に応じて酵素量を酵素活性の測定により測
定する方法、放射線同位元素量を放射線測定装置を用い
て測定する方法、蛍光物質量を蛍光光度計により測定す
る方法、化学発光物質量を酵素を用いた化学発光により
測定する方法などにより行うことができる。
−２０５７７４号公報記載の方法により測定できる。即
ち、標識物質に応じて酵素量を酵素活性の測定により測
定する方法、放射線同位元素量を放射線測定装置を用い
て測定する方法、蛍光物質量を蛍光光度計により測定す
る方法、化学発光物質量を酵素を用いた化学発光により
測定する方法などにより行うことができる。
【００１６】本発明の免疫測定試薬には、この免疫測定
試薬の使用を便ならしめるために、種々の補助剤を包含
させることができる。たとえば、第二抗体または第三抗
体が固体状である場合にはそれらを溶解させるための溶
解剤、免疫複合体を得る工程で不溶化固体を洗浄するた
めの洗浄液、標識物質が酵素である場合にその酵素活性
を測定するための基質、及び酵素反応を停止するための
反応停止剤などを任意の組合せで包含させることができ
る。
試薬の使用を便ならしめるために、種々の補助剤を包含
させることができる。たとえば、第二抗体または第三抗
体が固体状である場合にはそれらを溶解させるための溶
解剤、免疫複合体を得る工程で不溶化固体を洗浄するた
めの洗浄液、標識物質が酵素である場合にその酵素活性
を測定するための基質、及び酵素反応を停止するための
反応停止剤などを任意の組合せで包含させることができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、実施例および比較例により、本発明を
更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ ＣＡ１９−９の測定 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 ＣＡ１９−９に対するモノクローナル抗体は、特開平２
−２０５７７４号公報記載の方法に従って製造し、マウ
ス由来のＩｇＧ１サブクラスとＩｇＡクラスの２クロー
ンのモノクローナル抗体が得られ、以下の検討に用い
た。 ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブ
クラス）結合ガラスビーズの作製 特開平２−２０５７７４号公報記載の方法に従い、ガラ
スビーズの表面にＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＡ１９−９
モノクローナル抗体をコーティングした。 ｃ）抗マウスＩｇＡモノクロ−ナル抗体の作製 マウスＩｇＡ １００μｇをフロイントの完全アジュバ
ントとともにＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹腔内に投与し免
疫した。２ヶ月後に再びマウスＩｇＡ １００μｇを静
脈内に投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採取し
た。ＲＰＭＩ １６４０培地にて洗浄した後、脾細胞全
量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／
１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチ
レングリコール１５４０及び７．５％ジメチルスルフォ
キシドを含むＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌ中で１分間
融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、
９６ウェルマイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｇ３サブクラスの抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体を
産生する細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養
し、培養上清液を採取した。この培養液中のモノクロー
ナル抗体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキッ
ト（バイオラッド社製）を用いて精製単離し、以下の検
討に用いた。 ｄ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡモノクローナ
ル抗体の作製 抗マウスＩｇＡモノクロ−ナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAW
A,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92 （1982） 1413-1424］
に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体を得
た。この試薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で
１０〜５０００倍に希釈して使用した。 ｅ）ＣＡ１９−９標準溶液の調整 ＳＷ−１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ
１６４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上
清液中のＣＡ１９−９濃度をイムノクロンＣＡ１９−９
（富士レビオ社製）を用いて測定し、濃度が５，１０，
２０，４０ｕｎｉｔ／ｍｌなるように１％牛血清アルブ
ミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。
更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ ＣＡ１９−９の測定 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 ＣＡ１９−９に対するモノクローナル抗体は、特開平２
−２０５７７４号公報記載の方法に従って製造し、マウ
ス由来のＩｇＧ１サブクラスとＩｇＡクラスの２クロー
ンのモノクローナル抗体が得られ、以下の検討に用い
た。 ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブ
クラス）結合ガラスビーズの作製 特開平２−２０５７７４号公報記載の方法に従い、ガラ
スビーズの表面にＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＡ１９−９
モノクローナル抗体をコーティングした。 ｃ）抗マウスＩｇＡモノクロ−ナル抗体の作製 マウスＩｇＡ １００μｇをフロイントの完全アジュバ
ントとともにＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹腔内に投与し免
疫した。２ヶ月後に再びマウスＩｇＡ １００μｇを静
脈内に投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採取し
た。ＲＰＭＩ １６４０培地にて洗浄した後、脾細胞全
量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／
１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチ
レングリコール１５４０及び７．５％ジメチルスルフォ
キシドを含むＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌ中で１分間
融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、
９６ウェルマイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｇ３サブクラスの抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体を
産生する細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養
し、培養上清液を採取した。この培養液中のモノクロー
ナル抗体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキッ
ト（バイオラッド社製）を用いて精製単離し、以下の検
討に用いた。 ｄ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡモノクローナ
ル抗体の作製 抗マウスＩｇＡモノクロ−ナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAW
A,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92 （1982） 1413-1424］
に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体を得
た。この試薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で
１０〜５０００倍に希釈して使用した。 ｅ）ＣＡ１９−９標準溶液の調整 ＳＷ−１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ
１６４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上
清液中のＣＡ１９−９濃度をイムノクロンＣＡ１９−９
（富士レビオ社製）を用いて測定し、濃度が５，１０，
２０，４０ｕｎｉｔ／ｍｌなるように１％牛血清アルブ
ミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。
【００１８】ｆ）ＣＡ１９−９測定試薬の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラ
ス）結合ガラスビーズ１００個、抗ＣＡ１９−９モノク
ローナル抗体（ＩｇＡクラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液１２ｍｌ、ペルオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＡモノクローナル抗体含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液６０ｍｌ、１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ
リン酸緩衝液４０ｍｌ、ＣＡ１９−９標準溶液 ５，１
０，２０，４０ｕｎｉｔ／ｍｌを各１ｍｌ、生理食塩水
１０００ｍｌ、基質溶液（過酸化水素含有オルト-フェ
ニレンジアミン溶液）６０ｍｌ、及び１．５規定硫酸水
溶液３５０ｍｌを別々の容器に充填した後密栓して、Ｃ
Ａ１９−９測定試薬を製造した。 ｇ）ＣＡ１９−９標準溶液の測定 ＣＡ１９−９ ４０ｕｎｉｔ／ｍｌを含む標準溶液 ５
０μｌ,抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＡク
ラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝液１０
０μｌ及び１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液３００μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノ
クローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスビー
ズを１個入れインキュベーション（３７℃、１５分間）
したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移
し、インキュベーション（３７℃、１５分間）した。再
度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基
質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶
液）５００μl中に移し、インキュベーション（３７℃、
１５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加
えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測
定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。４
０ｕｎｉｔ／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値
の平均値、標準偏差、ＣＶを算出した。 同様に、ＣＡ
１９−９標準溶液５，１０，２０ｕｎｉｔ／ｍｌ及び０
ブランクの測定も各々１０回繰り返し行い、測定値の平
均値、標準偏差、ＣＶを算出した。結果を表１に示す。
ス）結合ガラスビーズ１００個、抗ＣＡ１９−９モノク
ローナル抗体（ＩｇＡクラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液１２ｍｌ、ペルオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＡモノクローナル抗体含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液６０ｍｌ、１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ
リン酸緩衝液４０ｍｌ、ＣＡ１９−９標準溶液 ５，１
０，２０，４０ｕｎｉｔ／ｍｌを各１ｍｌ、生理食塩水
１０００ｍｌ、基質溶液（過酸化水素含有オルト-フェ
ニレンジアミン溶液）６０ｍｌ、及び１．５規定硫酸水
溶液３５０ｍｌを別々の容器に充填した後密栓して、Ｃ
Ａ１９−９測定試薬を製造した。 ｇ）ＣＡ１９−９標準溶液の測定 ＣＡ１９−９ ４０ｕｎｉｔ／ｍｌを含む標準溶液 ５
０μｌ,抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＡク
ラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝液１０
０μｌ及び１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液３００μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノ
クローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスビー
ズを１個入れインキュベーション（３７℃、１５分間）
したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移
し、インキュベーション（３７℃、１５分間）した。再
度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基
質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶
液）５００μl中に移し、インキュベーション（３７℃、
１５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加
えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測
定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。４
０ｕｎｉｔ／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値
の平均値、標準偏差、ＣＶを算出した。 同様に、ＣＡ
１９−９標準溶液５，１０，２０ｕｎｉｔ／ｍｌ及び０
ブランクの測定も各々１０回繰り返し行い、測定値の平
均値、標準偏差、ＣＶを算出した。結果を表１に示す。
【００１９】比較例１ ヤギ由来のポリクローナル抗体
を用いたＥＩＡによるＣＡ１９−９の測定 実施例１と比較するため、ヤギ抗マウスＩｇＡポリクロ
ーナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＣ
Ａ１９−９の測定を行った。 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 実施例１．ａ）に準じた。 ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブ
クラス）結合ガラスビーズの作製 実施例１．ｂ）に準じた。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡポリクローナ
ル抗体の作製 ヤギ抗マウスIgAポリクローナル抗体（カペル社製）を
文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカ
ワ、エトール；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IM
AGAWA,E.ISHIKAWA,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92（198
2） 1413-1424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと
結合し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＡポリ
クローナル抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清アル
ブミン含有緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用し
た。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調整 実施例１．ｅ）に準じた。 ｅ）ＣＡ１９−９標準溶液の測定 ＣＡ１９−９ ４０ｕｎｉｔ／ｍｌを含む標準溶液 ５
０μｌ、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＡク
ラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍ緩衝液１００μｌ
及び１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液
３００μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノクロー
ナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスビーズを１
個入れインキュベーション（３７、１５分間）したの
ち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＡポリクーナル抗体含有
０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、
インキュベーション（３７℃、１５分間）した。再度、
生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶
液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）
５００μｌ中に移し、インキュベーション（３７℃、１
５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加え
て反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定
し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。４０
ｕｎｉｔ／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値の
平均値、標準偏差、ＣＶを算出した。 同様に、ＣＡ１
９−９標準溶液５，１０，２０ｕｎｉｔ／ｍｌ及び０ブ
ランクの測定も各々１０回繰り返し行い、測定値の平均
値、標準偏差、ＣＶを算出した。結果を表１に示す。
を用いたＥＩＡによるＣＡ１９−９の測定 実施例１と比較するため、ヤギ抗マウスＩｇＡポリクロ
ーナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＣ
Ａ１９−９の測定を行った。 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 実施例１．ａ）に準じた。 ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブ
クラス）結合ガラスビーズの作製 実施例１．ｂ）に準じた。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡポリクローナ
ル抗体の作製 ヤギ抗マウスIgAポリクローナル抗体（カペル社製）を
文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカ
ワ、エトール；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IM
AGAWA,E.ISHIKAWA,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92（198
2） 1413-1424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと
結合し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＡポリ
クローナル抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清アル
ブミン含有緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用し
た。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調整 実施例１．ｅ）に準じた。 ｅ）ＣＡ１９−９標準溶液の測定 ＣＡ１９−９ ４０ｕｎｉｔ／ｍｌを含む標準溶液 ５
０μｌ、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＩｇＡク
ラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍ緩衝液１００μｌ
及び１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液
３００μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノクロー
ナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスビーズを１
個入れインキュベーション（３７、１５分間）したの
ち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＡポリクーナル抗体含有
０．０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、
インキュベーション（３７℃、１５分間）した。再度、
生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶
液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）
５００μｌ中に移し、インキュベーション（３７℃、１
５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加え
て反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定
し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。４０
ｕｎｉｔ／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値の
平均値、標準偏差、ＣＶを算出した。 同様に、ＣＡ１
９−９標準溶液５，１０，２０ｕｎｉｔ／ｍｌ及び０ブ
ランクの測定も各々１０回繰り返し行い、測定値の平均
値、標準偏差、ＣＶを算出した。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】実施例２ ＣＥＡの測定 ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体の製造 ＣＥＡに対するモノクローナル抗体は、特開平２−２０
５７７４号公報記載の方法に従って製造し、マウス由来
のＩｇＧ１サブクラスとＩｇＧ２ａサブクラスの２クロ
ーンのモノクローナル抗体が得られ、以下の検討に用い
た。 ｂ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラ
ス）結合ガラスビーズの作製 米国特許第６５２７６１号明細書の方法に従い、ガラス
ビーズの表面にＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体をコーティングした。 ｃ）抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体の作製 マウスＩｇＧ２ａ １００μｇをフロイントの完全アジ
ュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与し
免疫した。２ヶ月後に再びマウスＩｇＧ２ａ１００μｇ
を静脈内に投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採取
した。ＲＰＭＩ １６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３ＮＳ１／
１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチ
レングリコール１５４０及び７．５％ジメチルスルフォ
キシドを含むＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌ中で１分間
融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、
９６ウェルマイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｍクラスの抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を産
生する細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養
し、培養上清液を採取した。この培養液中のモノクロー
ナル抗体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキッ
ト（バイオラッド社製）を用いて精製単離し、以下の検
討に用いた。 ｄ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクロ
ーナル抗体の作製 抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を文献［エス・
ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトー
ル；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.IS
HIKAWA,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92 （1982） 1413-1
424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル
抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清アルブミン含有
緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用した。 ｅ）ＣＥＡ標準溶液の調整 大腸癌肝転移巣から過塩素酸抽出法により得られた高値
ＣＥＡをＷＨＯのＣＥＡインターナショナルリファレン
ススタンダード（６３／７０１）を用いて、三洋化成工
業（株）製ＣＥＡキット「グラオザイムＣＥＡ」により
濃度を検定し、濃度が２．５，５，１０，２０ｎｇ／ｍ
ｌとなるように１％牛血清アルブミン含有緩衝液で希釈
し標準溶液とした。
５７７４号公報記載の方法に従って製造し、マウス由来
のＩｇＧ１サブクラスとＩｇＧ２ａサブクラスの２クロ
ーンのモノクローナル抗体が得られ、以下の検討に用い
た。 ｂ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラ
ス）結合ガラスビーズの作製 米国特許第６５２７６１号明細書の方法に従い、ガラス
ビーズの表面にＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体をコーティングした。 ｃ）抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体の作製 マウスＩｇＧ２ａ １００μｇをフロイントの完全アジ
ュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与し
免疫した。２ヶ月後に再びマウスＩｇＧ２ａ１００μｇ
を静脈内に投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採取
した。ＲＰＭＩ １６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３ＮＳ１／
１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチ
レングリコール１５４０及び７．５％ジメチルスルフォ
キシドを含むＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌ中で１分間
融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、
９６ウェルマイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｍクラスの抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を産
生する細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養
し、培養上清液を採取した。この培養液中のモノクロー
ナル抗体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキッ
ト（バイオラッド社製）を用いて精製単離し、以下の検
討に用いた。 ｄ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクロ
ーナル抗体の作製 抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を文献［エス・
ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトー
ル；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.IS
HIKAWA,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92 （1982） 1413-1
424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル
抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清アルブミン含有
緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用した。 ｅ）ＣＥＡ標準溶液の調整 大腸癌肝転移巣から過塩素酸抽出法により得られた高値
ＣＥＡをＷＨＯのＣＥＡインターナショナルリファレン
ススタンダード（６３／７０１）を用いて、三洋化成工
業（株）製ＣＥＡキット「グラオザイムＣＥＡ」により
濃度を検定し、濃度が２．５，５，１０，２０ｎｇ／ｍ
ｌとなるように１％牛血清アルブミン含有緩衝液で希釈
し標準溶液とした。
【００２２】ｆ）ＣＥＡ測定試薬の製造 抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラス）結
合ガラスビーズ１００個、抗ＣＥＡモノクローナル抗体
（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２
Ｍリン酸緩衝液１２ｍｌ、ペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧ２ａモノクローナル抗体含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液６０ｍｌ、１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ
リン酸緩衝液４０ｍｌ、ＣＥＡ標準溶液２．５，５，１
０，２０ｎｇ／ｍｌを各１ｍｌ、生理食塩水１０００ｍ
ｌ、基質溶液（過酸化水素含有オルト-フェニレンジア
ミン溶液）６０ｍｌ、及び１．５規定硫酸水溶液３５０
ｍｌを別々の容器に充填した後密栓して、ＣＥＡ測定試
薬を製造した。 ｇ）ＣＥＡ標準溶液の測定 ＣＥＡ ２０ｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μｌ、抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０
μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝液１００μｌ及び
１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液３０
０μｌを入れた試験管に抗ＣＥＡモノクローナル抗体
（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスビーズを１個入れイ
ンキュベーション（３７℃、１５分間）したのち、生理
食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ
標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体含有０．０
２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、インキ
ュベーション（３７℃、１５分間）した。再度、生理食
塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過
酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）５００
μｌ中に移し、インキュベーション（３７℃、１５分
間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて反
応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、
ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。２０ｎｇ
／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値の平均値、
標準偏差、ＣＶを算出した。同様に、ＣＥＡ標準溶液
２．５，５，１０ｎｇ／ｍｌ及び０ブランクの測定も各
々１０回繰り返し行い、測定値の平均値、標準偏差、Ｃ
Ｖを算出した。結果を表２に示す。
合ガラスビーズ１００個、抗ＣＥＡモノクローナル抗体
（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０μｇ／ｍｌ含有０．０２
Ｍリン酸緩衝液１２ｍｌ、ペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧ２ａモノクローナル抗体含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液６０ｍｌ、１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍ
リン酸緩衝液４０ｍｌ、ＣＥＡ標準溶液２．５，５，１
０，２０ｎｇ／ｍｌを各１ｍｌ、生理食塩水１０００ｍ
ｌ、基質溶液（過酸化水素含有オルト-フェニレンジア
ミン溶液）６０ｍｌ、及び１．５規定硫酸水溶液３５０
ｍｌを別々の容器に充填した後密栓して、ＣＥＡ測定試
薬を製造した。 ｇ）ＣＥＡ標準溶液の測定 ＣＥＡ ２０ｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μｌ、抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０
μｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝液１００μｌ及び
１％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液３０
０μｌを入れた試験管に抗ＣＥＡモノクローナル抗体
（ＩｇＧ１サブクラス）結合ガラスビーズを１個入れイ
ンキュベーション（３７℃、１５分間）したのち、生理
食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ
標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体含有０．０
２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、インキ
ュベーション（３７℃、１５分間）した。再度、生理食
塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過
酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）５００
μｌ中に移し、インキュベーション（３７℃、１５分
間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて反
応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、
ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。２０ｎｇ
／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値の平均値、
標準偏差、ＣＶを算出した。同様に、ＣＥＡ標準溶液
２．５，５，１０ｎｇ／ｍｌ及び０ブランクの測定も各
々１０回繰り返し行い、測定値の平均値、標準偏差、Ｃ
Ｖを算出した。結果を表２に示す。
【００２３】比較例２ シープ由来ののポリクローナル
抗体を用いたＥＩＡによるＣＥＡの測定 実施例２と比較するため、シープ抗マウスＩｇＡポリク
ローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により
ＣＥＡの測定を行った。 ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体の製造 実施例２．ａ）に準じた。 ｂ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラ
ス）結合ガラスビーズの作製 実施例２．ｂ）に準じた。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識シープ抗マウスＩｇＧ２ａポ
リクローナル抗体の作製シープ抗マウスＩｇＧ２ａポリ
クローナル抗体（バインディングサイト社製）を文献
［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、
エトール；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAW
A,E.ISHIKAWA,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92（1982） 1
413-1424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合
し、ペルオキシダーゼ標識シープ抗マウスＩｇＧ２ａポ
リクローナル抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清ア
ルブミン含有緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用
した。 ｄ）ＣＥＡ標準溶液の調整 実施例２．ｅ）に準じた。 ｅ）ＣＥＡ標準溶液の測定 ＣＥＡ２０ｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μｌ、抗ＣＥ
Ａモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０μ
ｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝液１００μｌ及び１
％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液３００
μｌを入れた試験管に抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ１サブクラス）結合ガラスビーズを１個入れインキ
ュベーション（３７℃、１５分間）したのち、生理食塩
水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識
シープ抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル抗体含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、イン
キュベーション（３７℃、１５分間）した。再度、生理
食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液
（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）５
００μｌ中に移し、インキュベーション（３７℃、１５
分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて
反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定
し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。２０
ｎｇ／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値の平均
値、標準偏差、ＣＶを算出した。同様に、ＣＥＡ標準溶
液２．５、５、１０ｎｇ／ｍｌ及び０ブランクの測定も
各々１０回繰り返し行い、測定値の平均値、標準偏差、
ＣＶを算出した。結果を表２に示す。
抗体を用いたＥＩＡによるＣＥＡの測定 実施例２と比較するため、シープ抗マウスＩｇＡポリク
ローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により
ＣＥＡの測定を行った。 ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体の製造 実施例２．ａ）に準じた。 ｂ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＩｇＧ１サブクラ
ス）結合ガラスビーズの作製 実施例２．ｂ）に準じた。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識シープ抗マウスＩｇＧ２ａポ
リクローナル抗体の作製シープ抗マウスＩｇＧ２ａポリ
クローナル抗体（バインディングサイト社製）を文献
［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、
エトール；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAW
A,E.ISHIKAWA,et.al.;J.Biochem.）, Vol.92（1982） 1
413-1424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合
し、ペルオキシダーゼ標識シープ抗マウスＩｇＧ２ａポ
リクローナル抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清ア
ルブミン含有緩衝液で１０〜５０００倍に希釈して使用
した。 ｄ）ＣＥＡ標準溶液の調整 実施例２．ｅ）に準じた。 ｅ）ＣＥＡ標準溶液の測定 ＣＥＡ２０ｎｇ／ｍｌを含む標準溶液５０μｌ、抗ＣＥ
Ａモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａサブクラス）１０μ
ｇ／ｍｌ含有０．０２Ｍリン酸緩衝液１００μｌ及び１
％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液３００
μｌを入れた試験管に抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ１サブクラス）結合ガラスビーズを１個入れインキ
ュベーション（３７℃、１５分間）したのち、生理食塩
水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識
シープ抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル抗体含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、イン
キュベーション（３７℃、１５分間）した。再度、生理
食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液
（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）５
００μｌ中に移し、インキュベーション（３７℃、１５
分間）したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて
反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定
し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を測定した。２０
ｎｇ／ｍｌの測定を１０回繰り返し行い、測定値の平均
値、標準偏差、ＣＶを算出した。同様に、ＣＥＡ標準溶
液２．５、５、１０ｎｇ／ｍｌ及び０ブランクの測定も
各々１０回繰り返し行い、測定値の平均値、標準偏差、
ＣＶを算出した。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【発明の効果】本発明の測定方法によれば、従来の第三
抗体に第一抗体、第二抗体と異なる種の動物由来の抗体
を用いた測定方法に比較して高感度な測定が可能とな
る。即ち、第三抗体に第一抗体及び第二抗体とは異なる
種の動物由来の抗体を使った場合は、第三抗体の特異性
が不十分なことから、一部第二抗体以外の物質との結合
がおき、十分な感度が得られないこともあるが、本発明
の免疫測定方法によれば、第三抗体として第一抗体、第
二抗体と同じ種の動物由来のモノクローナル抗体を用い
ているため、より高い特異性が得られ、測定感度を向上
させることができる。以上の点から、本発明は、特に高
感度の測定が要求される血清またはその他の体液中に極
微量含まれている腫瘍関連抗原、ホルモン、ウイルスな
どの検出に応用でき、かつ、これらの検出時間を短縮す
ることができる。
抗体に第一抗体、第二抗体と異なる種の動物由来の抗体
を用いた測定方法に比較して高感度な測定が可能とな
る。即ち、第三抗体に第一抗体及び第二抗体とは異なる
種の動物由来の抗体を使った場合は、第三抗体の特異性
が不十分なことから、一部第二抗体以外の物質との結合
がおき、十分な感度が得られないこともあるが、本発明
の免疫測定方法によれば、第三抗体として第一抗体、第
二抗体と同じ種の動物由来のモノクローナル抗体を用い
ているため、より高い特異性が得られ、測定感度を向上
させることができる。以上の点から、本発明は、特に高
感度の測定が要求される血清またはその他の体液中に極
微量含まれている腫瘍関連抗原、ホルモン、ウイルスな
どの検出に応用でき、かつ、これらの検出時間を短縮す
ることができる。
Claims (3)
- 【請求項１】 測定の対象となる抗原性物質に、 不溶性固体と結合しており、且つこの抗原性物質を認
識するモノクローナル抗体（第一抗体）、 この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異なるク
ラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）
及び 標識物質により標識されており、且つ第二抗体のクラ
ス又はサブクラスを認識するモノクローナル抗体（第三
抗体） を結合させて得た免疫複合体中の標識物質量を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法であり、且つ
第一抗体、第二抗体及び第三抗体が同じ種の動物由来の
モノクローナル抗体であることを特徴とする抗原性物質
の免疫測定法。 - 【請求項２】 第一抗体、第二抗体及び第三抗体がマウ
ス由来のモノクローナル抗体である請求項１記載の免疫
測定法。 - 【請求項３】不溶性固体と結合しており、且つ測定の
対象となる抗原性物質を認識するモノクローナル抗体
（第一抗体）、 この抗原性物質を認識し、且つ第一抗体とは異なるク
ラス又はサブクラスのモノクローナル抗体（第二抗体）
及び 標識物質により標識されており、且つ第二抗体のクラ
ス又はサブクラスを認識する標識モノクローナル抗体
（第三抗体） の組合せからなる免疫測定試薬において、第一抗体、第
二抗体及び第三抗体が同じ種の動物由来のモノクローナ
ル抗体であることを特徴とする免疫測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3254363A JPH0782019B2 (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 免疫測定法及び免疫測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3254363A JPH0782019B2 (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 免疫測定法及び免疫測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06130063A JPH06130063A (ja) | 1994-05-13 |
| JPH0782019B2 true JPH0782019B2 (ja) | 1995-09-06 |
Family
ID=17263951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3254363A Expired - Fee Related JPH0782019B2 (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 免疫測定法及び免疫測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0782019B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
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-
1991
- 1991-09-05 JP JP3254363A patent/JPH0782019B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06130063A (ja) | 1994-05-13 |
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