JPH0532705B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、完全抗原の新しいタイプの免疫化学
的測定方法及びその方法を利用するのに適した新
しいタイプの測定試薬に関する。 とくに、本発明は例えば血液、尿その他の体液
や体液成分などの如き被検体中の微量な抗原を免
疫化学的に測定する測定方法及びその試薬に関
し、優れた確実性、信頼度、精度、敏感性及び高
い特異性をもつて、偽反応生起のトラブルを伴う
ことなしに、再現性良く安定且つ容易な操作で、
短時間に被検体中の微量な抗原を免疫化学的に測
定できる新しいタイプの測定方法及びその方法に
利用するに適した新しいタイプの測定試薬に関す
る。 更に詳しくは、本発明は、 (A) 完全抗原感作担体及び (B) 上記抗原に対する単一種のモノクロナル抗体
感作担体 を用い、被検体中の該抗原による上記(A)及び(B)両
試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴と
する上記抗原の免疫化学的測定方法に関する。本
発明はまた、 (A) 完全抗原感作担体及び (B) 上記抗原に対する単一種のモノクロナル抗体
感作担体 から成ることを特徴とする上記抗原の免疫化学的
測定試薬にも関する。 従来、例えば血液、尿その他の体液や体液成分
などの如き検体中に存在する生物学的活性を有す
る微量物質を、免疫化学的手段で測定する方法は
古くから知られている。かかる免疫化学的測定法
として、例べば赤血球を担体として用い、これを
抗原又は抗体で感作し、これを被検液中の抗体又
は抗原と反応させ、その際、免疫化学的凝集又は
凝集阻止反応を生起させて、該微量物質を測定す
る方法も既に知られている。また、担体として赤
血球の代りに、非生物学的粒子として例えば合成
樹脂ラテツクス、ベントナイト、コロジオン、コ
レステロール結晶、水晶等を免疫化学反応におけ
る固体担体として用いることも知られている（以
上例えば特開昭50−82230号公開公報）。 このような抗原抗体反応を利用した免疫化学的
手法によつて被検体中の抗原の存在（定性）もし
くはその濃度（定量）を測定検出するのに従来も
つとも普通に利用されてきた抗体感作担体は、ポ
リクロナル抗体感作担体であつた。 1975年C.Milsteinらがマウスのミエローマ細胞
と脾臓中の抗体産生細胞とを細胞融合し、該細胞
からモノクロナル抗体の産生に成功して以来、細
胞融合技術分野における著るしい技術の進歩に伴
つて、モノクロナル抗体産生細胞株の形成、それ
を利用したモノクロナル抗体の産生が容易とな
り、このようなモノクロナル抗体を利用した抗原
の免疫化学的測定方法に関する提案がなされるよ
うになつた。 このような提案として、特開昭57−86051号の
提案が知られている。この提案に於ては、２個又
はそれ以上の異種類のモノクロナル抗体が同一の
抗原に対応して用いられることを特徴とし、少く
とも２個の抗体分子に抗原を結合させる免疫化学
的反応を利用した抗原定量法が提案されている。
そして、この提案には、従来の抗体すなわちポリ
クロナル抗体が対応抗原と反応して沈殿物を生ず
る公知現象とは全く異なつて、モノクロナル抗体
は対応抗原と結合して沈殿物を生成することがな
く、モノクロナル抗体で被覆された例えば赤血
球、ラテツクス球、金属粒子などの如き担体粒子
が対応抗原の存在下で凝集しないことが記載され
ている。 この提案に於ては、従来公知の知見とは異つ
て、モノクロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿
物を生成しないという事実があるにも拘わらず、
複数種の異種モノクロナル抗体を使用すると抗原
と結合して沈殿物を生成できるという新しい知見
が得られたことを記載し、それゆえに、この提案
においては、上述のとおり、少なくとも二種の異
種モノクロナル抗体の使用を必須とする抗原定量
法に特定されている。 更に、この提案には、このような複数種の異種
モノクロナル抗体の使用によつてもなお、測定の
感度と特異性に関して必ずしも好結果が得られる
わけではなく、全く効果的ではないことさえあり
得るため、可能な限りの結合の仕方を試みた上で
検討選択しなければならないことを記述してい
る。 このような複数種の異種モノクロナル抗体の使
用を必須とする類似の提案として、特開昭57−
118159号の提案も知られている。 そして、これらモノクロナル抗体を利用する抗
体原の免疫化学的測定方法に関する従来提案に於
ては、従来のポリクロナル抗体の場合とは異なつ
て、単一種のモノクロナル抗体は対応抗原と結合
して沈殿物を生成せず、複数種の異種モノクロナ
ル抗体の使用によつてはじめて沈殿物を生成でき
るという事実から当然のことながら、複数種の異
種モノクロナル抗体の使用が必須であるという点
で共通している。 しかしながら、前者の提案に記載されているよ
うに、モノクロナル抗体と対応抗原との凝集を生
じさせるために複数種の異種モノクロナル抗体を
担体に感作し、その感作担体を使用してもなお、
測定の感度と特異性に関して必ずしも好結果が達
成できるとはかぎらない欠陥があり、更には、利
用し得るような凝集さえ生ぜず、全く効果的でな
いことさえあるという重大な技術的欠点があつ
た。そして、満足すべき凝集性を与えるために、
例えばより多種の異種モノクロナル抗体を使用す
ればするほど、当然のことながら、モノクロナル
抗体の利用による高い特異性の利点はより多く失
われていく不都合を伴うことが回避できなういと
いう両立し難い技術的課題が生じていた。 すなわち、モノクロナル抗体は抗原分子中の一
つの特定部位を特異的に認識する能力を有する抗
体であるが、二種以上より多種のモノクロナル抗
体を利用すればするほど、二種以上より多種の特
定部位を同時に認識する結果となり、モノクロナ
ル抗体の利用による高い特異性の利点がより多く
失われていくという両立し難い技術的課題を伴
う。更に又、抗原分子の多数の部位を認識できる
従来のポリクロナル抗体利用の場合とは異なつ
て、上述したように、モノクロナル抗体は一つの
特定部位しか認識しないので、ポリクロナル抗体
利用の場合に比して、凝集反応における凝集性は
著るしく弱いことが予期され、事実、上述したよ
うに、モノクロナル抗体利用の従来提案において
は単一のモノクロナル抗体の利用では対応抗原と
結合して沈殿物を生成しないので複数種の異種モ
ノクロナル抗体の利用が必須であることを教え、
更に、前述した前者の提案においては、複数種の
異種モノクロナル抗体を利用してもなお、凝集が
生じない場合があるという技術的欠陥のあること
を開示している。 本発明者等は、モノクロナル抗体を免疫化学的
な抗原測定法に利用する際の上述の如き両立し難
い技術的課題ないし技術的欠陥を解決できる方法
を開発すべく研究を行つてきた。 その結果、モノクロナル抗体利用における前記
従来知見とは全く異なつて、完全抗原を担体に感
作させた完全抗原感作担体の場合には、該抗原に
対する単一種のモノクロナル抗体を担体に感作さ
せた単一種のモノクロナル抗体感作担体との間
に、満足すべき凝集反応が生起し、斯くて、モノ
クロナル抗体利用における従来知見に必須であつ
た複数種の異種モノクロナル抗体を利用する必要
が全くないという予想外の新しい知見を得た。 このモノクロナル抗体利用における全く新しい
知見に基いて更に研究を進めた結果、(A)完全抗原
感作担体及び(B)上記抗原に対する単一種のモノク
ロナル抗体感作担体の組み合わせから成る新しい
タイプの試薬を用い、被検体中の該抗原による上
記(A)及び(B)両試薬成分の凝集反応に対する凝集阻
止反応を測定するという新しいタイプの免疫化学
的な完全抗原測定方法が提供でき、顕著に優れた
確実性、信頼度、精度、感度及び顕著に高い抗原
特異性をもつて、偽反応生起のトラブルを伴うこ
となしに、優れた再現性、安定性且つ容易な操作
で、短時間に被検体中の微量な抗原を免疫化学的
に測定できることを見い出した。 更に又、上記の顕著に優れた作用効果は、対象
完全抗原に対するモノクロナル抗体の種類に実質
的な影響を受けない利点を有し、斯くて広汎な任
意の抗原の免疫化学的測定方法に適用可能である
ことがわかつた。 従つて、本発明の目的はモノクロナル抗体を利
用した完全抗原の新しいタイプの免疫化学的測定
方法及びその方法に利用するのに適した新しいタ
イプの測定試薬を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
ばに利点は、以下の記載から一層明らかなとなる
であろう。 本発明に於いて完全抗原とは、生体内に於てそ
れ自体で抗体産性能を有する抗原を意味し、生体
内に於てそれ自体では抗体産生能を有しないハプ
テン（不完全抗原）を除外する意味である。換言
すると、それ自体で抗原性を有する抗原を指す。 このような完全抗原として任意の抗原が利用で
き、例えば、以下の如き抗原を例示することがで
きる。 （） ペプチドホルモンとしては、例えば (i) 成長ホルモン（GH）、副腎皮質刺激ホル
モン（ACTH）、メラミン細胞刺激ホルモン
（MSH）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモ
ン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）、卵胞
刺激ホルモン（FSH）、オキシトシン等の下
垂体ホルモン、 (ii) カルシトニン、副甲状腺ホルモン等のカル
シウム代謝調節ホルモン、 (iii) インシユリン、プロインシユリン、膵グル
カゴン等の膵ホルモン、 (iv) ガストリン、セレクチン等の消化管ホルモ
ン、 (v) アンデオテンシン、ブラジキニン等の血管
に作用するホルモン、 (vi) ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（hCG）、ヒ
ト脱盤催乳ホルモン（hPL）等の胎盤ホルモ
ン、 等をあげることができ、また、 （） ホルモン以外の物質としては、例えば (i) 前立腺性酸性フオスフアターゼ（PAP）、
アルカリ性フオスフアターゼ、トランスアミ
ナーゼ、乳酸脱水素酵素、トランスアミナー
ゼ、トリプシン、ペプシノーゲン等の酵素 (ii) α−フエトプロテイン（AFP）、ガン胎児
性抗原（CEA）等のガン特異物質 (iii) 免疫グロプリンＧ（IgG）、フイブリン−フ
イブリノゲン分解産物（FDP）、抗トロンビ
ン（AT）、トランスフエリン等の血清
タンパク成分、 (iv) その他として、リユマチ因子、セロトニ
ン、ウロキナーゼ、フエリチン、サブスタン
スＰ等の物質 等々の生体内に存在する成分及び代謝産物の如く
多くの完全抗原類をあげることができる。 本発明の完全抗原類は、しかし、上記例示の完
全抗原類に限定されるものではない。 本発明で利用する上記例示の如き完全抗原に対
するモノクロナル抗体は、細胞融合技術分野にお
いてそれ自体公知の手法を適宜に選択組み合わせ
てモノクロナル抗体産生融合細胞株を形成し、該
細胞株を利用して産生、取得することができる。 その一態様によれば、上記例示の如き完全抗原
を用いて、これを適当な動物たとえばマウス、ラ
ツト、ウサギ、ヒツギ、ウマ、ウシなどの如き動
物に、投与たとえばアジユバントと共に皮下注射
の如き手法で投与して、該動物を免疫したのち、
この免疫動物たとえば免疫マウスの該抗原に対す
る抗体産生細胞たとえば脾細胞、胸腺細胞、リン
パ節細胞および／または末梢血細胞の如き細胞を
採取し、該細胞と自己増殖性を有するが抗体産生
能を実質的に有しない適当な株化細胞たとえばマ
ウス骨髄腫株化細胞とを、それ自体公知の手法に
より細胞融合処理する。 単クローン性抗体を得るためのミエローマ細胞
と抗体産性細胞との組合せは、各細胞が融合して
増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、
それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定され
ず、任意の組合せでよい。 使用されるミエローマ細胞は特に限定はなく、
多くのマウス、ラツト、ウサギ、ヒトなどの動物
の細胞体を使用することができる。好ましい株化
細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ末融合のミ
エローマ細胞が選択培地で生存せず、一方融合細
胞のみが生存するようなものが良い。最も普通に
用いられるものは８−アザグアニジン抵抗性の株
化細胞で、これはヒポキサンチン・グアニン・ホ
スホリボシル・トランスフエラーゼを欠損し、ヒ
ボキサンチン・アミンプテリン・チミジン
（HAT）培地に育生できない性質を有している。
さらに使用する株化細胞は「非分泌型」のもので
あることが好ましい。例えばマウスミエローマ
MOPC−21株由来のP₃／×63−Ag8U₁（P₃U₁）、
P₃／×63−Ag8・６・５・３、P₃／NSI−１−
Ag4−１、Sp2／Ｏ−Ag14、ラツトミエローマ
210・RCY3・Ag1・２・３などが好適に用いら
れる。 該細胞融合処理は、例えば、通常イーグル最少
基本培地（MEM）、RPMI−1640などの培地中で
上記免疫マウスの脾細胞１〜５×10⁸個と上記マ
ウス骨髄腫株化細胞１〜５×10⁷個とを、混合し
て行なうことができる。融合促進剤としては、平
均分子量1000〜6000のポリエチレングリコール
（PEG）が好ましく、他の融合促進剤、例えば、
ポリビニルアルコール、ウイルスなどを使用する
ことができる。PEGの使用濃度は約30〜50％で
用いることができる。 上述のようにして得ることのできる融合細胞含
有系から融合細胞を、それ自体公知の手法を利用
して、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及
びクローニング処理して、免疫マウスと形成に用
いた完全抗原に対するモノクロナル抗体産生能を
有し且つ自己増殖能を持つ融合細胞株を取得する
ことができる。 上記融合細胞の選別処理は、例えば、20％ウシ
胎児血清含有RPMI−1640培地なで細胞融合を終
えた細胞を適当に希釈し、96穴マイクロプレート
に10⁵〜10⁶／ウエル程度に分注し、各ウエルに選
択培地（たとえばHAT培地）を加え、以後選択
培地交換を行いながら、５％CO₂培養器（37℃）
で培養を続けることにより行うことができる。ミ
エローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を
用いれば、末融合のミエローマ細胞はHAT培地
で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なのでin
vitro培養では長期間生育できない。したがつて
培養後10〜14日ぐらいから生育してくる細胞は全
く融合細胞である。 上述のようにして得ることのできる融合細胞株
の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング
処理は、常法により行うことができるが例えば、
以下のようにして行うことができる。 融合細胞の生育したウエルの培養上清の一部を
採取し、一定量の標識抗原とインキユベーシヨン
し、標識抗原との結合能を測定することにより、
目的とする抗体を分泌しているウエルを検索する
ことができる。即ち、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどのラジオア
イソトープあるいは酵素などで標識した抗原と培
養上清を反応させた後、各反応液について抗原−
抗体結合物を分離し、標識量を測定することによ
り、目的とする抗体の存在および結合能を検索す
ることができる。 目的とする抗体活性の認められる各ウエル中に
は２種以上の融合細胞が生育している可能性があ
るので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成
法によりクローニングを行い、モノクロナル抗体
産生融合細胞株を得ることができる（このような
モノクロナル抗体産生融合細胞株は微工研の寄託
受託拒否対象である。） 上述のようにして得ることのできるモノクロナ
ル抗体産生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成
に用いた完全抗原に対するモノクロナル抗体を取
得するには、該モノクロナル抗体産生細胞株を、
例えば適当な培地に培養し、培地からモノクロナ
ル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物
と同系の動物に該細胞株を移植し腹水中のモノク
ロナル抗体を採取する方法など、それ自体公知の
手法を利用して取得することができる。 上記前者の態様によれば、例えば、モノクロナ
ル抗体産生融合細胞株を10％ウシ胎児血清含有
RPMI1640培地などの培養液で培養し、その培養
上清液を硫安分画、抗原を結合させたセフアロー
ス4Bなどのアフイニテイークロマトグラフイー
などによつて精製することにより目的とするモノ
クロナル抗体を採取することができる。 又、上記後者の態様によれば、例えば、同系動
物にプリスタン（２，６，10，14−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した
後、融合細胞を腹腔内投与することによりin
vivoで融合細胞を大量に増殖させる。その結果、
形成される腹水には高濃度のモノクロナル抗体が
含まれている。この腹水から硫安分画及び必要に
応じて前記アフイニテイークロマトグラフイーな
どにより、目的とするモノクロナル抗体を取得す
ることができる。 上述のようにして取得できるようなモノクロナ
ル抗体は市販品として入手することも可能であ
り、利用できる。 本発明によれば、前記例示の如き完全抗原を適
当な担体に感作させた(A)完全抗原感作担体と、上
述のようにして取得できる上記抗原に対するモノ
クロナル抗体の単一種を適当な担体に感作させた
(B)上記抗原に対する単一種のモノクロナル抗体感
作担体との組み合わせから成ることを特徴とする
上記抗原の免疫化学的測定試薬が提供できる。 このような感作担体の調製に利用する担体とし
ては、従来より免疫化学的凝集反応および凝集阻
止反応において一般的に用いられる微粒子の担体
を使用することができ、例えばヒト、羊、ウサギ
などの赤血球、細菌の細胞などの生物学的粒子、
高分子ラテツクス、ベントナイト、コロジオン、
コレステロール結晶、シリカ、カオリンなどの非
生物学的粒子などの如き担体を挙げることができ
る。 このような担体の中で、高分子ラテツクス担体
の例としては、ポリスチレンラテツクス、スチレ
ン−ブタジエンコポリマーラテツクス、ポリビニ
ルトルエンラテツクス、ビニルトルエン・ｔ−ブ
チルスチレンコポリマーラテツクス、スチレン−
メタアクリレートコポリマーラテツクスなどおよ
び官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基
又はカルボアミド基（−CONH₂）を有し、且つ
基体が前記ラテツクスから成る反応性高分子ラテ
ツクスなどを挙げることができる。 上記例示の如き高分子ラテツクス担体の粒子サ
イズは適宜に選択できるが、例えば、平均粒径が
約0.01〜約２ミクロンのものが使用でき、特に平
均粒径が約0.05〜約1.5ミクロンのものが好まし
い。又、他の非生物学的担体についても上記高分
子ラテツクス担体と同様に平均粒径約0.01〜約２
ミクロンのものが使用できる。 上記例示の如き担体に、完全抗原もしくは該抗
原に対するモノクロナル抗体を感作させる手法は
種々知られており、本発明において適宜に選択利
用できる。このような感作手法としては、担体に
これらを吸着させる手法及び化学的に結合させる
手法のいずれの手法も利用することができ、本発
明に於て、完全抗原感作担体もしくはモノクロナ
ル抗体感作担体と称するものは、これらの任意の
手法を適宜に選択利用して担体に完全抗原もしく
はモノクロナル抗体を担持させたすべての感作担
体を意味する。 以下、その数態様について更に詳しく説明す
る。 完全抗原及びモノクロナル抗体感作担体の調製
態様：− 完全抗原またはモノクロナル抗体を吸着により
担体に感作するには、完全抗原またはモノクロナ
ル抗体の溶液と担体の懸濁液を混合することによ
り、容易に完全抗原感作担体あるいはモノクロナ
ル抗体感作担体を得ることができる。 完全抗原及び抗体は多くの場合カルボキシル基
と第１級アミノ基の双方を有する。抗原またはモ
ノクロナル抗体を化学的に担体に結合させるに
は、例えば前記官能基を有する反応性高分子ラテ
ツクスと完全抗原又はモノクロナル抗体をカルボ
ジイミド法、カルボニルジイミダゾール法、混合
酸無水物法、活性エステル法などの一つを適宜選
択して用い、結合することにより完全抗原感作担
体あるいはモノクロナル抗体感作担体を得ること
ができる。 また赤血球を担体として用い、完全抗原又はモ
ノクロナル抗体を感作するには、例えば赤血球を
ホルマリン、グルタルアルデヒド又はピルビンア
ルデヒド等の適切なもので固定化した固定赤血球
を用い、必要に応じタンニン酸あるいはビスジア
ゾベンチジン（BDB）やグルタルアルデヒド等
の縮合剤を用いて感作させ、完全抗原感作血球あ
るいはモノクロナル抗体感作血球を得ることがで
きる。 たとえば上述のようにして調製できる(A)完全抗
原感作担体と(B)上記抗原に対する単一種のモノク
ロナル抗体感作担体の組み合せから成る本発明の
免疫化学的測定試薬としては、下記の如き測定試
薬を例示することができる。 (1)Ａ：前立腺性酸性フオスフアターゼ（PAP）
感作ラテツクスと Ｂ：抗PAPモノクロナル抗体感作ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 (2)Ａ：α−フエトプロテイン（AFP）感作ラテ
ツクスと Ｂ：抗AFPモノクロナル抗体感作ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 (3)Ａ：ヒト胎盤催乳ホルモン（hPL）感作ラテツ
クスと Ｂ：抗hPLモノクロナル抗体感作ラテツクス よりなる免疫化学的測定試薬、 (4)Ａ：ヒト絨毛性性腺刺激乳ホルモン（hCG）感
作ラテツクスと Ｂ：抗hCGモノクロナル抗体感作ラテツクスよ
りなる免疫化学的測定試薬、 (5)Ａ：ヒト生長ホルモン（hGH）感作ラテツク
スと Ｂ：抗hGHモノクロナル抗体感作ラテツクス
よりなる免疫化学的測定試薬、 (6)Ａ：ガン胎児性抗原（CEA）感作ラテツクス
と Ｂ：抗CEAモノクロナル抗体感作ラテツクス
よりなる免疫化学的測定試薬、 (7)Ａ：フイブリン・フイブリノゲン分解産物
（FDP）感作ラテツクスと Ｂ：抗FDPモノクロナル抗体感作ラテツクス
よりなる免疫化学的測定試薬、 (8)Ａ：抗トロンビン（AT）感作ラテツクス
と Ｂ：抗ATモノクロナル抗体感作ラテツクス
よりなる免疫化学的測定試薬、 (9)Ａ：PAP感作赤血球と Ｂ：抗PAPモノクロナル抗体感作赤血球より
なる免疫化学的測定試薬、 (10)Ａ：AFP感作赤血球と Ｂ：抗AFPモノクロナル抗体感作赤血球より
なる免疫化学的測定試薬、 (11)Ａ：hCG感作赤血球と Ｂ：抗hCGモノクロナル抗体感作赤血球よりな
る免疫化学的測定試薬、 (12)Ａ：AFP感作血球と Ｂ：抗AFPモノクロナル抗体感作赤血球より
なる免疫化学的測定試薬、 等々を挙げることができるが、本発明の試薬は上
記に掲げる具体例の例示に限定されるものではな
い。 本発明によれば、上述の如き新しいタイプの測
定試薬を利用した完全抗原の新しいタイプの免疫
化学的測定方法が提供できる。この測定方法によ
れば、(A)完全抗原感作担体及び(B)上記抗原に対す
る単一種のモノクロナル抗体感作担体の組み合わ
せを用い、被検体中の該抗原による上記(A)及び(B)
両試薬成分の凝集を阻止する凝集阻止反応を測定
することにより、上記抗原を免疫化学的に測定す
ることができる。測定は、被検体中の抗原の存在
を測定検出する定性的な測定及び被検体中の抗原
の濃度を測定検出する定量的な測定のいずれの態
様によつても行なうことができる。被検体の例と
しては、尿、血清、血漿、羊水などの如き体液も
しくは体液成分を例示することができる。以下、
本発明の免疫化学的測定方法について更に詳しく
説明する。 血液、尿その他の体液中に存在する微量物質は
前記試薬を用いて凝集阻止反応により定量するこ
とができる。具体的な測定法は実施例として示し
たが、一般的な測定法は次に述べる通りである。 原理的には完全抗原感作担体とモノクロナル抗
体感作担体の凝集反応系を用いた凝集阻止反応で
ある。すなわち、(1)例えば、清浄なスライド板上
に１滴の試薬検体（適宜希釈）を置き、その上に
１滴の前記モノクロナル抗体感作ラテツクスを滴
下し、次いで完全抗原感作ラテツクス１滴を滴下
した後、三者を混合し、２分間揺動することによ
り、試験の結果が観察され、凝集像を陰性、凝集
阻止像（非凝集像）を陽性と判定する。 (2)清浄な丸底試験管に検体（適宜希釈）の一定
量を入れ、これにモノクロナル抗体感作血球懸濁
液の一定量を加えて振盪混和後、抗原感作血球懸
濁体の一定量を加えて振盪混和し、ミラー付スタ
ンドに静置し、２時間後に管底像を観察する。こ
の場合、凝集阻止像（陽性像）は沈降リングを形
成し、凝集像（陰性像）はマツト状を呈する。 検体中の抗原濃度は、検体を適宜希釈して試験
を行い、陽性像を呈する最高希釈倍数に測定感度
を乗ずることにより求めることができる。 本発明の(A)完全抗原感作担体及び(B)上記抗原に
対する単一種のモノクロナル抗体感作担体の組み
合わせからなる該抗原の免疫化学的測定試薬及び
これを用いた該抗原のの免疫化学的測定方法によ
れば、モノクロナル抗体利用の従来技術において
は、単一種のモノクロナル抗体の利用によつては
対応抗原と結合して沈殿物を生成しないので二以
上複数種の異種モノクロナル抗体の使用が必須で
あつたにも拘わらず、全く意外なことに、上記(A)
及び(B)両試薬の間には満足すべき凝集反応が生ず
る。斯くて、本発明によれば、抗原分子中の一つ
の特定部位を特異的に認識する能力を有するモノ
クロナル抗体の単一種と抗原との組み合わせによ
る凝集反応であるため、顕著に高い特異性が達成
できる特色がある。更に、上記(A)及び(B)両試薬の
間の凝集反応で形成される凝集像は、予想外なこ
とにも、従来のポリクロナル抗体を用いたものよ
りも強い凝集性を示す鮮明な凝集像となる特色が
ある。又更に、モノクロナル抗体利用の従来技術
においては、二以上の異種モノクロナル抗体を使
用してもなお、全く効果的でないことさえあると
いうトラブルがあつたにも拘わらず、本発明によ
ればそのようなトラブルから解放され、広汎な任
意の抗原の免疫学的測定方法に適用可能となる特
色を有する。 本発明によれば、上述の如き特色を持つたモノ
クロナル抗体利用の新しいタイプの免疫化学的測
定試薬及び測定方法が提供でき、顕著に優れた確
実性、信頼度、精度、感度及び顕著に高い特異性
をもつて、偽反応生起のトラブルを伴うことなし
に、優れた再現生、安定性で且つ容易な操作で、
短時間に被検体中の微量の抗原を免疫化学的に測
定することができる。 実施例 １ 前立腺性酸性フオスフアターゼ（PAP）の測
定（） (a) PAP感作ラテツクスの製造 PAP50μｇを５mlのグリシン緩衝化食塩液
（PH8.2）を溶解し、これに10％ポリスチレンラ
テツクス１mlを加えて混合し、室温で２時間処
理した。次いで遠心分離し、得られた沈殿をグ
リシン緩衝化食塩液にて遠心洗浄し、沈殿を
0.05％にBSA（ウシ血清アルブミン）を含むグ
リシン緩衝化食塩液10mlに懸濁し、PAP感作
ポリスチレンラテツクスを製造した。 (b) 抗PAPモノクロナル抗体感作ラテツクスの
製造 抗PAPモノクロナル抗体0.2mgを５mlのグリ
シン緩衝化食塩液（PH8.2）を溶解し、これに
10％ポリスチレンラテツクス１mlを加えて混合
し、56℃で30分間処理した。次いで遠心分離し
て得た沈殿をグリシン緩衝化食塩得にて遠心洗
浄し、沈殿を0.05％にBSAを含むグリシン緩衝
化食塩液20mlにて懸濁させ、抗PAPモノクロ
ナル抗体感作ポリスチレンラテツクスを製造し
た。 (c) PAPの測定 前立腺癌患者血清５検体および健常人血清３
検体について原血清及びグリシン緩衝化食塩液
（PH8.2）で５、10、20、40及び80倍に希釈し、
各希釈検体の１滴（0.03ml）を反応スライド板
上に滴下し、これに(d)で製造した抗PAPモノ
クロナル抗体感作ラテツクスを各１滴ずつ滴下
し、次いで(c)で製造したPAP感作ラテツクス
を各１滴ずつ滴下する。この三者を均一に混合
し、２分間揺動後、肉眼で凝集像、凝集阻止像
を観察した、尚、本実施例においてはその試薬
の感度を10nｇ／ml調整してあるので各検体の
PAP濃度は第１表に示す値であつた。

【表】 実施例 ２ PAPの測定（） (a) PAP感作血球の製造 ホルマリン固定羊血球の４％懸濁液（リン酸
緩衝化食塩液、PH6.4）に等量の0.01％タンニ
ン酸溶液を加えて56℃30分反応させた後、リン
酸緩衝化食塩液にて血球を洗浄し、８％懸濁液
とした。次いでPAP0.005％溶液を等量加え、
37℃１時間反応させた。反応終了後、リン酸緩
衝化食塩液にて血球を遠心洗浄し、0.2％に
NRS（正常ウサギ血清）、５％に乳糖を含むリ
ン酸緩衝化食塩液にて0.75％血球濃度に希釈
し、0.1mlずつ分注した後、凍結乾燥してPAP
感作血球を製造した。 (b) 抗PAPモノクノナル抗体感作血球の製造 ホルマリン固定羊血球の４％懸濁液（リン酸
緩衝化食塩液、PH6.4）に等量の0.01％タンニ
ン酸溶液を加えて、56℃30分反応させた後、リ
ン酸緩衝化食塩液にて血球を洗浄して８％懸濁
液とした。次いで抗PAPモノクロナル抗体の
0.001％溶液を等量加え56℃で２時間反応させ
る。反応終了後、リン酸緩衝化食塩液にて血球
を遠心洗浄し、0.2％にＮ乙Ｓ、５％に乳糖を
含むリン酸緩衝化食塩液にて0.75％血球濃度に
希釈し、0.1mlずつ分注した、次いで凍結乾燥
して抗PAPモノクロナル抗体感作血球を製造
した。 (c) PAPの測定 前立腺癌患者血清及び健常人血清について、
それぞれをリン酸緩衝化食塩液で５、25、50、
100、200、400倍に希釈し、各希釈検体を丸底
小試験管に0.1mlずつ分注し、次いで、上記(b)
で製造した抗PAPモノクロナル抗体感作血球
１アンプルをリン酸緩衝化食塩液0.2mlで懸濁
させた全量を、それぞれに添加し、混合した
後、前記(a)で製造したPAP感作血球１アンプ
ルをリン酸緩衝化食塩液0.2mlで懸濁させた全
量をそれぞれに添加してよく撹拌し、ミラー付
スタンドに静置し、２時間後の管底像により判
定した。本実施例では測定感度を2nｇ／mlに
調整してあるので、各検体のPAP濃度は第２
表に示す値であつた。

【表】

【表】 実施例 ３ ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の測定 (a) 抗hCGモノクロナル抗体感作ラテツクスの製
造 抗hCGモノクロナル抗体を用い、実施例１−
(b)と同様にして、抗hCGモノクロナル抗体感作
ラテツクスを製造した。 (b) hCG感作ラテツクスの製造 hCG（比活性9600IU／mg）100μｇを５mlの精
製水に溶解した。該溶液にカルボキシモデイフ
アイドラテツクスの10％懸濁液１mlを加えて混
合し、次いで10mgの１−エチル−３（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイド
ロクロライドを加え、撹拌下に一夜反応を行つ
た。反応終了後、遠心分離して得た沈殿をグリ
シン緩衝化食塩液で洗浄し、沈殿を0.1％に
BSAを含むグリシン緩衝化食塩液10mlで懸濁
させ、56℃で30分間反応させた。反応後、遠心
分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液で洗
浄し、同緩衝液10mlに懸濁させてhCG感作ラテ
ツクスを製造した。 (c) hCGの測定 妊婦尿５検体及び正常婦人尿３検体につい
て、前記(a)で製造した抗hCGモノクロナル抗体
感作ラテツクスと上記(b)で製造したhCG感作ラ
テツクスとを用いて実施例１−(c)と同様な操作
により、hCGを測定した。 尚、この実施例で用いた試薬の感度を
0.5IU／mlに調整してあるので、各検体のhCG
濃度は第３表に示す値であつた。

【表】 実施例 ４ ヒト胎盤性ラクトゲン（hPL）の測定 (a) 抗hPLモノクロナル抗体感作ラテツクスの製
造 抗hPLモノクロナル抗体を用い、実施例１(b)
と同様な方法で、抗hPLモノクロナル抗体感作
ラテツクスを製造した。 (b) hPL感作ラテツクスの製造 実施例１−(a)と同様な方法で、hPL感作ラテ
ツクスを製造した。 (c) hPLの測定 妊婦血清５検体及び対照として正常婦人血清
３検体について、前記(a)で製造した抗hPLモノ
クロナル抗体感作ラテツクスと上記(b)で製造し
たhPL感作ラテツクスとを用いて、実施例１−
(c)と同様な操作により、検体中のhPLを測定し
た。 尚、本実施例においては試薬の感度を0.5μ
ｇ／mlに調整してあるので、各検体のhPL濃度
は第４表に示す値であつた。

【表】 参考例 上記実施例で用いるモノクロナル抗体は例えば
次の様な操作により製造することができる。 (a) 精製PAPの製造 ヒト精漿200mlから硫酸アンモニウムによる
塩析（40％上清、75％沈殿）によりPAP粗抽
出物6.75ｇを得た。これをｐ−セルロースクロ
マトグラフイー（2.7×19cm）に対し、次いで
未吸着分画を濃縮し、0.1M酢酸緩衝液（１ｍ
MCaCl₂、MgCl₂、MnCl₂、0.1M NaCl、PH
5.0）で透析後、上記緩衝液で平衡化したコン
カナバリンＡ−セフアロースカラム（２×45
cm）に付した後、４℃で一晩インキユベートし
た。次いで上記緩衝液で蛋白質の流出がなくな
るまで洗浄し、α−メチル−Ｄ−マンノシドの
グラジユエントクロマトグラフイー（0.1M→
0.5M）を行い、酵素活性を有する分画を集め
濃縮した。次いで同画分を0.02Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラ
ム（３×40cm）に付し、同緩衝液で蛋白質の流
出がなくなるまで洗浄後、0.02Mリン酸緩衝液
（PH7.0）及び0.5M NaCl含有0.02Mリン酸緩衝
液（PH6.0）を用いてグラジユエントクロマト
グラフイーを行い、酵素活性分画を集め濃縮し
た。次いで、0.02Mクエン酸緩衝液（PH6.0）
で平衡化したセフアクリルＳ−200（26×84cm）
及びセフアデツクスＧ−100（2.6×88cm）によ
るゲル過で精製して、精製PAP128mgを得
た。 (b) 抗PAPモノクロナル抗体の製造 上記(a)で製造した精製PAP50μｇを完全フロ
イドアジユバンドと共にBALB／Ｃマウス
（６〜８週令）に３週間おきに皮下投与し、最
後に80μｇを静注した。 最後免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し
て、脾細胞を採取し、デルベコのモデイフアイド
最少基本培地（以下D′MEMと称す）で３回洗浄
した後、細胞数を算出し、その２×10⁸個をマウ
スミエローマ細胞P₃−NS−１／１−Ag4・１（以
下NS−１と称す）１×10⁷個と混合して遠心し細
胞を集めた。このペレツトに37℃に温めておいた
ポリエチレングリコール溶液（PEG−100：4.25
％、DMSO：1.5％含有D′MEM）を１ml加え、
１分間遠心管をゆつくり回転させて細胞融合を行
つた。37℃のD′MEMを30秒ごとに２mlずつ10回
加えたのち遠心分離し、ペレツトを20％ウシ胎児
血清含有RPMI−1640培地でNS−01として５×
10⁴個／0.2mlとなるように懸濁し、96ウエルマイ
クロプレートに0.2mlずつ分注し、５％CO₂培養
器で培養した。24時間後各ウエルの上清の半量を
すて、HAT培地（ヒポキサンチン・アミノプテ
リン・チミジン、10％ウシ胎児血清含有RPMI−
1640培地）を0.1ml加え、その後３〜４日ごとに
半量をHAT培地交換を行いながら２週間培養し
たのち、増殖したウエル中の培養上清の抗体活性
を測定した。 活性の認められたウエルの細胞をBALB／Ｃ
マウス胸腺細胞を含む10％ウシ胎児血清含有RPI
−1640培地で希釈し、限界希釈法によりクローニ
ングを行つて12株の抗モノクロナル抗体産生融合
細胞を得た。これを大量培養し、その培養上清か
らPAPを結合させたセフアロース4Bを用いたア
フイテイークロマトグラフイーに付し、モノクロ
ナル抗体を得た。また２×10⁶個以上の細胞をプ
リスタン0.5mlを予め投与したBALB／Ｃマウス
に腹腔内投与し、腹水腫瘍を作せて腹水を得たの
ち、この腹水をPAPを結合させたセフアロース
4Bを用いたアフイニテイークロマトグラフイー
によりモノクロナル抗体を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (A) 完全抗原感作担体及び (B) 上記抗原に対する単一種のモノクロナル抗体
   感作担体 を用い、被検体中の該抗原による上記(A)及び(B)両
   試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴と
   する上記抗原の免疫化学的測定方法。 ２ (A) 完全抗原感作担体及び (B) 上記抗原に対する単一種のモノクロナル抗体
   感作担体 から成ることを特徴とする上記抗原の免疫化学的
   測定試薬。