JPH0787784B2 - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents
セルラ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPH0787784B2 JPH0787784B2 JP14805487A JP14805487A JPH0787784B2 JP H0787784 B2 JPH0787784 B2 JP H0787784B2 JP 14805487 A JP14805487 A JP 14805487A JP 14805487 A JP14805487 A JP 14805487A JP H0787784 B2 JPH0787784 B2 JP H0787784B2
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- JP
- Japan
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- cellulase
- protease
- culture
- medium
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 近年、セルロースが安価なグルコース源として脚光をあ
び、それを発酵原料として工業用アルコールなどを大量
に安定供給する技術の開発が進められている。本発明は
このセルロースを効率よく分解しうる酵素を提供するも
のである。
び、それを発酵原料として工業用アルコールなどを大量
に安定供給する技術の開発が進められている。本発明は
このセルロースを効率よく分解しうる酵素を提供するも
のである。
セルラーゼは糸状菌、担子菌、放線菌、細菌など多種多
様の微生物によって生産されることが知られているが、
主にトリコデルマ属、アスペルギルス属、スポロトリク
ム属などの糸状菌がセルラーゼの生産に利用されてい
る。
様の微生物によって生産されることが知られているが、
主にトリコデルマ属、アスペルギルス属、スポロトリク
ム属などの糸状菌がセルラーゼの生産に利用されてい
る。
セルラーゼ産生菌は一般にプロテアーゼを副生し、糸状
菌は15〜20単位/ml程度を副生する。
菌は15〜20単位/ml程度を副生する。
セルロース産生能を有する糸状菌をセルラーゼ生産培地
で培養すると、しばしばセルラーゼ産生能の低下が起こ
る。また、糸状菌より得られたセルラーゼ製剤を用いて
膜リアクター中でセルロースの連続糖化を長時間繰返す
と糖化活性の低下が起こる。
で培養すると、しばしばセルラーゼ産生能の低下が起こ
る。また、糸状菌より得られたセルラーゼ製剤を用いて
膜リアクター中でセルロースの連続糖化を長時間繰返す
と糖化活性の低下が起こる。
本発明者らは、このような問題を解決すべく種々研究の
結果、プロテアーゼ副生量の低下した変異株を誘導する
ことによってセルラーゼ産生能も高く、しかも長時間安
定な糖化活性を示すセルラーゼ製剤が得られることを見
出し本発明を完成した。すなわち、本発明はセルラーゼ
産性能を有する糸状菌よりプロテアーゼ低下変位株を誘
導しその株をセルロースを含有する栄養培地に培養し、
培養物からセルラーゼを採取することを特徴とするセル
ラーゼの製造方法に関するものである。
結果、プロテアーゼ副生量の低下した変異株を誘導する
ことによってセルラーゼ産生能も高く、しかも長時間安
定な糖化活性を示すセルラーゼ製剤が得られることを見
出し本発明を完成した。すなわち、本発明はセルラーゼ
産性能を有する糸状菌よりプロテアーゼ低下変位株を誘
導しその株をセルロースを含有する栄養培地に培養し、
培養物からセルラーゼを採取することを特徴とするセル
ラーゼの製造方法に関するものである。
本発明に用いる糸状菌はセルラーゼ産性能を有するもの
から誘導する。このセルラーゼ産性能を有する糸状菌は
種々のものが知られているが、例えば、スポロトリクム
・セルロフィルム ATCC 20493（AJ 6987）、トリコデル
マ・リーセイATCC 26921（QM 9414）、アスペルギルス
・アクレアータス（AJII 7073）などがある。
から誘導する。このセルラーゼ産性能を有する糸状菌は
種々のものが知られているが、例えば、スポロトリクム
・セルロフィルム ATCC 20493（AJ 6987）、トリコデル
マ・リーセイATCC 26921（QM 9414）、アスペルギルス
・アクレアータス（AJII 7073）などがある。
これらから、プロテアーゼ産生能の低下した変異株を取
得する方法は、通常の微生物の変異方法に従って変異操
作を行い、プロテアーゼ産性能低下株の選別方法に従っ
て変異操作を行なえばよい。変異方法の例としては、NG
（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン）、亜硝酸などの薬剤による処理、Ｘ線、紫外線など
の照射処理などがある。
得する方法は、通常の微生物の変異方法に従って変異操
作を行い、プロテアーゼ産性能低下株の選別方法に従っ
て変異操作を行なえばよい。変異方法の例としては、NG
（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン）、亜硝酸などの薬剤による処理、Ｘ線、紫外線など
の照射処理などがある。
プロテアーゼ産生能低下株の選別方法は次のように行な
う。まず、基準培地としてマンデルスの培地を用いる。
この培地は後述する取得例に記載された組成を有するも
ので“ADVANCES IN CHEMISTRY SERIES"No.95“Cellulas
es and their Application"pp391〜413に記載されてい
る。この培地に前記変異処理した糸状菌を培養する。培
養は当該糸状菌変異株を親株の至適温度でセルラーゼの
生産量が最大値に達するまで好気的条件下で行う。通常
は20〜45℃で２〜10日間程度培養すればよい。糸状菌の
生産するプロテアーゼには、酸性、中性、及びアルカリ
性pHに最大活性を示す少なくとも３種のプロテアーゼが
知られているが、選別基準のプロテアーゼは、そのいず
れであってもよい。プロテアーゼ活性は基質にカゼイン
を用いた萩原法で測定する。すなわち、0.6％基質溶液5
mlに酵素液1mlを加え、30℃、最適pH下で10分間反応さ
せる。除蛋白液5mlを加え、濾液中の分解生成物を275m
μにおける吸収やフォーリン呈色法で定量する。１分間
にチロシン１μｇ相当量の吸収又は呈色を示す非蛋白性
物質を生成する活性を１単位とする。基質にカゼインを
用いた萩原法は例えば「酵素研究法」第２巻第240頁
（昭和33年）朝倉書店に記載されている。このような条
件で公知のセルラーゼ生産糸状菌を培養するとプロテア
ーゼが15〜20単位/ml生成されるが、本発明においては
生成量が10単位/ml以下に低下したものを選別して使用
する。プロテアーゼの生成量は低いもののほうが好まし
く、５単位/ml以下特に２単位/ml以下のものが好まし
い。親株に対してはプロテアーゼ生成量が1/2以下、特
に1/4以下のものが適当である。
う。まず、基準培地としてマンデルスの培地を用いる。
この培地は後述する取得例に記載された組成を有するも
ので“ADVANCES IN CHEMISTRY SERIES"No.95“Cellulas
es and their Application"pp391〜413に記載されてい
る。この培地に前記変異処理した糸状菌を培養する。培
養は当該糸状菌変異株を親株の至適温度でセルラーゼの
生産量が最大値に達するまで好気的条件下で行う。通常
は20〜45℃で２〜10日間程度培養すればよい。糸状菌の
生産するプロテアーゼには、酸性、中性、及びアルカリ
性pHに最大活性を示す少なくとも３種のプロテアーゼが
知られているが、選別基準のプロテアーゼは、そのいず
れであってもよい。プロテアーゼ活性は基質にカゼイン
を用いた萩原法で測定する。すなわち、0.6％基質溶液5
mlに酵素液1mlを加え、30℃、最適pH下で10分間反応さ
せる。除蛋白液5mlを加え、濾液中の分解生成物を275m
μにおける吸収やフォーリン呈色法で定量する。１分間
にチロシン１μｇ相当量の吸収又は呈色を示す非蛋白性
物質を生成する活性を１単位とする。基質にカゼインを
用いた萩原法は例えば「酵素研究法」第２巻第240頁
（昭和33年）朝倉書店に記載されている。このような条
件で公知のセルラーゼ生産糸状菌を培養するとプロテア
ーゼが15〜20単位/ml生成されるが、本発明においては
生成量が10単位/ml以下に低下したものを選別して使用
する。プロテアーゼの生成量は低いもののほうが好まし
く、５単位/ml以下特に２単位/ml以下のものが好まし
い。親株に対してはプロテアーゼ生成量が1/2以下、特
に1/4以下のものが適当である。
このような糸状菌の取得例を次に示す。
取得例１ 親株として、スポロトリクム・セルロフィルムAJ 11711
6（FERM-P 7037）をポテトデキストロース寒天斜面培養
地（PDA培養値と略称する）、で45℃５日間、引続いて2
6℃３日間培養し、胞子を充分形成せしめた。形成した
胞子を0.01％Tween-80を含む0.1MK−リン酸緩衝液、pH
7.0、に懸濁させ、ガーゼで濾過して大きな菌糸体を除
き、NG 1000μg/mlの存在下で26℃、30分間インキュベ
ートした。この胞子懸濁液を遠心して胞子を集め、前記
リン酸緩衝液を用いて充分に洗浄し、PDA平面プレート
培地に、プレート当り50〜100個のコロニーが出るよう
にまいた。これを２〜３日間インキュベートし、出現し
たコロニーをスキムミルク（0.5％）寒天（1.5％）培地
（SM培地と略称する）にレプリカした。
6（FERM-P 7037）をポテトデキストロース寒天斜面培養
地（PDA培養値と略称する）、で45℃５日間、引続いて2
6℃３日間培養し、胞子を充分形成せしめた。形成した
胞子を0.01％Tween-80を含む0.1MK−リン酸緩衝液、pH
7.0、に懸濁させ、ガーゼで濾過して大きな菌糸体を除
き、NG 1000μg/mlの存在下で26℃、30分間インキュベ
ートした。この胞子懸濁液を遠心して胞子を集め、前記
リン酸緩衝液を用いて充分に洗浄し、PDA平面プレート
培地に、プレート当り50〜100個のコロニーが出るよう
にまいた。これを２〜３日間インキュベートし、出現し
たコロニーをスキムミルク（0.5％）寒天（1.5％）培地
（SM培地と略称する）にレプリカした。
このSM培地でハロー形成が親株より著しく低下したコロ
ニーを15株釣菌し、下記組成のセルラーゼ生産培地（マ
ンデルスの培地）5mlを含む30ml容の大型試験管中で45
℃で４日間振盪培養した。
ニーを15株釣菌し、下記組成のセルラーゼ生産培地（マ
ンデルスの培地）5mlを含む30ml容の大型試験管中で45
℃で４日間振盪培養した。
マンデルス培地 セルロースパウダー 4.0g/dl KH2PO4 0.2 〃 (NH4)2SO4 0.14 〃 ペプトン 1.2 〃 MgSO4・7H2O 0.03 〃 CaCl2・2H2O 0.03 〃 尿 素 0.03 〃 Tween-80 0.2 〃 微量要素液* 0.1ml/dl pH6.0* ZnSO4・7H2O 150mg FeSO4・7H2O 500mg CoCl2・6H2O 200mg MnSO4・4H2O 150mg を水100mlに溶解 このようにして培養したプロテアーゼ産生能低下株の中
で生育が親株と同程度に良好なもの６株について培養液
のセルラーゼ活性及びプロテアーゼ活性を測定したとこ
ろ、いずれの変異株の培養液も３〜９単位/ml（親株の1
/2〜1/6）のプロテアーゼ活性を示した。この６株のう
ち最もセルラーゼ活性の高く、比較的プロテアーゼ活性
の低下した変異株スポロトリクム・セルロフィルムAJ 1
17163（FERM-P 9375）を得た。
で生育が親株と同程度に良好なもの６株について培養液
のセルラーゼ活性及びプロテアーゼ活性を測定したとこ
ろ、いずれの変異株の培養液も３〜９単位/ml（親株の1
/2〜1/6）のプロテアーゼ活性を示した。この６株のう
ち最もセルラーゼ活性の高く、比較的プロテアーゼ活性
の低下した変異株スポロトリクム・セルロフィルムAJ 1
17163（FERM-P 9375）を得た。
取得例２ 親株としてトリコデルマ・リーセイATCC 26921を用い、
取得例１と同様の方法によってプロテアーゼ産性能低下
株35株を得た。この各変異株を前記の組成のマンデルス
液体培地に30℃で10日間振盪培養し、良好に生育した８
株について培養液のセルラーゼ活性及びプロテアーゼ活
性を測定したところ、いずれの変異株も２〜６単位/ml
（親株の1/2〜1/10）に低下したプロテアーゼ測定を示
した。これらのうち培養液のセルラーゼ活性の最も高い
変異株トリコデルマ・リーセイRT-5（FEPM-P 9376）を
得た。
取得例１と同様の方法によってプロテアーゼ産性能低下
株35株を得た。この各変異株を前記の組成のマンデルス
液体培地に30℃で10日間振盪培養し、良好に生育した８
株について培養液のセルラーゼ活性及びプロテアーゼ活
性を測定したところ、いずれの変異株も２〜６単位/ml
（親株の1/2〜1/10）に低下したプロテアーゼ測定を示
した。これらのうち培養液のセルラーゼ活性の最も高い
変異株トリコデルマ・リーセイRT-5（FEPM-P 9376）を
得た。
本発明で実施される変異株の培養法は親株の場合と同様
の方法により実施され、固体培養法、液体培養法のいず
れでも生産される。固体培養法、液体培養法のいずれで
も生産される。培養はpH4〜9.0、温度30〜50℃で２〜14
日間行う。
の方法により実施され、固体培養法、液体培養法のいず
れでも生産される。固体培養法、液体培養法のいずれで
も生産される。培養はpH4〜9.0、温度30〜50℃で２〜14
日間行う。
この場合セルラーゼ生産に用いられる培地の炭素源とし
ては、親株の場合と同様に濾紙、一般紙類、オガクヅ、
大豆粕、コーヒー粕等の植物繊維質およびその含有物が
用いられる。窒素源としては、硫安等の無機アンモニウ
ム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、ペプトン、蛋白分解
物等の有機窒素源が使用される。その他、KH2PO，MgS
O4，CaCl2，CoCl2，FeSO4，MnSO4，ZnSO4等の無機塩類
さらに必要に応じて有機微量栄養源を含有する栄養培地
が使用される。
ては、親株の場合と同様に濾紙、一般紙類、オガクヅ、
大豆粕、コーヒー粕等の植物繊維質およびその含有物が
用いられる。窒素源としては、硫安等の無機アンモニウ
ム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、ペプトン、蛋白分解
物等の有機窒素源が使用される。その他、KH2PO，MgS
O4，CaCl2，CoCl2，FeSO4，MnSO4，ZnSO4等の無機塩類
さらに必要に応じて有機微量栄養源を含有する栄養培地
が使用される。
このような方法で培養して得られた培養液はそのまま酵
素源として使用できるが、得られた培養液から分離した
菌体および培養濾液はいずれも粗酵素として使用するこ
ともできる。また菌体を除去した培養液から、塩析法、
有機溶剤による沈澱法等公知の方法を用いることによ
り、強力な活性を有する粗酵素剤を得ることができる。
素源として使用できるが、得られた培養液から分離した
菌体および培養濾液はいずれも粗酵素として使用するこ
ともできる。また菌体を除去した培養液から、塩析法、
有機溶剤による沈澱法等公知の方法を用いることによ
り、強力な活性を有する粗酵素剤を得ることができる。
本明細書におけるセルラーゼ活性は以下の方法で測定し
た。すなわち、濾紙（ワットマンNo.1）50mgを基質と
し、これに酵素液0.5mlと酢酸酸緩衝液（pH4.9,0.05M）
1.0mlを加え、60℃で1.0時間酵素反応を行った後、100
℃で5.0分間加熱し酵素反応を停止させ、これにジニト
ロサルチル酸試薬3.0mlを加え、100℃で5.0分間加熱し
発色させる。これに水16mlを加え550nmの波長で比色定
量し、生成した還元糖量を求めてフィルターペーパー活
性（FPA）で表示した。なお、トリコデルマ・リーセイ
変異株のセルラーゼ活性の場合には50℃で反応を行っ
た。
た。すなわち、濾紙（ワットマンNo.1）50mgを基質と
し、これに酵素液0.5mlと酢酸酸緩衝液（pH4.9,0.05M）
1.0mlを加え、60℃で1.0時間酵素反応を行った後、100
℃で5.0分間加熱し酵素反応を停止させ、これにジニト
ロサルチル酸試薬3.0mlを加え、100℃で5.0分間加熱し
発色させる。これに水16mlを加え550nmの波長で比色定
量し、生成した還元糖量を求めてフィルターペーパー活
性（FPA）で表示した。なお、トリコデルマ・リーセイ
変異株のセルラーゼ活性の場合には50℃で反応を行っ
た。
実施例Ｉ スポロトリクム・セルロフィルムAJ 117116（FERM-P 70
37）及びそのプロテアーゼ産性能低下変異株AJ 117163
（FERM-P 9375）をPAD培地pH6.0のスラントを用いて45
℃５日間、引続き26℃３日間培養して充分胞子を形成さ
せた。スラント上の胞子及び菌体を75mlの上記セルラー
ゼ生産培地を含む500ml容坂口フラスコに接種し48℃で
４日間振盪培養（振幅7.0cm,120rpm） ３日目と培養終了後、培養液を3000rpmで遠心して、培
養濾液を分離し、この培養濾液中のセルラーゼ活性及び
プロテアーゼ活性を測定したところ下表に示すような結
果が得られた。
37）及びそのプロテアーゼ産性能低下変異株AJ 117163
（FERM-P 9375）をPAD培地pH6.0のスラントを用いて45
℃５日間、引続き26℃３日間培養して充分胞子を形成さ
せた。スラント上の胞子及び菌体を75mlの上記セルラー
ゼ生産培地を含む500ml容坂口フラスコに接種し48℃で
４日間振盪培養（振幅7.0cm,120rpm） ３日目と培養終了後、培養液を3000rpmで遠心して、培
養濾液を分離し、この培養濾液中のセルラーゼ活性及び
プロテアーゼ活性を測定したところ下表に示すような結
果が得られた。
実施例２ トリコデルマ・リーセイATCC 26921及びそのプロテアー
ゼ産性能低下変異株TR-5（FERM-P 9376）をPDA培地pH6.
0のスラントに30℃で15日間培養した。スラント上に生
育した菌体を実施例１と同じ培養液に接種し、30℃で10
日間振盪培養した。
ゼ産性能低下変異株TR-5（FERM-P 9376）をPDA培地pH6.
0のスラントに30℃で15日間培養した。スラント上に生
育した菌体を実施例１と同じ培養液に接種し、30℃で10
日間振盪培養した。
培養８日及び10日目の培養液のセルラーゼ活性及びプロ
テアーゼ活性を測定したところ下表の示すような結果が
得られた。
テアーゼ活性を測定したところ下表の示すような結果が
得られた。
実施例３ セルロース粉末（山陽国策パルプ社製KCフロック）を0.
05M酢酸緩衝液を懸濁し、これに酵素と酢酸エチル（0.2
％）を添加した。酵素は実施例１と同様な条件で調製し
たスポロトリクム、セルロフィルムAJ 117116（FERM-P
7037）とプロテアーゼ産性能低下変異株AJ117163（FERM
-P 9375）の培地濾液の限外濾過濃縮・凍結乾燥標品を
用いた。この反応液20〜40lを第１図に示したような膜
リアクターの中へ入れ、リアクター全体を温度50℃にな
るように制御した。用いた膜は日東電工（株）製のチュ
ーブラ型UF膜（NTU-3020）（分画分子量20000）であ
る。反応は連続的に行い、UF膜を透過する糖化液量に見
合った量のセルロース懸濁液を常に供給し、反応液量を
一定に保った。
05M酢酸緩衝液を懸濁し、これに酵素と酢酸エチル（0.2
％）を添加した。酵素は実施例１と同様な条件で調製し
たスポロトリクム、セルロフィルムAJ 117116（FERM-P
7037）とプロテアーゼ産性能低下変異株AJ117163（FERM
-P 9375）の培地濾液の限外濾過濃縮・凍結乾燥標品を
用いた。この反応液20〜40lを第１図に示したような膜
リアクターの中へ入れ、リアクター全体を温度50℃にな
るように制御した。用いた膜は日東電工（株）製のチュ
ーブラ型UF膜（NTU-3020）（分画分子量20000）であ
る。反応は連続的に行い、UF膜を透過する糖化液量に見
合った量のセルロース懸濁液を常に供給し、反応液量を
一定に保った。
親株（FERM-P 7037）及び変異株（FERM-P 9375）のセル
ラーゼ標品を使用した場合の糖化液中のグルコース濃度
を測定した結果を第２図に示した。第２図が示すように
リアクターを用いた連続糖化には親株よりもプロテアー
ゼ産生能低下変異株（FERM-P 9375）の方がより高い糖
化活性を維持していることがわかった。
ラーゼ標品を使用した場合の糖化液中のグルコース濃度
を測定した結果を第２図に示した。第２図が示すように
リアクターを用いた連続糖化には親株よりもプロテアー
ゼ産生能低下変異株（FERM-P 9375）の方がより高い糖
化活性を維持していることがわかった。
本発明のセルラーゼ製剤を用いることによりセルロース
から酵素法でグルコースを効率よくかつ高収率で取得す
ることができる。
から酵素法でグルコースを効率よくかつ高収率で取得す
ることができる。
第１図はセルラーゼにセルロースの連続糖化装置を示し
たものであり、第２図は連続糖化による糖化液中のグル
コース濃度を経時的に示したものである。
たものであり、第２図は連続糖化による糖化液中のグル
コース濃度を経時的に示したものである。
Claims (1)
- 【請求項１】マンデルスの培地にセルラーゼ生産量が最
大値に達するまで至適温度で培養したときのプロテアー
ゼ副生量が10単位/ml以下である糸状菌をセルロースを
含有する栄養培地に培養し、培養物からセルラーゼを採
取することを特徴とするセルラーゼの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14805487A JPH0787784B2 (ja) | 1987-06-16 | 1987-06-16 | セルラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14805487A JPH0787784B2 (ja) | 1987-06-16 | 1987-06-16 | セルラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63313583A JPS63313583A (ja) | 1988-12-21 |
| JPH0787784B2 true JPH0787784B2 (ja) | 1995-09-27 |
Family
ID=15444129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14805487A Expired - Lifetime JPH0787784B2 (ja) | 1987-06-16 | 1987-06-16 | セルラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0787784B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010081826A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-15 | Kansai Electric Power Co Inc:The | セルラーゼ生産菌用培地、セルラーゼ生産菌の培養方法、及びセルロースの糖化方法 |
| CN118752576A (zh) * | 2024-07-09 | 2024-10-11 | 淮阴师范学院 | 一种酶法改性豆粕制备无醛纤维板的方法 |
-
1987
- 1987-06-16 JP JP14805487A patent/JPH0787784B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63313583A (ja) | 1988-12-21 |
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