JPH09163980A - セルラーゼの製造方法 - Google Patents
セルラーゼの製造方法Info
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- JPH09163980A JPH09163980A JP30092996A JP30092996A JPH09163980A JP H09163980 A JPH09163980 A JP H09163980A JP 30092996 A JP30092996 A JP 30092996A JP 30092996 A JP30092996 A JP 30092996A JP H09163980 A JPH09163980 A JP H09163980A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 セルラーゼの改良された製法を提供する。
【構成】 (a) トリコデルマ・リーセイに属する突然変
異株で、(b) セルラーゼを生産する能力を有し、(c) 結
晶性セルロ−ス１０．０ｇ／ｌ，ポリペプトン１．０ｇ
／ｌおよび酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分とする培地
５００ｍｌを含む２リットル容フラスコで２８℃、４日
間培養後、結晶性セルロ−ス６０ｇ／ｌ、ポリペプトン
１．０ｇ／ｌおよび酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分と
する培地３リットルを含む５リットル発酵槽でｐＨを調
節しながら２８℃、１ＶＶＭ、４５０ｒｐｍで７日間培
養した培養液を遠心分離した後に、上清中のβ−グルコ
シダーゼ活性が１３単位／ｍｌ以上である微生物を、培
地に培養し、得られたセルラーゼを採取する工程からな
る。
異株で、(b) セルラーゼを生産する能力を有し、(c) 結
晶性セルロ−ス１０．０ｇ／ｌ，ポリペプトン１．０ｇ
／ｌおよび酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分とする培地
５００ｍｌを含む２リットル容フラスコで２８℃、４日
間培養後、結晶性セルロ−ス６０ｇ／ｌ、ポリペプトン
１．０ｇ／ｌおよび酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分と
する培地３リットルを含む５リットル発酵槽でｐＨを調
節しながら２８℃、１ＶＶＭ、４５０ｒｐｍで７日間培
養した培養液を遠心分離した後に、上清中のβ−グルコ
シダーゼ活性が１３単位／ｍｌ以上である微生物を、培
地に培養し、得られたセルラーゼを採取する工程からな
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はセルラーゼの製造方法に
関する。本明細書においてセルラーゼとは、エキソセロ
ビオハイドロラーゼ（以下、Ｃ1酵素と称す）、エンド
−β−グルカナーゼ（以下、Ｃx酵素と称す）およびβ
−グルコシダーゼからなる酵素系の総称であり、セルロ
ースをグルコースまで分解する酵素である。
関する。本明細書においてセルラーゼとは、エキソセロ
ビオハイドロラーゼ（以下、Ｃ1酵素と称す）、エンド
−β−グルカナーゼ（以下、Ｃx酵素と称す）およびβ
−グルコシダーゼからなる酵素系の総称であり、セルロ
ースをグルコースまで分解する酵素である。
【０００２】
【従来の技術】近年、セルロース資源の有効利用をめざ
し、セルロースの効率的な糖化法の確立が要請されてい
る。糖化に必要なセルラーゼの酵素源としては、トリコ
デルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) ＱＭ６a （Ａ
ＴＣＣ １３６３１）から取得された一連の変異株、例
えばトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２
６９２１）［バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング・シンポジウム（Biotechnology & Bioen
gineering Symposium), 6, 9-20 (1976)］が最も有望と
されている。これらの菌株の生産するセルラーゼのＣ1
およびＣx酵素活性は、他の種類の微生物由来のものと
比較してきわめて強力である。しかし、β−グルコシダ
ーゼは微弱な活性しか有さない［エンザイム・アンド・
マイクロバイアル・テクノロジー（Enzyme and Microbi
al Technology), 2, 91-102(1980)］。セルロースをこ
れらの菌株の生産するセルラーゼを用いて糖化しようと
すると、セロビオースが蓄積する。この蓄積したセロビ
オースをグルコースまで分解するために、アスペルギル
ス・ニガーやアスペルギルス・フォエニシスのβ−グル
コシダーゼを添加することまで検討されている［カナデ
ィアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー(Can
adian Journal of Microbiology), 23,139-147 (1977)]
。
し、セルロースの効率的な糖化法の確立が要請されてい
る。糖化に必要なセルラーゼの酵素源としては、トリコ
デルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) ＱＭ６a （Ａ
ＴＣＣ １３６３１）から取得された一連の変異株、例
えばトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２
６９２１）［バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング・シンポジウム（Biotechnology & Bioen
gineering Symposium), 6, 9-20 (1976)］が最も有望と
されている。これらの菌株の生産するセルラーゼのＣ1
およびＣx酵素活性は、他の種類の微生物由来のものと
比較してきわめて強力である。しかし、β−グルコシダ
ーゼは微弱な活性しか有さない［エンザイム・アンド・
マイクロバイアル・テクノロジー（Enzyme and Microbi
al Technology), 2, 91-102(1980)］。セルロースをこ
れらの菌株の生産するセルラーゼを用いて糖化しようと
すると、セロビオースが蓄積する。この蓄積したセロビ
オースをグルコースまで分解するために、アスペルギル
ス・ニガーやアスペルギルス・フォエニシスのβ−グル
コシダーゼを添加することまで検討されている［カナデ
ィアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー(Can
adian Journal of Microbiology), 23,139-147 (1977)]
。
【０００３】そこで、トリコデルマ・リーセイのβ−グ
ルコシダーゼ活性を高めるために培養方法を検討したり
［アプライド・アンド・エンバイロンメタル・マイクロ
バイオロジー（Applied and Environmental Microbiolo
gy), 31, 648-654 (1976) 、及びバイオテクノロジー・
アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology &Bio
engineering) 23, 1837-1849 (1981)] 、また種々の変
異株の取得が試みられてきた［エフイーエムエス・シン
ポジウム（FEMS Symposium) No. 13, 405-416(1982)、
特開昭59-17984号公報］。しかしながら、高濃度のセル
ロースを効率よく糖化させるためには、これらの研究で
得られたセルラーゼのβ−グルコシダーゼ活性ではまだ
不十分である。また、安価にセルロースの糖化を行うた
めには、β−グルコシダーゼ活性だけでなく、Ｃ1酵素
活性、Ｃx酵素活性も高活性であることを必要とする。
ルコシダーゼ活性を高めるために培養方法を検討したり
［アプライド・アンド・エンバイロンメタル・マイクロ
バイオロジー（Applied and Environmental Microbiolo
gy), 31, 648-654 (1976) 、及びバイオテクノロジー・
アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology &Bio
engineering) 23, 1837-1849 (1981)] 、また種々の変
異株の取得が試みられてきた［エフイーエムエス・シン
ポジウム（FEMS Symposium) No. 13, 405-416(1982)、
特開昭59-17984号公報］。しかしながら、高濃度のセル
ロースを効率よく糖化させるためには、これらの研究で
得られたセルラーゼのβ−グルコシダーゼ活性ではまだ
不十分である。また、安価にセルロースの糖化を行うた
めには、β−グルコシダーゼ活性だけでなく、Ｃ1酵素
活性、Ｃx酵素活性も高活性であることを必要とする。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、改良
されたセルラーゼの製造方法、とくにβ−グルコシダー
ゼ活性の高い製造方法を提供することにある。
されたセルラーゼの製造方法、とくにβ−グルコシダー
ゼ活性の高い製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、(a) トリコデ
ルマ・リーセイに属する突然変異株で、(b) セルラーゼ
を生産する能力を有し、(c) 結晶性セルロース１０．０
ｇ／ｌ、ポリペプトン１．０ｇ／ｌおよび酵母エキス
０．５ｇ／ｌを主成分とする培地５００ｍｌを含む２リ
ットル容フラスコで２８℃、４日間培養後、培養液を結
晶性セルロース６０ｇ／ｌポリペプトン、１．０ｇ／ｌ
および酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分とする培地３リ
ットルを含む５リットル発酵槽でｐＨを調節しながら２
８℃、１ＶＶＭ、４５０ｒｐｍで７日間培養した培養液
を遠心分離した後に、培養上清中のβ−グルコシダーゼ
活性１３単位／ｍｌ以上である微生物を、培地に培養
し、得られたセルラーゼを採取する工程からなる、セル
ラ−ゼの製造方法に関する。
ルマ・リーセイに属する突然変異株で、(b) セルラーゼ
を生産する能力を有し、(c) 結晶性セルロース１０．０
ｇ／ｌ、ポリペプトン１．０ｇ／ｌおよび酵母エキス
０．５ｇ／ｌを主成分とする培地５００ｍｌを含む２リ
ットル容フラスコで２８℃、４日間培養後、培養液を結
晶性セルロース６０ｇ／ｌポリペプトン、１．０ｇ／ｌ
および酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分とする培地３リ
ットルを含む５リットル発酵槽でｐＨを調節しながら２
８℃、１ＶＶＭ、４５０ｒｐｍで７日間培養した培養液
を遠心分離した後に、培養上清中のβ−グルコシダーゼ
活性１３単位／ｍｌ以上である微生物を、培地に培養
し、得られたセルラーゼを採取する工程からなる、セル
ラ−ゼの製造方法に関する。
【０００６】本発明の方法に前記突然変異株トリコデル
マ・リーセイＰＣＤー１０（ＦＥＲＭ Ｐ−８１７２）
又はトリコデルマ・リーセイＣＤＵー１１（ＦＥＲＭ
Ｐ−８１７３）が好適である。
マ・リーセイＰＣＤー１０（ＦＥＲＭ Ｐ−８１７２）
又はトリコデルマ・リーセイＣＤＵー１１（ＦＥＲＭ
Ｐ−８１７３）が好適である。
【０００７】トリコデルマ・リーセイの菌学的性質は、
イー・ジー・シモンズ，アブストラクト・セカンド・イ
ンターナショナル・マイコロジカル・コングレス（E.G.
Simmons, Abst. 2nd International Mycological Cong
ress) 米国フロリダ州タンパ，１９７７年８月，６１８
頁］に記載されている。
イー・ジー・シモンズ，アブストラクト・セカンド・イ
ンターナショナル・マイコロジカル・コングレス（E.G.
Simmons, Abst. 2nd International Mycological Cong
ress) 米国フロリダ州タンパ，１９７７年８月，６１８
頁］に記載されている。
【０００８】本発明の目的に用いられる変異株は例えば
次の方法で得られる。セルラーゼ生産能を有しかつトリ
コデルマ・リーセイに属する微生物を、紫外線照射やニ
トロソグアニジンのような変異誘発剤の使用など、公知
の変異誘導処理し、処理ずみの菌株からセロビオースに
よるセルラーゼ誘導能の高い菌株を選ぶ。このための実
用的な手法として、例えば、親株としてＱＭ９４１４
（ＡＴＣＣ ２６９２１）を用い、ポテトデキストロー
ス寒天斜面培地上で２５℃、７日間培養し、胞子を十分
形成させる。形成した胞子を生理的食塩水に懸濁し（約
１〜３×１０7 個／ｍｌ）、 Ｎ−メチル−Ｎ' −ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンと反応させる（３００μｇ／
ｍｌ，ｐＨ７．０，３０℃，３０〜１２０分）。この胞
子懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、
平板あたり１００〜３００胞子／ｍｌになるよう希釈
し、表１に示したセロビオースを炭素源とする寒天平板
に塗布し、３０℃で２日間培養し、生育してきたコロニ
ーの上に５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０を含む０．５％
リン酸膨潤セルロース寒天を加えて、４５℃で１０〜２
４時間保温する。セルラーゼを生成しているコロニーの
まわりは透明帯が生成するので、これによってＣ1酵素
活性、Ｃx酵素活性の高まった変異株を選ぶことができ
る。また、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０、及び３０％
グルコースを含む０．０５％４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−グルコシド寒天を加えて、45℃で２〜１６
時間保温する。紫外線を照射すると、β−グルコシダー
ゼ活性の高いコロニーのまわりには蛍光を生じるので、
これによってβ−グルコシダーゼ活性の高まった突然変
異株を選ぶことができる。こうして得られた突然変異株
とＱＭ９４１４との性状の比較を表２に示す。
次の方法で得られる。セルラーゼ生産能を有しかつトリ
コデルマ・リーセイに属する微生物を、紫外線照射やニ
トロソグアニジンのような変異誘発剤の使用など、公知
の変異誘導処理し、処理ずみの菌株からセロビオースに
よるセルラーゼ誘導能の高い菌株を選ぶ。このための実
用的な手法として、例えば、親株としてＱＭ９４１４
（ＡＴＣＣ ２６９２１）を用い、ポテトデキストロー
ス寒天斜面培地上で２５℃、７日間培養し、胞子を十分
形成させる。形成した胞子を生理的食塩水に懸濁し（約
１〜３×１０7 個／ｍｌ）、 Ｎ−メチル−Ｎ' −ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンと反応させる（３００μｇ／
ｍｌ，ｐＨ７．０，３０℃，３０〜１２０分）。この胞
子懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、
平板あたり１００〜３００胞子／ｍｌになるよう希釈
し、表１に示したセロビオースを炭素源とする寒天平板
に塗布し、３０℃で２日間培養し、生育してきたコロニ
ーの上に５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０を含む０．５％
リン酸膨潤セルロース寒天を加えて、４５℃で１０〜２
４時間保温する。セルラーゼを生成しているコロニーの
まわりは透明帯が生成するので、これによってＣ1酵素
活性、Ｃx酵素活性の高まった変異株を選ぶことができ
る。また、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０、及び３０％
グルコースを含む０．０５％４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−グルコシド寒天を加えて、45℃で２〜１６
時間保温する。紫外線を照射すると、β−グルコシダー
ゼ活性の高いコロニーのまわりには蛍光を生じるので、
これによってβ−グルコシダーゼ活性の高まった突然変
異株を選ぶことができる。こうして得られた突然変異株
とＱＭ９４１４との性状の比較を表２に示す。
【０００９】
【表１】 寒天培地の組成 セロビオース ５ ｇ 酵母エキス １ ｇ (NH4)2SO4 ２ ｇ KH2PO4 ４ ｇ Na2HPO4 ６ ｇ MgSO4・7H2O ２００ ｍｇ F2SO4・7H2O １ ｍｇ CaCl2・2H2O １ ｍｇ トリトンX-100[半井化学薬品（株）製] １ ｇ 寒天 ２０ ｇ H3BO3 １０ μｇ MnSO4・4H20 １０ μｇ ZnSO4・7H2O ７０ μｇ CuSO4・5H2O ５０ μｇ (NH4)6Mo7024・4H2O １０ μｇ 水 １ｌ（ｐＨ５．５）
【００１０】
【表２】突然変異株とQM9414との性状の比較（寒天培地
上での性質の比較） （注）菌株１：QM9414。菌株２：PCD-10。菌株３：CDU-
11 Ａ：ポテトデキストロース寒天培地。 Ｂ：セロビオース−リン酸膨潤セルロース寒天培地。 Ｃ：セロビオース−４−メチルウンベリフェリル−β−
Ｄ−グルコシド寒天培地。
上での性質の比較） （注）菌株１：QM9414。菌株２：PCD-10。菌株３：CDU-
11 Ａ：ポテトデキストロース寒天培地。 Ｂ：セロビオース−リン酸膨潤セルロース寒天培地。 Ｃ：セロビオース−４−メチルウンベリフェリル−β−
Ｄ−グルコシド寒天培地。
【００１１】本発明における培地の炭素源としては、セ
ルロースパウダー、セロビオース、瀘紙、一般紙類、オ
ガクズ、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー
粕、澱粉、ラクトース等が使用される。窒素源として
は、硫安、硝安等の無機アンモニウム塩、尿素、アミノ
酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白分解物
等の有機窒素含有物が使用される。無機塩類としては、
KH2PO4、MgSO4・7H2O、CaCl2・2H2O、Fe2Cl3・6H2O 、MnCl
2 ・4H2O 、ZnSO4・7H2O 等が使用される。必要ならば有
機微量栄養物を含有する培地が使用される。菌株の培養
は、液体培養のほかに固形培養も可能である。液体培養
には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、前記培地を使
用して、培養温度２０〜３３℃、好ましくは、２８〜３
０℃、培養ｐＨ４〜６で培養すれば、４〜１０日間でセ
ルラーゼ活性は最高となる。ついで培養液から遠心分
離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去して上澄
液を得る。この上澄液は、このまま粗酵素液として使用
することができる。当該酵素の活性測定法は次に示すよ
うな酵素反応後、比色定量を用いる方法で測定する。
ルロースパウダー、セロビオース、瀘紙、一般紙類、オ
ガクズ、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー
粕、澱粉、ラクトース等が使用される。窒素源として
は、硫安、硝安等の無機アンモニウム塩、尿素、アミノ
酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白分解物
等の有機窒素含有物が使用される。無機塩類としては、
KH2PO4、MgSO4・7H2O、CaCl2・2H2O、Fe2Cl3・6H2O 、MnCl
2 ・4H2O 、ZnSO4・7H2O 等が使用される。必要ならば有
機微量栄養物を含有する培地が使用される。菌株の培養
は、液体培養のほかに固形培養も可能である。液体培養
には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、前記培地を使
用して、培養温度２０〜３３℃、好ましくは、２８〜３
０℃、培養ｐＨ４〜６で培養すれば、４〜１０日間でセ
ルラーゼ活性は最高となる。ついで培養液から遠心分
離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去して上澄
液を得る。この上澄液は、このまま粗酵素液として使用
することができる。当該酵素の活性測定法は次に示すよ
うな酵素反応後、比色定量を用いる方法で測定する。
【００１２】（１） Ｃ1酵素活性 アビセルＳＦ１５０ｍｇを基質として、これに酵素液
１．０ｍｌ、０．２Ｍ、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液４．０
ｍｌをそれぞれ加え、４５℃で１時間反応させる。１０
０℃，１０分間加熱して反応を停止させる。３，５−ジ
ニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。１分
間に１μモルのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単
位と定義する。
１．０ｍｌ、０．２Ｍ、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液４．０
ｍｌをそれぞれ加え、４５℃で１時間反応させる。１０
０℃，１０分間加熱して反応を停止させる。３，５−ジ
ニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。１分
間に１μモルのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単
位と定義する。
【００１３】（２） Ｃx酵素活性 ０．２Ｍ、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液に溶解した１％カル
ボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を用意する。
これに等量の適当に希釈した酵素溶液を加え、４５℃で
３０分間反応させる。１００℃、１０分間加熱して反応
を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により
還元糖を比色定量する。１分間に１μモルのグルコース
を遊離する酵素量を１酵素単位と定義する。
ボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を用意する。
これに等量の適当に希釈した酵素溶液を加え、４５℃で
３０分間反応させる。１００℃、１０分間加熱して反応
を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により
還元糖を比色定量する。１分間に１μモルのグルコース
を遊離する酵素量を１酵素単位と定義する。
【００１４】（３） β−グルコシダーゼ活性 基質液として、０．０５Ｍ、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液に
溶解した２ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを用意する。基質液１．０ｍｌに酵素液２０
μｌを加え、４５℃で１０分間反応させる。
溶解した２ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを用意する。基質液１．０ｍｌに酵素液２０
μｌを加え、４５℃で１０分間反応させる。
【００１５】２．０ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加
えて反応を停止する。１分間に１μモルのｐ−ニトロフ
ェノールを遊離する酵素量を１酵素単位と定義する。ま
た、得られた上澄液から凍結乾燥、硫安塩析、有機溶剤
による沈殿法など公知の方法を用いることにより粗酵素
剤を得ることができる。
えて反応を停止する。１分間に１μモルのｐ−ニトロフ
ェノールを遊離する酵素量を１酵素単位と定義する。ま
た、得られた上澄液から凍結乾燥、硫安塩析、有機溶剤
による沈殿法など公知の方法を用いることにより粗酵素
剤を得ることができる。
【００１６】
【実施例１】トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ａ
ＴＣＣ２６９２１）、ＰＣＤ−１０（ＦＥＲＭ Ｐ−８
１７２）、ＣＤＵ−１１（ＦＥＲＭ Ｐ−８１７３）の
各菌株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２５
℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金
耳をセロビオースを炭素源とする表３の組成の培地５０
ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種して、２８
℃、７日間振盪培養した。７日目に培養液を濾過し、上
清のセルラーゼ活性を求めた。その結果を表４に示す。
ＴＣＣ２６９２１）、ＰＣＤ−１０（ＦＥＲＭ Ｐ−８
１７２）、ＣＤＵ−１１（ＦＥＲＭ Ｐ−８１７３）の
各菌株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２５
℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金
耳をセロビオースを炭素源とする表３の組成の培地５０
ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種して、２８
℃、７日間振盪培養した。７日目に培養液を濾過し、上
清のセルラーゼ活性を求めた。その結果を表４に示す。
【００１７】
【表３】 フラスコ培地の組成 セロビオース １０．０ ｇ ポリペプトン １．０ ｇ 酵母エキス ０．５ ｇ KH2PO4 ２．０ ｇ (NH4)2SO4 １．５ ｇ MgSO4・7H2O ０．３ ｇ CaCl2・2H2O ０．３ ｇ ツイーン８０［半井化学薬品（株）製] １．０ ｍｌ 微量元素液＊ １．０ ｍｌ 酒石酸緩衝液 ５０ ｍＭ 水 １ｌ（ｐＨ４．０） ＊微量元素液 H3BO4 ６ ｍｇ (NH4)6Mo7024・4H2O ２６ ｍｇ FeCl3・6H2O １００ ｍｇ CuSO4・5H2O ４０ ｍｇ MnCl2・4H20 ８ ｍｇ ZnSO4・7H2O ２００ ｍｇ 水 １００ ｍｌ
【００１８】
【表４】各種菌株によるフラスコ培養でのセルラーゼ生
産
産
【００１９】
【実施例２】トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４、Ｐ
ＣＤ−１０、ＣＤＵ−１１の各菌株をポテトデキストロ
ース寒天斜面培地上で、２５℃、７日間培養して胞子を
十分形成させる。その１白金耳を表３の組成の培地のう
ち、セロビオースのかわりにアビセルＰＨ３０１（旭化
成社製）を用い、さらに酒石酸緩衝液を除いたもの５０
ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２８
℃、４日間振盪培養した。これを同組成の培地５００ｍ
ｌを含む２ｌ容三角フラスコに接種し、２８℃、４日間
振盪培養した。本培養液をアビセルＰＨ３０１ ６０ｇ
／ｌ、ツイーン８０のかわりにアデカノールＬＧ−１０
９（旭電化製）６ｇ／ｌを用いた同組成の培地３ｌを含
む５ｌ発酵槽に添加して、２８℃で培養した。通気は１
ＶＶＭ、撹拌は４５０ｒｐｍで、またｐＨの下限を２Ｎ
NH4OHによって培養開始後３日間はｐＨ４．０に調節
し、その後ｐＨ５．５に上昇させ、培養終了までこのｐ
Ｈで調節した。７日目に培養液を遠心分離し、その上清
中のセルラーゼ活性を求めた。その結果を表５に示す。
ＣＤ−１０、ＣＤＵ−１１の各菌株をポテトデキストロ
ース寒天斜面培地上で、２５℃、７日間培養して胞子を
十分形成させる。その１白金耳を表３の組成の培地のう
ち、セロビオースのかわりにアビセルＰＨ３０１（旭化
成社製）を用い、さらに酒石酸緩衝液を除いたもの５０
ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２８
℃、４日間振盪培養した。これを同組成の培地５００ｍ
ｌを含む２ｌ容三角フラスコに接種し、２８℃、４日間
振盪培養した。本培養液をアビセルＰＨ３０１ ６０ｇ
／ｌ、ツイーン８０のかわりにアデカノールＬＧ−１０
９（旭電化製）６ｇ／ｌを用いた同組成の培地３ｌを含
む５ｌ発酵槽に添加して、２８℃で培養した。通気は１
ＶＶＭ、撹拌は４５０ｒｐｍで、またｐＨの下限を２Ｎ
NH4OHによって培養開始後３日間はｐＨ４．０に調節
し、その後ｐＨ５．５に上昇させ、培養終了までこのｐ
Ｈで調節した。７日目に培養液を遠心分離し、その上清
中のセルラーゼ活性を求めた。その結果を表５に示す。
【００２０】
【表５】各種菌株による５ｌ発酵槽でのセルラーゼ生産
【００２１】
【実施例３】実施例２で得たトリコデルマ・リーセイＣ
ＤＵ−１１の上清のうち、１ｌを硫安７０％飽和で塩析
後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ファイン
ケミカルズ社製）を用いて脱塩し、さらに凍結乾燥して
３０ｇの粗酵素標品を得た。Ｃ1酵素活性０．７２単位
／ｍｇ、Ｃx酵素活性６．５単位／ｍｇ、β−グルコシ
ダーゼ活性０．５０単位／ｍｇであった。ケインバガス
を微粉砕し、０．３ＮのNaOHに懸濁して、１２０℃、１
５分間処理した。洗滌、中和後、０．１Ｍの酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に１５０ｇ／ｌの濃度になるように懸濁
した。さらに上記の粗酵素標品を１０ｇ／ｌの濃度にな
るように添加して、４５℃で２４時間作用させた。反応
液を遠心分離し、その上清を Shodex Ionpack Ｃ−８１
１（昭和電工製）等のカラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーを用いる方法（０．１％Ｈ3ＰＯ4で６０℃で
溶出、屈折計で検出）で分析した。グルコースは６９ｇ
／ｌ、キシロースは３１ｇ／ｌ生成したが、セロビオー
スやオリゴ糖の存在は全く認められなかった。
ＤＵ−１１の上清のうち、１ｌを硫安７０％飽和で塩析
後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ファイン
ケミカルズ社製）を用いて脱塩し、さらに凍結乾燥して
３０ｇの粗酵素標品を得た。Ｃ1酵素活性０．７２単位
／ｍｇ、Ｃx酵素活性６．５単位／ｍｇ、β−グルコシ
ダーゼ活性０．５０単位／ｍｇであった。ケインバガス
を微粉砕し、０．３ＮのNaOHに懸濁して、１２０℃、１
５分間処理した。洗滌、中和後、０．１Ｍの酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に１５０ｇ／ｌの濃度になるように懸濁
した。さらに上記の粗酵素標品を１０ｇ／ｌの濃度にな
るように添加して、４５℃で２４時間作用させた。反応
液を遠心分離し、その上清を Shodex Ionpack Ｃ−８１
１（昭和電工製）等のカラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーを用いる方法（０．１％Ｈ3ＰＯ4で６０℃で
溶出、屈折計で検出）で分析した。グルコースは６９ｇ
／ｌ、キシロースは３１ｇ／ｌ生成したが、セロビオー
スやオリゴ糖の存在は全く認められなかった。
【００２２】
【発明の効果】セルラーゼを高収率で得ることができ
る。
る。
Claims (3)
- 【請求項１】 (a) トリコデルマ・リーセイに属する突
然変異株で、(b) セルラーゼを生産する能力を有し、
(c) 結晶性セルロ−ス１０．０ｇ／ｌ，ポリペプトン
１．０ｇ／ｌおよび酵母エキス０．５ｇ／ｌを主成分と
する培地５００ｍｌを含む２リットル容フラスコで２８
℃、４日間培養後、結晶性セルロ−ス６０ｇ／ｌ、ポリ
ペプトン１．０ｇ／ｌおよび酵母エキス０．５ｇ／ｌを
主成分とする培地３リットルを含む５リットル発酵槽で
ｐＨを調節しながら２８℃、１ＶＶＭ、４５０ｒｐｍで
７日間培養した培養液を遠心分離した後に、上清中のβ
−グルコシダーゼ活性が１３単位／ｍｌ以上である微生
物を、培地に培養し、得られたセルラーゼを採取する工
程からなる、セルラ−ゼの製造方法。 - 【請求項２】 微生物がトリコデルマ・リーセイＰＣＤ
ー１０（ＦＥＲＭＰ−８１７２）である請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 微生物がトリコデルマ・リーセイＣＤＵ
ー１１（ＦＥＲＭＰ−８１７３）である請求項１記載の
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30092996A JPH09163980A (ja) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | セルラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30092996A JPH09163980A (ja) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | セルラーゼの製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60105306A Division JP2678747B2 (ja) | 1985-05-17 | 1985-05-17 | セルラーゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09163980A true JPH09163980A (ja) | 1997-06-24 |
Family
ID=17890824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30092996A Pending JPH09163980A (ja) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | セルラーゼの製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09163980A (ja) |
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-
1996
- 1996-10-25 JP JP30092996A patent/JPH09163980A/ja active Pending
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