JPH0787996A - 廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌の検出および定量的測定を行う方法 - Google Patents
廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌の検出および定量的測定を行う方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌の検出
および定量的測定を行う方法を提供する。 【構成】 相補的配列を有するために廃水または土壌試
料中のニトロソモナス属細菌のゲノム部分だけに交雑
し、他の細菌のゲノムの部分とは明白な交雑信号を発し
ない遺伝子プローブを使用し、前記遺伝子プローブに付
けた公知のラベルを利用して交雑核酸の定量的測定を行
うことによって、廃水または土壌試料のニトロソモナス
属細菌含量を直接に示す前記定量的測定値を得る。
および定量的測定を行う方法を提供する。 【構成】 相補的配列を有するために廃水または土壌試
料中のニトロソモナス属細菌のゲノム部分だけに交雑
し、他の細菌のゲノムの部分とは明白な交雑信号を発し
ない遺伝子プローブを使用し、前記遺伝子プローブに付
けた公知のラベルを利用して交雑核酸の定量的測定を行
うことによって、廃水または土壌試料のニトロソモナス
属細菌含量を直接に示す前記定量的測定値を得る。
Description
【０００１】アンモニウムは魚類を害する毒であり、か
つ水の富栄養化を促進するから、これは廃水から完全に
除去しなければならない。アンモニウムの工業的高度濃
縮方法は多数提案されているが、ｐｐｍ程度の濃度のア
ンモニウムは、生物学的除去方法によってのみ経済的に
除去できる。生物学的除去方法では、アンモニアを亜硝
酸塩に酸化する菌（アンモニア酸化菌）と、さらに硝酸
塩に酸化する菌（亜硝酸塩酸化菌）との２種の細菌が使
用される。これらの細菌は、細胞の代謝のためのエネル
ギーを前記酸化反応から得て生存する菌である。アンモ
ニア酸化菌はＣＯ2 を唯一の炭素源として使用し、亜硝
酸塩酸化菌はさらにまた別の炭素源を使用する。生じた
硝酸塩は、低酸素濃度下に種々の従属栄養体型の細菌に
よって窒素に還元でき、したがって完全に除去できる
（文献１）。
つ水の富栄養化を促進するから、これは廃水から完全に
除去しなければならない。アンモニウムの工業的高度濃
縮方法は多数提案されているが、ｐｐｍ程度の濃度のア
ンモニウムは、生物学的除去方法によってのみ経済的に
除去できる。生物学的除去方法では、アンモニアを亜硝
酸塩に酸化する菌（アンモニア酸化菌）と、さらに硝酸
塩に酸化する菌（亜硝酸塩酸化菌）との２種の細菌が使
用される。これらの細菌は、細胞の代謝のためのエネル
ギーを前記酸化反応から得て生存する菌である。アンモ
ニア酸化菌はＣＯ2 を唯一の炭素源として使用し、亜硝
酸塩酸化菌はさらにまた別の炭素源を使用する。生じた
硝酸塩は、低酸素濃度下に種々の従属栄養体型の細菌に
よって窒素に還元でき、したがって完全に除去できる
（文献１）。
【０００２】しかしながら、前記の窒素の微生物学的除
去方法には、硝化菌（ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｔｓ）の生
長速度が低いという欠点がある。ＣＯ2 が唯一の炭素源
であり、したがって細胞の生長速度は最低である。さら
に、イソチオシアネート、アミン、フェノール、含窒素
複素環式化合物のごとき多くの有機化合物がアンモニア
酸化菌の生長を妨害する。その結果として産業廃水処理
工場における窒素の生物学的除去操作の効率が非常に低
くなる。硝化菌は、微生物学的培養を包含する測定方法
では迅速に定量的測定を行うことができないから、廃水
中の硝化菌の量の変化を認識し、それに対応する制御手
段によって最適処理容量に調節する方法の開発は、今ま
で不可能であると思われていた。
去方法には、硝化菌（ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｔｓ）の生
長速度が低いという欠点がある。ＣＯ2 が唯一の炭素源
であり、したがって細胞の生長速度は最低である。さら
に、イソチオシアネート、アミン、フェノール、含窒素
複素環式化合物のごとき多くの有機化合物がアンモニア
酸化菌の生長を妨害する。その結果として産業廃水処理
工場における窒素の生物学的除去操作の効率が非常に低
くなる。硝化菌は、微生物学的培養を包含する測定方法
では迅速に定量的測定を行うことができないから、廃水
中の硝化菌の量の変化を認識し、それに対応する制御手
段によって最適処理容量に調節する方法の開発は、今ま
で不可能であると思われていた。
【０００３】本発明によれば、前記のアンモニア酸化菌
のための遺伝子プローブを作成することによって前記の
問題が解決できる。この遺伝子プローブを使用すること
によって、廃水や土壌等の中に存在する複雑なバイオマ
ス中の硝化菌が核酸の濃度から定量的に測定できる。該
遺伝子プローブ試験では、遺伝子プローブおよび硝化菌
からの相補的ターゲットであるＤＮＡを特異的に２倍化
し（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）、すなわち交雑させる（ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚｅｄ）。遺伝子プローブは、後記のごとき配
列を基準として生物学的に作成し、あるいは合成的手法
（１００個までのオリゴヌクレオチド）によって作成
し、これにラベル（放射能、染料、酵素等）を付ける。
硝化菌を含む試料（たとえば、エアレーション工程で得
られるスラッジまたは土壌から採取された核酸のライセ
ート（ｌｙｓａｔｅ）を含む試料）に前記の遺伝子プロ
ーブを添加すると、遺伝子プローブおよび硝化菌のＤＮ
Ａの相補的配列によって交雑が起る。この交雑反応は溶
液中で実施でき、あるいは、担体（たとえばニトロセル
ロース、ナイロン膜、ビード等）に固定された核酸を用
いて実施できる。交雑した核酸は、遺伝子プローブのラ
ベルを利用して定量的に測定でき、これによって、廃水
または土壌中のバイオマスの硝化菌含有量を直接に示す
データが得られる。
のための遺伝子プローブを作成することによって前記の
問題が解決できる。この遺伝子プローブを使用すること
によって、廃水や土壌等の中に存在する複雑なバイオマ
ス中の硝化菌が核酸の濃度から定量的に測定できる。該
遺伝子プローブ試験では、遺伝子プローブおよび硝化菌
からの相補的ターゲットであるＤＮＡを特異的に２倍化
し（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）、すなわち交雑させる（ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚｅｄ）。遺伝子プローブは、後記のごとき配
列を基準として生物学的に作成し、あるいは合成的手法
（１００個までのオリゴヌクレオチド）によって作成
し、これにラベル（放射能、染料、酵素等）を付ける。
硝化菌を含む試料（たとえば、エアレーション工程で得
られるスラッジまたは土壌から採取された核酸のライセ
ート（ｌｙｓａｔｅ）を含む試料）に前記の遺伝子プロ
ーブを添加すると、遺伝子プローブおよび硝化菌のＤＮ
Ａの相補的配列によって交雑が起る。この交雑反応は溶
液中で実施でき、あるいは、担体（たとえばニトロセル
ロース、ナイロン膜、ビード等）に固定された核酸を用
いて実施できる。交雑した核酸は、遺伝子プローブのラ
ベルを利用して定量的に測定でき、これによって、廃水
または土壌中のバイオマスの硝化菌含有量を直接に示す
データが得られる。
【０００４】本発明方法の実施のために不可欠な特性を
有する遺伝子プローブは前記の方法によって単離される
が、該遺伝子プローブおよびその種々の変種もまた本発
明の範囲内に入る。前記の新規な遺伝子プローブの主な
用途は、廃水処理工場で窒素分を生物学的に除去する際
に、硝化菌濃度の試験および監視のために使用すること
である。該新規遺伝子プローブによる硝化菌の検出の際
の検出限界は、細菌１０5 −１０6 個の範囲である。検
出感度は、増幅方法たとえばＰＣＲ法（ポリメラーゼ鎖
の反応）によってかなり改善できる。本発明に使用され
る遺伝子プローブの配列を基準として、増幅によって検
出限界が細菌１０−１００個という値に改善できる。本
発明を具体的に例示するために、次に実施例を示す。 ニトロソモナス属細菌の遺伝子プローブの遺伝子工学的
単離 ニトロソモナス属の細菌ニトロソモナス・ユーロパエア
（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）（Ａ
ＴＣＣ１９７１８）からゲノム核酸を、プレパレーチ
ブ、リソチーム／ＳＤＳ核酸単離法によって単離した。
有する遺伝子プローブは前記の方法によって単離される
が、該遺伝子プローブおよびその種々の変種もまた本発
明の範囲内に入る。前記の新規な遺伝子プローブの主な
用途は、廃水処理工場で窒素分を生物学的に除去する際
に、硝化菌濃度の試験および監視のために使用すること
である。該新規遺伝子プローブによる硝化菌の検出の際
の検出限界は、細菌１０5 −１０6 個の範囲である。検
出感度は、増幅方法たとえばＰＣＲ法（ポリメラーゼ鎖
の反応）によってかなり改善できる。本発明に使用され
る遺伝子プローブの配列を基準として、増幅によって検
出限界が細菌１０−１００個という値に改善できる。本
発明を具体的に例示するために、次に実施例を示す。 ニトロソモナス属細菌の遺伝子プローブの遺伝子工学的
単離 ニトロソモナス属の細菌ニトロソモナス・ユーロパエア
（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）（Ａ
ＴＣＣ１９７１８）からゲノム核酸を、プレパレーチ
ブ、リソチーム／ＳＤＳ核酸単離法によって単離した。
【０００５】遺伝子プローブの作成のために、前記のゲ
ノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断して１−１５ｋ
ｂの大形のＤＮＡ断片を得、該ＤＮＡ断片を遺伝子工学
的方法によって、ＢａｍＨＩ−線状化ｐＢＲ３２２プラ
スミドベクターに結合させ、次いで、適合した大腸菌の
細胞ＡＧ１中で形質転換した。次の日に、アンピシリン
抵抗性を有するクローンを単離し、ニトロソモナスのＤ
ＮＡを含有する組み換えクローンを、テトラサイクリン
に対するプラスミドベクターの感受性によって同定し
た。このクローニング実験は、マニアチスによって記載
された遺伝学的方法（２）によって行った。前記の組み
換えクローンからプラスミドＤＮＡを、分析用核酸単離
方法によって単離し、加入されたニトロソモナスのＤＮ
Ａの寸法を、ゲル電気泳動分離操作を行うことによって
測定した。１−１５ｋｂの範囲内のニトロソモナスのＤ
ＮＡを含むクローンの正確な寸法の測定のために、前記
のプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、線状化さ
れたプラスミドをゲル電気泳動分離方法によって分離し
た。ニトロソモナスのＤＮＡの正確なインサートサイズ
すなわち該挿入体の正確な寸法を表１に示す。
ノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断して１−１５ｋ
ｂの大形のＤＮＡ断片を得、該ＤＮＡ断片を遺伝子工学
的方法によって、ＢａｍＨＩ−線状化ｐＢＲ３２２プラ
スミドベクターに結合させ、次いで、適合した大腸菌の
細胞ＡＧ１中で形質転換した。次の日に、アンピシリン
抵抗性を有するクローンを単離し、ニトロソモナスのＤ
ＮＡを含有する組み換えクローンを、テトラサイクリン
に対するプラスミドベクターの感受性によって同定し
た。このクローニング実験は、マニアチスによって記載
された遺伝学的方法（２）によって行った。前記の組み
換えクローンからプラスミドＤＮＡを、分析用核酸単離
方法によって単離し、加入されたニトロソモナスのＤＮ
Ａの寸法を、ゲル電気泳動分離操作を行うことによって
測定した。１−１５ｋｂの範囲内のニトロソモナスのＤ
ＮＡを含むクローンの正確な寸法の測定のために、前記
のプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、線状化さ
れたプラスミドをゲル電気泳動分離方法によって分離し
た。ニトロソモナスのＤＮＡの正確なインサートサイズ
すなわち該挿入体の正確な寸法を表１に示す。
【０００６】単離されたニトロソモナスの遺伝子のプロ
ーブ類のうちで、どのプローブが最も広いニトロソモナ
ス検出スペクトルを有するかは、逆相交雑操作によって
決定できる。この目的のために、個々の遺伝子プローブ
試料にアガローズゲル中でゲル電気泳動分離操作を行
い、次いで遺伝子プローブ中のＤＮＡを該ゲルからニト
ロセルロースフィルタに移して固定した。ゲノミックな
ニトロソモナスのＤＮＡに適切なラベリング（たとえば
Ｐ32−ＡＴＰ、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素）を行
い、これをサザンのブロッチング法において遺伝子プロ
ーブとして使用した。該遺伝子プローブはニトロセルロ
ースフィルタに固定した。前記のサザンのブロッチング
交雑試験において６ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３２
３．１３を同定したが、これは非常に強い交雑信号を発
した。この遺伝子プローブにＤＯＴブロッチング交雑試
験を行い、そのニトロソモナス特異性について調べた。
この試験の結果、遺伝子プローブＳＰＮ３２３．１３は
ニトロソモナスに対して特異性を示し、かつ、試験され
たすべての遺伝子プローブのうちで最も広いニトロソモ
ナス検出スペクトルを有することが見出された。この遺
伝子プローブを、より短い遺伝子プローブの開発のため
に使用し、そしてオリゴヌクレオチド型の遺伝子プロー
ブを化学的に合成した。
ーブ類のうちで、どのプローブが最も広いニトロソモナ
ス検出スペクトルを有するかは、逆相交雑操作によって
決定できる。この目的のために、個々の遺伝子プローブ
試料にアガローズゲル中でゲル電気泳動分離操作を行
い、次いで遺伝子プローブ中のＤＮＡを該ゲルからニト
ロセルロースフィルタに移して固定した。ゲノミックな
ニトロソモナスのＤＮＡに適切なラベリング（たとえば
Ｐ32−ＡＴＰ、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素）を行
い、これをサザンのブロッチング法において遺伝子プロ
ーブとして使用した。該遺伝子プローブはニトロセルロ
ースフィルタに固定した。前記のサザンのブロッチング
交雑試験において６ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３２
３．１３を同定したが、これは非常に強い交雑信号を発
した。この遺伝子プローブにＤＯＴブロッチング交雑試
験を行い、そのニトロソモナス特異性について調べた。
この試験の結果、遺伝子プローブＳＰＮ３２３．１３は
ニトロソモナスに対して特異性を示し、かつ、試験され
たすべての遺伝子プローブのうちで最も広いニトロソモ
ナス検出スペクトルを有することが見出された。この遺
伝子プローブを、より短い遺伝子プローブの開発のため
に使用し、そしてオリゴヌクレオチド型の遺伝子プロー
ブを化学的に合成した。
【０００７】ニトロソモナス遺伝子プローブの遺伝子工
学的開発 他の短い遺伝子プローブは、前記の６ｋｂの遺伝子プロ
ーブＳＰＮ３２３．１３を基礎として作成した（図
１）。該遺伝子プローブは、種々の制限酵素による切断
によって分子生物学的に特徴ずけられるものである。こ
の遺伝子プローブの線状の制限酵素地図（両配向方向）
を図２に示す。１．４ｋｂのＣｌａＩ断片１．７ｋｂの
Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片および２．５ｋｂのＳａ
１Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を、ベクタｐＢＲ３２２およびｐ
ＳＫブルースクリプト（ストラータ遺伝子）にサブクロ
ーニングした。個々の遺伝子断片を含む組み換えクロー
ンを単離し、その分子生物学的特徴を調べた。対応する
制限酵素による切断操作およびゲル電気泳動分離操作の
後に、個々の遺伝子断片を電気溶離操作によって単離し
た。次いでこれらの遺伝子プローブにラベリングを、通
常のラベリング剤（Ｐ32ＡＴＰ、ビオチン、ジゴキシゲ
ニン、酵素）を用いて行い、そして遺伝子プローブ試験
を行ってこれらの遺伝子プローブの特異性について調べ
た。
学的開発 他の短い遺伝子プローブは、前記の６ｋｂの遺伝子プロ
ーブＳＰＮ３２３．１３を基礎として作成した（図
１）。該遺伝子プローブは、種々の制限酵素による切断
によって分子生物学的に特徴ずけられるものである。こ
の遺伝子プローブの線状の制限酵素地図（両配向方向）
を図２に示す。１．４ｋｂのＣｌａＩ断片１．７ｋｂの
Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片および２．５ｋｂのＳａ
１Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を、ベクタｐＢＲ３２２およびｐ
ＳＫブルースクリプト（ストラータ遺伝子）にサブクロ
ーニングした。個々の遺伝子断片を含む組み換えクロー
ンを単離し、その分子生物学的特徴を調べた。対応する
制限酵素による切断操作およびゲル電気泳動分離操作の
後に、個々の遺伝子断片を電気溶離操作によって単離し
た。次いでこれらの遺伝子プローブにラベリングを、通
常のラベリング剤（Ｐ32ＡＴＰ、ビオチン、ジゴキシゲ
ニン、酵素）を用いて行い、そして遺伝子プローブ試験
を行ってこれらの遺伝子プローブの特異性について調べ
た。
【０００８】前記の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ
３６６．１はニトロソモナス属の細菌に対して顕著な特
異性を示し、そしてそれにもかかわらずニトロソモナス
属に対して非常に広い検出スペクトルを有するために、
前記の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１が
ニトロソモナス属検出用プローブとして特に適当である
ことが見出された。オリゴヌクレオチド型の遺伝子プロ
ーブの適性の一層の改善および合成方法の開発のため
に、前記の遺伝子プローブを最初に制限酵素で切断して
分子生物学的特性を調べた。１．７ｋｂの遺伝子プロー
ブＳＰＮ３６６．１の線状の制限酵素地図を図３に示
す。前記の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．
１を短くするために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、Ａｃｃ
Ｉ、ＰｓｔＩおよびＣｌａＩによる切断によって生じた
０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．５ｋｂおよび０．７ｋｂ
の遺伝子断片をベクタｐＳＫブルースクリプト（ストラ
ータ遺伝子）にサブクローニングした。
３６６．１はニトロソモナス属の細菌に対して顕著な特
異性を示し、そしてそれにもかかわらずニトロソモナス
属に対して非常に広い検出スペクトルを有するために、
前記の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１が
ニトロソモナス属検出用プローブとして特に適当である
ことが見出された。オリゴヌクレオチド型の遺伝子プロ
ーブの適性の一層の改善および合成方法の開発のため
に、前記の遺伝子プローブを最初に制限酵素で切断して
分子生物学的特性を調べた。１．７ｋｂの遺伝子プロー
ブＳＰＮ３６６．１の線状の制限酵素地図を図３に示
す。前記の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．
１を短くするために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、Ａｃｃ
Ｉ、ＰｓｔＩおよびＣｌａＩによる切断によって生じた
０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．５ｋｂおよび０．７ｋｂ
の遺伝子断片をベクタｐＳＫブルースクリプト（ストラ
ータ遺伝子）にサブクローニングした。
【０００９】前記の０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．５ｋ
ｂおよび０．７ｋｂの遺伝子プローブを、それに対応す
る構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）から、制限酵素によ
る切断およびアガロースゲル中のゲル電気泳動分離操作
の後に電気溶離操作を行うことによって単離した。これ
らの遺伝子プローブにラベリング（Ｐ32ＡＴＰ、ビオチ
ン、ジゴキシゲニン−ＵＴＰ、酵素）を、ランダムプラ
イムラベリング方法によって行い、その後に遺伝子プロ
ーブ試験を行って該遺伝子プローブの特異性および感受
性について調べた。前記の遺伝子プローブＳＰＮ３９
１．７（０．２ｋｂ）、ＳＰＮ３９７．１（０．３ｋ
ｂ）、ＳＰＮ３９１．３（０．５ｋｂ）およびＳＰＮ３
９１．１６（０．７ｋｂ）において、ニトロソモナスに
対する特異性および検出感度について著しい差異はな
く、これらはすべて遺伝子プローブとして同様に有利に
使用できるものであることが見出された。前記の遺伝子
プローブＳＰＮ３９１．７、ＳＰＮ３９７．１、ＳＰＮ
３９１．３およびＳＰＮ３９１．１６を、１．７ｋｂの
遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１と比較した場合の遺伝
子プローブ試験の結果を表２に示す。
ｂおよび０．７ｋｂの遺伝子プローブを、それに対応す
る構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）から、制限酵素によ
る切断およびアガロースゲル中のゲル電気泳動分離操作
の後に電気溶離操作を行うことによって単離した。これ
らの遺伝子プローブにラベリング（Ｐ32ＡＴＰ、ビオチ
ン、ジゴキシゲニン−ＵＴＰ、酵素）を、ランダムプラ
イムラベリング方法によって行い、その後に遺伝子プロ
ーブ試験を行って該遺伝子プローブの特異性および感受
性について調べた。前記の遺伝子プローブＳＰＮ３９
１．７（０．２ｋｂ）、ＳＰＮ３９７．１（０．３ｋ
ｂ）、ＳＰＮ３９１．３（０．５ｋｂ）およびＳＰＮ３
９１．１６（０．７ｋｂ）において、ニトロソモナスに
対する特異性および検出感度について著しい差異はな
く、これらはすべて遺伝子プローブとして同様に有利に
使用できるものであることが見出された。前記の遺伝子
プローブＳＰＮ３９１．７、ＳＰＮ３９７．１、ＳＰＮ
３９１．３およびＳＰＮ３９１．１６を、１．７ｋｂの
遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１と比較した場合の遺伝
子プローブ試験の結果を表２に示す。
【００１０】遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１の配列決
定 １．７ｋｂの遺伝子プローブの配列決定を、遺伝子プロ
ーブＳＰＮ３６６．１（１．７ｋｂ）および０．２ｋ
ｂ、０．３ｋｂ、０．５ｋｂおよび０．７ｋｂの遺伝子
プローブの参照下に行った。配列決定はサンガーのジデ
オキシチエンターミネーション方法（５）によって行っ
た。１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１のヌ
クレオチドの配列を後記の配列表示表に示す。 オリゴヌクレオチド型の遺伝子プローブの化学合成 既存の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１の
配列を基礎として、Ｓ．Ｌ．ビュケージおよびＭ．Ｈ．
カルーサのアミダイト法（６）によってオリゴヌクレオ
チド型の遺伝子プローブの化学合成を行った。遺伝子プ
ローブ３６６．１の１．７ｋｂの遺伝子配列の区域から
の種々のオリゴヌクレオチドについて遺伝子プローブ試
験を行った結果、１．７ｋｂの遺伝子プローブの任意の
区域からの１５−１００量体のオリゴヌクレオチドは遺
伝子プローブ試験に使用できるものであることが見出さ
れた。
定 １．７ｋｂの遺伝子プローブの配列決定を、遺伝子プロ
ーブＳＰＮ３６６．１（１．７ｋｂ）および０．２ｋ
ｂ、０．３ｋｂ、０．５ｋｂおよび０．７ｋｂの遺伝子
プローブの参照下に行った。配列決定はサンガーのジデ
オキシチエンターミネーション方法（５）によって行っ
た。１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１のヌ
クレオチドの配列を後記の配列表示表に示す。 オリゴヌクレオチド型の遺伝子プローブの化学合成 既存の１．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．１の
配列を基礎として、Ｓ．Ｌ．ビュケージおよびＭ．Ｈ．
カルーサのアミダイト法（６）によってオリゴヌクレオ
チド型の遺伝子プローブの化学合成を行った。遺伝子プ
ローブ３６６．１の１．７ｋｂの遺伝子配列の区域から
の種々のオリゴヌクレオチドについて遺伝子プローブ試
験を行った結果、１．７ｋｂの遺伝子プローブの任意の
区域からの１５−１００量体のオリゴヌクレオチドは遺
伝子プローブ試験に使用できるものであることが見出さ
れた。
【００１１】下記のオリゴヌクレオチド型の遺伝子プロ
ーブが、遺伝子プローブ試験のために特に適当であるこ
とが確認された。 5′d (TTA GAA GTA ATG AGC CCA TGG CTA TTT GCC GCG CAT AAA CAT TTT ATC CAG TC) 3′ 5′d (CTT CTT CGC AGT GGG CAA ACT CTG TAG CTT CTG TTT TAA GAA ATT TGC GGC)3′ 5′d (CGT GTA AGT GCA AGC GGC AGT TCT TCT GCG GGA ATG CCG CTG CCG TTA TCG GTC)3′
ーブが、遺伝子プローブ試験のために特に適当であるこ
とが確認された。 5′d (TTA GAA GTA ATG AGC CCA TGG CTA TTT GCC GCG CAT AAA CAT TTT ATC CAG TC) 3′ 5′d (CTT CTT CGC AGT GGG CAA ACT CTG TAG CTT CTG TTT TAA GAA ATT TGC GGC)3′ 5′d (CGT GTA AGT GCA AGC GGC AGT TCT TCT GCG GGA ATG CCG CTG CCG TTA TCG GTC)3′
【００１２】遺伝子プローブ試験 遺伝子プローブの特異性および感受性を調べるために遺
伝子プローブ試験を行った。この試験では、ジゴキシゲ
ニン−ＵＴＰでラベリングを行った遺伝子プローブを使
用した。なお前記ラベリングは、ベーリンガ／マンハイ
ムのジゴキシゲニンテストキットを用いて行った。
伝子プローブ試験を行った。この試験では、ジゴキシゲ
ニン−ＵＴＰでラベリングを行った遺伝子プローブを使
用した。なお前記ラベリングは、ベーリンガ／マンハイ
ムのジゴキシゲニンテストキットを用いて行った。
【００１３】ニトロソモナス遺伝子プローブのラベリン
グ 前記の遺伝子プローブのラベリングを、フェインバーグ
およびボーゲルスタインのランダムプライム法（３）に
従ってジゴキシゲニン−ＵＴＰを用いて行った。このラ
ンダムプライム法によるラベリングの前に遺伝子プロー
ブを、それに対応する組み換えプラスミドから制限酵素
によって切り取った。線状化された遺伝子プローブを、
線状化されたプラスミドベクターから０．８％アガロー
スゲル中のゲル電気泳動分離操作によって分離した。該
アガロースゲルから遺伝子プローブＤＮＡを切断し、電
気溶離操作によってアガロースのブロックから遺伝子プ
ローブを単離した。次いで遺伝子プローブＤＮＡを、フ
ェノールを用いる抽出操作およびエタノールを用いる沈
澱操作によってさらに精製した。ジゴキシゲニン−ＵＴ
Ｐを用いるラベリングを行う前に、遺伝子プローブＤＮ
Ａを、水浴中で１００℃に１０分間加熱しそして氷／Ｎ
ａＣｌで速やかに冷却することによって変性した。ラベ
リングのために、変性された遺伝子プローブＤＮＡ（１
μｇ）、ヘキサヌクレオチド混合物２μｌおよびｄＮＴ
Ｂラベリング剤混合物２μｌを混合し、２回蒸留した滅
菌蒸留水を加えて全量を１９μｌにし、クレノー酵素１
μｌを添加した。ジゴキシゲニン−ＵＴＰを用いるラベ
リング操作を３７℃において６０分間行った。次いで、
ＥＤＴＡ溶液（０．２モル／ｌ、ｐＨ８）２μｌの添加
によって反応を停止させ、ラベリングされたＤＮＡを、
ＬｉＣｌ（４モル／ｌ）２．５μｌおよび予め冷却され
たエタノール（−２０℃）７５μｌによって沈澱させ
た。−７０℃において３０分間保った後に、ＤＮＡ沈澱
に遠心分離操作（１２，０００Ｇ）を行い、冷エタノー
ル（７０％）で洗浄し、真空乾燥し、その後にトリス−
ＨＣｌ（１０ミリモル／ｌ）およびＥＤＴＡ（１ミリモ
ル／ｌ）の溶液（ｐＨ８）５０μｌ中に溶解した。
グ 前記の遺伝子プローブのラベリングを、フェインバーグ
およびボーゲルスタインのランダムプライム法（３）に
従ってジゴキシゲニン−ＵＴＰを用いて行った。このラ
ンダムプライム法によるラベリングの前に遺伝子プロー
ブを、それに対応する組み換えプラスミドから制限酵素
によって切り取った。線状化された遺伝子プローブを、
線状化されたプラスミドベクターから０．８％アガロー
スゲル中のゲル電気泳動分離操作によって分離した。該
アガロースゲルから遺伝子プローブＤＮＡを切断し、電
気溶離操作によってアガロースのブロックから遺伝子プ
ローブを単離した。次いで遺伝子プローブＤＮＡを、フ
ェノールを用いる抽出操作およびエタノールを用いる沈
澱操作によってさらに精製した。ジゴキシゲニン−ＵＴ
Ｐを用いるラベリングを行う前に、遺伝子プローブＤＮ
Ａを、水浴中で１００℃に１０分間加熱しそして氷／Ｎ
ａＣｌで速やかに冷却することによって変性した。ラベ
リングのために、変性された遺伝子プローブＤＮＡ（１
μｇ）、ヘキサヌクレオチド混合物２μｌおよびｄＮＴ
Ｂラベリング剤混合物２μｌを混合し、２回蒸留した滅
菌蒸留水を加えて全量を１９μｌにし、クレノー酵素１
μｌを添加した。ジゴキシゲニン−ＵＴＰを用いるラベ
リング操作を３７℃において６０分間行った。次いで、
ＥＤＴＡ溶液（０．２モル／ｌ、ｐＨ８）２μｌの添加
によって反応を停止させ、ラベリングされたＤＮＡを、
ＬｉＣｌ（４モル／ｌ）２．５μｌおよび予め冷却され
たエタノール（−２０℃）７５μｌによって沈澱させ
た。−７０℃において３０分間保った後に、ＤＮＡ沈澱
に遠心分離操作（１２，０００Ｇ）を行い、冷エタノー
ル（７０％）で洗浄し、真空乾燥し、その後にトリス−
ＨＣｌ（１０ミリモル／ｌ）およびＥＤＴＡ（１ミリモ
ル／ｌ）の溶液（ｐＨ８）５０μｌ中に溶解した。
【００１４】ニトロソモナス遺伝子プローブとの交雑 この交雑実験では次の操作を行った。廃水または土壌の
バイオマスからのニトロソモナスＤＮＡ含有核酸抽出物
を最初に１００℃に加熱し、次いで氷／ＮａＣｌで速や
かに冷却することによって変性して、ＤＮＡのシングル
ストランド、すなわち１本鎖のＤＮＡを得た。ニトロセ
ルロース膜を次のごとく予備処理し、すなわち、水およ
び２０×ＳＳＣ（ＮａＣｌ（３モル／ｌ）、クエン酸ナ
トリウム０．３モル／ｌ、ｐＨ＝７）の中で膨潤させ、
乾燥することからなる予備処理を行った。ナイロン膜
は、予備処理せずに使用した。変性された核酸含有抽出
物を、シュライヘル／シュールミニフォルド−ＩＩ−濾
過ユニットを用いてニトロセルロース膜またはナイロン
膜に適用し、次いで加熱操作を真空中で８０℃において
１時間行うことによって固定し、またはＵＶ−トランス
イルミネータを用いてＵＶ架橋操作を５分間行うこと
（ナイロン膜の場合）によって固定した。
バイオマスからのニトロソモナスＤＮＡ含有核酸抽出物
を最初に１００℃に加熱し、次いで氷／ＮａＣｌで速や
かに冷却することによって変性して、ＤＮＡのシングル
ストランド、すなわち１本鎖のＤＮＡを得た。ニトロセ
ルロース膜を次のごとく予備処理し、すなわち、水およ
び２０×ＳＳＣ（ＮａＣｌ（３モル／ｌ）、クエン酸ナ
トリウム０．３モル／ｌ、ｐＨ＝７）の中で膨潤させ、
乾燥することからなる予備処理を行った。ナイロン膜
は、予備処理せずに使用した。変性された核酸含有抽出
物を、シュライヘル／シュールミニフォルド−ＩＩ−濾
過ユニットを用いてニトロセルロース膜またはナイロン
膜に適用し、次いで加熱操作を真空中で８０℃において
１時間行うことによって固定し、またはＵＶ−トランス
イルミネータを用いてＵＶ架橋操作を５分間行うこと
（ナイロン膜の場合）によって固定した。
【００１５】交雑用溶液（５×ＳＳＣ；ブロッキング剤
０．５％；Ｎ−ラウロイルサルコシンのＮａ塩０．１
％；ＳＤＳ（０．０２％））２０ｍｌを含むプラスチッ
クバッグに前記のナイロン／ニトロセルロースフィルタ
を取り付け、予備交雑操作を６８℃において１時間行っ
た。次いで前記の予備交雑用溶液を、新たに変性された
遺伝子プローブＤＮＡ（１００ｎｇ）を含む（同一組成
の）交雑用溶液２．５ｍｌと交換した。交雑用試料（ｂ
ａｔｃｈ）を６８℃において２時間培養した。その後に
該フィルタを室温において洗浄後（２×ＳＳＣ；ＳＤＳ
−０．１％）５０ｍｌで５分間（×２）洗浄し、次いで
６８℃において、別の洗浄液（０．１×ＳＳＣ；ＳＤＳ
−０．１％）で１５分間（×２）洗浄した。該フィルタ
は交雑したＤＮＡの検出のために直接に使用し、また
は、その後の検出操作に使用するために、空気中で乾燥
した後に一旦貯蔵した。
０．５％；Ｎ−ラウロイルサルコシンのＮａ塩０．１
％；ＳＤＳ（０．０２％））２０ｍｌを含むプラスチッ
クバッグに前記のナイロン／ニトロセルロースフィルタ
を取り付け、予備交雑操作を６８℃において１時間行っ
た。次いで前記の予備交雑用溶液を、新たに変性された
遺伝子プローブＤＮＡ（１００ｎｇ）を含む（同一組成
の）交雑用溶液２．５ｍｌと交換した。交雑用試料（ｂ
ａｔｃｈ）を６８℃において２時間培養した。その後に
該フィルタを室温において洗浄後（２×ＳＳＣ；ＳＤＳ
−０．１％）５０ｍｌで５分間（×２）洗浄し、次いで
６８℃において、別の洗浄液（０．１×ＳＳＣ；ＳＤＳ
−０．１％）で１５分間（×２）洗浄した。該フィルタ
は交雑したＤＮＡの検出のために直接に使用し、また
は、その後の検出操作に使用するために、空気中で乾燥
した後に一旦貯蔵した。
【００１６】交雑したニトロソモナスＤＮＡの検出 交雑したニトロソモナスＤＮＡの定量的検出のために免
疫学的検出反応を行った。ジゴキシゲニンのラベルを付
けた交雑ＤＮＡに結合し得るａｌｋ−ホスファターゼを
組合せた抗体コンジュゲートを使用した。この呈色反応
は，アルカリ性のｐＨにおいて、無色の５−ブロモー４
−クロロ−３インドリルホスフェ−トおよびニトロブル
ーテトラゾリウムの添加によって開始された。生じた青
色沈澱を定量的測定を、２−１２時間後にシマズＣＳ４
３０濃度計を用いて行った。該検出反応は下記のバッフ
ァを使用した。
疫学的検出反応を行った。ジゴキシゲニンのラベルを付
けた交雑ＤＮＡに結合し得るａｌｋ−ホスファターゼを
組合せた抗体コンジュゲートを使用した。この呈色反応
は，アルカリ性のｐＨにおいて、無色の５−ブロモー４
−クロロ−３インドリルホスフェ−トおよびニトロブル
ーテトラゾリウムの添加によって開始された。生じた青
色沈澱を定量的測定を、２−１２時間後にシマズＣＳ４
３０濃度計を用いて行った。該検出反応は下記のバッフ
ァを使用した。
【００１７】バッファ１：トリス／ＨＣｌ（１００ミリ
モル／ｌ）；ＮａＣｌ（１５０ミリモル／ｌ）、ｐＨ
７．５ バッファ２：ブロッキング剤のバッファ１中０．５％溶
液 バッファ３：トリス／ＨＣｌ（１００ミリモル／ｌ）；
ＮａＣｌ（１００ミリモル／ｌ）；ＭｇＣｌ2 （５０ミ
リモル／ｌ）ｐＨ９．５ バッファ４：トリス／ＨＣｌ（１０ミリモル／ｌ）；Ｅ
ＤＴＡ（１ミリモル／ｌ）ｐＨ８ 染料溶液（新たに調製）：ＮＢＴ４５μｌおよびＸ−ホ
スフェート３５μｌをバッファ３（１０ｍｌ）に添加。
モル／ｌ）；ＮａＣｌ（１５０ミリモル／ｌ）、ｐＨ
７．５ バッファ２：ブロッキング剤のバッファ１中０．５％溶
液 バッファ３：トリス／ＨＣｌ（１００ミリモル／ｌ）；
ＮａＣｌ（１００ミリモル／ｌ）；ＭｇＣｌ2 （５０ミ
リモル／ｌ）ｐＨ９．５ バッファ４：トリス／ＨＣｌ（１０ミリモル／ｌ）；Ｅ
ＤＴＡ（１ミリモル／ｌ）ｐＨ８ 染料溶液（新たに調製）：ＮＢＴ４５μｌおよびＸ−ホ
スフェート３５μｌをバッファ３（１０ｍｌ）に添加。
【００１８】前記のニトロセルロース／ナイロンフィル
タをバッファ１で１分間洗浄し、バッファ２（１００ｍ
ｌ）を使用して３０分間培養し、バッファ１で再び洗浄
した。前記の抗体コンジュケートをバッファ１で１：５
０００の比率で希釈し、前記のフィルタを上記の抗体コ
ンジュゲートの希薄溶液約２０ｍｌと共に３０分間培養
した。未結合の抗体コンジュゲートは、バッファ１（１
００ｍｌ）を用いる洗浄操作を１５分間（×２）行うこ
とによって除去した。次いでフィルタの平衡化操作を、
２０ｍｌのバッファ３の存在下に２分間行った。その後
フィルタを染料溶液２０ｍｌと共にプラスチックバッグ
中に密閉して、暗所で培養した。個々のスロットブロッ
ト（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔｓ）の色濃度を、同時に用いた
ニトロソモナスＤＮＡ標準試料と、濃度測定方法に従っ
て比較することによって測定した。
タをバッファ１で１分間洗浄し、バッファ２（１００ｍ
ｌ）を使用して３０分間培養し、バッファ１で再び洗浄
した。前記の抗体コンジュケートをバッファ１で１：５
０００の比率で希釈し、前記のフィルタを上記の抗体コ
ンジュゲートの希薄溶液約２０ｍｌと共に３０分間培養
した。未結合の抗体コンジュゲートは、バッファ１（１
００ｍｌ）を用いる洗浄操作を１５分間（×２）行うこ
とによって除去した。次いでフィルタの平衡化操作を、
２０ｍｌのバッファ３の存在下に２分間行った。その後
フィルタを染料溶液２０ｍｌと共にプラスチックバッグ
中に密閉して、暗所で培養した。個々のスロットブロッ
ト（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔｓ）の色濃度を、同時に用いた
ニトロソモナスＤＮＡ標準試料と、濃度測定方法に従っ
て比較することによって測定した。
【００１９】遺伝子プローブの特異性 遺伝子プローブの特異性を、既述の遺伝子プローブ試験
によって調べた。芳香族ハロゲン化合物、芳香族ニトロ
化合物、芳香族アミノ化合物、アルキルスルホン酸およ
びアリールスルホン酸を減成する細菌のごとき或特性を
有する種々のグラム陰性菌およびグラム陽性菌から核酸
を抽出し種々のニトロソモナス菌を単離し、既述の遺伝
子プローブを用いてドットブロット交雑試験を行い、ど
の細菌のリゼイト（ｌｙｓａｔｅｓ）が確実な交雑信号
を出すかを調べた（表２）。前記の実験によって、生長
したニトロソモナスの遺伝子プローブはすべてのニトロ
ソモナス属の細菌のリゼイトと特異的に交雑し、そして
他の細菌のリゼイトとの交雑信号は出さないことが見出
された。
によって調べた。芳香族ハロゲン化合物、芳香族ニトロ
化合物、芳香族アミノ化合物、アルキルスルホン酸およ
びアリールスルホン酸を減成する細菌のごとき或特性を
有する種々のグラム陰性菌およびグラム陽性菌から核酸
を抽出し種々のニトロソモナス菌を単離し、既述の遺伝
子プローブを用いてドットブロット交雑試験を行い、ど
の細菌のリゼイト（ｌｙｓａｔｅｓ）が確実な交雑信号
を出すかを調べた（表２）。前記の実験によって、生長
したニトロソモナスの遺伝子プローブはすべてのニトロ
ソモナス属の細菌のリゼイトと特異的に交雑し、そして
他の細菌のリゼイトとの交雑信号は出さないことが見出
された。
【００２０】ニトロソモナス遺伝子プローブの使用を包
含する水中／廃水中のニトロソモナス属の細菌の検出お
よび定量 水中／廃水中のニトロソモナス属の細菌の検出および定
量のために次の操作を行った。水／廃水に遠心分離操作
を行うことにより得られた試料から、最初に全部の核酸
を単離した。湿ったバイオマス５０ｍｇに０．５Ｍ−Ｅ
ＤＴＡ１５０μｌ、２回蒸留したＨ2 Ｏ１５０μｌおよ
びＳＤＳ（２０％）３μｌを添加し、水浴を用いて１０
０℃において６０秒間培養し、その直後に氷／塩浴中で
１分間保った。その後に、第１回目のフェノール抽出を
行うためにトリス−飽和フェノール液を６００μｌ添加
し、次いで混合操作を行い、そして遠心分離操作（５，
０００Ｇ）を５分間行った。上部のＤＮＡ相に対しフェ
ノール抽出操作を繰り返した。次いでエーテル抽出を行
って少量のフェノールを除去した。エーテル相を除去
し、ＤＮＡをイソプロパノール中で沈澱させ、次いで卓
上型遠心分離機を用いて遠心分離操作（５，０００Ｇ）
を行ってＤＮＡを分離した。得られたＤＮＡペレットを
７０％エタノールで洗浄した。その後ＤＮＡペレットを
ＴＥバッファ２２０μｌ中に入れ、既述の遺伝子プロー
ブ試験方法に従ってニトロセルロース膜またはナイロン
膜に固定し、次いで前記の遺伝子プローブと交雑させ
た。
含する水中／廃水中のニトロソモナス属の細菌の検出お
よび定量 水中／廃水中のニトロソモナス属の細菌の検出および定
量のために次の操作を行った。水／廃水に遠心分離操作
を行うことにより得られた試料から、最初に全部の核酸
を単離した。湿ったバイオマス５０ｍｇに０．５Ｍ−Ｅ
ＤＴＡ１５０μｌ、２回蒸留したＨ2 Ｏ１５０μｌおよ
びＳＤＳ（２０％）３μｌを添加し、水浴を用いて１０
０℃において６０秒間培養し、その直後に氷／塩浴中で
１分間保った。その後に、第１回目のフェノール抽出を
行うためにトリス−飽和フェノール液を６００μｌ添加
し、次いで混合操作を行い、そして遠心分離操作（５，
０００Ｇ）を５分間行った。上部のＤＮＡ相に対しフェ
ノール抽出操作を繰り返した。次いでエーテル抽出を行
って少量のフェノールを除去した。エーテル相を除去
し、ＤＮＡをイソプロパノール中で沈澱させ、次いで卓
上型遠心分離機を用いて遠心分離操作（５，０００Ｇ）
を行ってＤＮＡを分離した。得られたＤＮＡペレットを
７０％エタノールで洗浄した。その後ＤＮＡペレットを
ＴＥバッファ２２０μｌ中に入れ、既述の遺伝子プロー
ブ試験方法に従ってニトロセルロース膜またはナイロン
膜に固定し、次いで前記の遺伝子プローブと交雑させ
た。
【００２１】定量は次の方法で行った。ニトロソモナス
ＤＮＡの標準試料を２５０ｎｇ−３．５ｎｇの濃度で使
用した。この濃度値は、ニトロソモナス属の細菌の細胞
２．５×１０6 個ないし３．５×１０4 個に対応する。
交雑反応が確実に行われたかどうかを調べるために、シ
マズＣＳ９３０型濃度計を用いて５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルニトロブルーテトラゾリウム錯体の
色濃度を測定した。試料中のニトロソモナス特異性ＤＮ
Ａの濃度（すなわちニトロソモナス菌の細胞の力価）を
ニトロソモナスＤＮＡの標準試料のスロットブロットと
の比較によって測定した。この検出方法の検出限界は、
ニトロソモナス菌１０5 −１０6 個という値であった。
ＤＮＡの標準試料を２５０ｎｇ−３．５ｎｇの濃度で使
用した。この濃度値は、ニトロソモナス属の細菌の細胞
２．５×１０6 個ないし３．５×１０4 個に対応する。
交雑反応が確実に行われたかどうかを調べるために、シ
マズＣＳ９３０型濃度計を用いて５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルニトロブルーテトラゾリウム錯体の
色濃度を測定した。試料中のニトロソモナス特異性ＤＮ
Ａの濃度（すなわちニトロソモナス菌の細胞の力価）を
ニトロソモナスＤＮＡの標準試料のスロットブロットと
の比較によって測定した。この検出方法の検出限界は、
ニトロソモナス菌１０5 −１０6 個という値であった。
【００２２】ニトロソモナス遺伝子プローブを用いる土
壌中のニトロソモナス属の細菌の検出および定量 土壌中のニトロソモナス属の細菌の検出および定量に関
する実験を次の方法によって行った。土壌中に存在する
細菌の核酸を、トルビックおよびマルムールの方法
（４）によって単離した。ＴＥバッファ（トリス／ＨＣ
ｌ（１０ミリモル／ｌ）、ＥＤＴＡ（１ミリモル／
ｌ）、ｐＨ８）１００ｍｌを土壌１０ｇに添加し、この
試料を充分に混合し、次いで濾過によって細菌抽出物を
土壌から分離した。遠心分離操作（５，０００Ｇ）によ
って細菌を濾液から分離した。細菌を含む画分を０．１
Ｍ−Ｎａ4 Ｐ2Ｏ7 （ｐＨ７）１００ｍｌで１回洗浄
し、０．１５Ｍ−ＮａＣｌおよび１０ｍＭ−ＥＤＴＡを
含む液（ＥＤＴＡ含有塩水）１００ｍｌで１回洗浄し、
遠心分離操作（５，０００Ｇ）を行い、次いでＥＤＴＡ
含有塩水２５ｍｌ中に再び懸濁させた。リソチームを１
ｍｇ／ｍｌ添加し、次いで３７℃において３０分間培養
し、細菌を最終濃度１％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）で溶解し、すなわち溶菌した（ｌｙｓｅｄ）。土
壌中になお存在する腐植物質の大部分を除去するため
に、イオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィ、またはプロナーゼ処理、リボヌク
レアーゼ（ＲＮａｓｅ）処理およびフェノール抽出操作
等によってさらに精製を行うことも可能である。
壌中のニトロソモナス属の細菌の検出および定量 土壌中のニトロソモナス属の細菌の検出および定量に関
する実験を次の方法によって行った。土壌中に存在する
細菌の核酸を、トルビックおよびマルムールの方法
（４）によって単離した。ＴＥバッファ（トリス／ＨＣ
ｌ（１０ミリモル／ｌ）、ＥＤＴＡ（１ミリモル／
ｌ）、ｐＨ８）１００ｍｌを土壌１０ｇに添加し、この
試料を充分に混合し、次いで濾過によって細菌抽出物を
土壌から分離した。遠心分離操作（５，０００Ｇ）によ
って細菌を濾液から分離した。細菌を含む画分を０．１
Ｍ−Ｎａ4 Ｐ2Ｏ7 （ｐＨ７）１００ｍｌで１回洗浄
し、０．１５Ｍ−ＮａＣｌおよび１０ｍＭ−ＥＤＴＡを
含む液（ＥＤＴＡ含有塩水）１００ｍｌで１回洗浄し、
遠心分離操作（５，０００Ｇ）を行い、次いでＥＤＴＡ
含有塩水２５ｍｌ中に再び懸濁させた。リソチームを１
ｍｇ／ｍｌ添加し、次いで３７℃において３０分間培養
し、細菌を最終濃度１％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）で溶解し、すなわち溶菌した（ｌｙｓｅｄ）。土
壌中になお存在する腐植物質の大部分を除去するため
に、イオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィ、またはプロナーゼ処理、リボヌク
レアーゼ（ＲＮａｓｅ）処理およびフェノール抽出操作
等によってさらに精製を行うことも可能である。
【００２３】既述の遺伝子プローブ試験方法の説明の文
節中に記載の操作方法によってＤＮＡをニトロセルロー
ス膜またはナイロン膜に固定し、そしてベーリンガー／
マンハイム社のジゴキシゲニンテストキットを用いて交
雑反応を行った。ニトロソモナス特異性ＤＮＡの濃度
（すなわち細胞の力価）は、スロットブロットの５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルニトロブルーテトラ
ゾリウム錯体の色濃度によって定量的に測定した。
節中に記載の操作方法によってＤＮＡをニトロセルロー
ス膜またはナイロン膜に固定し、そしてベーリンガー／
マンハイム社のジゴキシゲニンテストキットを用いて交
雑反応を行った。ニトロソモナス特異性ＤＮＡの濃度
（すなわち細胞の力価）は、スロットブロットの５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルニトロブルーテトラ
ゾリウム錯体の色濃度によって定量的に測定した。
【００２４】
【表１】 表１ ニトロソモナスクローンの分子生物学的特徴 クローンコード ベクター インサート〔ＫＢ〕 細 菌 ──────────────────────────────────── ２５６／１５ ｐＢＲ ３２２ ２．７ ニトロソモナス ２５６／３２ ｐＢＲ ３２２ ５．８ ニトロソモナス ２５６／３６ ｐＢＲ ３２２ ２．３ ニトロソモナス ２５６／３９ ｐＢＲ ３２２ １．３ ニトロソモナス ２５８／２１ ｐＢＲ ３２２ ３．９ ニトロソモナス ２５８／２２ ｐＢＲ ３２２ ５．９ ニトロソモナス ２５８／２３ ｐＢＲ ３２２ ３．３ ニトロソモナス ２５８／２７ ｐＢＲ ３２２ ２１．６ ニトロソモナス ２５８／２９ ｐＢＲ ３２２ ６．０ ニトロソモナス ２５８／３３ ｐＢＲ ３２２ ３．４ ニトロソモナス ２５８／３４ ｐＢＲ ３２２ ７．１ ニトロソモナス ２５８／３５ ｐＢＲ ３２２ ７．５ ニトロソモナス ３２３／９Ａ ｐＳＰＴ １９ ６．０ ニトロソモナス ３２３／１３Ｂ ｐＳＰＴ １９ ６．０ ニトロソモナス ３２２／９Ａ ｐＳＫ ６．０ ニトロソモナス ３２２／１０Ｂ ｐＳＫ ６．０ ニトロソモナス
【００２５】前記のニトロソモナスＤＮＡは、大腸菌の
ベクタｐＢＲ３２２中のＢａｍＨＩ断片として、大腸菌
５ＫまたはＡＧ１中にクローニングされる。前記のゲノ
ムＤＮＡは、細菌ニトロソモナス・ユーロパエア（ＡＴ
ＣＣ１９７１８）から単離され、クローニングされた。
２５８／２９からの６Ｋｂの遺伝子プローブは両配向方
向においてベクターｐＳＰＴ１９およびｐＳＫブルース
クリプト中に再クローニングされた（ｒｅｃｌｏｎｅ
ｄ）。
ベクタｐＢＲ３２２中のＢａｍＨＩ断片として、大腸菌
５ＫまたはＡＧ１中にクローニングされる。前記のゲノ
ムＤＮＡは、細菌ニトロソモナス・ユーロパエア（ＡＴ
ＣＣ１９７１８）から単離され、クローニングされた。
２５８／２９からの６Ｋｂの遺伝子プローブは両配向方
向においてベクターｐＳＰＴ１９およびｐＳＫブルース
クリプト中に再クローニングされた（ｒｅｃｌｏｎｅ
ｄ）。
【００２６】
【表２】
【００２７】ヌクレオチドの配列を表３−表４に示す
（配列番号：２７６７５／１；長さ：１７２２ｂｐ；配
列の種類：ヌクレオチドの配列）。なお、この配列に関
する追加情報は次の通りである。鎖の種類：二本鎖（二
重鎖）；トポロジー：線状；配列分子の種類：ゲノムＤ
ＮＡ。
（配列番号：２７６７５／１；長さ：１７２２ｂｐ；配
列の種類：ヌクレオチドの配列）。なお、この配列に関
する追加情報は次の通りである。鎖の種類：二本鎖（二
重鎖）；トポロジー：線状；配列分子の種類：ゲノムＤ
ＮＡ。
【００２８】
【表３】
【００２９】
【表４】
【００３０】本発明の態様は次の通りである。 １．相補的配列を有するために廃水または土壌試料中の
ニトロソモナス属細菌のゲノムの部分だけに交雑し、他
の細菌のゲノムの部分とは明白な交雑信号を発しない遺
伝子プローブを使用し、前記遺伝子プローブに付けた公
知のラベルを利用して交雑核酸の定量的測定を行うこと
によって、廃水または土壌試料のニトロソモナス属細菌
含量を直接に示す前記定量的測定値を得ることを特徴と
する、廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌の検出およ
び定量的測定を行う方法。
ニトロソモナス属細菌のゲノムの部分だけに交雑し、他
の細菌のゲノムの部分とは明白な交雑信号を発しない遺
伝子プローブを使用し、前記遺伝子プローブに付けた公
知のラベルを利用して交雑核酸の定量的測定を行うこと
によって、廃水または土壌試料のニトロソモナス属細菌
含量を直接に示す前記定量的測定値を得ることを特徴と
する、廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌の検出およ
び定量的測定を行う方法。
【００３１】２．第２図に記載の６ｋｂの遺伝子断片に
よって特徴づけられる、前記第１項記載の方法に用いら
れる遺伝子プローブ。 ３．第２図に記載の１．４ｋｂの遺伝子断片を含有する
前記第２項記載の遺伝子プローブ。 ４．第２図および第３図に記載の１．７ｋｂの遺伝子断
片を含有する前記第２項記載の遺伝子プローブ。 ５．第２図に記載の２．５ｋｂの遺伝子断片を含有する
前記第２項記載の遺伝子プローブ。
よって特徴づけられる、前記第１項記載の方法に用いら
れる遺伝子プローブ。 ３．第２図に記載の１．４ｋｂの遺伝子断片を含有する
前記第２項記載の遺伝子プローブ。 ４．第２図および第３図に記載の１．７ｋｂの遺伝子断
片を含有する前記第２項記載の遺伝子プローブ。 ５．第２図に記載の２．５ｋｂの遺伝子断片を含有する
前記第２項記載の遺伝子プローブ。
【００３２】６．前記の配列表に記載のヌクレオチド配
列を含む前記第４項記載の遺伝子プローブ ７．前記の配列表に記載のヌクレオチド配列中のオリゴ
ヌクレオチド１−５３を含有する前記第４項記載の遺伝
子プローブ。 ８．前記の配列表に記載のヌクレオチド配列中のオリゴ
ヌクレオチド１３１５−１３６５を含有する前記第４項
記載の遺伝子プローブ。 ９．前記の配列表に記載のヌクレオチド配列中のオリゴ
ヌクレオチド１６１０−１６６３を含有する前記第４項
記載の遺伝子プローブ。
列を含む前記第４項記載の遺伝子プローブ ７．前記の配列表に記載のヌクレオチド配列中のオリゴ
ヌクレオチド１−５３を含有する前記第４項記載の遺伝
子プローブ。 ８．前記の配列表に記載のヌクレオチド配列中のオリゴ
ヌクレオチド１３１５−１３６５を含有する前記第４項
記載の遺伝子プローブ。 ９．前記の配列表に記載のヌクレオチド配列中のオリゴ
ヌクレオチド１６１０−１６６３を含有する前記第４項
記載の遺伝子プローブ。
【００３３】本明細書中に引用された刊行物の名称を以
下に示す。 １．Ｊ．Ｉ．プロサーの論文「オートロフィック、ニト
リフィケーション、イン、バクテリア」（「Ａｄｖ．ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」第３０巻
第１２５頁−第１７７頁（１９８９年）） ２．Ｊ．サンブルック、Ｅ．Ｆ．フリッチュ、Ｔ．マニ
アチス編「モレキュラー、クローニング；ア、ラボラト
リ、マニュアル」、コールド、スプリング、ハーバー、
ラボラトリ、プレス（１９８９年）
下に示す。 １．Ｊ．Ｉ．プロサーの論文「オートロフィック、ニト
リフィケーション、イン、バクテリア」（「Ａｄｖ．ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」第３０巻
第１２５頁−第１７７頁（１９８９年）） ２．Ｊ．サンブルック、Ｅ．Ｆ．フリッチュ、Ｔ．マニ
アチス編「モレキュラー、クローニング；ア、ラボラト
リ、マニュアル」、コールド、スプリング、ハーバー、
ラボラトリ、プレス（１９８９年）
【００３４】３．Ａ．Ｆ．フアインバーグおよびＢ．ボ
ーゲルシュタインの論文「ア、テクニック、フォア、ラ
ジオラベリング、ＤＮＡ、リストリクション、エンドヌ
クレアーゼ、フラグメンツ、ツウ、ハイ、スペシフィッ
ク、アクチビチイ」（「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」
第１３２巻第６頁（１９８３年）） ４．Ｖ．Ｌ．トルスビツクの論文「アイソレーション、
オブ、バクテリアル、ＤＮＡ、フロム、ソイル」（「Ｓ
ｏｉｌ Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第１２巻第１０
頁−第２１頁（１９８０年））
ーゲルシュタインの論文「ア、テクニック、フォア、ラ
ジオラベリング、ＤＮＡ、リストリクション、エンドヌ
クレアーゼ、フラグメンツ、ツウ、ハイ、スペシフィッ
ク、アクチビチイ」（「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」
第１３２巻第６頁（１９８３年）） ４．Ｖ．Ｌ．トルスビツクの論文「アイソレーション、
オブ、バクテリアル、ＤＮＡ、フロム、ソイル」（「Ｓ
ｏｉｌ Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第１２巻第１０
頁−第２１頁（１９８０年））
【００３５】５．Ｆ．サンガー、Ｓ．ニクレン、Ａ．
Ｒ．クールソンの論文「ＤＮＡ、シークエンシング、ウ
イズ、チェーン−ターミネーチング、インヒビターズ」
（「Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．」第７４巻第５４６３頁（１９７
７年）） ６．Ｃ．Ｌ．ビューケージおよびＭ．Ｈ．カルサースの
論文「デオキシヌクレオシド、ホスホルアミダイツ；
ア、ニュー、クラス、オブ、キイー、インタメディエー
ツ、フォア、デオキシポリヌクレオチド、シンセシス」
（「テトラヘドロン、レターズ」第２２巻第１８５９頁
−１８６２頁（１９８１頁））
Ｒ．クールソンの論文「ＤＮＡ、シークエンシング、ウ
イズ、チェーン−ターミネーチング、インヒビターズ」
（「Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．」第７４巻第５４６３頁（１９７
７年）） ６．Ｃ．Ｌ．ビューケージおよびＭ．Ｈ．カルサースの
論文「デオキシヌクレオシド、ホスホルアミダイツ；
ア、ニュー、クラス、オブ、キイー、インタメディエー
ツ、フォア、デオキシポリヌクレオチド、シンセシス」
（「テトラヘドロン、レターズ」第２２巻第１８５９頁
−１８６２頁（１９８１頁））
【図１】 ニトロソモナス属の細菌に特異性を示す遺伝
子プローブの調製方法を図解した図面である。
子プローブの調製方法を図解した図面である。
【図２】 ベクターｐＳＰＴ１９中の６ｋｂの遺伝子プ
ローブの両配向方向における制限地図（すなわち制限酵
素地図）である。
ローブの両配向方向における制限地図（すなわち制限酵
素地図）である。
【図３】 １．７ｋｂの遺伝子プローブＳＰＮ３６６．
１の制限地図である。
１の制限地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ハンス・ゲオルグ・ラスト ドイツ連邦共和国デイー 5600 ベルギツ シユ・グラツドバツハ、ロムメルシヤイデ ル・ホーヘ 10 (72)発明者 アントニウス・レーベルデイング ドイツ連邦共和国デイー 5600 ヴツペル タル１、アム・ローム 105 (72)発明者 ラインハルト・カンネ ドイツ連邦共和国デイー 5090 レーフエ ルクーゼン、ヒユツシヤイデルシユトラー セ 80
Claims (1)
- 【請求項１】 相補的配列を有するために廃水または土
壌試料中のニトロソモナス属細菌のゲノムの部分だけに
交雑し、他の細菌のゲノムの部分とは明白な交雑信号を
発しない遺伝子プローブを使用し、前記遺伝子プローブ
に付けた公知のラベルを利用して交雑核酸の定量的測定
を行うことによって、廃水または土壌試料のニトロソモ
ナス属細菌含量を直接に示す前記定量的測定値を得るこ
とを特徴とする、廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌
の検出および定量的測定を行う方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4014845.9 | 1990-05-09 | ||
| DE4014845A DE4014845A1 (de) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | Verfahren zur detektion und quantitativen bestimmung von nitrosomonas-staemmen in abwaessern oder boeden |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787996A true JPH0787996A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=6406013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3130292A Pending JPH0787996A (ja) | 1990-05-09 | 1991-05-07 | 廃水や土壌中のニトロソモナス属細菌の検出および定量的測定を行う方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5462855A (ja) |
| EP (1) | EP0456047B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0787996A (ja) |
| AT (1) | ATE133209T1 (ja) |
| CA (1) | CA2041889A1 (ja) |
| DE (2) | DE4014845A1 (ja) |
| DK (1) | DK0456047T3 (ja) |
| ES (1) | ES2082881T3 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4421901A1 (de) * | 1994-06-23 | 1996-01-04 | Bayer Ag | Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial |
| AT401270B (de) * | 1994-09-26 | 1996-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna |
| WO1998028444A2 (en) * | 1996-12-23 | 1998-07-02 | The University Of Chicago | Customized oligonucleotide microchips as multiple biosensors |
| US6458584B1 (en) * | 1996-12-23 | 2002-10-01 | University Of Chicago | Customized oligonucleotide microchips that convert multiple genetic information to simple patterns, are portable and reusable |
| US6124094A (en) * | 1997-10-17 | 2000-09-26 | Eastman Chemical Company | Zoogloeal and hyphomicrobium spp. nucleic acids |
| EP1032648A4 (en) | 1997-12-22 | 2004-03-17 | Aquaria Inc | NITRITE OXIDIZING BACTERIA AND METHOD OF USE |
| JP4046588B2 (ja) * | 2002-10-10 | 2008-02-13 | Ｎｅｃエレクトロニクス株式会社 | キャパシタの製造方法 |
| US7544501B2 (en) | 2003-10-09 | 2009-06-09 | Aquaria, Inc. | Nitrite-oxidizing bacteria and methods of using and detecting the same |
| WO2022147868A1 (en) * | 2021-01-08 | 2022-07-14 | The University Of Hong Kong | Sewage surveillance for sars-cov-2 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE202801T1 (de) * | 1983-01-10 | 2001-07-15 | Gen Probe Inc | Verfahren zum nachweis, identifizieren und quantifizieren von organismen und viren |
-
1990
- 1990-05-09 DE DE4014845A patent/DE4014845A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-26 DK DK91106742.9T patent/DK0456047T3/da active
- 1991-04-26 ES ES91106742T patent/ES2082881T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 DE DE59107264T patent/DE59107264D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-26 EP EP91106742A patent/EP0456047B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 AT AT91106742T patent/ATE133209T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 CA CA002041889A patent/CA2041889A1/en not_active Abandoned
- 1991-05-07 JP JP3130292A patent/JPH0787996A/ja active Pending
-
1993
- 1993-04-30 US US08/055,945 patent/US5462855A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4014845A1 (de) | 1991-11-14 |
| EP0456047B1 (de) | 1996-01-17 |
| EP0456047A1 (de) | 1991-11-13 |
| US5462855A (en) | 1995-10-31 |
| CA2041889A1 (en) | 1991-11-10 |
| DK0456047T3 (da) | 1996-05-20 |
| DE59107264D1 (de) | 1996-02-29 |
| ATE133209T1 (de) | 1996-02-15 |
| ES2082881T3 (es) | 1996-04-01 |
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