JPH0789872A - 腸原生動物のワクチン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、動物における腸原生動物感染を予
防もしくは治療するためのワクチンおよび方法を提供す
る。特に、ジアルジア鞭毛虫症を予防もしくは治療する
ためのワクチンおよび方法を提供する。 【構成】 胆汁入り増殖培地で腸原生動物を培養して得
たワクチン株、ならびにそれらのサブユニット、トキシ
ンおよび抗体、それらを含む組成物ならびにそれらの製
造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は、腸の原生動物（プロトゾア）
に対するワクチンに関する。詳細には、ジアルジア属
（Giardia）に対するワクチンを開示する。

【０００２】

【文献】以下に示す文献を、本出願の関連した部分に肩
文字として本出願の中で引用する。

【０００３】１．Taylor他著「ランブル鞭毛虫（Giardi
a lamblia）感染に対する人免疫応答」、J. Infect. Di
s.、 155:137-140 (1987）。

【０００４】２．Gillon著「ジアルジア鞭毛虫症におけ
る小腸粘膜の変化」「Giardia and Giardiasis」、Erla
ndsen他編集、 Plenum Press、 New York、 163-183 (198
4）。

【０００５】３．Wolfe著「臨床的症状および古典的方
法による診断」「Human Parasitic Diseases、Volume 3
- Giardiasis」、Meyer編集、 Elsevier Science Publi
shers、 New York、 175-186 (1990）。

【０００６】４．Feely他著「ジアルジア属の生物学」
「Human Parasitic Diseases、Volume 3 - Giardiasi
s」、Meyer編集、 Elsevier Science Publishers、 New Y
ork、 11-49 (1990）。

【０００７】５．Steketee他著「チャイルド・デイケア
センターにおける最近のジアルジア鞭毛虫症の発生」、
Wis. Am. J. Pub. Health 79:485-490 (1989）。

【０００８】６．Faubert著「ジアルジア鞭毛虫症が動
物寄生病であることの証拠」、Parasitology Today、4
(3):66-71 (1988）。

【０００９】７．Roach他著「野生マウスにおけるヒト
および動物源からのジアルジア・ジュオデナリス（Giar
dia duodenalis）伝染」「Advances in Giardia Resear
ch」Wallis他編集、 Univ. Calgary Press、 Calgary、 79
-82 (1988）。

【００１０】８．Swabby他著「ヒトおよび動物源からの
ジアルジア属によるモンゴルアレチネズミ（Meriones u
nguiculatus）の感染」「Advances in Giardia Researc
h」、Wallis他編集、 Univ. Calgary Press、 Calgary、 7
5-77 (1988）。

【００１１】９．Jakubowski著「パープルバープス（Pu
rple burps）および飲料水供給の濾過」、Am. J. Pub.
Health、 78:123-125 (1988）。

【００１２】１０．Buret他著「家畜反すう動物におけ
るジアルジア鞭毛虫症に関する動物寄生の可能性」、J.
Infect. Dis.、 155: 137-140 (1987）。

【００１３】１１．Vinayak他著「ランブル鞭毛虫の５
６ｋＤａ分子を経口で用いた全身免疫化で実験マウスに
保護を与える」、Vaccine 10:21-27 (1992）。

【００１４】１２．Buret他著「成長、腸形態およびジ
サッカリダーゼ活性に対するマウスのジアルジア鞭毛虫
症の影響」、J. Parasitol. 76 (3):403-409 (1990）。

【００１５】１３．Buret他著「ジアルジア・ジュオデ
ナリスに感染したアレチネズミにおける小腸の発育と酵
素活性および微絨毛の音波処理」、Parasitol. Res. 7
7:109-114 (1991）。

【００１６】１４．Janoff他著「ジアルジア属感染にお
ける免疫の役割」、「Human Parasitic Diseases、Volu
me 3 - Giardiasis」、Meyer編集、 Elsevier Science P
ublishers、 New York、 215-235 (1990）。

【００１７】１５．Lewis他著「アレチネズミにおける
ランブル鞭毛虫感染のコルチゾン誘発再燃」、Am. J. T
rop. Med. Hyg. 36 (1):33-40 (1987）。

【００１８】１６．Istre他著「山リゾートにおける飲
料水を媒介とするジアルジア鞭毛虫症：後天性免疫に関
する証拠」、Am. J. Public Health、 74 (6):602-604
(1984）。

【００１９】１７．den Hollander他著「ジアルジア鞭
毛虫症の免疫学」、Parasitology Today、 4:124-130 (1
988）。

【００２０】１８．Adam著「ジアルジア種の生物学」、
Microbiology Reviews、 55:706-732(1991）。

【００２１】１９．Roberts-Thomson他著「動物モデル
におけるジアルジア鞭毛虫症感染に対する後天性耐
性」、J. Immunology、 117:2036-2037 (1976）。

【００２２】２０．LoGalbo他著「Ｘ関連無ガンマグロ
ブリン血症を有する３人の患者における症候性ジアルジ
ア鞭毛虫症」、J. Pediat、 101:78-80 (1982）。

【００２３】２１．Janoff他著「エイズにかかった患者
ではランブル鞭毛虫に対する急性抗体応答が押えられて
いる」、J. Infect. Dis、 157:798-804 (1988）。

【００２４】２２．Butscher他著「ジアルジア・ムリス
（Giardia muris）の表面糖蛋白質に対するモノクロー
ナル抗体の治療作用」、Immunology、 64:175-180 (198
8）。 ２３．Stevens他著「マウスのジアルジア鞭毛虫症にお
ける局所的免疫：母親の腸を犠牲にしてミルクが保護さ
れるか」、Trans. Assoc. Am. Phys. 91:268-272 (197
8）。

【００２５】２４．Roberts-Thomson他著「ジアルジア
・ムリス感染に対するマウスの保護」、Infect. Immu
n.、 24:971-973 (1979）。

【００２６】２５．Smith他著「慢性ジアルジア鞭毛虫
症：薬剤感受性、トキシン産生、および宿主免疫応答に
関する研究」、Gastroenterology、 83:797-803 (198
2）。

【００２７】２６．Katelaris他著「ジアルジア鞭毛虫
症における下痢と吸収不良：多因子進行か」、Gut. 33:
295-297 (1992）。

【００２８】２７．Nash他著「ランブル鞭毛虫の排泄−
分泌産物」、J. Immunology、 131:2004-2010 (1983）。

【００２９】２８．Katelaris他著「ランブル鞭毛虫に
よる下痢の病原性：エキソトキシンに関する証拠」、J.
Gastroenterology．Hepatol. 3 (suppl 1):A4 (198
8）。

【００３０】２９．Zaman著「電子顕微鏡走査するため
のランブル鞭毛虫用担体としてのデキストラン粒子」、
J. Electron. Microsc.、 41:179-180 (1992）。

【００３１】３０．Kirkpatrick他著「猫のジアルジア
鞭毛虫症、自然および誘発された感染に関する観察」、
Am. J. Vet. Res.、 45:2182-2188 (1984）。

【００３２】上記出版物および特許明細書の開示内容
は、個々の出版物または特許明細書各々の文脈が具体的
かつ独立して本明細書に包含されている場合には、同じ
内容でそれらの全体が引用することによって本明細書の
内容となる。

【００３３】

【発明の背景】腸の原生動物は、人および動物の数多く
の病気の原因となるものである。これらが家畜動物に感
染すると、重大な経済的な損失がもたらされ得る。重要
な腸原生動物には、クリプトスポリジウム（cryptospor
idium）、トリコモナズ（trichomonads）、ヒストモナ
ス（histomonas）、スピロヌクレウス（spironucleu
s）、アメーバ属（entamoeba）、球虫類（coccidia）、
トキソプラスマ（toxoplasma）および住肉胞子虫類（sa
rcocystis）が含まれる。最も問題となる腸原生動物門
の１つはジアルジア属（Giardia）である。

【００３４】ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）は西
洋諸国で最も通常に見いだされる病原性寄生性生物であ
り、北アメリカの多くで風土病である¹。ジアルジア属
は、便−経口ルートで伝染する鞭毛のある原生動物であ
る²。ジアルジア属における病原メカニズムはほとんど
理解されていないが、これは、他の数多くの胃腸管病に
類似した症状をもたらす。最も通常の症状は下痢、食欲
不振、倦怠感、腹拡張および胃腸内にガスが溜まること
である。感染の急性段階は通常数日間継続するのみであ
るが、時として特に子供では、慢性段階が数カ月に渡っ
て継続し得る³。

【００３５】ジアルジア属の栄養型がそれの宿主の中に
一度入ると、これらは、宿主の腸絨毛の上皮に取り付
き、胞のうに包まれた後、宿主の便の中に排出される。
感染した宿主の数人は、この感染の短い急性段階が過ぎ
た後、症状を示さないでのう子を移す人になる⁴。

【００３６】ジアルジア属感染の主要源は飲料水の中に
混入している。このことから、「バックパッカー下痢
（backpackers diarrhea）」の名前を得ている、と言う
のは、キャンプをしている時の多くの人が汚染された水
に暴露されたことが原因となって感染したからであ
る⁴。ジアルジア鞭毛虫症の発生もまたデイケアセンタ
ー（day care center）でしばしば問題になっている。
デイケアセンターで繰り返されるジアルジア属感染は通
常のことであり、子供達の多くが全く症状を示さないに
も拘らず、その感染のキャリアであることが見いだされ
ている。このことによって、デイケアセンターにおける
ジアルジア属の検出および有効な治療が困難になってい
る⁵。

【００３７】ジアルジア属感染で興味の持たれている主
要な領域は、ジアルジア属の人感染株のための貯蔵者と
して動物宿主が作用し得ることである。ジアルジア属の
種間伝染が生じる可能性もありそして生じていると言っ
た証拠が存在している。人におけるジアルジア属の株
は、アレチネズミ、マウス、モルモット、ラクーンおよ
びビーバー^6-8に感染性を示すことが示されている。カ
ナダでジアルジア属感染に与えられている一般名の「ビ
ーバーフィーバー（beaver fever）」は、３匹のビーバ
ーから成る集団による水源の汚染が原因となる感染が流
行したことで生まれた⁹。ジアルジア属感染は犬および
猫においては通常のことである。犬の１０−６８％およ
び猫の２５％がジアルジア属に感染していると見積もら
れている。家畜の反すう動物でジアルジア属感染が流行
していることに関する研究により、羊の１７．７％およ
び牛の１０．４％が感染していることが確認されてお
り、子羊（３５．６％）および子牛（２７．７％）の罹
病率の方が高い¹⁰。

【００３８】前に示したように、臨床的ジアルジア鞭毛
虫症は、無症状の寄生性生物キャリアから下痢、腹痙
攣、頭痛、ガス、膨満および不快によって特徴づけられ
る病気の範囲であり得る¹’¹¹。体重減少および成長の
遅れもまた、人および動物におけるジアルジア鞭毛虫症
に関連した通常の問題である¹¹。

【００３９】人では、ジアルジア属に関係した組織学的
変化には絨毛萎縮が含まれる²。動物モデルとしてモン
ゴルアレチネズミ（Mongolian gerbils）を用いた極最
近の研究により、主に十二指腸内で微絨毛の拡散が低下
すると共に刷子縁の酵素活性が低下することが示され
た。この酵素欠乏症は、上皮の微絨毛が短くなることに
よって引き起こされ得る¹²。他の研究は、体重増加の低
下、食物吸収の低下、腸ジサッカリダーゼ活性の低下お
よび絨毛萎縮と、ジアルジア属感染とを相互に関係付け
ている¹³。この微絨毛の拡散低下は、ジアルジア属が産
生するトキシンの結果であり得る¹²。

【００４０】

【発明が解決しようとする課題】ジアルジア鞭毛虫症が
流行しそして無症状担体キャリアが原因となって感染し
た全ての人を治療することが困難であることから、ジア
ルジア属に対するワクチンを開発することが非常に望ま
れている。宿主はジアルジア属に対して免疫応答を上昇
し、そしてこれらは、一次感染の後長く継続する免疫を
維持し得ることが示された¹⁴'¹⁵。宿主を繰り返してジ
アルジア属に暴露すると、感染の危険性が低下する¹⁶。
従って、宿主が免疫を取得する可能性がある。この宿主
が示す免疫応答は、ジアルジア属に対して示す宿主応答
の幅広い多様性を説明するものであり得る。この免疫シ
ステムがその原生動物に対して適当な防御を生じること
ができない場合、病気になる¹⁴。ジアルジア属の免疫分
野における先の研究は、病原メカニズムに関する理解が
不足していたことで妨げられていた。

【００４１】自然的および実験的ランブル鞭毛虫および
ジアルジア・ムリス感染で、その宿主は細胞および体液
免疫を生じることが示された¹’³’¹⁴’¹⁷’¹⁸。自然的
および実験的感染における免疫の進展は、この寄生性生
物がいなくなることに関連している¹⁶’¹⁸。しかしなが
ら、ジアルジア属に対して上昇した免疫応答を示す人お
よび動物でも、その宿主における不適当な免疫が原因と
なり得る臨床的または準臨床的ジアルジア鞭毛虫症を示
し得る¹⁴’²⁰’²¹。ジアルジア属寄生性生物に二次暴露
された後、症状のひどさ、感染過程および感染率が低下
することが、人および動物モデルで示され
た¹⁴’¹⁶’¹⁹。

【００４２】ランブル鞭毛虫およびジアルジア・ムリス
栄養型およびのう子に対する数多くのモノクローナルお
よびポリクローナル抗体が実験室動物の中で産生され
た。このような抗体を作り出す目的は、診断目的である
か或は実験室研究のための試薬を得るためである。これ
らの抗体は、標準的ハイブリドーマ技術およびＢＡＬＢ
／ｃマウスを用いて作り出されている。抗原およびフロ
インドのアジュバンドで複数免疫化を行うことによっ
て、ラビットおよび小型げっ歯類動物の中でポリクロー
ナル抗体が作り出された。

【００４３】抗ジアルジア属抗体を用いた受動免疫化が
行われた。Butscher他²²は、Ｇ．ムリス栄養型の表面糖
蛋白質に対するモノクローナル抗体を腹こう内投与する
ことでマウスにおける寄生性生物数が減少することを示
した。免疫の受動的転移が母乳で示された²³。ジアルジ
ア・ムリスに予め感染させた母マウスはそれらの乳飲み
子に保護を与えるが、ナイーブな（naive）母親の母乳
は保護を与えない。

【００４４】ジアルジア属の栄養型またはサブユニット
ワクチンを用いた動物の実際的免疫化に関する研究は極
めて限定されている。Roberts-Thomson他は、実験室マ
ウスの２つの株に予防接種した後、対抗研究を行っ
た²⁴。損傷を受けていないジアルジア・ムリス栄養型
（１０⁶）をフロインドのアジュバンドと一緒にした後
（１：１の比率）、腹こう内注射および足裏内注射を行
った。４週間後、アジュバントなしの同じ服用を動物の
同じ場所に投与した。対照マウスにはアジュバントのみ
を与えるか或は処理を行わなかった。１週間後、マウス
にジアルジア・ムリスののう子を投与した。予防接種し
たＢＡＬＢ／ｃマウスは、より短い期間の間にのう子の
排出を低くする一方、対照マウスと予防接種したＣ３Ｈ
／Ｈｅマウスの間では、のう子排出に関する差は全くな
かった。従って、この研究では、変動を示すと共に有効
性を示さない結果が得られた。

【００４５】Vinayak他¹¹は、ランブル鞭毛虫から５６
ｋＤａの蛋白質を単離した。マウスを皮下で免疫化し
（０日）、そして多重ラメラホスファチジルコリンリポ
ソーム（ＭＰＬ）に捕捉されている５６ｋＤａの表面関
連抗原を１００μｇ用いて経口免疫化した（７日）。免
疫化していない動物と、ＭＰＬ−に捕捉されているＰＢ
Ｓ（燐酸塩緩衝食塩水）で同様に免疫化した動物を対照
として用いた。最後の免疫化服用を行った後７日で、全
ての動物へチャレンジを行った。ＭＰＬ−に捕捉されて
いる５６ｋＤａの表面関連抗原を用いた免疫化により、
対照群と比較して、腸の栄養型コロニー形成および感染
期間の低下がもたらされた。この５６ｋＤａの表面抗原
はそのジアルジア属感染を免疫調節することが示され
た。

【００４６】ジアルジア属は、小腸粘膜の機能または構
造に影響を与える細胞毒を分泌すると考えられているが
²⁵’²⁶、細胞毒を同定するための古典的方法を用いて同
定される毒性原理はまだ１つ以上存在しているべきであ
る²⁵’²⁶。ジアルジア属の培養物濾液を用いて排泄／分
泌産物を処理することにより培養培地を生じさせること
が示された²⁵。培養物の濾液は、培養中の線維芽細胞に
損傷を与えると共に、ラットの潅流ループ（perfused l
oops）からの塩および水吸収を低下させることが示され
ているが、ジアルジア鞭毛虫症の病原性でこれらの物質
が果す役割は未知である²⁷。

【００４７】人を含む動物におけるジアルジア鞭毛虫症
を含む原生動物感染を予防および治療する目的で用いら
れ得る有効なワクチンに対する必要性が存在している。

【００４８】

【課題を解決するための手段】本発明は、動物における
腸原生動物感染を予防または治療するためのワクチンお
よび方法、並びに上記ワクチンで用いられ得る新規なト
キシン類を提供するものである。特にジアルジア鞭毛虫
症を予防または治療するためのワクチン類および方法も
提供する。本発明はまた、これらの方法で得られるか或
は用いられる新規なトキシン類、抗体、ワクチン株およ
び組成物の製造および使用方法も包含している。

【００４９】従って、１つの態様において、本発明は、
腸原生動物のワクチン株を提供するものである。これら
のワクチン株の製造方法も提供する。

【００５０】本発明の別の態様は、腸原生動物のワクチ
ン株を含んでいるワクチン組成物である。腸原生動物の
サブユニットまたはトキシンを含んでいる、細胞が入っ
ていないワクチン組成物もまた、これらのワクチン組成
物を製造する方法と同様提供する。

【００５１】本発明のさらなる別の態様は、腸原生動物
門のワクチン株の有効量を動物に投与することを含む、
動物における腸原生動物門による感染を予防または治療
する方法である。腸原生動物のサブユニットまたはトキ
シンを含んでいる、細胞が入っていない組成物を投与す
ることを含む、腸原生動物による感染を予防または治療
する方法も提供する。

【００５２】本発明のさらなる別の態様は腸原生動物の
トキシンである。このトキシンの製造方法もまた、この
トキシンに対する抗体およびこの抗体を用いた受動免疫
化方法と同様提供する。

【００５３】Ａ． 定義 本明細書で用いる下記の言葉は以下の意味を有する。

【００５４】アジュバント：抗原性を増強する目的で用
いられる賦形剤。アジュバント類の使用は当該技術分野
でよく知られている。アジュバント類には、抗原を吸着
し得る鉱物、例えばみょうばん、水酸化または燐酸アル
ミニウムなどの懸濁液；鉱油の中に抗原溶液が乳化させ
てある油中水エマルジョン、例えばフロインドの不完全
アジュバンドなどが含まれると共に、更に抗原性を増強
するための追加的因子、例えばフロイントの完全アジュ
バント内の死滅ミコバクテリアなどが含まれ得る。

【００５５】抗体：公知抗原または抗原決定基に免疫学
的に結合する分子、特に蛋白質。

【００５６】胆汁：肝臓によって分泌されたあと十二指
腸に排泄される物質であり、ここでこれは脂肪の乳化を
助け、ぜん動を上昇させ、そして腐敗作用を遅らせる助
けをする。この言葉胆汁はまた、粉末にしたか或は乾燥
した胆汁を表す目的でも用いる。胆汁はまた、胆汁の如
何なる成分、例えば個々の胆汁塩も意味している。

【００５７】コロニー形成：原生動物がその感染した動
物の腸に付着すること。

【００５８】のう子：数多くの原生動物の寄生性生物、
例えばジアルジア属の感染性形態。のう子には通常、非
常に濃縮された細胞質と抵抗力を示す細胞壁が備わって
いる。これらはしばしば便の中に落とされ（shed）、そ
してこれが、１つの動物から別の動物に病気が広がる経
路である。のう子は生存能力を示し得る、即ち新しい宿
主の中で栄養型を生じ得るか、或は生存能力を示さない
可能性がある。

【００５９】有効量：感染または病気に対して動物を保
護するに必要とされるか或は感染または病気の特別な症
状を和らげるに必要とされる用量。

【００６０】飼料変換率：単位量の体重を生じるに必要
とされる飼料の重量として表す、動物が体重を増やす能
力の尺度。原生動物門によって引き起こされる病気を含
む腸の病気は、動物が飼料を体重に変換する効率が低い
ことによってこのパラメーターが低くする。

【００６１】ジアルジア属：小腸に寄生する寄生性鞭毛
虫の属である。この出願で用いるこの言葉は、この属の
全ての種を含んでいる。ジアルジア属を表す目的で前に
用いたランブル（Lamblia）属もまた本出願で用いるこ
の言葉の中に包含される。

【００６２】ジアルジア鞭毛虫症：ジアルジア属による
感染。この感染の症状、例えば下痢、腹痙攣、頭痛、ガ
ス、膨満、体重損失、体重上昇の不足、脱水、不快、吸
収不良、寄生性生物による腸のコロニー形成、のう子の
排出などもまた、この言葉ジアルジア鞭毛虫症の中に含
まれる。

【００６３】免疫応答：宿主における興味の持たれてい
る組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗
体仲介免疫応答の進展。上記応答は下記の１種以上を含
んでいる可能性がある、即ち興味の持たれている組成物
またはワクチンの中に含まれている抗原または抗原類に
特異的に向かう抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレ
ッサーＴ細胞および／または細胞毒性Ｔ細胞の産生。

【００６４】腸原生動物門：それが感染する動物の腸に
棲息する原生動物門のいずれも。

【００６５】腸原生動物感染：腸原生動物門による感
染。この感染の症状、例えば下痢、腹痙攣、頭痛、ガ
ス、膨満、体重損失、体重上昇の不足、脱水、不快、吸
収不良、寄生性生物による腸のコロニー形成、のう子の
排出などもまた含まれる。

【００６６】中和する：毒性効果を防止するか或は和ら
げることができる。

【００６７】症状の予防（防止）：トキシンによって引
き起こされる影響いずれかの防止（予防）を含む。

【００６８】インビトロ（in vitro）産生：感染した宿
主動物の動物内ではなく培養物内で産生。インビトロ産
生には組換え体産生が含まれる。

【００６９】保護免疫性を示す：感染または病気に対し
て動物を保護するか、或は感染または病気の特別な症状
を和らげることができる。

【００７０】組換え的に作り出される：微生物、植物ま
たは動物を含む何らかの他のシステムにおける遺伝子発
現を用いて作り出される、および／または配列が公知の
場合本技術分野で知られている方法を用いて化学的に合
成される。

【００７１】音波処理：細胞の懸濁液を高周波数の音波
に暴露することによって細胞を崩壊させること。

【００７２】サブユニット：全有機体よりも小さい腸原
生動物門の一部いずれか。抗原性を示すサブユニットを
ワクチン組成物の中で用いて免疫応答を生じさせること
ができる。サブユニットには、鞭毛、腹の粘着性を示す
円板（ventral adhesive disk）、膜、細胞骨格膜蛋白
質、シトゾル膜蛋白質、トキシン類、並びに抗原性を示
し得るものであり免疫応答を誘発する有機体の他のいず
れかの部分が含まれ得る。これには組換え的に作り出さ
れたサブユニットが含まれる。

【００７３】トキシン：腸原生動物門が産生する有毒ま
たは毒性を示す物質。これは細胞外産物（エキソトキシ
ン）であってもよい。腸の細胞が影響を受ける場合、ト
キシンをエンテロトキシンと分類する。これには組換え
的に作り出されたトキシン類も含まれる。

【００７４】栄養型：特定の腸寄生性生物、例えばジア
ルジア属の増殖型（begetative）形態。

【００７５】ワクチン株：動物に投与されたとき保護免
疫原性を示す腸原生動物門の株。これには遺伝的に弱毒
化された株も含まれる。

【００７６】Ｂ． 具体的な態様 本発明は、腸原生動物のワクチン株および上記原生動物
からのトキシン類を提供するものである。予想外に、胆
汁が入っている培地の中で腸原生動物を培養すると、そ
れらを用いて動物に予防接種したとき保護免疫原性を示
すようになることが見いだされた。更に、胆汁含有培地
内の上記培養により、インビトロにおけるトキシンの産
生がもたらされる。このトキシンは、腸原生動物による
感染に対する免疫化を行うか或はトキシンを中和する抗
体を上昇させる目的で用いられ得る。

【００７７】特に、宿主動物の腸内で細胞外的に存在し
ている腸原生動物が本発明で用いるに好適である。最も
好適な具体例において、本発明は、ジアルジア属のワク
チン株、トキシン類およびトキシン類に対する抗体を提
供する。上記株、トキシン類および抗体は、ジアルジア
鞭毛虫症およびそれの症状を防止および治療するに有効
である。

【００７８】本発明では種々のジアルジア属株が有効で
ある。インビトロで充分に増殖し、標的動物種に感染し
得るものであり、そしてインビトロで増殖させた時トキ
シンを産生する株が好適である。特に、ジアルジア属株
ＷＢ（人からの単離物）、Ｓ２（我々が羊から単離した
株）、Ｄ３（我々が犬から単離した株）、およびＮ（我
々が飲料水から単離した株）が用いられ得る。株Ｎおよ
びＳ２が最も好適である。

【００７９】本発明のジアルジア属株を胆汁含有ＴＹＩ
−Ｓ−３３培地の中で増殖させることによって培養し
た。脱水した牛の胆汁を一般に用いたが、しかしなが
ら、個々の胆汁塩を含む胆汁の画分もまた本発明で有効
であると予測される。ジアルジア属の栄養型は、細かく
分割した固体状支持体も含んでいる容器の中で増殖し得
る。これは、その栄養型が付着する表面積を上昇させ
る。デキストランビードが特に好適な固体状支持体であ
る²⁹。他の支持体系、例えばガラスビードまたは繊維も
また適切であり得る。培地製造、ジアルジア属栄養型の
副次培養および収穫の詳細を以下の実施例の中に示す。

【００８０】本発明はまた、ジアルジア属か或は有効に
免疫原性を示す他の腸原生動物のワクチン株を含んでい
るワクチン組成物も提供する。上記ワクチン組成物では
ジアルジア属の種々の株が有効であり得る。特に、イン
ビトロで培養したときトキシンを産生する株が好適であ
る。最も好適な株の例はジアルジア属株Ｓ２およびＮで
ある。

【００８１】これらのワクチン株を以下の実施例の中に
示す如く培養した後、ワクチン組成物で用いる目的で収
穫する。ワクチン組成物の中で用いるに先立って原生動
物を崩壊させ得る。種々の崩壊方法を好適に用いること
ができ、これらには音波処理、浸透、圧力差の利用また
は凍結が含まれる。音波処理が最も好適である。

【００８２】ワクチン組成物は、腸原生動物の１種以上
のワクチン株および／またはジアルジア属または他の腸
原生動物の１種以上のサブユニットおよび／またはトキ
シン類を含んでいてもよい。上記サブユニットおよび／
またはトキシン類は、全原生動物門または音波処理した
原生動物に追加して用いられ得るか、或は細胞が入って
いないワクチン組成物の中で用いられ得る。

【００８３】ワクチン組成物の中で用いるに先立ってそ
の腸原生動物、トキシン類またはサブユニットを不活性
化することが有効であり得る。穏やかな熱処理またはホ
ルマリンによる不活性化などの通常の技術が用いられ得
る。

【００８４】上記ワクチン組成物の組成には、アジュバ
ントを含む適切な製薬上許容される担体が含まれ得る。
アジュバント、例えばみょうばんを基とするアジュバン
トの使用が好適である。本発明では数多くの市販アジュ
バント類が有効である。これらの試験では、水酸化アル
ミニウムおよびQuill A（Super Fos、 Copenhagen、 Denm
ark）が入っているみょうばんを基とするアジュバント
を用いた。上記ワクチン組成物に関する正確な組成は、
特別なワクチン株、免疫化すべき種および免疫化ルート
に依存している。上記ワクチン組成物の組成は当該技術
分野の技術者によく知られている。

【００８５】上記ワクチン組成物は、腸原生動物に敏感
な如何なる動物、例えば牛、羊、山羊、兎、馬、豚、
犬、猫および鳥種などの免疫化で有効である。家畜およ
び野生型両方の動物を免疫化することが可能であると共
に、食物製造用動物の免疫化も意図している。これらの
ワクチン組成物を用いて人を免疫化することもできる。
本発明は、予防または治療を必要としている動物にジア
ルジア属または他の腸原生動物のワクチン株の有効量を
投与することによる、ジアルジア鞭毛虫症または他の腸
原生動物感染の予防もしくは治療方法を提供するもので
ある。上記ワクチン株は上に考察した如きワクチン組成
物の中で用いられ得る。この方法は犬、猫、羊、人、家
畜動物（特に食物製造用動物）、鳥種および野生動物で
有効である。野生動物における使用は、人または家畜動
物が用いる水源の汚染を防止し得る。

【００８６】投与のルートは便利なルートのいずれかで
あってもよく、腸原生動物、処理すべき動物および他の
要因に応じて変化し得る。非経口投与、例えば皮下、筋
肉内または静脈投与が好適である。犬および猫種では皮
下投与が最も好適である。腸用のコートされている経口
服用形態を含む経口投与もまた用いられ得る。

【００８７】投与のスケジュールは、その腸原生動物お
よび処理すべき動物に応じて変化し得る。動物に単一投
与を受けさせるか、或は補助服用か数回の服用を受けさ
せ得る。連続した保護を行う目的で年１回の補助服用が
用いられ得る。特に、一次過程として、２１日離した２
回投与が好適である。

【００８８】治療すべき動物の年令もまた投与のルート
およびスケジュールに影響を与える。母親の抗体がもは
や存在しなくなりそしてその動物が免疫学的に受容能力
を有するようになる年令における投与が好適である。こ
れは、犬または猫種の年令で約６から７週である。追加
的に、母親を免疫化して母親のミルク内抗体の受動転移
を通して子の感染を防止するのが好適である。

【００８９】本発明の方法は、腸のコロニー形成を防止
するに有効である、即ち腸粘膜に原生動物が付着するの
を防止するに有効である。これはまた、ジアルジア鞭毛
虫症の症状を防止するに有効である。これには、トキシ
ンの中和、並びにこれらの有機体が腸内腔の中に存在し
ているが付着していない場合に生じる生理学的トキシン
効果のいずれかを防止することが含まれる。更に、本発
明の方法は、のう子、特に生存能力のあるのう子が便に
排出されるのを低くするものである。これによって、感
染が更に広がるのを防止する。

【００９０】慢性的に感染している動物または人を含
む、症状を示すか或は無症状の動物に対して治療を行う
ことが可能であると共に、その治療を用いて、下痢の如
き感染症状を和らげることによって成長速度を上昇させ
ることができる。このように、これを食物製造用動物に
投与すると、飼料変換率が上昇し得る。

【００９１】本発明は、ジアルジア属または他の腸原生
動物のトキシン類およびこれらのトキシン類の製造方法
を提供する。予想外に、胆汁が入っている培地の中で有
機体を培養すると、それらがインビトロでトキシンを産
生するようになることを見い出した。このトキシンを用
いることで、腸原生動物感染に対して動物を免疫化する
ことができる。これらの有機体が増殖する培地を濃縮す
ると、感染を予防および／または治療するに有効なトキ
シンが得られた。このジアルジア属におけるこのトキシ
ンはエキソトキシンであり、非常に高い細胞毒性を示
す。これは効力のあるエンテロトキシンであると見られ
る。

【００９２】最近まで、ジアルジア属のエンテロトキシ
ンを単離する試みは不成功であった。しかしながら、濃
縮した溶液を用いると共により高い感度を示す分析シス
テムを用いることにより、ジアルジア属が産生する細胞
毒性因子を検出することが可能になった。このトキシン
を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用い
て検出した。このＣＨＯバイオアッセイは、皮膚透過性
アッセイ、脂肪細胞脂肪分解アッセイおよび回腸ループ
アッセイよりも１００−１０，０００倍高い感度を有す
ることが確かめられた。このトキシンを用いた試験によ
り、これがＣＨＯ細胞の伸長を生じさせることが示され
た。伸長度合（即ち長くなった細胞のパーセント）は、
一般にトキシン濃度と共に上昇することが見いだされ
た。ジアルジア属トキシンを用いたとき観察される結果
は、細菌のエンテロトキシン類を用いて行う他の研究と
非常に類似している。大腸菌のトキシン類、コレラトキ
シンおよび百日咳トキシンを用いた時と同様な効果がＣ
ＨＯ細胞に関して見いだされた。

【００９３】ジアルジア属トキシンの部分的精製を達成
した。このジアルジア属トキシンは細胞内で産生される
蛋白質であり、これは、３７℃または室温か或は冷蔵ま
たは冷凍したとき安定性を示すことが確立された。トキ
シン含有培地は、分子量が約２２、３２、３８および３
９ｋＤａのクマシー染色蛋白質と共に９７ｋＤａ以上の
分子量を有するいくつかの蛋白質を含んでいることがＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認され、これらの蛋白質は対
照培地の中には存在していない。トキシン含有培地を硫
酸アンモニウムで分別することにより、分子量が約１６
−２０、２５−２８、３６−４２および５０−６５ｋＤ
ａの蛋白質（これらは対照培地の中には存在していな
い）と共に細胞毒性を示す画分が得られた。

【００９４】このトキシンを用いた免疫化により、下痢
を含むジアルジア鞭毛虫症の症状が低くなると共に、便
へののう子排出が低下した。

【００９５】本発明はまた、ジアルジア属または他の腸
原生動物のトキシン類に対する抗体も提供する。ポリク
ローナル抗体がジアルジア属トキシンに対して上昇し
た。通常技術を用いることで、モノクローナル抗体もま
た上昇し得る。これらの抗体は、このトキシンの毒性効
果を中和する抗血清として有効性を示す。従って、これ
らは、ジアルジア鞭毛虫症および他の腸原生動物感染の
症状を解放すると期待され得る。腸用のコートされてい
る服用調合物を用いた上記抗体の経口投与が好適である
と期待される。

【００９６】本発明の方法は、他の腸原生動物感染を予
防および治療するためのワクチン株、ワクチン組成物、
トキシン類、および抗トキシン類の製造で有効である。
本発明で有効な他の腸原生動物としては、クリプトスポ
リジウム、トリコモナド類、ヒストモナス、スピロヌク
レウス、アメーバ属、球虫類、トキソプラスマおよび肉
胞子虫属が含まれる。特に、クリプトスポリジウム、ト
リコモナド類、ヒストモナス、スピロヌクレウスおよび
アメーバ属が挙げられる。

【００９７】クリプトスポリジウム・ムリス（クリプト
スポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）と
も呼ばれている）は、哺乳動物および家禽類の小腸およ
び大腸の中で見いだされる原生動物寄生性生物であり、
そしてクリプトスポリジウム・メレグリジス（Cryptosp
oridium melegridis）は、家禽類の呼吸および胃腸管の
刷子縁の中で見いだされる。この寄生性生物は、人およ
び他の哺乳動物および鳥において軽いからひどい下痢を
引き起こすと共に、鳥の呼吸病の原因となっている。ク
リプトスポリジウムは、刷子縁表面積を狭くし、電解質
の輸送を悪化し、そしてジアルジア鞭毛虫症と同様な吸
収不良下痢の原因となっている。クリプトスポリジウム
種のための全細胞もしくはサブユニットワクチンを開発
することに関して多大な可能性が存在している。このワ
クチンは、この寄生性生物を崩壊させることによって製
造され、これらの蛋白質とアジュバントを組み合わせた
後、経口もしくは非経口ルートで動物または人を免疫化
することができる。１種以上のトキシン類が重要な毒性
を示す因子である可能性があり、そしてこれらのトキシ
ン類（またはトキソイド類）もまた経口もしくは非経口
ルートによる予防接種で用いられ得る。このワクチンを
用いることでこの病気を予防するか或はこの病気の症状
に対する保護を行うことができる。クリプトスポリジウ
ム症（cryptosporijiosis）の症状を治療する目的で抗
トキシン抗体も用いられ得る。

【００９８】トリコモナド類は、哺乳動物および鳥の胃
腸管、生殖および呼吸管の中に見いだされる鞭毛を有す
る原生動物寄生性生物の大きな集団である。大部分のト
リコモナド類は非病原性の共生動物であると信じられて
いる。しかしながら、我々は、これらの原生動物寄生性
生物のいくつかはジアルジア属と同様、動物における体
重上昇および飼料変換率に影響を与える可能性があると
共に、ある場合には下痢の原因となり得ると考えてい
る。このメカニズムにはトキシンが介在している可能性
がある。崩壊させたトリコモナス属（trichomonas）寄
生性生物とアジュバントを用いた予防接種は、感染から
の保護を与えるか、或はこの感染の症状を軽減し得る。
同様に、トキシンまたはトキソイドも保護を与え得る。
このワクチンは、腸のコロニー形成およびこの腸の損傷
を防止する。異なるトリコモナド種の交差保護もあり得
る。

【００９９】ヒストモナス・メレアグリジス（Histomon
as meleagridis）は、家禽類における鞭毛のある原生動
物寄生性生物である。この寄生性生物は、盲腸から放出
された後、血液流を通って肝臓に至る。この肝臓および
盲腸の壊死および組織変性が生じる。この感染から回復
した鳥はこの病気に対して免疫性を示す。我々は、この
病気の病原性にトキシンが関与している可能性があると
考えている。崩壊させた細胞またはトキシンのワクチン
を用いた予防接種は、家禽類におけるヒストモナス症を
制御する²有効な方法を提供し得る。このワクチンは、
腸のコロニー形成または盲腸の貫入を防止する。このワ
クチンはまた肝臓および盲腸の壊死を防止し得る。

【０１００】スピロヌクレウス・メレアグリジス（Spir
onucleus meleagridis）は、下痢および死亡をもたらす
若鳥の病気である。死後この腸内は水状の液体で満たさ
れていることが確認されている。この寄生性生物は家庭
用および野生鳥類に感染する。我々は、スピロヌクレウ
ス・メレアグリジスは、トキシンが介在した過程を通し
て症状を誘発すると考えている。崩壊させた全寄生性生
物またはトキシンもしくはトキソイドのワクチンは、こ
の感染からの保護を与え得る。このワクチンは、このト
キシンの中和を行いそして／またはこの寄生性生物のコ
ロニー形成を防止する。

【０１０１】赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）
は、人および動物におけるアメーバ赤痢の原因となる病
原性を示すアメーバ状原生動物である。この有機体は、
盲腸および結腸にコロニー形成して下痢および赤痢の原
因となる。この寄生性生物は腸壁に侵入して粘膜下組織
の中で増殖することで潰瘍化の原因となり得る。この寄
生性生物はまたリンパ管または腸間膜静脈の中に入る結
果として体全体の膿瘍を生じ得る。我々は、１種以上の
トキシン類が重要な毒性因子であり得ると考えている。
崩壊させた栄養型および／またはトキシンを用いた予防
接種は、この寄生性生物のコロニー形成および／または
侵入に対する保護を与える作用を示し得る。予防接種も
また、この病気で見られる下痢および赤痢に対する保護
となり得る、と言うのは、これはこのトキシンを中和し
そして／またはこの寄生性生物の侵入を防止するからで
ある。

【０１０２】コクシジウム症は、アイメリア種（Eimeri
a spp.）またはイソスポラ種（Isospora spp.）によっ
て引き起こされる複雑な腸の病気であり、これは、家畜
動物で主要な経済的重要さを有している。これらの原生
動物類は、複雑な生活環を有しておりそして宿主に特異
的である。ワクチンを製造する試みが行われた。家禽類
のワクチンが製造された（CocciVac、 CocciVac T、 Sher
win Laboratories）。これらのワクチン類は、鶏および
七面鳥に対して病原性を示す種の全てを含んでいる。サ
ブユニットワクチン類の開発は大きく不成功であった。
球虫類のトキシンはまだ同定されておらず、トキシンワ
クチン類もまだ製造されていない。人および動物の球虫
類に関するトキシンまたはトキソイドを基とするサブユ
ニットまたは強化ワクチンの製造には可能性がある。こ
れらには、イソスポラ種、アイメリア種、ウェニオネラ
種（Wenyonell spp.）およびチゼリア種（Tyzzeria sp
p.）が含まれる。

【０１０３】トキソプラスマは複雑な生活環を有してい
る。いくつかの研究グループは、アジュバントの有り無
しによる、熱死滅および熱−もしくはホルマリンで死滅
させた相同タキゾイトを用いた実験的免疫化ではマウ
ス、ハムスターおよびラビットを保護することができな
かった。実験的挑戦に対して特定の画分が保護を与え
た。トキソプラスマの細胞毒はまだ同定されていない
が、しかしながら、トキシンまたはトキソイドを用いた
動物および人における免疫化はこの病気からの保護を与
え得る。

【０１０４】球虫類と同様、肉胞子虫属も複雑な生活環
を有しており、それらの接合子のうは、この捕食動物の
腸細胞内に存在していると共にその無性段階の間は捕食
される動物の組織内に存在している。これらは数多くの
家畜および野生動物に共通している。現在の時点では、
これらの原生動物寄生性生物のためのワクチンは存在し
ておらず、そして細胞毒も示されていない。本発明を用
いることでこの寄生性生物のためのワクチンを開発する
ことが可能である。

【０１０５】以下に示す実施例は如何なる様式でも本発
明の範囲を限定することを意図するものではない。

【０１０６】

【実施例】一般に、特に言及しない限り、これらの実施
例では下記の材料と方法を用いた。

【０１０７】１．培地の処方および製造 ランブル鞭毛虫用培地（ＴＹＩ−Ｓ−３３）を、下記の
材料を用いて調製した。

【０１０８】 ｇ／Ｌ カゼインの加水分解物（Gibco 152-0014M） ２０．０ 酵母エキス（BBL 11929） １０．０ デキストロース（無水） １０．０ ＮａＣｌ ２．０ Ｋ₂ＨＰＯ₄（無水） １．０ ＫＨ₂ＰＯ₄（無水） ０．６ Ｌ−システイン（Sigma C 2529） ２．０ Ｌ−アスコルビン酸（Sigma A 4034） ０．２ 牛の胆汁（Sigma B 3883） ０．８ 特に明記されていない限り、化学品はBritish Drug Hou
ses（ＢＤＨ）から入手したものであった。

【０１０９】上に示した乾燥材料を一緒にした後、必要
になるまで暗所中４℃で貯蔵した。National Collectio
n of Type Cultures、 Colindale、 England（ＮＣＴＣ）
のビタミンミックス（Gibco Cat. #440-1100 EB）を、
包装の指示に従って調製し、滅菌濾過（０．２２μ）し
た後、３０ｍＬの一定分量として−２０℃で貯蔵した。
容積測定用フラスコを用い５０ｍＬの蒸留水（ｄＨ
₂Ｏ）の中に２．２８ｇ懸濁させることによって、クエ
ン酸第二鉄アンモニウム溶液を調製した。この溶液は光
に不安定なことから、暗所中４℃で貯蔵した。ＣＬＥＸ
（牛胎児血清（ＦＣＳ）代用品）を解凍した後、無菌の
１００ｍＬ一定分量として−２０℃で貯蔵した（Dextra
n Products CLEX C-500）。

【０１１０】１リットルの培地に関して、撹拌棒が入っ
ている１リットルのフラスコの中に８７０ｍＬのｄＨ₂
Ｏの半分を注ぎ込み、乾燥材料を加えた後、残りの水を
用いてこの容器とフラスコの縁を濯いだ。次に、そのク
エン酸第二鉄アンモニウム溶液の５００ｍＬを加えた。
この培地が透明になるまで（通常２−３時間）この溶液
を撹拌した後、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．８に
調整した。この培地を無菌条件下で滅菌濾過（０．２２
μおよびプレフィルター）し、３０ｍＬのビタミンミッ
クスと１００ｍＬのＣＬＥＸを加えた後、混合した。調
製した培地を一定分量に分けた後、必要になるまで−２
０℃で貯蔵した。

【０１１１】２．ジアルジア属栄養型の凍結 下記の操作を用いてジアルジア属の栄養型を凍結した。
ジアルジア属を増殖させて後期対数期に入らせた（７２
時間）。この管の側面上に存在している健康な栄養型を
保持するように培地を注ぎ出した。新鮮な培地を注ぎ入
れ、そしてこれらの管に氷上で１０−１５分間冷衝撃を
与えた後、５００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離した。
無菌条件下、１４ｍＬの培地をピペットで取り出し、約
２ｍＬを残すことにより、これらの栄養型を再懸濁し
た。この栄養型懸濁液の約０．９ｍＬを、ＣＬＥＸ中２
０％のＤＭＳＯが０．９ｍＬ入っているクリオチューブ
に加えた。これらのクリオチューブを、液体Ｎ₂に貯蔵
するためのガラス管の中に入れ、そしてこれらを絶縁容
器の中に入れた。この絶縁容器を最小で１２時間そして
最大で７２時間−７０℃の冷凍庫の中に入れた後、液体
Ｎ₂冷凍庫の中に入れた。

【０１１２】クリオチューブを３７℃の水浴の中に入れ
ることで栄養型を急速解凍し、新鮮な培地の中に入れた
後、最初の日は水平に培養し、２４時間後継代培養し、
そして通常に培養した。

【０１１３】３．ジアルジア属栄養型の継代培養 用いたランブル鞭毛虫株は、ＷＢ（人からの単離物、AT
CC 30957）、Ｓ２（我々の実験室において羊から単離し
た株）、Ｄ３（我々の実験室において犬から単離した
株）、およびＮ（我々の実験室においてBotwood、 Newfo
undlandの飲料水から単離した株）であった。

【０１１４】使用した全ての株のジアルジア栄養型を継
代培養する目的で下記の操作を用いた。ジアルジア属を
増殖させて後期対数期に入らせた（７２時間）後、培養
管を氷の中に１０から１５分間入れることで冷衝撃を与
えた。層流れフード下、新鮮な培養管各々に約７−８ｍ
ｇのピペラシリン（Piperacillin）（Pipracil、 Lederl
e）を入れた後、新しい管各々に新鮮なＴＹＩ−Ｓ−３
３培地を１５ｍＬ加えた。冷衝撃を与えた後、後期対数
期のジアルジア属が入っている管を数回逆さにすること
で、沈降および粘着している集団を混合した。１ｍＬの
無菌ピペットを用い、１ｍＬの栄養型を取り出した後、
その新しい培養管に加え、このピペットを１から２回フ
ラッシュ洗浄した。新しい管をパラフィルム（Parafil
m）でシールした後、直立させて３７℃の培養器の中に
入れた。継代培養を再び３から４日間行った。

【０１１５】二者択一的に、二重表面ガラス製のローラ
ーボトル（Bellco Cat. #7730-38910）の中でジアルジ
ア属栄養型を培養した。７２時間の培養後、１ｍＬの培
養培地当たり１０⁶個の栄養型から成る濃度が容易に得
られる。各々のローラーボトルは約６５０ｍＬの培地を
必要とした。如何なる大きな気泡も追い出してこのボト
ルを充分に満たす目的で、この培地を使用に先立って３
７℃に温めた。このボトルの上部で高濃度のピペラシリ
ンに栄養型が暴露されるのを回避する目的で、この抗生
物質を最初にいくらかの培地（最終濃度１ｍＬ当たり約
０．５ｍｇまで）の中に溶解させ、この溶液をそのボト
ルの中に注ぎ込み、このボトルにその培地を更に加えて
その上部近くまで満たし、ジアルジア属を加え（上に示
した如く冷衝撃を与えた最小で１０⁶個の栄養型）、こ
のボトルの上部まで満たし、ピペットを用いて如何なる
気泡も除去した後、このボトルをパラフィルムでしっか
りと密封する。このローラーボトル装置（Wheaton Mode
l III）をモーター出力の６−８％に設定（１分当たり
２回の回転）して、ボトルを３−４日間培養した。 ４．ジアルジア属栄養型の収穫 ジアルジア属の栄養型を下記の如く収穫した。ジアルジ
ア属を増殖させて後期対数期に入らせた（７２時間）
後、管またはボトルを氷の上に置くことで（１０ｍＬの
管および３０ｍＬの管では１５−２０分間、ローラーボ
トルでは４５分間）冷衝撃を与えた。次に、管またはボ
トルを数回逆さにした後、この内容物を無菌遠心分離管
またはボトルの中に注ぎ込む。これらを５００ｘｇで１
０分間４℃で高速回転させることにより、これらの栄養
型をペレットにする。培地を取り出し、そしてこのペレ
ットを無菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）の中に再懸濁させるこ
とでこの培地の元の体積にした。この懸濁液を５００ｘ
ｇで１０分間４℃で高速回転させた。上澄み液を取り出
し、そしてその栄養型を新鮮なＰＢＳの中に再懸濁させ
た。ＰＢＳ洗浄を全体で４回行った。最終的な高速回転
を行った後、その栄養型を再懸濁させて、ＰＢＳ中所望
濃度とした。

【０１１６】これらの栄養型に損傷を与えないように低
速で遠心分離し、このようにして生じたペレットは非常
に柔らかであり、そしてこれらの有機体は自動性を示
す。このペレットそれ自身が再懸濁する前にその上澄み
液を除去するような迅速な行動を取ることが重要であ
る。

【０１１７】５．ジアルジア属栄養型の音波処理 Virsonic Cell Disrupterを用いてジアルジア属栄養型
の音波処理を行った。２０秒間の破壊を３回行うことで
一般に充分である。血球計数器を用いて無傷の栄養型が
存在していることを検査した。完全な崩壊が必要な場
合、追加的破壊を用いた。常に栄養型を氷の上に保持
し、そして破壊と破壊の間は、７０％のエタノールを用
いてその音波処理装置の先端を冷却した。音波処理物を
一定分量に分けて−２０℃で保存した。

【０１１８】６．全音波処理物ワクチンの製造 ジアルジア属の全音波処理物ワクチンを下記の如く製造
した。その音波処理物の蛋白質濃度を測定（BIORAD蛋白
質アッセイ）した後、無菌ＰＢＳ中０．７５ｍｇ／ｍＬ
になるように調整した。この溶液を、前に記述したみょ
うばんを基とするアジュバントと４：１で混合すること
で、次の試験における動物の免疫化で用いた。

【０１１９】７．ジアルジア属トキシンの濃縮 Amicon装置（Model No. 8200）を用いてジアルジア属培
地および非常に希釈されているサンプルを濃縮すること
で、有効なトキシン濃度を達成した。この装置では、指
定ＭＷカットオフが備わっている膜を通して水および低
分子量（ＭＷ）粒子を追い出すようにＮ₂圧力が用いら
れている。これらの試験で用いる膜ＹＭ−１０は、１
０，０００のＭＷカットオフを有している。この装置に
はまた、この膜に蛋白質が詰まらないようにして水をよ
り容易に通すことを可能にする撹拌棒が備わっている。

【０１２０】同じ蛋白質に関しては、時には膜を２回以
上用いた。使用後、これらの膜をｄＨ₂Ｏの中で濯いだ
後、１０％のエタノールの中で冷蔵した。新しい膜をｄ
Ｈ₂Ｏの中に１時間浸し、水を３回交換することで、こ
の膜の防腐剤を除去した。

【０１２１】８．若い子猫モデル モデル感染システムとして若い（６−８週）子猫を用い
ることの可能性に対する調査を、我々の初期研究として
行った。ジアルジア属が存在していない状態であること
を確かめる目的で、条件付けを行っている期間の間、こ
れらの子猫の便に対して便浮選を数回行った。子猫（ｎ
＝６）に麻酔をかけ、側腹切開を行って、これらの子猫
に、１．０ｍＬのＰＢＳ中１．０ｘ１０⁶個のランブル
鞭毛虫栄養型を十二指腸内接種した。２匹の子猫の各々
に下記のランブル鞭毛虫株を受けさせた。１）ＷＢ株
（充分に特徴付けされている人からの単離物、ATCC 309
57）；２）Ｓ２株（我々の実験室が羊から単離した
株）；または３）Ｄ３株（我々の実験室が犬から単離し
た株）。

【０１２２】臨床的な兆候を監視し、感染直後７日間の
間、のう子に関する便検査を４回行った（表１）。音波
処理した個々のジアルジア属株（即ちそれぞれＷＢ、Ｓ
２、Ｄ３）に対するＩｇＭタイターおよびＩｇＧタイタ
ー（表２）を測定する目的で、実験的感染を行ったその
日と７日後（と殺した日）に血清サンプルを採取した。
各々の子猫から得た長さが１．０ｃｍの十二指腸に関し
て栄養型の数測定を行い、そして組織サンプルを採取し
て光顕微鏡および電子顕微鏡で検査した。胆汁と粘膜切
屑を集め、そして後の局所的免疫学応答試験および酵素
アッセイを行う目的で冷凍（−７０℃）保存した。

【０１２３】ＷＢおよびＳ２に感染させた子猫の十二指
腸、空腸および回腸（より低い度合）の中に、ランブル
鞭毛虫に典型的な形態を有する原生動物寄生性生物が見
られた。これらの顕微鏡技術のいずれを用いても、Ｄ３
に感染させた子猫の中には栄養型の証拠は全く見られな
かった。このような試験的調査を基にして、更に一層の
試験で子猫感染モデルを用いることを決定した、と言う
のは、このモデルでは、ジアルジア属株が感染して臨床
的兆候を生じるからである。

【０１２４】

【表１】 表１：ジアルジア属に感染させた子猫の臨床的兆候 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 子猫番号 ジアルジア属株 現れる症状 ジアルジア属の便結果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ ＷＢ 軟便 陰性 ２ ＷＢ 軟便 陰性 ３ Ｓ２ 下痢 陽性 ４ Ｓ２ 軟便 陽性 ５ Ｄ３ 下痢 陰性 ６ Ｄ３ 軟便 陰性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【０１２５】

【表２】 表２：ジアルジア属に対する子猫血清ＥＬＩＳＡタイター ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 子猫番号 ジアルジア属株 ０日タイター ７日タイター ＩｇＭ ＩｇＧ ＩｇＭ ＩｇＧ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ ＷＢ ８ １ ８ ２５６ ２ ＷＢ １６ ０ １６ １６ ３ Ｓ２ ６４ ４ ６４ １２８ ４ Ｓ２ ６４ ０ ６４ ６４ ５ Ｄ３ ６４ ２ ３２ ６４０ ６ Ｄ３ ３２ ４ ３２ ２５６ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【０１２６】

【表３】 表３：十二指腸組織の栄養型数 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 子猫番号 ジアルジア属株 栄養型数 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ ＷＢ ８．７５ｘ１０³ ２ ＷＢ ５．０ｘ１０³ ３ Ｓ２ ０ ４ Ｓ２ ２．０ｘ１０⁴ ５ Ｄ３ ０ ６ Ｄ３ ０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ９． 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ） ２ｍＭのＥＤＴＡ中、１体積当たり１０重量％で組織を
均一化することによって、猫および犬の腸粘膜均一サン
プルを調製した後、−８０℃で貯蔵した。サンプルを解
凍し、ＰＥＰＢＳ（２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳ
Ｆ）で１：２（猫）または１：１（犬）に希釈し、この
混合物を１８Ｇの針に５回通すことで分散させた後、１
７，０００ｘｇで２０分間高速回転させた。可溶蛋白質
画分を含んでいる上澄み液を用いてこのＥＬＩＳＡを行
った。血清および胆汁サンプルを−８０℃で保存し、解
凍し、ＰＥＰＢＳで２倍希釈し、遠心分離にかけた後、
このＥＬＩＳＡの実施で用いる目的で上澄み液を取り出
した。全てのサンプルに関して重複分析を行った。

【０１２７】ＰＢＳ中２％の、ガンマグロブリンが入っ
ていないＦＣＳを用い、３７℃で１時間、３回洗浄を行
うことにより、イヌＩｇＧ血清アッセイ以外の全てのア
ッセイに関するブロッキングを行った。イヌＩｇＧ血清
アッセイでは、ＰＢＳ中１０％のスキンミルク粉末を用
いたブロッキングを３７℃で１時間行った。

【０１２８】ネコＩｇＧアッセイでは、その抗原とし
て、音波処理したジアルジア属（Ｓ２）を用いた。音波
処理したＳ２（ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍＬ）を各々のウ
エル（ウエル１個当たり１００μＬ）に加えた後、４℃
で一晩培養した。次に、これらのウエルをＰＢＳ−Twee
nで洗浄（３回）した。上に記述した如く調製した血
清、胆汁または腸粘膜上澄み液を、その一次抗体として
用いた（３７℃、１時間、３回の洗浄）。その二次抗体
として、ヤギ抗ネコＩｇＧ−ＨＲＰ（KPL cat. #04200
2）をＰＢＳ中に１：１０００で希釈したものを用いた
（３７℃、１時間、４回の洗浄）。

【０１２９】ＩｇＡネコアッセイでは、その抗原とし
て、音波処理したジアルジア属Ｓ２株を用いた。上に記
述した如く調製した血清、胆汁または腸粘膜上澄み液
を、その一次抗体として用いた。その二次抗体として、
ヤギ抗ネコＩｇＡ（Bethyl Lab.cat. #A20-101）をＰＢ
Ｓ中に１：２５０で希釈したものを用いた（３７℃、１
時間、４回の洗浄）。その三次抗体として、ラビット抗
ヤギＩｇＡ−ＨＲＰ（Sigma cat. #A-4174）をＰＢＳ中
に１：５００で希釈したものを用いた（３７℃、１時
間、４回の洗浄）。

【０１３０】イヌのアッセイでは、ネコのアッセイで記
述した如く、音波処理したジアルジア属Ｓ２株を用いて
そのウエルをコートした。上に記述した如く調製した血
清、胆汁または腸粘膜上澄み液を、その一次抗体として
用いた。その二次抗体として、ヤギ抗イヌＩｇＧ−ＨＲ
Ｐ（KPL cat. #041902）またはヤギ抗イヌＩｇＡ−ＨＲ
Ｐ（Bethyl Lab. cat. #A40-104P）をＰＢＳ中に１：１
０００で希釈したものを用いた。

【０１３１】実施例１株の選択および保存 我々の標準的実験室方法を用いて、ＴＹＩ−Ｓ−３３培
地が入っている管中インビトロで、種々のランブル鞭毛
虫株を増殖させた。一次および二次ストックを−７０℃
で凍結させて保存した。これらの３種のランブル鞭毛虫
株（ＷＢ、Ｓ２、Ｄ３）の増殖曲線を測定（図１）し、
そしてこれらを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞のトキシン応答（細胞伸長）に対して比較した
（図２−４）。Ｄ３は最も印象的な増殖特性を示した
が、これらの３種全ての株は、インビトロで適当な増殖
能力を示し、標的動物種に感染する能力を有すると共
に、ＣＨＯ細胞に毒性効果を示すことから、明らかに有
望であった。

【０１３２】実施例２子猫の予防接種−実験的感染 この調査では、下記の実験グループを確立した：グルー
プＡ−上に記述したアジュバントの０．２ｍＬと０．８
ｍＬのＰＢＳを皮下投与することで７匹の子猫の模擬免
疫化を行った後、２８日後に、１．０ｍＬのＰＢＳ中１
ｘ１０⁶個の生存能力のある栄養型を十二指腸内接種す
ることによって、ランブル鞭毛虫株Ｓ２に感染させたグ
ループ；グループＢ−０．２ｍＬのアジュバントとＳ２
の濃縮（１０ｘ）培養物の上澄み液の０．８ｍＬ（７５
０μｇの蛋白質／ｍＬ、そしてＣＨＯ細胞毒性活性を示
すことが示されたもの）を皮下投与することで３匹の子
猫に予防接種し、２１日後に同じ調合物をブースター投
与した後、２８日後にＳ２で十二指腸内感染させたグル
ープ；グループＣ−０．２ｍＬのアジュバントと音波処
理した全Ｓ２栄養型の０．８ｍＬ（７５０μｇの蛋白質
／ｍＬ）を皮下投与することで８匹の子猫に予防接種
し、２１日後に同じ調合物をブースター投与した後、２
８日後にＳ２で十二指腸内感染させたグループ。

【０１３３】臨床的兆候を監視し、そして感染後４２日
間、定量的に便のう子数を毎日数えた。これらの子猫の
体重を毎日測定し、予防接種していないグループ（グル
ープＡ）とＳ２音波処理物ワクチンのグループ（グルー
プＣ）に関する成長曲線を生じさせた。血清サンプルを
毎週および死後入手して、ＩｇＧのＥＬＩＳＡタイター
を測定した。安楽死させた後、腸サンプル（十二指腸、
空腸、回腸）を取り出して、栄養型数、光顕微鏡および
電子顕微鏡測定を行った。粘膜切屑、血清サンプルおよ
び胆汁を採取し、凍結（−７０℃）貯蔵することで、免
疫学的分析および酵素的調査を行った。

【０１３４】この試験において、全ての子猫で、間欠的
下痢または軟便が不規則に見られた。予防接種していな
い動物と予防接種した動物の間には、ひどさに関する差
は観察されなかった。予防接種していないグループＡ、
および音波処理したＳ２で予防接種したグループＢに関
する、ランブル鞭毛虫感染させた後の体重上昇データを
図５に示す。予防接種した子猫は、予防接種していない
対照に比べて、この試験期間中有意に体重が上昇した。
血清ＩｇＧのＥＬＩＳＡで測定した、上記３種の実験グ
ループの子猫に関する免疫学的応答を図６に示す。グル
ープＢ（トキシンで免疫化した）およびグループＣ（音
波処理したＳ２で免疫化した）の両方共、免疫化および
ブースター投与に典型的な応答である、血清ＩｇＧの有
意な上昇を示した。これらの免疫化した動物をジアルジ
ア属に後感染させた時見られるタイター上昇は、最小限
のみであった。それとは対照的に、グループＡ、即ち免
疫化しないで感染させた子猫は、感染させた後でのみ応
答を示したが、これの血清タイターの上昇は最小限であ
った。図６にはまた、免疫化せずそして感染させていな
い子猫１匹（ｎ＝１）に関するＩｇＧタイターも含め
る。全ての子猫の十二指腸、空腸および回腸から得られ
る１．０ｃｍの腸セグメントに対して、腸栄養型数を数
えた。その結果を図７に示す。音波処理したＳ２栄養型
を用いた免疫化（グループＣ）では、予防接種していな
い子猫（グループＡ）と比較して、十二指腸および空腸
の腸内腔内に存在している栄養型の数が減少していた。
トキシンで免疫化した（グループＢ）の動物で得られる
データは、説得力の低いものである、と言うのは、恐ら
くは、このグループの「ｎ値」が比較的小さい（ｎ＝
３）ことによるものであろう。二者択一的に、トキシン
単独を用いた免疫化は、感染を生じさせることなく症状
を防止するか、或はより多い服用量のトキシンはより高
い効果を示し得る。興味の持たれることに、家庭用猫の
ジアルジア鞭毛虫症に関して典型的に記述されているよ
うには³⁰、回腸の中に栄養型を見付け出すのは容易でな
かった。上に記述した腸栄養型データに関する変化もま
た図８に示し、ここでは、栄養型が見られる腸サンプル
のパーセントを実験グループの中で比較する。ジアルジ
ア属栄養型の存在に関して、音波処理したＳ２で免疫化
した（グループＣ）子猫では、免疫化していない（グル
ープＡ）およびトキシンで免疫化した（グループＢ）子
猫に比較して、腸サンプルの比較的低いパーセントが陽
性を示した。

【０１３５】音波処理したＳ２栄養型を用いた免疫化に
より、子猫ののう子排泄のひどさが低下した。

【０１３６】選択した腸組織サンプルの顕微鏡検査によ
り、免疫化していない子猫の中には栄養型が存在してい
たが、音波処理したＳ２で免疫化した子猫に関しては全
くか或はほとんど存在が観察されなかった。

【０１３７】血清および腸粘膜内のＩｇＡレベルに関す
る免疫学的試験結果を表４に示す。予防接種せずそして
チャレンジしていない動物では全くＩｇＡ応答が記録さ
れなかった。Ｓ２音波処理物で予防接種した後、チャレ
ンジした動物では、強いＩｇＡ応答が記録された。それ
とは対照的に、予防接種しないでチャレンジした動物が
示すＩｇＡ応答は弱かった。トキシンで予防接種した
後、チャレンジした動物では、中程度のＩｇＡ応答があ
った。このように、予防接種は、自然感染よりも強力な
ＩｇＡ免疫応答を引き出した。予防接種をせずそしてチ
ャレンジしていない動物を含む、全ての胆汁サンプルに
おいて、非特異的免疫応答が記録された。

【０１３８】

【表４】

【０１３９】実施例３犬の予防接種−実験的感染 音波処理したジアルジア属株Ｓ２を用いた犬の予防接種
の効果に関する試験を下記の如く行った。８から１０週
令の子犬４匹から成る２つのグループを用いた。１つの
グループの動物（番号１から４）には、上に記述した如
く調製した音波処理ジアルジア属株Ｓ２が入っているワ
クチンを皮下注射した（１日）。上に記述したアジュバ
ントの０．２ｍＬと０．８ｍＬのＰＢＳの中に６００μ
ｇの蛋白質が含まれているワクチンを、各々の動物に受
けさせた。もう１つのグループ（番号５から８）には予
防接種を行わなかった。

【０１４０】３週間後（２１日）、動物１から４に、上
と同じジアルジア属ワクチンの補助予防接種を受けさせ
た。動物５から８には予防接種を行わなかった。２８日
目、全ての子犬に、４ｘ１０⁶個のランブル鞭毛虫株Ｎ
栄養型のチャレンジを行った。株Ｎは犬に高い感染性を
示すことからこれを用いた。この挑戦用有機体を、１．
０ｍＬのＰＢＳの中に入れて十二指腸内投与した。結果
は、ジアルジア属株Ｓ２を用いた免疫化は、ジアルジア
属株Ｎの感染に対して交差保護性を示すことを示してい
る。

【０１４１】チャレンジを行った後、血液サンプルを週
毎に採取し、そして全ての動物を５６日目にと殺するま
で、堅さおよびのう子排出に関して便を毎日検査した。

【０１４２】予防接種は下痢に対して犬を保護してお
り、予防接種した動物が示す下痢は平均で２．２±１．
５日である一方、予防接種していない動物が示す下痢は
平均で８．２±５．６日であった。

【０１４３】のう子の排出データは、予防接種した動物
が排出するのう子数は予防接種していない動物よりも少
ないことを示していた。結果を図９に示す。

【０１４４】長さが１ｃｍの腸セグメントをＰＢＳの中
に懸濁させ、そして３７℃で１時間振とうした。血球計
数器を用いて栄養型の数を数えた。結果を表５に示す。
予防接種により、免疫化した動物の腸の全ての領域でジ
アルジア属栄養型がなくなっていた。

【０１４５】

【表５】 表５：腸１ｃｍ当たりの栄養型数 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 免疫化したもの 免疫化していないもの ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 十二指腸 空腸 回腸 十二指腸 空 腸 回 腸 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 平均 ０ ０ ０ ０ ３００００ ３１３ ＳＤ ０ ０ ０ ０ ４４２００ ６２５ ＳＥ ０ ０ ０ ０ ２２１００ ３１３ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ このワクチンは、ジアルジア属に対して特異的な血清お
よび粘膜免疫応答を誘発した。予防接種後３週間で始ま
る、このワクチンに対する強力な血清ＩｇＧ応答が存在
していた。それとは対照的に、予防接種していない犬
は、感染４週間後に弱い応答を示したのみであった。

【０１４６】予防接種して６週でチャレンジした時、若
干から中程度の血清ＩｇＡ応答が存在していたが、予防
接種していない動物では全く血清ＩｇＡ応答がなかっ
た。両方のグループ共、死後、胆汁中に検出可能なＩｇ
Ａを有していた。予防接種した動物および予防接種して
いない動物の十二指腸および回腸の中でＩｇＡが検出さ
れた。

【０１４７】実施例５トキシンの産生、精製およびアッセイ ランブル鞭毛虫のＷＢ単離物を、ＮＣＴＣ−１０９ビタ
ミンミックス（３％）、ＣＬＥＸ（１０％）、胆汁
（０．８ｇ／Ｌ）およびピペラシリンを補ったＴＹＩ−
Ｓ−３３培地中３７℃で１０日間培養した。３日の間隔
で移しながら、培養物を対数期に維持した。１０日後、
この培地（「条件付けした培地」）を３，０００ｘｇで
１５分間遠心分離し、無菌濾過（０．２２μのフィルタ
ー−NalgeneCo.）した後、ＹＭ−１０膜フィルターが備
わっているAmicon装置を用いて濃縮した。

【０１４８】チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ
−Ｋ１（ATCC No. CCL61）を、相対湿度が９０％の３７
℃で、５％のＣＯ₂中、アミノ酸類と共に１０％の牛胎
児血清（ＦＣＳ）および０．５％のペニシリンとストレ
プトマイシンを補ったイーグルのアルファ最少必須培地
（ＭＥＭ）の中で増殖させた。

【０１４９】形態学的試験に関して、９６個のウエルが
備わっている組織培養プレート（Linbro Corp.）の各々
のウエルに、２００μＬの培地中５ｘ１０³個のＣＨＯ
細胞から成る懸濁液を入れた後、５％のＣＯ₂中３７℃
で４８時間培養した。各々のウエルの中の培地をピペッ
トで集めて、１５０μＬの新鮮な培地で置換した。試験
すべき基質の５０μＬを、第一列のウエルに加え、そし
てこの列の最後に至るまで、連続的な４倍希釈を行った
（１２個のウエル）。このプレートを再び４８時間培養
した。次に、各々のウエルをギムザ染色で染色し、そし
て長く伸びた細胞のパーセントを測定した。このグラフ
上の形態学データ各々は、数を数えた５００個の細胞か
ら長く伸びた細胞の平均パーセントを表している（図１
０）。ランブル鞭毛虫の濃縮培地に関する分析結果を、
ジアルジア属が入っていない濃縮培地の対照と比較し
た。コレラトキシン（Sigma Corp.）および百日咳トキ
シンを正の対照として用いた。コレラトキシンは、特徴
的な伸長反応を引き出し、そして百日咳トキシンは、特
徴的な凝集反応を引き出す。

【０１５０】ＣＨＯ細胞の形態に対する、これらの濾液
の希釈度を変化させることによる効果を、図１０に示
す。濃縮したジアルジア属１０日培地（ＧＭ）に暴露し
た後の細胞の伸長率は顕著である。同じ希釈度の濃縮対
照無菌培地（ＣＭ）に暴露した時、ＣＨＯ細胞はまた伸
長を示したが同じ度合ではなかった。このＣＭは、より
高い濃度のときある程度の形態学的応答を示し、元の濃
度の０．２５倍の濃度のとき最大の応答が得られたが、
それでもＣＨＯ細胞の３１．６％のみの伸長であった。
このＧＭは、より高い濃度の時ずっと大きな効果をＣＨ
Ｏ細胞形態にもたらし（元の濃度の０．２５倍の時７５
％）、そしてまた、非常に低い濃度でも伸長を生じさせ
た。元の濃縮したジアルジア属培地の１．５ｘ１０^-5以
上の濃度の時、ＣＨＯ細胞の伸長が生じた。第一希釈の
後ＧＭを上昇させることによってその伸長が生じた後、
希釈するにつれて減少し始めた（図１０）。

【０１５１】１０個の培養管の中に入っている１６．０
ｍＬの新鮮なＴＹＩ−Ｓ−３３培地の中に、０日の時、
５００，０００個の栄養型を接種した。１つの管をラン
ダムに選択して栄養型の数を毎日数えた。この培地のサ
ンプル２．０ｍＬを取り出した後、０．２２μのフィル
ター（Costar Corp.）を用いて無菌濾過した。この滅菌
した培養培地の１ｍＬを４℃で冷蔵し、そして他方の
１．０ｍＬを−７０℃で冷凍した。この操作を８日間繰
り返した。集めた培養培地の画分各々を、上に記述した
如きＣＨＯ細胞バイオアッセイで分析した。

【０１５２】健康な対数期のジアルジア属栄養型を、２
０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄し、
５，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、１．０ｍＬ
の緩衝液の中に再懸濁させた。次に、１５秒の破壊１回
で、これらの栄養型を音波処理し、そしてこの音波処理
物を、生存している栄養型に関して光顕微鏡で試験し
た。シトゾル内容物を集める目的で、その音波処理物を
０．２２μのフィルター（Costar Corp.）で濾過した。
このフィルターを１．０ｍＬの緩衝液で逆洗浄すること
により、それらの膜とシトゾル画分を集めた。この緩衝
液、シトゾル画分および膜画分を、ＣＨＯ細胞バイオア
ッセイにより、毒性活性に関して分析した。増殖培地
（ＧＭ）タイターとジアルジア属増殖の曲線関係を、図
１１に示す。これらのジアルジア属栄養型は分割して、
対数様式で数が上昇した。１日目では、遅滞期の証拠が
存在しており、２日目には促進期に入り、そして３日目
には減速期に入る。その後、この栄養型の数は一定して
少なくなる。これらの栄養型の数は３日で最大値に到達
し４ｘ１０⁷個であった。この培地のタイターは１日後
上昇し始め、そしてこれらの栄養型の増殖段階の間上昇
した。３日後、この栄養型数は少なくなり始めた時、こ
のタイターは上昇し続けた。

【０１５３】ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、
トキシン培地内の蛋白質を分離した。このゲルを、クー
マシーブリリアントブルーで染色した。この対照培地
を、ジアルジア属音波処理物（シトゾル内容物）、その
中で３、４、５、６、７、１０および２５日間増殖させ
たランブル鞭毛虫が入っているトキシン培地、並びにＦ
ＣＳと比較した。トキシンが入っている培地は、分子量
が約２２、３２、３８、３９の蛋白質と、９７ｋＤａ以
上の分子量を有する蛋白質を含んでいるが、これらは、
対照培地の中には存在していない。

【０１５４】そのトリス緩衝液、並びにその音波処理し
た栄養型から得られる膜および細胞骨格画分は、毒性活
性に関して陰性であった。そのシトゾル画分は、その最
大濃度で細胞の死滅を生じさせ、そしてより低い濃度で
は細胞を生存させそして伸長させた。このような発見
は、ＧＭを用いたとき得られる結果と類似している。

【０１５５】トキシン産生に対する胆汁の効果を図１２
に示す。胆汁が入っている培地の中で増殖させたジアル
ジア属は、ＣＨＯ細胞伸長で測定して、トキシンを産生
した。胆汁無しの培地で増殖させたジアルジア属は産生
しなかった。

【０１５６】実施例６成体猫の免疫化 ３種のランブル鞭毛虫株の抽出物を用いた免疫化に対す
る成長した猫の免疫学的応答を調査する目的で追加的試
験を行った。１２匹の成体猫を、音波処理したランブル
鞭毛虫株ＷＢ（３７３μｇの蛋白質／ｍＬ）（ｎ＝
４）、Ｓ２（８６４μｇの蛋白質／ｍＬ）（ｎ＝４）お
よびＤ３（１２０μｇの蛋白質／ｍＬ）（ｎ＝４）で免
疫化した。前に記述したアジュバントの０．２ｍＬと
０．８ｍＬの音波処理物から成るワクチンの１．０ｍＬ
を皮下注射で受けさせることにより、猫の予防接種を行
った。２１日後、これらの猫にブースター投与し、そし
て更に２１日後２回目の補助投与を行った。免疫化前の
血液サンプルを採取し、そして全ての猫に関して、各々
の促進免疫化後７日で、ＩｇＧのＥＬＩＳＡのためのサ
ンプリングを行った。以下に示す表（表６）は、この試
験で得られる免疫学的データの要約である。成熟した猫
は、上の実験（即ち表２）で記述した若い子猫よりも高
い、ジアルジア属に対する初期ＩｇＧタイターを示し、
そしてこれらの成熟した猫は、ＩｇＧタイターが有意に
上昇すると共に予防接種に対する応答を示した。

【０１５７】

【表６】

【０１５８】実施例７子羊の免疫化 平均体重が１８ｋｇの、Caesarean誘導子羊の５匹を、A
griculture Canada、 Lethbridge、 Alberta、 Canadaの羊
（Romanof交雑種）集団から選択した。最初の予防接種
を行うその日に、免疫化前の血液サンプルを採取した。
次に、これらの子羊に、１ｍＬのワクチンを筋肉内注射
（ＩＭ）で接種した。このワクチンは、前に記述した如
く調製した音波処理ランブル鞭毛虫栄養型（Ｓ２株）の
０．８ｍＬを用い、その前日に再懸濁して、１ｍＬのＰ
ＢＳ（燐酸塩緩衝食塩水）当たり０．７５ｍｇの蛋白質
を得るように調製したものであった。次に、この音波処
理した溶液を、みょうばんを基としたアジュバントの
０．２ｍＬに加えることにより、最終蛋白濃度である
０．６ｍｇ／ｍＬを得た。

【０１５９】３週間後、別の血液サンプルを採取した
後、これらの子羊に、最初の注射と同じ２番目の注射
（補助服用）をまたＩＭで受けさせた。その最初の接種
後５５週および７０週で、血液サンプルを採取した。こ
の注射した部位を定期的に監視したが、異常な反応は全
く観察されなかった。

【０１６０】採血した後直ぐこの血液を遠心分離にか
け、そして分析するまで血清を凍結した。ランブル鞭毛
虫に特異的な抗体タイターの検出をＥＬＩＳＡ（酵素結
合イムノソルベント検定法）試験を用いて行った。重複
してサンプルを実験した。ラビット抗−ヒツジＩｇＧ
ＨＲＰ接合試薬（ICN Cat. #674531）を二次抗体として
用いる以外は前に記述したネコＩｇＧアッセイと同じ様
式で、このＥＬＩＳＡを行った。負の対照として０週を
用いた。タイターの結果を表７に示す。

【０１６１】これらの子羊は、このワクチンを１回接種
した後でさえ、ランブル鞭毛虫に対して有意に抗体タイ
ターを上昇した。３週目に行ったブースター接種によ
り、この初期の免疫応答が上昇した。

【０１６２】

【表７】

【０１６３】実施例８ １０ＸのＴＹＩ−Ｓ−３３で条件付けした培地の硫酸ア
ンモニウム分別 ランブル鞭毛虫のＳ２単離物を実施例５に記述したのと
同様にして培養した。１０倍濃度のＴＹＩ−Ｓ−３３で
条件付けした培地と対照培地を、前に記述した如きＣＨ
Ｏ伸長アッセイにおけるトキシン活性に関して、０−４
０％、４０−６０％、６０−８０％の硫酸アンモニウム
ペレット、８０−１００％の上澄み液および１００％の
硫酸アンモニウムペレットに対して比較した。結果を表
８に示す。ＣＨＯ細胞の５０％伸長を生じさせる１０Ｘ
培地の最大希釈度として活性を定義した。

【０１６４】硫酸アンモニウム分別により１１５．９倍
（６４００／５５．２）の精製度が得られた。回収は１
０％であった。

【０１６５】活性を示す画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの
上を流した。対照培地にも条件付けした培地にも検出さ
れないユニークな帯が、硫酸アンモニウム画分の中に見
られた。これらの帯は、６５−５０ｋＤａ、４２−３６
ｋＤａ、２８−２５ｋＤａおよび２０−１６ｋＤａの範
囲の分子量を有している。他の蛋白質も存在し得るが検
出不可能である。

【０１６６】

【表８】 表８ １０ＸのＴＹ５−Ｓ−３３で条件付けした培地の硫酸アンモニウム分別 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 活 性 活性 特異性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 対照１０Ｘ ＴＹＩ−Ｓ−３３ ８ ５．１ 条件付けした１０Ｘ ＴＹＩ−Ｓ−３３ ３２ ５５．２ ０−４０％の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ８ ５．３ ４０−６０％の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４ ２．２ ６０−８０％の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４ １．０ ８０−１００％の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３２ ６４００．０ １００％のペレット ＮＤ＊ ＮＤ＊ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊ 活性を検出せず。

【０１６７】実施例９子犬および子猫の免疫化 子犬（３３）と子猫（３３）をランダムに割り当てて、
予防接種グループ（２０匹の子犬と２０匹の子猫）、対
照の予防接種無しグループ（１０匹の子犬と１０匹の子
猫）および対照の処置無しグループ（３匹の子犬と３匹
の子猫）を生じさせた。０日および２１日目に、胆汁が
入っている培地の中で増殖させたジアルジア属Ｓ２栄養
型を含んでいるジアルジア属ワクチンの１．０ｍＬを、
２０匹の子犬と２０匹の子猫に皮下予防接種した。予防
接種無しの対照グループには食塩水のみを受けさせた。

【０１６８】ポリスチレン製のボトル（１．２から２．
５Ｌ）の中に入っている胆汁を含む培地の中で栄養型を
培養し、３４から３７℃で４８から９６時間培養するこ
とによって、ワクチンの調製を行った。ボトルを２４時
間以内に２から７℃に冷却することで、栄養型が脱離し
て増殖表面を生じるのを可能にした。栄養型を収穫した
後、連続流のローター遠心分離で濃縮した。次に、この
濃縮した栄養型を遠心分離にかけ、冷標準食塩水で２回
洗浄した後、元の培養体積の５から１０％になるように
再懸濁した。この懸濁液を高圧ホモジェナイザーにより
２回均一化することにより、栄養型の全体的崩壊を達成
した。この均一化させた懸濁液が含んでいる全蛋白質は
１ｍＬ当たり２００μｇ以上であった（Biorad蛋白質ア
ッセイ）。ワクチンの各々１．０ｍＬは、０．９ｍＬの
標準食塩水と０．１ｍＬのみょうばんを基とするアジュ
バントの中に蛋白質を１５０μｇ含んでいた。

【０１６９】３５日目、この予防接種したグループと対
照の予防接種無しグループに、１００万個のランブル鞭
毛虫栄養型を用いた十二指腸内接種の挑戦を行った。ジ
アルジア属Ｓ２株を用いた挑戦を子猫に行い、そしてＮ
株を用いた挑戦を子犬に行った。この病気に関する３５
日から５６日の臨床的症状（下痢、食欲不振、活動）を
毎日記録し、そして動物の体重を毎週測定した。便のサ
ンプルを毎週採取し、便ののう子の数を数えた。第一予
防接種の前およびこの試験全体を通して週毎に採血し
て、血清抗体レベルを測定した。５６日目、動物を安楽
死させた後、十二指腸、空腸および回腸のセグメントを
取り出して、栄養型の数を数えた。

【０１７０】予防接種した子犬の軟便は１２．３±１．
３日であり、そして下痢は０．２±０．１日であった
が、予防接種しなかった子犬の軟便は１５．１±１．３
日であり、そして下痢は０．６±０．２日であった。予
防接種した子猫の軟便は２．８５±０．６０日であった
が、予防接種しなかった子猫の軟便は４．４±０．９日
であった。従って、予防接種した動物に下痢または軟便
が生じる回数は減少していた。

【０１７１】活動に関しては予防接種動物と対照動物の
間には差が見られなかった。

【０１７２】予防接種した子犬と予防接種しなかった子
犬との間には、上昇率の差は存在していなかった。予防
接種しなかった子猫は、予防接種した動物に比較して、
感染後期間の間成長の遅れを示した（図１３）。

【０１７３】感染前および感染後期間の間のう子の数を
数えた。予防接種した動物は便にのう子を排泄しない
か、或はのう子排泄を示した期間は短かった。予防接種
しなかった動物は、より長い期間に渡ってより多くの数
ののう子を排泄した。

【０１７４】予防接種しなかった動物はより大きな比率
でジアルジア属ののう子を排出した。子犬でのう子を排
出したのは、予防接種した動物では０−５％であるのに
比較して、予防接種しなかった動物では２０−８０％で
あった。子猫でのう子を排出したのは、予防接種した動
物では０−３５％であるのに比較して、予防接種しなか
った動物では４０−８０％であった。

【０１７５】予防接種した子猫と予防接種しなかった子
猫に関して、のう子の生存能力を評価した。これらのの
う子をメチレンブルーで染色した後これらののう子が染
料を吸収するのを観察することによって上記を達成し
た。生存能力損失の指示である空胞化および異常構造に
関しても、のう子を検査した。のう子が排泄された時の
のう子の生存能力は、予防接種した動物では３８．８％
±５．０％であり、そして予防接種しなかった子猫では
９９．９％±０．１％であった。

【０１７６】剖検時に、前の実施例に記述した方法を用
いて、十二指腸、空腸および回腸内の栄養型の数を数え
た。これらの数および対数変換した数を表９から１２に
示す。予防接種した動物の栄養型出現率および栄養型数
は、予防接種しなかった動物よりも低かった。

【０１７７】この試験の最後に、予防接種した子犬の中
でその寄生性生物に感染したのは、これらの動物の５−
１０％であったが、予防接種した子猫の中で感染したの
は、これらの動物の０−５％であった。予防接種しなか
った動物の中でその寄生性生物に感染したのは、これら
の子犬の８０−９０％であり、そしてこれらの子猫の３
０−６０％であった。

【０１７８】

【表９】

【０１７９】

【表１０】

【０１８０】

【表１１】

【０１８１】

【表１２】

【０１８２】前の実施例に記述した方法を用いて抗体測
定を行った。予防接種した動物では体液免疫が明確な一
方、予防接種しなかった動物が示すジアルジア属寄生性
生物に対する応答は劣っていた。子猫における感染前お
よび感染後期間中の血清ＩｇＧ応答を図１４に示す。

【０１８３】本文中に示した如き本発明の教示を受けた
後の本分野の技術者に、本発明の種々の具体例を実施す
る上記様式の修飾形が明らかになるであろう。上に記述
した実施例は制限するものではなく単に本発明を例示す
るものであり、請求の範囲で本発明の範囲を定義する。

【０１８４】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。

【０１８５】１．保護免疫原性を示すように胆汁が入っ
ている培地の中で培養した腸原生動物のワクチン株。

【０１８６】２．ａ）胆汁が入っている増殖用培地中イ
ンビトロで腸原生動物の株を培養する結果として、保護
免疫原性を示すワクチン株を生じさせ、そして ｂ）その得られるワクチン株を単離する、ことを含む、
腸原生動物のワクチン株を製造する方法。

【０１８７】３．保護免疫原性を示すようにする目的で
胆汁が入っている培地の中で培養した腸原生動物のワク
チン株、上記腸原生動物の上記ワクチン株のサブユニッ
ト、上記腸原生動物のトキシン、およびそれらの組み合
わせから成る群から選択される免疫原を保護免疫原性量
で含んでいる、インビボ投与されたとき腸原生動物に対
する保護免疫を与えるワクチン組成物。

【０１８８】４．野生または家畜動物、食物製造で用い
られる動物、人、犬、猫または鳥種で用いるに適合して
いる第３項の組成物。

【０１８９】５．上記組成物内の上記腸原生動物以外の
腸原生動物門に対して交差保護免疫を与える第３項の組
成物。

【０１９０】６．ａ）腸原生動物のワクチン株を調製
し、そして ｂ）上記ワクチン株と薬学的許容担体とを一緒にする、
ことを含む、ワクチン組成物の製造方法。

【０１９１】７．保護免疫原性を示すようにする目的で
胆汁が入っている培地の中で培養した、感染の原因とな
る腸原生動物のワクチン株、上記腸原生動物の上記ワク
チン株のサブユニット、上記腸原生動物のトキシン、お
よびそれらの組み合わせから成る群から選択される免疫
原を有効量で含んでいる少なくとも１つの服用量を動物
に投与することを含む、動物における腸原生動物の感染
を予防または治療する方法。

【０１９２】８．上記有効量が、生存能力のある腸原生
動物のう子が動物内で落ちるのを防止するに充分な量で
ある第７項の方法。

【０１９３】９．上記投与を、症状を示すか或は症状を
示さない動物に対して行い、そして上記有効量が、上記
動物の成長速度を上昇させるに充分である第７項の方
法。

【０１９４】１０．上記動物が人であり、そして上記人
が慢性の腸原生動物感染を示している第７項の方法。

【０１９５】１１．上記投与を、食物製造で用いられる
動物に対して行い、そして上記有効量が、上記動物にお
ける飼料変換率を上昇させるに充分である第７項の方
法。

【０１９６】１２．胆汁が入っている培地の中で培養し
たときインビトロでトキシンを産生し得る腸原生動物の
株から単離される、腸原生動物のトキシン。

【０１９７】１３．上記腸原生動物に感染した動物に有
効量の上記トキシンが投与される時、上記トキシンによ
る免疫化で腸原生動物感染の症状を防止する、第１２項
のトキシン。

【０１９８】１４．上記トキシンが細胞毒性を示す効果
を生じる第１２項のトキシン。

【０１９９】１５．上記トキシンがエキソトキシンを含
んでいる第１２項のトキシン。

【０２００】１６．上記トキシンがエンテロトキシンを
含んでいる第１２項のトキシン。

【０２０１】１７．ａ）胆汁が入っている培地中インビ
トロで腸原生動物を増殖させることによって培養物を調
製し、そして ｂ）上記培養物からトキシンを単離する、ことを含む、
腸原生動物のトキシンを製造する方法。

【０２０２】１８．胆汁が入っている培地の中で腸原生
動物を培養するとき上記腸原生動物が産生する腸原生動
物トキシンに対する抗体。

【０２０３】１９．上記トキシンを中和する第１８項の
抗体。

【０２０４】２０．腸原生動物感染の症状を示す動物に
投与されたとき上記症状を和らげる第１８項の抗体。

【０２０５】２１．胆汁が入っている培地の中で原生動
物を培養するとき上記腸原生動物が産生する腸原生動物
トキシンに対する抗体の有効量を動物に投与することを
含む、腸原生動物の感染に敏感な動物またはそれに苦し
んでいる動物の中に受動免疫を与える方法。

【０２０６】２２．上記腸原生動物が、ジアルジア属、
クリプトスポリジウム、トリコモナド類、ヒストモナ
ス、スピロヌクレウス、アメーバ属、球虫類、トキソプ
ラスマまたは肉胞子虫属を含む第１、２、３、６、７、
１２、１７、１８または２１項いずれか記載の発明。

【０２０７】２３．上記ワクチン株がインビトロでトキ
シンを産生する第１、２、３、６または７項いずれか記
載の発明。

【図面の簡単な説明】

【図１】 種々のジアルジア属株の増殖を説明するもの
である。

【図２】 ＣＨＯ細胞におけるジアルジア属株Ｓ２のト
キシンタイターを説明するものである。

【図３】 ＣＨＯ細胞におけるジアルジア属株ＷＢのト
キシンタイターを説明するものである。

【図４】 ＣＨＯ細胞におけるジアルジア属株Ｄ３のト
キシンタイターを説明するものである。

【図５】 子猫における、ジアルジア属で挑戦した後の
体重上昇に対する予防接種の効果を説明するものであ
る。

【図６】 子猫における、免疫応答に対する予防接種の
効果を説明するものである。

【図７】 子猫における、ジアルジア属で挑戦した後の
栄養型数に対する予防接種の効果を説明するものであ
る。

【図８】 ジアルジア属で挑戦した後、栄養型が見られ
る子猫腸サンプルのパーセントに対する予防接種の効果
を説明するものである。

【図９】 予防接種した犬および予防接種していない犬
における、便ののう子排泄を説明するものである。

【図１０】 ＣＨＯ細胞に対するジアルジア属トキシン
の効果を説明するものである。

【図１１】 トキシン産生曲線を説明するものである。

【図１２】 ＣＨＯ細胞伸長で測定した、ジアルジア属
トキシン産生に対する胆汁の効果を説明するものであ
る。

【図１３】 子猫における、ジアルジア属でチャレンジ
する前と後の体重上昇に対する予防接種の効果を説明す
るものである。

【図１４】 子猫における、血清ＩｇＧタイターに対す
る予防接種の効果を説明するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/10 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:90） (72)発明者 ハワード・セリ カナダ・テイ２エル １エイチ２・アルバ ータ・カルガリー・ブルツクリンクレセン トノースウエスト3824 (72)発明者 ダグラス・ダブリユー・モーク カナダ・テイ４ビー １ゼツト５・アルバ ータ・エアドリー・メインストリート 649・ナンバー８

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 保護免疫原性を示すように胆汁が入って
   いる培地の中で培養した腸原生動物のワクチン株。
2. 【請求項２】 ａ）胆汁が入っている増殖用培地中イン
   ビトロ(in vitro)で腸原生動物の株を培養し、保護免疫
   原性を示すワクチン株を生じさせる工程、および ｂ）その得られるワクチン株を単離する工程、を含んで
   なる、腸原生動物のワクチン株の製造方法。
3. 【請求項３】 保護免疫原性を示すように胆汁が入って
   いる培地の中で培養した腸原生動物のワクチン株、上記
   腸原生動物の上記ワクチン株のサブユニット、上記腸原
   生動物のトキシン、およびそれらの組み合わせから成る
   群から選択される免疫原を保護免疫原性量で含んでな
   る、インビボ（in vivo）投与されたとき腸原生動物に
   対する保護免疫を与えるワクチン組成物。
4. 【請求項４】 ａ）腸原生動物のワクチン株を調製する
   工程、および ｂ）上記ワクチン株と製薬上許容される担体とを一緒に
   する工程、を含んでなる、ワクチン組成物の製造方法。
5. 【請求項５】 保護免疫原性を示すように胆汁が入って
   いる培地の中で培養した、感染の原因となる腸原生動物
   のワクチン株、上記腸内原生動物の上記ワクチン株のサ
   ブユニット、上記腸原生動物のトキシン、およびそれら
   の組み合わせから成る群から選択される免疫原を有効量
   で含んでいる少なくとも１つの服用量を動物に投与する
   ことを含んでなる、動物における腸原生動物の感染を予
   防または治療する方法。
6. 【請求項６】 胆汁が入っている培地の中で培養したと
   きインビトロ（in vitro）でトキシンを産生し得る腸原
   生動物の株から単離された、腸原生動物のトキシン。
7. 【請求項７】 ａ）胆汁が入っている培地中インビトロ
   （in vitro）で腸原生動物を増殖させることによって培
   養物を調製する工程、および ｂ）上記培養物からトキシンを単離する工程、ことを含
   んでなる、腸原生動物のトキシンの製造方法。
8. 【請求項８】 胆汁が入っている培地の中で腸原生動物
   を培養するとき上記腸原生動物が産生する腸原生動物ト
   キシンに対する抗体。
9. 【請求項９】 胆汁が入っている培地の中で腸原生動物
   を培養するとき上記腸原生動物が産生する腸原生動物ト
   キシンに対する抗体の有効量を動物に投与することを含
   んでなる、腸原生動物の感染に感受性の動物またはそれ
   に苦しんでいる動物に受動免疫を与える方法。