JPH0789911B2 - 昆虫に対する活性を有するセロリ・シャクトリ虫からの多重包埋核多角体病ウイルス - Google Patents
昆虫に対する活性を有するセロリ・シャクトリ虫からの多重包埋核多角体病ウイルスInfo
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- JPH0789911B2 JPH0789911B2 JP2505219A JP50521990A JPH0789911B2 JP H0789911 B2 JPH0789911 B2 JP H0789911B2 JP 2505219 A JP2505219 A JP 2505219A JP 50521990 A JP50521990 A JP 50521990A JP H0789911 B2 JPH0789911 B2 JP H0789911B2
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- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、昆虫に対して広い宿主域の活性スペクトラム
を有するセロリ・シャクトリ虫、即ちシングラハファル
シフェラ（Syngrapha falcifera）から単離する多重包
埋核多角体病ウイルスに関する。
を有するセロリ・シャクトリ虫、即ちシングラハファル
シフェラ（Syngrapha falcifera）から単離する多重包
埋核多角体病ウイルスに関する。
本発明に於いては、概念を正確に伝えるため次の略語を
使用する場合がある。
使用する場合がある。
AcMEV:多重包埋オートグラハ・カルホルニカ（Autograp
ha Californica Multiple Embedded）ウイルス HPV−85−CLMEV:多重包埋セロリ・シャクトリ虫（Celer
y Looper Multiple Embedded）ウイルス DOC:デオキシコール酸ナトリウム（Sodium Deoxycholat
e） HaMEV:多重包埋ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis ar
migera Multiple Embedded） IB:封入体（Inclusion Bodies） MEIB:多重包埋封入体（Mutiplc Embedded Inclusion Bo
dies） MENPV:多重包埋核多角体病ウイルス（Multiple Embedde
d Nuclear Polyhedrosis Virus） MEV:多重包埋（Multiple Embedded）ウイルス NPV:核多角体病ウイルス（Nuclear Polyhedrosis Viru
s） OS:懸濁原液（Original Suspension） PIB:多角体封入体（Polyhedra Inclusion Body（ie
s）） REN:制限酵素（Restriction Edonuclease） SDW:無菌蒸留水（Sterile Distilled Water） SEV:単純包埋（Single Embedded）ウイルス SoMEV:多重包埋スポドプテラ・オルニソガリ（Spodopte
ra ornithogalli Multiple Embedded）ウイルス TEM:透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Micros
copy） 背景技術 ウイルス、細菌、真菌、原虫などを含む微生物製剤によ
る昆虫の制御方法が多くの研究機関によって研究されて
いる。微生物殺虫剤は、環境に於いて特定の害虫にのみ
毒性を持っているが、他の生物には無害であると期待さ
れる。さらに、微生物殺虫剤は外界では急速に失活分解
し無害化してしまうと考えられる［A.Senuta,Agrichemi
cal Age,p.21（1987年１月発行）参照］。
ha Californica Multiple Embedded）ウイルス HPV−85−CLMEV:多重包埋セロリ・シャクトリ虫（Celer
y Looper Multiple Embedded）ウイルス DOC:デオキシコール酸ナトリウム（Sodium Deoxycholat
e） HaMEV:多重包埋ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis ar
migera Multiple Embedded） IB:封入体（Inclusion Bodies） MEIB:多重包埋封入体（Mutiplc Embedded Inclusion Bo
dies） MENPV:多重包埋核多角体病ウイルス（Multiple Embedde
d Nuclear Polyhedrosis Virus） MEV:多重包埋（Multiple Embedded）ウイルス NPV:核多角体病ウイルス（Nuclear Polyhedrosis Viru
s） OS:懸濁原液（Original Suspension） PIB:多角体封入体（Polyhedra Inclusion Body（ie
s）） REN:制限酵素（Restriction Edonuclease） SDW:無菌蒸留水（Sterile Distilled Water） SEV:単純包埋（Single Embedded）ウイルス SoMEV:多重包埋スポドプテラ・オルニソガリ（Spodopte
ra ornithogalli Multiple Embedded）ウイルス TEM:透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Micros
copy） 背景技術 ウイルス、細菌、真菌、原虫などを含む微生物製剤によ
る昆虫の制御方法が多くの研究機関によって研究されて
いる。微生物殺虫剤は、環境に於いて特定の害虫にのみ
毒性を持っているが、他の生物には無害であると期待さ
れる。さらに、微生物殺虫剤は外界では急速に失活分解
し無害化してしまうと考えられる［A.Senuta,Agrichemi
cal Age,p.21（1987年１月発行）参照］。
ウイルス殺虫剤は、効用を期待されてはいるが、研究開
発および市場開発に多額の費用がかかること、使用時期
に正確なタイミングを必要とすること、昆虫に対する特
異性は優れているが対象が限れていることなどからこれ
まで使用が抑えられてきた。
発および市場開発に多額の費用がかかること、使用時期
に正確なタイミングを必要とすること、昆虫に対する特
異性は優れているが対象が限れていることなどからこれ
まで使用が抑えられてきた。
しかしながら、現在までにウイルス殺虫剤４剤がアメリ
カ合衆国政府から使用を認められるまでになってきてい
る［Senutaの上記文献参照；“The Biology of Baculov
iruses,Vol.11.Practical Application for Insect Con
trol,"R.R.Granados and B.A.Federici,eds.,CRC Press
Inc.,Boca Raton,FL,320 pp.（1986年発行）のBetz,Re
gistration of Baculoviruses as Pesticides参照］。
これら４剤の中には、「ビロンＨ（Viron H）」，最近
では「エルカー（ELCAR）」の商標で市販されており、
ワタミバナゾウ虫（cotton bollworm），タバコ蛾（tob
acco budworm），毒蛾（tussock moth）の幼虫、マイマ
イ蛾（gypsy moth）の幼虫、松ハバチ（pine sawfly）
の幼虫などに用いられる多角体病ヘリオチス（Heliothi
s）がある。
カ合衆国政府から使用を認められるまでになってきてい
る［Senutaの上記文献参照；“The Biology of Baculov
iruses,Vol.11.Practical Application for Insect Con
trol,"R.R.Granados and B.A.Federici,eds.,CRC Press
Inc.,Boca Raton,FL,320 pp.（1986年発行）のBetz,Re
gistration of Baculoviruses as Pesticides参照］。
これら４剤の中には、「ビロンＨ（Viron H）」，最近
では「エルカー（ELCAR）」の商標で市販されており、
ワタミバナゾウ虫（cotton bollworm），タバコ蛾（tob
acco budworm），毒蛾（tussock moth）の幼虫、マイマ
イ蛾（gypsy moth）の幼虫、松ハバチ（pine sawfly）
の幼虫などに用いられる多角体病ヘリオチス（Heliothi
s）がある。
多角体病ウイルスはこれ迄に、ヘリオチス・ジー（Heli
othis zea）［Ignoffo,J.Invertebr,Pathol.7:315−319
（1965年発行）参照］、オートグラハ・カルホルニカ
（Autographa californica）［Vail et al.,J.Inverteb
r.Pathol.17:383−388（1971年発行）参照］およびヘリ
オチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）［Williams
and Payne,Ann.Appl.Biol.104:405−412（1984年発
行）参照］［Chauthani and Rehnborg,J.Invertebr.Pat
ol.17:234−237（1971年発行），および“The Biology
of Baculoviruses,Vol.11.Practical Application for
Insect Control,"R.R.Granados and B.A.Federici,ed
s.,CRC Press Inc.,Boca Raton,FL（1986年発行）のSha
piro,In vivo Production of Baculoviruses参照］を起
源として単離された。しかし、セロリ・シャクトリ虫で
あるシングラハ・ファルシフェラからウイルスが単離さ
れたとの報告は、まだ知られていない。
othis zea）［Ignoffo,J.Invertebr,Pathol.7:315−319
（1965年発行）参照］、オートグラハ・カルホルニカ
（Autographa californica）［Vail et al.,J.Inverteb
r.Pathol.17:383−388（1971年発行）参照］およびヘリ
オチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）［Williams
and Payne,Ann.Appl.Biol.104:405−412（1984年発
行）参照］［Chauthani and Rehnborg,J.Invertebr.Pat
ol.17:234−237（1971年発行），および“The Biology
of Baculoviruses,Vol.11.Practical Application for
Insect Control,"R.R.Granados and B.A.Federici,ed
s.,CRC Press Inc.,Boca Raton,FL（1986年発行）のSha
piro,In vivo Production of Baculoviruses参照］を起
源として単離された。しかし、セロリ・シャクトリ虫で
あるシングラハ・ファルシフェラからウイルスが単離さ
れたとの報告は、まだ知られていない。
本発明のウイルスを、制限酵素分析法（REN）により上
記の近縁ウイルスと比較し、また広い宿主域を持つこと
で知られている多重包埋オートグラハ・カルフォルニカ
（AcMEV）とも比較した。その結果、RENパターンは、本
発明のウイルスが他の公知のウイルスとは異なるもので
あることを明確に示した。
記の近縁ウイルスと比較し、また広い宿主域を持つこと
で知られている多重包埋オートグラハ・カルフォルニカ
（AcMEV）とも比較した。その結果、RENパターンは、本
発明のウイルスが他の公知のウイルスとは異なるもので
あることを明確に示した。
技術的課題 本発明の課題は、害虫の制御に有用なセロリ・シャクト
リ虫、即ちシングラハ・ファルシフェラから単離される
新ウイルスを提供することにある。
リ虫、即ちシングラハ・ファルシフェラから単離される
新ウイルスを提供することにある。
本発明の他の課題は、昆虫生息地において新バキュロウ
イルスを使用してなる害虫の制御方法を提供することに
ある。
イルスを使用してなる害虫の制御方法を提供することに
ある。
本発明の更に他の課題は下記に詳細に説明するが、本発
明の明細書を検討し、かつ実施すれば、当業者に明白と
なろう。
明の明細書を検討し、かつ実施すれば、当業者に明白と
なろう。
発明の開示 本発明のウイルスの名称は、多重包埋セロリ・シャクト
リ虫ウイルス（Celery Looper Multiple Embedded Viru
s）（HPV−85−CLMEV）と言う。このウイルスは、アイ
ダホ州83341キンバレー、郵便箱186、ルート１、合衆国
農業省土壌水質研究所（The United States Department
of Agriculture,Soil and Water Researc,Route 1,Box
186,Kimberly,Idaho 83341）に長期保存されると共
に、メリーランド州20852ロックビル、パークローンド
ライブ12301アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（The American Type Culture Collection,12301
Parklawn Drive,Rockville,MD 20852）に、ブタペスト
条約に基づく寄託がなされている。
リ虫ウイルス（Celery Looper Multiple Embedded Viru
s）（HPV−85−CLMEV）と言う。このウイルスは、アイ
ダホ州83341キンバレー、郵便箱186、ルート１、合衆国
農業省土壌水質研究所（The United States Department
of Agriculture,Soil and Water Researc,Route 1,Box
186,Kimberly,Idaho 83341）に長期保存されると共
に、メリーランド州20852ロックビル、パークローンド
ライブ12301アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（The American Type Culture Collection,12301
Parklawn Drive,Rockville,MD 20852）に、ブタペスト
条約に基づく寄託がなされている。
ミズリー州クーパー郡プレイリーホームのキャベツ畑か
ら四齢のシャクトリ虫幼虫を数匹を採集し、当研究所に
於て人工食餌を与えながら観察すると共に、寄生虫の有
無を確認した。２日後、２匹の幼虫がリンシ目の核多角
体病の典型的な徴候「Aizawa,“Insect Pathology.An A
dvanced Treatise,"E.A.Steinhaus,ed.,Vol.1,pp,381−
412,Academic Press,New York ＆ London（1963年発
行）参照］を示して死亡した。この幼虫を取り分けて顕
微鏡で調べたところ、大きさが異なり、且つ形態学的特
徴を備えた無数の封入体が組織に存在することが観察さ
れた。死体を無菌蒸留水（SDW）3.0 ml中で粉砕し、ホ
モゲネート（homogenate）をナイロン・オーガンデー布
で濾過した後、生物検定および透過型電子顕微鏡（TE
M）観察用のアリコート（aliquots）を作成した。サン
プルのうち、非感染の幼虫は生態条件に合わせて飼育を
続け、セロリ・シャクトリ虫、即ちシングラハ・ファル
シフェラ（Kirby）に成長することを確認した。
ら四齢のシャクトリ虫幼虫を数匹を採集し、当研究所に
於て人工食餌を与えながら観察すると共に、寄生虫の有
無を確認した。２日後、２匹の幼虫がリンシ目の核多角
体病の典型的な徴候「Aizawa,“Insect Pathology.An A
dvanced Treatise,"E.A.Steinhaus,ed.,Vol.1,pp,381−
412,Academic Press,New York ＆ London（1963年発
行）参照］を示して死亡した。この幼虫を取り分けて顕
微鏡で調べたところ、大きさが異なり、且つ形態学的特
徴を備えた無数の封入体が組織に存在することが観察さ
れた。死体を無菌蒸留水（SDW）3.0 ml中で粉砕し、ホ
モゲネート（homogenate）をナイロン・オーガンデー布
で濾過した後、生物検定および透過型電子顕微鏡（TE
M）観察用のアリコート（aliquots）を作成した。サン
プルのうち、非感染の幼虫は生態条件に合わせて飼育を
続け、セロリ・シャクトリ虫、即ちシングラハ・ファル
シフェラ（Kirby）に成長することを確認した。
懸濁原液（OS）中のIB/mlは1.4×108であった。OSのア
リコートを連続希釈して、セロリ・シャクトリ虫の新生
幼虫およびキャベツ・シャクトリ虫，即ちトリコプラシ
ア・ニ（Trichoplusia ni）（Hubner）の生後24時間の
幼虫を用いて生物検定を行った［Igonoffo and Boenin
g,J.Econ.Entomol.63:1696−1697（1970年発行）参
照］。全ての幼虫は、処置後10日以内に死亡融解した。
感染組織を顕微鏡（500倍、位相差）で調べたところ、
1.6−2.6μｍの大きさを有するIBが無数存在し、そのう
ち大サイズIBが支配的であることが観察された（約3:1
比）。IBの形態が異なるのは、単純包埋（SEV）と多重
包埋（MEV）とが共に存在することを示すものと考えら
れた。そこで、さらに、もとの分離物からIBを分画して
透過型電子顕微鏡により観察したところSEVの存在を確
認したが、格子状に広範囲に観察を続けた結果では、多
重封入体（MEIB）が支配的な形態であった。
リコートを連続希釈して、セロリ・シャクトリ虫の新生
幼虫およびキャベツ・シャクトリ虫，即ちトリコプラシ
ア・ニ（Trichoplusia ni）（Hubner）の生後24時間の
幼虫を用いて生物検定を行った［Igonoffo and Boenin
g,J.Econ.Entomol.63:1696−1697（1970年発行）参
照］。全ての幼虫は、処置後10日以内に死亡融解した。
感染組織を顕微鏡（500倍、位相差）で調べたところ、
1.6−2.6μｍの大きさを有するIBが無数存在し、そのう
ち大サイズIBが支配的であることが観察された（約3:1
比）。IBの形態が異なるのは、単純包埋（SEV）と多重
包埋（MEV）とが共に存在することを示すものと考えら
れた。そこで、さらに、もとの分離物からIBを分画して
透過型電子顕微鏡により観察したところSEVの存在を確
認したが、格子状に広範囲に観察を続けた結果では、多
重封入体（MEIB）が支配的な形態であった。
HPV−85−CLMEVの分裂増殖には、トリコプラシア・ニの
幼虫が適していることが分かった。従って、1000 IB/0.
1mを含む懸濁液（凍結貯蔵）から、希釈による細菌汚染
を防ぐため連続希釈液（200,100,50,15,10および1.0 IB
/mm2）を調製した。この中最低濃度のIBで死亡した幼虫
（各回25匹,6回処理）を選び出して、その後の分裂増殖
に使用した。希釈液処理をしたトリコプラシア・ニ幼虫
は４日以内に全て死亡融解したが、このうち２つの最低
濃度の幼虫12匹を調べたところ、細菌に汚染されていな
かった。これらの幼虫のうち大サイズIBのみを含む２匹
をを無菌蒸留水中で粉砕し、IBを単離し、水洗し且つ分
画遠心法により濃縮した。この懸濁液は細菌汚染がな
く、その後の全ての分裂増殖および試験にはこのものか
ら取り分けて使用した。
幼虫が適していることが分かった。従って、1000 IB/0.
1mを含む懸濁液（凍結貯蔵）から、希釈による細菌汚染
を防ぐため連続希釈液（200,100,50,15,10および1.0 IB
/mm2）を調製した。この中最低濃度のIBで死亡した幼虫
（各回25匹,6回処理）を選び出して、その後の分裂増殖
に使用した。希釈液処理をしたトリコプラシア・ニ幼虫
は４日以内に全て死亡融解したが、このうち２つの最低
濃度の幼虫12匹を調べたところ、細菌に汚染されていな
かった。これらの幼虫のうち大サイズIBのみを含む２匹
をを無菌蒸留水中で粉砕し、IBを単離し、水洗し且つ分
画遠心法により濃縮した。この懸濁液は細菌汚染がな
く、その後の全ての分裂増殖および試験にはこのものか
ら取り分けて使用した。
病理、顕微鏡および制限酵素所見 HPV−85−CLMEVに感
染した幼虫は、リンシ目幼虫の格多角体病の典型的な徴
候［Aizawaの上記文献参照］を示すのが肉眼で観察され
た。これらの幼虫は、嗜眠に陥り、食餌の摂取をやめ、
乳白色になって死亡し、続いて全般的に黒色化し最後に
は皮膜が破裂（融解）してゆくのが認められた。脂肪
体、気管基質、血球、表皮の細胞核にIBが観察された。
不作為法により抽出したIBの平均直径は測微計（500
倍、位相差）による測定値で1.87±0.09μｍ標準偏差値
（範囲＝2.0−3.0μm,n＝10）であった。電子顕微鏡写
真では、ウイルス粒子（ビリヨン）は多重包埋で、各IB
に多数の塊りがついていることを示していた。
染した幼虫は、リンシ目幼虫の格多角体病の典型的な徴
候［Aizawaの上記文献参照］を示すのが肉眼で観察され
た。これらの幼虫は、嗜眠に陥り、食餌の摂取をやめ、
乳白色になって死亡し、続いて全般的に黒色化し最後に
は皮膜が破裂（融解）してゆくのが認められた。脂肪
体、気管基質、血球、表皮の細胞核にIBが観察された。
不作為法により抽出したIBの平均直径は測微計（500
倍、位相差）による測定値で1.87±0.09μｍ標準偏差値
（範囲＝2.0−3.0μm,n＝10）であった。電子顕微鏡写
真では、ウイルス粒子（ビリヨン）は多重包埋で、各IB
に多数の塊りがついていることを示していた。
制限酵素分析法においてはHPV−85PCLMEVのDNAは独特の
切断パターンを示し、このウイルスが他の近縁ウイルス
とは異なるものであることを結論づけている。
切断パターンを示し、このウイルスが他の近縁ウイルス
とは異なるものであることを結論づけている。
懸濁仕込液の増殖および生物検定 HPV−85−CLMEVとAc
MEVとは、トリコプラシア・ニ幼虫により容易に分裂増
殖することができた。集菌方法は時間がかからず、遠心
分離法によるIBの単離も容易であった。集菌時、細菌汚
染による障害は少なかったばかりでなく、しかもその全
ては人工食餌に起因するものであり、従って接種材料と
して用いたウイルス懸濁液が細菌に汚染されることはな
かった。一方、感染幼虫の中から同一の外観を持つのみ
を選び出すことにより物理的に汚染を防止する試みも数
回行った。最も効果的な方法としては融解前に幼虫の死
体を集めて凍結する方法を舉げることができる。この他
にも死亡前に幼虫を人工食餌から離し無菌ペトリデッシ
ュに移して、30℃で死亡融解するまで培養することも行
った。ホモゲネートは無菌蒸留水と混合した後、IBを遠
心分離法により採取した。
MEVとは、トリコプラシア・ニ幼虫により容易に分裂増
殖することができた。集菌方法は時間がかからず、遠心
分離法によるIBの単離も容易であった。集菌時、細菌汚
染による障害は少なかったばかりでなく、しかもその全
ては人工食餌に起因するものであり、従って接種材料と
して用いたウイルス懸濁液が細菌に汚染されることはな
かった。一方、感染幼虫の中から同一の外観を持つのみ
を選び出すことにより物理的に汚染を防止する試みも数
回行った。最も効果的な方法としては融解前に幼虫の死
体を集めて凍結する方法を舉げることができる。この他
にも死亡前に幼虫を人工食餌から離し無菌ペトリデッシ
ュに移して、30℃で死亡融解するまで培養することも行
った。ホモゲネートは無菌蒸留水と混合した後、IBを遠
心分離法により採取した。
AcMEV製剤は、細菌その他の細胞を溶解するため3.3％デ
オキシコール酸ナトリウム溶液で処理した。この方法は
非常に効果的で、実質的に純粋なIB懸濁液を得ることが
できた。ウイルス粒子がアルカリを放出する（the alka
li release of the nucleocapsids）前あるいは制限酵
素による特性付け前に純粋なIB懸濁液を調製する方法と
して常にこの技術が用いられている。
オキシコール酸ナトリウム溶液で処理した。この方法は
非常に効果的で、実質的に純粋なIB懸濁液を得ることが
できた。ウイルス粒子がアルカリを放出する（the alka
li release of the nucleocapsids）前あるいは制限酵
素による特性付け前に純粋なIB懸濁液を調製する方法と
して常にこの技術が用いられている。
使用量関連死亡率、経時死亡率および感受性試験 通常の生物検定試験、HPV−85−CLMEVとAcMEVの比較、
および感受性試験はすべて懸濁原液毎に作成したアリコ
ートによって行った。トリコプラシア・ニに対するAcME
Vの活性（LC50＝0.32 IB/mm2）はベイル（Vail）らの報
告［Environ.Entomol.11:1187−1192（1982年発行）参
照］と同一であった。生物検定試験では、１回50匹の幼
虫を用いる試験を少なくとも４回宛繰り返してデータを
作成し、一方比較生物検定は全てこれと同時に行った。
通常の感受性試験は、必ずしも繰り返して行はなかっ
た。しかし、感受性ありと報告された幼虫は全て顕微鏡
によって調べ代表的観察事項、例えば感染組織を写真で
記録した。マンジュカ・セクスタ（Manduca sexta）幼
虫の場合は、IBを感染幼虫（Manduca sexta）から採取
し、トリコプラシア・ニの新生幼虫に対して生物検定を
行ったが、トリコプラシア・ニ幼虫は全て３日以内に死
亡融解し、HPV−85−CLMEVが検出された。この感受性試
験においては、市販のウイルス殺虫剤「エルカー（ELCA
R）」の推奨使用量（4 oz/acre,A.I.4x109 PIB/g）と同
様の濃度100 IB/mm2での試験も行った。このことにより
現実的ではあるが、比較的には穏健な感受性推定値とな
った。
および感受性試験はすべて懸濁原液毎に作成したアリコ
ートによって行った。トリコプラシア・ニに対するAcME
Vの活性（LC50＝0.32 IB/mm2）はベイル（Vail）らの報
告［Environ.Entomol.11:1187−1192（1982年発行）参
照］と同一であった。生物検定試験では、１回50匹の幼
虫を用いる試験を少なくとも４回宛繰り返してデータを
作成し、一方比較生物検定は全てこれと同時に行った。
通常の感受性試験は、必ずしも繰り返して行はなかっ
た。しかし、感受性ありと報告された幼虫は全て顕微鏡
によって調べ代表的観察事項、例えば感染組織を写真で
記録した。マンジュカ・セクスタ（Manduca sexta）幼
虫の場合は、IBを感染幼虫（Manduca sexta）から採取
し、トリコプラシア・ニの新生幼虫に対して生物検定を
行ったが、トリコプラシア・ニ幼虫は全て３日以内に死
亡融解し、HPV−85−CLMEVが検出された。この感受性試
験においては、市販のウイルス殺虫剤「エルカー（ELCA
R）」の推奨使用量（4 oz/acre,A.I.4x109 PIB/g）と同
様の濃度100 IB/mm2での試験も行った。このことにより
現実的ではあるが、比較的には穏健な感受性推定値とな
った。
生物検定の結果では、HPV−85−CLMEVがシングラハ・フ
ァルシフェラ（Syngrapha falcifera），トリコプラシ
ア・ニ（Trichoplusia ni），ヘリオチス・ジー（Helio
this zea）およびヘリオチス・ビルセンス（Heliothis
virescens）の幼虫に対して特に高い活性を持っていた
ことおよびリンシ目（order）の中10科（family）33種
（species）（Table V）に感染力があったことを示して
いた。
ァルシフェラ（Syngrapha falcifera），トリコプラシ
ア・ニ（Trichoplusia ni），ヘリオチス・ジー（Helio
this zea）およびヘリオチス・ビルセンス（Heliothis
virescens）の幼虫に対して特に高い活性を持っていた
ことおよびリンシ目（order）の中10科（family）33種
（species）（Table V）に感染力があったことを示して
いた。
Table Iは、シングラハ・ファルシフェラとトリコプラ
シア・ニの新生幼虫のHPV−85−CLMEVの各種濃度に対す
る使用量関連死亡反応を纏めたものである。トリコプラ
シア・ニ幼虫は、HPV−85−CLMEV全濃度に対してシング
ラハ・ファルシフェラ幼虫よりも高い感受性を持ってい
る。
シア・ニの新生幼虫のHPV−85−CLMEVの各種濃度に対す
る使用量関連死亡反応を纏めたものである。トリコプラ
シア・ニ幼虫は、HPV−85−CLMEV全濃度に対してシング
ラハ・ファルシフェラ幼虫よりも高い感受性を持ってい
る。
HPV−85−CLMEVは、スペクトラムが広く、活性の高い多
重包埋核多角体病ウイルスである。公知の文献と比較し
ても、ヘリオチス属複合（complex）に対してこのウイ
ルスが既存の「エルカー（ELCAR）」（ヘリオチス単純
包埋ウイルス）［Ignoffo,J.Invertebr.Pathol.7:315−
319（1965号発行）:Ignoffo,J.Invertebr.Pathol.8:531
−536（1966年発行）:Ignoffo and Couch,Microbial Co
ntrol of Pests and Plant Diseases 1970−1980,H.D.B
urges（ed.）,pp.330−362,Academic Press Inc.,Londo
n（1981年発行）参照］よりも遥かに高い活性を持つこ
とが分かる。
重包埋核多角体病ウイルスである。公知の文献と比較し
ても、ヘリオチス属複合（complex）に対してこのウイ
ルスが既存の「エルカー（ELCAR）」（ヘリオチス単純
包埋ウイルス）［Ignoffo,J.Invertebr.Pathol.7:315−
319（1965号発行）:Ignoffo,J.Invertebr.Pathol.8:531
−536（1966年発行）:Ignoffo and Couch,Microbial Co
ntrol of Pests and Plant Diseases 1970−1980,H.D.B
urges（ed.）,pp.330−362,Academic Press Inc.,Londo
n（1981年発行）参照］よりも遥かに高い活性を持つこ
とが分かる。
HPV−85−CLMEVとAcMEVの幼虫死亡必要日数および両剤
のLT50値の相違点をTable IIに示す。
のLT50値の相違点をTable IIに示す。
Table I.HPV−85−CLMEVによる シングラハ・ファルシフェラとトリコプシア・ニの新生
幼虫の使用量関連死亡反応 HPV−85−CLMEVとAcMEVとを比較する上で、アグロチス
・イプシロン幼虫の感受性と急速に駆除された事実は特
に興味深い。Table IIIは、HPV−85−CLMEVとAcMEVの３
濃度に対する10種の反応を示したものである。HPV−85
−CLMEVは10種全てに対して活性があり、しかも10日の
試験期間内で10種のうち７種で死亡率100％となってい
る。AcMEVは10種の中３種で死亡率100％となってはいる
が、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、ペリドロマ・
ソウシア（Peridroma saucia）またはダイアクリシア・
バージニカ（Diacrisia Virginica）に対しては感染力
を持たなかった（即ち、HPV−85−CLMEVが奏功した幼虫
において、AcMEVは死亡率０％であった）。HPV−85−CL
MEVがこれらの濃度においてAcMEVよりも高い活性を持っ
ていることは明かである。生物検定によるLC50値（Tabl
e IV）でも、HPV−85−CLMEVとAcMEVの活性の違いを明
白に示している。HPV−85−CLMEVとAcMEVによるヘリオ
チス・ジー幼虫のLC50を比較すると、HPV−85−CLMEVの
生物検定活性はAcMEVのそれよりも28.6％高い。
幼虫の使用量関連死亡反応 HPV−85−CLMEVとAcMEVとを比較する上で、アグロチス
・イプシロン幼虫の感受性と急速に駆除された事実は特
に興味深い。Table IIIは、HPV−85−CLMEVとAcMEVの３
濃度に対する10種の反応を示したものである。HPV−85
−CLMEVは10種全てに対して活性があり、しかも10日の
試験期間内で10種のうち７種で死亡率100％となってい
る。AcMEVは10種の中３種で死亡率100％となってはいる
が、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、ペリドロマ・
ソウシア（Peridroma saucia）またはダイアクリシア・
バージニカ（Diacrisia Virginica）に対しては感染力
を持たなかった（即ち、HPV−85−CLMEVが奏功した幼虫
において、AcMEVは死亡率０％であった）。HPV−85−CL
MEVがこれらの濃度においてAcMEVよりも高い活性を持っ
ていることは明かである。生物検定によるLC50値（Tabl
e IV）でも、HPV−85−CLMEVとAcMEVの活性の違いを明
白に示している。HPV−85−CLMEVとAcMEVによるヘリオ
チス・ジー幼虫のLC50を比較すると、HPV−85−CLMEVの
生物検定活性はAcMEVのそれよりも28.6％高い。
Table Vは、HPV−85−CLMEVを100−200 IB/mm2濃度で食
餌培養基に混入して奏功した種をまとめたものであつ
て、これで全部であるとは言えないにせよ、HPV−85−C
LMEVの適用範囲（spectrum）がいかに広いかを示してい
る。HPV−85−CLMEVは、ブラックカット・ワーム（blac
k cutworm）、フォールウエッブワーム（fall webwor
m）、ベルベットビーン・キャタピラー（velvet bean c
aterpillar）、タバコ蛾（tobacco budworm）、コーン
イヤー・ワーム（corn earworm）、キャベツ・シャクト
リ虫（cabbage looper）、大豆シャクトリ虫（soybean
looper）、フォールアーミーワーム（fall armywor
m）、コドリングモス（codling moth）、渡来型キャベ
ツ虫（imported cabbage worm）、ネーブルオレンジ・
ワーム（navel orangeworm）、ダイヤモンドバックト・
モス（diamond backed moth）、ヨーロピアン・コーン
・ボアラー（European corn borer）、サンフラワーモ
ス（sunflower moth）、アーモンド・モス（almond mot
h）、メディタレニアン・フラワー・モス（Mediterrane
anflour moth）、レイズン・モス（raisin moth）の
他、16のリンシ目昆虫など、広範囲の感染力を持ってい
るため、広い適用範囲で固体群を駆除する方法を与える
点で極めて重要である。大きい経済的被害を与える昆虫
のうちこのように広範囲の種類に感染力を持つ多重包埋
多角体病ウイルスは、このもの以外では報告されていな
い。
餌培養基に混入して奏功した種をまとめたものであつ
て、これで全部であるとは言えないにせよ、HPV−85−C
LMEVの適用範囲（spectrum）がいかに広いかを示してい
る。HPV−85−CLMEVは、ブラックカット・ワーム（blac
k cutworm）、フォールウエッブワーム（fall webwor
m）、ベルベットビーン・キャタピラー（velvet bean c
aterpillar）、タバコ蛾（tobacco budworm）、コーン
イヤー・ワーム（corn earworm）、キャベツ・シャクト
リ虫（cabbage looper）、大豆シャクトリ虫（soybean
looper）、フォールアーミーワーム（fall armywor
m）、コドリングモス（codling moth）、渡来型キャベ
ツ虫（imported cabbage worm）、ネーブルオレンジ・
ワーム（navel orangeworm）、ダイヤモンドバックト・
モス（diamond backed moth）、ヨーロピアン・コーン
・ボアラー（European corn borer）、サンフラワーモ
ス（sunflower moth）、アーモンド・モス（almond mot
h）、メディタレニアン・フラワー・モス（Mediterrane
anflour moth）、レイズン・モス（raisin moth）の
他、16のリンシ目昆虫など、広範囲の感染力を持ってい
るため、広い適用範囲で固体群を駆除する方法を与える
点で極めて重要である。大きい経済的被害を与える昆虫
のうちこのように広範囲の種類に感染力を持つ多重包埋
多角体病ウイルスは、このもの以外では報告されていな
い。
本発明のウイルス殺虫剤は、ウイルスを純粋な形で単離
する必要はなく、幼虫ホモゲネートなどの培地あるいは
ホモゲネートの分画から直接に工業生産することができ
る。もちろん、これ以外の手段よって生産してもよい。
高い特異性、即ち対象生物と非対象生物の反応各々を高
い確度で予測することが求められる使用方法では、純粋
あるいは実質的に純粋なウイルスの組成にすることが好
ましく行われる。例えば、幼虫材料中に含まれる不要の
成分のため所望の作用に好ましくない影響のおそれがあ
る場合などがこれに当たる。
する必要はなく、幼虫ホモゲネートなどの培地あるいは
ホモゲネートの分画から直接に工業生産することができ
る。もちろん、これ以外の手段よって生産してもよい。
高い特異性、即ち対象生物と非対象生物の反応各々を高
い確度で予測することが求められる使用方法では、純粋
あるいは実質的に純粋なウイルスの組成にすることが好
ましく行われる。例えば、幼虫材料中に含まれる不要の
成分のため所望の作用に好ましくない影響のおそれがあ
る場合などがこれに当たる。
HPV−85−CLMEVは、公知の担体または賦形剤の中から適
当なものを用いて製剤に調製する。特に、農業経営上好
ましいものがよい。適当とされる化合物担体の具体例と
しては、セルロース、砂糖、水和性粉末のような活性の
ない固体および水性界面活性剤混合物などが擧げられ
る。組成中のウイルス濃度は、培養基（substrate）、
対象昆虫の種類、使用方法、どのような反応を所望する
のかによって大きく異なるが、典型例としては少なくと
も約4.0 X 109ないし4.0 X 1011 IB/gがである。処理さ
れる植物に対する植物毒性、非対象昆虫の耐薬性などを
考慮して、最高濃度をきめてもよい。
当なものを用いて製剤に調製する。特に、農業経営上好
ましいものがよい。適当とされる化合物担体の具体例と
しては、セルロース、砂糖、水和性粉末のような活性の
ない固体および水性界面活性剤混合物などが擧げられ
る。組成中のウイルス濃度は、培養基（substrate）、
対象昆虫の種類、使用方法、どのような反応を所望する
のかによって大きく異なるが、典型例としては少なくと
も約4.0 X 109ないし4.0 X 1011 IB/gがである。処理さ
れる植物に対する植物毒性、非対象昆虫の耐薬性などを
考慮して、最高濃度をきめてもよい。
ウイルスのような昆虫病原菌の場合、生物を保菌担体と
して用い病原菌を伝播することが望ましい。保菌担体に
用いる生物しては、例えば対象昆虫に近い種の昆虫で、
しかも病原菌の影響が比較的にすくないものが擧げられ
る。本発明においては、「担体」なる語は化合物担体と
生物を用いる保菌担体の双方を含むものとする。
して用い病原菌を伝播することが望ましい。保菌担体に
用いる生物しては、例えば対象昆虫に近い種の昆虫で、
しかも病原菌の影響が比較的にすくないものが擧げられ
る。本発明においては、「担体」なる語は化合物担体と
生物を用いる保菌担体の双方を含むものとする。
本発明のウイルスを使用する場合には、予め通常の試験
により感染を起こすに充分な有効量を設定して使用す
る。本発明においては害虫の撲滅を最終目的としてお
り、従って「有効量」即ち「殺虫有効量」なる語は未処
理群と比べ試験群において有意の死亡率を達成するに足
るウイルスの量を意味するものとする。実際使用の場
合、害虫の種類、幼虫の成長段階、培養基の性質、賦形
剤あるいは担体の種類、使用期間など、関連する要因に
より有効量を変えてもよい。
により感染を起こすに充分な有効量を設定して使用す
る。本発明においては害虫の撲滅を最終目的としてお
り、従って「有効量」即ち「殺虫有効量」なる語は未処
理群と比べ試験群において有意の死亡率を達成するに足
るウイルスの量を意味するものとする。実際使用の場
合、害虫の種類、幼虫の成長段階、培養基の性質、賦形
剤あるいは担体の種類、使用期間など、関連する要因に
より有効量を変えてもよい。
本発明のウイルスは、昆虫が摂取することにより始めて
効果を発揮するものであり、従って制御対象である昆虫
の所在位置またはその近辺で使用する。植物である場合
には、使用方法の典型例として葉の表面に塗布すること
が擧げられる。
効果を発揮するものであり、従って制御対象である昆虫
の所在位置またはその近辺で使用する。植物である場合
には、使用方法の典型例として葉の表面に塗布すること
が擧げられる。
本発明のウイルス殺虫剤は各種の昆虫の制御に効果があ
る。さらに詳しくは農業経営上重大な被害のある昆虫、
特にリンシ目に分類されるものが本剤の使用に適してい
るが、本発明の実施態様はこれによって制限されるもの
ではない。
る。さらに詳しくは農業経営上重大な被害のある昆虫、
特にリンシ目に分類されるものが本剤の使用に適してい
るが、本発明の実施態様はこれによって制限されるもの
ではない。
本発明を次の実施例により詳細説明するが、本発明の特
許請求の範囲はこれによって制限されるものでない。
許請求の範囲はこれによって制限されるものでない。
実施例１ 生物検定試験用HPV−85−CLMEV懸濁仕込液の調製 HPV−85−CLMEVの接種材料原液（制限酵素試験用ウイル
スの増殖に用いたもの）を用いて懸濁仕込液を調製し生
物検定試験用とした。ウイルスの増殖にはトリコプラシ
ア・ニの幼虫（四齢中間期）を使用した。これらの幼虫
は実験用コロニー（20年以上連続継続代飼育）から提供
を受けたもので、小麦幼芽からなる標準人工食餌［（Wi
lkinson et al.,J.Econ.Entomol.65:264−268（1972年
発行）参照］により四齢中間期に成長するまで飼養し
た。この中から一定の大きさの幼虫500匹を肉眼により
選び出し、区画セルのついたディスポーザブル・プラス
チック・トレー［Ignoffo and Boeningの上記文献参
照］をHPV−85−CLMEV水性懸濁液（4.48 X 104 IB;50 I
B/mm2）0.1 mlで処理し、この上に幼虫をおき人工食餌
（895mm2）を与えた。このようにしたトレーを26℃で４
日間培養した（完全に遮光）。４日間の培養で幼虫は死
亡、体は弛緩し融解し始めていた。この時、死亡した感
染個体の融解がさらに進むのを防ぐため、トレーを−70
℃のフリーザー中においた（48時間）。このようにし
て、HPV−85−CLMEV IBの採集用として選んだ500匹の中
から430匹の凍結幼虫（皮膜は完全に残存）を得た。
スの増殖に用いたもの）を用いて懸濁仕込液を調製し生
物検定試験用とした。ウイルスの増殖にはトリコプラシ
ア・ニの幼虫（四齢中間期）を使用した。これらの幼虫
は実験用コロニー（20年以上連続継続代飼育）から提供
を受けたもので、小麦幼芽からなる標準人工食餌［（Wi
lkinson et al.,J.Econ.Entomol.65:264−268（1972年
発行）参照］により四齢中間期に成長するまで飼養し
た。この中から一定の大きさの幼虫500匹を肉眼により
選び出し、区画セルのついたディスポーザブル・プラス
チック・トレー［Ignoffo and Boeningの上記文献参
照］をHPV−85−CLMEV水性懸濁液（4.48 X 104 IB;50 I
B/mm2）0.1 mlで処理し、この上に幼虫をおき人工食餌
（895mm2）を与えた。このようにしたトレーを26℃で４
日間培養した（完全に遮光）。４日間の培養で幼虫は死
亡、体は弛緩し融解し始めていた。この時、死亡した感
染個体の融解がさらに進むのを防ぐため、トレーを−70
℃のフリーザー中においた（48時間）。このようにし
て、HPV−85−CLMEV IBの採集用として選んだ500匹の中
から430匹の凍結幼虫（皮膜は完全に残存）を得た。
実施例２ 採集方法 凍結幼虫を無菌蒸留水（幼虫１匹/1.0 ml）に添加、
「ストーバル（Sorvall）」ホモゲナイザー中におき、
３分間、6000 rpmで処理してIBの水性懸濁液を調製し
た。ホモゲネートはナイロン・オーガンデイ布で濾過、
50−mlのアリコートに分けた後、50−mlの分離管にお
き、30秒、2000 rpmにより組織の大破片を沈澱させた。
さらに、10分間、7000 rpmによりIBをペレットにすると
共に、上澄み液を捨てた後再びペレットを同量の無菌蒸
留水に懸濁させた。この操作を３回繰り返し、最後に懸
濁液（225 ml）を水洗した後、IBの計測を行った（改良
型ニューバウワー（Neubauer）モデル、発光線血球計、
位相差500倍）ところ、懸濁原液中のIB濃度は1.72 x 10
8 IB/ml（SEM＝0.23）であった。懸濁原液225 mlから1.
0−mlのアリコート13個を取分け、頭部に栓のついた15
−ml無菌ジスポーザブル・プラスチック・チューブ中に
これらのアリコートを入れ、−４℃で凍結させて生物検
定用とした。このように調製したアリコートは、試験毎
に解凍希釈して用いたが、この方法により生物検定を行
う度に懸濁原液の解凍、再凍結を繰り返す必要がなくな
つた。
「ストーバル（Sorvall）」ホモゲナイザー中におき、
３分間、6000 rpmで処理してIBの水性懸濁液を調製し
た。ホモゲネートはナイロン・オーガンデイ布で濾過、
50−mlのアリコートに分けた後、50−mlの分離管にお
き、30秒、2000 rpmにより組織の大破片を沈澱させた。
さらに、10分間、7000 rpmによりIBをペレットにすると
共に、上澄み液を捨てた後再びペレットを同量の無菌蒸
留水に懸濁させた。この操作を３回繰り返し、最後に懸
濁液（225 ml）を水洗した後、IBの計測を行った（改良
型ニューバウワー（Neubauer）モデル、発光線血球計、
位相差500倍）ところ、懸濁原液中のIB濃度は1.72 x 10
8 IB/ml（SEM＝0.23）であった。懸濁原液225 mlから1.
0−mlのアリコート13個を取分け、頭部に栓のついた15
−ml無菌ジスポーザブル・プラスチック・チューブ中に
これらのアリコートを入れ、−４℃で凍結させて生物検
定用とした。このように調製したアリコートは、試験毎
に解凍希釈して用いたが、この方法により生物検定を行
う度に懸濁原液の解凍、再凍結を繰り返す必要がなくな
つた。
実施例３ AcMEV懸濁仕込液の調製 アルファルファルーパー、即ちオートグラハ・カルフォ
ルニカ（Speyer）の多重包埋核多角体病ウイルス（AcME
V）の凍結乾燥粉末を入手した。提供元はアリゾナ州フ
ェニックス、合衆国農業省農業研究局西部綿花研究所、
フレッド スチュワート博士（Dr.Fred Stewart,USDA−
ARS,Western Cotton Research Laboratory,Phoenix,Ari
zona）であった。この粉末の多角体封入体含有量は約6.
0 X 109PIB/gで、1974年以来参照サンプルとして冷凍貯
蔵されて来たものである。粉末100mgをメスフラスコ中
で無菌蒸留水100mlに懸濁し、増殖原液を調製、さらに
連続希釈して、血球計計測を行いつつ8.89 x 105 IB/ml
を含有する接種材料50mlを作成した。このウイルスが長
期保存（12年）されたものであることから、増殖媒に四
齢のトリコプラシア・ニ幼虫を使用すること、任意に濃
度を100IB/mm2とすること、このものを食餌の表面に散
布すること、また細菌感染を抑えるため、標準食餌（阻
害剤含有）を用いることとした。食餌トレー９個（１個
当り幼虫50匹、各トレーの区画セルに分けて収容）を上
記に従って処理した上、26℃で培養した（完全遮光）。
処理後４日で、幼虫は核多角体病ウイルス感染症特有の
徴候を示して死に始めた。通常の場合に問題となる二次
細菌感染を防ぐため、嗜眠に陥ったり死んだりして弛緩
した幼虫320匹を集め、無菌ジスポザブル・ペトリ・皿
（直径10cm）の上に置き30℃でさらにもう１日すべての
幼虫が融解するまで培養した。組織のホモゲネートを無
菌蒸留水90 mlに添加しナイロン・オーガンデー布で濾
過したところ、バチルス型細菌に汚染されていることが
分かった（後日人工食餌トレーに起因したことが判
明）。このホモゲネートを分画遠心分離機により洗浄す
ると共に、10分、7,000 rpmでペレットにした。ペレッ
トは（残存する細菌細胞を溶解するため）3.3％（w/v）
デオキシコール酸ナトリウム溶液で処理し26℃で約24時
間培養した。デオキシコール酸ナトリウム溶液を傾注し
ながら（上記のように）IBペレットを取り出し、無菌蒸
留水50 mlに再び懸濁した後、同様にして水洗を二度繰
り返した。水洗後IBペレットを無菌蒸留水70 mlに再び
懸濁し、この懸濁液のコードをAcMEV懸濁原液とし、そ
の後の全てのAcMEV生物検定に用いた。血球計計測では
原液1 ml当りのIB含有量は2.736 x 109であった。AcMEV
懸濁原液から1.0−mlのアリコート12個を取分け、その
各々を頭部に栓のついた15−ml無菌プラスチック・チュ
ーブ各一個にいれ、ラベルを貼り凍結して生物検定用と
した。
ルニカ（Speyer）の多重包埋核多角体病ウイルス（AcME
V）の凍結乾燥粉末を入手した。提供元はアリゾナ州フ
ェニックス、合衆国農業省農業研究局西部綿花研究所、
フレッド スチュワート博士（Dr.Fred Stewart,USDA−
ARS,Western Cotton Research Laboratory,Phoenix,Ari
zona）であった。この粉末の多角体封入体含有量は約6.
0 X 109PIB/gで、1974年以来参照サンプルとして冷凍貯
蔵されて来たものである。粉末100mgをメスフラスコ中
で無菌蒸留水100mlに懸濁し、増殖原液を調製、さらに
連続希釈して、血球計計測を行いつつ8.89 x 105 IB/ml
を含有する接種材料50mlを作成した。このウイルスが長
期保存（12年）されたものであることから、増殖媒に四
齢のトリコプラシア・ニ幼虫を使用すること、任意に濃
度を100IB/mm2とすること、このものを食餌の表面に散
布すること、また細菌感染を抑えるため、標準食餌（阻
害剤含有）を用いることとした。食餌トレー９個（１個
当り幼虫50匹、各トレーの区画セルに分けて収容）を上
記に従って処理した上、26℃で培養した（完全遮光）。
処理後４日で、幼虫は核多角体病ウイルス感染症特有の
徴候を示して死に始めた。通常の場合に問題となる二次
細菌感染を防ぐため、嗜眠に陥ったり死んだりして弛緩
した幼虫320匹を集め、無菌ジスポザブル・ペトリ・皿
（直径10cm）の上に置き30℃でさらにもう１日すべての
幼虫が融解するまで培養した。組織のホモゲネートを無
菌蒸留水90 mlに添加しナイロン・オーガンデー布で濾
過したところ、バチルス型細菌に汚染されていることが
分かった（後日人工食餌トレーに起因したことが判
明）。このホモゲネートを分画遠心分離機により洗浄す
ると共に、10分、7,000 rpmでペレットにした。ペレッ
トは（残存する細菌細胞を溶解するため）3.3％（w/v）
デオキシコール酸ナトリウム溶液で処理し26℃で約24時
間培養した。デオキシコール酸ナトリウム溶液を傾注し
ながら（上記のように）IBペレットを取り出し、無菌蒸
留水50 mlに再び懸濁した後、同様にして水洗を二度繰
り返した。水洗後IBペレットを無菌蒸留水70 mlに再び
懸濁し、この懸濁液のコードをAcMEV懸濁原液とし、そ
の後の全てのAcMEV生物検定に用いた。血球計計測では
原液1 ml当りのIB含有量は2.736 x 109であった。AcMEV
懸濁原液から1.0−mlのアリコート12個を取分け、その
各々を頭部に栓のついた15−ml無菌プラスチック・チュ
ーブ各一個にいれ、ラベルを貼り凍結して生物検定用と
した。
実施例４ 使用量関連死亡率、経時死亡率、感受性各試験 次の新生幼虫を用いて、HPV−85−CLMEVおよびAcMEVの
使用量関連死亡率と経時死亡率を検討した：アグロチス
・イプシロン（Agrotis ipsilon）、ヘリオチス・サブ
フレキシア（Heliothis subflexa）、ヘリオチス・ビル
センス（H.virescens）、ヘリオチス・ジー（H.zea）、
スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperd
a）、シングラハ・ファルシフェラ（Syngrapha falcife
ra）、トリコプラシア・ニ（Trichoplusia ni）（AcMEV
の増殖前にシングラハ・ファルシフェラのコロニーが失
われたため、AcMEVの試験はこの昆虫については行わな
かった）。
使用量関連死亡率と経時死亡率を検討した：アグロチス
・イプシロン（Agrotis ipsilon）、ヘリオチス・サブ
フレキシア（Heliothis subflexa）、ヘリオチス・ビル
センス（H.virescens）、ヘリオチス・ジー（H.zea）、
スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperd
a）、シングラハ・ファルシフェラ（Syngrapha falcife
ra）、トリコプラシア・ニ（Trichoplusia ni）（AcMEV
の増殖前にシングラハ・ファルシフェラのコロニーが失
われたため、AcMEVの試験はこの昆虫については行わな
かった）。
実施例５ シングラハ・ファルシフェラ新生幼虫に対するHPV−85
−CLMEVの効果 シングラハ・ファルシフェラとトリコプラシア・ニ新生
幼虫の使用量関連死亡反応を測定した。事前に使用量に
ついて広範囲のスクリーニングテストを行った結果で
は、LC50は＜1.0 IB/mm2であった。1.6 x 107 IB/mlを
含む水性懸濁液を用いて連続希釈液をつくり食餌表面汚
染法［Ignoffo and Boeningの上記文献参照］により生
物検定を行った。IB濃度各々0.75,0.50,0.25,0.10,0.05
IB/mm2を食餌表面に散布し、幼虫50匹に１濃度を連続
４日間与え、これを４回繰り返して１濃度につき合計20
0匹とするとともに、同時に幼虫50匹に無処理の食餌を
与えてコントロールした。処理した食餌は随意に幼虫に
とらせ（幼虫１匹／セル）、これを10日間続け（死亡数
は毎日記録）、10日目をもって実験を終了した。トレー
は26℃の常温器（完全遮光）に保持した。各濃度による
幼虫死亡数を計算し必要な場合には訂正［Abbott,J.Eco
n.Entomol.18:265−267（1925年発行）参照］を行っ
た。10日間死亡数をパーセントに換算の上、プロビット
（Probit）分析を行い回帰方程式を計算した［Finney,P
robit Analysis,3d ed.,Cambridge Univ.Press,London
（1971年発行）;Busvine,A Critical Review of the Te
chniques for Testing Insecticides,Commonwealth Agr
ic.Bureau,345 pp.（1971年発行）参照］。LC50の信頼
限界は確率95％で計算した。トリコプラシア・ニ新生幼
虫に対するAcMEVの実験も同一の手続によって行った
が、シングラハファルシフェラ新生幼虫によるAcMEVの
生物検定は行わなかった。24時間毎、試験期間10日間
（毎日1600−1630時の間）の幼虫死亡率を処理毎に分け
てプロットし、上記２種の昆虫の経時死亡曲線（幼虫死
亡数／処理のパーセント）を作成した。
−CLMEVの効果 シングラハ・ファルシフェラとトリコプラシア・ニ新生
幼虫の使用量関連死亡反応を測定した。事前に使用量に
ついて広範囲のスクリーニングテストを行った結果で
は、LC50は＜1.0 IB/mm2であった。1.6 x 107 IB/mlを
含む水性懸濁液を用いて連続希釈液をつくり食餌表面汚
染法［Ignoffo and Boeningの上記文献参照］により生
物検定を行った。IB濃度各々0.75,0.50,0.25,0.10,0.05
IB/mm2を食餌表面に散布し、幼虫50匹に１濃度を連続
４日間与え、これを４回繰り返して１濃度につき合計20
0匹とするとともに、同時に幼虫50匹に無処理の食餌を
与えてコントロールした。処理した食餌は随意に幼虫に
とらせ（幼虫１匹／セル）、これを10日間続け（死亡数
は毎日記録）、10日目をもって実験を終了した。トレー
は26℃の常温器（完全遮光）に保持した。各濃度による
幼虫死亡数を計算し必要な場合には訂正［Abbott,J.Eco
n.Entomol.18:265−267（1925年発行）参照］を行っ
た。10日間死亡数をパーセントに換算の上、プロビット
（Probit）分析を行い回帰方程式を計算した［Finney,P
robit Analysis,3d ed.,Cambridge Univ.Press,London
（1971年発行）;Busvine,A Critical Review of the Te
chniques for Testing Insecticides,Commonwealth Agr
ic.Bureau,345 pp.（1971年発行）参照］。LC50の信頼
限界は確率95％で計算した。トリコプラシア・ニ新生幼
虫に対するAcMEVの実験も同一の手続によって行った
が、シングラハファルシフェラ新生幼虫によるAcMEVの
生物検定は行わなかった。24時間毎、試験期間10日間
（毎日1600−1630時の間）の幼虫死亡率を処理毎に分け
てプロットし、上記２種の昆虫の経時死亡曲線（幼虫死
亡数／処理のパーセント）を作成した。
実施例６ 感受性、宿主域試験 この感受性および宿主域試験は、ミズリー州コロンビ
ア、合衆国農業省農業研究局BCIRL（USDA−ARS−BCIRL,
Columbia,Missouri）で飼育されているリンシ目昆虫、
ミズリー州中部で繁殖しているものを野外から採集した
幼虫段階のリンシ目昆虫、およびミズリー州コロンビ
ア、ミズリー大学昆虫科（The University of Missouri
Entomology Department,Columbia,Missouri）から提供
された若干のコロニーを試験対象として実施した。ま
た、メリーランド州ベルツビル（Beltsville,Marylan
d）、ミシシッピー州ストーンビル（Stoneville,Missis
sippi）、カルフォルニア州フレスノ（Fresno,Californ
ia）、ジョージア州チフトン（Tifton,Geogia）に所在
の合衆国農業省各研究所から御協力を得、それぞれが保
持しているリンシ目幼虫から選んだものを用いてHPV−8
5−CLMEVのスクリーニングテストを実施して頂いた。こ
のようにして、広範な種類の宿主（および成長段階）に
ついて、HPV−85−CLMEV感受性試験を行った。（実用の
場合の典型例として）標準懸濁仕込液10および100 IB/m
m2（使用量）を食餌培養基（人工および天然の宿主植
物）に添加することにより、幼虫の感受性の生物検定を
行うこととしたが、上記濃度の中100 IB/mm2は「エレカ
ー（ELCAR）」の推奨使用量（113.4g,4 x 109 IB/g A
I）と同等であった。また、10日の試験期間内で上記濃
度に対する幼虫の感受性が立証されたが（特有の徴候／
症状，顕微鏡所見）、野外に於ける実用の場合でもこれ
とほとんど同じものが所望されている。成長が進んだ段
階の昆虫（例えば、三−四齢のカットワーム）および10
日の試験期間内で感染発生の蓋然性が低いと判断された
場合、それに応じて使用量を増量した。
ア、合衆国農業省農業研究局BCIRL（USDA−ARS−BCIRL,
Columbia,Missouri）で飼育されているリンシ目昆虫、
ミズリー州中部で繁殖しているものを野外から採集した
幼虫段階のリンシ目昆虫、およびミズリー州コロンビ
ア、ミズリー大学昆虫科（The University of Missouri
Entomology Department,Columbia,Missouri）から提供
された若干のコロニーを試験対象として実施した。ま
た、メリーランド州ベルツビル（Beltsville,Marylan
d）、ミシシッピー州ストーンビル（Stoneville,Missis
sippi）、カルフォルニア州フレスノ（Fresno,Californ
ia）、ジョージア州チフトン（Tifton,Geogia）に所在
の合衆国農業省各研究所から御協力を得、それぞれが保
持しているリンシ目幼虫から選んだものを用いてHPV−8
5−CLMEVのスクリーニングテストを実施して頂いた。こ
のようにして、広範な種類の宿主（および成長段階）に
ついて、HPV−85−CLMEV感受性試験を行った。（実用の
場合の典型例として）標準懸濁仕込液10および100 IB/m
m2（使用量）を食餌培養基（人工および天然の宿主植
物）に添加することにより、幼虫の感受性の生物検定を
行うこととしたが、上記濃度の中100 IB/mm2は「エレカ
ー（ELCAR）」の推奨使用量（113.4g,4 x 109 IB/g A
I）と同等であった。また、10日の試験期間内で上記濃
度に対する幼虫の感受性が立証されたが（特有の徴候／
症状，顕微鏡所見）、野外に於ける実用の場合でもこれ
とほとんど同じものが所望されている。成長が進んだ段
階の昆虫（例えば、三−四齢のカットワーム）および10
日の試験期間内で感染発生の蓋然性が低いと判断された
場合、それに応じて使用量を増量した。
実施例７ 水性粉末剤の調製 研究用の参考あるいは基準として、標準化された、安定
性の高い水性粉末剤を調製した［Proc.4th Int.Colloq.
Insect Pathol.,College Park,MD（1971年発行）のCunn
ingham,“Polyhedrosis Viruses Infecting the Easter
n Hemlock Looper,Lombdina fiscellaria"およびMartig
noni,“Production,Activity,and Safety of the Dougl
as−Fir Tussock Moth Nucleopolyhedrosis Virus,"USD
A,Forest Serv.Tech.Bull.No.1585（1978年発行）参
照］。調製方法としては、ベイルら［Vail et al.の上
記文献参照］の方法を一部変更したものを用いた。五齢
のトリコプラシア・ニ幼虫500匹からホモゲネートを作
り、これから1.135 x 109 IB/mlを含む懸濁液200mlを得
た。この懸濁液を250 mlの「ナルジーン（Nalgene）」
遠心管に入れ10分間、7,000 rpmにより分離した後、上
澄み液を捨てた。ペレットを（細菌と細胞の溶解のた
め）3.3％デオキシコール酸ナトリウム50 ml中に再び懸
濁し、約20時間、27℃で培養した。上記と同様の遠心分
離により懸濁液からデオキシコール酸ナトリウムを除
き、ペレットを無菌蒸留水150 mlに懸濁し、10分間7,00
0 rpmの回転をさせることにより水洗を行い、これを２
回繰り返した。第二回目の水洗を終えた後、ペレットを
無菌蒸留水150 mlに懸濁し、試薬用Ｄ（＋）＃2248ラク
トース（α−ラクトースの一水和物）（J.T.Baker,Inc.
製）350gと共に1200 ml「ビルチス（Virtis）」凍結乾
燥容器に入れ濃厚なスラリー（マルトースの代わりにラ
クトースを用いた）を形成させた。凍結乾燥フラスコを
回転させることによりスラリーをフラスコ内に一様に散
らせた後、先ず−70℃のフリーザー内に１時間放置し、
続いて24時間の凍結乾燥を行った。フラスコの内容物を
取り出し乳鉢と乳棒により粉砕し、これをNo.42真ちゅ
うスクリーン（345μ）でふるいにかけパラピン紙上に
落とした。これにより、均質度の高い白色粉末を得た。
凍結乾燥製剤は一晩フリーザー（−４℃）に収容した
後、IB/gの計量と活性の生物検定を行った。
性の高い水性粉末剤を調製した［Proc.4th Int.Colloq.
Insect Pathol.,College Park,MD（1971年発行）のCunn
ingham,“Polyhedrosis Viruses Infecting the Easter
n Hemlock Looper,Lombdina fiscellaria"およびMartig
noni,“Production,Activity,and Safety of the Dougl
as−Fir Tussock Moth Nucleopolyhedrosis Virus,"USD
A,Forest Serv.Tech.Bull.No.1585（1978年発行）参
照］。調製方法としては、ベイルら［Vail et al.の上
記文献参照］の方法を一部変更したものを用いた。五齢
のトリコプラシア・ニ幼虫500匹からホモゲネートを作
り、これから1.135 x 109 IB/mlを含む懸濁液200mlを得
た。この懸濁液を250 mlの「ナルジーン（Nalgene）」
遠心管に入れ10分間、7,000 rpmにより分離した後、上
澄み液を捨てた。ペレットを（細菌と細胞の溶解のた
め）3.3％デオキシコール酸ナトリウム50 ml中に再び懸
濁し、約20時間、27℃で培養した。上記と同様の遠心分
離により懸濁液からデオキシコール酸ナトリウムを除
き、ペレットを無菌蒸留水150 mlに懸濁し、10分間7,00
0 rpmの回転をさせることにより水洗を行い、これを２
回繰り返した。第二回目の水洗を終えた後、ペレットを
無菌蒸留水150 mlに懸濁し、試薬用Ｄ（＋）＃2248ラク
トース（α−ラクトースの一水和物）（J.T.Baker,Inc.
製）350gと共に1200 ml「ビルチス（Virtis）」凍結乾
燥容器に入れ濃厚なスラリー（マルトースの代わりにラ
クトースを用いた）を形成させた。凍結乾燥フラスコを
回転させることによりスラリーをフラスコ内に一様に散
らせた後、先ず−70℃のフリーザー内に１時間放置し、
続いて24時間の凍結乾燥を行った。フラスコの内容物を
取り出し乳鉢と乳棒により粉砕し、これをNo.42真ちゅ
うスクリーン（345μ）でふるいにかけパラピン紙上に
落とした。これにより、均質度の高い白色粉末を得た。
凍結乾燥製剤は一晩フリーザー（−４℃）に収容した
後、IB/gの計量と活性の生物検定を行った。
実施例８ IB/gの測定 粉末10グラムを100 mlメスフラスコにとり、充分量を加
えて100 mlとした。この懸濁液を200 mlビーカーに入
れ、短時間の音波処理（１分間75−100ワット）をして
塊を粉砕した。連続希釈液を調製し、血球計により凍結
乾燥粉末のIB/g数を測定した。さらに、このを懸濁液を
濃度8950 IB/0.1 mlに調整した後、三齢のトリコプラシ
ア・ニ、ヘリオチス・ジー、ヘリオチス・ビルセンスお
よびスポドプテラ・フルギペルダの幼虫を用いて生物検
定を行い力価／感染力を追認した。
えて100 mlとした。この懸濁液を200 mlビーカーに入
れ、短時間の音波処理（１分間75−100ワット）をして
塊を粉砕した。連続希釈液を調製し、血球計により凍結
乾燥粉末のIB/g数を測定した。さらに、このを懸濁液を
濃度8950 IB/0.1 mlに調整した後、三齢のトリコプラシ
ア・ニ、ヘリオチス・ジー、ヘリオチス・ビルセンスお
よびスポドプテラ・フルギペルダの幼虫を用いて生物検
定を行い力価／感染力を追認した。
実施例９ 病理および顕微鏡所見 感染幼虫は、嗜眠に陥り、食餌をとらなくなり、乳白色
となって死んで行き皮膜は破裂した（融解）。位相差顕
微鏡（500倍）で観察を行ったところ、切除して水性封
入を通して見た感染組織および血液細胞、血液リンパに
おいてIBを容易に確認することができた。
となって死んで行き皮膜は破裂した（融解）。位相差顕
微鏡（500倍）で観察を行ったところ、切除して水性封
入を通して見た感染組織および血液細胞、血液リンパに
おいてIBを容易に確認することができた。
実施例10 透過型電子顕微鏡測定 水性懸濁液（懸濁原液）を「エッペンドルフ（Eppendor
f）」5412遠心分離機により10分間15,000 rpmの処理を
行いペレット状の封入体（IB）を得た。このIBを２時間
４℃で１％グルタルアルデヒド中（pH 7.2）で固定し、
４時間５％庶糖−カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.
2）で洗い、各回１時間宛の間隔においてこれを４回繰
り返し２％四酸化オスミウムで固定（１時間）、再び庶
糖−カコジル酸ナトリウム緩衝液で洗った（10分間）
後、各々20,40,60,80,90および100％エタノールで連続
脱水した。IBを100％エタノールに30分間放置しその
後、10分間15,000 rpmで遠心分離をおこなった。ペレッ
トをスパーズ（Spurs）培地に浸透、包埋させて、これ
からLKB 2088ウルトラトームＶ（Ultratome V）により
薄片（0.7−1.0μｍ）を作成した。薄片には１％エタノ
ール化酢酸ウラニルで色付け（10分間）し、続いて消イ
オン水で洗いクエン酸鉛で色付け（２分間）を行った。
さらに、無菌蒸留水で洗い、乾燥の後ジオール（JEOL）
100S電子顕微鏡により80 KVで観察した。
f）」5412遠心分離機により10分間15,000 rpmの処理を
行いペレット状の封入体（IB）を得た。このIBを２時間
４℃で１％グルタルアルデヒド中（pH 7.2）で固定し、
４時間５％庶糖−カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.
2）で洗い、各回１時間宛の間隔においてこれを４回繰
り返し２％四酸化オスミウムで固定（１時間）、再び庶
糖−カコジル酸ナトリウム緩衝液で洗った（10分間）
後、各々20,40,60,80,90および100％エタノールで連続
脱水した。IBを100％エタノールに30分間放置しその
後、10分間15,000 rpmで遠心分離をおこなった。ペレッ
トをスパーズ（Spurs）培地に浸透、包埋させて、これ
からLKB 2088ウルトラトームＶ（Ultratome V）により
薄片（0.7−1.0μｍ）を作成した。薄片には１％エタノ
ール化酢酸ウラニルで色付け（10分間）し、続いて消イ
オン水で洗いクエン酸鉛で色付け（２分間）を行った。
さらに、無菌蒸留水で洗い、乾燥の後ジオール（JEOL）
100S電子顕微鏡により80 KVで観察した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パトラー，ベンジャミン アメリカ合衆国、65211 ミズーリ、コロ ンビア、アグリカルチャー・ビルディング 187 ユニヴァーシティ・オヴ・ミズー リ、デパートメント・オヴ・エントモロジ ー
Claims (5)
- 【請求項１】HPV−85−CLMEV,ATCC No.VR 2237の同定特
性を有し、リンシ目の昆虫に対して広範な殺虫効果を有
することを特徴とする多重包理核多角体病ウイルス。 - 【請求項２】昆虫または昆虫の生息地に殺虫剤を使用し
てなる昆虫の制御方法において、昆虫または昆虫の生息
地にHPV−85−CLMEV,ATCC No.VR2237の同定特性を有
し、リンシ目の昆虫に対して広範な殺虫効果を有する多
重包理核多角体病ウイルスの殺虫有効量を使用すること
を特徴とする昆虫の制御方法。 - 【請求項３】上記の昆虫がリンシ目であることを特徴と
する請求項２に記載の昆虫の制御方法。 - 【請求項４】殺虫に充分な量のHPV−85−CLMEV,ATCC N
o.VR 2237の同定特性を有し、リンシ目の昆虫に対する
広範な殺虫効果を有する多重包理核多角体病ウイルス
と、不活性担体とを含有することを特徴とする殺虫剤組
成物。 - 【請求項５】上記不活性担体がラクトースであることを
特徴とする請求項４に記載の殺虫剤組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/320,126 US4911913A (en) | 1989-03-07 | 1989-03-07 | Multiple embedded nuclear polyhedrosis virus from celery looper with activity against lepidoptera |
| US320,126 | 1989-03-07 | ||
| PCT/US1990/001086 WO1990010387A1 (en) | 1989-03-07 | 1990-03-07 | A multiple embedded nuclear polyhedrosis virus from celery looper with activity against lepidoptera |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04500160A JPH04500160A (ja) | 1992-01-16 |
| JPH0789911B2 true JPH0789911B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=23244995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2505219A Expired - Fee Related JPH0789911B2 (ja) | 1989-03-07 | 1990-03-07 | 昆虫に対する活性を有するセロリ・シャクトリ虫からの多重包埋核多角体病ウイルス |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4911913A (ja) |
| EP (1) | EP0462219B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0789911B2 (ja) |
| AU (1) | AU647455B2 (ja) |
| BR (1) | BR9007135A (ja) |
| CA (1) | CA2044579C (ja) |
| DE (1) | DE69023641T2 (ja) |
| DK (1) | DK0462219T3 (ja) |
| ES (1) | ES2081978T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990010387A1 (ja) |
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| US5879674A (en) * | 1992-02-18 | 1999-03-09 | American Cyanamid Company | Potentiation of epizootic viral infections of insects |
| US5593669A (en) * | 1992-04-29 | 1997-01-14 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Stable pre-occluded virus particle |
| US5405770A (en) * | 1993-01-21 | 1995-04-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Heliothis subflexa cell line for the production of baculoviruses |
| US5420031A (en) * | 1993-02-08 | 1995-05-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Gypsy moth virus with enhanced polyhedra production stability |
| GB9323495D0 (en) * | 1993-11-15 | 1994-01-05 | Zeneca Ltd | Biological control agent |
| GB9405951D0 (en) * | 1994-03-25 | 1994-05-11 | Zeneca Ltd | Biological control agents |
| US6042843A (en) * | 1996-11-25 | 2000-03-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Baculovirus for the control of insect pests |
| US5882913A (en) * | 1997-08-07 | 1999-03-16 | The United States Of American As Represented By The Secretary Of Agriculture | Strain of gypsy moth virus with enhanced polyhedra and budded virus production |
| US5853982A (en) * | 1997-10-03 | 1998-12-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method of isolating strains of the Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus |
| GB9908328D0 (en) * | 1999-04-12 | 1999-06-09 | Mann Stephen P | Enzymes,dilutents and the provision of water for hydrolytic catalysis |
| US6521454B1 (en) | 1999-06-30 | 2003-02-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Baculoviruses, insecticidal compositions, and methods for control of invertebrates |
| US8110608B2 (en) | 2008-06-05 | 2012-02-07 | Ecolab Usa Inc. | Solid form sodium lauryl sulfate (SLS) pesticide composition |
| US8968757B2 (en) | 2010-10-12 | 2015-03-03 | Ecolab Usa Inc. | Highly wettable, water dispersible, granules including two pesticides |
| CN112602712A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-06 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 草地贪夜蛾成虫诱捕剂、其制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE3627396A1 (de) * | 1986-08-13 | 1988-02-18 | Hoechst Ag | Verfahren zur zuechtung von granuloseviren |
| US4844896A (en) * | 1987-11-02 | 1989-07-04 | Lim Technology Laboratories, Inc. | Microencapsulated insecticidal pathogens |
-
1989
- 1989-03-07 US US07/320,126 patent/US4911913A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-07 EP EP90905294A patent/EP0462219B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 CA CA002044579A patent/CA2044579C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-07 BR BR909007135A patent/BR9007135A/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-03-07 WO PCT/US1990/001086 patent/WO1990010387A1/en not_active Ceased
- 1990-03-07 ES ES90905294T patent/ES2081978T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 DE DE69023641T patent/DE69023641T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-07 JP JP2505219A patent/JPH0789911B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-07 DK DK90905294.6T patent/DK0462219T3/da active
-
1991
- 1991-03-04 AU AU72083/91A patent/AU647455B2/en not_active Ceased
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| BR9007135A (pt) | 1991-11-26 |
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| US4911913A (en) | 1990-03-27 |
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| EP0462219A4 (en) | 1992-09-09 |
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| CA2044579C (en) | 1997-05-13 |
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