JPH0789931B2 - Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼のゲノムの分子クロ−ン - Google Patents
Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼のゲノムの分子クロ−ンInfo
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- JPH0789931B2 JPH0789931B2 JP60503937A JP50393785A JPH0789931B2 JP H0789931 B2 JPH0789931 B2 JP H0789931B2 JP 60503937 A JP60503937 A JP 60503937A JP 50393785 A JP50393785 A JP 50393785A JP H0789931 B2 JPH0789931 B2 JP H0789931B2
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- dna
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- sst
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 関連する発明においてHTLV−IIIを検出．分離し、HT細
胞株で不死化した。HTLV−IIIが後天性免疫不全症候群
（AIDS.エイズ）に関係していることが強く証拠づけら
れたので、このウイルスの産生を強め得ることおよびこ
のウイルスのDNA配列を決め得ることがエイズの治療
法、あるいはエイズに対する薬剤を開発する上で決定的
に重要である。本発明は、HTLV−IIIウイルスの完全な
ゲノムを分子クローニングする方法を示すことにより、
意味ある一歩となるものである。要約すれば、H9/HTLV
−IIIと名付けられたひとつの株により産生されるHTLV
−IIIウイルスの完全なゲノムの分子クローニングを開
示している。非常に関連を持つがいくつかの制限酵素切
断部位を異にするこのウイルスの二つの型を同定してい
る。両変株は感染細胞株に組込まれた形および組込まれ
ない形で存在する。二つの型のHTLV−IIIの完全なゲノ
ムを分子クローニングし、多クローン的に組込まれたプ
ロウイルスおよび組込まれないウイルスDNAとして長期
間感染細胞株に存在することを示している。これらのク
ローンを、種々のエイズ患者から採ったH9/HTLV−III以
外の細胞株における、およびエイズ患者の新鮮なリンパ
様組織におけるウイルス配列を検出するプローブとして
使用し、更にこのクローン化ゲノムがほとんどエイズの
病源体のHTLV−IIIから成っている証拠を与えている。
胞株で不死化した。HTLV−IIIが後天性免疫不全症候群
（AIDS.エイズ）に関係していることが強く証拠づけら
れたので、このウイルスの産生を強め得ることおよびこ
のウイルスのDNA配列を決め得ることがエイズの治療
法、あるいはエイズに対する薬剤を開発する上で決定的
に重要である。本発明は、HTLV−IIIウイルスの完全な
ゲノムを分子クローニングする方法を示すことにより、
意味ある一歩となるものである。要約すれば、H9/HTLV
−IIIと名付けられたひとつの株により産生されるHTLV
−IIIウイルスの完全なゲノムの分子クローニングを開
示している。非常に関連を持つがいくつかの制限酵素切
断部位を異にするこのウイルスの二つの型を同定してい
る。両変株は感染細胞株に組込まれた形および組込まれ
ない形で存在する。二つの型のHTLV−IIIの完全なゲノ
ムを分子クローニングし、多クローン的に組込まれたプ
ロウイルスおよび組込まれないウイルスDNAとして長期
間感染細胞株に存在することを示している。これらのク
ローンを、種々のエイズ患者から採ったH9/HTLV−III以
外の細胞株における、およびエイズ患者の新鮮なリンパ
様組織におけるウイルス配列を検出するプローブとして
使用し、更にこのクローン化ゲノムがほとんどエイズの
病源体のHTLV−IIIから成っている証拠を与えている。
有用性の記述 HTLV群のウイルスについての従来の研究成果により三種
の変株が認められた。これらの内、HTLV−IIIがエイズ
の病源体と信じられた。本発明によってつくられたクロ
ーンを使い、HTLV−IIIがHTLV−ＩおよびHTLV−IIと明
らかに異ることが示され、この際、HTLV−ＩとHTLV−II
は高い同一性を持っていて、このために血清中のエイズ
ウイルスの同定が良好にできた。
の変株が認められた。これらの内、HTLV−IIIがエイズ
の病源体と信じられた。本発明によってつくられたクロ
ーンを使い、HTLV−IIIがHTLV−ＩおよびHTLV−IIと明
らかに異ることが示され、この際、HTLV−ＩとHTLV−II
は高い同一性を持っていて、このために血清中のエイズ
ウイルスの同定が良好にできた。
図面の説明 第１図はHTLV−IIIの組込まれないDNAのサザーンプロッ
ト（Southern blot）分析を表わす。４時間後に未消化D
NAにはウイルスの配列は検出できなかった。しかし、1
0,15,24および48時間で採取したものには約10Kbの長さ
のウイルスの主要な分子種が存在し、ウイルスの直線状
の組込まれない形を示している。いくつかの制限酵素で
消化した15時間後の試料の代表的なサザーン プロット
（Southern blot）を本図に示す。方法:8×103個の新鮮
で未感染H9細胞に４×1011粒子のHTLV−IIIを含む細胞
株H9/HTLV−IIIの濃縮上澄液を感染させた。感染させた
細胞を５個のローラーびんに分注し、4,10,15,24および
48時間後に採取した。低分子量DNAをハート（Hirt）分
画法を使って調製した。未消化および消化DNA30μｇを
0.8％アガロース ゲルで分離、ニトロセルロース紙に
移し、１×SSC,40％ホルムアミドおよび10％硫酸デキス
トラン中、37℃で24時間、HTLV−III cDNAプローブとハ
イブリダイゼイションを行った。cDNAはオリゴ（dT）プ
ライマーの存在下に二度バンド化処理したHTLV−IIIウ
イルスから調製したポリ（Ａ）選択RNAから合成した。
フィルターは１×SSCにより65℃で洗浄した。
ト（Southern blot）分析を表わす。４時間後に未消化D
NAにはウイルスの配列は検出できなかった。しかし、1
0,15,24および48時間で採取したものには約10Kbの長さ
のウイルスの主要な分子種が存在し、ウイルスの直線状
の組込まれない形を示している。いくつかの制限酵素で
消化した15時間後の試料の代表的なサザーン プロット
（Southern blot）を本図に示す。方法:8×103個の新鮮
で未感染H9細胞に４×1011粒子のHTLV−IIIを含む細胞
株H9/HTLV−IIIの濃縮上澄液を感染させた。感染させた
細胞を５個のローラーびんに分注し、4,10,15,24および
48時間後に採取した。低分子量DNAをハート（Hirt）分
画法を使って調製した。未消化および消化DNA30μｇを
0.8％アガロース ゲルで分離、ニトロセルロース紙に
移し、１×SSC,40％ホルムアミドおよび10％硫酸デキス
トラン中、37℃で24時間、HTLV−III cDNAプローブとハ
イブリダイゼイションを行った。cDNAはオリゴ（dT）プ
ライマーの存在下に二度バンド化処理したHTLV−IIIウ
イルスから調製したポリ（Ａ）選択RNAから合成した。
フィルターは１×SSCにより65℃で洗浄した。
第２図は組込まれていないウイルスDNAからクローン化
した関連性の高い二つのHTLV−III変株の制限エンドヌ
クレアーゼ地図を表わす。三種の組換えファージクロー
ン（λBH10,λBH5およびλBH8）を分析し、その挿入
（それぞれ9Kb,5.5Kbおよび3.5Kb）を示した酵素によっ
て地図をつくった。これには太字とアステリスクで描か
れた３個所の酵素部位で異っているHTLV−IIIの二種の
変株型が示されている。Sst IはHTLV−IIIのLTRを切断
するので、三種のクローンはひとつのLTRを持つ二つの
全長のゲノムを表わしている。LTRの全長は大体である
が、このウイルスゲノムの図式的地図を図の下部に示
す。方法:15および24時間採取物から集めた低分子量DNA
を10−40％庶糖濃度勾配で分画した。画分の一部を0.5
％アガロース ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース紙
に移し、第１図に記載した条件下にHTLV cDNAとハイブ
リダイゼイションを行った。ハイブリダイゼイションに
より示された組込まれない直線のHTLV−IIIゲノムを含
む画分を集め、そのDNAを次いでSst Iで消化し、λgtWe
sλＢのホスファダーゼ処理Sst I枝部に結合した。in v
itroでパッケージングした後、組換えファージをHTLV−
III cDNAによりウイルス配列をスクリーニングした。
した関連性の高い二つのHTLV−III変株の制限エンドヌ
クレアーゼ地図を表わす。三種の組換えファージクロー
ン（λBH10,λBH5およびλBH8）を分析し、その挿入
（それぞれ9Kb,5.5Kbおよび3.5Kb）を示した酵素によっ
て地図をつくった。これには太字とアステリスクで描か
れた３個所の酵素部位で異っているHTLV−IIIの二種の
変株型が示されている。Sst IはHTLV−IIIのLTRを切断
するので、三種のクローンはひとつのLTRを持つ二つの
全長のゲノムを表わしている。LTRの全長は大体である
が、このウイルスゲノムの図式的地図を図の下部に示
す。方法:15および24時間採取物から集めた低分子量DNA
を10−40％庶糖濃度勾配で分画した。画分の一部を0.5
％アガロース ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース紙
に移し、第１図に記載した条件下にHTLV cDNAとハイブ
リダイゼイションを行った。ハイブリダイゼイションに
より示された組込まれない直線のHTLV−IIIゲノムを含
む画分を集め、そのDNAを次いでSst Iで消化し、λgtWe
sλＢのホスファダーゼ処理Sst I枝部に結合した。in v
itroでパッケージングした後、組換えファージをHTLV−
III cDNAによりウイルス配列をスクリーニングした。
第３図は感染細胞株9/HTLV−IIIにおけるHTLV−IIIウイ
ルス配列を表わす。HTLV−IIIの両変株型は感染細胞株
の内でプロウイルスおよび組込まれないウイルスDNAと
して検出された。しかし、非感染H9細胞、非感染HT細胞
にも、正常ヒト胸腺（NT）にもウイルス配列は見い出せ
なかった。方法：高分子量DNA10μｇを示されたように
制限酵素で消化し、第１図において記載したものと同じ
条件下でBH10のニック翻訳ファージ挿入部とハイブリダ
イゼイションを行った。
ルス配列を表わす。HTLV−IIIの両変株型は感染細胞株
の内でプロウイルスおよび組込まれないウイルスDNAと
して検出された。しかし、非感染H9細胞、非感染HT細胞
にも、正常ヒト胸腺（NT）にもウイルス配列は見い出せ
なかった。方法：高分子量DNA10μｇを示されたように
制限酵素で消化し、第１図において記載したものと同じ
条件下でBH10のニック翻訳ファージ挿入部とハイブリダ
イゼイションを行った。
第４図はHTLV群の他のものとHTLV−IIIの配列の同一性
を表わす。HTLV−1,HTLV−I bおよびHTLV−IIの図式化
した制限地図を描き、相当するゲノム部分に関して生じ
たフラグメントの長さと位置を下に示す。LTR,gag,pol,
envおよびpX部分はHTLV−Ｉの公表されたヌクレオチド
配列にしたがったスケールで描いた。厳密さの増加とし
て最も高度に保存されるバンドはHTLV−Ｉ（1.8KbのPst
Iフラグメント）およびHTLV−II b（3.1Kb Pst Iフラ
グメント）のgag/pol接続部分に相当し、また重り合わ
ないHTLV−II（2.1Kb Sma I/BamH Iフラグメント）のpo
l部分の３′部分に相当し、HTLV−IIにおけるものと同
じゲノム組立てを推定させる。HTLV−Ｉ（2.1Kb Sst I
Pstフラグメント）およびHTLV−I b（1.4Kb Pstフラグ
メント）のpXに相当するフラグメントは保存されること
が少いが、元のオートラジオグラムにTm−28℃でまだ見
ることができる。GaLVを消化すると６個のフラグメント
を生ずるが、そのいずれも中程度または高度の厳密さで
ハイブリダイゼイションを示さない。方法：プロトタイ
プのHTLV−I,HTLV−I b,HTLV−IIIおよびGaLV（Seato
株）の全長を持つゲノムのサブクローンを下記の酵素で
消化した。Pst IとSst I（HTLV−ＩおよびHTLV−I b）,
BamH IとSma I（HTLV−II）およびHind IIIとSma IとXh
o I（GaLV）。４枚の複製フィルターを用意し、λBH10
のニック翻訳挿入と低厳密度で（８×SSC,20％ホルムア
ミド、10％硫酸デキストラン、37℃）36時間ハイブリダ
イゼイションを行った。次いでフィルターを異った温
度、フィルター１は22℃（Tm−70℃）、フィルター２は
37℃（Tm−56℃）、フィルター３は50℃（Tm−42℃）お
よび65℃（Tm−28℃）で１×SSCにより洗浄した。
を表わす。HTLV−1,HTLV−I bおよびHTLV−IIの図式化
した制限地図を描き、相当するゲノム部分に関して生じ
たフラグメントの長さと位置を下に示す。LTR,gag,pol,
envおよびpX部分はHTLV−Ｉの公表されたヌクレオチド
配列にしたがったスケールで描いた。厳密さの増加とし
て最も高度に保存されるバンドはHTLV−Ｉ（1.8KbのPst
Iフラグメント）およびHTLV−II b（3.1Kb Pst Iフラ
グメント）のgag/pol接続部分に相当し、また重り合わ
ないHTLV−II（2.1Kb Sma I/BamH Iフラグメント）のpo
l部分の３′部分に相当し、HTLV−IIにおけるものと同
じゲノム組立てを推定させる。HTLV−Ｉ（2.1Kb Sst I
Pstフラグメント）およびHTLV−I b（1.4Kb Pstフラグ
メント）のpXに相当するフラグメントは保存されること
が少いが、元のオートラジオグラムにTm−28℃でまだ見
ることができる。GaLVを消化すると６個のフラグメント
を生ずるが、そのいずれも中程度または高度の厳密さで
ハイブリダイゼイションを示さない。方法：プロトタイ
プのHTLV−I,HTLV−I b,HTLV−IIIおよびGaLV（Seato
株）の全長を持つゲノムのサブクローンを下記の酵素で
消化した。Pst IとSst I（HTLV−ＩおよびHTLV−I b）,
BamH IとSma I（HTLV−II）およびHind IIIとSma IとXh
o I（GaLV）。４枚の複製フィルターを用意し、λBH10
のニック翻訳挿入と低厳密度で（８×SSC,20％ホルムア
ミド、10％硫酸デキストラン、37℃）36時間ハイブリダ
イゼイションを行った。次いでフィルターを異った温
度、フィルター１は22℃（Tm−70℃）、フィルター２は
37℃（Tm−56℃）、フィルター３は50℃（Tm−42℃）お
よび65℃（Tm−28℃）で１×SSCにより洗浄した。
発 明 本発明は急性的に感染した細胞において組込まれないプ
ロウイルスの濃度を高めた画分からHTLV−IIIの分子ク
ローンを製造する方法に関する。HTLV−IIIゲノムのた
めの三種のクローンを、組込まれないウイルスDNAを分
離し、同定し、適当な制限酵素を使ってこのDNAを切断
し、ウイルスcDNAによってスクリーニングされ得るファ
ージライブラリーを構築することによる組換えDNA技術
を使って製造した。この方法により三種の組換えDNAク
ローンが製造できた：完全なHTLV−IIIゲノムに相当す
る9.0Kbのウイルス挿入を含むBH10;5.5Kbの挿入を含む
クローンBH8:および3.5Kbのウイルス挿入を含むクロー
ンBH5。これら三種のクローン間の差を図示した第３図
を参照。
ロウイルスの濃度を高めた画分からHTLV−IIIの分子ク
ローンを製造する方法に関する。HTLV−IIIゲノムのた
めの三種のクローンを、組込まれないウイルスDNAを分
離し、同定し、適当な制限酵素を使ってこのDNAを切断
し、ウイルスcDNAによってスクリーニングされ得るファ
ージライブラリーを構築することによる組換えDNA技術
を使って製造した。この方法により三種の組換えDNAク
ローンが製造できた：完全なHTLV−IIIゲノムに相当す
る9.0Kbのウイルス挿入を含むBH10;5.5Kbの挿入を含む
クローンBH8:および3.5Kbのウイルス挿入を含むクロー
ンBH5。これら三種のクローン間の差を図示した第３図
を参照。
一般に、HTLV−IIIゲノムのクローニングには、濃縮し
たHTLV−IIIウイルスをH9細胞に感染後、組込まれない
ウイルスDNAを分離すること、およびラムダ ファージ
ライブラリーでこのDNAをクローニングしてウイルスc
DNAでスクリーニングすることが含まれる。細胞株H9/HT
LV−IIIは、多量のHTLV−IIIウイルスを産生し、エイズ
血清中のウイルス特異抗原および抗体を検出するために
使用する免疫的分析用の主要な産生細胞株として働く。
H9/HTLV−III細胞（感染細胞）を培養し、細胞を集め、
次いで新たに感染した細胞から低分子量DNAを抽出す
る。これにより組込まれないウイルスDNAが得られる。c
DNAライブラリーをHTLV−III cDNAを使ってつくる。次
いで、このcDNAを組込まれていないウイルスDNA分析の
ためのプローブとして使用する。次に組込まれていない
直線DNA（プロウイルスDNA）を得るが、これは全HTLV−
IIIゲノムを含み、すなわち複製能を持つ。次いでこのD
NAを消化し、プラスミド ラムダgtWes・ラダムＢに入
れラダムBH10クローンを形成させる。他のクローンはHT
LV−IIIゲノム全体は含んでいないプロウイルスDNAを消
化することによってつくる。
たHTLV−IIIウイルスをH9細胞に感染後、組込まれない
ウイルスDNAを分離すること、およびラムダ ファージ
ライブラリーでこのDNAをクローニングしてウイルスc
DNAでスクリーニングすることが含まれる。細胞株H9/HT
LV−IIIは、多量のHTLV−IIIウイルスを産生し、エイズ
血清中のウイルス特異抗原および抗体を検出するために
使用する免疫的分析用の主要な産生細胞株として働く。
H9/HTLV−III細胞（感染細胞）を培養し、細胞を集め、
次いで新たに感染した細胞から低分子量DNAを抽出す
る。これにより組込まれないウイルスDNAが得られる。c
DNAライブラリーをHTLV−III cDNAを使ってつくる。次
いで、このcDNAを組込まれていないウイルスDNA分析の
ためのプローブとして使用する。次に組込まれていない
直線DNA（プロウイルスDNA）を得るが、これは全HTLV−
IIIゲノムを含み、すなわち複製能を持つ。次いでこのD
NAを消化し、プラスミド ラムダgtWes・ラダムＢに入
れラダムBH10クローンを形成させる。他のクローンはHT
LV−IIIゲノム全体は含んでいないプロウイルスDNAを消
化することによってつくる。
上記の方法の内のふたつの要素が組換えDNA法で、すな
わちDNAライブラリーとcDNAプローブである。ライブラ
リーは、H9/HTLV−III細胞から全DNAを取採り、適当な
制限酵素を使ってそのDNAをフラグメントに切断し、放
射標識したcDNAプローブとそのフラグメントとをハイブ
リダイゼイションを行い、フラグメントをプラスミドベ
クターに接続し、次いでこの組換えDNAを適当な宿主に
導入することによってつくられる。
わちDNAライブラリーとcDNAプローブである。ライブラ
リーは、H9/HTLV−III細胞から全DNAを取採り、適当な
制限酵素を使ってそのDNAをフラグメントに切断し、放
射標識したcDNAプローブとそのフラグメントとをハイブ
リダイゼイションを行い、フラグメントをプラスミドベ
クターに接続し、次いでこの組換えDNAを適当な宿主に
導入することによってつくられる。
cDNAプローブは二度バンド化処理したHTLV−III mRNAか
らつくったHTLV−III cDNAプローブである。短いオリゴ
dT鎖をmRNA鎖のポリＡ尾部とハイブリダイゼイションを
行う。オリゴＴセグメントが逆転写酵素作用のプライマ
ーとして働く。この酵素は相補DNA鎖合成のための鋳型
としてmRNAを使用する。得られたcDNAは末端がヘアピン
ループ状である。mRNA鎖をNaOH処理により一度分解する
と、ヘアピンループはDNAポリメラーゼＩのプライマー
となり、対になったDNA鎖を完結させる。次いでループ
をSIヌクレアーゼで切断して二重鎖cDNA分子を得る。次
にDNAリガーゼを使用することにより、この二重鎖cDNA
にリンカーを加える。リンカーを制限酵素により切り開
いた後に、pBR322のような、同じ酵素で切断した適当な
プラスミドにこのcDNAを挿入する。得られたものがcDNA
含有組換えプラスミドである。
らつくったHTLV−III cDNAプローブである。短いオリゴ
dT鎖をmRNA鎖のポリＡ尾部とハイブリダイゼイションを
行う。オリゴＴセグメントが逆転写酵素作用のプライマ
ーとして働く。この酵素は相補DNA鎖合成のための鋳型
としてmRNAを使用する。得られたcDNAは末端がヘアピン
ループ状である。mRNA鎖をNaOH処理により一度分解する
と、ヘアピンループはDNAポリメラーゼＩのプライマー
となり、対になったDNA鎖を完結させる。次いでループ
をSIヌクレアーゼで切断して二重鎖cDNA分子を得る。次
にDNAリガーゼを使用することにより、この二重鎖cDNA
にリンカーを加える。リンカーを制限酵素により切り開
いた後に、pBR322のような、同じ酵素で切断した適当な
プラスミドにこのcDNAを挿入する。得られたものがcDNA
含有組換えプラスミドである。
従って、本発明は、H9/HTLV−III細胞から全細胞mRNAを
分離すること； 上記mRNAから二重鎖cDNAをつくり、このcDNAをファージ
ラムダ中に挿入して組換えDNA分子をつくること； 上記組換えDNA分子と放射標識されたHTLV−III cDNAプ
ローブとハイブリダイゼーションを行うこと； 上記分子からcDNAを放し、このcDNAを適当なプラスミド
中に挿入すること；および 上記プラスミドをHTLV−III DNA配列を表現可能な適当
な宿主に移入すること から本質的になる、HTLV−IIIのcDNA配列を分子クロー
ニングおよび表現する方法を提供する。
分離すること； 上記mRNAから二重鎖cDNAをつくり、このcDNAをファージ
ラムダ中に挿入して組換えDNA分子をつくること； 上記組換えDNA分子と放射標識されたHTLV−III cDNAプ
ローブとハイブリダイゼーションを行うこと； 上記分子からcDNAを放し、このcDNAを適当なプラスミド
中に挿入すること；および 上記プラスミドをHTLV−III DNA配列を表現可能な適当
な宿主に移入すること から本質的になる、HTLV−IIIのcDNA配列を分子クロー
ニングおよび表現する方法を提供する。
寄託の陳述 本発明のHTLV−III産生ヒトＴ細胞株および組換えファ
ージは、特許有効期間中、一般への制限なしに寄託が永
続されていることに関して米国特許庁により決められて
いるようにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに寄託されている。受託番号は、HTLV−III産生ヒ
トＴ細胞株であるH9/HTLV−IIIがCRL8543、組換えファ
ージクローンのうち、BH10を含むλBH10が40125、BH8を
含むλBHが40127、そしてBH5を含むλBH5が40126であ
る。
ージは、特許有効期間中、一般への制限なしに寄託が永
続されていることに関して米国特許庁により決められて
いるようにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに寄託されている。受託番号は、HTLV−III産生ヒ
トＴ細胞株であるH9/HTLV−IIIがCRL8543、組換えファ
ージクローンのうち、BH10を含むλBH10が40125、BH8を
含むλBHが40127、そしてBH5を含むλBH5が40126であ
る。
詳細な説明 H9/HTLV−IIIからの濃縮ウイルスを使い、新鮮な非感染
H9細胞に50ウイルス粒子／細胞の割合で感染させる；培
養物から4,10,15,24および48時間後に細胞を集める。染
色体外DNAをハート（Hirt）の方法によって抽出し、HTL
V−III cDNAをプローブとして使って組込まれていない
ウイルスDNAの量を分析する。このcDNAはオリゴ（dT）
によってプライマーをつけ、庶糖密度勾配で二度バンド
形成させたウイルス粒子からのポリ（Ａ）含有RNAから
転写した。組込まれない直線ウイルスDNAは10時間後に
初めて検出され、以降の時点でも存在する。15時間で採
取したもののサザーン ブロット（Southern blot）を
第１図に示す。未消化DNAにおける約10Kbのバンドは組
込まれていない複写能のあるHTLV−IIIの直線型を示
す。10,15および24時間採取物には閉じた、または切れ
目を持つ環状DNAは検出できなかったが、48時間採取物
には両型が少量認められた（データは示していない）。
ウイルスゲノムはXba Iで切断されなかったが、Sst Iで
は9Kb,5.5Kbおよび3.5Kbの主要な３個のバンドが生じた
（第１図）。これらのバンドは二つの型のHTLV−IIIの
完全なゲノムの表わし、両方共にSst IによりLTRで切断
され、一方はそのゲノムの中央に更にSst I部位を持
つ。組換えDNAクローンBH10は9.0Kbのウイルス挿入を含
み、これは完全なHTLV−IIIゲノムに一致する大きさで
ある。組換えDNAクローンBH8およびBH5はそれぞれ5.5Kb
と3.5Kbの挿入を含み、BH5の二三の制限酵素部位多形性
を除き、これらは共にBH10と完全に重なる。したがっ
て、BH10とBH8およびBH5はHTLV−IIIの二つの変株を表
わしている。
H9細胞に50ウイルス粒子／細胞の割合で感染させる；培
養物から4,10,15,24および48時間後に細胞を集める。染
色体外DNAをハート（Hirt）の方法によって抽出し、HTL
V−III cDNAをプローブとして使って組込まれていない
ウイルスDNAの量を分析する。このcDNAはオリゴ（dT）
によってプライマーをつけ、庶糖密度勾配で二度バンド
形成させたウイルス粒子からのポリ（Ａ）含有RNAから
転写した。組込まれない直線ウイルスDNAは10時間後に
初めて検出され、以降の時点でも存在する。15時間で採
取したもののサザーン ブロット（Southern blot）を
第１図に示す。未消化DNAにおける約10Kbのバンドは組
込まれていない複写能のあるHTLV−IIIの直線型を示
す。10,15および24時間採取物には閉じた、または切れ
目を持つ環状DNAは検出できなかったが、48時間採取物
には両型が少量認められた（データは示していない）。
ウイルスゲノムはXba Iで切断されなかったが、Sst Iで
は9Kb,5.5Kbおよび3.5Kbの主要な３個のバンドが生じた
（第１図）。これらのバンドは二つの型のHTLV−IIIの
完全なゲノムの表わし、両方共にSst IによりLTRで切断
され、一方はそのゲノムの中央に更にSst I部位を持
つ。組換えDNAクローンBH10は9.0Kbのウイルス挿入を含
み、これは完全なHTLV−IIIゲノムに一致する大きさで
ある。組換えDNAクローンBH8およびBH5はそれぞれ5.5Kb
と3.5Kbの挿入を含み、BH5の二三の制限酵素部位多形性
を除き、これらは共にBH10と完全に重なる。したがっ
て、BH10とBH8およびBH5はHTLV−IIIの二つの変株を表
わしている。
実施例１ 元の細胞株にこれら二種の変株が存在することを示すた
めに、ニック翻訳したラムダBH10の挿入をいくつかの制
限酵素で消化したH9/HTLV−IIIゲノムcDNAのサザーン
ブロット（Southern blot）とハイブリダイゼイション
を行った（第３図）。期待された9.0Kb,5.5Kbおよび3.5
Kbの３個のバンドを生成する酵素Sst Iを使って両型を
検出することができた。プロウイルスを切断しないXba
Iはプロウイルスの多クローン組込みを表わす高分子量
ゲノム、および消化されていない最初の標品にも同一バ
ンドが存在することから組込まれていないウイルスDNA
を表わすものと解釈され得る約10Kbのバンドを生成する
（第１図）。これは消化されていない細胞DNAのサザー
ン ブロット（Southern blot）ハイブリダイゼイショ
ンによって確認された。したがって、組込まれていない
ウイルスDNAが存在するということから、最初および全
細胞DNA標品の両方に見られる4Kbおよび4.5Kb EcoR I
フラグメントの存在を説明できる（第１図および第３
図）。Bgl IIおよびHind IIIは両方ともLTRを切断し、
期待される内側のバンドが生じた。内側のバンドに加え
て、Hind III消化物中あるいはいくつかの薄いバンド
は、欠陥プロウイルスかまたはHind III制限パターンで
差異を持つもうひとつの変株を表わす。非感染H9細胞株
および非感染の母株HT、更には正常ヒト胸腺にHTLV−II
I配列が存在しないことは、HTLV−IIIは外来性のもので
あり、またウイルスがいかなるヒト細胞配列をも含んで
いないことを示している。同じ結果がラムダBH5および
ラムダBH8からのニック翻訳挿入を使って得られた。
めに、ニック翻訳したラムダBH10の挿入をいくつかの制
限酵素で消化したH9/HTLV−IIIゲノムcDNAのサザーン
ブロット（Southern blot）とハイブリダイゼイション
を行った（第３図）。期待された9.0Kb,5.5Kbおよび3.5
Kbの３個のバンドを生成する酵素Sst Iを使って両型を
検出することができた。プロウイルスを切断しないXba
Iはプロウイルスの多クローン組込みを表わす高分子量
ゲノム、および消化されていない最初の標品にも同一バ
ンドが存在することから組込まれていないウイルスDNA
を表わすものと解釈され得る約10Kbのバンドを生成する
（第１図）。これは消化されていない細胞DNAのサザー
ン ブロット（Southern blot）ハイブリダイゼイショ
ンによって確認された。したがって、組込まれていない
ウイルスDNAが存在するということから、最初および全
細胞DNA標品の両方に見られる4Kbおよび4.5Kb EcoR I
フラグメントの存在を説明できる（第１図および第３
図）。Bgl IIおよびHind IIIは両方ともLTRを切断し、
期待される内側のバンドが生じた。内側のバンドに加え
て、Hind III消化物中あるいはいくつかの薄いバンド
は、欠陥プロウイルスかまたはHind III制限パターンで
差異を持つもうひとつの変株を表わす。非感染H9細胞株
および非感染の母株HT、更には正常ヒト胸腺にHTLV−II
I配列が存在しないことは、HTLV−IIIは外来性のもので
あり、またウイルスがいかなるヒト細胞配列をも含んで
いないことを示している。同じ結果がラムダBH5および
ラムダBH8からのニック翻訳挿入を使って得られた。
実施例２ クローン化HTLV−IIIゲノムによりHTLV−III,HTLV−Ｉ
およびHTLV−II間の配列の同一性を示し得るかどうかを
評価した。HTLV−I,HTLV−I b,HTLV−IIおよび対照とし
てのGALVの完全なゲノムを表わす制限酵素消化クローン
の複製サザーン ブロット（Southern blot）を全長のH
TLV−IIIプローブと緩和条件下でハイブリダイゼイショ
ンを行った。次にHTLV−IIIとこれらのウイルスとの同
一性の程度を調べるために低、中および高度の厳密さの
条件下で洗浄した（λBH10i）（第４図）。この実験か
らHTLV−III,HTLV−I,HTLV−I bおよびHTLV−IIの間に
は特異的な同一性があるが、HTLV−IIIとGALVについて
はないことがわかった。ここに示されたように、HTLV−
IIIと他のHTLV群のものとのハイブリダイゼイションは
−42℃および−28℃の値で検出され、この条件下ではGA
LVとのハイブリダイゼイションは見られなかった（第４
図、パネルＣおよびＤ）。註について、最大の同一性を
示す制限フラグメントは、HTLV−Ｉのgag/pol部分、お
よびHTLV−IIのpol部分の見かけ上重なり合わない部分
に相当している（ゲノム配置がHTLV−Ｉのものに類似し
ていると推定）。更に解析することにより、gagの５′
側の半分、およびgagとpolの間のギャップがHTLV−Ｉで
最も同一性を持つことがわかった。最後に、HTLV−I b
（HTLV−Ｉの変株）において、元のオートラジオグラム
上で、pX部分（1.4Kb Pstフラグメント）およびHTLV−
Ｉの相当するpXフラグメント（2.1Kb Pst/Sst）とのハ
イブリダイゼイションを認めることができた。
およびHTLV−II間の配列の同一性を示し得るかどうかを
評価した。HTLV−I,HTLV−I b,HTLV−IIおよび対照とし
てのGALVの完全なゲノムを表わす制限酵素消化クローン
の複製サザーン ブロット（Southern blot）を全長のH
TLV−IIIプローブと緩和条件下でハイブリダイゼイショ
ンを行った。次にHTLV−IIIとこれらのウイルスとの同
一性の程度を調べるために低、中および高度の厳密さの
条件下で洗浄した（λBH10i）（第４図）。この実験か
らHTLV−III,HTLV−I,HTLV−I bおよびHTLV−IIの間に
は特異的な同一性があるが、HTLV−IIIとGALVについて
はないことがわかった。ここに示されたように、HTLV−
IIIと他のHTLV群のものとのハイブリダイゼイションは
−42℃および−28℃の値で検出され、この条件下ではGA
LVとのハイブリダイゼイションは見られなかった（第４
図、パネルＣおよびＤ）。註について、最大の同一性を
示す制限フラグメントは、HTLV−Ｉのgag/pol部分、お
よびHTLV−IIのpol部分の見かけ上重なり合わない部分
に相当している（ゲノム配置がHTLV−Ｉのものに類似し
ていると推定）。更に解析することにより、gagの５′
側の半分、およびgagとpolの間のギャップがHTLV−Ｉで
最も同一性を持つことがわかった。最後に、HTLV−I b
（HTLV−Ｉの変株）において、元のオートラジオグラム
上で、pX部分（1.4Kb Pstフラグメント）およびHTLV−
Ｉの相当するpXフラグメント（2.1Kb Pst/Sst）とのハ
イブリダイゼイションを認めることができた。
実施例３ 第２図はλBH10,λBH5およびλBH8と名付けられ、大き
さが第１図に示す三種のSst Iフラグメントに相当する
三種クローンの制限地図を表わす。これら地図の比較か
ら、λBH5とλBH8を加えたものが１個のHTLV−IIIゲノ
ムを構成し、λBH10がもうひとつを構成していることが
示唆される。二種のウイルスの型は内側のSst I部位を
含め21の地図化された酵素部位の内の只３個が異るだけ
である。期待されたように、λBH5およびλBH8のファー
ジ挿入は、サザーン ブロット（Southern blot）ハイ
ブリダイゼイションおよび電子顕微鏡ヘテロデュフ・レ
ックス分析で分析した所、高厳密度条件下でλBH10とハ
イブリダイゼイションを行うが、たがいには行なはな
い。クローン中のLTR配列の存在を示し、またその方向
性を決めるために、cDNAクローン（CI5）をプローブと
して使用し、これはU3およびＲ配列を含んでいた。この
クローンはλBH10およびλBH8の0.5KbBgl IIフラグメン
トと強くハイブリダイゼイションを行い、この方向が
３′であり、また、λBH5およびλBH10の0.7Kb Sst I/P
st Iフラグメントとわずかにハイブリダイゼイションを
行い、この方向が５′であることを示し、Sst IはHTLV
−IIIのLTRをＲ部分で切断することを示した。
さが第１図に示す三種のSst Iフラグメントに相当する
三種クローンの制限地図を表わす。これら地図の比較か
ら、λBH5とλBH8を加えたものが１個のHTLV−IIIゲノ
ムを構成し、λBH10がもうひとつを構成していることが
示唆される。二種のウイルスの型は内側のSst I部位を
含め21の地図化された酵素部位の内の只３個が異るだけ
である。期待されたように、λBH5およびλBH8のファー
ジ挿入は、サザーン ブロット（Southern blot）ハイ
ブリダイゼイションおよび電子顕微鏡ヘテロデュフ・レ
ックス分析で分析した所、高厳密度条件下でλBH10とハ
イブリダイゼイションを行うが、たがいには行なはな
い。クローン中のLTR配列の存在を示し、またその方向
性を決めるために、cDNAクローン（CI5）をプローブと
して使用し、これはU3およびＲ配列を含んでいた。この
クローンはλBH10およびλBH8の0.5KbBgl IIフラグメン
トと強くハイブリダイゼイションを行い、この方向が
３′であり、また、λBH5およびλBH10の0.7Kb Sst I/P
st Iフラグメントとわずかにハイブリダイゼイションを
行い、この方向が５′であることを示し、Sst IはHTLV
−IIIのLTRをＲ部分で切断することを示した。
実施例４ 元の細胞株にHTLV−IIIの二種の変株型が存在すること
を、λBH10の放射標識挿入といくつかの制限酵素によっ
て消化したH9/HTLV−IIIゲノムDNAのサザーン ブロッ
ト（Southern blot）とハイブリダイゼイションを行う
ことによって示した（第３図）。期待される9Kb,5.5Kb
および3.5Kbの長さの３個のバンドを生ずる酵素Sst Iを
使ってこの型を検出した。これらはH9/HTLV−IIIゲノム
ライブラリーからのフランキング細胞配列といっしょ
にクローン化されたので、これら両型も組込まれたプロ
ウイルスとして存在する。更に、プロウイルスを切断し
ないXba Iは、プロウイルスの多クローン性組込みを表
わす高分子量染色帯、および組込まれていないウイルス
DNAを表わす約10Kbのバンドを生成した。
を、λBH10の放射標識挿入といくつかの制限酵素によっ
て消化したH9/HTLV−IIIゲノムDNAのサザーン ブロッ
ト（Southern blot）とハイブリダイゼイションを行う
ことによって示した（第３図）。期待される9Kb,5.5Kb
および3.5Kbの長さの３個のバンドを生ずる酵素Sst Iを
使ってこの型を検出した。これらはH9/HTLV−IIIゲノム
ライブラリーからのフランキング細胞配列といっしょ
にクローン化されたので、これら両型も組込まれたプロ
ウイルスとして存在する。更に、プロウイルスを切断し
ないXba Iは、プロウイルスの多クローン性組込みを表
わす高分子量染色帯、および組込まれていないウイルス
DNAを表わす約10Kbのバンドを生成した。
この10Kbバンドは未消化H9/HTLV−III DNA中にも検出さ
れ、組込まれていないウイルスを再び示した。組込まれ
ていないウイルスDNAが存在することにより、ハート（H
irt）および全細胞DNA標品中に4Kbおよび4.5Kb EcoR I
フラグメントが見られることも説明できる（第１図およ
び第３図）。Bgl IIおよびHind IIIは共にLTRを切断し
て期待された内側のバンドを生ずる。Hind IIIを使った
時に内側のバンドに加えて存在するいくつかの弱いバン
ドは欠陥プロウイルスまたは複製数の少いもうひとつの
変株型を表わす。非感染H9細胞株および非感染母細胞株
HT,更に正常ヒト胸腺のDNAにHTLV−III配列が無いこと
はHTLV−IIIが外来性であることを強く示し、またウイ
ルスがヒト細胞の配列を含んでいないことを示してい
る。プローブ挿入としてλBH5およびλBH8を使って同じ
結果が得られた。
れ、組込まれていないウイルスを再び示した。組込まれ
ていないウイルスDNAが存在することにより、ハート（H
irt）および全細胞DNA標品中に4Kbおよび4.5Kb EcoR I
フラグメントが見られることも説明できる（第１図およ
び第３図）。Bgl IIおよびHind IIIは共にLTRを切断し
て期待された内側のバンドを生ずる。Hind IIIを使った
時に内側のバンドに加えて存在するいくつかの弱いバン
ドは欠陥プロウイルスまたは複製数の少いもうひとつの
変株型を表わす。非感染H9細胞株および非感染母細胞株
HT,更に正常ヒト胸腺のDNAにHTLV−III配列が無いこと
はHTLV−IIIが外来性であることを強く示し、またウイ
ルスがヒト細胞の配列を含んでいないことを示してい
る。プローブ挿入としてλBH5およびλBH8を使って同じ
結果が得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーン，ベアトリス エイチ アメリカ合衆国 20815 マリーランド, シエヴイー チエイズ，ブルツクローン テラス 3123 (72)発明者 ポポヴイツク，ミクラス アメリカ合衆国 20814 マリーランド ベセスダ，プークス ヒル ロード ＃401 ３ (56)参考文献 特開 昭60−67859（ＪＰ，Ａ)
Claims (22)
- 【請求項１】H9/HTLV−III細胞からの組込まれていない
ウイルスDNAを制限酵素SstIで切断することにより得ら
れるHTLV−IIIゲノムの3.5Kbないし9.0KbのDNAフラグメ
ントをベクターλgtWes・λＢに挿入することにより製
造されるHTLV−IIIゲノムの組換えDNAクローン。 - 【請求項２】DNAフラグメントが下記の制限酵素地図： を有する完全HTLV−IIIゲノムの9.0Kb Set I−Bgl II
フラグメントである請求項１記載の組換えDNAクロー
ン。 - 【請求項３】DNAフラグメントがHTLV−IIIゲノムからの
5.5Kb Sst I−Sst Iフラグメントであり、該DNAフラグ
メントが下記の制限酵素地図： を有する請求項１記載の組換えDNAクローン。 - 【請求項４】DNAフラグメントがHTLV−IIIゲノムからの
3.5Kb Sst I−Bgl IIフラグメントであり、該DNAフラ
グメンが下記の制限酵素地図： を有する請求項１記載の組換えDNAクローン。 - 【請求項５】以下の工程： （ａ）HTLV−III感染細胞からの組込まれていないウイ
ルスDNAを制限酵素Sst IでDNAフラグメントに切断し
て、HTLV−IIIゲノムの3.5Kbないし9.0KbのDNAフラグメ
ントを製造し、 （ｂ）該DNAフラグメントを適当なクローニングベクタ
ー中に連結して組換えDNAクローンを製造する、 ことからなるHTLV−IIIゲノムDNAの組換えDNAクローン
の製造方法。 - 【請求項６】DNAフラグメントが下記の制限酵素地図： を有する完全HTLV−IIIゲノムの9.0Kb Sst I−Bgl II
フラグメントである請求項５記載の方法。 - 【請求項７】DNAフラグメントがHTLV−IIIゲノムからの
5.5Kb Sst I−Sst Iフラグメントであり、該DNAフラグ
メントが下記の制限酵素地図： を有する請求項５記載の方法。 - 【請求項８】DNAフラグメントがHTLV−IIIゲノムからの
3.5Kb Sst I−Bgl IIフラグメントであり、該DNAフラ
グメントが下記の制限酵素地図： を有する請求項５記載の方法。 - 【請求項９】H9/HTLV−III細胞から全細胞mRNAを分離す
ること； 上記mRNAから二重鎖cDNAをつくり、この二重鎖cDNAをフ
ァージラムダ中に挿入して組換えDNA分子をつくるこ
と； 上記組換えDNA分子と放射標識されたHTLV−III cDNAプ
ローブとハイブリダイゼーションを行うこと； 上記分子からcDNAを放し、このcDNAを適当なプラスミド
中に挿入すること；および 上記プラスミドをHTLV−III DNA配列を表現可能な適当
な宿主細胞にトランスフェクションすること から本質的になる、HTLV−IIIのcDNA配列を分子クロー
ニングする方法。 - 【請求項１０】上記プラスミドがλBH10である特許請求
の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】上記プラスミドがλBH8である特許請求
の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１２】上記プラスミドがλBH5である特許請求
の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１３】上記cDNA配列が9.0Kb配列に相当する特
許請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１４】上記cDNA配列が5.5Kb配列に相当する特
許請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１５】上記cDNA配列が3.5Kb配列に相当する特
許請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１６】HTLV−IIIゲノムが下記の制限酵素地
図： の制限部位を少なくとも含有する請求項１記載の組換え
DNAクローン。 - 【請求項１７】上記HTLV−IIIゲノムの3.5Kbないし9.0K
bのDNAフラグメントが、放射標識されたHTLV−III cDNA
プローブにハイブリダイゼーションし得る工程（ａ）の
Sst I制限DNAフラグメントから選択される請求項５記載
の方法。 - 【請求項１８】上記HTLV−III感染細胞がH9/HTLV−III
細胞である請求項５記載の方法。 - 【請求項１９】上記クローニングベクターがλgtWes・
λＢである請求項５記載の方法。 - 【請求項２０】DNAフラグメントがHTLV−III a変異株か
ら誘導される請求項２記載の組換えDNAクローン。 - 【請求項２１】上記DNAフラグメントがHTLV−III b変異
株から誘導される請求項２記載の組換えDNAクローン。 - 【請求項２２】以下の工程： （ａ）HTLV−III感染細胞からの組込まれていないウイ
ルスDNAを制限酵素でDNAフラグメントに切断し、 （ｂ）上記DNAフラグメントを、HTLV−IIIゲノムの3.5K
bないし9.0KbのDNA Sst I−制限フラグメントを含む放
射標識HTLV−III cDNAプローブにハイブリダイゼーショ
ンを行い、そして （ｃ）上記プローブにハイブリダイゼーションを行い得
る工程（ｂ）からのDNAフラグメントを適当なクローニ
ングベクター中に連結して組換えDNAクローンを製造す
る、 からなるHTLV−IIIの組換えDNAクローンの製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64330684A | 1984-08-22 | 1984-08-22 | |
| US643306 | 1984-08-22 | ||
| PCT/US1985/001601 WO1986001535A1 (en) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | Molecular clones of the genome of htlv-iii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61501431A JPS61501431A (ja) | 1986-07-17 |
| JPH0789931B2 true JPH0789931B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=24580229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60503937A Expired - Lifetime JPH0789931B2 (ja) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼のゲノムの分子クロ−ン |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173529B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0789931B2 (ja) |
| AT (1) | ATE54009T1 (ja) |
| AU (1) | AU580094B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341366C (ja) |
| DE (1) | DE3578340D1 (ja) |
| IE (1) | IE59401B1 (ja) |
| IL (1) | IL76082A (ja) |
| NZ (1) | NZ213155A (ja) |
| WO (1) | WO1986001535A1 (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8423659D0 (en) | 1984-09-19 | 1984-10-24 | Pasteur Institut | Cloned dna sequences |
| US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
| KR930000189B1 (ko) | 1984-10-18 | 1993-01-11 | 앵스뛰띠 빠스뙤르 | 임파선증과 후천성 면역 결핍증 바이러스의 항원을 제조하는 방법 및 이 항원에 대한 항체의 생산 방법 |
| CA1341482C (en) * | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
| US7393949B1 (en) | 1987-12-24 | 2008-07-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences |
| US7285271B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-10-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Antigenic composition comprising an HIV gag or env polypeptide |
| US7273695B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-09-25 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HIV immunoassays using synthetic envelope polypeptides |
| ATE138100T1 (de) * | 1984-12-24 | 1996-06-15 | Genentech Inc | Fusionen von aids-verwandten polypeptiden |
| US5853978A (en) * | 1985-12-04 | 1998-12-29 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and methods of use |
| US6534285B1 (en) | 1984-12-24 | 2003-03-18 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
| US4774175A (en) * | 1985-03-01 | 1988-09-27 | Centocor, Inc. | Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III |
| US5008182A (en) * | 1986-01-10 | 1991-04-16 | Cetus Corporation | Detection of AIDS associated virus by polymerase chain reaction |
| US5176995A (en) * | 1985-03-28 | 1993-01-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of viruses by amplification and hybridization |
| IE64785B1 (en) * | 1985-04-08 | 1995-09-06 | Genetic Systems Corp | Expression of immunologically reactive viral proteins |
| US5773210A (en) * | 1985-04-19 | 1998-06-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) viral envelope protein and method of testing for AIDS |
| DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
| FR2593519B1 (fr) * | 1985-09-25 | 1994-01-07 | Oncogen | Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires pour la preparation de ce vaccin |
| NZ217645A (en) * | 1985-09-25 | 1991-11-26 | Oncogen | Recombinant viruses expressing lav/htlv-iii related epitopes and vaccine formulations |
| WO1987003908A1 (en) * | 1985-12-24 | 1987-07-02 | United States Of America, Represented By The Unite | Plasmid and phage clones of human t-cell lymphotropic virus type iii |
| JPS63500353A (ja) * | 1986-01-31 | 1988-02-12 | アメリカ合衆国 | ヒトｔリンパ球指向性ウイルス３からのｓｏｒ遺伝子生産物 |
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