JPH0797400A

JPH0797400A - カルシトニン誘導体

Info

Publication number: JPH0797400A
Application number: JP5274737A
Authority: JP
Inventors: Shozo Muranishi; 昌三村西; Akira Yamamoto; 昌山本; Takuya Fujita; 卓也藤田
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1993-09-28
Filing date: 1993-09-28
Publication date: 1995-04-11

Abstract

(57)【要約】【目的】消化管において安定であり、経腸吸収性に
優れたカルシトニン誘導体を提供しようとするものであ
る。【構成】式（Ｉ）：【化１】（式中、Ｒ^１は脂肪酸残基又は低級アルコキシカルボニ
ル基を示す）で表されるカルシトニン誘導体。【効果】本発明のカルシトニン誘導体は、ヒトカル
シトニンの有する欠点を解消した、消化管において安定
であり、経腸吸収性に優れ、且つヒトカルシトニンと同
様に血漿中カルシウム濃度の低下作用等の優れた薬理作
用を有しているため、高カルシウム血症や骨粗鬆症にお
ける疼痛の緩和、骨量減少の改善等に用いることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なカルシトニン誘
導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】カルシウム代謝の恒常性に関与している
カルシトニンは、１９６１年にＣｏｐｐらにより発見さ
れた。ヒトでは主に甲状腺のＣ細胞から、鳥類以下では
鰓後体から分泌されるペプチドホルモンで３２個のアミ
ノ酸からなり、そのＮ末端近くにＳ−Ｓ結合がある特異
的な構造を示すペプチドホルモンである。当該カルシト
ニンは、その特有の生理作用より種々の疾病の治療薬と
しての利用可能性を有しているが、ペプチド化合物本来
の不安定性、即ち消化管内において種々の酵素により分
解されるおそれや、消化管からの吸収が困難である等、
医薬品としては致命的な欠点を有している。尚、ペプチ
ド化合物の消化管内における不安定性や消化管からの吸
収性を改善するための方策としては、ペプチドのＮ末端
のアミノ基を脂肪酸残基又は低級アルコキシカルボニル
基で修飾する方法が知られている（特開平３−２９４２
９１号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記ヒトカ
ルシトニンの有する欠点を解消した、消化管において安
定であり、経腸吸収性に優れ、且つヒトカルシトニンと
同様に血漿中カルシウム濃度の低下作用等の優れた薬理
作用を有し、高カルシウム血症や骨粗鬆症における疼痛
の緩和、骨量減少の改善等に用いることができるカルシ
トニン誘導体を提供しようとするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトカルシトニンの生
理活性発現には、Ｃ末端のプロリンのアミド基と、Ｎ末
端付近のＳ−Ｓ結合を含む部分の立体構造が重要であ
り、これらの部分の構造を保持して活性を維持しつつ、
ヒトカルシトニンにおけるリジンの遊離アミノ基を脂肪
酸残基又は低級アルコキシカルボニル基で修飾すること
により、ヒトカルシトニンの有する前記の欠点を解決
し、本発明を完成した。

【０００５】即ち、本発明は、式（Ｉ）：

【０００６】

【化２】

【０００７】（式中，Ｒ^１は脂肪酸残基又は低級アルコ
キシカルボニル基を示す）で表されるカルシトニン誘導
体に関する。

【０００８】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
活性基、その他に関して略号で表示する場合は、ＩＵＰ
ＡＣ、ＩＵＢの規定もしくは当該分野における慣用記号
に従うものとする。また、アミノ酸などに関して光学異
性体があり得る場合は、特に明記しない限りＬ体を示
す。

【０００９】本明細書において、前記式（Ｉ）中、Ｒ^１
で示される脂肪酸残基は、炭素数２〜２０の直鎖又は分
枝鎖状の飽和もしくは不飽和（二重結合を有する）の脂
肪酸残基であり、例えばアセチル基、プロピオニル基、
ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリ
ル基、ヘキサノイル基、ピバロイル基、ラウロイル基、
ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、ア
ラキドノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、
オレイル基、リノレオイル基、リノレイノル基等が例示
され、好ましくは炭素数５〜２０の脂肪酸残基、さらに
好ましくは炭素数５〜８の脂肪酸残基である。

【００１０】また同式（Ｉ）中、Ｒ^１で示される低級ア
ルコキシカルボニル基は、炭素数１〜６の直鎖又は分枝
鎖状のアルコキシ基を有するアルコキシカルボニル基で
あり、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニ
ル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル
基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシ
カルボニル基等が例示される。

【００１１】本発明化合物は種々の方法により製造する
ことができるが、例えば、次の反応工程式に示すよう
に、ヒトカルシトニン（ＩＩ）にＲ^１ _２ＯまたはＲ^１
−Ｙで示されるアシル化剤（ＩＩＩ）を作用させること
により合成することができる。

【００１２】

【化３】

【００１３】反応工程式中、Ｒ^１は前記した意味を有
し、アシル化剤としてのＲ^１ _２Ｏはその酸無水物を、ま
たＲ^１−Ｙは対応するカルボン酸のハライド又はアジド
を示すか、該カルボン酸の活性エステル、例えばペンタ
クロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロ
キシスクシニイミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾー
ル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３−ジカ
ルボキシイミド等とのエステルを示す。

【００１４】上記反応工程式に示す反応は、一般に適当
な不活性溶媒中で実施することができる。ここで用いら
れる不活性溶媒としては、この種のペプチド結合形成反
応に慣用されている各種のもの、例えばジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメ
チルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）等及びこれらの混合
溶媒を例示できる。

【００１５】前記反応における各原料化合物の使用割合
は特に限定されないが、通常、化合物（ＩＩ）に対して
アシル化剤（ＩＩＩ）を少なくとも等モル程度、好まし
くは等モル〜５倍モル量用いる。反応温度はペプチド結
合形成反応に通常使用されている範囲でよく、一般には
−４０℃〜８０℃、好ましくは−２０℃〜４０℃の範囲
で、反応時間は３０分〜２４時間の範囲である。尚、酸
ハライドを用いる場合、上記反応は脱酸剤の存在下に実
施するのがよく、この脱酸剤としては通常用いられる各
種の塩基性化合物、例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸
塩、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ピリジ
ン、キノリン等の第三級アミン類等を使用できる。

【００１６】かくして、前記反応工程式に示す方法によ
り本発明の式（Ｉ）で表されるカルシトニン誘導体が製
造できる。該誘導体は、上記反応終了後に反応系より通
常のペプチドの分離手段、例えば抽出法、分配法、カラ
ムクロマトグラフィー操作等により分離、精製できる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに説明す
る。

【００１８】実施例１アセチル化カルシトニンの合成ヒトカルシトニン２０ｍｇ（約０．００５６ミリモル）
をＤＭＦに溶解し、その後、氷冷下で無水酢酸１．１３
ｍｇ（約０．０１１ミリモル）を加え、１０分間攪拌し
た。攪拌後、ＤＭＦを留去して濃縮し、エーテルで再結
晶することにより目的化合物１１ｍｇ（収率５５％）を
得た。

【００１９】上記で得られた化合物につき、以下の条件
でＨＰＬＣを行った結果、目的化合物はリテンションタ
イム３３．１８分に溶出された。ＨＰＬＣ条件カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８−ＡＲ−３００
（ナカライテスク社製）４．６ｍｍ×１５０ｍｍ移動相Ａ：アセトニトリル：水：１０％ＴＦＡ＝１
０：９０：１移動相Ｂ：アセトニトリル：水：１０％ＴＦＡ＝８
０：２０：１流速：１．０ｍｌ／分

【００２０】実施例２カプロイル化カルシトニンの合
成ヒトカルシトニン２０ｍｇ（約０．００５６ミリモル）
をＤＭＦに溶解し、その後、氷冷下で無水カプロン酸
２．４０ｍｇ（約０．０１１ミリモル）を加え、１０分
間攪拌した。攪拌後、ＤＭＦを留去して濃縮し、エーテ
ルで再結晶することにより目的化合物２２．６１ｍｇ
（収率１１３％）を得た。尚、上記で得られた化合物に
つき、実施例１と同一条件でＨＰＬＣを行った結果、目
的化合物はリテンションタイム３７．２７分に溶出され
た。

【００２１】実施例３生物活性試験（血漿中カルシウ
ム濃度低下作用試験）体重２００ｇ前後のウィスター系雄性ラットを１８〜２
４時間絶食させ、ペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇの
腹腔内投与により麻酔する。大腿部を切開し、股静脈か
ら供試薬物液を１００μｇ／ｋｇ投与する。その後、頸
静脈より経時的に血液を採取し、血漿中のカルシウム濃
度を測定する。血漿中カルシウムの測定には、市販のカ
ルシウム測定キット（和光純薬株式会社製）を用いた。
なお、供試薬液としては、供試薬物１００μｇをポリオ
キシエチレン硬化ヒマシ油（ＨＣＯ６０、日光ケミカル
社製）０．５ｗ／ｖ％含有のＰＢＳ（−）溶液１ｍｌに
溶解したものを用いた。上記試験結果を図１に示す。

【００２２】該図は横軸に時間（分）、縦軸に供試薬液
投与前の血漿中カルシウム濃度に対する各測定点での血
漿中カルシウム濃度の割合（初期血漿中カルシウム濃度
に対する％）をとり、前記各実施例で得られた本発明カ
ルシトニン誘導体をそれぞれ供試薬物とした結果をグラ
フに示したものである。図中（１）は本発明のアセチル
化カルシトニンを、（２）は本発明のカプロイル化カル
シトニンを、また（３）はコントロール（薬物無添加）
をそれぞれ示す。尚、各供試薬物における結果は、各群
５〜８匹の供試動物の平均値±標準誤差として示した。
上記図１より、本発明のカルシトニン誘導体は、いずれ
もコントロールに比較して顕著に血漿中カルシウム濃度
を減少することが認められ、このことからこれら各誘導
体は、優れた血漿中カルシウム濃度低下作用を示すこと
が明らかになった。

【００２３】実施例４小腸吸収性試験本発明のカルシトニン誘導体及び対照としてのヒトカル
シトニンにつき、各薬物の小腸における吸収性を、血漿
中カルシウム濃度低下作用を指標として以下のとおり試
験した。

【００２４】（１）薬液の調製ラット体重１ｋｇ当たり供試薬物５００μｇを、ジメチ
ルアセトアミド１０μｌに溶解する。別途に、ポリオキ
シエチレン硬化ヒマシ油（ＨＣＯ６０、日光ケミカル社
製）１５０ｍｇ（０．５ｗ／ｖ％）を秤量し、ＰＢＳ
（−）３０ｍｌ中に溶解し、この溶液中に上記で調製し
た薬液を加え供試薬液とする。

【００２５】（２）小腸投与による血漿中カルシウム濃
度低下作用の測定ｉｎｓｉｔｕｌｏｏｐ法（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃ
ｉ．，５９，１５４（１９７０））により、上記で調製
した各供試薬液のそれぞれを、供試薬物濃度が２０μｇ
／ｍｌとなる濃度でウィスター系雄性ラット（体重２０
０ｇ前後）に小腸投与した（薬液量５ｍｌ）。尚、供試
動物は上記投与前に、ふん食を防止し、１８〜２４時間
絶食させ、前記実施例３の血漿中カルシウム濃度低下作
用試験と同様に麻酔し、腹部切開、カニュレーション挿
入を行ない、十二指腸からでたカニューレの下を結紮
し、また盲腸の上２〜３ｃｍ当たりを結紮（但し、胆管
もともに結紮する）する手術を施しておいた。

【００２６】前記実施例３における血漿中カルシウム濃
度低下作用試験と同様に薬液投与後経時的に血液を採取
し、血漿中カルシウム濃度を測定した。得られた結果を
図１と同様にして、図２に示す。

【００２７】図中、（１）は本発明のアセチル化カルシ
トニンを、（２）は本発明のカプロイル化カルシトニン
を、（３）は対照としてのヒトカルシトニンを、（４）
はコントロール（薬物無添加）をそれぞれ示す。結果
は、各供試薬物投与群供試動物３〜６匹における平均値
±標準誤差として示した。本発明のカルシトニン誘導体
は、ヒトカルシトニンに対して有意に血漿中カルシウム
濃度を低下させた（アセチル化カルシトニンではＰ＜
０．００１、カプロイル化カルシトニンではＰ＜０．０
１）。また、前記図２で示した試験における試験開始よ
り６時間までの血漿中カルシウム濃度の低下の割合を求
めた結果を第１表に示す。結果は平均値±標準誤差とし
て示した。

【００２８】

【表１】

【００２９】これにより、本発明のカルシトニン誘導体
は、ヒトカルシトニンと比較して有意に小腸投与後の血
漿中カルシウム濃度を低下させることが明らかになっ
た。

【００３０】実施例５腸管粘膜ホモジネート中での安
定性試験（１）腸管粘膜ホモジネートの調製体重２５０〜３００ｇのウィスター系雄性ラットを１８
〜２４時間絶食させ、ペントバルビタール５０ｍｇ／ｋ
ｇの腹腔内投与により麻酔する。正中線に沿って腹部を
切開し、十二指腸部から回腸部までを小腸部分として、
結腸部から直腸部までを大腸部分として摘出する。各腸
管部分を切開後、ガラスプレート上にのせカバーグラス
で腸管粘膜をかきとり試験管に集める。ＰＢＳ（−）を
１〜２ｍｌ加え、ホモジナイザー（ＰＯＬＹＴＲＯＮ）
でホモジネートする。得られたホモジネートを冷却遠心
器（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＨＩＭＡＣｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ｅ、ＳＣＲ２０ＢＢ：ローターＨＩＴＡＣＨＩ、ＲＰＲ
２０−２−２６６７）で５０００ｒｐｍ、１０分間遠心
し、上清を回収する。上清中の蛋白濃度を測定し、蛋白
濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（−）で希釈
し、実験に用いるまで−８０℃で凍結保存しておく。

【００３１】（２）腸管粘膜ホモジネートを用いた供試
薬物の安定性試験各供試薬物の腸管粘膜ホモジネート中での安定性試験は
以下の方法により行った。まず、１００μｌのホモジネ
ートと１００μｌのＰＢＳ（−）溶液を３７℃で３０分
間インキュベートする。この溶液中に０．０５７ｍＭの
各供試薬物３００μｌを加え、経時的に５０μｌずつ採
取する。採取した溶液は、即座に１００μｌのアセトニ
トリルを添加することにより酵素分解を停止させ、５０
μｌの３００μＭチモロールを内部標準物質として添加
後、ＨＰＬＣを用いて実施例１に示したＨＰＬＣ条件に
より定量した。これにより求められた各供試薬物の分解
の半減期の結果を第２表に示す。なお、各供試薬物にお
ける結果は各３例の平均値±標準誤差として示した。こ
れにより本発明のカルシトニン誘導体は消化管粘膜にお
いてヒトカルシトニンに比較して安定であることが明ら
かになった。

【００３２】

【表２】

【００３３】

【発明の効果】本発明のカルシトニン誘導体は、前記ヒ
トカルシトニンの有する欠点を解消した、消化管におい
て安定であり、経腸吸収性に優れ、且つヒトカルシトニ
ンと同様に血漿中カルシウム濃度の低下作用等の優れた
薬理作用を有しているため、高カルシウム血症や骨粗鬆
症における疼痛の緩和、骨量減少の改善等に用いること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各供試薬物の静脈投与による血漿中カ
ルシウム濃度低下作用試験の結果を示す。なお、（１）
は本発明のアセチル化カルシトニンを、（２）は本発明
のカプロイル化カルシトニンを、（３）はコントロール
（薬物無添加）を示す。

【図２】図２は、各供試薬物の小腸投与による小腸吸収
性試験の結果を示す。なお、（１）は本発明のアセチル
化カルシトニンを、（２）は本発明のカプロイル化カル
シトニンを、（３）は対照としてのヒトカルシトニン
を、（４）はコントロール（薬物無添加）を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）：【化１】（式中，Ｒ^１は脂肪酸残基又は低級アルコキシカルボニ
ル基を示す）で表されるカルシトニン誘導体。