JPH0799353B2 - 塩基配列決定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サンガーの方法によって核酸の塩基配列を決
定する過程で、特に予めプライマーを蛍光物質や燐光物
質などの標識色素でラベルしておき、最終段階のゲル電
気泳動からの配列の読取りをその標識色素からの発光を
利用して分光学的方法により行なう装置に関するもので
ある。

（従来の技術） ゲル電気泳動によって展開した核酸断片のバンドの蛍光
式読取り方式としてはオンライン方式とオフライン方式
の２通りが考えられる。

オンライ方式では核酸断片を泳動ゲル中に電気泳動させ
ながら、泳動レーン上のある一点の蛍光の時間変化を読
取り、オフライン方式では別途泳動させた泳動ゲルを泳
動終了後に読取り専用装置に装着して泳動パターンを読
み取る。

サンガー法（「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」誌、第74巻、
第5463ページ（1977年）参照）では試料は末端塩基がそ
れぞれＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（テミン）
又はＣ（シトシン）のいずれかである４種類の核酸断片
試料で１組の試料となる。４種類の末端塩基のいずれか
をもつ１種類の試料を１つのレーンで泳動させたり、多
検体を同時に泳動させようとすると、オフライン方式で
はスラブ状泳動ゲルの二次元方式での栄光測定が必要と
なり、オンライン方式でも泳動ゲルと試料配列方向での
一次元の高速蛍光測定が必要となる。

これまでに発表されているスラブ状泳動ゲルの蛍光測定
装置は何れもオンライン方式である。

最も簡単に蛍光測定を実現する方法は、第９図に示され
る装置を用いるものである（「High Technology」誌、1
986年12月号、第49ページの装置もこの範ちゅうに属す
る）。

第９図において、２はポリアクリルアミドにてなる泳動
ゲルであり、その両端が電極槽4,6に浸されている。電
極槽4,6には電解液が収容されている。電極槽4,6の間に
は泳動電源８によって泳動電圧が印加される。泳動ゲル
２の一端には試料を注入するためのスロット10が設けら
れており、このスロット10に末端塩基別の試料が注入さ
れ、泳動電源８からの泳動電圧によって試料が泳動ゲル
２中を矢印12方向に電気泳動し展開されていく。

14は励起光光源としてのレーザであり、励起光はハーフ
ミラー又はダイクロイックミラー16で反射され、対物レ
ンズ18を経て泳動ゲル２に照射される。泳動ゲル２中を
泳動してきた試料の蛍光ラベルからの蛍光は再び対物レ
ンズ18で集光され、ハーフミラー又はダイクロイックミ
ラー16を透過して蛍光選択用干渉フィルタ20を通り、光
電素子としての光電子増倍管22に受光され検出される。

第９図の装置では、１つの対物レンズ18を励起光照射用
及び蛍光受光用に共用し、対物レンズ18及びそれと関連
する光学系全体を試料の配列方向23（泳動方向12と直交
する方向、図では横方向）に機械的に走査する。

スラブ状泳動ゲル２の蛍光測定装置の他の装置は第10図
に示されるものである（日本生物物理学会予稿集、3E11
30（1986年10月）参照）。

励起光光源としてのレーザ14からの励起光を集光レンズ
24によって泳動ゲル２の端面から泳動ゲル２に平行な方
向に入射させる。蛍光は泳動ゲル２の面の法線方向に蛍
光受光レンズ26によって一次元的又は二次元的に一度に
受光し、蛍光選択用干渉フィルタ20を経てイメージイン
テンシファイヤ28で増幅し、一次元又は二次元の光検出
器30で受光し検出する。

（発明が解決しようとする問題点） 第９図に示される塩基配列決定装置では、蛍光を励起光
の反射方向で測定するため、励起光のレーリー散乱が強
い背景光となり、そのためにS/N比が悪くなる。レーリ
ー散乱は前方及び後方で強く、90度方向では弱い。

また、第９図の装置では対物レンズ18を初め、励起光学
系及び受光光学系の全体又は一部を機械的に走査しなけ
ればならない。オンライン測定では泳動の速度に比べて
十分短かい時間のうちに全てのレーンを走査しなければ
ならないが、一般にこのような精密光学系は重く、慣性
が大きいため、そのような高速走査は全くできないか又
はできても非常に高価なものになる。

第10図の装置では通常利用可能な蛍光受光レンズ26の直
径に比べて泳動ゲル２が極めて大きいため、蛍光光の受
光立体角が極めて小さくなり、蛍光受光信号は微弱で、
これを補うために検出部は一次元又は二次元で、かつ、
増幅度を大きくしなければならない。例えばそのために
イメージインテンシファイア28などを使用しなければな
らなくなるが、このような素子は非常に高価である。

また、泳動ゲル２が薄いとレーザビームが絞り切れずに
泳動ゲル２からはみ出すことがあり、また泳動ゲルが正
確に真直ぐでなく、励起光を入射させるところで曲ると
測定できなくなるなどの問題がある。

本発明は標識色素からの発光を励起光の散乱の影響が少
ない90度方向で受光し、また受光装置としてアレイ型セ
ンサを用いなくてもすむような塩基配列決定装置を提供
することを目的とするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明では、蛍光物質などの標識色素によりラベルされ
た核酸断片を電気泳動により展開させた又は展開中のス
ラブ状泳動ゲルの面の法線方向から励起光ビームを入射
させ、泳動ゲル中に展開した核酸断片の標識色素の出す
発光を泳動ゲルの端面で受光する。

（実施例） 第１図は本発明をオフライン方式の塩基配列決定装置に
適用した実施例を表わし、第２図は第１図のＣ−Ｃ線位
置での断面図である。

２はポリアクリルアミド泳動ゲルであり、サンガー法に
よってDNA断片のプライマーを予めFITC（488nmで励起す
ると520nm付近の蛍光を出す物質）でラベルしておき、
これを電気泳動ゲル２の一端に末端塩基A,G,T,C別に注
入し、別の電気泳動装置で電気泳動させたものである。
32はこのように電気泳動により展開された核酸断片であ
る。

励起光を発生する励起光源としてのアルゴンレーザ14か
らのレーザ光である励起光15を集光レンズ24で就航す
る。アルゴンレーザは488nmの光を発振する。34は励起
光15を泳動ゲル２の表面上で泳動方向12方向へ走査する
ためのガルバノミラーである。36はガルバノミラー34で
反射された励起光15を泳動ゲル２の表面上で泳動方向12
と直交する方向のゾーン方向23に高速走査させるための
ガルバノミラーである。ガルバノミラー34,36の回転角
は泳動ゲル２上の励起光照射位置を示す情報としてマイ
クロコンピュータ42に取り込まれ、ガルバノミラー34,3
6の回転はマイクロコンピュータ42からの信号により駆
動機構（図示略）を経て駆動される。

泳動ゲル２の側方には光ファイバ束44が設けられてい
る。光ファイバ束44の一端はその端面の配列が泳動ゲル
２の一端面に対応した形状で、薄い長方形の面を形成す
るように配列されており、この端面は泳動ゲル２の一端
面と対向して配置されている。光ファイバ束44の他の端
面は小さい束に束ねられ、その他端面から出た光が蛍光
選択用干渉フィルタ20を経て光電子増倍管22に導かれる
ようになっている。光電子増倍管22の検出信号はA/D変
換器41でデジタル信号に変換された後にマイクロコンピ
ュータ42へ取り込まれる。

マイクロコンピュータ42ではガルバノミラー34,36から
泳動ゲル２上の照射位置を示す信号を取り込み、その照
射位置での蛍光光を光電子増倍管22の検出信号として取
り込む。このようにガルバノミラー39と36によって泳動
ゲル２の全表面上を走査することによって、泳動ゲル２
に電気泳動により展開したDNA断片試料の展開パターン
を光電子増倍管22の蛍光検出信号として得ることができ
る。

泳動ゲル２中に展開したDNA断片試料に励起光15が照射
されると、第２図に示されるように蛍光３が発生する。

本発明者らは実験・研究の結果、このときもし泳動ゲル
の励起ビームが当ったところに蛍光物質でラベルされた
核酸断片があれば、これから発した蛍光光は泳動ゲルの
中を全反射により伝搬し、泳動ゲル端面に現われること
を知った。この蛍光光が全反射によるものであること
は、泳動ゲル端面を見る目の角度が大きく変ってもやは
り蛍光光が見えることと、泳動ゲルを曲げてもなお蛍光
が観測されることから明らかである。泳動ゲルの端面か
ら受光される光が全反射によって伝達されたものである
ことから、端面に到達可能な光の厚さ方向の立体角（第
２図でαとして示されるもの）は泳動ゲル及びその周辺
光学材料の全反射臨界角で決まり、極めて大きくなる。
更に、蛍光光を受光する方向は励起光に対しては90度の
方向にあたり、レーリー散乱光の伝搬は極小に抑えられ
る。実験によると、励起光が泳動ゲルの面内方向にも散
乱し、伝搬し、その散乱した光が励起光を照射していな
い場所の蛍光物質をも励起してしまう現象は全くなかっ
た。

このときの泳動ゲル２中での光の散乱による蛍光３の減
衰は、伝搬距離が20cmでも僅かに30％程度である。これ
はサンガー法で常用されている８％ポリアクリルアミド
ゲルを用いた場合の測定値である。

端面に表われた蛍光光は光ファイバ束44によって受光さ
れ、光ファイバ束44を伝搬し、蛍光選択用干渉フィルタ
20を通り、光電子増倍管22で電気信号に変えられる。光
ファイバ束44の例としては例えばESKA（三菱レーヨン株
式会社の商品）を用いることができる。

よく知られているように、DNA断片はこの場合すでに電
気泳動によって長さの短かい順に展開されているから、
その泳動パターンを各ゾーンごと（末端塩基別）に読み
取ればシーケンス決定を行なうことができる。ガルバノ
ミラー34,36の回転角度から励起光15の当っている場所
がマイクロコンピュータ42によって計算され、そのとき
の蛍光の強さがわかるので、泳動パターンがわかり、目
的を達成することができる。

第３図は本発明をオンライン式の塩基配列決定装置に適
用した実施例を表わすものである。

泳動ゲル２の両端が電極槽4,6に浸され、泳動用電源８
から泳動電圧が印加されている。ポリアクリルアミド泳
動ゲル２の一端の試料注入用スロット10に、すでに説明
したサンガーの方法によって準備され、さらにプライマ
ーをFITCでラベルしたDNA断片が末端塩基A,G,T,C別に注
入され、泳動電圧によってバンド32になって泳動する。
励起光15はアルゴンレーザ14から発振された488nmのレ
ーザ光である。46は励起光15を一直線上で走査する正多
面型ミラーである。48は励起光15を集光し一直線上に収
束させるｆθレンズ系である。正他面型メラー46とｆθ
レンズ系48によって励起光15のスポットは泳動ゲル２の
泳動方向12と直交する方向の一直線49上を高速に走査す
る。正多角形ミラー46とｆθレンズ系48による平面走査
についてはよく知られている（例えば、「光技術応用シ
ステム」（精機学会編、昭晃堂、昭和58年）第107〜110
ページを参照）。

また、ｆθレンズ系48と泳動ゲル２の間の光路にはハー
フミラー50が設けられており、励起光15の一部はハーフ
ミラー50によって反射され、励起光15の位置がビーム位
置検出センサ52によって検出される。ビーム位置検出セ
ンサ52としては、例えばＳ−1352（浜松ホトニクス社の
商品）などを用いることができる。

泳動ゲル２の一端面には第１図で用いられているのと同
じ光ファイバ束44の長方形の端面が対向して設けられて
おり、光ファイバ束44の他端は蛍光選択用干渉フィルタ
20を介して光電子増倍管22に対向している。

光電子増倍管22の検出信号はA/D変換器41を介してデジ
タル信号に変換され、マイクロコンピュータ42に取り込
まれる。マイクロコンピュータ42にはまた、ビーム位置
検出センサ52から励起光15の照射位置を示すデータが取
り込まれる。

次に、第３図の実施例の動作について説明する。

もし、ある瞬間に励起光15の照射位置にDNA断片のバン
ドがあれば、このバンドから蛍光が放出され、すでに説
明したように泳動ゲル２内を伝搬して光ファイバ束44に
入射し、光ファイバ束44を伝搬して干渉フィルタ20を経
て光電子増倍管22に入射する。マイクロコンピュータ42
ではビーム位置検出センサ52からの励起光の照射位置と
光電子増倍管22からの蛍光の有無を示す信号によってDN
Aのバンドの状態がわかる。すでに説明したように、泳
動はDNA断片の分子長さの短かい順に出てくるので、こ
れによってよく知られた方法で塩基配列を決定すること
ができる。

第４図は更に他の実施例において、励起光の照射場所か
ら蛍光光に強度補正を行なう場合を示している。

泳動ゲル２の端面に達する蛍光光３は励起光15が当って
いる場所から端面を見たときの立体角Θに依存すると考
えられるが、実際には端面の条件などで変ってくる。そ
こで、実測により励起光15の場所（X,Y）によって蛍光
光３の強度を補正する。54は強度補正の計算を行なう部
分であり、光電子増倍管22からの信号強度と照射位置
（X,Y」の値を入力することによって実験的に補正す
る。データ処理部56ではこの補正された蛍光光を基にし
てDNA塩基配列のシーケンスを決定する。

第５図は他の実施例を示す概略平面図、第６図は第５図
のＡ−Ａ線位置での断面図である。

第５図の実施例では、ゲル２に対して紙面垂直方向の表
面側から裏面側に向って励起光15を照射するものとす
る。

泳動ゲル２の一端面には光ファイバ束44が設けられてお
り、反対側の端面にはミラー58が設けられて、光ファイ
バ束44と反対方向に伝搬された蛍光光をミラー58によっ
て反射させて光ファイバ束44方向へ伝搬させている。

また、励起光15が照射される側と反対側に泳動ゲル２の
表面に対向して、励起光15を反射させるミラー60を設け
ている。

ミラー58によって蛍光光の利用効率が上がり、ミラー60
によって励起光15も強められるので感度が上がる。

第７図及び第８図は本発明をオンライン方式に適用した
さらに他の実施例を表わすものである。第８図は第７図
のＢ−Ｂ線位置での断面図である。

この実施例では蛍光受光用の光ファイバ束44が設けられ
ている泳動ゲル２の端面及び励起光15が入射し走査する
狭い領域以外をミラー62で被っている。

このようにミラー62で被うことによって、蛍光光及び励
起光15の利用効率はさらに上がり、感度がさらに上昇す
る。

以上の実施例では泳動ゲル２の端面から蛍光光を受光す
る装置として光ファイバ束44を用いているが、受光装置
は単に泳動ゲル２の端面で蛍光光を受光して光電素子の
光電面に導くためのものであるので、そのような機能を
果すものであれば例えば光学的成形品であってもよい。

実施例では標識色素として蛍光物質を用いているが、蛍
光物質に代えて燐光物質を用いることもできる（特願昭
62−862230号参照）。

（発明の効果） 本発明の塩基配列決定装置では、スラブ状泳動ゲルの厚
さ方向から励起光を照射し、その泳動ゲル中に展開した
核酸断片のラベルの標識色素の出す発光を泳動ゲルの端
面で受光するようにしたので、蛍光の測定に大きな妨害
となる励起光のレーリー散乱の最も小さい90度方向での
蛍光の受光ができる。

励起光が当っている場所で測定位置を特定するので、受
光側では場所を区別して受光する必要はなく、結像のた
めのレンズが不要で立体角を大きく取ることができ、S/
N比が上がる他、高価な高感度の一次元アレイ型センサ
又は二次元アレイ型センサも不要になり、光電子増倍管
などの光電素子が１個ですむため、受光部だけのコスト
に関しては1/100程度となる。

第10図に示される装置と比較すると、本発明では泳動ゲ
ル中に蛍光光を通しているために、泳動ゲルが薄くても
全く問題はない。

また、励起光に比べて蛍光光は僅かに波長が長く、その
ために泳動ゲルによる蛍光光のレーリー散乱が励起光に
比べて少ない。

さらに、蛍光光を全反射によって伝搬させて受光してい
るので、第10図に示される装置と比べると泳動ゲルの歪
や撓みが全く問題にならない。

このように、本発明による塩基配列決定装置では高感度
で正確な塩基配列の決定を行なうことができるようにな
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は一実施例を示す概略斜視図、第２図は第１図の
Ｃ−Ｃ線位置での概略断面図、第３図は他の実施例を示
す概略斜視図、第４図はさらに他の実施例を示す概略平
面図、第５図はさらに他の実施例を示す概略平面図、第
６図は第５図のＡ−Ａ線位置での断面図、第７図はさら
に他の実施例を示す概略平面図、第８図は第７図のＢ−
Ｂ線位置での断面図、第９図及び第10図はそれぞれ従来
の塩基配列決定装置を示す概略斜視図である。 ２……泳動ゲル、 ３……蛍光光、 14……アルゴンレーザ、 15……励起光、 34,36……ガルバノミラー、 44……光ファイバ束、 46……正多面形ミラー、 48……Ｆθレンズ系。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標識色素によりラベルされた核酸断片を末
   端塩基別の複数の泳動レーンで電気泳動により展開させ
   た又は展開中のスラブ状泳動ゲルに、このスラブ状泳動
   ゲルの面の放線方向から励起光ビームを入射させる機構
   と、 泳動ゲル中に展開した核酸断片の標識色素の出す発光を
   泳動ゲルの端面で受光するために、一方の端面の形状を
   泳動ゲルの端面形状に対応した薄い長方形としてその端
   面を泳動ゲルの端面に対向させ、他方の端面を光電素子
   の光電面に導いた受光装置とを備えた塩基配列決定装
   置。
2. 【請求項２】励起光スポットの照射位置によって受光強
   度を補正する手段を備えた特許請求の範囲第１項に記載
   の塩基配列決定装置。
3. 【請求項３】前記泳動ゲルの測定端面及び表面の励起光
   照射部分以外の端面、表面及び裏面の少なくとも一部を
   反射鏡で被った特許請求の範囲第１項に記載の塩基配列
   決定装置。