JPH1068694A - 核酸の塩基配列決定方法 - Google Patents
核酸の塩基配列決定方法Info
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- JPH1068694A JPH1068694A JP9173525A JP17352597A JPH1068694A JP H1068694 A JPH1068694 A JP H1068694A JP 9173525 A JP9173525 A JP 9173525A JP 17352597 A JP17352597 A JP 17352597A JP H1068694 A JPH1068694 A JP H1068694A
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- JP
- Japan
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- nucleic acid
- fluorescence
- light
- wavelength
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Abstract
(57)【要約】
【目的】単純な機構で各波長の蛍光検出する核酸の塩基
配列決定方法を提供する。 【構成】末端塩基の種類に応じて発光波長の異なる蛍光
体で標識した核酸断片を電気泳動により分離する工程
と、レーザ光を照射して蛍光体を励起して蛍光を発生さ
せる工程と、蛍光を分光したままで集光する工程と、集
光された光を検出し、検出された光の波長と核酸断片の
長さの関係から試料の塩基配列を決定する工程とを有す
る。 【効果】光路を大きく変化せず波長分散でき、蛍光画像
を歪ませず高感度検出できる。
配列決定方法を提供する。 【構成】末端塩基の種類に応じて発光波長の異なる蛍光
体で標識した核酸断片を電気泳動により分離する工程
と、レーザ光を照射して蛍光体を励起して蛍光を発生さ
せる工程と、蛍光を分光したままで集光する工程と、集
光された光を検出し、検出された光の波長と核酸断片の
長さの関係から試料の塩基配列を決定する工程とを有す
る。 【効果】光路を大きく変化せず波長分散でき、蛍光画像
を歪ませず高感度検出できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡあるいはＲＮＡ
の塩基配列決定方法に係り、特に末端塩基の種類に応じ
て発光波長の異なる蛍光体で標識された核酸断片から波
長の異なる蛍光を検出するのに好適な塩基配列決定方法
に関する。
の塩基配列決定方法に係り、特に末端塩基の種類に応じ
て発光波長の異なる蛍光体で標識された核酸断片から波
長の異なる蛍光を検出するのに好適な塩基配列決定方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＤＮＡ上の塩基配列決定はオート
ラジオグラフィを用いて、分離パターンを写真に転写す
ることにより行なっていた。しかし、放射性元素を使用
する煩雑さに加えて手間と時間のかかる難点があった。
そこでＤＮＡを蛍光標識して電気泳動分離中のＤＮＡ断
片を実時間で検出する方式が注目されている（エル、エ
ム、スミス等、ネーチャー３２１、６７４（１９８６）
（Ｌ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ３２
１、６７４（１９８６）））。この方法では、特定のＤ
ＮＡ末端を保持すると共に末端あるいは途中に蛍光標識
を行ない、他の末端の核酸の持つ塩基がアデニン（Ａ）
であるＤＮＡフラグメント群、シトシン（Ｃ）、チミン
（Ｔ）、あるいはグアニン（Ｇ）で終わる四種のフラグ
メント群を作製する。この時、各塩基群を標識する蛍光
体には発光波長の異なるものを用いる。これら四つの断
片群をいっしょにしてゲル電気泳動分離を行なう。電気
泳動速度は短いＤＮＡ断片ほど早いので、試料注入口か
ら一定距離の所をレーザーで照射すると短い断片から順
次照射領域を通過し蛍光を発する。塩基種により発光波
長が異なるので、波長から塩基種が決定され、泳動時間
から長さが決定できる。四種の波長の異なる蛍光を識別
するために、透過波長の異なる四種のフィルターを回転
させたりしている。また、複数個の試料の測定を可能と
するため、平板型ゲルを用いた装置が米国アプライド
バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）社から市販されている。この装置では、レーザー
ビームを細く絞りゲル平面の一点を照射する。ここから
出た蛍光は、回転フィルターを通過して受光部で検出さ
れる。多数試料の測定ではレーザー照射位置と検出部を
連動させて一直線上を走査して情報を得ている。
ラジオグラフィを用いて、分離パターンを写真に転写す
ることにより行なっていた。しかし、放射性元素を使用
する煩雑さに加えて手間と時間のかかる難点があった。
そこでＤＮＡを蛍光標識して電気泳動分離中のＤＮＡ断
片を実時間で検出する方式が注目されている（エル、エ
ム、スミス等、ネーチャー３２１、６７４（１９８６）
（Ｌ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ３２
１、６７４（１９８６）））。この方法では、特定のＤ
ＮＡ末端を保持すると共に末端あるいは途中に蛍光標識
を行ない、他の末端の核酸の持つ塩基がアデニン（Ａ）
であるＤＮＡフラグメント群、シトシン（Ｃ）、チミン
（Ｔ）、あるいはグアニン（Ｇ）で終わる四種のフラグ
メント群を作製する。この時、各塩基群を標識する蛍光
体には発光波長の異なるものを用いる。これら四つの断
片群をいっしょにしてゲル電気泳動分離を行なう。電気
泳動速度は短いＤＮＡ断片ほど早いので、試料注入口か
ら一定距離の所をレーザーで照射すると短い断片から順
次照射領域を通過し蛍光を発する。塩基種により発光波
長が異なるので、波長から塩基種が決定され、泳動時間
から長さが決定できる。四種の波長の異なる蛍光を識別
するために、透過波長の異なる四種のフィルターを回転
させたりしている。また、複数個の試料の測定を可能と
するため、平板型ゲルを用いた装置が米国アプライド
バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）社から市販されている。この装置では、レーザー
ビームを細く絞りゲル平面の一点を照射する。ここから
出た蛍光は、回転フィルターを通過して受光部で検出さ
れる。多数試料の測定ではレーザー照射位置と検出部を
連動させて一直線上を走査して情報を得ている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では、検
出部に受光される受光量を多くするという点で配慮がさ
れていなかった。即ち、泳動板上の１０ｃｍの領域を判
定しようとすると、各地点をレーザーが照射する時間
は、仮にレーザビーム幅を０．５ｍｍとすると、１回の
走査時間（通常１秒程度）の１／２００となってしま
う。更に、４つの塩基に対応して４つのフィルターが回
転するので、着目する１つの塩基群あたりの計測時間は
更に１／４になり、結局、全体の計測時間の１／８００
程度が１地点、１塩基種の計測に用いられるだけで、受
光量が少なく高感度が得られない。本発明の目的は、回
転フィルターを用いることなく、単純な機構で全ての計
測時間にわたって各波長の蛍光を受光できる高感度な蛍
光検出型電気泳動装置における蛍光検出方法を提供する
ことにある。
出部に受光される受光量を多くするという点で配慮がさ
れていなかった。即ち、泳動板上の１０ｃｍの領域を判
定しようとすると、各地点をレーザーが照射する時間
は、仮にレーザビーム幅を０．５ｍｍとすると、１回の
走査時間（通常１秒程度）の１／２００となってしま
う。更に、４つの塩基に対応して４つのフィルターが回
転するので、着目する１つの塩基群あたりの計測時間は
更に１／４になり、結局、全体の計測時間の１／８００
程度が１地点、１塩基種の計測に用いられるだけで、受
光量が少なく高感度が得られない。本発明の目的は、回
転フィルターを用いることなく、単純な機構で全ての計
測時間にわたって各波長の蛍光を受光できる高感度な蛍
光検出型電気泳動装置における蛍光検出方法を提供する
ことにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記目的は測定領域を同
時に照射し、発する蛍光を直視プリズム（複合プリズ
ム）で波長分散させると同時に、レンズ系でイメージ増
幅器上に結像させ、二次元検出器を用いて検出すること
により達成される。即ち集光レンズの前面に直視プリズ
ムを設置し、波長分散と結像を同時に行なう事により達
成される。
時に照射し、発する蛍光を直視プリズム（複合プリズ
ム）で波長分散させると同時に、レンズ系でイメージ増
幅器上に結像させ、二次元検出器を用いて検出すること
により達成される。即ち集光レンズの前面に直視プリズ
ムを設置し、波長分散と結像を同時に行なう事により達
成される。
【０００５】本発明の核酸の塩基配列決定方法は、末端
塩基の種類に応じて発光波長の異なる蛍光体で標識した
核酸断片を電気泳動により分離する工程と、レーザ光を
照射して蛍光体を励起して蛍光を発生させる工程と、蛍
光を複数回屈折させて、蛍光体の種類に応じた波長の光
をそれぞれ異なる方向に分散させる工程と、分散された
光を集光する工程と、集光された光を検出する工程と、
検出された光の波長と核酸断片の長さの関係から試料の
塩基配列を決定する工程とを有することに特徴がある。
塩基の種類に応じて発光波長の異なる蛍光体で標識した
核酸断片を電気泳動により分離する工程と、レーザ光を
照射して蛍光体を励起して蛍光を発生させる工程と、蛍
光を複数回屈折させて、蛍光体の種類に応じた波長の光
をそれぞれ異なる方向に分散させる工程と、分散された
光を集光する工程と、集光された光を検出する工程と、
検出された光の波長と核酸断片の長さの関係から試料の
塩基配列を決定する工程とを有することに特徴がある。
【０００６】
【作用】通常の単一プリズムと異なり、複数のプリズム
を組み合わせた直視プリズム（複合プリズム）では、出
射後の光路が入射前とあまり変化なく、波長による分散
だけをひきおこす。このため蛍光線画像を歪めることな
く、レンズ系を用いて波長分散した型で、イメージ増幅
器あるいは高感度二次元検出器上に結像する事ができ
る。蛍光線画像を水平方向に取るとすると、上下方向に
波長分散した蛍光像が並ぶことになる。上下方向の位置
で波長を識別し、水平方向の座標から照射されている部
分の位置を識別する。上下方向分散は異なる蛍光体で標
識された塩基種の違いを表わしており、左右は装填位置
の違いを反映しており、試料の違いを表わすことにな
る。
を組み合わせた直視プリズム（複合プリズム）では、出
射後の光路が入射前とあまり変化なく、波長による分散
だけをひきおこす。このため蛍光線画像を歪めることな
く、レンズ系を用いて波長分散した型で、イメージ増幅
器あるいは高感度二次元検出器上に結像する事ができ
る。蛍光線画像を水平方向に取るとすると、上下方向に
波長分散した蛍光像が並ぶことになる。上下方向の位置
で波長を識別し、水平方向の座標から照射されている部
分の位置を識別する。上下方向分散は異なる蛍光体で標
識された塩基種の違いを表わしており、左右は装填位置
の違いを反映しており、試料の違いを表わすことにな
る。
【０００７】
【実施例】以下、本発明の一実施例を図１〜図２により
説明する。図１は全体の装置構成を示したものである。
図２は塩基配列決定の原理を、図３は組合せプリズムの
動作原理を示したものである。配列を決定しようとする
ＤＮＡ（検体）１６の片方の末端に蛍光標識（Ｆ）を行
ない、他の末端がアデニン（Ａ）塩基で終わる断片群
（｛Ａ｝ファミリー）を作製する。同様の断片群（ファ
ミリー）を他の塩基、シトシン（Ｃ）、グアニン
（Ｇ）、チミン（Ｔ）についても作製する。ただし、標
識蛍光体の種類を断片群毎に変えておく。これら断片群
を１つにまとめて泳動ゲル上に装填し、電気泳動を行な
う。一つの試料（検体）について一個の泳動路を使用す
る。本実施例では複数の泳動路が確保できるので、多く
の試料（検体）を同時に測定することができる。ＤＮＡ
断片は短いものほど早く泳動するので、泳動始点から一
定距離の所を、光で照射し通過するＤＮＡフラグメント
から出る蛍光を観測すると、泳動時間から塩基長がわか
り、蛍光波長から末端塩基種がわかる。
説明する。図１は全体の装置構成を示したものである。
図２は塩基配列決定の原理を、図３は組合せプリズムの
動作原理を示したものである。配列を決定しようとする
ＤＮＡ（検体）１６の片方の末端に蛍光標識（Ｆ）を行
ない、他の末端がアデニン（Ａ）塩基で終わる断片群
（｛Ａ｝ファミリー）を作製する。同様の断片群（ファ
ミリー）を他の塩基、シトシン（Ｃ）、グアニン
（Ｇ）、チミン（Ｔ）についても作製する。ただし、標
識蛍光体の種類を断片群毎に変えておく。これら断片群
を１つにまとめて泳動ゲル上に装填し、電気泳動を行な
う。一つの試料（検体）について一個の泳動路を使用す
る。本実施例では複数の泳動路が確保できるので、多く
の試料（検体）を同時に測定することができる。ＤＮＡ
断片は短いものほど早く泳動するので、泳動始点から一
定距離の所を、光で照射し通過するＤＮＡフラグメント
から出る蛍光を観測すると、泳動時間から塩基長がわか
り、蛍光波長から末端塩基種がわかる。
【０００８】複数泳動路を含む励起光の線状照射部のゲ
ルや蛍光体等から発せられる蛍光線画像は、励起光をカ
ットするフィルター４を通過し、直視プリズム１４で波
長分散させられ、結像レンズ５でイメージ増幅器６上に
波長分散画像として結像する。波長分散した増幅画像は
二次元検出器７により受光される。二次元検出器７上の
水平方向（泳動方向に垂直な方向）の位置が照射部座
標、即ち泳動路の区別を表し、垂直方向（泳動方向）が
波長分散される方向に対応する。二次元検出器７上の１
本の水平方向の受光素子ライン、または水平方向の複数
の受光素子ラインで波長分散された蛍光像を受光する。
従って、波長分散された蛍光像を二次元検出器７上の垂
直方向の異なった４ヵ所の位置で得る。該信号は検出回
路９に入力され、信号検出の様子はモニター８上に見る
事ができる。また、検出回路９からの信号のメモリ１
０、計算機１１、出力機器１２によって処理、分析する
ことができる。なお、上記二次元検出器７として、複数
のラインセンサーを配列したものを使用しても良い。
ルや蛍光体等から発せられる蛍光線画像は、励起光をカ
ットするフィルター４を通過し、直視プリズム１４で波
長分散させられ、結像レンズ５でイメージ増幅器６上に
波長分散画像として結像する。波長分散した増幅画像は
二次元検出器７により受光される。二次元検出器７上の
水平方向（泳動方向に垂直な方向）の位置が照射部座
標、即ち泳動路の区別を表し、垂直方向（泳動方向）が
波長分散される方向に対応する。二次元検出器７上の１
本の水平方向の受光素子ライン、または水平方向の複数
の受光素子ラインで波長分散された蛍光像を受光する。
従って、波長分散された蛍光像を二次元検出器７上の垂
直方向の異なった４ヵ所の位置で得る。該信号は検出回
路９に入力され、信号検出の様子はモニター８上に見る
事ができる。また、検出回路９からの信号のメモリ１
０、計算機１１、出力機器１２によって処理、分析する
ことができる。なお、上記二次元検出器７として、複数
のラインセンサーを配列したものを使用しても良い。
【０００９】励起波長４８８ｎｍを用いＦＩＴＣ（発光
波長５１５ｎｍ）及びその異性体（発光波長５３５ｎ
ｍ、５５５ｎｍ、及び５７５ｎｍ）を蛍光体に使用した
場合の例を説明する。図３に示したように、屈折率ｎ2
およびｎ3のプリズムを組み合わせて使用する時、波長
による屈折角の分散∂ｕout／∂λは（数１）で与えら
れる。
波長５１５ｎｍ）及びその異性体（発光波長５３５ｎ
ｍ、５５５ｎｍ、及び５７５ｎｍ）を蛍光体に使用した
場合の例を説明する。図３に示したように、屈折率ｎ2
およびｎ3のプリズムを組み合わせて使用する時、波長
による屈折角の分散∂ｕout／∂λは（数１）で与えら
れる。
【００１０】
【数１】 ∂ｕout／∂λ＝2α2／（λI−λC）・｛（ｎｄ2−１）／（νｄ2） −［（ｎｄ3−１）／（νｄ3）］・（ｎ2−ｎ1）／（ｎ3−ｎ1）｝…（数１） α2は第１プリズムの頂角、ｎ2は屈折率、ｎ1は空気の
屈折率、ｎ3は第２プリズムの屈折率である。ｎｄ2、ｎ
ｄ3は第１、及び第２プリズムを構成するガラスのｎｄ
値であり、νｄ2、及びνｄ3はνｄ値である。λF＝
０．４８６１μｍ、λC＝０．６５６３μｍである。α2
を１５°とし、第１プリズム材にＳＦＳ１を、第２プリ
ズム材にＦＫ５を用いると、第２プリズムの頂角α
3は、（数２）となる。
屈折率、ｎ3は第２プリズムの屈折率である。ｎｄ2、ｎ
ｄ3は第１、及び第２プリズムを構成するガラスのｎｄ
値であり、νｄ2、及びνｄ3はνｄ値である。λF＝
０．４８６１μｍ、λC＝０．６５６３μｍである。α2
を１５°とし、第１プリズム材にＳＦＳ１を、第２プリ
ズム材にＦＫ５を用いると、第２プリズムの頂角α
3は、（数２）となる。
【００１１】
【数２】 α2・（ｎ2−ｎ1）／（ｎ3−ｎ1）≒３４．５° …（数２） また、νｄ2＝２１、ｎｄ2＝１．９２、νｄ3＝７０、
ｎｄ3＝１．４であるので、波長による屈折角の分散∂
ｕout／∂λは（数３）で与えられる。
ｎｄ3＝１．４であるので、波長による屈折角の分散∂
ｕout／∂λは（数３）で与えられる。
【００１２】
【数３】 ∂ｕout／∂λ＝（−２×０．２６２／０.１７０２）｛０．９２／２１ −０．９２／７０｝＝−０．０９５ …（数３） となる。ここで、波長差Δλ＝２０ｎｍとし、結像位置
Ｌ＝６０ｍｍとすると、分散Δδは、（数４）となる。
Ｌ＝６０ｍｍとすると、分散Δδは、（数４）となる。
【００１３】
【数４】 Δδ＝０．０９５・Δλ・Ｌ＝０．１１（ｍｍ） …（数４） 即ち、イメージ増幅器上で０．１１ｍｍの分散が得られ
る。より大きな分散が必要な実施例では、α2を３０°
とし、Ｌ＝１００ｍｍとして、分散を０．３６ｍｍと大
きくし、波長識別を十分行なえるようにした。なお、イ
メージ増幅器の位置分解能は約０．０３ｍｍである。
る。より大きな分散が必要な実施例では、α2を３０°
とし、Ｌ＝１００ｍｍとして、分散を０．３６ｍｍと大
きくし、波長識別を十分行なえるようにした。なお、イ
メージ増幅器の位置分解能は約０．０３ｍｍである。
【００１４】
【発明の効果】本発明によれば、光路を大きく変化する
事なく波長分散をすることができるので、蛍光画像をゆ
がませる事なく波長分散して計測できる。本方式は回転
フィルターで交互に異なる波長を受光する必要がなく、
単純な機構で全ての計測時間にわたって、各波長の蛍光
を受光できるので非常な高感度が得られる。
事なく波長分散をすることができるので、蛍光画像をゆ
がませる事なく波長分散して計測できる。本方式は回転
フィルターで交互に異なる波長を受光する必要がなく、
単純な機構で全ての計測時間にわたって、各波長の蛍光
を受光できるので非常な高感度が得られる。
【図１】本発明の実施例の装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施例でのＤＮＡ塩基配列決定の原理
を示す図。
を示す図。
【図３】本発明の実施例での直視プリズムの例を示す
図。
図。
１…ゲル板、２…レーザー、３…ミラー、４…反射フィ
ルター、５…レンズ、６…イメージ増幅器、７…二次元
検出器、８…モニター、９…検出回路、１０…メモリ、
１１…計算機、１２…出力機器、１３…レーザー光、１
４…直視プリズム、１５…ＤＮＡバンド、１６…目的と
するＤＮＡ、１７…泳動板、１８…サンプルウエル、１
９…入射光、２０…第１プリズム、２１…第２プリズ
ム、２２…第３プリズム。
ルター、５…レンズ、６…イメージ増幅器、７…二次元
検出器、８…モニター、９…検出回路、１０…メモリ、
１１…計算機、１２…出力機器、１３…レーザー光、１
４…直視プリズム、１５…ＤＮＡバンド、１６…目的と
するＤＮＡ、１７…泳動板、１８…サンプルウエル、１
９…入射光、２０…第１プリズム、２１…第２プリズ
ム、２２…第３プリズム。
Claims (3)
- 【請求項１】末端塩基の種類に応じて発光波長の異なる
蛍光体で標識した核酸断片を電気泳動により分離する工
程と、レーザ光を照射して前記蛍光体を励起して蛍光を
発生させる工程と、前記蛍光を分光したままで集光する
工程と、集光された光を検出し、検出された光の波長と
前記核酸断片の長さの関係から試料の塩基配列を決定す
る工程とを有することを特徴とする核酸の塩基配列決定
方法。 - 【請求項２】末端塩基の種類に応じて発光波長の異なる
蛍光体で標識した核酸断片を電気泳動により分離する工
程と、レーザ光を照射して前記蛍光体を励起して蛍光を
発生させる工程と、前記蛍光を分光し集光する工程と、
集光された光を検出し、検出された光の波長と前記核酸
断片の長さの関係から試料の塩基配列を決定する工程と
を有することを特徴とする核酸の塩基配列決定方法。 - 【請求項３】末端塩基の種類に応じて発光波長の異なる
蛍光体で標識した核酸断片を電気泳動により分離する工
程と、レーザ光を照射して前記蛍光体を励起して蛍光を
発生させる工程と、前記蛍光を複数回屈折させて、前記
蛍光体の種類に応じた波長の光をそれぞれ異なる方向に
分散させる工程と、分散された光を集光する工程と、集
光された光を検出する工程とを有することを特徴とする
核酸の塩基配列決定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9173525A JPH1068694A (ja) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | 核酸の塩基配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9173525A JPH1068694A (ja) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | 核酸の塩基配列決定方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8081185A Division JP2746252B2 (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 蛍光検出型電気泳動装置における蛍光検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1068694A true JPH1068694A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=15962148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9173525A Pending JPH1068694A (ja) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | 核酸の塩基配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1068694A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010086935A1 (ja) * | 2009-01-30 | 2010-08-05 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | 蛍光分析装置、及び蛍光分析方法 |
| WO2010146758A1 (ja) * | 2009-06-15 | 2010-12-23 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | 蛍光分析方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5398849A (en) * | 1977-02-10 | 1978-08-29 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Optical branching filter |
| JPS60242368A (ja) * | 1984-05-16 | 1985-12-02 | Hitachi Ltd | 核酸塩基配列決定方法 |
-
1997
- 1997-06-30 JP JP9173525A patent/JPH1068694A/ja active Pending
Patent Citations (2)
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