JPH08101195A - 変性リポプロテイン類の測定法 - Google Patents
変性リポプロテイン類の測定法Info
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- JPH08101195A JPH08101195A JP6190279A JP19027994A JPH08101195A JP H08101195 A JPH08101195 A JP H08101195A JP 6190279 A JP6190279 A JP 6190279A JP 19027994 A JP19027994 A JP 19027994A JP H08101195 A JPH08101195 A JP H08101195A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 変性リポプロテイン類を含む生体試料に変性
リポプロテイン類を認識する抗体を反応せしめるに際
し、生体試料中の変性リポプロテインの変性部位をリポ
プロテイン粒子表面に露出させることを特徴とする変性
リポプロテイン類の測定法。 【効果】 本発明方法によれば、動脈硬化症等の種々の
疾患の原因物質となる生体中の変性リポプロテイン類を
確実に測定することができる。
リポプロテイン類を認識する抗体を反応せしめるに際
し、生体試料中の変性リポプロテインの変性部位をリポ
プロテイン粒子表面に露出させることを特徴とする変性
リポプロテイン類の測定法。 【効果】 本発明方法によれば、動脈硬化症等の種々の
疾患の原因物質となる生体中の変性リポプロテイン類を
確実に測定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動脈硬化症に関与して
いると考えられている変性リポプロテイン類の生体中の
存在量を正確に測定する方法に関する。
いると考えられている変性リポプロテイン類の生体中の
存在量を正確に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】動脈硬化症は虚血性心疾患、脳梗塞等の
主因となることが知られている。この動脈硬化の発症の
メカニズムは、血管内皮下層に平滑筋細胞、結合組織及
び多量の脂質（おもにコレステロールエステル）が蓄積
することによって粥腫を形成し、動脈壁が肥厚、更には
硬化に至り、動脈の機能低下を引き起こすことにあると
されており、特に、本症の初期病変に認められる粥腫
は、マクロファージが変性した低比重リポプロテイン
（ＬＤＬ）を取り込むことによって生じた泡沫細胞から
形成されている。しかしながら、生体中でマクロファー
ジを泡沫化させる変性ＬＤＬの正体は現在まで不明であ
るが、近年、動脈硬化に重要な役割を果たしているとさ
れる血管内皮細胞とＬＤＬとの相互作用によって生ずる
変性ＬＤＬ〔Ｑｕｉｎｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｐａｒｔｈａｓａ
ｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｆｏｎｇ，Ｌ．Ｇ．＆ Ｓｔｅｉｎ
ｂｅｒｇ，Ｄ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，２９９５−２９９８〕又
は同様に動脈硬化に重要な役割を果たしている過酸化脂
質やトロンボキサンＡ2 の最終分解産物として知られる
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）と結合したＬＤＬ〔Ｆｏ
ｇｅｌｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．，Ｓ
ｅａｇｅｒ，Ｊ．，Ｈｏｋｏｍ，Ｍ．，Ｃｈｉｌｄ，
Ｊ．Ｓ．＆ Ｂｄｗａｒｄｓ，Ｐ．Ａ．（１９８０）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，
２２１４−２２１８〕の２種の変性ＬＤＬが動脈硬化の
初期病変に深く関与している可能性が提唱されており、
生体中のこれらの変性ＬＤＬを測定することが重要視さ
れている。
主因となることが知られている。この動脈硬化の発症の
メカニズムは、血管内皮下層に平滑筋細胞、結合組織及
び多量の脂質（おもにコレステロールエステル）が蓄積
することによって粥腫を形成し、動脈壁が肥厚、更には
硬化に至り、動脈の機能低下を引き起こすことにあると
されており、特に、本症の初期病変に認められる粥腫
は、マクロファージが変性した低比重リポプロテイン
（ＬＤＬ）を取り込むことによって生じた泡沫細胞から
形成されている。しかしながら、生体中でマクロファー
ジを泡沫化させる変性ＬＤＬの正体は現在まで不明であ
るが、近年、動脈硬化に重要な役割を果たしているとさ
れる血管内皮細胞とＬＤＬとの相互作用によって生ずる
変性ＬＤＬ〔Ｑｕｉｎｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｐａｒｔｈａｓａ
ｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｆｏｎｇ，Ｌ．Ｇ．＆ Ｓｔｅｉｎ
ｂｅｒｇ，Ｄ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，２９９５−２９９８〕又
は同様に動脈硬化に重要な役割を果たしている過酸化脂
質やトロンボキサンＡ2 の最終分解産物として知られる
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）と結合したＬＤＬ〔Ｆｏ
ｇｅｌｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．，Ｓ
ｅａｇｅｒ，Ｊ．，Ｈｏｋｏｍ，Ｍ．，Ｃｈｉｌｄ，
Ｊ．Ｓ．＆ Ｂｄｗａｒｄｓ，Ｐ．Ａ．（１９８０）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，
２２１４−２２１８〕の２種の変性ＬＤＬが動脈硬化の
初期病変に深く関与している可能性が提唱されており、
生体中のこれらの変性ＬＤＬを測定することが重要視さ
れている。
【０００３】従来、変性ＬＤＬを測定する方法として
は、いくつかの方法が報告されており、例えば、Ｇｏｎ
ｅｎらは、ＭＤＡ化ＬＤＬを固相化し、ＭＤＡ化ＬＤＬ
を認識する抗体を用いたＥＩＡ競合法〔Ｇｏｎｅｎ，
Ｂ．，Ｆａｌｌｏｎ，Ｊ．Ｊ．＆Ｂａｋｅｒ Ｓ．Ａ．
（１９８７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ６５，
２６５−２７２〕を、Ｓａｌｍｏｎらは、ＭＤＡ化ＬＤ
Ｌを認識する抗体を固相化し、ＬＤＬを認識する抗体を
酵素標識してＥＩＡサンドイッチ法〔Ｓａｌｍｏｎ，
Ｓ．，Ｍａｚｉｅｒｅ，Ｃ．，Ｔｈｅｒｏｎ，Ｌ．，Ｂ
ｅｕｃｌｅｒ，Ｉ．，Ａｙｒａｕｌｔ−Ｊａｒｒｉｅ
ｒ，Ｍ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．＆ Ｐｏｌｏｎｏ
ｖｓｋｉ，Ｊ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ ９２０，２１５−２２０〕をそれぞ
れ用いて、動脈硬化巣の抽出物又は血液中のＭＤＡ化Ｌ
ＤＬの測定を行っている。
は、いくつかの方法が報告されており、例えば、Ｇｏｎ
ｅｎらは、ＭＤＡ化ＬＤＬを固相化し、ＭＤＡ化ＬＤＬ
を認識する抗体を用いたＥＩＡ競合法〔Ｇｏｎｅｎ，
Ｂ．，Ｆａｌｌｏｎ，Ｊ．Ｊ．＆Ｂａｋｅｒ Ｓ．Ａ．
（１９８７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ６５，
２６５−２７２〕を、Ｓａｌｍｏｎらは、ＭＤＡ化ＬＤ
Ｌを認識する抗体を固相化し、ＬＤＬを認識する抗体を
酵素標識してＥＩＡサンドイッチ法〔Ｓａｌｍｏｎ，
Ｓ．，Ｍａｚｉｅｒｅ，Ｃ．，Ｔｈｅｒｏｎ，Ｌ．，Ｂ
ｅｕｃｌｅｒ，Ｉ．，Ａｙｒａｕｌｔ−Ｊａｒｒｉｅ
ｒ，Ｍ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．＆ Ｐｏｌｏｎｏ
ｖｓｋｉ，Ｊ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ ９２０，２１５−２２０〕をそれぞ
れ用いて、動脈硬化巣の抽出物又は血液中のＭＤＡ化Ｌ
ＤＬの測定を行っている。
【０００４】しかしながら、Ｇｏｎｅｎらは、同測定方
法による動脈硬化組織中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定するこ
とに失敗している。また、Ｓａｌｍｏｎらは、血液中の
ＭＤＡ化ＬＤＬの測定を６５検体について実施したとこ
ろ、１４検体のみが測定可能であったが、残る５１検体
では測定できなかったことを報告している。
法による動脈硬化組織中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定するこ
とに失敗している。また、Ｓａｌｍｏｎらは、血液中の
ＭＤＡ化ＬＤＬの測定を６５検体について実施したとこ
ろ、１４検体のみが測定可能であったが、残る５１検体
では測定できなかったことを報告している。
【０００５】このように、これまで、人工的に合成した
ＭＤＡ化ＬＤＬを測定する方法は知られていたが、この
方法を用いても生体試料中のＭＤＡ化ＬＤＬ、すなわち
変性ＬＤＬを測定することができなかった。
ＭＤＡ化ＬＤＬを測定する方法は知られていたが、この
方法を用いても生体試料中のＭＤＡ化ＬＤＬ、すなわち
変性ＬＤＬを測定することができなかった。
【０００６】一方、冠動脈疾患の発症にリポプロテイン
スモールａ（Ｌｐ（ａ））が、他の動脈硬化性疾患発症
の危険因子とは独立して関係していることが知られてお
り、この発症メカニズムとして、近年注目されているの
が、変性Ｌｐ（ａ）の関与である〔Ｌｏｓｃａｌｚｏ，
Ｊ．（１９９０）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１
０，６７２−６７９〕。すなわち、変性Ｌｐ（ａ）が冠
動脈に集積し、そこへマクロファージが誘引されて、変
性Ｌｐ（ａ）を取り込むことにより、泡沫化するという
メカニズムである。この仮説を支持する報告として、近
年Ｌｐ（ａ）を銅処理又はマロンジアルデヒド（ＭＤ
Ａ）化することによって、マイナス荷電をもった変性Ｌ
ｐ（ａ）とすると、マクロファージへの取り込み量が増
加するという報告〔Ｈａｂｅｒｌａｎｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｆ
ｌｅｓｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ．＆ Ｆｏｇ
ｅｌｍａｎ，Ａ．Ｍ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６７，４１４３−４１５１〕や、動脈硬化巣に
はＬｐ（ａ）が集積しており、このＬｐ（ａ）はｎａｔ
ｉｖｅ（正常）Ｌｐ（ａ）と比較すると、アガロース電
気泳動上、よりマイナス荷電を有していたという報告
〔Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｊ．Ａ．，Ｐｅｐｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｓ
ｍｅｊｋａｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ（１９９０）Ａｒｔｅ
ｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０，８１２ａ〕が挙げら
れる。このように、変性Ｌｐ（ａ）は動脈硬化発症に深
く関与している可能性が提唱されており、生体中の変性
Ｌｐ（ａ）を測定することが重要視されている。
スモールａ（Ｌｐ（ａ））が、他の動脈硬化性疾患発症
の危険因子とは独立して関係していることが知られてお
り、この発症メカニズムとして、近年注目されているの
が、変性Ｌｐ（ａ）の関与である〔Ｌｏｓｃａｌｚｏ，
Ｊ．（１９９０）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１
０，６７２−６７９〕。すなわち、変性Ｌｐ（ａ）が冠
動脈に集積し、そこへマクロファージが誘引されて、変
性Ｌｐ（ａ）を取り込むことにより、泡沫化するという
メカニズムである。この仮説を支持する報告として、近
年Ｌｐ（ａ）を銅処理又はマロンジアルデヒド（ＭＤ
Ａ）化することによって、マイナス荷電をもった変性Ｌ
ｐ（ａ）とすると、マクロファージへの取り込み量が増
加するという報告〔Ｈａｂｅｒｌａｎｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｆ
ｌｅｓｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ．＆ Ｆｏｇ
ｅｌｍａｎ，Ａ．Ｍ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６７，４１４３−４１５１〕や、動脈硬化巣に
はＬｐ（ａ）が集積しており、このＬｐ（ａ）はｎａｔ
ｉｖｅ（正常）Ｌｐ（ａ）と比較すると、アガロース電
気泳動上、よりマイナス荷電を有していたという報告
〔Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｊ．Ａ．，Ｐｅｐｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｓ
ｍｅｊｋａｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ（１９９０）Ａｒｔｅ
ｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０，８１２ａ〕が挙げら
れる。このように、変性Ｌｐ（ａ）は動脈硬化発症に深
く関与している可能性が提唱されており、生体中の変性
Ｌｐ（ａ）を測定することが重要視されている。
【０００７】従来より、生体中のＬｐ（ａ）を測定する
方法としては、数多くの方法が報告されており、Ｆｌｅ
ｓｓらは、Ｌｐ（ａ）がＬＤＬとアポスモールａ（アポ
（ａ））との結合物に類似していることを利用して、Ｌ
ＤＬ中の主要構成タンパクであるアポＢを認識する抗体
とアポ（ａ）を認識する抗体とを用いたＥＩＡサンドイ
ッチ法〔Ｆｌｅｓｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．
Ｌ．，＆ Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ．（１９８９）Ｊ．Ｌｉ
ｐｉｄ Ｒｅｓ．３０，６５１−６６２〕を確立してい
る。
方法としては、数多くの方法が報告されており、Ｆｌｅ
ｓｓらは、Ｌｐ（ａ）がＬＤＬとアポスモールａ（アポ
（ａ））との結合物に類似していることを利用して、Ｌ
ＤＬ中の主要構成タンパクであるアポＢを認識する抗体
とアポ（ａ）を認識する抗体とを用いたＥＩＡサンドイ
ッチ法〔Ｆｌｅｓｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．
Ｌ．，＆ Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ．（１９８９）Ｊ．Ｌｉ
ｐｉｄ Ｒｅｓ．３０，６５１−６６２〕を確立してい
る。
【０００８】このように、これまで、Ｌｐ（ａ）を測定
する方法は知られていたが、冠動脈疾患の発症に、より
強く関与している可能性が考えられている生体試料中の
変性Ｌｐ（ａ）を測定することはできなかった。
する方法は知られていたが、冠動脈疾患の発症に、より
強く関与している可能性が考えられている生体試料中の
変性Ｌｐ（ａ）を測定することはできなかった。
【０００９】また、種々のリポプロテインの中で変性リ
ポプロテインの存在が知られているものとしては、高比
重リポプロテイン（ＨＤＬ）等があるが、これらの変性
体についても未だ測定法は見出されていないＭｏｒｅ
ｌ，Ｄ．Ｗ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ，Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．２００，４０８−４１
６，Ｍａｚｉｅｒｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｙａｒａ，Ｉ．，Ｓ
ａｌｍｏｎ，Ｓ．，Ａｕｃｌａｉｒ，Ｍ．，Ｈａｉｇｌ
ｅ，Ｊ．，Ｓａｎｔｕｓ，Ｒ．，＆ Ｍａｚｉｅｒｅ，
Ｃ．（１９９３）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １
０４，２１３−２１９。
ポプロテインの存在が知られているものとしては、高比
重リポプロテイン（ＨＤＬ）等があるが、これらの変性
体についても未だ測定法は見出されていないＭｏｒｅ
ｌ，Ｄ．Ｗ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ，Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．２００，４０８−４１
６，Ｍａｚｉｅｒｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｙａｒａ，Ｉ．，Ｓ
ａｌｍｏｎ，Ｓ．，Ａｕｃｌａｉｒ，Ｍ．，Ｈａｉｇｌ
ｅ，Ｊ．，Ｓａｎｔｕｓ，Ｒ．，＆ Ｍａｚｉｅｒｅ，
Ｃ．（１９９３）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １
０４，２１３−２１９。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は生体試料中の変性リポプロテイン類を選択的に測定す
る方法を提供することにある。
は生体試料中の変性リポプロテイン類を選択的に測定す
る方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】このような実情におい
て、本発明者は鋭意研究を行った結果、変性リポプロテ
イン類を認識する抗体（抗変性リポプロテイン抗体と称
する）を用いても生体中の変性リポプロテインを測定し
得ないのは、生体中においては、変性リポプロテイン類
の変性部位がリポプロテイン粒子の内部に隠蔽されて不
活性化されていることに原因すること、従って、この変
性部位をリポプロテイン粒子の表面に露出させれば、抗
変性リポプロテイン抗体との反応が可能になり、変性リ
ポプロテイン類を選択的に測定できることを見出し、本
発明を完成した。
て、本発明者は鋭意研究を行った結果、変性リポプロテ
イン類を認識する抗体（抗変性リポプロテイン抗体と称
する）を用いても生体中の変性リポプロテインを測定し
得ないのは、生体中においては、変性リポプロテイン類
の変性部位がリポプロテイン粒子の内部に隠蔽されて不
活性化されていることに原因すること、従って、この変
性部位をリポプロテイン粒子の表面に露出させれば、抗
変性リポプロテイン抗体との反応が可能になり、変性リ
ポプロテイン類を選択的に測定できることを見出し、本
発明を完成した。
【００１２】すなわち、本発明は、変性リポプロテイン
類を含む生体試料に抗変性リポプロテイン抗体を反応せ
しめるに際し、生体試料中の変性リポプロテイン類の変
性部位をリポプロテイン粒子表面に露出させることを特
徴とする変性リポプロテイン類の測定法を提供するもの
である。
類を含む生体試料に抗変性リポプロテイン抗体を反応せ
しめるに際し、生体試料中の変性リポプロテイン類の変
性部位をリポプロテイン粒子表面に露出させることを特
徴とする変性リポプロテイン類の測定法を提供するもの
である。
【００１３】本発明における測定対象である変性リポプ
ロテイン類としては、変性ＬＤＬ、変性Ｌｐ（ａ）、変
性ＨＤＬ等が挙げられる。ここで変性ＬＤＬは前記のよ
うに動脈硬化症の発症に深く関与している。また、変性
Ｌｐ（ａ）は動脈の中でも特に冠動脈における硬化症の
発症に深く関与している。また変性ＨＤＬも動脈硬化症
の発症に深く関与している。
ロテイン類としては、変性ＬＤＬ、変性Ｌｐ（ａ）、変
性ＨＤＬ等が挙げられる。ここで変性ＬＤＬは前記のよ
うに動脈硬化症の発症に深く関与している。また、変性
Ｌｐ（ａ）は動脈の中でも特に冠動脈における硬化症の
発症に深く関与している。また変性ＨＤＬも動脈硬化症
の発症に深く関与している。
【００１４】本発明に用いられる生体試料としては、変
性リポプロテインが存在する試料であれば特に制限され
ないが、血液、血漿、血清等が挙げられる。このうち、
血漿又は血清が特に好ましい。
性リポプロテインが存在する試料であれば特に制限され
ないが、血液、血漿、血清等が挙げられる。このうち、
血漿又は血清が特に好ましい。
【００１５】本発明に用いる抗変性リポプロテイン抗体
としては、変性リポプロテインと反応し、正常リポプロ
テインと反応しない抗体であればポリクローナル抗体及
びモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクロー
ナル抗体が好ましい。抗変性リポプロテイン抗体として
は、例えば抗ＭＤＡ化リポプロテイン抗体、ＭＤＡ残基
を認識する抗ハプテン抗体を挙げることができ、特に抗
ＭＤＡ化リポプロテインモノクローナル抗体が好まし
い。具体的には抗ＭＤＡ化ＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）抗体、抗ＨＤＡ化ＨＤＬ抗体が挙げられるが、Ｌ
ｐ（ａ）の場合にはＬＤＬとアポ（ａ）の結合物に類似
することから抗ＭＤＡ化ＬＤＬ抗体を用いることもでき
る。当該モノクローナル抗体は例えば特開平４−１７３
０９６号に記載の方法に従って、次のようにして製造さ
れる。
としては、変性リポプロテインと反応し、正常リポプロ
テインと反応しない抗体であればポリクローナル抗体及
びモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクロー
ナル抗体が好ましい。抗変性リポプロテイン抗体として
は、例えば抗ＭＤＡ化リポプロテイン抗体、ＭＤＡ残基
を認識する抗ハプテン抗体を挙げることができ、特に抗
ＭＤＡ化リポプロテインモノクローナル抗体が好まし
い。具体的には抗ＭＤＡ化ＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）抗体、抗ＨＤＡ化ＨＤＬ抗体が挙げられるが、Ｌ
ｐ（ａ）の場合にはＬＤＬとアポ（ａ）の結合物に類似
することから抗ＭＤＡ化ＬＤＬ抗体を用いることもでき
る。当該モノクローナル抗体は例えば特開平４−１７３
０９６号に記載の方法に従って、次のようにして製造さ
れる。
【００１６】まず、ヒトの新鮮血清より通常の分離超遠
心法によって精製リポプロテインを調製し、これにＭＤ
Ａを反応せしめてＭＤＡ化リポプロテインを調製する。
リポプロテインのＭＤＡ化反応は、通常pH６〜７、反応
温度２０〜４０℃にて３０分〜２４時間行うのが好まし
い。この反応は４℃に冷却することによって停止するこ
とができるので、反応液は４℃に冷却して反応を停止さ
せ、pH６〜８の緩衝液、必要に応じてＥＤＴＡ １０〜
１００μＭを添加したものに対して、４℃下で透析す
る。
心法によって精製リポプロテインを調製し、これにＭＤ
Ａを反応せしめてＭＤＡ化リポプロテインを調製する。
リポプロテインのＭＤＡ化反応は、通常pH６〜７、反応
温度２０〜４０℃にて３０分〜２４時間行うのが好まし
い。この反応は４℃に冷却することによって停止するこ
とができるので、反応液は４℃に冷却して反応を停止さ
せ、pH６〜８の緩衝液、必要に応じてＥＤＴＡ １０〜
１００μＭを添加したものに対して、４℃下で透析す
る。
【００１７】このヒトＭＤＡ化リポプロテインを免疫原
として使用し、既知の細胞融合手段によって、抗ヒトＭ
ＤＡ化リポプロテインモノクローナル抗体を調製するこ
とができる。すなわち、ヒトＭＤＡ化リポプロテインを
マウスに免疫し、一定期間後、マウスの脾臓を摘出す
る。摘出した脾臓細胞は、ポリエチレングリコールの存
在下、ミエローマ細胞と融合せしめた後、一定期間該融
合細胞を培養し、培養上清に産生された抗体のリポプロ
テイン及びＭＤＡ化リポプロテインに対する反応性の違
いから、特異性の高い抗ヒトＭＤＡ化リポプロテインモ
ノクローナル抗体を産生する融合細胞株を得ることがで
きる。得られた融合細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ
ｖｉｖｏで培養して抗ＭＤＡ化リポプロテイン抗体を
得ることができる。
として使用し、既知の細胞融合手段によって、抗ヒトＭ
ＤＡ化リポプロテインモノクローナル抗体を調製するこ
とができる。すなわち、ヒトＭＤＡ化リポプロテインを
マウスに免疫し、一定期間後、マウスの脾臓を摘出す
る。摘出した脾臓細胞は、ポリエチレングリコールの存
在下、ミエローマ細胞と融合せしめた後、一定期間該融
合細胞を培養し、培養上清に産生された抗体のリポプロ
テイン及びＭＤＡ化リポプロテインに対する反応性の違
いから、特異性の高い抗ヒトＭＤＡ化リポプロテインモ
ノクローナル抗体を産生する融合細胞株を得ることがで
きる。得られた融合細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ
ｖｉｖｏで培養して抗ＭＤＡ化リポプロテイン抗体を
得ることができる。
【００１８】本発明において最も重要な生体試料中の変
性リポプロテインの変性部位をリポプロテイン粒子表面
に露出させる手段としては、界面活性剤処理が挙げられ
る。すなわち、生体中の変性リポプロテイン類に界面活
性剤を作用させると、リポプロテイン類に構造変化が生
起して、リポプロテイン粒子内部に隠蔽されていた変性
部位が表面に露出される。そして、本発明方法において
は、生体試料と抗変性リポプロテイン抗体との反応系に
界面活性剤を共存させれば、当該抗体と変性リポプロテ
インとの反応が生起し、生体試料中の変性リポプロテイ
ンが選択的に測定できる。
性リポプロテインの変性部位をリポプロテイン粒子表面
に露出させる手段としては、界面活性剤処理が挙げられ
る。すなわち、生体中の変性リポプロテイン類に界面活
性剤を作用させると、リポプロテイン類に構造変化が生
起して、リポプロテイン粒子内部に隠蔽されていた変性
部位が表面に露出される。そして、本発明方法において
は、生体試料と抗変性リポプロテイン抗体との反応系に
界面活性剤を共存させれば、当該抗体と変性リポプロテ
インとの反応が生起し、生体試料中の変性リポプロテイ
ンが選択的に測定できる。
【００１９】用いられる界面活性剤としては、陰イオン
性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤
及び非イオン性界面活性剤が挙げられるが、陰イオン性
界面活性剤が好ましい。例えばモノ又はジ−Ｃ8-18アル
キル第４級アンモニウム塩、Ｃ8-18アルキル硫酸塩、Ｃ
8-18アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｃ8-18アルキルリ
ン酸塩、Ｃ8-18アルキルエーテル硫酸塩、Ｃ8-18アルキ
ルエーテルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレン
２級アルキルエーテル等が挙げられ、このうちセチルト
リメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウ
ム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルリン酸ジエタノー
ルアミン、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル
（酸化エチレン９モル付加物）等が特に好ましい。界面
活性剤の濃度は０．１〜５０mMの範囲、特に０．５〜２
０mMの範囲で使用するのが好ましく、更にＳＤＳの場合
は、１〜５mMの範囲で使用するのが好ましい。
性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤
及び非イオン性界面活性剤が挙げられるが、陰イオン性
界面活性剤が好ましい。例えばモノ又はジ−Ｃ8-18アル
キル第４級アンモニウム塩、Ｃ8-18アルキル硫酸塩、Ｃ
8-18アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｃ8-18アルキルリ
ン酸塩、Ｃ8-18アルキルエーテル硫酸塩、Ｃ8-18アルキ
ルエーテルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレン
２級アルキルエーテル等が挙げられ、このうちセチルト
リメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウ
ム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルリン酸ジエタノー
ルアミン、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル
（酸化エチレン９モル付加物）等が特に好ましい。界面
活性剤の濃度は０．１〜５０mMの範囲、特に０．５〜２
０mMの範囲で使用するのが好ましく、更にＳＤＳの場合
は、１〜５mMの範囲で使用するのが好ましい。
【００２０】かくしてリポプロテイン粒子表面に露出さ
れた変性リポプロテインの測定手法としては、通常の免
疫測定法であれば特に制限されず、例えば、免疫比濁
法、ネフェロメトリックイムノアッセイ、ラテックス凝
集法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ等が利用できる。特に、特異性、感度及び利便性の面
ですぐれたエンザイムイムノアッセイが好ましい。
れた変性リポプロテインの測定手法としては、通常の免
疫測定法であれば特に制限されず、例えば、免疫比濁
法、ネフェロメトリックイムノアッセイ、ラテックス凝
集法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ等が利用できる。特に、特異性、感度及び利便性の面
ですぐれたエンザイムイムノアッセイが好ましい。
【００２１】次に本発明方法をエンザイムイムノアッセ
イを例にとって詳細に説明する。
イを例にとって詳細に説明する。
【００２２】まず、ヒト血清中には、ヒトＭＤＡ化リポ
プロテイン以外のＭＤＡ化蛋白が存在することが示唆さ
れている〔Ｋｅｒｇｏｎｏｕ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｒｕｎａ，
Ｂ．，Ｐｅｎｎａｃｉｎｏ，Ｉ．＆ Ｄｕｃｏｕｓｓ
ｏ，Ｒ．（１９８８）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ７１，１２１−１２４〕の
で、該抗ヒトＭＤＡ化リポプロテインモノクローナル抗
体が他のＭＤＡ化蛋白と反応する可能性があることを考
慮する必要がある。従って、変性ＬＤＬを測定する場合
にはヒトＭＤＡ化ＬＤＬの測定の特異性を高めるため
に、ヒトＭＤＡ化ＬＤＬ及びＬＤＬを構成しているヒト
アポＢを認識する抗体とサンドイッチした免疫学的測定
法を用いるのが好ましい。すなわち、抗ヒトＭＤＡ化Ｌ
ＤＬモノクローナル抗体及び抗ヒトアポＢ抗体の何れか
一方を不溶性担体に固定し、他方を標識物で標識し、こ
れらを生体試料と接触させてサンドイッチの免疫学的測
定を行ってヒトＭＤＡ化ＬＤＬを測定する。
プロテイン以外のＭＤＡ化蛋白が存在することが示唆さ
れている〔Ｋｅｒｇｏｎｏｕ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｒｕｎａ，
Ｂ．，Ｐｅｎｎａｃｉｎｏ，Ｉ．＆ Ｄｕｃｏｕｓｓ
ｏ，Ｒ．（１９８８）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ７１，１２１−１２４〕の
で、該抗ヒトＭＤＡ化リポプロテインモノクローナル抗
体が他のＭＤＡ化蛋白と反応する可能性があることを考
慮する必要がある。従って、変性ＬＤＬを測定する場合
にはヒトＭＤＡ化ＬＤＬの測定の特異性を高めるため
に、ヒトＭＤＡ化ＬＤＬ及びＬＤＬを構成しているヒト
アポＢを認識する抗体とサンドイッチした免疫学的測定
法を用いるのが好ましい。すなわち、抗ヒトＭＤＡ化Ｌ
ＤＬモノクローナル抗体及び抗ヒトアポＢ抗体の何れか
一方を不溶性担体に固定し、他方を標識物で標識し、こ
れらを生体試料と接触させてサンドイッチの免疫学的測
定を行ってヒトＭＤＡ化ＬＤＬを測定する。
【００２３】また、変性Ｌｐ（ａ）を測定する場合に
は、ヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定の特異性を高めるた
めに、ヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を構成しているヒトアポ
（ａ）を認識する抗体とサンドイッチした免疫学的測定
法を用いるのが好ましい。すなわち、抗ヒトＭＤＡ化Ｌ
ｐ（ａ）モノクローナル抗体及び抗ヒトアポＢ抗体の何
れか一方を不溶性担体に固定し、他方を標識物で標識
し、これらを生体試料と接触させてサンドイッチの免疫
学的測定を行ってヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測定する。
更に、変性ＨＤＬを測定する場合には、ヒトＭＤＡ化Ｈ
ＤＬの測定の特異性を高めるために、ヒトＭＤＡ化ＨＤ
Ｌを構成しているヒトアポＡ−Ｉ又はアポＡ−IIを認識
する抗体とサンドイッチした免疫学的測定法を用いるの
が好ましい。すなわち、抗ヒトＭＤＡ化ＨＤＬモノクロ
ーナル抗体及び抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体又は抗ヒトアポＡ
−II抗体の何れか一方を不溶性担体に固定し、他方を標
識物で標識し、これらを生体試料と接触させて、サンド
イッチの免疫学的測定を行ってヒトＭＤＡ化ＨＤＬを測
定する。
は、ヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定の特異性を高めるた
めに、ヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を構成しているヒトアポ
（ａ）を認識する抗体とサンドイッチした免疫学的測定
法を用いるのが好ましい。すなわち、抗ヒトＭＤＡ化Ｌ
ｐ（ａ）モノクローナル抗体及び抗ヒトアポＢ抗体の何
れか一方を不溶性担体に固定し、他方を標識物で標識
し、これらを生体試料と接触させてサンドイッチの免疫
学的測定を行ってヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測定する。
更に、変性ＨＤＬを測定する場合には、ヒトＭＤＡ化Ｈ
ＤＬの測定の特異性を高めるために、ヒトＭＤＡ化ＨＤ
Ｌを構成しているヒトアポＡ−Ｉ又はアポＡ−IIを認識
する抗体とサンドイッチした免疫学的測定法を用いるの
が好ましい。すなわち、抗ヒトＭＤＡ化ＨＤＬモノクロ
ーナル抗体及び抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体又は抗ヒトアポＡ
−II抗体の何れか一方を不溶性担体に固定し、他方を標
識物で標識し、これらを生体試料と接触させて、サンド
イッチの免疫学的測定を行ってヒトＭＤＡ化ＨＤＬを測
定する。
【００２４】ここに使用する不溶性担体としては、ポリ
エチレン、ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、ガ
ラス、シリコン、不溶性多糖などが挙げられ、これらの
担体は、球状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは試
験管、マイクロタイタープレートなどとして用いること
ができる。不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着又は
共有結合によって不溶性担体に結合させることによって
行われる。
エチレン、ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、ガ
ラス、シリコン、不溶性多糖などが挙げられ、これらの
担体は、球状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは試
験管、マイクロタイタープレートなどとして用いること
ができる。不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着又は
共有結合によって不溶性担体に結合させることによって
行われる。
【００２５】標識抗体に用いる標識物としては、ラジオ
アイソトープ、酵素、各種蛍光物質及び金コロイドなど
の微粒子などがある。例えば、標識抗体の標識物として
酵素を用いる場合、酵素標識抗体は公知の方法によって
調製することができ、必要に応じて、使用する抗体を適
当なプロテアーゼにより限定分解してF(ab')2 とした
後、又は更に還元剤の存在下Fab'とした後、酵素と標識
することもできる。抗体の標識に使用する酵素としては
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカ
リ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙
げられる。
アイソトープ、酵素、各種蛍光物質及び金コロイドなど
の微粒子などがある。例えば、標識抗体の標識物として
酵素を用いる場合、酵素標識抗体は公知の方法によって
調製することができ、必要に応じて、使用する抗体を適
当なプロテアーゼにより限定分解してF(ab')2 とした
後、又は更に還元剤の存在下Fab'とした後、酵素と標識
することもできる。抗体の標識に使用する酵素としては
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカ
リ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙
げられる。
【００２６】免疫反応は、一段階反応でも二段階反応で
もどちらでもよく、一段階反応で行う場合は、該反応中
に界面活性剤を加えればよい。二段階で免疫反応を行う
場合は、まず第一反応で、不溶化抗体に生体試料を接触
させて、抗原を結合させて不溶化抗体−抗原複合体と
し、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合させて、不
溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とすることによっ
て行われるが、この二段階反応のうち、抗変性リポプロ
テイン抗体と抗原とを接触させる段階で、反応液中に界
面活性剤を共存させた緩衝液を用いる。すなわち、不溶
化抗体として抗変性リポプロテイン抗体を用いるとき
は、第一反応に、逆に標識抗体として用いるときは、第
二反応に界面活性剤を共存させた緩衝液を共存させて反
応を行う。
もどちらでもよく、一段階反応で行う場合は、該反応中
に界面活性剤を加えればよい。二段階で免疫反応を行う
場合は、まず第一反応で、不溶化抗体に生体試料を接触
させて、抗原を結合させて不溶化抗体−抗原複合体と
し、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合させて、不
溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とすることによっ
て行われるが、この二段階反応のうち、抗変性リポプロ
テイン抗体と抗原とを接触させる段階で、反応液中に界
面活性剤を共存させた緩衝液を用いる。すなわち、不溶
化抗体として抗変性リポプロテイン抗体を用いるとき
は、第一反応に、逆に標識抗体として用いるときは、第
二反応に界面活性剤を共存させた緩衝液を共存させて反
応を行う。
【００２７】緩衝液としては、pH６〜１０の範囲のもの
を使用することができる。緩衝剤としては、グリシン、
トリス、リン酸塩、イミダゾール、トリエタノールアミ
ン、バルビツール酸塩又はグッドの緩衝剤を１０〜１０
０mMの範囲で使用するのが好ましく、特にグリシン、Ｈ
ＥＰＥＳ（グッドの緩衝剤の一種）又はリン酸塩の緩衝
剤を１０〜５０mMの濃度で使用してpH７〜９に調製する
のが好ましい。
を使用することができる。緩衝剤としては、グリシン、
トリス、リン酸塩、イミダゾール、トリエタノールアミ
ン、バルビツール酸塩又はグッドの緩衝剤を１０〜１０
０mMの範囲で使用するのが好ましく、特にグリシン、Ｈ
ＥＰＥＳ（グッドの緩衝剤の一種）又はリン酸塩の緩衝
剤を１０〜５０mMの濃度で使用してpH７〜９に調製する
のが好ましい。
【００２８】更に、反応液中の抗原及び抗体を安定化さ
せるために、適当な蛋白を共存させるのが望ましい。こ
の蛋白としては例えばＢＳＡ、ＨＳＡ、ゼラチン等が挙
げられる。蛋白濃度は０．０５〜２．０％（Ｗ／Ｖ）の
範囲で使用することが好ましく、特にＢＳＡを０．１〜
１．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で使用することが好ましい。
せるために、適当な蛋白を共存させるのが望ましい。こ
の蛋白としては例えばＢＳＡ、ＨＳＡ、ゼラチン等が挙
げられる。蛋白濃度は０．０５〜２．０％（Ｗ／Ｖ）の
範囲で使用することが好ましく、特にＢＳＡを０．１〜
１．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で使用することが好ましい。
【００２９】また、必要に応じて、イオン強度を調整す
るためにＮａＣｌ、ＫＣｌ等の塩類を、好ましくは１０
〜３００mMの濃度範囲で、更には細菌の発生を防止する
ために、クロルヘキシジン、ＮａＮ3 等の防腐剤を添加
することができる。
るためにＮａＣｌ、ＫＣｌ等の塩類を、好ましくは１０
〜３００mMの濃度範囲で、更には細菌の発生を防止する
ために、クロルヘキシジン、ＮａＮ3 等の防腐剤を添加
することができる。
【００３０】二段階で免疫反応を行う場合、他方の抗ア
ポＢ抗体、抗アポ（ａ）抗体、抗アポＡ−Ｉ抗体や抗ア
ポＡ−II抗体と抗原とを反応させる段階は、使用する抗
体を不溶化抗体又は標識抗体のいずれに用いても、免疫
反応を最適なpH６〜９に保つことができれば特に緩衝剤
の種類は問わない。
ポＢ抗体、抗アポ（ａ）抗体、抗アポＡ−Ｉ抗体や抗ア
ポＡ−II抗体と抗原とを反応させる段階は、使用する抗
体を不溶化抗体又は標識抗体のいずれに用いても、免疫
反応を最適なpH６〜９に保つことができれば特に緩衝剤
の種類は問わない。
【００３１】そして、このようにして得られた複合体中
の標識活性を測定すれば生体試料中の変性リポプロテイ
ンの量を測定することができる。
の標識活性を測定すれば生体試料中の変性リポプロテイ
ンの量を測定することができる。
【００３２】
【発明の効果】本発明は、生体中に存在する変性リポプ
ロテインのリポプロテイン粒子内部に隠蔽された変性部
位をリポプロテイン粒子表面に露出させて抗変性リポプ
ロテイン抗体と反応させることに成功し、これによって
生体中の変性リポプロテインを正確に測定することを可
能にしたものである。
ロテインのリポプロテイン粒子内部に隠蔽された変性部
位をリポプロテイン粒子表面に露出させて抗変性リポプ
ロテイン抗体と反応させることに成功し、これによって
生体中の変性リポプロテインを正確に測定することを可
能にしたものである。
【００３３】
【実施例】次に実施例を挙げて説明する。尚抗ヒトＭＤ
Ａ化ＬＤＬモノクローナル抗体Ｎｏ．２９２２５は特開
平４−１７３０９６号の実施例１に記載のものを使用し
た。
Ａ化ＬＤＬモノクローナル抗体Ｎｏ．２９２２５は特開
平４−１７３０９６号の実施例１に記載のものを使用し
た。
【００３４】実施例１ ＳＤＳのＭＤＡ化ＬＤＬ測定系に及ぼす効果：まず、抗
ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体Ｎｏ．２９２２
５を１ml当たり１６μg となるように、リン酸緩衝液
（pH７．２）−生理食塩水（以下ＰＢＳ）にて調製後、
マイクロプレートに１００μl ／ウェルずつ分注し、４
℃で一晩静置して固定化した。次いで、精製水でよく洗
浄後、４％スキムミルクを含むＰＢＳ中にて、４℃で一
晩ブロッキングしたものを抗体結合プレートとして反応
に供した。
ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体Ｎｏ．２９２２
５を１ml当たり１６μg となるように、リン酸緩衝液
（pH７．２）−生理食塩水（以下ＰＢＳ）にて調製後、
マイクロプレートに１００μl ／ウェルずつ分注し、４
℃で一晩静置して固定化した。次いで、精製水でよく洗
浄後、４％スキムミルクを含むＰＢＳ中にて、４℃で一
晩ブロッキングしたものを抗体結合プレートとして反応
に供した。
【００３５】測定操作は、ＳＤＳを０、０．７５、２．
２５、３．７５及び５．２５mMの濃度でそれぞれ添加し
た０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、７５mM Ｎａ
Ｃｌ及び０．１％ＮａＮ3 を含む２５mMグリシン（pH
９．０）（以下ＳＤＳ含有ＢＳＡ−Ｇｌｙ）をそれぞれ
１００μl ／ウェルずつ加え、更に、健常人血清をＢＳ
Ａ−Ｇｌｙで、２００倍から３２００倍まで５段階希釈
したものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始し
た。３７℃で１時間の反応後、よく洗浄し、次いでβ−
ガラクトシダーゼ標識抗ヒトアポＢモノクローナル抗体
液を１００μl ずつ分注し、３７℃で１時間反応させ
た。よく洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドを基質として酵素反応を３７℃で行い、１
時間後に０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3液をそれぞれ１００μl
ずつ加えて、反応を停止させた後、波長４１４nmの吸光
度を測定した。
２５、３．７５及び５．２５mMの濃度でそれぞれ添加し
た０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、７５mM Ｎａ
Ｃｌ及び０．１％ＮａＮ3 を含む２５mMグリシン（pH
９．０）（以下ＳＤＳ含有ＢＳＡ−Ｇｌｙ）をそれぞれ
１００μl ／ウェルずつ加え、更に、健常人血清をＢＳ
Ａ−Ｇｌｙで、２００倍から３２００倍まで５段階希釈
したものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始し
た。３７℃で１時間の反応後、よく洗浄し、次いでβ−
ガラクトシダーゼ標識抗ヒトアポＢモノクローナル抗体
液を１００μl ずつ分注し、３７℃で１時間反応させ
た。よく洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドを基質として酵素反応を３７℃で行い、１
時間後に０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3液をそれぞれ１００μl
ずつ加えて、反応を停止させた後、波長４１４nmの吸光
度を測定した。
【００３６】その結果は図１に示すとおりであり、ＳＤ
Ｓ無添加の反応系では、全く血清中のＭＤＡ化ＬＤＬが
検出されないのに対して、ＳＤＳを反応系に添加するこ
とによって、血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定することが
できる。
Ｓ無添加の反応系では、全く血清中のＭＤＡ化ＬＤＬが
検出されないのに対して、ＳＤＳを反応系に添加するこ
とによって、血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定することが
できる。
【００３７】実施例２ ＭＤＡ化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いたＭＤＡ
化ＬＤＬ測定系の特異性確認：ＨＳＡのＭＤＡ化反応
は、特開平４−１７３０９６号の実施例１の方法に準じ
て、ＨＳＡ及びＭＤＡを５０mMリン酸緩衝液（pH６）中
に最終濃度がそれぞれ３mg／ml及び１６．７mMとなるよ
うに溶解し、２５℃下５時間反応させる。反応液は４℃
に冷却して反応を停止させ、１００μＭ ＥＤＴＡ含有
のＰＢＳで、４℃下、透析したものをＭＤＡ化ＨＳＡと
して使用した。また、実施例１と同様の方法で調製した
抗体結合プレートを反応に供した。反応に供したサンプ
ルは、健常人血清を予め０．５％ＢＳＡ、１５０mM Ｎ
ａＣｌ及び０．０５％ＮａＮ3 を含む２５mMリン酸緩衝
液（pH７．２）（以下ＢＳＡ−ＰＢＳ）で、３２００倍
希釈したものと、ＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡを０、１、
１０、１００μg ／mlの濃度になるように調製したＢＳ
Ａ−ＰＢＳとを１：１の割合でそれぞれ混合して調製し
た。
化ＬＤＬ測定系の特異性確認：ＨＳＡのＭＤＡ化反応
は、特開平４−１７３０９６号の実施例１の方法に準じ
て、ＨＳＡ及びＭＤＡを５０mMリン酸緩衝液（pH６）中
に最終濃度がそれぞれ３mg／ml及び１６．７mMとなるよ
うに溶解し、２５℃下５時間反応させる。反応液は４℃
に冷却して反応を停止させ、１００μＭ ＥＤＴＡ含有
のＰＢＳで、４℃下、透析したものをＭＤＡ化ＨＳＡと
して使用した。また、実施例１と同様の方法で調製した
抗体結合プレートを反応に供した。反応に供したサンプ
ルは、健常人血清を予め０．５％ＢＳＡ、１５０mM Ｎ
ａＣｌ及び０．０５％ＮａＮ3 を含む２５mMリン酸緩衝
液（pH７．２）（以下ＢＳＡ−ＰＢＳ）で、３２００倍
希釈したものと、ＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡを０、１、
１０、１００μg ／mlの濃度になるように調製したＢＳ
Ａ−ＰＢＳとを１：１の割合でそれぞれ混合して調製し
た。
【００３８】測定操作は、２．５mM ＳＤＳ含有のＢＳ
Ａ−ＰＢＳを１００μl ／ウェルずつ抗体結合プレート
に添加後、上記のようにして調製したサンプルをそれぞ
れ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。以下、実施例
１の操作法に従って、測定を行った。
Ａ−ＰＢＳを１００μl ／ウェルずつ抗体結合プレート
に添加後、上記のようにして調製したサンプルをそれぞ
れ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。以下、実施例
１の操作法に従って、測定を行った。
【００３９】本実施例は、ＭＤＡ化ＨＳＡがプレートに
固相化した抗ＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体と反応
する性質を利用して、当該測定法で検出されているもの
が、血液中のＭＤＡ化ＬＤＬであるならば、該ＭＤＡ化
ＬＤＬが反応系に添加したＭＤＡ化ＨＳＡと競合阻害を
受けることを示すためのものである。その結果は図２に
示すとおりであり、ＨＳＡの添加では反応に影響を与え
ないのに対して、ＭＤＡ化ＨＳＡを添加することによっ
て、ＭＤＡ化ＨＳＡの濃度依存的に反応の阻害が認めら
れたため、当該測定法は血液中のＭＤＡ化ＬＤＬを特異
的に測定していることを示している。
固相化した抗ＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体と反応
する性質を利用して、当該測定法で検出されているもの
が、血液中のＭＤＡ化ＬＤＬであるならば、該ＭＤＡ化
ＬＤＬが反応系に添加したＭＤＡ化ＨＳＡと競合阻害を
受けることを示すためのものである。その結果は図２に
示すとおりであり、ＨＳＡの添加では反応に影響を与え
ないのに対して、ＭＤＡ化ＨＳＡを添加することによっ
て、ＭＤＡ化ＨＳＡの濃度依存的に反応の阻害が認めら
れたため、当該測定法は血液中のＭＤＡ化ＬＤＬを特異
的に測定していることを示している。
【００４０】実施例３ リポタンパク分画との反応性：まず、ヒトの新鮮血清よ
り通常の超遠心分離法によってリポタンパク分画を得
る。すなわち、ヒトの新鮮血清より遠心によってカイロ
ミクロンを除去した後、ＫＢｒの添加によって血清の比
重ｄを調製し、段階的な超遠心分離法によって、ｄ＜
１．０１９、１．０１９＜ｄ＜１．０６３及び１．０６
３＜ｄ＜１．２１に分画し、それぞれ超低比重リポタン
パク（ＶＬＤＬ）＋中間比重リポタンパク（ＩＤＬ）、
ＬＤＬ及び高比重リポタンパク（ＨＤＬ）分画とした。
各リポタンパク分画は、１００μＭ ＥＤＴＡ含有のＰ
ＢＳで透析後、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク定量を行っ
た。また、ＬＤＬの一部は、ＭＤＡ化した（実施例２の
ＨＳＡのＭＤＡ化と同様の方法でＭＤＡ化ＬＤＬを調製
した）後、各リポタンパク分画と同様に１００μＭ Ｅ
ＤＴＡ含有のＰＢＳで透析し、更にＬｏｗｒｙ法によっ
てタンパク定量を行った。このようにして調製した各リ
ポタンパクは、ＢＳＡ−Ｇｌｙ（実施例１参照）で、Ｍ
ＤＡ化ＬＤＬは、０．０１、０．０４、０．２及び１．
０μg ／mlとなるように、そしてその他のリポタンパク
分画は、０．５、５．０、５０及び５００μg ／mlとな
るように、それぞれ希釈しサンプルとした。
り通常の超遠心分離法によってリポタンパク分画を得
る。すなわち、ヒトの新鮮血清より遠心によってカイロ
ミクロンを除去した後、ＫＢｒの添加によって血清の比
重ｄを調製し、段階的な超遠心分離法によって、ｄ＜
１．０１９、１．０１９＜ｄ＜１．０６３及び１．０６
３＜ｄ＜１．２１に分画し、それぞれ超低比重リポタン
パク（ＶＬＤＬ）＋中間比重リポタンパク（ＩＤＬ）、
ＬＤＬ及び高比重リポタンパク（ＨＤＬ）分画とした。
各リポタンパク分画は、１００μＭ ＥＤＴＡ含有のＰ
ＢＳで透析後、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク定量を行っ
た。また、ＬＤＬの一部は、ＭＤＡ化した（実施例２の
ＨＳＡのＭＤＡ化と同様の方法でＭＤＡ化ＬＤＬを調製
した）後、各リポタンパク分画と同様に１００μＭ Ｅ
ＤＴＡ含有のＰＢＳで透析し、更にＬｏｗｒｙ法によっ
てタンパク定量を行った。このようにして調製した各リ
ポタンパクは、ＢＳＡ−Ｇｌｙ（実施例１参照）で、Ｍ
ＤＡ化ＬＤＬは、０．０１、０．０４、０．２及び１．
０μg ／mlとなるように、そしてその他のリポタンパク
分画は、０．５、５．０、５０及び５００μg ／mlとな
るように、それぞれ希釈しサンプルとした。
【００４１】測定操作は、実施例１と同様の方法で調製
した抗体結合プレートに、３．７５mM ＳＤＳ含有ＢＳ
Ａ−Ｇｌｙを１００μl ／ウェルずつ添加後、上記のよ
うにして調製したサンプルをそれぞれ５０μl ／ウェル
ずつ分注し、反応を開始した。以下、実施例１の操作法
に従って、測定を行った。その結果は図３に示すとおり
であり、ＭＤＡ化ＬＤＬの反応性に比し、アポＢを含む
リポタンパクであるＬＤＬやＶＬＤＬ＋ＩＤＬでさえ、
約１０００分の１程度の反応性しか示さなかった。
した抗体結合プレートに、３．７５mM ＳＤＳ含有ＢＳ
Ａ−Ｇｌｙを１００μl ／ウェルずつ添加後、上記のよ
うにして調製したサンプルをそれぞれ５０μl ／ウェル
ずつ分注し、反応を開始した。以下、実施例１の操作法
に従って、測定を行った。その結果は図３に示すとおり
であり、ＭＤＡ化ＬＤＬの反応性に比し、アポＢを含む
リポタンパクであるＬＤＬやＶＬＤＬ＋ＩＤＬでさえ、
約１０００分の１程度の反応性しか示さなかった。
【００４２】実施例４ 陰イオン性界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン
酸ナトリウムを加えたＭＤＡ化ＬＤＬの測定法：実施例
１と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反応に供
した。測定操作は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウムを８．６mMの濃度で添加した０．１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ（実施例１参照）を１００μl ／ウェルずつ加
え、更に、ヒト血清を０．１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで、
４００倍から３２００倍まで四段階希釈したものをそれ
ぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。以下、実施
例１の操作法に従って、測定を行った。
酸ナトリウムを加えたＭＤＡ化ＬＤＬの測定法：実施例
１と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反応に供
した。測定操作は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウムを８．６mMの濃度で添加した０．１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ（実施例１参照）を１００μl ／ウェルずつ加
え、更に、ヒト血清を０．１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで、
４００倍から３２００倍まで四段階希釈したものをそれ
ぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。以下、実施
例１の操作法に従って、測定を行った。
【００４３】その結果は図４に示すとおりであり、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム無添加の反応系で
は、全く血清中のＭＤＡ化ＬＤＬが検出されないのに対
して、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを反応系
に添加することによって、血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測
定することができる。
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム無添加の反応系で
は、全く血清中のＭＤＡ化ＬＤＬが検出されないのに対
して、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを反応系
に添加することによって、血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測
定することができる。
【００４４】実施例５ 検体として、健常人４９名、糖尿病患者３１名及び動脈
硬化性疾患患者２１名の血清を用い、実施例１の方法に
従って血清中のＭＤＡ化ＬＤＬの量を測定した。すなわ
ち、実施例１と同様の方法で調製した抗体結合プレート
を反応に供した。測定操作は、血清を４０１倍希釈した
もの５０μl と、３．７５mMのＳＤＳ含有ＢＳＡ−Ｇｌ
ｙ １００μl ずつをウェルに加え、以下実施例１の操
作法に従って測定を行った。
硬化性疾患患者２１名の血清を用い、実施例１の方法に
従って血清中のＭＤＡ化ＬＤＬの量を測定した。すなわ
ち、実施例１と同様の方法で調製した抗体結合プレート
を反応に供した。測定操作は、血清を４０１倍希釈した
もの５０μl と、３．７５mMのＳＤＳ含有ＢＳＡ−Ｇｌ
ｙ １００μl ずつをウェルに加え、以下実施例１の操
作法に従って測定を行った。
【００４５】その結果は図５の（１）〜（３）に示すと
おりであり、健常人に比べ糖尿病及び動脈硬化性疾患患
者の血清中にはＭＤＡ化ＬＤＬが多く存在することが明
らかである。
おりであり、健常人に比べ糖尿病及び動脈硬化性疾患患
者の血清中にはＭＤＡ化ＬＤＬが多く存在することが明
らかである。
【００４６】実施例６ ＳＤＳのＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）測定系に及ぼす効果：ま
ず、抗ヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体Ｎ
ｏ．２９２２５（特開平４−１７３０９６号の抗ＭＤＡ
化ＬＤＬモノクローナル抗体に相当する）を１ml当たり
１６μg となるように、リン酸緩衝液（pH７．２）−生
理食塩水（以下ＰＢＳ）にて調製後、マイクロプレート
に１００μl ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩静置して
固定化した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加え
たＰＢＳ（以下ＰＢＳＴ）でよく洗浄後、４％スキムミ
ルクを含むＰＢＳ中にて、４℃で一晩ブロッキングした
ものを抗体結合プレートとして反応に供した。
ず、抗ヒトＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体Ｎ
ｏ．２９２２５（特開平４−１７３０９６号の抗ＭＤＡ
化ＬＤＬモノクローナル抗体に相当する）を１ml当たり
１６μg となるように、リン酸緩衝液（pH７．２）−生
理食塩水（以下ＰＢＳ）にて調製後、マイクロプレート
に１００μl ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩静置して
固定化した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加え
たＰＢＳ（以下ＰＢＳＴ）でよく洗浄後、４％スキムミ
ルクを含むＰＢＳ中にて、４℃で一晩ブロッキングした
ものを抗体結合プレートとして反応に供した。
【００４７】測定操作は、ＳＤＳを０、３．７５、６．
７５、９．７５及び１５．７５mMの濃度でそれぞれ添加
した０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、３０mM Ｎ
ａＣｌ及び０．１％ＮａＮ3 を含む２５mM ＨＥＰＥＳ
（pH７．０）（以下ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ）をそれぞれ１
００μl ／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清をＢＳＡ−
ＨＥＰＥＳで、５０倍から４００倍まで４段階希釈した
ものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。
室温で１時間の反応後、よく洗浄し、次いでβ−ガラク
トシダーゼ標識抗ヒトアポ（ａ）モノクローナル抗体液
を１００μl ずつ分注し、室温で１時間反応させた。よ
く洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを基質として酵素反応を室温で行い、１時間後に
０．１ＭＮａ2ＣＯ3液をそれぞれ１００μl ずつ加え
て、反応を停止する。その後、波長４１４nm（副波長６
９０nm）の吸光度を測定した。
７５、９．７５及び１５．７５mMの濃度でそれぞれ添加
した０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、３０mM Ｎ
ａＣｌ及び０．１％ＮａＮ3 を含む２５mM ＨＥＰＥＳ
（pH７．０）（以下ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ）をそれぞれ１
００μl ／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清をＢＳＡ−
ＨＥＰＥＳで、５０倍から４００倍まで４段階希釈した
ものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。
室温で１時間の反応後、よく洗浄し、次いでβ−ガラク
トシダーゼ標識抗ヒトアポ（ａ）モノクローナル抗体液
を１００μl ずつ分注し、室温で１時間反応させた。よ
く洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを基質として酵素反応を室温で行い、１時間後に
０．１ＭＮａ2ＣＯ3液をそれぞれ１００μl ずつ加え
て、反応を停止する。その後、波長４１４nm（副波長６
９０nm）の吸光度を測定した。
【００４８】その結果は図６に示すとおりであり、ＳＤ
Ｓ未添加の反応系では、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）が検出されないのに対して、ＳＤＳを反応系に添
加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測
定することができる。
Ｓ未添加の反応系では、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）が検出されないのに対して、ＳＤＳを反応系に添
加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測
定することができる。
【００４９】実施例７ ＭＤＡ化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いたＭＤＡ
化Ｌｐ（ａ）測定系の特異性確認：まず、ＨＳＡのＭＤ
Ａ化反応は、ＨＳＡ及びＭＤＡを５０mM酢酸緩衝液（pH
４）中に最終濃度がそれぞれ９mg／ml及び１３３．３mM
となるように溶解し、２５℃下５時間反応させる。反応
液は４℃に冷却して反応を停止させ、３０mM ＮａＣｌ
及び０．１％ＮａＮ3含有の２５mM ＨＥＰＥＳ緩衝液
（pH７）で、４℃下、透析したものをＭＤＡ化ＨＳＡと
して使用した。また、実施例６と同様の方法で調製した
抗体結合プレートを反応に供した。反応に供したサンプ
ルは、ヒト血清を予めＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参
照）で、５０倍希釈したものと、ＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨ
ＳＡを０、１０、１００、５００μg ／mlの濃度になる
ように調製したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳとを１：１の割合で
それぞれ混合して調製した。
化Ｌｐ（ａ）測定系の特異性確認：まず、ＨＳＡのＭＤ
Ａ化反応は、ＨＳＡ及びＭＤＡを５０mM酢酸緩衝液（pH
４）中に最終濃度がそれぞれ９mg／ml及び１３３．３mM
となるように溶解し、２５℃下５時間反応させる。反応
液は４℃に冷却して反応を停止させ、３０mM ＮａＣｌ
及び０．１％ＮａＮ3含有の２５mM ＨＥＰＥＳ緩衝液
（pH７）で、４℃下、透析したものをＭＤＡ化ＨＳＡと
して使用した。また、実施例６と同様の方法で調製した
抗体結合プレートを反応に供した。反応に供したサンプ
ルは、ヒト血清を予めＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参
照）で、５０倍希釈したものと、ＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨ
ＳＡを０、１０、１００、５００μg ／mlの濃度になる
ように調製したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳとを１：１の割合で
それぞれ混合して調製した。
【００５０】測定操作は、６．７５mM ＳＤＳ含有のＢ
ＳＡ−ＨＥＰＥＳを１００μl ／ウェルずつ抗体結合プ
レートに添加後、上記のようにして調製したサンプルを
それぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。室温で
１．５時間の反応後、よく洗浄し、次いでβ−ガラクト
シダーゼ標識抗ヒトアポ（ａ）モノクローナル抗体液を
１００μl ずつ分注し、室温で１．５時間反応させた。
よく洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを基質として酵素反応を室温で行い、１．５時
間後に０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3液をそれぞれ１００μl ず
つ加えて、反応を停止する。その後、波長４１４nm（副
波長６９０nm）の吸光度を測定した。
ＳＡ−ＨＥＰＥＳを１００μl ／ウェルずつ抗体結合プ
レートに添加後、上記のようにして調製したサンプルを
それぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。室温で
１．５時間の反応後、よく洗浄し、次いでβ−ガラクト
シダーゼ標識抗ヒトアポ（ａ）モノクローナル抗体液を
１００μl ずつ分注し、室温で１．５時間反応させた。
よく洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを基質として酵素反応を室温で行い、１．５時
間後に０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3液をそれぞれ１００μl ず
つ加えて、反応を停止する。その後、波長４１４nm（副
波長６９０nm）の吸光度を測定した。
【００５１】本実施例は、ＭＤＡ化ＨＳＡがプレートに
固相化した抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体と
反応する性質を利用して、当該測定法で検出されている
ものが、血液中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）であるならば、該
ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が反応系に添加したＭＤＡ化ＨＳＡ
と競合阻害を受けることを示すためのものである。
固相化した抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体と
反応する性質を利用して、当該測定法で検出されている
ものが、血液中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）であるならば、該
ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が反応系に添加したＭＤＡ化ＨＳＡ
と競合阻害を受けることを示すためのものである。
【００５２】その結果は、図７に示すとおりであり、Ｈ
ＳＡの添加では反応に影響を与えないのに対して、ＭＤ
Ａ化ＨＳＡを添加することによって、ＭＤＡ化ＨＳＡの
濃度依存的に反応の阻害が認められたため、当該測定法
は血液中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を特異的に測定している
ことを示している。
ＳＡの添加では反応に影響を与えないのに対して、ＭＤ
Ａ化ＨＳＡを添加することによって、ＭＤＡ化ＨＳＡの
濃度依存的に反応の阻害が認められたため、当該測定法
は血液中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を特異的に測定している
ことを示している。
【００５３】実施例８ 陰イオン性界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン
酸ナトリウムを加えたＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定法：実
施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反応
に供した。測定操作は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナ
トリウムを０、１、５及び１０mMの濃度でそれぞれ添加
したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参照）を１００μl
／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清をＢＳＡ−ＨＥＰＥ
Ｓで、５０倍から４００倍まで４段階希釈したものをそ
れぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。以下、実
施例７の操作法に従って、測定を行った。
酸ナトリウムを加えたＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定法：実
施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反応
に供した。測定操作は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナ
トリウムを０、１、５及び１０mMの濃度でそれぞれ添加
したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参照）を１００μl
／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清をＢＳＡ−ＨＥＰＥ
Ｓで、５０倍から４００倍まで４段階希釈したものをそ
れぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。以下、実
施例７の操作法に従って、測定を行った。
【００５４】その結果は図８に示すとおりであり、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム未添加の反応系で
は、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が検出されないの
に対して、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを反
応系に添加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）を測定することができる。
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム未添加の反応系で
は、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が検出されないの
に対して、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを反
応系に添加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）を測定することができる。
【００５５】実施例９ 陽イオン性界面活性剤としてセチルトリメチルアンモニ
ウムクロライドを加えたＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定法：
実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反
応に供した。測定操作は、セチルトリメチルアンモニウ
ムクロライドを０、５、１０及び２０mMの濃度でそれぞ
れ添加したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参照）を１０
０μl ／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清をＢＳＡ−Ｈ
ＥＰＥＳで、１００倍から４００倍まで３段階希釈した
ものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。
以下、実施例７の操作法に従って、測定を行った。
ウムクロライドを加えたＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定法：
実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反
応に供した。測定操作は、セチルトリメチルアンモニウ
ムクロライドを０、５、１０及び２０mMの濃度でそれぞ
れ添加したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参照）を１０
０μl ／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清をＢＳＡ−Ｈ
ＥＰＥＳで、１００倍から４００倍まで３段階希釈した
ものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応を開始した。
以下、実施例７の操作法に従って、測定を行った。
【００５６】その結果は図９に示すとおりであり、セチ
ルトリメチルアンモニウムクロライド未添加の反応系で
は、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が検出されないの
に対して、セチルトリメチルアンモニウムクロライドを
反応系に添加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）を測定することができる。
ルトリメチルアンモニウムクロライド未添加の反応系で
は、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が検出されないの
に対して、セチルトリメチルアンモニウムクロライドを
反応系に添加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌｐ
（ａ）を測定することができる。
【００５７】実施例１０ 非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン２級ア
ルキルエーテルを加えたＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定法：
実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反
応に供した。測定操作は、ポリオキシエチレン２級アル
キルエーテルを０、０．０５、０．２及び０．５％の濃
度でそれぞれ添加したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参
照）を１００μl ／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清を
ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳで、３００倍から２７００倍まで３
段階希釈したものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応
を開始した。室温で１．５時間の反応後、よく洗浄し、
次いでβ−ガラクトシダーゼ標識抗ヒトアポ（ａ）モノ
クローナル抗体液を１００μl ずつ分注し、室温で１．
５時間反応させた。よく洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質として酵素反応を室
温で行い、３０分後に０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3液をそれぞ
れ１００μl ずつ加えて、反応を停止する。その後、波
長４１４nm（副波長６９０nm）の吸光度を測定した。
ルキルエーテルを加えたＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の測定法：
実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレートを反
応に供した。測定操作は、ポリオキシエチレン２級アル
キルエーテルを０、０．０５、０．２及び０．５％の濃
度でそれぞれ添加したＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（実施例６参
照）を１００μl ／ウェルずつ加え、更に、ヒト血清を
ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳで、３００倍から２７００倍まで３
段階希釈したものをそれぞれ５０μl ずつ分注し、反応
を開始した。室温で１．５時間の反応後、よく洗浄し、
次いでβ−ガラクトシダーゼ標識抗ヒトアポ（ａ）モノ
クローナル抗体液を１００μl ずつ分注し、室温で１．
５時間反応させた。よく洗浄後、Ｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質として酵素反応を室
温で行い、３０分後に０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3液をそれぞ
れ１００μl ずつ加えて、反応を停止する。その後、波
長４１４nm（副波長６９０nm）の吸光度を測定した。
【００５８】その結果は図１０に示すとおりであり、ポ
リオキシエチレン２級アルキルエーテル未添加の反応系
では、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が検出されない
のに対して、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル
を反応系に添加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌ
ｐ（ａ）を測定することができる。
リオキシエチレン２級アルキルエーテル未添加の反応系
では、全く血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）が検出されない
のに対して、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル
を反応系に添加することによって、血清中のＭＤＡ化Ｌ
ｐ（ａ）を測定することができる。
【００５９】実施例１１ 検体として、健常人２５名、糖尿病患者１３名及び動脈
硬化性疾患患者１０名の血清を用い、実施例７の方法に
従って血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の量を測定した。す
なわち、実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレ
ートを反応に供した。また、測定操作は、血清を５０倍
希釈したものを５０μl と６．７５mMのＳＤＳ含有ＢＳ
Ａ−ＨＥＰＥＳ１００μl ずつをウェルに加え、以下実
施例２の操作法に従って測定を行った。その結果は図１
１の（１）〜（３）に示すとおりであり、健常人に比べ
糖尿病及び動脈硬化性疾患患者の血清中にはＭＤＡ化Ｌ
ｐ（ａ）が多く存在することが明らかである。
硬化性疾患患者１０名の血清を用い、実施例７の方法に
従って血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の量を測定した。す
なわち、実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレ
ートを反応に供した。また、測定操作は、血清を５０倍
希釈したものを５０μl と６．７５mMのＳＤＳ含有ＢＳ
Ａ−ＨＥＰＥＳ１００μl ずつをウェルに加え、以下実
施例２の操作法に従って測定を行った。その結果は図１
１の（１）〜（３）に示すとおりであり、健常人に比べ
糖尿病及び動脈硬化性疾患患者の血清中にはＭＤＡ化Ｌ
ｐ（ａ）が多く存在することが明らかである。
【図１】抗ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体を用
いてヒト血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定する際にＳＤＳ
の測定系に及ぼす効果を示す図である。
いてヒト血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定する際にＳＤＳ
の測定系に及ぼす効果を示す図である。
【図２】ヒト血清とＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡの混合物
に、ＳＤＳの共存下抗ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナ
ル抗体を反応させたときのＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡ濃
度と酵素活性との関係を示す図である。
に、ＳＤＳの共存下抗ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナ
ル抗体を反応させたときのＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡ濃
度と酵素活性との関係を示す図である。
【図３】抗ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体のＭ
ＤＡ化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＨＤＬに
対する反応性を示す図である。
ＤＡ化ＬＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＨＤＬに
対する反応性を示す図である。
【図４】抗ヒトＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナル抗体を用
いて、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの非存在
下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定し
たときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との関係を示
す図である。
いて、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの非存在
下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定し
たときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との関係を示
す図である。
【図５】本発明方法により健常人、糖尿病患者及び動脈
硬化性疾患患者血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定したとき
の、各血清と酵素活性との関係を示す図である。
硬化性疾患患者血清中のＭＤＡ化ＬＤＬを測定したとき
の、各血清と酵素活性との関係を示す図である。
【図６】抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体を用
いてヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測定する際にＳ
ＤＳの測定系に及ぼす効果を示す図である。
いてヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測定する際にＳ
ＤＳの測定系に及ぼす効果を示す図である。
【図７】ヒト血清とＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡの混合物
に、ＳＤＳの共存下抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナ
ル抗体を反応させたときのＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡ濃
度と阻害効果との関係を示す図である。
に、ＳＤＳの共存下抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナ
ル抗体を反応させたときのＭＤＡ化ＨＳＡ又はＨＳＡ濃
度と阻害効果との関係を示す図である。
【図８】抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体を用
いて、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの非存在
下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測
定したときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との関係
を示す図である。
いて、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの非存在
下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測
定したときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との関係
を示す図である。
【図９】抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体を用
いて、セチルトリメチルアンモニウムクロライドの非存
在下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を
測定したときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との関
係を示す図である。
いて、セチルトリメチルアンモニウムクロライドの非存
在下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を
測定したときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との関
係を示す図である。
【図１０】抗ＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体を
用いて、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテルの非
存在下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）
を測定したときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との
関係を示す図である。
用いて、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテルの非
存在下又は共存下に、ヒト血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）
を測定したときの、ヒト血清の希釈倍率と酵素活性との
関係を示す図である。
【図１１】本発明方法により健常人、糖尿病患者及び動
脈硬化性疾患患者血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測定し
たときの、各血清と酵素活性との関係を示す図である。
脈硬化性疾患患者血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）を測定し
たときの、各血清と酵素活性との関係を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５９】実施例１１ 検体として、健常人２５名、糖尿病患者１３名及び動脈
硬化性疾患患者１０名の血清を用い、実施例７の方法に
従って血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の量を測定した。す
なわち、実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレ
ートを反応に供した。また、測定操作は、血清を５０倍
希釈したものを５０μｌと６．７５ｍＭのＳＤＳ含有Ｂ
ＳＡ−ＨＥＰＥＳ１００μｌずつをウェルに加え、以下
実施例７の操作法に従って測定を行った。その結果は図
１１の（１）〜（３）に示すとおりであり、健常人に比
べ糖尿病及び動脈硬化性疾患患者の血清中にはＭＤＡ化
Ｌｐ（ａ）が多く存在することが明らかである。
硬化性疾患患者１０名の血清を用い、実施例７の方法に
従って血清中のＭＤＡ化Ｌｐ（ａ）の量を測定した。す
なわち、実施例６と同様の方法で調製した抗体結合プレ
ートを反応に供した。また、測定操作は、血清を５０倍
希釈したものを５０μｌと６．７５ｍＭのＳＤＳ含有Ｂ
ＳＡ−ＨＥＰＥＳ１００μｌずつをウェルに加え、以下
実施例７の操作法に従って測定を行った。その結果は図
１１の（１）〜（３）に示すとおりであり、健常人に比
べ糖尿病及び動脈硬化性疾患患者の血清中にはＭＤＡ化
Ｌｐ（ａ）が多く存在することが明らかである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 野沢 正之 東京都墨田区業平５−５−12 第一化学薬 品株式会社東京研究所内 (72)発明者 真鍋 満久 東京都墨田区業平５−５−12 第一化学薬 品株式会社東京研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 変性リポプロテイン類を含む生体試料に
変性リポプロテイン類を認識する抗体を反応せしめるに
際し、生体試料中の変性リポプロテイン類の変性部位を
リポプロテイン粒子表面に露出させることを特徴とする
変性リポプロテイン類の測定法。 - 【請求項２】 変性リポプロテイン類の変性部位をリポ
プロテイン粒子表面に露出させる方法が、生体試料と変
性リポプロテイン類を認識する抗体との反応系に界面活
性剤を共存させることである請求項１記載の変性リポプ
ロテイン類の測定法。 - 【請求項３】 変性リポプロテイン類を認識する抗体が
抗マロンジアルデヒド化リポプロテイン類抗体である請
求項１又は２記載の変性リポプロテイン類の測定法。 - 【請求項４】 界面活性剤が陰イオン性界面活性剤であ
る請求項２記載の変性リポプロテイン類の測定法。 - 【請求項５】 陰イオン性界面活性剤がアルキル硫酸塩
である請求項４記載の変性リポプロテイン類の測定法。 - 【請求項６】 変性リポプロテイン類が、変性低比重リ
ポプロテイン、変性リポプロテインスモールａ及び変性
高比重リポプロテインから選ばれるものである請求項１
〜５のいずれかの項記載の変性リポプロテイン類の測定
法。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP19027994A JP3356556B2 (ja) | 1993-10-22 | 1994-08-12 | 変性リポプロテイン類の測定法 |
| DE69419577T DE69419577T2 (de) | 1993-10-22 | 1994-10-19 | Bestimmung von denaturierten Lipoproteinen |
| AU75923/94A AU674446B2 (en) | 1993-10-22 | 1994-10-19 | Assay of denatured lipoproteins |
| AT94116477T ATE182407T1 (de) | 1993-10-22 | 1994-10-19 | Bestimmung von denaturierten lipoproteinen |
| EP94116477A EP0650055B1 (en) | 1993-10-22 | 1994-10-19 | Assay of denatured lipoproteins |
| US08/949,911 US6248545B1 (en) | 1993-10-22 | 1997-10-14 | Assay of denatured lipoproteins |
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|---|---|---|---|
| JP26480993 | 1993-10-22 | ||
| JP5-264809 | 1993-10-22 | ||
| JP6-181329 | 1994-08-02 | ||
| JP18132994 | 1994-08-02 | ||
| JP19027994A JP3356556B2 (ja) | 1993-10-22 | 1994-08-12 | 変性リポプロテイン類の測定法 |
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| EP (1) | EP0650055B1 (ja) |
| JP (1) | JP3356556B2 (ja) |
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Cited By (3)
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| US20080302666A1 (en) * | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Benner W Henry | Apparatus for differential charged-particle mobility |
| US9354200B1 (en) | 2008-08-07 | 2016-05-31 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Detection apparatus for differential-charged particle mobility analyzer |
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| CN117192134A (zh) * | 2023-09-14 | 2023-12-08 | 宁波美康盛德生物科技有限公司 | 一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒、检测方法 |
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| JP2949354B2 (ja) * | 1990-02-22 | 1999-09-13 | 株式会社日本抗体研究所 | 変性リポタンパクの測定法及びこれに用いるキット |
| CA2079880A1 (en) * | 1990-04-24 | 1991-10-25 | William E. Van Nostrand | Purification, detection and methods of use of protease nexin-2 |
| JP3115587B2 (ja) * | 1990-11-07 | 2000-12-11 | 第一化学薬品株式会社 | モノクローナル抗体及びマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクの測定法 |
| US5744318A (en) * | 1994-12-30 | 1998-04-28 | Alteon Inc. | Monoclonal antibody for the detection of advanced glycosylation endproducts in biological samples |
-
1994
- 1994-08-12 JP JP19027994A patent/JP3356556B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-19 AT AT94116477T patent/ATE182407T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-19 DE DE69419577T patent/DE69419577T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-19 AU AU75923/94A patent/AU674446B2/en not_active Ceased
- 1994-10-19 EP EP94116477A patent/EP0650055B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-10-14 US US08/949,911 patent/US6248545B1/en not_active Expired - Lifetime
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| US6248545B1 (en) | 2001-06-19 |
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| EP0650055B1 (en) | 1999-07-21 |
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