JPH08103298A - コレステロールの高感度定量法および定量用試薬 - Google Patents
コレステロールの高感度定量法および定量用試薬Info
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- JPH08103298A JPH08103298A JP26458194A JP26458194A JPH08103298A JP H08103298 A JPH08103298 A JP H08103298A JP 26458194 A JP26458194 A JP 26458194A JP 26458194 A JP26458194 A JP 26458194A JP H08103298 A JPH08103298 A JP H08103298A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】簡便で、特殊な装置を必要とせず、更には汎用
の自動分析装置にも適用可能な、コレステロールの高感
度定量方法とそれに用いる定量用試薬キットを提供。 【構成】コレステロールを含有する試料と、コレステ
ロールデヒドロゲナーゼと、酸化型補酵素Ａ及び還
元型補酵素Ｂとを反応させて、酵素サイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって生成する酸化型補酵素Ａの
還元型生成物の増加の程度、又は、該反応によって消費
される還元型補酵素Ｂの減少の程度を測定し、その測定
結果に基づいて試料中のコレステロール量を定量するこ
とを特徴とするコレステロールの高感度定量法及び上記
〜を含んでなることを特徴とするコレステロールの
高感度定量用試薬キット。
の自動分析装置にも適用可能な、コレステロールの高感
度定量方法とそれに用いる定量用試薬キットを提供。 【構成】コレステロールを含有する試料と、コレステ
ロールデヒドロゲナーゼと、酸化型補酵素Ａ及び還
元型補酵素Ｂとを反応させて、酵素サイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって生成する酸化型補酵素Ａの
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結果に基づいて試料中のコレステロール量を定量するこ
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〜を含んでなることを特徴とするコレステロールの
高感度定量用試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野で有用なコレステロールの高感度定量法に関する
ものである。
の分野で有用なコレステロールの高感度定量法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】生体中のコレステロールは主に肝臓で合
成され、血中では血清蛋白と結合し、リポ蛋白となって
存在している。血清中のコレステロールの濃度は肝及び
腸管におけるコレステロールの生成及び異化や血中リポ
蛋白代謝と密接に関係しており、血清コレステロールの
測定は動脈硬化症、糖尿病、肝疾患等の診断及び治療の
経過観察に必須の検査となっている。
成され、血中では血清蛋白と結合し、リポ蛋白となって
存在している。血清中のコレステロールの濃度は肝及び
腸管におけるコレステロールの生成及び異化や血中リポ
蛋白代謝と密接に関係しており、血清コレステロールの
測定は動脈硬化症、糖尿病、肝疾患等の診断及び治療の
経過観察に必須の検査となっている。
【０００３】従来コレステロールの測定法としては１）
Ａｂｅｌｌらの方法（Standard methods of Clinical C
hemistry, Vol.2,p26,1958）、o-フタルアルデヒド法
（Anal.Biochem,29,143,1969）等の化学法、２）コレス
テロールオキシダーゼを用いた酵素法（Clin.Chem.20,4
70,1974）、３）コレステロールデヒドロゲナーゼを用
いた酵素法（特公平2-49720号公報）等が用いられてき
たが、１）の化学法は硫酸等の強酸を使用しなければな
らないことや操作が煩雑であることなど問題があるた
め、現在では温和な条件下で実施可能で、自動分析装置
への適用が可能な酵素法が主流となっている。
Ａｂｅｌｌらの方法（Standard methods of Clinical C
hemistry, Vol.2,p26,1958）、o-フタルアルデヒド法
（Anal.Biochem,29,143,1969）等の化学法、２）コレス
テロールオキシダーゼを用いた酵素法（Clin.Chem.20,4
70,1974）、３）コレステロールデヒドロゲナーゼを用
いた酵素法（特公平2-49720号公報）等が用いられてき
たが、１）の化学法は硫酸等の強酸を使用しなければな
らないことや操作が煩雑であることなど問題があるた
め、現在では温和な条件下で実施可能で、自動分析装置
への適用が可能な酵素法が主流となっている。
【０００４】しかし、２）のコレステロールオキシダー
ゼを用いた方法は、現在酵素法としてもっとも汎用され
ている方法であるものの、反応生成物である過酸化水素
を、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬による呈色反
応に導き、この呈色度を測定するため血清中に含まれる
還元性物質による負の影響をまぬがれない。
ゼを用いた方法は、現在酵素法としてもっとも汎用され
ている方法であるものの、反応生成物である過酸化水素
を、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬による呈色反
応に導き、この呈色度を測定するため血清中に含まれる
還元性物質による負の影響をまぬがれない。
【０００５】また、２）及び３）の方法ともに測定感度
は生成する色素あるいはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分子吸光係数
によって左右されるため、低濃度のコレステロールの検
出には限界があるという問題がある。
は生成する色素あるいはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分子吸光係数
によって左右されるため、低濃度のコレステロールの検
出には限界があるという問題がある。
【０００６】ところが、血清に抗ヒトアポＡ−Iモノク
ローナル抗体と抗ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗
体とを反応させた際に、そのいずれの抗体にも反応しな
いリポ蛋白分画が存在することが確認され、これは、動
脈硬化との関係が明らかにされているレムナントリポ蛋
白と類似性が多く認められることから remunant likepa
rticle : ＲＬＰと呼ばれている。近年レムナントリポ
蛋白の動態を知る上で簡易的な方法として、このＲＬＰ
中のコレステロール濃度を測定することの意義が注目さ
れている（動脈硬化 Vol.20,79,1992）。しかし血清中
のＲＬＰ−コレステロールの濃度は正常値が５mg/dl以
下（前出文献）と血清中の総コレステロールの正常値
（130〜250mg/dl）あるいは遊離型のコレステロールの
正常値（50〜80mg/dl）（臨床検査法提要改訂第２８
版，VIIー63〜69 金原出版（株））に比べて極めて微量
であり、従来のコレステロールオキシダーゼあるいはコ
レステロールデヒドロゲナーゼを用いた分光光度計によ
る測定では検出感度が十分と言えるものではなかった。
ローナル抗体と抗ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗
体とを反応させた際に、そのいずれの抗体にも反応しな
いリポ蛋白分画が存在することが確認され、これは、動
脈硬化との関係が明らかにされているレムナントリポ蛋
白と類似性が多く認められることから remunant likepa
rticle : ＲＬＰと呼ばれている。近年レムナントリポ
蛋白の動態を知る上で簡易的な方法として、このＲＬＰ
中のコレステロール濃度を測定することの意義が注目さ
れている（動脈硬化 Vol.20,79,1992）。しかし血清中
のＲＬＰ−コレステロールの濃度は正常値が５mg/dl以
下（前出文献）と血清中の総コレステロールの正常値
（130〜250mg/dl）あるいは遊離型のコレステロールの
正常値（50〜80mg/dl）（臨床検査法提要改訂第２８
版，VIIー63〜69 金原出版（株））に比べて極めて微量
であり、従来のコレステロールオキシダーゼあるいはコ
レステロールデヒドロゲナーゼを用いた分光光度計によ
る測定では検出感度が十分と言えるものではなかった。
【０００７】尚、高感度のコレステロール測定法として
は試料に酸化型ＮＡＤ存在下でコレステロールデヒドロ
ゲナーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨを蛍光光度計を
用いて定量するという方法が報告されている（特開平3ー
201998号公報）。しかしながら、この蛍光分析法も特殊
な測定装置が必要である等の理由から臨床検査等の汎用
検査に適したものとは言えない。
は試料に酸化型ＮＡＤ存在下でコレステロールデヒドロ
ゲナーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨを蛍光光度計を
用いて定量するという方法が報告されている（特開平3ー
201998号公報）。しかしながら、この蛍光分析法も特殊
な測定装置が必要である等の理由から臨床検査等の汎用
検査に適したものとは言えない。
【０００８】一方、酵素法によって微量の物質を高感度
に定量する方法としては、いわゆる酵素サイクリングを
利用した定量法が知られており、特開平3-224498号公
報、特開平3-251196号公報等により各種デヒドロゲナー
ゼ及びＮＡＤ（Ｐ）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類を共存さ
せ、デヒドロゲナーゼの可逆反応を利用した酵素サイク
リング法による定量法が報告されている。しかしなが
ら、コレステロールデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイ
クリング法によりコレステロールを高感度に定量する方
法についてはこれまでに報告はない。
に定量する方法としては、いわゆる酵素サイクリングを
利用した定量法が知られており、特開平3-224498号公
報、特開平3-251196号公報等により各種デヒドロゲナー
ゼ及びＮＡＤ（Ｐ）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類を共存さ
せ、デヒドロゲナーゼの可逆反応を利用した酵素サイク
リング法による定量法が報告されている。しかしなが
ら、コレステロールデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイ
クリング法によりコレステロールを高感度に定量する方
法についてはこれまでに報告はない。
【０００９】
【発明の目的】本発明は上記した如き状況に鑑みなされ
たもので、簡便で、特殊な装置を必要とせず、更には汎
用の自動分析装置にも適用可能なコレステロールの高感
度定量方法及び定量用試薬キットを提供することをその
目的とする。
たもので、簡便で、特殊な装置を必要とせず、更には汎
用の自動分析装置にも適用可能なコレステロールの高感
度定量方法及び定量用試薬キットを提供することをその
目的とする。
【００１０】
【発明の構成】本発明は、コレステロールを含有する試
料と、コレステロールデヒドロゲナーゼと、酸化型補酵
素Ａ及び還元型補酵素Ｂとを反応させて、下記式１
料と、コレステロールデヒドロゲナーゼと、酸化型補酵
素Ａ及び還元型補酵素Ｂとを反応させて、下記式１
【式２】 ［式中、酸化型補酵素ＡはチオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ
類、ＮＡＤ類またはＮＡＤＰ類の酸化型を示す。また、
還元型補酵素Ｂは酸化型補酵素Ａが酸化型チオＮＡＤ類
または酸化型チオＮＡＤＰ類のときは還元型ＮＡＤ類ま
たは還元型ＮＡＤＰ類を示し、酸化型補酵素Ａが酸化型
ＮＡＤ類または酸化型ＮＡＤＰ類のときは還元型チオＮ
ＡＤ類または還元型チオＮＡＤＰ類を示す。］で表わさ
れるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって生
成する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の増加の程度、又
は、該反応によって消費される還元型補酵素Ｂの減少の
程度を測定し、その測定結果に基づいて試料中のコレス
テロール量を定量することを特徴とするコレステロール
の高感度定量法の発明である。また、本発明は、試料が
予めコレステロールエステラーゼ処理されているもので
あるか、または、コレステロールエステラーゼ共存下に
式１のサイクリング反応を行わせることを特徴とするコ
レステロールの高感度定量法の発明である。更に、本発
明は、コレステロールデヒドロゲナーゼ、酸化型補
酵素Ａ、及び還元型補酵素Ｂ、（但し、酸化型補酵素
Ａ及び還元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含んでなるこ
とを特徴とするコレステロール高感度定量用試薬キット
の発明である。更にまた、本発明は、コレステロール
エステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、
酸化型補酵素Ａ、及び還元型補酵素Ｂ、（但し、酸化
型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含ん
でなることを特徴とするコレステロール高感度定量用試
薬キットの発明である。
類、ＮＡＤ類またはＮＡＤＰ類の酸化型を示す。また、
還元型補酵素Ｂは酸化型補酵素Ａが酸化型チオＮＡＤ類
または酸化型チオＮＡＤＰ類のときは還元型ＮＡＤ類ま
たは還元型ＮＡＤＰ類を示し、酸化型補酵素Ａが酸化型
ＮＡＤ類または酸化型ＮＡＤＰ類のときは還元型チオＮ
ＡＤ類または還元型チオＮＡＤＰ類を示す。］で表わさ
れるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって生
成する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の増加の程度、又
は、該反応によって消費される還元型補酵素Ｂの減少の
程度を測定し、その測定結果に基づいて試料中のコレス
テロール量を定量することを特徴とするコレステロール
の高感度定量法の発明である。また、本発明は、試料が
予めコレステロールエステラーゼ処理されているもので
あるか、または、コレステロールエステラーゼ共存下に
式１のサイクリング反応を行わせることを特徴とするコ
レステロールの高感度定量法の発明である。更に、本発
明は、コレステロールデヒドロゲナーゼ、酸化型補
酵素Ａ、及び還元型補酵素Ｂ、（但し、酸化型補酵素
Ａ及び還元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含んでなるこ
とを特徴とするコレステロール高感度定量用試薬キット
の発明である。更にまた、本発明は、コレステロール
エステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、
酸化型補酵素Ａ、及び還元型補酵素Ｂ、（但し、酸化
型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含ん
でなることを特徴とするコレステロール高感度定量用試
薬キットの発明である。
【００１１】即ち、本発明者らは、コレステロールを高
感度に定量する方法について鋭意研究を重ねた結果、コ
レステロールを含有する試料に、コレステロールデヒド
ロゲナーゼ、酸化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂを反応
させ、上記式１で表される酵素サイクリング反応を行わ
せ、該反応によって生成する補酵素Ａの還元型生成物量
（生成物が還元型チオＮＡＤ類又は還元型チオＮＡＤＰ
類の場合は４００ｎｍ付近、還元型ＮＡＤ類又は還元型
ＮＡＤＰ類の場合は３４０ｎｍ付近の吸収上昇）または
該反応によって消費される還元型補酵素Ｂの量（還元型
補酵素Ｂが還元型ＮＡＤ類又は還元型ＮＡＤＰ類の場合
は３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ類又は還元型チオ
ＮＡＤＰ類の場合は４００ｎｍ付近の吸収の減少）を測
定することによりコレステロールを高感度に定量し得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
感度に定量する方法について鋭意研究を重ねた結果、コ
レステロールを含有する試料に、コレステロールデヒド
ロゲナーゼ、酸化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂを反応
させ、上記式１で表される酵素サイクリング反応を行わ
せ、該反応によって生成する補酵素Ａの還元型生成物量
（生成物が還元型チオＮＡＤ類又は還元型チオＮＡＤＰ
類の場合は４００ｎｍ付近、還元型ＮＡＤ類又は還元型
ＮＡＤＰ類の場合は３４０ｎｍ付近の吸収上昇）または
該反応によって消費される還元型補酵素Ｂの量（還元型
補酵素Ｂが還元型ＮＡＤ類又は還元型ＮＡＤＰ類の場合
は３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ類又は還元型チオ
ＮＡＤＰ類の場合は４００ｎｍ付近の吸収の減少）を測
定することによりコレステロールを高感度に定量し得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】本発明において用いられるコレステロール
デヒドロゲナーゼは上記式１で表わされる酵素サイクリ
ング反応に使用可能なものであればどのようなものでも
良く、特に限定されない。また、その由来も特に限定さ
れず、公知のもの（例えば、温血動物肝由来、嫌気性微
生物由来、好気性微生物由来のもの等、より具体的には
天野製薬（株）より販売されているNocardia属由来のも
の等）は全て用いることができる。
デヒドロゲナーゼは上記式１で表わされる酵素サイクリ
ング反応に使用可能なものであればどのようなものでも
良く、特に限定されない。また、その由来も特に限定さ
れず、公知のもの（例えば、温血動物肝由来、嫌気性微
生物由来、好気性微生物由来のもの等、より具体的には
天野製薬（株）より販売されているNocardia属由来のも
の等）は全て用いることができる。
【００１３】本発明において使用される酸化型補酵素
Ａ、還元型補酵素Ｂ及びコレステロールデヒドロゲナー
ゼの反応液中の濃度は、測定対象のコレステロールの検
量範囲をどの程度に設定するかによって若干異なり、特
に限定されないが、酸化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂ
の反応液中の濃度としては通常0.01〜50mM、好ましくは
0.05〜10mMの範囲から、また、コレステロールデヒドロ
ゲナーゼの反応液中の濃度としては通常0.5〜500U/ml、
好ましくは２〜100U/mlの範囲から適宜選択される。
Ａ、還元型補酵素Ｂ及びコレステロールデヒドロゲナー
ゼの反応液中の濃度は、測定対象のコレステロールの検
量範囲をどの程度に設定するかによって若干異なり、特
に限定されないが、酸化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂ
の反応液中の濃度としては通常0.01〜50mM、好ましくは
0.05〜10mMの範囲から、また、コレステロールデヒドロ
ゲナーゼの反応液中の濃度としては通常0.5〜500U/ml、
好ましくは２〜100U/mlの範囲から適宜選択される。
【００１４】本発明の定量法において用いられる試液中
には、酸化型補酵素Ａ、還元型補酵素Ｂ、コレステロー
ルデヒドロゲナーゼ以外に、通常この分野で用いられる
試薬類、例えば、緩衝剤、反応促進剤、酵素活性賦活
剤、防腐剤等が含まれていても良いことは言うまでもな
い。例えば、反応pHを一定に保つための緩衝剤として
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸、
リン酸塩、グッド緩衝剤等一般にこの分野で汎用されて
いるものが使用できる。本発明の定量法を実施する際の
pH範囲は７〜11好ましくは８〜10であり、また、反応温
度については特に制限はないが、一般に酵素反応を行う
のに適した温度、例えば20〜40℃が好ましい。また酵素
法による脂質の測定では反応促進剤として界面活性剤が
通常用いられているが、本発明の組成物においても従来
のコレステロール測定試薬等で用いられている界面活性
剤を使用することができる。
には、酸化型補酵素Ａ、還元型補酵素Ｂ、コレステロー
ルデヒドロゲナーゼ以外に、通常この分野で用いられる
試薬類、例えば、緩衝剤、反応促進剤、酵素活性賦活
剤、防腐剤等が含まれていても良いことは言うまでもな
い。例えば、反応pHを一定に保つための緩衝剤として
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸、
リン酸塩、グッド緩衝剤等一般にこの分野で汎用されて
いるものが使用できる。本発明の定量法を実施する際の
pH範囲は７〜11好ましくは８〜10であり、また、反応温
度については特に制限はないが、一般に酵素反応を行う
のに適した温度、例えば20〜40℃が好ましい。また酵素
法による脂質の測定では反応促進剤として界面活性剤が
通常用いられているが、本発明の組成物においても従来
のコレステロール測定試薬等で用いられている界面活性
剤を使用することができる。
【００１５】本発明の定量法によるコレステロールの定
量は具体的には例えば以下のように行えば良い。
量は具体的には例えば以下のように行えば良い。
【００１６】コレステロールを含有する検体と、酸化型
補酵素Ａ、還元型補酵素Ｂ及びコレステロールデヒドロ
ゲナーゼ、要すれば界面活性剤を含む緩衝液とを混合
し、常記した如き反応条件で反応を行い、反応液中に生
成する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量を単位時間当
りの吸光度の増加量として測定するか、あるいは反応に
より消費される還元型補酵素Ｂの量を単位時間当りの吸
光度の減少量として測定し、得られた測定値を、予めコ
レステロール濃度既知の検体により得られたコレステロ
ール濃度と単位時間当りの吸光度変化量との関係を示す
検量線にあてはめることにより目的の検体中のコレステ
ロール濃度を求めることができる。尚、本発明の方法に
よるコレステロールの測定法としては、上記した如き反
応を行い、反応開始一定時間後に反応停止剤（例えばタ
ンパク質変性剤等）により反応を停止し、その後に、反
応液中に生成した酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量、
あるいは反応により消費された還元型補酵素Ｂの量に由
来する吸光度変化を測定し、その測定値を利用する所謂
レイトアンドエンド法等によっても測定可能であること
は言うまでもない。
補酵素Ａ、還元型補酵素Ｂ及びコレステロールデヒドロ
ゲナーゼ、要すれば界面活性剤を含む緩衝液とを混合
し、常記した如き反応条件で反応を行い、反応液中に生
成する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量を単位時間当
りの吸光度の増加量として測定するか、あるいは反応に
より消費される還元型補酵素Ｂの量を単位時間当りの吸
光度の減少量として測定し、得られた測定値を、予めコ
レステロール濃度既知の検体により得られたコレステロ
ール濃度と単位時間当りの吸光度変化量との関係を示す
検量線にあてはめることにより目的の検体中のコレステ
ロール濃度を求めることができる。尚、本発明の方法に
よるコレステロールの測定法としては、上記した如き反
応を行い、反応開始一定時間後に反応停止剤（例えばタ
ンパク質変性剤等）により反応を停止し、その後に、反
応液中に生成した酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量、
あるいは反応により消費された還元型補酵素Ｂの量に由
来する吸光度変化を測定し、その測定値を利用する所謂
レイトアンドエンド法等によっても測定可能であること
は言うまでもない。
【００１７】また、還元型チオＮＡＤ類及び還元型チオ
ＮＡＤＰ類は400nm付近に吸収極大をもち、還元型ＮＡ
Ｄ類及び還元型ＮＡＤＰ類は340nm付近に吸収極大をも
っている。従って、酸化型補酵素Ａの還元型生成物の増
加量を測定する場合、該還元型生成物が、還元型チオＮ
ＡＤ類及び還元型チオＮＡＤＰ類の場合は、400nm付近
の吸光度の増加を、還元型ＮＡＤ類及び還元型ＮＡＤＰ
類の場合は、340nm付近の吸光度の増加を測定すれば良
く、同様に、還元型補酵素Ｂの消費量を測定する場合、
還元型補酵素Ｂが、還元型チオＮＡＤ類及び還元型チオ
ＮＡＤＰ類の場合は、400nm付近の吸光度の減少を、還
元型ＮＡＤ類及び還元型ＮＡＤＰ類の場合は、340nm付
近の吸光度の減少を測定すればよい。
ＮＡＤＰ類は400nm付近に吸収極大をもち、還元型ＮＡ
Ｄ類及び還元型ＮＡＤＰ類は340nm付近に吸収極大をも
っている。従って、酸化型補酵素Ａの還元型生成物の増
加量を測定する場合、該還元型生成物が、還元型チオＮ
ＡＤ類及び還元型チオＮＡＤＰ類の場合は、400nm付近
の吸光度の増加を、還元型ＮＡＤ類及び還元型ＮＡＤＰ
類の場合は、340nm付近の吸光度の増加を測定すれば良
く、同様に、還元型補酵素Ｂの消費量を測定する場合、
還元型補酵素Ｂが、還元型チオＮＡＤ類及び還元型チオ
ＮＡＤＰ類の場合は、400nm付近の吸光度の減少を、還
元型ＮＡＤ類及び還元型ＮＡＤＰ類の場合は、340nm付
近の吸光度の減少を測定すればよい。
【００１８】また、測定対象物にエステル型コレステロ
ールが含まれている場合には、例えば試料を予めコレス
テロールエステラーゼ処理しておくか、或いは上記式１
の反応を行わせる際にコレステロールエステラーゼを共
存させておくことによりエステル型コレステロールをコ
レステロールとするか、更にまた、試料をアルカリ性エ
タノール等によりアルカリ処理し、エステル型コレステ
ロールをコレステロールとすれば本発明の方法により測
定することができる。本発明において用いられるコレス
テロールエステラーゼは、少なくともエステル型コレス
テロールを基質としてコレステロールを生成する反応を
なすものであればどのようなものでも良く、特に限定さ
れない。また、その由来も特に限定されず、公知のもの
（例えば、ほ乳動物膵臓由来、微生物由来のもの等、よ
り具体的にはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙより販売されている牛膵臓由来のものや、天野製薬
（株）より販売されているPseudomonas属由来のもの
等）は全て用いることができる。また、コレステロール
エステラーゼの反応液中の濃度は、特に限定されない
が、通常0.01〜100U/ml、好ましくは0.05〜50U/mlの範
囲から適宜選択される。
ールが含まれている場合には、例えば試料を予めコレス
テロールエステラーゼ処理しておくか、或いは上記式１
の反応を行わせる際にコレステロールエステラーゼを共
存させておくことによりエステル型コレステロールをコ
レステロールとするか、更にまた、試料をアルカリ性エ
タノール等によりアルカリ処理し、エステル型コレステ
ロールをコレステロールとすれば本発明の方法により測
定することができる。本発明において用いられるコレス
テロールエステラーゼは、少なくともエステル型コレス
テロールを基質としてコレステロールを生成する反応を
なすものであればどのようなものでも良く、特に限定さ
れない。また、その由来も特に限定されず、公知のもの
（例えば、ほ乳動物膵臓由来、微生物由来のもの等、よ
り具体的にはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙより販売されている牛膵臓由来のものや、天野製薬
（株）より販売されているPseudomonas属由来のもの
等）は全て用いることができる。また、コレステロール
エステラーゼの反応液中の濃度は、特に限定されない
が、通常0.01〜100U/ml、好ましくは0.05〜50U/mlの範
囲から適宜選択される。
【００１９】本発明の試薬キットは、上記コレステロー
ルの高感度定量法を実施するために使用されるもので、
コレステロールデヒドロゲナーゼ、酸化型補酵素Ａ
及び還元型補酵素Ｂ（但し、酸化型補酵素ＡはチオＮ
ＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類またはＮＡＤＰ類の
酸化型を示し、還元型補酵素Ｂは酸化型補酵素Ａが酸化
型チオＮＡＤ類または酸化型チオＮＡＤＰ類のときは還
元型ＮＡＤ類または還元型ＮＡＤＰ類を示すか、または
酸化型補酵素Ａが酸化型ＮＡＤ類または酸化型ＮＡＤＰ
類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型チオＮＡＤ
Ｐ類を示す。）を含んでなるもの、又は、コレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナー
ゼ、酸化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂ（但し、酸
化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含
んでなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、
具体例等については上で述べた通りである。
ルの高感度定量法を実施するために使用されるもので、
コレステロールデヒドロゲナーゼ、酸化型補酵素Ａ
及び還元型補酵素Ｂ（但し、酸化型補酵素ＡはチオＮ
ＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類またはＮＡＤＰ類の
酸化型を示し、還元型補酵素Ｂは酸化型補酵素Ａが酸化
型チオＮＡＤ類または酸化型チオＮＡＤＰ類のときは還
元型ＮＡＤ類または還元型ＮＡＤＰ類を示すか、または
酸化型補酵素Ａが酸化型ＮＡＤ類または酸化型ＮＡＤＰ
類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型チオＮＡＤ
Ｐ類を示す。）を含んでなるもの、又は、コレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナー
ゼ、酸化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂ（但し、酸
化型補酵素Ａ及び還元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含
んでなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、
具体例等については上で述べた通りである。
【００２０】以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら
により何ら限定されるものではない。
により何ら限定されるものではない。
【００２１】
実施例１． 〈試薬〉 Ｒ１ ５ｍＭ 酸化型チオＮＡＤ（オリエンタル酵母工業（株）製 ） ０．２％ トリトンＸ−１００ ｉｎ ４８ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０） Ｒ２ ５ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業（株）製） ０．２％ トリトンＸ−１００ ５０Ｕ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ （天野製薬（株）製 Nocardia sp.由来） ｉｎ ４８ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）
【００２２】〈操作方法〉０〜10mg/dlのコレステロー
ルを含有する試料５ulにＲ１を180ul添加し、37℃で５
分間加温した後、Ｒ２を180ul添加し24秒後から180秒後
の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nmで測
定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度変化
（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図１に示す。
ルを含有する試料５ulにＲ１を180ul添加し、37℃で５
分間加温した後、Ｒ２を180ul添加し24秒後から180秒後
の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nmで測
定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度変化
（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図１に示す。
【００２３】比較例１． 〈試薬〉実施例１．のＲ２からＮＡＤＨをのぞいた試薬
を調製した。
を調製した。
【００２４】〈操作方法〉０〜10mg/dlのコレステロー
ルを含有する試料５ulにＲ１を180ul添加し、37℃で５
分間加温した後、Ｒ２を180ul添加し37℃ ５分後の吸光
度を試薬盲検の値を対照に主波長405nm、副波長480nmで
測定した。その結果を図２に示す。
ルを含有する試料５ulにＲ１を180ul添加し、37℃で５
分間加温した後、Ｒ２を180ul添加し37℃ ５分後の吸光
度を試薬盲検の値を対照に主波長405nm、副波長480nmで
測定した。その結果を図２に示す。
【００２５】図１及び図２から明らかなように本発明に
よる方法では、酵素サイクリングを行わない方法に比べ
はるかに高感度であり、且つコレステロール10mg/dlま
で良好な検量線が得られた。
よる方法では、酵素サイクリングを行わない方法に比べ
はるかに高感度であり、且つコレステロール10mg/dlま
で良好な検量線が得られた。
【００２６】実施例２． 〈試薬〉 Ｒ１ ５ｍＭ 酸化型チオＮＡＤ（オリエンタル酵母工業（株）製 ） ０．２％ トリトンＸ−１００ ５０Ｕ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ （天野製薬（株）製 Nocardia sp.由来） ｉｎ ４８ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０） Ｒ２ ２ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業（株）製） ０．２％ トリトンＸ−１００ ｉｎ ４８ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）
【００２７】〈操作方法〉０〜10mg/dlのコレステロー
ルを含有する試料５ulにＲ１を180ul添加し、37℃で５
分間加温した後、Ｒ２を180ul添加し１分後から４分後
の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nmで測
定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度変化
（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図３に示す。図３
から明らかなように、コレステロール10mg/dlまで良好
な検量線が得られた。
ルを含有する試料５ulにＲ１を180ul添加し、37℃で５
分間加温した後、Ｒ２を180ul添加し１分後から４分後
の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nmで測
定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度変化
（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図３に示す。図３
から明らかなように、コレステロール10mg/dlまで良好
な検量線が得られた。
【００２８】
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、検体中に共
存する還元性物質の影響を受けにくいデヒドロゲナーゼ
反応系を用い、さらに酵素サイクリング反応を利用する
ことによる微量のコレステロールの定量法を提供するも
のであり、本発明を利用することにより、従来法に比較
して微量のコレステロールを精度良く高感度に定量で
き、且つ自動分析装置への適用も可能である。
存する還元性物質の影響を受けにくいデヒドロゲナーゼ
反応系を用い、さらに酵素サイクリング反応を利用する
ことによる微量のコレステロールの定量法を提供するも
のであり、本発明を利用することにより、従来法に比較
して微量のコレステロールを精度良く高感度に定量で
き、且つ自動分析装置への適用も可能である。
【図１】実施例１におけるコレステロール濃度と吸光度
変化の関係を示すグラフ。
変化の関係を示すグラフ。
【図２】比較例１におけるコレステロール濃度と吸光度
の関係を示すグラフ。
の関係を示すグラフ。
【図３】実施例２におけるコレステロール濃度と吸光度
変化の関係を示すグラフ。
変化の関係を示すグラフ。
【手続補正書】
【提出日】平成７年１０月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】コレステロールを含有する検体と、酸化型
補酵素Ａ、還元型補酵素Ｂ及びコレステロールデヒドロ
ゲナーゼ、要すれば界面活性剤を含む緩衝液とを混合
し、上記した如き反応条件で反応を行い、反応液中に生
成する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量を単位時間当
りの吸光度の増加量として測定するか、あるいは反応に
より消費される還元型補酵素Ｂの量を単位時間当りの吸
光度の減少量として測定し、得られた測定値を、予めコ
レステロール濃度既知の検体により得られたコレステロ
ール濃度と単位時間当りの吸光度変化量との関係を示す
検量線にあてはめることにより目的の検体中のコレステ
ロール濃度を求めることができる。尚、本発明の方法に
よるコレステロールの測定法としては、上記した如き反
応を行い、反応開始一定時間後に反応停止剤（例えばタ
ンパク質変性剤等）により反応を停止し、その後に、反
応液中に生成した酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量、
あるいは反応により消費された還元型補酵素Ｂの量に由
来する吸光度変化を測定し、その測定値を利用する所謂
レイトアンドエンド法等によっても測定可能であること
は言うまでもない。
補酵素Ａ、還元型補酵素Ｂ及びコレステロールデヒドロ
ゲナーゼ、要すれば界面活性剤を含む緩衝液とを混合
し、上記した如き反応条件で反応を行い、反応液中に生
成する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量を単位時間当
りの吸光度の増加量として測定するか、あるいは反応に
より消費される還元型補酵素Ｂの量を単位時間当りの吸
光度の減少量として測定し、得られた測定値を、予めコ
レステロール濃度既知の検体により得られたコレステロ
ール濃度と単位時間当りの吸光度変化量との関係を示す
検量線にあてはめることにより目的の検体中のコレステ
ロール濃度を求めることができる。尚、本発明の方法に
よるコレステロールの測定法としては、上記した如き反
応を行い、反応開始一定時間後に反応停止剤（例えばタ
ンパク質変性剤等）により反応を停止し、その後に、反
応液中に生成した酸化型補酵素Ａの還元型生成物の量、
あるいは反応により消費された還元型補酵素Ｂの量に由
来する吸光度変化を測定し、その測定値を利用する所謂
レイトアンドエンド法等によっても測定可能であること
は言うまでもない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】〈操作方法〉０〜10mg/dlのコレステロー
ルを含有する試料５μlにＲ１を180μl添加し、37℃で
５分間加温した後、Ｒ２を180μl添加し24秒後から180
秒後の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nm
で測定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度
変化（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図１に示す。
ルを含有する試料５μlにＲ１を180μl添加し、37℃で
５分間加温した後、Ｒ２を180μl添加し24秒後から180
秒後の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nm
で測定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度
変化（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図１に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】〈操作方法〉０〜10mg/dlのコレステロー
ルを含有する試料５μlにＲ１を180μl添加し、37℃で
５分間加温した後、Ｒ２を180μl添加し37℃ ５分後の
吸光度を試薬盲検の値を対照に主波長405nm、副波長480
nmで測定した。その結果を図２に示す。
ルを含有する試料５μlにＲ１を180μl添加し、37℃で
５分間加温した後、Ｒ２を180μl添加し37℃ ５分後の
吸光度を試薬盲検の値を対照に主波長405nm、副波長480
nmで測定した。その結果を図２に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】〈操作方法〉０〜10mg/dlのコレステロー
ルを含有する試料５μlにＲ１を180μl添加し、37℃で
５分間加温した後、Ｒ２を180μl添加し１分後から４分
後の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nmで
測定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度変
化（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図３に示す。図
３から明らかなように、コレステロール10mg/dlまで良
好な検量線が得られた。
ルを含有する試料５μlにＲ１を180μl添加し、37℃で
５分間加温した後、Ｒ２を180μl添加し１分後から４分
後の37℃での吸光度上昇を主波長405nm、副波長480nmで
測定し、試薬盲検の値を対照に１分間当たりの吸光度変
化（ΔＥ／min）を求めた。その結果を図３に示す。図
３から明らかなように、コレステロール10mg/dlまで良
好な検量線が得られた。
Claims (8)
- 【請求項１】 コレステロールを含有する試料と、コレ
ステロールデヒドロゲナーゼと、酸化型補酵素Ａ及び還
元型補酵素Ｂとを反応させて、下記式１ 【式１】 ［式中、酸化型補酵素Ａはチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ類という）、チオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類
（以下、チオＮＡＤＰ類という）、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類という）または
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類
（以下、ＮＡＤＰ類という）の酸化型を示す。また、還
元型補酵素Ｂは酸化型補酵素Ａが酸化型チオＮＡＤ類ま
たは酸化型チオＮＡＤＰ類のときは還元型ＮＡＤ類また
は還元型ＮＡＤＰ類を示し、酸化型補酵素Ａが酸化型Ｎ
ＡＤ類または酸化型ＮＡＤＰ類のときは還元型チオＮＡ
Ｄ類または還元型チオＮＡＤＰ類を示す。］で表わされ
るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって生成
する酸化型補酵素Ａの還元型生成物の増加の程度、又
は、該反応によって消費される還元型補酵素Ｂの減少の
程度を測定し、その測定結果に基づいて試料中のコレス
テロール量を定量することを特徴とするコレステロール
の高感度定量法。 - 【請求項２】試料が予めコレステロールエステラーゼ処
理されているものであるか、または、コレステロールエ
ステラーゼ共存下に式１のサイクリング反応を行わせ
る、請求項１に記載の定量法。 - 【請求項３】 チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチ
ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項１
又は２に記載のコレステロールの高感度定量法。 - 【請求項４】 チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）
またはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドホスフェートである請求項１又は２に記載のコレステ
ロールの高感度定量法。 - 【請求項５】 ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒ
ポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる
群より選ばれた補酵素である請求項１又は２に記載のコ
レステロールの高感度定量法。 - 【請求項６】 ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチル
ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレ
オチドホスフェート、およびニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）
からなる群より選ばれた補酵素である請求項１又は２に
記載のコレステロールの高感度定量法。 - 【請求項７】コレステロールデヒドロゲナーゼ、 酸化型補酵素Ａ、 及び還元型補酵素Ｂ、（但し、酸化型補酵素Ａ及び還
元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含んでなることを特徴
とするコレステロール高感度定量用試薬キット。 - 【請求項８】コレステロールエステラーゼ、 コレステロールデヒドロゲナーゼ、 酸化型補酵素Ａ、 及び還元型補酵素Ｂ、（但し、酸化型補酵素Ａ及び還
元型補酵素Ｂは前記に同じ。）を含んでなることを特徴
とするコレステロール高感度定量用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26458194A JPH08103298A (ja) | 1994-10-04 | 1994-10-04 | コレステロールの高感度定量法および定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26458194A JPH08103298A (ja) | 1994-10-04 | 1994-10-04 | コレステロールの高感度定量法および定量用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08103298A true JPH08103298A (ja) | 1996-04-23 |
Family
ID=17405284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26458194A Withdrawn JPH08103298A (ja) | 1994-10-04 | 1994-10-04 | コレステロールの高感度定量法および定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08103298A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380380B1 (en) * | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
-
1994
- 1994-10-04 JP JP26458194A patent/JPH08103298A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380380B1 (en) * | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020115 |