JPH08107798A - 核酸の定量法 - Google Patents
核酸の定量法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 定量すべき核酸とは検出できる特徴の少なく
とも一つが異なっている既知核酸分子所定量を内部標準
として検体に増幅段階の前に添加する核酸増幅を利用す
る検体中核酸の定量法であって、精密度が高く、再現性
の良い定量法を提供する。 【解決手段】 相互にも、定量すべき核酸とも検出可能
な特徴の少なくとも１種が異なる核酸分子少なくとも２
種の既知量を内部標準として核酸増幅の前に検体に添加
し、増幅した検体と得られた標準核酸との量を測定し、
得られた測定値から検体中に最初に存在していた定量す
べき核酸の量を決定する。
とも一つが異なっている既知核酸分子所定量を内部標準
として検体に増幅段階の前に添加する核酸増幅を利用す
る検体中核酸の定量法であって、精密度が高く、再現性
の良い定量法を提供する。 【解決手段】 相互にも、定量すべき核酸とも検出可能
な特徴の少なくとも１種が異なる核酸分子少なくとも２
種の既知量を内部標準として核酸増幅の前に検体に添加
し、増幅した検体と得られた標準核酸との量を測定し、
得られた測定値から検体中に最初に存在していた定量す
べき核酸の量を決定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸増幅を応用する標本
中の核酸定量方法に関し、ここに、増幅段階の前に、既
知量の既知核酸分子を内部標準として標本に添加するも
のであって、その標準核酸分子は検出しうる特徴の少な
くとも１個が定量すべき核酸とは異なるものである。
中の核酸定量方法に関し、ここに、増幅段階の前に、既
知量の既知核酸分子を内部標準として標本に添加するも
のであって、その標準核酸分子は検出しうる特徴の少な
くとも１個が定量すべき核酸とは異なるものである。
【０００２】
【従来の技術】種々のウイルス病診断のためには、現
在、著しく信頼性の低い検出法しか存在しない。利用さ
れているＥＬＩＳＡ法では血液中を循環している僅かな
ウイルス蛋白質を検出できないので疾患の早期にはウイ
ルス感染を診断することが不可能なこともしばしばであ
る。しかしながら、治療が成功するためには感染を可能
な限り早期に認識することに大きな価値がある。さら
に、ウイルス感染症では血液中のウイルス濃度は疾患の
経過または治療の影響で変動する。このためウイルス粒
子の量があまりに減少するかもしれないので、常法の感
度は十分でないと思われる。このような場合、ＥＬＩＳ
Ａ検査で誤まった陰性結果を得ると疾患の経過に誤った
印象を与えることになると思われる。
在、著しく信頼性の低い検出法しか存在しない。利用さ
れているＥＬＩＳＡ法では血液中を循環している僅かな
ウイルス蛋白質を検出できないので疾患の早期にはウイ
ルス感染を診断することが不可能なこともしばしばであ
る。しかしながら、治療が成功するためには感染を可能
な限り早期に認識することに大きな価値がある。さら
に、ウイルス感染症では血液中のウイルス濃度は疾患の
経過または治療の影響で変動する。このためウイルス粒
子の量があまりに減少するかもしれないので、常法の感
度は十分でないと思われる。このような場合、ＥＬＩＳ
Ａ検査で誤まった陰性結果を得ると疾患の経過に誤った
印象を与えることになると思われる。
【０００３】核酸検出の別の側面はバイオ技術的生産物
の品質管理である。一方では、感染性ウイルスから得て
ワクチンとして利用する免疫原性ウイルス蛋白質処理物
では夾雑するウイルス核酸の量を検討しなければならな
い。他方では、ウイルス発現系によって製造した組み換
え生成物では発現系から誘導されるかもしれない夾雑核
酸について検討する。この場合、許容される夾雑核酸の
限界値は世界保健機構は用量当り１００ｐｇ、米国食品
医薬局は用量当り１０ｐｇであると規定している。
の品質管理である。一方では、感染性ウイルスから得て
ワクチンとして利用する免疫原性ウイルス蛋白質処理物
では夾雑するウイルス核酸の量を検討しなければならな
い。他方では、ウイルス発現系によって製造した組み換
え生成物では発現系から誘導されるかもしれない夾雑核
酸について検討する。この場合、許容される夾雑核酸の
限界値は世界保健機構は用量当り１００ｐｇ、米国食品
医薬局は用量当り１０ｐｇであると規定している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ技術の発達によ
り核酸検出用の検出限界を劇的に低下させることが可能
になった。しかしながら、殊に低濃度の核酸について
は、結果の再現性は未だに大きな課題を提起している。
この理由は、一方では、技術が完成されていないこと、
および他方では検出すべき核酸のコピー数がしばしば非
常に僅かなことである。この低濃度範囲での定量的測定
において、分析誤差は当然、殊に劇しい効果を現す。
り核酸検出用の検出限界を劇的に低下させることが可能
になった。しかしながら、殊に低濃度の核酸について
は、結果の再現性は未だに大きな課題を提起している。
この理由は、一方では、技術が完成されていないこと、
および他方では検出すべき核酸のコピー数がしばしば非
常に僅かなことである。この低濃度範囲での定量的測定
において、分析誤差は当然、殊に劇しい効果を現す。
【０００５】反応器によってＰＣＲの効率が頻繁に変り
うることは、当業者にはよく知られている。この効率の
差は１０5もの差となって結果に現れてくることになろ
う。このように、公知方法で得られる定量データの再現
性は未だに不十分である。
うることは、当業者にはよく知られている。この効率の
差は１０5もの差となって結果に現れてくることになろ
う。このように、公知方法で得られる定量データの再現
性は未だに不十分である。
【０００６】ＰＣＲの再現性を改善するために、Ｇｉｌ
ｌｉｌａｎｄ（ＰＮＡＳ、８７巻：２７２５頁（１９９
０年））は競合的ＰＣＲ法を開発している。ＤＮＡ量を
測定するために内部標準の系統的希釈を用い、検体と同
時に増幅する。ＰＣＲは飽和まで実施する。これで臭化
エチジウム染色法によるＰＣＲ生成物の検出も可能にな
る。続いて、ＰＣＲ生成物をゲル上で分離し、検体のコ
ピー数を標準希釈系のコピー数と比較して、これで検体
の濃度を推測する。検体の濃度と標準の濃度が反応器中
で約１：１の比率で増幅されたとすれば、この推測濃度
は正確であると思われる。転じて、これは標準希釈の数
を多く使うほど、ＤＮＡ量の測定がより精密になること
を意味する。
ｌｉｌａｎｄ（ＰＮＡＳ、８７巻：２７２５頁（１９９
０年））は競合的ＰＣＲ法を開発している。ＤＮＡ量を
測定するために内部標準の系統的希釈を用い、検体と同
時に増幅する。ＰＣＲは飽和まで実施する。これで臭化
エチジウム染色法によるＰＣＲ生成物の検出も可能にな
る。続いて、ＰＣＲ生成物をゲル上で分離し、検体のコ
ピー数を標準希釈系のコピー数と比較して、これで検体
の濃度を推測する。検体の濃度と標準の濃度が反応器中
で約１：１の比率で増幅されたとすれば、この推測濃度
は正確であると思われる。転じて、これは標準希釈の数
を多く使うほど、ＤＮＡ量の測定がより精密になること
を意味する。
【０００７】Ｗａｎｇなど（ＰＮＡＳ、８６巻：９７１
７頁（１９８９年））はＲＮＡの定量法を提唱してい
る。このＰＣＲは指数相で停止する。様々な標準濃度で
の増幅により著者は補正曲線を提出している。指数的反
応相にあるので、ＰＣＲ生成物の数はＰＣＲサイクル数
とＲＮＡの濃度とに直接的に比例して増加し、この補正
曲線は直線となり、この直線から増幅した検体の濃度を
最終的に測定することができる。この方法の欠点はＰＣ
Ｒ生成物の最終濃度が比較的に低く、そのために検出用
には高感度の検出法を利用しなければならないことであ
る。Ｗａｎｇなどは放射能標識ヌクレオチドを使用して
いる。
７頁（１９８９年））はＲＮＡの定量法を提唱してい
る。このＰＣＲは指数相で停止する。様々な標準濃度で
の増幅により著者は補正曲線を提出している。指数的反
応相にあるので、ＰＣＲ生成物の数はＰＣＲサイクル数
とＲＮＡの濃度とに直接的に比例して増加し、この補正
曲線は直線となり、この直線から増幅した検体の濃度を
最終的に測定することができる。この方法の欠点はＰＣ
Ｒ生成物の最終濃度が比較的に低く、そのために検出用
には高感度の検出法を利用しなければならないことであ
る。Ｗａｎｇなどは放射能標識ヌクレオチドを使用して
いる。
【０００８】ＷＯ９３／２３５７３によれば、コピー数
が１０2から１０8までの範囲のウイルスＲＮＡ濃度は競
合的ＰＣＲにより測定できる。ＨＩＶ−１の多重測定で
は、この方法の再現性は変動係数０．２６±０．１５で
あると報告されている。この場合、検体対標準の濃度比
率が１：１に近づくほど測定はさらに精密になる。この
方法では標準ＲＮＡは検体を前処理した後になって添加
することに注目すべきである。しかしながら、検体を抽
出する時、ＲＮＡの５０％までは失われうる。最終的に
は、検体に最初に含まれていたＲＮＡの量は抽出後に添
加される標準に基づいて算出する。こうして、検体当り
にありうるコピー数として最低の限界が測定される。こ
れでは抽出による損失部分は考慮に入れることはできな
い。
が１０2から１０8までの範囲のウイルスＲＮＡ濃度は競
合的ＰＣＲにより測定できる。ＨＩＶ−１の多重測定で
は、この方法の再現性は変動係数０．２６±０．１５で
あると報告されている。この場合、検体対標準の濃度比
率が１：１に近づくほど測定はさらに精密になる。この
方法では標準ＲＮＡは検体を前処理した後になって添加
することに注目すべきである。しかしながら、検体を抽
出する時、ＲＮＡの５０％までは失われうる。最終的に
は、検体に最初に含まれていたＲＮＡの量は抽出後に添
加される標準に基づいて算出する。こうして、検体当り
にありうるコピー数として最低の限界が測定される。こ
れでは抽出による損失部分は考慮に入れることはできな
い。
【０００９】ＷＯ９４／２０６４０もＨＩＶ感染患者血
漿中のＨＩＶゲノム１００コピーの測定が可能であると
して競合的ＲＴ・ＰＣＲ法を記載している。それでも１
００コピーまたはそれ以下の範囲についてはＨＩＶゲノ
ムの濃度測定は推測によってのみ行っている。１０4か
ら１０6コピーまでの範囲のコピー数の測定での標準偏
差は同一血漿から三重測定を行えば２２％であり、同一
ＲＮＡ処理物の二重測定の場合には標準偏差は１５％で
ある（ＷＯ９４／２０６４０、２２頁、８〜１３行）。
ここでも、ＲＮＡの抽出効率は考慮していない。検出さ
れたＨＩＶ・ＲＮＡのコピー数は、４．４×１０3から
９．３×１０6までの範囲にある。患者一人については
１００コピーが「外挿値」であるとして記載されてい
る。そこで、低コピー数（１０3またはそれ以下）の正
確な測定のためにはこの方法が適当かどうかは全く問題
である。
漿中のＨＩＶゲノム１００コピーの測定が可能であると
して競合的ＲＴ・ＰＣＲ法を記載している。それでも１
００コピーまたはそれ以下の範囲についてはＨＩＶゲノ
ムの濃度測定は推測によってのみ行っている。１０4か
ら１０6コピーまでの範囲のコピー数の測定での標準偏
差は同一血漿から三重測定を行えば２２％であり、同一
ＲＮＡ処理物の二重測定の場合には標準偏差は１５％で
ある（ＷＯ９４／２０６４０、２２頁、８〜１３行）。
ここでも、ＲＮＡの抽出効率は考慮していない。検出さ
れたＨＩＶ・ＲＮＡのコピー数は、４．４×１０3から
９．３×１０6までの範囲にある。患者一人については
１００コピーが「外挿値」であるとして記載されてい
る。そこで、低コピー数（１０3またはそれ以下）の正
確な測定のためにはこの方法が適当かどうかは全く問題
である。
【００１０】少量のＰＣＲ生成物を検出するための改良
がＰｏｒｃｈｅｒなど（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
１３巻：１０６頁（１９９２年））によって開発され、
螢光標識プライマーおよび自動レーザー螢光ＤＮＡシー
クエンサーでのＰＣＲ生成物定量を利用している。
がＰｏｒｃｈｅｒなど（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
１３巻：１０６頁（１９９２年））によって開発され、
螢光標識プライマーおよび自動レーザー螢光ＤＮＡシー
クエンサーでのＰＣＲ生成物定量を利用している。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は検体中に存在す
る核酸の量に関して、とりわけ再現性良く非常に精密な
情報をもたらすことができ、また同時に、定量すべき核
酸の検出限界に関して記述することもできる核酸定量法
の提供を目的とする。
る核酸の量に関して、とりわけ再現性良く非常に精密な
情報をもたらすことができ、また同時に、定量すべき核
酸の検出限界に関して記述することもできる核酸定量法
の提供を目的とする。
【００１２】本発明方法である前記形式の方法は、核酸
増幅前に、相互にも、定量すべき核酸とも検出可能な特
徴少なくとも１種が異なる核酸分子少なくとも２種の既
知量を内部標準として検体に添加し、増幅した検体と標
準核酸との量を測定し、得られた量から検体中に最初に
存在していた核酸の量を決定するという点で特徴付けら
れる。
増幅前に、相互にも、定量すべき核酸とも検出可能な特
徴少なくとも１種が異なる核酸分子少なくとも２種の既
知量を内部標準として検体に添加し、増幅した検体と標
準核酸との量を測定し、得られた量から検体中に最初に
存在していた核酸の量を決定するという点で特徴付けら
れる。
【００１３】本発明方法では、驚くべきことにすべての
型の核酸について非常に正確に定量ができ、さらに再現
性が良い。
型の核酸について非常に正確に定量ができ、さらに再現
性が良い。
【００１４】核酸増幅は原理的に、Ｍｕｌｌｉｓなどが
開発した技術（米国特許４６８３１９５および４６８３
２０２）またはその他の技術に基づく方法であって、た
とえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−
ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）または連結酵素（リガーゼ）−
ＣＲ（ＬＣＲ）を示す。
開発した技術（米国特許４６８３１９５および４６８３
２０２）またはその他の技術に基づく方法であって、た
とえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−
ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）または連結酵素（リガーゼ）−
ＣＲ（ＬＣＲ）を示す。
【００１５】標準核酸は定量すべき核酸とは検出可能な
特徴少なくとも１種が異なり、さらに、同一のプライマ
ーにより増幅されることができるものでなければならな
い。定量すべき核酸とはサイズが異なるか、または独特
な制限切断部位を持っている標準核酸が便利であること
は証明されている。ＤＮＡ量を測定する時には標準核酸
は好ましくはＤＮＡであり、ＲＮＡ量を測定する時には
標準核酸は好ましくはＲＮＡである。標準として好適な
ものは定量すべき核酸とはＰＣＲ生成物において長さで
１％から２０％およびヌクレオチド数で少なくとも３
個、最大５０個違うものである。ＰＣＲ生成物が定量す
べき核酸よりも長い標準核酸を「プラス」（「＋」）標
準と記載し、ＰＣＲ生成物が定量すべき核酸よりも短い
標準核酸を「マイナス」（「−」）標準と記載すること
にする。勿論、標準核酸の精密な配列は判明していなけ
ればならない。
特徴少なくとも１種が異なり、さらに、同一のプライマ
ーにより増幅されることができるものでなければならな
い。定量すべき核酸とはサイズが異なるか、または独特
な制限切断部位を持っている標準核酸が便利であること
は証明されている。ＤＮＡ量を測定する時には標準核酸
は好ましくはＤＮＡであり、ＲＮＡ量を測定する時には
標準核酸は好ましくはＲＮＡである。標準として好適な
ものは定量すべき核酸とはＰＣＲ生成物において長さで
１％から２０％およびヌクレオチド数で少なくとも３
個、最大５０個違うものである。ＰＣＲ生成物が定量す
べき核酸よりも長い標準核酸を「プラス」（「＋」）標
準と記載し、ＰＣＲ生成物が定量すべき核酸よりも短い
標準核酸を「マイナス」（「−」）標準と記載すること
にする。勿論、標準核酸の精密な配列は判明していなけ
ればならない。
【００１６】本発明の方法によれば、好ましくは標準は
いくつかの濃度で使用し、その一つは検出限界の僅かに
上の濃度で添加する。
いくつかの濃度で使用し、その一つは検出限界の僅かに
上の濃度で添加する。
【００１７】増幅過程で使用するプライマーは、好まし
くは増幅核酸の検出限界を増加する基、たとえば螢光基
または放射能活性基または類縁蛋白質と後続検出反応と
で検出できる化学的基（たとえば、ビオチン−アビジ
ン、ＤＩＧ標識その他）を含むが、螢光基を持つプライ
マーは殊に好適である。
くは増幅核酸の検出限界を増加する基、たとえば螢光基
または放射能活性基または類縁蛋白質と後続検出反応と
で検出できる化学的基（たとえば、ビオチン−アビジ
ン、ＤＩＧ標識その他）を含むが、螢光基を持つプライ
マーは殊に好適である。
【００１８】増幅後の核酸量の測定（核酸量とは基本的
にはＤＮＡまたはＲＮＡの量であると理解すべきであっ
て、核酸の量は、たとえば重さ（ｍｇ、μｇ、ｎｇ、ｐ
ｇ）の形で表現しうるし、またはある核酸分子のコピー
数としても示しうる）は種々の方法で実施しうるが、多
くの場合、増幅した定量すべき核酸から増幅した標準核
酸を分離し、分離した核酸の量を個別に測定する段階を
含む。好ましくは、この分離段階はゲル電気泳動または
クロマトグラフィー法から構成しうる。
にはＤＮＡまたはＲＮＡの量であると理解すべきであっ
て、核酸の量は、たとえば重さ（ｍｇ、μｇ、ｎｇ、ｐ
ｇ）の形で表現しうるし、またはある核酸分子のコピー
数としても示しうる）は種々の方法で実施しうるが、多
くの場合、増幅した定量すべき核酸から増幅した標準核
酸を分離し、分離した核酸の量を個別に測定する段階を
含む。好ましくは、この分離段階はゲル電気泳動または
クロマトグラフィー法から構成しうる。
【００１９】自動的で分離と定量との段階を結合した検
出法は殊に適当であることが証明されている。本発明方
法の好適な態様では、増幅した核酸の量の測定を核酸検
出装置、好ましくは螢光感受性核酸検出器を使用して行
うことから構成される。このような核酸検出器の例はレ
ーザー誘発螢光測定装置を持つ自動ＤＮＡシークエンサ
ー（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社のＧｅｎｅ・Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）３７３Ａ）また
はＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動装置である。こ
れら装置によって、長さの違いがｂｐ１個に過ぎない核
酸分子を分離することが可能である。
出法は殊に適当であることが証明されている。本発明方
法の好適な態様では、増幅した核酸の量の測定を核酸検
出装置、好ましくは螢光感受性核酸検出器を使用して行
うことから構成される。このような核酸検出器の例はレ
ーザー誘発螢光測定装置を持つ自動ＤＮＡシークエンサ
ー（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社のＧｅｎｅ・Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）３７３Ａ）また
はＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動装置である。こ
れら装置によって、長さの違いがｂｐ１個に過ぎない核
酸分子を分離することが可能である。
【００２０】Ｇｅｎｅ・Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）の特殊
な長所の一つは一つのレーン上で種々の螢光染料を区別
できることである。これによりゲル上の使えるレーンの
全てを異なる検体に使用できるので多数の検体を一つの
ゲル上で同時に処理できる。さらに、異なる螢光染料で
標識した複数のＰＣＲ生成物を一つのレーン上で分析で
きる（多重ＰＣＲ）。たとえば、検体中の異なる核酸２
種を同時に検出する時には追加的な費用と価格は半分近
くに節約できる。本発明方法をルーチン操作に使用する
時、たとえば血液検体のＨＩＶおよびＨＣＶを検査する
ような時には、このことは殊に有利である。これとは対
照的に、ＰｏｒｃｈｅｒなどがＰＣＲ生成物分析用に使
用した自動レーザー螢光ＤＮＡシークエンサーはレーン
当り螢光染料１種のみ（従ってＤＮＡ１種のみ）が分析
できる。
な長所の一つは一つのレーン上で種々の螢光染料を区別
できることである。これによりゲル上の使えるレーンの
全てを異なる検体に使用できるので多数の検体を一つの
ゲル上で同時に処理できる。さらに、異なる螢光染料で
標識した複数のＰＣＲ生成物を一つのレーン上で分析で
きる（多重ＰＣＲ）。たとえば、検体中の異なる核酸２
種を同時に検出する時には追加的な費用と価格は半分近
くに節約できる。本発明方法をルーチン操作に使用する
時、たとえば血液検体のＨＩＶおよびＨＣＶを検査する
ような時には、このことは殊に有利である。これとは対
照的に、ＰｏｒｃｈｅｒなどがＰＣＲ生成物分析用に使
用した自動レーザー螢光ＤＮＡシークエンサーはレーン
当り螢光染料１種のみ（従ってＤＮＡ１種のみ）が分析
できる。
【００２１】そこで、本発明方法の好適な態様は、得ら
れた増幅検体および標準核酸のいくつかの量を同じ検体
中で多重分析を用いて決定する方法に関する。
れた増幅検体および標準核酸のいくつかの量を同じ検体
中で多重分析を用いて決定する方法に関する。
【００２２】本発明の好適な態様では増幅段階を指数的
生長相の間に停止する。
生長相の間に停止する。
【００２３】そこで、増幅した標準のコピー数の比率は
定量すべき配列のコピー数に直接に比例する。さらに、
単一標準の共増幅によって定量すべき核酸のコピー数を
測定できる。この点で、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法
ではさらに精密な多数の標準が異なる検体について異な
る希釈で使用されるが、本発明方法では異なる標準分子
少なくとも２種またはそれ以上についての一回だけの測
定が検体ごとに必要である点で、頻繁に実用されている
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法よりもずっと有利であ
る。
定量すべき配列のコピー数に直接に比例する。さらに、
単一標準の共増幅によって定量すべき核酸のコピー数を
測定できる。この点で、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法
ではさらに精密な多数の標準が異なる検体について異な
る希釈で使用されるが、本発明方法では異なる標準分子
少なくとも２種またはそれ以上についての一回だけの測
定が検体ごとに必要である点で、頻繁に実用されている
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法よりもずっと有利であ
る。
【００２４】本発明方法の殊に好適な応用分野には微生
物からの核酸の定量があり、好ましくはＨＩＶ、パルボ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣ
Ｖ、バキュロウイルス、アデノウイルス、インフルエン
ザウイルス、ワクチニアウイルス、ボレリア菌種、サル
モネラ菌種または酵母からの核酸である。これら微生物
は病原菌として、またワクチン製造と組み換え蛋白質製
造とでの利用の故に、意味がある。
物からの核酸の定量があり、好ましくはＨＩＶ、パルボ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣ
Ｖ、バキュロウイルス、アデノウイルス、インフルエン
ザウイルス、ワクチニアウイルス、ボレリア菌種、サル
モネラ菌種または酵母からの核酸である。これら微生物
は病原菌として、またワクチン製造と組み換え蛋白質製
造とでの利用の故に、意味がある。
【００２５】殊に、本発明方法はバイオ技術的生産物中
の夾雑物として残留しうるウイルス核酸の定量において
応用する。好ましくは、これらバイオ技術的生成物はバ
イオ技術により感染性ウイルスから得られた免疫原的ウ
イルス蛋白質またはウイルス部分であるか、またはそれ
らはウイルスの発現系を用いた組み換え生成物でありう
るし、また発現系のウイルス核酸を夾雑物を含みうるも
のである。
の夾雑物として残留しうるウイルス核酸の定量において
応用する。好ましくは、これらバイオ技術的生成物はバ
イオ技術により感染性ウイルスから得られた免疫原的ウ
イルス蛋白質またはウイルス部分であるか、またはそれ
らはウイルスの発現系を用いた組み換え生成物でありう
るし、また発現系のウイルス核酸を夾雑物を含みうるも
のである。
【００２６】好ましくは、ウイルス核酸は生物学的検体
中、殊にヒト血漿およびその処理物中で、本発明方法に
従って定量する。本方法により、たとえば感染症の経過
またはワクチン化または治療による処置の監視、をより
よく、さらに精密な方法で監視することができる。
中、殊にヒト血漿およびその処理物中で、本発明方法に
従って定量する。本方法により、たとえば感染症の経過
またはワクチン化または治療による処置の監視、をより
よく、さらに精密な方法で監視することができる。
【００２７】ここでは、本発明方法によりこれらウイル
スの感染量の少なくとも十分の一またはそれ以下の濃度
で病原性ウイルスを測定できることが殊に重要である。
スの感染量の少なくとも十分の一またはそれ以下の濃度
で病原性ウイルスを測定できることが殊に重要である。
【００２８】定量すべき検体の操作法に影響されずに、
検体中核酸のできるだけ精密な定量値を得るために、本
発明の好適な態様に従って検体に標準を、好ましくは抽
出工程の前に、直接添加し、続いて検体核酸と標準核酸
とを同じ操作に付す（共抽出）。これで間違いなく再現
性が増すばかりでなく、さらに検体の操作と無関係な定
量結果を得ることが可能になる。
検体中核酸のできるだけ精密な定量値を得るために、本
発明の好適な態様に従って検体に標準を、好ましくは抽
出工程の前に、直接添加し、続いて検体核酸と標準核酸
とを同じ操作に付す（共抽出）。これで間違いなく再現
性が増すばかりでなく、さらに検体の操作と無関係な定
量結果を得ることが可能になる。
【００２９】本発明の別の側面は標準核酸少なくとも１
種を検出限界より僅かに上の濃度で使用する、ある核酸
の検出限界測定法に関する。
種を検出限界より僅かに上の濃度で使用する、ある核酸
の検出限界測定法に関する。
【００３０】好ましくは、次式に従ってコピー数として
核酸の量を算出する：
核酸の量を算出する：
【数１】 Ｎsample＝Ａsample／Ａstandard×Ｎstandard×Ｆ×Ｄ ［式中、Ａsampleは検体の増幅された核酸のピーク面積
である。Ａstandardは増幅された内部標準のピーク面積
である。Ｎstandardは使用した内部標準のコピー数であ
る。Ｆは抽出容積に対する単位容積の比である。Ｄは
（抽出前に検体を希釈した場合の）希釈係数である］
である。Ａstandardは増幅された内部標準のピーク面積
である。Ｎstandardは使用した内部標準のコピー数であ
る。Ｆは抽出容積に対する単位容積の比である。Ｄは
（抽出前に検体を希釈した場合の）希釈係数である］
【００３１】本発明方法の特別な応用分野で夾雑ウイル
ス核酸を定量する場合、核酸の量をＷＨＯおよびＦＤＡ
の規定に合致させるためにｐｇ／ｍＬで表す。そのため
に、本発明により、次式を使用する：
ス核酸を定量する場合、核酸の量をＷＨＯおよびＦＤＡ
の規定に合致させるためにｐｇ／ｍＬで表す。そのため
に、本発明により、次式を使用する：
【数２】 ｍ（検体）＝Ａs／Ａst×Ｎst×Ｆ１×Ｄ×Ｆ２ ［式中、Ａsは検体のＰＣＲ生成物のピーク面積であ
る。Ａstは標準のＰＣＲ生成物のピーク面積である。Ｎ
stは標準プラスミドのコピー数である。Ｆ１は抽出容積
に対する単位容積の比である。Ｄは検体の希釈係数（要
すれば）である。Ｆ２はｐｇで表したウイルス分子の質
量である（ウイルスＤＮＡの分子量／アボガドロ定
数）］
る。Ａstは標準のＰＣＲ生成物のピーク面積である。Ｎ
stは標準プラスミドのコピー数である。Ｆ１は抽出容積
に対する単位容積の比である。Ｄは検体の希釈係数（要
すれば）である。Ｆ２はｐｇで表したウイルス分子の質
量である（ウイルスＤＮＡの分子量／アボガドロ定
数）］
【００３２】本発明方法によれば様々な濃度の標準少な
くとも２種を使用するので、前記の計算式に従えば検体
濃度に計算値少なくとも２個が得られ、これから最終的
には平均値を算出する。ルーチン的操作法によれば、通
例は各検体につき標準少なくとも２個について２組の分
析を行うので最終的に計算値４個からの平均値をその検
体濃度について算出することができる。
くとも２種を使用するので、前記の計算式に従えば検体
濃度に計算値少なくとも２個が得られ、これから最終的
には平均値を算出する。ルーチン的操作法によれば、通
例は各検体につき標準少なくとも２個について２組の分
析を行うので最終的に計算値４個からの平均値をその検
体濃度について算出することができる。
【００３３】本発明方法は殊に高い再現性によって特徴
付けられる。多重測定から得られる標準偏差は大きくと
も１５％であるが、コピー数が１０2の低濃度範囲では
一般には１０％またはそれ以下である。このきわめて小
さな標準偏差は多重測定では個々の検体および標準がそ
れぞれの時に別々の時に調製され、操作における誤差お
よび検体抽出とＰＣＲとの効率の偏差自体がこれらの標
準偏差に含まれていることを考えると殊に驚くべきこと
である。
付けられる。多重測定から得られる標準偏差は大きくと
も１５％であるが、コピー数が１０2の低濃度範囲では
一般には１０％またはそれ以下である。このきわめて小
さな標準偏差は多重測定では個々の検体および標準がそ
れぞれの時に別々の時に調製され、操作における誤差お
よび検体抽出とＰＣＲとの効率の偏差自体がこれらの標
準偏差に含まれていることを考えると殊に驚くべきこと
である。
【００３４】ＷＯ９３／２３５７３およびＷＯ９４／２
０６４０には検体調製後いくつかの部分に分割し、これ
らの部分を再現性測定に用いて標準偏差０．２６±０．
１５または２２％または１５％が得られたと記載してい
る。そこで、検体抽出またはＲＴ−ＰＣＲの各々に起因
する効率変動はこの標準偏差の測定には含まれないの
で、必然的に歪曲されてはいるが高い再現性を示す。
０６４０には検体調製後いくつかの部分に分割し、これ
らの部分を再現性測定に用いて標準偏差０．２６±０．
１５または２２％または１５％が得られたと記載してい
る。そこで、検体抽出またはＲＴ−ＰＣＲの各々に起因
する効率変動はこの標準偏差の測定には含まれないの
で、必然的に歪曲されてはいるが高い再現性を示す。
【００３５】ＰＣＲの効率は、たとえば増幅すべき核酸
分子の型により影響される。本発明方法がＲＮＡウイル
ス測定に使用される時、逆転写は不完全であり、存在す
るＲＮＡの数％だけが実際に転写されているものと思わ
れるという一般的に公知の問題に直面する。さらに、
「＋」標準と「−」標準との各々の増幅効率は各測定に
おいて相違しうるが、平均値では等しいことが証明され
た。これは測定すべき濃度に変動をもたらす。
分子の型により影響される。本発明方法がＲＮＡウイル
ス測定に使用される時、逆転写は不完全であり、存在す
るＲＮＡの数％だけが実際に転写されているものと思わ
れるという一般的に公知の問題に直面する。さらに、
「＋」標準と「−」標準との各々の増幅効率は各測定に
おいて相違しうるが、平均値では等しいことが証明され
た。これは測定すべき濃度に変動をもたらす。
【００３６】本発明の好適態様に従えば、様々な量の標
準核酸少なくとも２種を増幅前に検体に添加すること
で、得られる情報が増加する。
準核酸少なくとも２種を増幅前に検体に添加すること
で、得られる情報が増加する。
【００３７】検体濃度の測定における他の不正確さを排
除するため、ルーチン操作では検体毎に適量２個を測定
し、標準少なくとも２個を共増幅する。こうして、検体
毎に測定値４個を得て、これから平均値を算出できる。
実施例には本方法の精密性と再現性を明示する。本方法
が広範囲の濃度にわたって再現性が得られることも明示
する。
除するため、ルーチン操作では検体毎に適量２個を測定
し、標準少なくとも２個を共増幅する。こうして、検体
毎に測定値４個を得て、これから平均値を算出できる。
実施例には本方法の精密性と再現性を明示する。本方法
が広範囲の濃度にわたって再現性が得られることも明示
する。
【００３８】本発明方法の好適な態様では、定量すべき
核酸とは長さが違う標準核酸２種の中で、好ましくは１
種は定量すべき核酸より短い標準核酸配列、他種は定量
すべき核酸より長い標準核酸配列を使用する。殊に好適
な長さの相違の範囲は１％と２０％との間である。
核酸とは長さが違う標準核酸２種の中で、好ましくは１
種は定量すべき核酸より短い標準核酸配列、他種は定量
すべき核酸より長い標準核酸配列を使用する。殊に好適
な長さの相違の範囲は１％と２０％との間である。
【００３９】本発明方法のためには一本鎖化した型のＰ
ＣＲに内部標準核酸を添加するのが有利であることが証
明されている。そして、増幅すべき核酸の種々の型に基
づく反応効率の相違がさらに相殺される。
ＣＲに内部標準核酸を添加するのが有利であることが証
明されている。そして、増幅すべき核酸の種々の型に基
づく反応効率の相違がさらに相殺される。
【００４０】核酸の定量化における重要問題は−前述の
とおり−感度と再現性である。本発明方法では１から５
００コピーの範囲の核酸の量が実質的に先行技術に記載
されている方法より精密にそして再現性よく測定するこ
とができる。しかしながら、本方法の再現性の限界には
達していない。
とおり−感度と再現性である。本発明方法では１から５
００コピーの範囲の核酸の量が実質的に先行技術に記載
されている方法より精密にそして再現性よく測定するこ
とができる。しかしながら、本方法の再現性の限界には
達していない。
【００４１】本発明方法の使用範囲は、たとえば、殊に
血液および血液製剤およびバイオ技術生成物のような生
物学的検体の核酸に関する定性的および定量的分析を含
む。別の応用分野の例は診断および／または感染症経過
の監視ならびにワクチン化および療法による処置の監視
である。
血液および血液製剤およびバイオ技術生成物のような生
物学的検体の核酸に関する定性的および定量的分析を含
む。別の応用分野の例は診断および／または感染症経過
の監視ならびにワクチン化および療法による処置の監視
である。
【００４２】本発明の重要な側面は生物学的製剤、殊に
本発明方法で測定して用量当り１０または１００ｐｇの
許容限界またはそれ以下の核酸含量、好ましくは検体当
り１から１００コピーまでの範囲またはそれ以下、すな
わち実質上核酸不含と見做すことができるバイオ技術的
製品に関する。
本発明方法で測定して用量当り１０または１００ｐｇの
許容限界またはそれ以下の核酸含量、好ましくは検体当
り１から１００コピーまでの範囲またはそれ以下、すな
わち実質上核酸不含と見做すことができるバイオ技術的
製品に関する。
【００４３】好適な製品はウイルスおよびｇｐ１６０の
ような細菌蛋白質、組み換え血液因子、血漿蛋白質なら
びにワクチン、殊にヘルペス、インフルエンザ、ＴＢ
Ｅ、パルボまたは肝炎ウイルスに対するワクチンおよび
モノクローナル抗体を含む。
ような細菌蛋白質、組み換え血液因子、血漿蛋白質なら
びにワクチン、殊にヘルペス、インフルエンザ、ＴＢ
Ｅ、パルボまたは肝炎ウイルスに対するワクチンおよび
モノクローナル抗体を含む。
【００４４】別の側面では、本発明は生物学的検体中の
核酸の検出に使用する本発明方法の使用に関する。
核酸の検出に使用する本発明方法の使用に関する。
【００４５】さらに背景として、殊にワクチンまたはバ
イオ技術蛋白質製品の分野における品質管理の問題に直
面している。そこで、霊長類の細胞培養物中に夾雑する
核酸（染色体のＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスのＤＮＡおよ
びＲＮＡ）を測定する時に、もし使用するプライマーが
特異的であれば、生産中の操作によるまたは製品調製中
に生じる夾雑物に本発明方法は対応することができる。
しかしながら、もし組み換え蛋白質生産が、たとえばＣ
ＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（幼若ハ
ムスター腎臓細胞）またはＣＥＣ（ニワトリ胚細胞）の
ような非霊長類の細胞培養物中で行われるなら、検体操
作が起こす夾雑物の問題が除かれるので検出限界は本発
明方法ではずっと低い。ＣＨＯ、ｖｅｒｏ（サル細胞
系）、ＢＨＫ、ＳＫ・Ｈｅｐｌ（ヒト肝臓細胞系）、ハ
イブリドーマまたはＣＥＣ細胞などに由来する核酸につ
いては、これら細胞培養物がワクチン生産においてまた
はバイオ技術生産蛋白質の生産にもっとも普通に使用さ
れるので、本発明の定量法の使用は殊に好適である。
イオ技術蛋白質製品の分野における品質管理の問題に直
面している。そこで、霊長類の細胞培養物中に夾雑する
核酸（染色体のＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスのＤＮＡおよ
びＲＮＡ）を測定する時に、もし使用するプライマーが
特異的であれば、生産中の操作によるまたは製品調製中
に生じる夾雑物に本発明方法は対応することができる。
しかしながら、もし組み換え蛋白質生産が、たとえばＣ
ＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（幼若ハ
ムスター腎臓細胞）またはＣＥＣ（ニワトリ胚細胞）の
ような非霊長類の細胞培養物中で行われるなら、検体操
作が起こす夾雑物の問題が除かれるので検出限界は本発
明方法ではずっと低い。ＣＨＯ、ｖｅｒｏ（サル細胞
系）、ＢＨＫ、ＳＫ・Ｈｅｐｌ（ヒト肝臓細胞系）、ハ
イブリドーマまたはＣＥＣ細胞などに由来する核酸につ
いては、これら細胞培養物がワクチン生産においてまた
はバイオ技術生産蛋白質の生産にもっとも普通に使用さ
れるので、本発明の定量法の使用は殊に好適である。
【００４６】勿論、プライマー対の選択は良い定量結果
を得るためには重要な因子である。そこで本発明は他の
側面において、本方法に使用する下記プライマーに関す
る： ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
を得るためには重要な因子である。そこで本発明は他の
側面において、本方法に使用する下記プライマーに関す
る： ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
【化１】 ＨＡＶ−２１７２：ＨＡＶ２１９６〜２１７２（配列番
号４）
号４）
【化２】 （番号付けはＣｏｈｅｎなど（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による） ＨＣＶＥＸＴ３２：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による） ＨＣＶＥＸＴ３２：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
【化３】 ＨＣＶＰＴ４：ＨＣＶ１５８〜１３９（配列番号６）
【化４】 （番号付けはＨａｎなど（ＰＮＡＳ、８８巻：１７１１
〜１７１５頁（１９９１年）による） ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
〜１７１５頁（１９９１年）による） ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
【化５】 ＨＢＶ−１９６０Ｂ：ＨＢＶ１９８３〜１９６０（配列
番号８）
番号８）
【化６】 （番号付けはＦｕｊｉｙａｍａなど（Ｎｕｃｌｅｉｃ・
Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１１巻：４６０１〜４６１０頁
（１９８３年）による） ｏｐｒｌ−ｒ：ワクチニア８４６２５〜８４６４４（配
列番号９）
Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１１巻：４６０１〜４６１０頁
（１９８３年）による） ｏｐｒｌ−ｒ：ワクチニア８４６２５〜８４６４４（配
列番号９）
【化７】 ｏｐｒｌ−ｆ：ワクチニア８４７６１〜８４７４３（配
列番号１０）
列番号１０）
【化８】 （番号付けはＧｏｅｂｅｌなど（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による） ｇＤ１：ＨＳＶ１３８３６４〜１３８３８１（配列番号
１１）
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による） ｇＤ１：ＨＳＶ１３８３６４〜１３８３８１（配列番号
１１）
【化９】 ｇＤ２Ｒ／Ｂ：ＨＳＶ１３８４７７〜１３８４５６（配
列番号１２）
列番号１２）
【化１０】 （ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．など、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢ
ａｎｋ・ＩＤ・ＨＥ１ＣＧ）
ａｎｋ・ＩＤ・ＨＥ１ＣＧ）
【００４７】また、標準製造用プラスミド、すなわち ｐｇａｇ１（既知ｐＢＳ／ＳＫ-プラスミドおよび多重
クローニング部位のＰｓｔＩとＡｐａＩ部位との間の挿
入から構成され、その挿入部はＲａｔｎｅｒなど（Ｎａ
ｔｕｒｅ、３１３巻：２７７〜２８４頁（１９８５
年））によるＨＩＶ−１配列の１４１７から２００８ま
での塩基対（ｂｐ）を含む） ｐｇａｇ−１５（ｐｇａｇ１からＲａｔｎｅｒなどのＨ
ＩＶ−１配列ｂｐ１５９３から始まる１５ｂｐの欠失で
誘導される） ｐｇａｇ＋１２（ｐｇａｇ１からｂｐ１５９３部位での
１２ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＡＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよびｐＣ
ＲＩＩプラスミドの多重クローニング部位での挿入から
構成され、その挿入部はＣｏｈｅｎなどのｃＤＮＡ配列
のｂｐ２０２０から２２２６までを含む） ｐＨＡＶ−１０ｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからＣｏｈｅｎなど
のＨＡＶ配列のｂｐ２１００から始まる１０ｂｐの欠失
で誘導される） ｐＨＡＶ＋９ｂｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからｂｐ２１００部
位での９ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＣＶ−ｗｔ（既知ｐＢＳ／ＳＫ-プラスミドおよび
このプラスミドのＥｃｏＲＶ部位への挿入から構成さ
れ、その挿入部はＨａｎなどによるｃＤＮＡ配列ｂｐ２
７から３１３までを含む） ｐＨＣＶ−７ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからＨａｎなどによ
るＨＣＶ配列ｂｐ１２６から開始する７ｂｐの欠失から
誘導される） ｐＨＣＶ＋８ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからｂｐ１２６部位
への８ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導され
る） ｐＨＢＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよび挿入
から構成され、その挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどによ
るＨＢＶゲノムのｂｐ１７６３から２０３２を含む） ｐＨＢＶ−９ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからＦｕｊｉｙａｍ
ａなどによるＨＢＶ配列ｂｐ１８６８から開始する９ｂ
ｐの欠失から誘導される） ｐＨＢＶ＋１２ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからｂｐ１８６８
部位への１２ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導
される） ｐＶＶ−ｗｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の既知ｐＴＺ１９
ＲプラスミドおよびこのプラスミドのＰｖｕＩＩ部位２
個の間への挿入から構成され、その挿入部はワクチニア
ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子のｂｐ８３８５５か
ら８４７６１まで（Ｇｏｅｂｅｌなど、１９９０年によ
る）を含む） ＰＶＶ−２１（ｐＶＶ−ｗｔから２１ヌクレオチド（ｂ
ｐ８４７１８から８４７３８まで）の欠失で誘導され
る） ＰＶＶ＋２４（ｐＶＶ−ｗｔから８４７１３部位への２
４ｂｐの挿入で誘導される） ｐＨｅｒｐ（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎ製の既知ｐＣＲＩ
Ｉプラスミドおよび挿入から構成され、その挿入部はＭ
ｃＧｅｏｃｈなど、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＤＥ・
１・ＣＧ１によるＨＳＶゲノムのｂｐ１３８３６４から
１３８７８４までを含む） ｐＨｅｒｐ−９（ｐ−Ｈｅｒｐから９ヌクレオチド（ｂ
ｐ１３８３８８から１３８３９６まで）の欠失で誘導さ
れる） ｐＨｅｒｐ＋１０（ｐ−Ｈｅｒｐからｂｐ１３８４０７
への１０ｂｐの挿入で誘導される）
クローニング部位のＰｓｔＩとＡｐａＩ部位との間の挿
入から構成され、その挿入部はＲａｔｎｅｒなど（Ｎａ
ｔｕｒｅ、３１３巻：２７７〜２８４頁（１９８５
年））によるＨＩＶ−１配列の１４１７から２００８ま
での塩基対（ｂｐ）を含む） ｐｇａｇ−１５（ｐｇａｇ１からＲａｔｎｅｒなどのＨ
ＩＶ−１配列ｂｐ１５９３から始まる１５ｂｐの欠失で
誘導される） ｐｇａｇ＋１２（ｐｇａｇ１からｂｐ１５９３部位での
１２ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＡＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよびｐＣ
ＲＩＩプラスミドの多重クローニング部位での挿入から
構成され、その挿入部はＣｏｈｅｎなどのｃＤＮＡ配列
のｂｐ２０２０から２２２６までを含む） ｐＨＡＶ−１０ｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからＣｏｈｅｎなど
のＨＡＶ配列のｂｐ２１００から始まる１０ｂｐの欠失
で誘導される） ｐＨＡＶ＋９ｂｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからｂｐ２１００部
位での９ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＣＶ−ｗｔ（既知ｐＢＳ／ＳＫ-プラスミドおよび
このプラスミドのＥｃｏＲＶ部位への挿入から構成さ
れ、その挿入部はＨａｎなどによるｃＤＮＡ配列ｂｐ２
７から３１３までを含む） ｐＨＣＶ−７ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからＨａｎなどによ
るＨＣＶ配列ｂｐ１２６から開始する７ｂｐの欠失から
誘導される） ｐＨＣＶ＋８ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからｂｐ１２６部位
への８ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導され
る） ｐＨＢＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよび挿入
から構成され、その挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどによ
るＨＢＶゲノムのｂｐ１７６３から２０３２を含む） ｐＨＢＶ−９ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからＦｕｊｉｙａｍ
ａなどによるＨＢＶ配列ｂｐ１８６８から開始する９ｂ
ｐの欠失から誘導される） ｐＨＢＶ＋１２ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからｂｐ１８６８
部位への１２ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導
される） ｐＶＶ−ｗｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の既知ｐＴＺ１９
ＲプラスミドおよびこのプラスミドのＰｖｕＩＩ部位２
個の間への挿入から構成され、その挿入部はワクチニア
ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子のｂｐ８３８５５か
ら８４７６１まで（Ｇｏｅｂｅｌなど、１９９０年によ
る）を含む） ＰＶＶ−２１（ｐＶＶ−ｗｔから２１ヌクレオチド（ｂ
ｐ８４７１８から８４７３８まで）の欠失で誘導され
る） ＰＶＶ＋２４（ｐＶＶ−ｗｔから８４７１３部位への２
４ｂｐの挿入で誘導される） ｐＨｅｒｐ（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎ製の既知ｐＣＲＩ
Ｉプラスミドおよび挿入から構成され、その挿入部はＭ
ｃＧｅｏｃｈなど、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＤＥ・
１・ＣＧ１によるＨＳＶゲノムのｂｐ１３８３６４から
１３８７８４までを含む） ｐＨｅｒｐ−９（ｐ−Ｈｅｒｐから９ヌクレオチド（ｂ
ｐ１３８３８８から１３８３９６まで）の欠失で誘導さ
れる） ｐＨｅｒｐ＋１０（ｐ−Ｈｅｒｐからｂｐ１３８４０７
への１０ｂｐの挿入で誘導される）
【００４８】別の側面では、本発明は検体中の核酸を定
量するためのキットに関し、次のものを含む： 相互にも、定量すべき核酸とも、検出できる特徴の少
なくとも一つが異なる内部標準としての既知核酸少なく
とも２種、 標準核酸と定量すべき核酸とに結合する蛍光標識した
プライマー、 目的とする核酸既知量を含むポジティブコントロー
ル、 目的とするウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネ
ガティブコントロール、 マニュアル（操作法）。 本発明のキットの好適な態様は次の通りである。 １．プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２
から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準
少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＳＫ３８およびＳＫ３９、 ＨＩＶ−１粒子既知量を含むポジティブコントロー
ル、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＩＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ２．プラスミドｐＨＣＶ−７およびｐＨＣＶ＋８から
試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少な
くとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＣＶ３２ＥｘｔおよびＨＣ
ＶＰＴ４、 ＨＣＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ３．プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐＨＡＶ＋９か
ら試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少
なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＡＶ＋２０５８およびＨＡ
Ｖ−２１７２、 ＨＡＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＡＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ４．プラスミドｐＨＢＶ−９およびｐＨＢＶ＋１２を
含む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＢＶ＋１７８０およびＨＢ
Ｖ−１９６０Ｂ、 ＨＢＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＢＶ−ＤＮＡを定量するためのキッ
ト。 ５．内部標識プラスミドｐＨｅｒｐ−９およびＨｅｒ
ｐ＋１０、 蛍光標識したプライマーｇＤＲ／ＢおよびｇＤＲ２Ｒ
／Ｂ、 ＨＳＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＳＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。
量するためのキットに関し、次のものを含む： 相互にも、定量すべき核酸とも、検出できる特徴の少
なくとも一つが異なる内部標準としての既知核酸少なく
とも２種、 標準核酸と定量すべき核酸とに結合する蛍光標識した
プライマー、 目的とする核酸既知量を含むポジティブコントロー
ル、 目的とするウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネ
ガティブコントロール、 マニュアル（操作法）。 本発明のキットの好適な態様は次の通りである。 １．プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２
から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準
少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＳＫ３８およびＳＫ３９、 ＨＩＶ−１粒子既知量を含むポジティブコントロー
ル、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＩＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ２．プラスミドｐＨＣＶ−７およびｐＨＣＶ＋８から
試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少な
くとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＣＶ３２ＥｘｔおよびＨＣ
ＶＰＴ４、 ＨＣＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ３．プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐＨＡＶ＋９か
ら試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少
なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＡＶ＋２０５８およびＨＡ
Ｖ−２１７２、 ＨＡＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＡＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ４．プラスミドｐＨＢＶ−９およびｐＨＢＶ＋１２を
含む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＢＶ＋１７８０およびＨＢ
Ｖ−１９６０Ｂ、 ＨＢＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＢＶ−ＤＮＡを定量するためのキッ
ト。 ５．内部標識プラスミドｐＨｅｒｐ−９およびＨｅｒ
ｐ＋１０、 蛍光標識したプライマーｇＤＲ／ＢおよびｇＤＲ２Ｒ
／Ｂ、 ＨＳＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＳＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。
【００４９】
【実施例】本発明を次の実施例および関連図面によって
さらに詳細に説明するが、しかしながら、これに限定す
るものでない。殊に実施例では本発明方法が多彩な検体
での優れた迅速かつ精密で高再現性のルーチン用に適す
る核酸の定量法であることを例示する。図１にはｐｇａ
ｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２のクローニングを、図２
にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＩＶの定量結果を、図３および
図４にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＡＶの定量結果を、および
図５、図６、図７、図８および図９にはＨＢＶの定量結
果を例示する。図１０、図１１、図１２および図１３は
配列プロトコールである。
さらに詳細に説明するが、しかしながら、これに限定す
るものでない。殊に実施例では本発明方法が多彩な検体
での優れた迅速かつ精密で高再現性のルーチン用に適す
る核酸の定量法であることを例示する。図１にはｐｇａ
ｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２のクローニングを、図２
にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＩＶの定量結果を、図３および
図４にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＡＶの定量結果を、および
図５、図６、図７、図８および図９にはＨＢＶの定量結
果を例示する。図１０、図１１、図１２および図１３は
配列プロトコールである。
【００５０】１．一般的実施指針： １．１．方法の原理 種々の起源からの核酸は螢光基を含むプライマーを用い
るＰＣＲによって増幅される（Ｓａｉｋｉなど、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２３９巻：４８７〜４９１頁（１９８５
年））。増幅されたＰＣＲ生成物の分析と定量とはレー
ザー誘発螢光測定器を持つ自動ＤＮＡシークエンサー
（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＤＮＡ・Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｒ・３７３Ａ／Ｇｅｎｅ・Ｓｃａｎ（商
標）ソフトウエアー）を用いて実施した。この装置はポ
リアクリルアミドゲル中で変性条件下にゲル電気泳動す
ることによって螢光標識ＰＣＲ生成物を大きさに従って
分離し、その量を定量的に測定することができる。検体
中のある配列のコピー数は定量すべき核酸および内部標
準少なくとも２個について得られたＰＣＲ生成物の強度
を基にして測定する。
るＰＣＲによって増幅される（Ｓａｉｋｉなど、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２３９巻：４８７〜４９１頁（１９８５
年））。増幅されたＰＣＲ生成物の分析と定量とはレー
ザー誘発螢光測定器を持つ自動ＤＮＡシークエンサー
（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＤＮＡ・Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｒ・３７３Ａ／Ｇｅｎｅ・Ｓｃａｎ（商
標）ソフトウエアー）を用いて実施した。この装置はポ
リアクリルアミドゲル中で変性条件下にゲル電気泳動す
ることによって螢光標識ＰＣＲ生成物を大きさに従って
分離し、その量を定量的に測定することができる。検体
中のある配列のコピー数は定量すべき核酸および内部標
準少なくとも２個について得られたＰＣＲ生成物の強度
を基にして測定する。
【００５１】１．２．１．ウイルス粒子ＤＮＡの抽出 検体５００μＬを超遠心分離器中、毎分７００００回転
で２０分間遠心分離する。ペレットをｐＨ８．０の１０
ｍＭ−トリス／塩酸５００μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２
０ｍｇ／ｍＬ）ならびに２０％ＳＤＳ１０μＬ中に溶解
する。標準核酸一定量とニシン精子ＤＮＡ１μｇを添加
し、検体を１時間５６℃でインキュベートする。次いで
検体をフェノールとクロロホルムとで順次抽出し、グリ
コーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
で２０分間遠心分離する。ペレットをｐＨ８．０の１０
ｍＭ−トリス／塩酸５００μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２
０ｍｇ／ｍＬ）ならびに２０％ＳＤＳ１０μＬ中に溶解
する。標準核酸一定量とニシン精子ＤＮＡ１μｇを添加
し、検体を１時間５６℃でインキュベートする。次いで
検体をフェノールとクロロホルムとで順次抽出し、グリ
コーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
【００５２】１．２．２．プロウイルスＤＮＡの抽出 細胞５×１０5個をライシス緩衝液１００μＬ（１×Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製ＰＣＲ緩衝液、Ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ・Ｋ・０．５ｍｇ／ｍＬ、０．４５％Ｔｗｅｅｎ）
中で５６℃で５時間ライシスする。この適量をＰＣＲに
使用する。
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製ＰＣＲ緩衝液、Ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ・Ｋ・０．５ｍｇ／ｍＬ、０．４５％Ｔｗｅｅｎ）
中で５６℃で５時間ライシスする。この適量をＰＣＲに
使用する。
【００５３】１．２．３．ウイルス残余ＤＮＡの抽出 検体５００μＬをｐＨ８．０の１０ｍＭ−トリス／塩酸
５μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ
とに溶解する。３７℃で一夜または５６℃で４時間イン
キュベーション後に、標準核酸一定量を添加し、検体を
フェノールおよびクロロホルムで順次に抽出し、ｇｌｙ
ｋｏｇｅｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
５μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ
とに溶解する。３７℃で一夜または５６℃で４時間イン
キュベーション後に、標準核酸一定量を添加し、検体を
フェノールおよびクロロホルムで順次に抽出し、ｇｌｙ
ｋｏｇｅｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
【００５４】１．２．４．ＲＮＡの抽出 血漿またはＰＢＳ希釈血漿１ｍＬを毎分７００００回転
で２０分間遠心分離する。上清液を吸引除去する。ペレ
ットをグアニジウム・イソチオシアネート溶液（Ｂｉｏ
ｔｅｃ製ＲＮＡｚｏｌ（商標））１ｍＬに取り、１ｍｇ
／ｍＬ酵母ｔ−ＲＮＡ５μＬおよび標準ＲＮＡ一定量、
たとえば２０μＬを添加する。マイナス−ＲＮＡ標準お
よびプラス−ＲＮＡ標準の所定数、たとえば４００コピ
ーと１２００コピーとを添加し、ふりまぜる。溶液を１
０分間７０℃に加熱し、クロロホルム１／１０容を添加
して１０分間氷上でインキュベーションする。その後、
これを机上遠心分離器で５分間遠心分離し、上清液を新
しいバイアルに移す。イソプロパノール５００μＬを添
加し、−８０℃に１５分間調整する。続いて１０分間遠
心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを
水５０μＬに取る。ＲＴ−ＰＣＲには５μＬを使用す
る。
で２０分間遠心分離する。上清液を吸引除去する。ペレ
ットをグアニジウム・イソチオシアネート溶液（Ｂｉｏ
ｔｅｃ製ＲＮＡｚｏｌ（商標））１ｍＬに取り、１ｍｇ
／ｍＬ酵母ｔ−ＲＮＡ５μＬおよび標準ＲＮＡ一定量、
たとえば２０μＬを添加する。マイナス−ＲＮＡ標準お
よびプラス−ＲＮＡ標準の所定数、たとえば４００コピ
ーと１２００コピーとを添加し、ふりまぜる。溶液を１
０分間７０℃に加熱し、クロロホルム１／１０容を添加
して１０分間氷上でインキュベーションする。その後、
これを机上遠心分離器で５分間遠心分離し、上清液を新
しいバイアルに移す。イソプロパノール５００μＬを添
加し、−８０℃に１５分間調整する。続いて１０分間遠
心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを
水５０μＬに取る。ＲＴ−ＰＣＲには５μＬを使用す
る。
【００５５】１．３．１．ＲＮＡ検出のためのＰＣＲ ＰＣＲ用セットには公知のように抽出核酸一定量、ＰＣ
Ｒ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製）、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、プライマー、Ｔａｑ−Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ製、５．０Ｕ／μＬ）と水とを含む。ＰＣＲは緩
衝液と酵素の製造元の指示書と通常の実施指導書（Ｍｕ
ｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌ
ｏｇｙ、１５５巻：３３５頁（１９８７年））とに従っ
てＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡ
ｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅｍ・９６００）で実施する。
Ｒ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製）、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、プライマー、Ｔａｑ−Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ製、５．０Ｕ／μＬ）と水とを含む。ＰＣＲは緩
衝液と酵素の製造元の指示書と通常の実施指導書（Ｍｕ
ｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌ
ｏｇｙ、１５５巻：３３５頁（１９８７年））とに従っ
てＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡ
ｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅｍ・９６００）で実施する。
【００５６】１．３．２．ＲＮＡ検出のためのＲＴ−Ｐ
ＣＲ ＲＴ−ＰＣＲ用セットには公知のように抽出核酸一定
量、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＲＴ緩衝液、ＭｇＣｌ
2、ｄＮＴＰ、ＲＴプライマーおよびｒＴ.ｔｈ．ポリメ
ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製、２．５Ｕ／μ
Ｌ）と水とを含む。ＲＴは緩衝液と酵素の製造元の指示
書と通常の実施指導書（Ｍｕｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇｙ、１５５巻：３３５
頁（１９８７年））とに従ってＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅ
ｍ・９６００）で実施する。ＰＣＲのためにはＭｇＣｌ
2、キレート緩衝液および第二のプライマーを追加す
る。次に前記指示書に従ってＰＣＲを実施する。
ＣＲ ＲＴ−ＰＣＲ用セットには公知のように抽出核酸一定
量、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＲＴ緩衝液、ＭｇＣｌ
2、ｄＮＴＰ、ＲＴプライマーおよびｒＴ.ｔｈ．ポリメ
ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製、２．５Ｕ／μ
Ｌ）と水とを含む。ＲＴは緩衝液と酵素の製造元の指示
書と通常の実施指導書（Ｍｕｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇｙ、１５５巻：３３５
頁（１９８７年））とに従ってＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅ
ｍ・９６００）で実施する。ＰＣＲのためにはＭｇＣｌ
2、キレート緩衝液および第二のプライマーを追加す
る。次に前記指示書に従ってＰＣＲを実施する。
【００５７】１．４．生成物の分析 ＰＣＲ生成物の判定および定量のためにはＰＣＲ溶液
０．５から１．０μＬを取り、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ製３７３Ａ装置で製造元の指示書に従っ
て分析する。
０．５から１．０μＬを取り、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ製３７３Ａ装置で製造元の指示書に従っ
て分析する。
【００５８】１．５．（ＲＴ）−ＰＣＲでの対照群 緊密な内部対照に加えて、一連のポジティブおよびネガ
ティブコントロールがＰＣＲの結果を保証する。種々の
コントロールについて、分析操作の様々な段階で標準を
添加する（リスト１）。 リスト１．（ＲＴ）−ＰＣＲでの対照群 ネガティブコントロール 型 説明 ｋ１＊＊ 試薬ブランクのコントロール。水添加、ＲＴ−ｍｉｘおよびＰＣ Ｒ−ｍｉｘ。保存溶液が貯蔵してある場所で操作する。検体はＰ ＣＲまで氷冷しておく。この対照は試薬中の夾雑に関する情報を 提供する。 ｋ３＊＊ 夾雑物のコントロール。ＲＴ−ｍｉｘへの抽出物に代える水の添 加。他の検体と同様に分析する。この対照はＲＴ−ＰＣＲを行う 場所での操作手順に起因する夾雑に関する情報を提供する。 ｋ４＊ 夾雑物のコントロール。ネガティブコントロール血漿またはＰＢ Ｓから得られる抽出物の分析。この対照は抽出工程に起因する誤 陽性の結果を検出する。内部標準は添加しない。 ポジティブコントロール 型 説明 ｋ５＊ 内部標準／試薬のコントロール。事前に抽出していないＲＴ−Ｐ ＣＲ／ＰＣＲ反応物への内部標準の直接的添加。この対照は内部 標準と試薬の機能との完全性をテストする。 ｋ６＊＊＊ 点検コントロール。試験管内転写による野生型標準プラスミドか ら誘導した点検所定量の分析。この対照は抽出操作と内部標準量 をテストする。 ｋ７＊ ウイルス粒子数コントロール。ネガティブ血漿またはＰＢＳで適 当な濃度にまで希釈したウイルス粒子所定量を含む部分の分析。 この対照は採用した検定法の全能率をテストする。 −−−− ＊：対照実験ｋ４、ｋ５およびｋ７は各抽出ごとに行う。 ＊＊：対照実験ｋ１およびｋ３は誤陽性野生型シグナルが認められたら、直 ちに行う。 ＊＊＊：ｋ６は内部標準調製の度に行う。コントロールｋ２はここに記載する 一酵素一管法導入以来削除した。
ティブコントロールがＰＣＲの結果を保証する。種々の
コントロールについて、分析操作の様々な段階で標準を
添加する（リスト１）。 リスト１．（ＲＴ）−ＰＣＲでの対照群 ネガティブコントロール 型 説明 ｋ１＊＊ 試薬ブランクのコントロール。水添加、ＲＴ−ｍｉｘおよびＰＣ Ｒ−ｍｉｘ。保存溶液が貯蔵してある場所で操作する。検体はＰ ＣＲまで氷冷しておく。この対照は試薬中の夾雑に関する情報を 提供する。 ｋ３＊＊ 夾雑物のコントロール。ＲＴ−ｍｉｘへの抽出物に代える水の添 加。他の検体と同様に分析する。この対照はＲＴ−ＰＣＲを行う 場所での操作手順に起因する夾雑に関する情報を提供する。 ｋ４＊ 夾雑物のコントロール。ネガティブコントロール血漿またはＰＢ Ｓから得られる抽出物の分析。この対照は抽出工程に起因する誤 陽性の結果を検出する。内部標準は添加しない。 ポジティブコントロール 型 説明 ｋ５＊ 内部標準／試薬のコントロール。事前に抽出していないＲＴ−Ｐ ＣＲ／ＰＣＲ反応物への内部標準の直接的添加。この対照は内部 標準と試薬の機能との完全性をテストする。 ｋ６＊＊＊ 点検コントロール。試験管内転写による野生型標準プラスミドか ら誘導した点検所定量の分析。この対照は抽出操作と内部標準量 をテストする。 ｋ７＊ ウイルス粒子数コントロール。ネガティブ血漿またはＰＢＳで適 当な濃度にまで希釈したウイルス粒子所定量を含む部分の分析。 この対照は採用した検定法の全能率をテストする。 −−−− ＊：対照実験ｋ４、ｋ５およびｋ７は各抽出ごとに行う。 ＊＊：対照実験ｋ１およびｋ３は誤陽性野生型シグナルが認められたら、直 ちに行う。 ＊＊＊：ｋ６は内部標準調製の度に行う。コントロールｋ２はここに記載する 一酵素一管法導入以来削除した。
【００５９】２．実施例１：逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）によるＨＩＶの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、野生
型ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１５ｂｐの生成物を与
えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１ １５５１〜１５７８（配列番号
１）
ＣＲ）によるＨＩＶの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、野生
型ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１５ｂｐの生成物を与
えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１ １５５１〜１５７８（配列番号
１）
【化１１】 ＳＫ３９：ＨＩＶ−１ １６６５〜１６３８（配列番号
２）
２）
【化１２】 （番号付けはＲａｔｎｅｒなどによる）を用いる。これ
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００６０】標準プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐｇ
ａｇ＋１２はプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。この
プラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ-（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重クローニン
グ部位への挿入部とから構成され、この挿入部はＲａｔ
ｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２００８ま
でを含む。
ａｇ＋１２はプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。この
プラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ-（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重クローニン
グ部位への挿入部とから構成され、この挿入部はＲａｔ
ｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２００８ま
でを含む。
【００６１】ｐｇａｇ−１５ではｂｐ１５９３から１６
０７までが欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入
部を部位１５９３（図１参照）に挿入する。プラスミド
を精製し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光
学測定により濃度を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス
／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ
ｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈
する。
０７までが欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入
部を部位１５９３（図１参照）に挿入する。プラスミド
を精製し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光
学測定により濃度を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス
／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ
ｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈
する。
【００６２】Ａｓｐ７１８で一本鎖化した後、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋなどによるＴ３ポリメラーゼで試験管内転写し
て６４４ｂ「＋」転写物と６１７ｂ「−」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生型ＤＮＡの長
さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａｇ−１
５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
ｒｏｏｋなどによるＴ３ポリメラーゼで試験管内転写し
て６４４ｂ「＋」転写物と６１７ｂ「−」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生型ＤＮＡの長
さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａｇ−１
５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
【００６３】図２Ａおよび２Ｂは対照実験結果を図示す
る。ｗｔ−ＲＮＡ各１００コピーの検体２種をプラスミ
ドｐｇａｇ１から製造し、前記方法に従って抽出し、
「−」および「＋」標準との共増幅により増幅し、「遺
伝子スキャンニング」により分析する。両レーンには
「−」、「ｗｔ」および「＋」標準を確認できる。これ
らクロマトグラムの定量的評価結果を表１、１および２
行に示す。
る。ｗｔ−ＲＮＡ各１００コピーの検体２種をプラスミ
ドｐｇａｇ１から製造し、前記方法に従って抽出し、
「−」および「＋」標準との共増幅により増幅し、「遺
伝子スキャンニング」により分析する。両レーンには
「−」、「ｗｔ」および「＋」標準を確認できる。これ
らクロマトグラムの定量的評価結果を表１、１および２
行に示す。
【００６４】「Ｎ−添加」および「Ｎ＋添加」の列は添
加した「−」および「＋」標準のコピー数を示す。「希
釈」は検体を希釈した倍率を示し、「容積」は後処理容
積を示す。「検体」は検体コードを示し、「注」は検体
に関するそれ以外の情報を含む。「ＧＳ＃、レーン」は
分析番号とそのレーン番号とを示す。「Ａ−」、「Ａｗ
ｔ」および「Ａ＋」はピーク面積、すなわちＰＣＲ生成
物「−」、「ｗｔ」および「＋」のの強度を示す。「Ｎ
−基準」と「Ｎ＋基準」とには前記の式により算出した
結果を検体ｍＬ当りのコピー数で表したものを含む。
「最終結果」の列にはこれらの値の平均値を示す。
加した「−」および「＋」標準のコピー数を示す。「希
釈」は検体を希釈した倍率を示し、「容積」は後処理容
積を示す。「検体」は検体コードを示し、「注」は検体
に関するそれ以外の情報を含む。「ＧＳ＃、レーン」は
分析番号とそのレーン番号とを示す。「Ａ−」、「Ａｗ
ｔ」および「Ａ＋」はピーク面積、すなわちＰＣＲ生成
物「−」、「ｗｔ」および「＋」のの強度を示す。「Ｎ
−基準」と「Ｎ＋基準」とには前記の式により算出した
結果を検体ｍＬ当りのコピー数で表したものを含む。
「最終結果」の列にはこれらの値の平均値を示す。
【００６５】１００コピーを添加した各検体について１
１４および１０６コピーが観測された。理論値（すなわ
ち、添加ｗｔコピー数）と測定値（すなわち、測定ｗｔ
コピー数）との間に良い相関関係が見られた。変動はお
のおの＋１４および＋６％である。これから未知量のｗ
ｔ−ＲＮＡをこの方法で測定することができると結論す
ることができる。
１４および１０６コピーが観測された。理論値（すなわ
ち、添加ｗｔコピー数）と測定値（すなわち、測定ｗｔ
コピー数）との間に良い相関関係が見られた。変動はお
のおの＋１４および＋６％である。これから未知量のｗ
ｔ−ＲＮＡをこの方法で測定することができると結論す
ることができる。
【００６６】別の対照実験のために陰性血漿と感染状況
を試験管内で測定してあったＨＩＶＩＩＩＢの標本とを
混合した。血漿中ウイルス濃度はｍＬ当り２００ＴＣＩ
Ｄ50であった。１：１０希釈および１：４０希釈各々
０．５ｍＬを前記のように分析した。結果を図２Ｃおよ
び２Ｄならびに表１の３行および４行目に示す。両検体
について未希釈血漿ｍＬ当りコピー数として３３１８７
および２５８９５の結果を得た。平均値からの偏差は１
２％であった。この実験から検体中に測定されるＨＩＶ
のコピー数は検定に使う量とは無関係であることが判
る。
を試験管内で測定してあったＨＩＶＩＩＩＢの標本とを
混合した。血漿中ウイルス濃度はｍＬ当り２００ＴＣＩ
Ｄ50であった。１：１０希釈および１：４０希釈各々
０．５ｍＬを前記のように分析した。結果を図２Ｃおよ
び２Ｄならびに表１の３行および４行目に示す。両検体
について未希釈血漿ｍＬ当りコピー数として３３１８７
および２５８９５の結果を得た。平均値からの偏差は１
２％であった。この実験から検体中に測定されるＨＩＶ
のコピー数は検定に使う量とは無関係であることが判
る。
【００６７】図２Ｅおよび２Ｆならびに表１の５行およ
び６行目は未知検体の測定結果を示す。独立の測定２回
において５６１２および５８２８コピーの値を得た。偏
差は２％であった。これから前記方法はＨＩＶの高感度
で精密な測定に適していると結論することができる。
び６行目は未知検体の測定結果を示す。独立の測定２回
において５６１２および５８２８コピーの値を得た。偏
差は２％であった。これから前記方法はＨＩＶの高感度
で精密な測定に適していると結論することができる。
【００６８】同一検体の種々の希釈を測定する時の大き
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
【表１】
【００６９】３．実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによるＨＡＶ
の定量 この定量ではＨＡＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１３９ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
の定量 この定量ではＨＡＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１３９ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
【化１３】 ＨＡＶ−２１７２：ＨＡＶ２１９６〜２１７２（配列番
号４）
号４）
【化１４】 （番号付けはＣｏｈｅｎなど、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による）を用いる。こ
れらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤ
ＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製
３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による）を用いる。こ
れらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤ
ＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製
３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００７０】標準プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐＨ
ＡＶ＋９はプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔから誘導する。こ
のプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＣｏｈｅｎなどのＨＡＶのｂｐ２０２０から２２
２６までを含む。
ＡＶ＋９はプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔから誘導する。こ
のプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＣｏｈｅｎなどのＨＡＶのｂｐ２０２０から２２
２６までを含む。
【００７１】ｐＨＡＶ−１０ではｂｐ２１００から２１
０９までが欠失し、ｐＨＡＶ＋９では９ｂｐの挿入部を
部位２１００に挿入する。プラスミドを精製し（ＱＵＩ
ＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度
を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クロ
ーニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏ
ｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈ
ａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈する。
０９までが欠失し、ｐＨＡＶ＋９では９ｂｐの挿入部を
部位２１００に挿入する。プラスミドを精製し（ＱＵＩ
ＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度
を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クロ
ーニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏ
ｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈ
ａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈する。
【００７２】ＡｌｗＮＩで一本鎖化した後、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋなどによりＴ７ポリメラーゼで試験管内転写して
１１４０ｂ「＋」転写物と１１２１ｂ「−」転写物と１
１３１ｂ「ｗｔ」転写物とを得て、これらをグアニジノ
イソチオシアネート溶液で抽出し、２６０ｎｍでの分光
光学的測定で定量する。これらのＲＮＡ処理物はＲＴ−
ＰＣＲの標準として使用する。
ｏｏｋなどによりＴ７ポリメラーゼで試験管内転写して
１１４０ｂ「＋」転写物と１１２１ｂ「−」転写物と１
１３１ｂ「ｗｔ」転写物とを得て、これらをグアニジノ
イソチオシアネート溶液で抽出し、２６０ｎｍでの分光
光学的測定で定量する。これらのＲＮＡ処理物はＲＴ−
ＰＣＲの標準として使用する。
【００７３】標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生
型ＤＮＡの長さは１４８（ｐＨＡＶ＋９）、１２９（ｐ
ＨＡＶ−１０）および１３９ｂｐ（ｗｔ）である。
型ＤＮＡの長さは１４８（ｐＨＡＶ＋９）、１２９（ｐ
ＨＡＶ−１０）および１３９ｂｐ（ｗｔ）である。
【００７４】前記方法により血漿２検体（ＰＬ１および
ＰＬ２）ならびにアルブミン２検体（アルブミンおよび
ヒトアルブミン）をＨＡＶについて検定した。表２はコ
ンピュータプログラム（ＭＳ・Ｅｘｃｅｌ（商標））を
用いた核酸検出装置での測定値の評価を示す。１および
２列はマイナス標準とプラス標準の使用量を示す。３お
よび４列は使用した希釈と容積を示す。５列では検体を
示し、６列は検定を実施したウイルスを示す。検体のコ
ピー数はマイナス標準から（Ｎ−基準、７列）およびプ
ラス標準から（Ｎ＋基準、８列）の両方で算出し、両算
出値の平均を測定結果とする。９列は空欄である。１０
列は検体番号を示す。１１、１２および１３列は検出ピ
ークの面積を示す。
ＰＬ２）ならびにアルブミン２検体（アルブミンおよび
ヒトアルブミン）をＨＡＶについて検定した。表２はコ
ンピュータプログラム（ＭＳ・Ｅｘｃｅｌ（商標））を
用いた核酸検出装置での測定値の評価を示す。１および
２列はマイナス標準とプラス標準の使用量を示す。３お
よび４列は使用した希釈と容積を示す。５列では検体を
示し、６列は検定を実施したウイルスを示す。検体のコ
ピー数はマイナス標準から（Ｎ−基準、７列）およびプ
ラス標準から（Ｎ＋基準、８列）の両方で算出し、両算
出値の平均を測定結果とする。９列は空欄である。１０
列は検体番号を示す。１１、１２および１３列は検出ピ
ークの面積を示す。
【００７５】図３および図４はＨＡＶ検定のグラフによ
る評価を示し、各レーンにおいてＰＣＲ生成物（および
副生成物）の螢光シグナル強度を図示する。生成物はそ
の大きさ（ｂｐで）によって確認できる。標準は長さ１
４８および１２９ｂｐを持ち、野生型は長さ１３９を持
つ。
る評価を示し、各レーンにおいてＰＣＲ生成物（および
副生成物）の螢光シグナル強度を図示する。生成物はそ
の大きさ（ｂｐで）によって確認できる。標準は長さ１
４８および１２９ｂｐを持ち、野生型は長さ１３９を持
つ。
【表２】 これら検定結果では血漿１は陽性（７９８コピー／ｍ
Ｌ）であるが、他の検体は検出限界以下であることを示
した。「検出限界ピーク」（プラス標準の抽出物でコピ
ー数３００コピー／ｍＬ）の存在は全測定で明らかに認
められる。
Ｌ）であるが、他の検体は検出限界以下であることを示
した。「検出限界ピーク」（プラス標準の抽出物でコピ
ー数３００コピー／ｍＬ）の存在は全測定で明らかに認
められる。
【００７６】４．実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ
の定量 この定量ではＨＣＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＣＶ３２ＥＸＴ：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
の定量 この定量ではＨＣＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＣＶ３２ＥＸＴ：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
【化１５】 ＨＣＶＰＴ４：ＨＣＶ１５８〜１３９（配列番号６）
【化１６】 （番号付けはＨａｎなど、ＰＮＡＳ、８８巻：１７１１
〜１７１５頁（１９９１年）による）を用いる。これら
プライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮＡ
合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９
４ＤＮＡ合成器）で製造した。
〜１７１５頁（１９９１年）による）を用いる。これら
プライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮＡ
合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９
４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００７７】標準プラスミドｐＨＣＶ−７とｐＨＣＶ＋
８とはプラスミドｐＨＣＶ−ｗｔから誘導する。このプ
ラスミドｐＨＣＶ−ｗｔは既知のｐＢＳ／ＳＫ-プラス
ミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＨａｎなどのＨＣＶのｂｐ２７から３１３までを
含む。
８とはプラスミドｐＨＣＶ−ｗｔから誘導する。このプ
ラスミドｐＨＣＶ−ｗｔは既知のｐＢＳ／ＳＫ-プラス
ミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＨａｎなどのＨＣＶのｂｐ２７から３１３までを
含む。
【００７８】ｐＨＣＶ−７ではｂｐ１２６から３１３ま
でが欠失し、ｐＨＣＶ＋８では８ｂｐの挿入部を部位１
２６に挿入する。プラスミドを精製（ＱＵＩＡＧＥＮ
法）し、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度を測定
し、これをＸｍｎＩで切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリ
ス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ
ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希
釈する。
でが欠失し、ｐＨＣＶ＋８では８ｂｐの挿入部を部位１
２６に挿入する。プラスミドを精製（ＱＵＩＡＧＥＮ
法）し、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度を測定
し、これをＸｍｎＩで切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリ
ス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ
ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希
釈する。
【００７９】ＳａｍｂｒｏｏｋなどによるＴ３ポリメラ
ーゼで試験管内転写して１３８５ｂ「＋」転写物と１３
７０ｂ「−」転写物と１３７７ｂ「ｗｔ」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
ーゼで試験管内転写して１３８５ｂ「＋」転写物と１３
７０ｂ「−」転写物と１３７７ｂ「ｗｔ」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
【００８０】標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生
型ＤＮＡの長さは１１２（ｐＨＣＶ＋８）、１０７（ｐ
ＨＣＶ−７）および１１４ｂｐ（ｗｔ）である。
型ＤＮＡの長さは１１２（ｐＨＣＶ＋８）、１０７（ｐ
ＨＣＶ−７）および１１４ｂｐ（ｗｔ）である。
【００８１】ｐＨＣＶ−ｗｔから作製したｗｔ−ＲＮＡ
２００および２０００コピーを含む検体２個を前記方法
で抽出し、「−」および「＋」標準とともに共増幅によ
り増幅し、「遺伝子スキャンニング」により分析した。
両レーンで「−」、「ｗｔ」および「＋」標準は認識で
きる。これらクロマトグラムの定量的評価の結果は表３
の１および２列に示した。この表は実施例１と同様にセ
ットしてある。
２００および２０００コピーを含む検体２個を前記方法
で抽出し、「−」および「＋」標準とともに共増幅によ
り増幅し、「遺伝子スキャンニング」により分析した。
両レーンで「−」、「ｗｔ」および「＋」標準は認識で
きる。これらクロマトグラムの定量的評価の結果は表３
の１および２列に示した。この表は実施例１と同様にセ
ットしてある。
【００８２】２０００および２００コピーを添加した各
検体について１９７２および１９３コピーの結果を得
た。理論値（すなわち、添加ｗｔコピー数）と測定値
（すなわち、測定ｗｔコピー数）との間に良い相関関係
があることが見出された。偏差は各々−１および−３％
であった。これから未知量のｗｔ−ＲＮＡがこの方法で
測定できることが結論づけられた。
検体について１９７２および１９３コピーの結果を得
た。理論値（すなわち、添加ｗｔコピー数）と測定値
（すなわち、測定ｗｔコピー数）との間に良い相関関係
があることが見出された。偏差は各々−１および−３％
であった。これから未知量のｗｔ−ＲＮＡがこの方法で
測定できることが結論づけられた。
【００８３】患者多数から得たＨＣＶ陽性血漿貯蔵標本
を用いてさらに対照実験を行った。１：１２５および
１：６２５希釈各０．５ｍＬを前記のように分析した。
結果を表３の３および４行に示す。両検体について、非
希釈標本ｍＬ当り各１２１５１５７および８９８３２７
コピーの結果を得た。平均値からの偏差は１５％であっ
た。この実験は検体中のＨＣＶコピー数測定値は検定に
用いた量とは無関係であることを示す。さらに、この例
は本発明の方法は低コピー数の範囲のみならず高コピー
数の範囲でも再現性があることを示す。
を用いてさらに対照実験を行った。１：１２５および
１：６２５希釈各０．５ｍＬを前記のように分析した。
結果を表３の３および４行に示す。両検体について、非
希釈標本ｍＬ当り各１２１５１５７および８９８３２７
コピーの結果を得た。平均値からの偏差は１５％であっ
た。この実験は検体中のＨＣＶコピー数測定値は検定に
用いた量とは無関係であることを示す。さらに、この例
は本発明の方法は低コピー数の範囲のみならず高コピー
数の範囲でも再現性があることを示す。
【００８４】表３の５および６行は未知検体の測定結果
を例示する。独立した２回の測定で各々３２７７および
３６７６コピーの結果を得た。偏差は５％であった。こ
れで前記方法はＨＣＶの高感度で精密な測定に適してい
ると結論することができる。
を例示する。独立した２回の測定で各々３２７７および
３６７６コピーの結果を得た。偏差は５％であった。こ
れで前記方法はＨＣＶの高感度で精密な測定に適してい
ると結論することができる。
【００８５】同一検体の種々の希釈の測定における大き
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
【表３】
【００８６】５．実施例４：ＨＩＶ−プロウイルスＤＮ
Ａの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、ＨＩ
Ｖ−プロウイルスＤＮＡのＰＣＲにより１１５ｂｐの大
きさの生成物を与えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１・１５５１〜１５７８（配列番号
１）
Ａの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、ＨＩ
Ｖ−プロウイルスＤＮＡのＰＣＲにより１１５ｂｐの大
きさの生成物を与えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１・１５５１〜１５７８（配列番号
１）
【化１７】 ＳＫ３９：ＨＩＶ−１・１６６５〜１６３８（配列番号
２）
２）
【化１８】 （番号付けはＲａｔｎｅｒなどによる）を用いる。これ
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００８７】標準プラスミドｐｇａｇ−１５とｐｇａｇ
＋１２とはプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。このプ
ラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ- プラスミド
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重ク
ローニング部位への挿入部とから構成され、この挿入部
はＲａｔｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２
００８までを含む。
＋１２とはプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。このプ
ラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ- プラスミド
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重ク
ローニング部位への挿入部とから構成され、この挿入部
はＲａｔｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２
００８までを含む。
【００８８】ｐｇａｇ−１５ではｂｐ１５９３〜１６０
７が欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入部を部
位１５９３（図１参照）に挿入した。プラスミドを精製
し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定
により濃度を測定し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＨ８の１
０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液
（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８
９年））中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲ
の標準として使用する。
７が欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入部を部
位１５９３（図１参照）に挿入した。プラスミドを精製
し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定
により濃度を測定し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＨ８の１
０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液
（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８
９年））中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲ
の標準として使用する。
【００８９】標準ＰＣＲ生成物の長さおよび野生型ＤＮ
Ａの長さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａ
ｇ−１５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
Ａの長さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａ
ｇ−１５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
【００９０】一連の定量結果を表４に示す。ＨＩＶプロ
ウイルスＤＮＡを種々のコピー数で含む一連の陽性検体
と陰性対照検体とを記号化して本発明方法で測定した。
表４は正確な範囲で全陰性対照が陰性として、また、全
陽性検体が陽性として定量されることを示す。殊に注目
に値するのは低コピー範囲での精密な測定値である。殊
に注目すべきはＣＤ−１３およびＣＤ−２６である。両
検体は１０5細胞当り２コピーを含むもので、定量値は
３コピーであった。これは本発明方法の精密さおよび究
極的と言える感度を例示する。
ウイルスＤＮＡを種々のコピー数で含む一連の陽性検体
と陰性対照検体とを記号化して本発明方法で測定した。
表４は正確な範囲で全陰性対照が陰性として、また、全
陽性検体が陽性として定量されることを示す。殊に注目
に値するのは低コピー範囲での精密な測定値である。殊
に注目すべきはＣＤ−１３およびＣＤ−２６である。両
検体は１０5細胞当り２コピーを含むもので、定量値は
３コピーであった。これは本発明方法の精密さおよび究
極的と言える感度を例示する。
【表４】
【００９１】６．実施例５：ＨＢＶの定量 この定量ではＨＢＶのゲノムに結合し、野生型ＤＮＡの
ＰＣＲにより１８２ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
ＰＣＲにより１８２ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
【化１９】 ＨＢＶ−１９６０Ｂ：ＨＢＶ１９８３〜１９６０（配列
番号８）
番号８）
【化２０】 （番号付けはＦｕｊｉｙａｍａなどによる）を用いる。
これらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いて
ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
製３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
これらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いて
ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
製３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００９２】標準プラスミドｐＨＢＶ−９とｐＨＢＶ＋
１２はプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔとから誘導される。こ
のプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）とこのプラスミド
の多重クローニング部位への挿入部とから構成され、こ
の挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどのＨＢＶのｂｐ１７６
３から１８６８までを含む。
１２はプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔとから誘導される。こ
のプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）とこのプラスミド
の多重クローニング部位への挿入部とから構成され、こ
の挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどのＨＢＶのｂｐ１７６
３から１８６８までを含む。
【００９３】ｐＨＢＶ−９ではｂｐ１８６８から１８７
６までが欠失し、ｐＨＢＶ＋１２では１２ｂｐの挿入部
を部位１８６８に挿入した。プラスミドを精製し（ＱＵ
ＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃
度を測定し、制限酵素で一度切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ
−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））
中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準と
して使用する。
６までが欠失し、ｐＨＢＶ＋１２では１２ｂｐの挿入部
を部位１８６８に挿入した。プラスミドを精製し（ＱＵ
ＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃
度を測定し、制限酵素で一度切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ
−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））
中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準と
して使用する。
【００９４】標準ＰＣＲ生成物の長さと野生型ＤＮＡと
の長さは１９４（ｐＨＢＶ＋１２）、１７３（ｐＨＢＶ
−９）および１８２ｂｐ（ｗｔ）である。
の長さは１９４（ｐＨＢＶ＋１２）、１７３（ｐＨＢＶ
−９）および１８２ｂｐ（ｗｔ）である。
【００９５】一連の定量結果を表５に示し、グラフとし
て図５、図６、図７、図８および図９に描く。増幅反応
は各々ｐＨＢＶ−９は１５０コピー、ｐＨＢＶ＋１２は
５０コピーから、ｐＨＢＶ−ｗｔは種々の量（４００、
２００、１００、５０および０コピー）から出発して実
施した。各セットは４回測定した。
て図５、図６、図７、図８および図９に描く。増幅反応
は各々ｐＨＢＶ−９は１５０コピー、ｐＨＢＶ＋１２は
５０コピーから、ｐＨＢＶ−ｗｔは種々の量（４００、
２００、１００、５０および０コピー）から出発して実
施した。各セットは４回測定した。
【表５】 結果はＤＮＡ含量測定が非常によく再現できることを示
す。
す。
【００９６】７．実施例６：ヘルペス・シンプレックス
ウイルス（ＨＳＶ）ＤＮＡの定量 この定量ではＨＳＶのゲノムに結合し、野生型ＤＮＡの
ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ｇＤＲ１／Ｂ：（配列番号１１）
ウイルス（ＨＳＶ）ＤＮＡの定量 この定量ではＨＳＶのゲノムに結合し、野生型ＤＮＡの
ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ｇＤＲ１／Ｂ：（配列番号１１）
【化２１】 ｇＤＲ２Ｒ／Ｂ：（配列番号１２）
【化２２】 を用いる。
【００９７】標準プラスミドｐＨｅｒｐ−９はプラスミ
ドｐＨｅｒｐから誘導する。このプラスミドｐＨｅｒｐ
は既知のｐＣＲＩＩプラスミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ製）とＨＳＶゲノムのｂｐ１２８３６４から１３８７
８４までの挿入部とから構成される（ＭｃＧｅｏｃｈ，
Ｄ．Ｊ．など、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＩＤＨＥ１
ＣＧ１）。
ドｐＨｅｒｐから誘導する。このプラスミドｐＨｅｒｐ
は既知のｐＣＲＩＩプラスミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ製）とＨＳＶゲノムのｂｐ１２８３６４から１３８７
８４までの挿入部とから構成される（ＭｃＧｅｏｃｈ，
Ｄ．Ｊ．など、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＩＤＨＥ１
ＣＧ１）。
【００９８】ｐＨＢＶ−９では９ｂｐを除去した。プラ
スミドを精製し、２６０ｎｍで分光光学測定により濃度
を測定し、制限酵素で一本鎖化し、ＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で希釈
した。このＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準として使用す
る。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１０５
（ｐＨｅｒｐ−９）および１１４ｂｐ（ｐＨｅｒｐ）で
ある。
スミドを精製し、２６０ｎｍで分光光学測定により濃度
を測定し、制限酵素で一本鎖化し、ＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で希釈
した。このＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準として使用す
る。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１０５
（ｐＨｅｒｐ−９）および１１４ｂｐ（ｐＨｅｒｐ）で
ある。
【００９９】定量結果を表６に示す。検体５個ならびに
ｐＨｅｒｐ野生型ＤＮＡ１．６６ｐｇを４００００コピ
ー（１列）の標準ｐＨｅｒｐ−９の存在下に前記方法に
より分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ量算出用の前
記数式での係数Ｆ２は１／６０００である。２列と３列
は希釈係数ならびに使用した検体の容積を記述する。４
列は検体名を示す。５列は検体に関する追加情報を含む
（要すれば）。６列にはＨＳＶ−ＤＮＡの算出量をｐｇ
／ｍＬで記載する。２回測定の平均値を７列に示す。８
および９列は標準プラスミド（８列）および野生型（９
列）ピーク面積を示す。
ｐＨｅｒｐ野生型ＤＮＡ１．６６ｐｇを４００００コピ
ー（１列）の標準ｐＨｅｒｐ−９の存在下に前記方法に
より分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ量算出用の前
記数式での係数Ｆ２は１／６０００である。２列と３列
は希釈係数ならびに使用した検体の容積を記述する。４
列は検体名を示す。５列は検体に関する追加情報を含む
（要すれば）。６列にはＨＳＶ−ＤＮＡの算出量をｐｇ
／ｍＬで記載する。２回測定の平均値を７列に示す。８
および９列は標準プラスミド（８列）および野生型（９
列）ピーク面積を示す。
【０１００】検体１４、１７とＪＡ１０とはヘルペスＤ
ＮＡの二重測定を行い、平均値からの偏差は０％から
４．３％までであった。この僅かな標準偏差も、もし測
定操作中にｐＨｅｒｐ＋１０標準を共測定すれば劇的に
改良されうる。
ＮＡの二重測定を行い、平均値からの偏差は０％から
４．３％までであった。この僅かな標準偏差も、もし測
定操作中にｐＨｅｒｐ＋１０標準を共測定すれば劇的に
改良されうる。
【表６】N-添加 希釈 容積 検体 注 pg/mL 最終結果 A・ Awt 4000 1 0.5 000.00 ヘルヘ゜ス 1333 - 100 10000 4000 1 0.5 標本 14.11 ・ 3.1 3 7872 1840 4000 1 0.5 標本 14.12 ・ 2.9 - 8171 1774 4000 1 0.5 標本 16.11 ・ 5.5 5.75 11105 4626 4000 1 0.5 標本 16.12 ・ 6 - 7285 3311 4000 1 0.5 標本 17.11 ・ 1.7 1.7 12402 1570 4000 1 0.5 標本 17.12 ・ 1.7 - 9118 1181 4000 1 0.5 YES 10.11 ・ 1.6 1.65 10713 1315 4000 1 0.5 YES 10.12 ・ 1.7 - 9200 1148 4000 1 0.5 H2O ・ 0 0 7843 ・1 4000 1 0.5 H2O ・ 0 - 4077 ・1 4000 1 0.5 PCR ・ 0 0 ・1 ・1 4000 1 0.5 PCR ・ 0 - ・1 ・110000 1 1 1.66pg wt1.2 ・ 1.8 - 3863 4352 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ８．実施例７：ワクチニア−ＤＮＡの定量 この定量ではワクチニアウイルスのゲノムに結合し、野
生型ＤＮＡのＰＣＲにより１３６ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち
生型ＤＮＡのＰＣＲにより１３６ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち
【化２３】 ｏｐｒｌ−ｒ：ＡＡＡ ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＧＧ Ｃ ｂｐ８４６２６〜８４６４４ ｏｐｒｌ−ｆ：ＡＴＡ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＴ ｂｐ８４７６１〜８４７４３ （番号付けはＧｏｅｂｅｌなど、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による）を用
いる。これらプライマーはＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９４ＤＮＡ合成器）で製
造した。
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による）を用
いる。これらプライマーはＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９４ＤＮＡ合成器）で製
造した。
【０１０１】標準的プラスミドｐＶＶ−２１はプラスミ
ドｐＶＶ−ｗｔから誘導する。このプラスミドｐＶＶ−
ｗｔは既知のｐＴＺ１９Ｒプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ製）とこのプラスミドのＰｖｕＩＩ制限切断部位２
個の間の挿入部とから構成される。この挿入部はワクチ
ニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子領域のｂｐ８３
８５５から８４７６１までを含む（Ｇｏｅｂｅｌなど、
１９９０年）。
ドｐＶＶ−ｗｔから誘導する。このプラスミドｐＶＶ−
ｗｔは既知のｐＴＺ１９Ｒプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ製）とこのプラスミドのＰｖｕＩＩ制限切断部位２
個の間の挿入部とから構成される。この挿入部はワクチ
ニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子領域のｂｐ８３
８５５から８４７６１までを含む（Ｇｏｅｂｅｌなど、
１９９０年）。
【０１０２】ｐＶＶ−２１では２１ｂｐ（ｂｐ８４７１
８から８４７３８まで）が欠失している。
８から８４７３８まで）が欠失している。
【０１０３】プラスミドを精製し、２６０ｎｍで分光光
学測定により濃度を測定し、制限酵素で一本鎖化し、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）で希釈した。
学測定により濃度を測定し、制限酵素で一本鎖化し、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）で希釈した。
【０１０４】このＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準として使
用する。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１
１５（ｐＶＶ−２１）および１３６（ｐＶＶｗｔ）であ
る。 定量結果を表７に示す。検体、水およびワクチニアＤＮ
Ａ１０ｐｇを標準血漿１００００コピー存在下（１列）
に前記方法により分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ
量算出用の前記数式での係数Ｆ２は１／５０００であ
る。
用する。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１
１５（ｐＶＶ−２１）および１３６（ｐＶＶｗｔ）であ
る。 定量結果を表７に示す。検体、水およびワクチニアＤＮ
Ａ１０ｐｇを標準血漿１００００コピー存在下（１列）
に前記方法により分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ
量算出用の前記数式での係数Ｆ２は１／５０００であ
る。
【０１０５】２列と３列は希釈倍率ならびに使用した検
体の容積を記述する。５列は検体に関する情報を含む
（要すれば）。４列は検体名を示す。６列にはワクチニ
アＤＮＡの算出量をｐｇ／ｍＬで記載する。７列にはＰ
ＣＲ生成物を分析するための遺伝子スキャンニング回数
を示す。８および９列は標準プラスミド（８列）および
野生型（９列）のピーク面積を示す。
体の容積を記述する。５列は検体に関する情報を含む
（要すれば）。４列は検体名を示す。６列にはワクチニ
アＤＮＡの算出量をｐｇ／ｍＬで記載する。７列にはＰ
ＣＲ生成物を分析するための遺伝子スキャンニング回数
を示す。８および９列は標準プラスミド（８列）および
野生型（９列）のピーク面積を示す。
【０１０６】検体３１１４９４ではワクチニアＤＮＡ各
々１．６４ｐｇおよび１．７７ｐｇが測定されたが、平
均値からの偏差は３．８％であった。検体３１０４９４
ではワクチニアＤＮＡ各々７．０ｐｇおよび７．２ｐｇ
が測定されたが、平均値からの偏差は１．４％であっ
た。この僅かな標準偏差も、もし測定操作中にｐＶＶ＋
２４標準を共測定すれば劇的に改良されうる。
々１．６４ｐｇおよび１．７７ｐｇが測定されたが、平
均値からの偏差は３．８％であった。検体３１０４９４
ではワクチニアＤＮＡ各々７．０ｐｇおよび７．２ｐｇ
が測定されたが、平均値からの偏差は１．４％であっ
た。この僅かな標準偏差も、もし測定操作中にｐＶＶ＋
２４標準を共測定すれば劇的に改良されうる。
【表７】N-添加 希釈 容積 検体 注 pg/mL GS# レーン A- A wt 45000 1 0.5 0000.00 ナシ 1800 261 00 100 10000 40000 1 1 10pg ナシ 10.6 259 06 35636 47165 40000 5 0.5 310494 ナシ 7 216 09 55109 4820 40000 5 0.5 310494 ナシ 7.2 216 01 37686 3375 40000 5 0.5 311494 ナシ 1.64 246 18 49362 1013 40000 5 0.5 311494 ナシ 1.77 246 20 48816 1079 40000 1 0.5 H2O ナシ ・1 246 21 41041 ・1 40000 1 0.5 H2O ナシ ・1 246 24 46458 ・1 40000 1 1 PCR ナシ 0 246 27 ・1 ・1 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９
【図１】 ｐｇａｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２のクロ
ーニングを例示した模式図である。
ーニングを例示した模式図である。
【図２】 ＲＴ−ＰＣＲでのＨＩＶの定量結果を例示し
たグラフである。
たグラフである。
【図３】 ＲＴ−ＰＣＲでのＨＡＶの定量結果を例示し
たグラフである。
たグラフである。
【図４】 ＲＴ−ＰＣＲでのＨＡＶの定量結果を例示し
たグラフである。
たグラフである。
【図５】 ＨＢＶの定量結果を例示したグラフである。
【図６】 ＨＢＶの定量結果を例示したグラフである。
【図７】 ＨＢＶの定量結果を例示したグラフである。
【図８】 ＨＢＶの定量結果を例示したグラフである。
【図９】 ＨＢＶの定量結果を例示したグラフである。
【図１０】 配列プロトコールである。
【図１１】 配列プロトコールである。
【図１２】 配列プロトコールである。
【図１３】 配列プロトコールである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１１月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸増幅を応用する標本
中の核酸定量方法に関し、ここに、増幅段階の前に、既
知量の既知核酸分子を内部標準として標本に添加するも
のであって、その標準核酸分子は検出しうる特徴の少な
くとも１個が定量すべき核酸とは異なるものである。
中の核酸定量方法に関し、ここに、増幅段階の前に、既
知量の既知核酸分子を内部標準として標本に添加するも
のであって、その標準核酸分子は検出しうる特徴の少な
くとも１個が定量すべき核酸とは異なるものである。
【０００２】
【従来の技術】種々のウイルス病診断のためには、現
在、著しく信頼性の低い検出法しか存在しない。利用さ
れているＥＬＩＳＡ法では血液中を循環している僅かな
ウイルス蛋白質を検出できないので疾患の早期にはウイ
ルス感染を診断することが不可能なこともしばしばであ
る。しかしながら、治療が成功するためには感染を可能
な限り早期に認識することに大きな価値がある。さら
に、ウイルス感染症では血液中のウイルス濃度は疾患の
経過または治療の影響で変動する。このためウイルス粒
子の量があまりに減少するかもしれないので、常法の感
度は十分でないと思われる。このような場合、ＥＬＩＳ
Ａ検査で誤まった陰性結果を得ると疾患の経過に誤った
印象を与えることになると思われる。
在、著しく信頼性の低い検出法しか存在しない。利用さ
れているＥＬＩＳＡ法では血液中を循環している僅かな
ウイルス蛋白質を検出できないので疾患の早期にはウイ
ルス感染を診断することが不可能なこともしばしばであ
る。しかしながら、治療が成功するためには感染を可能
な限り早期に認識することに大きな価値がある。さら
に、ウイルス感染症では血液中のウイルス濃度は疾患の
経過または治療の影響で変動する。このためウイルス粒
子の量があまりに減少するかもしれないので、常法の感
度は十分でないと思われる。このような場合、ＥＬＩＳ
Ａ検査で誤まった陰性結果を得ると疾患の経過に誤った
印象を与えることになると思われる。
【０００３】核酸検出の別の側面はバイオ技術的生産物
の品質管理である。一方では、感染性ウイルスから得て
ワクチンとして利用する免疫原性ウイルス蛋白質処理物
では夾雑するウイルス核酸の量を検討しなければならな
い。他方では、ウイルス発現系によって製造した組み換
え生成物では発現系から誘導されるかもしれない夾雑核
酸について検討する。この場合、許容される夾雑核酸の
限界値は世界保健機構は用量当り１００ｐｇ、米国食品
医薬局は用量当り１０ｐｇであると規定している。
の品質管理である。一方では、感染性ウイルスから得て
ワクチンとして利用する免疫原性ウイルス蛋白質処理物
では夾雑するウイルス核酸の量を検討しなければならな
い。他方では、ウイルス発現系によって製造した組み換
え生成物では発現系から誘導されるかもしれない夾雑核
酸について検討する。この場合、許容される夾雑核酸の
限界値は世界保健機構は用量当り１００ｐｇ、米国食品
医薬局は用量当り１０ｐｇであると規定している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ技術の発達によ
り核酸検出用の検出限界を劇的に低下させることが可能
になった。しかしながら、殊に低濃度の核酸について
は、結果の再現性は未だに大きな課題を提起している。
この理由は、一方では、技術が完成されていないこと、
および他方では検出すべき核酸のコピー数がしばしば非
常に僅かなことである。この低濃度範囲での定量的測定
において、分析誤差は当然、殊に劇しい効果を現す。
り核酸検出用の検出限界を劇的に低下させることが可能
になった。しかしながら、殊に低濃度の核酸について
は、結果の再現性は未だに大きな課題を提起している。
この理由は、一方では、技術が完成されていないこと、
および他方では検出すべき核酸のコピー数がしばしば非
常に僅かなことである。この低濃度範囲での定量的測定
において、分析誤差は当然、殊に劇しい効果を現す。
【０００５】反応器によってＰＣＲの効率が頻繁に変り
うることは、当業者にはよく知られている。この効率の
差は１０5もの差となって結果に現れてくることになろ
う。このように、公知方法で得られる定量データの再現
性は未だに不十分である。
うることは、当業者にはよく知られている。この効率の
差は１０5もの差となって結果に現れてくることになろ
う。このように、公知方法で得られる定量データの再現
性は未だに不十分である。
【０００６】ＰＣＲの再現性を改善するために、Ｇｉｌ
ｌｉｌａｎｄ（ＰＮＡＳ、８７巻：２７２５頁（１９９
０年））は競合的ＰＣＲ法を開発している。ＤＮＡ量を
測定するために内部標準の系統的希釈を用い、検体と同
時に増幅する。ＰＣＲは飽和まで実施する。これで臭化
エチジウム染色法によるＰＣＲ生成物の検出も可能にな
る。続いて、ＰＣＲ生成物をゲル上で分離し、検体のコ
ピー数を標準希釈系のコピー数と比較して、これで検体
の濃度を推測する。検体の濃度と標準の濃度が反応器中
で約１：１の比率で増幅されたとすれば、この推測濃度
は正確であると思われる。転じて、これは標準希釈の数
を多く使うほど、ＤＮＡ量の測定がより精密になること
を意味する。
ｌｉｌａｎｄ（ＰＮＡＳ、８７巻：２７２５頁（１９９
０年））は競合的ＰＣＲ法を開発している。ＤＮＡ量を
測定するために内部標準の系統的希釈を用い、検体と同
時に増幅する。ＰＣＲは飽和まで実施する。これで臭化
エチジウム染色法によるＰＣＲ生成物の検出も可能にな
る。続いて、ＰＣＲ生成物をゲル上で分離し、検体のコ
ピー数を標準希釈系のコピー数と比較して、これで検体
の濃度を推測する。検体の濃度と標準の濃度が反応器中
で約１：１の比率で増幅されたとすれば、この推測濃度
は正確であると思われる。転じて、これは標準希釈の数
を多く使うほど、ＤＮＡ量の測定がより精密になること
を意味する。
【０００７】Ｗａｎｇなど（ＰＮＡＳ、８６巻：９７１
７頁（１９８９年））はＲＮＡの定量法を提唱してい
る。このＰＣＲは指数相で停止する。様々な標準濃度で
の増幅により著者は補正曲線を提出している。指数的反
応相にあるので、ＰＣＲ生成物の数はＰＣＲサイクル数
とＲＮＡの濃度とに直接的に比例して増加し、この補正
曲線は直線となり、この直線から増幅した検体の濃度を
最終的に測定することができる。この方法の欠点はＰＣ
Ｒ生成物の最終濃度が比較的に低く、そのために検出用
には高感度の検出法を利用しなければならないことであ
る。Ｗａｎｇなどは放射能標識ヌクレオチドを使用して
いる。
７頁（１９８９年））はＲＮＡの定量法を提唱してい
る。このＰＣＲは指数相で停止する。様々な標準濃度で
の増幅により著者は補正曲線を提出している。指数的反
応相にあるので、ＰＣＲ生成物の数はＰＣＲサイクル数
とＲＮＡの濃度とに直接的に比例して増加し、この補正
曲線は直線となり、この直線から増幅した検体の濃度を
最終的に測定することができる。この方法の欠点はＰＣ
Ｒ生成物の最終濃度が比較的に低く、そのために検出用
には高感度の検出法を利用しなければならないことであ
る。Ｗａｎｇなどは放射能標識ヌクレオチドを使用して
いる。
【０００８】ＷＯ９３／２３５７３によれば、コピー数
が１０2から１０8までの範囲のウイルスＲＮＡ濃度は競
合的ＰＣＲにより測定できる。ＨＩＶ−１の多重測定で
は、この方法の再現性は変動係数０．２６±０．１５で
あると報告されている。この場合、検体対標準の濃度比
率が１：１に近づくほど測定はさらに精密になる。この
方法では標準ＲＮＡは検体を前処理した後になって添加
することに注目すべきである。しかしながら、検体を抽
出する時、ＲＮＡの５０％までは失われうる。最終的に
は、検体に最初に含まれていたＲＮＡの量は抽出後に添
加される標準に基づいて算出する。こうして、検体当り
にありうるコピー数として最低の限界が測定される。こ
れでは抽出による損失部分は考慮に入れることはできな
い。
が１０2から１０8までの範囲のウイルスＲＮＡ濃度は競
合的ＰＣＲにより測定できる。ＨＩＶ−１の多重測定で
は、この方法の再現性は変動係数０．２６±０．１５で
あると報告されている。この場合、検体対標準の濃度比
率が１：１に近づくほど測定はさらに精密になる。この
方法では標準ＲＮＡは検体を前処理した後になって添加
することに注目すべきである。しかしながら、検体を抽
出する時、ＲＮＡの５０％までは失われうる。最終的に
は、検体に最初に含まれていたＲＮＡの量は抽出後に添
加される標準に基づいて算出する。こうして、検体当り
にありうるコピー数として最低の限界が測定される。こ
れでは抽出による損失部分は考慮に入れることはできな
い。
【０００９】ＷＯ９４／２０６４０もＨＩＶ感染患者血
漿中のＨＩＶゲノム１００コピーの測定が可能であると
して競合的ＲＴ・ＰＣＲ法を記載している。それでも１
００コピーまたはそれ以下の範囲についてはＨＩＶゲノ
ムの濃度測定は推測によってのみ行っている。１０4か
ら１０6コピーまでの範囲のコピー数の測定での標準偏
差は同一血漿から三重測定を行えば２２％であり、同一
ＲＮＡ処理物の二重測定の場合には標準偏差は１５％で
ある（ＷＯ９４／２０６４０、２２頁、８〜１３行）。
ここでも、ＲＮＡの抽出効率は考慮していない。検出さ
れたＨＩＶ・ＲＮＡのコピー数は、４．４×１０3から
９．３×１０6までの範囲にある。患者一人については
１００コピーが「外挿値」であるとして記載されてい
る。そこで、低コピー数（１０3またはそれ以下）の正
確な測定のためにはこの方法が適当かどうかは全く問題
である。
漿中のＨＩＶゲノム１００コピーの測定が可能であると
して競合的ＲＴ・ＰＣＲ法を記載している。それでも１
００コピーまたはそれ以下の範囲についてはＨＩＶゲノ
ムの濃度測定は推測によってのみ行っている。１０4か
ら１０6コピーまでの範囲のコピー数の測定での標準偏
差は同一血漿から三重測定を行えば２２％であり、同一
ＲＮＡ処理物の二重測定の場合には標準偏差は１５％で
ある（ＷＯ９４／２０６４０、２２頁、８〜１３行）。
ここでも、ＲＮＡの抽出効率は考慮していない。検出さ
れたＨＩＶ・ＲＮＡのコピー数は、４．４×１０3から
９．３×１０6までの範囲にある。患者一人については
１００コピーが「外挿値」であるとして記載されてい
る。そこで、低コピー数（１０3またはそれ以下）の正
確な測定のためにはこの方法が適当かどうかは全く問題
である。
【００１０】少量のＰＣＲ生成物を検出するための改良
がＰｏｒｃｈｅｒなど（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
１３巻：１０６頁（１９９２年））によって開発され、
螢光標識プライマーおよび自動レーザー螢光ＤＮＡシー
クエンサーでのＰＣＲ生成物定量を利用している。
がＰｏｒｃｈｅｒなど（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
１３巻：１０６頁（１９９２年））によって開発され、
螢光標識プライマーおよび自動レーザー螢光ＤＮＡシー
クエンサーでのＰＣＲ生成物定量を利用している。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は検体中に存在す
る核酸の量に関して、とりわけ再現性良く非常に精密な
情報をもたらすことができ、また同時に、定量すべき核
酸の検出限界に関して記述することもできる核酸定量法
の提供を目的とする。
る核酸の量に関して、とりわけ再現性良く非常に精密な
情報をもたらすことができ、また同時に、定量すべき核
酸の検出限界に関して記述することもできる核酸定量法
の提供を目的とする。
【００１２】本発明方法である前記形式の方法は、核酸
増幅前に、相互にも、定量すべき核酸とも検出可能な特
徴少なくとも１種が異なる核酸分子少なくとも２種の既
知量を内部標準として検体に添加し、増幅した検体と標
準核酸との量を測定し、得られた量から検体中に最初に
存在していた核酸の量を決定するという点で特徴付けら
れる。
増幅前に、相互にも、定量すべき核酸とも検出可能な特
徴少なくとも１種が異なる核酸分子少なくとも２種の既
知量を内部標準として検体に添加し、増幅した検体と標
準核酸との量を測定し、得られた量から検体中に最初に
存在していた核酸の量を決定するという点で特徴付けら
れる。
【００１３】本発明方法では、驚くべきことにすべての
型の核酸について非常に正確に定量ができ、さらに再現
性が良い。
型の核酸について非常に正確に定量ができ、さらに再現
性が良い。
【００１４】核酸増幅は原理的に、Ｍｕｌｌｉｓなどが
開発した技術（米国特許４６８３１９５および４６８３
２０２）またはその他の技術に基づく方法であって、た
とえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−
ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）または連結酵素（リガーゼ）−
ＣＲ（ＬＣＲ）を示す。
開発した技術（米国特許４６８３１９５および４６８３
２０２）またはその他の技術に基づく方法であって、た
とえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−
ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）または連結酵素（リガーゼ）−
ＣＲ（ＬＣＲ）を示す。
【００１５】標準核酸は定量すべき核酸とは検出可能な
特徴少なくとも１種が異なり、さらに、同一のプライマ
ーにより増幅されることができるものでなければならな
い。定量すべき核酸とはサイズが異なるか、または独特
な制限切断部位を持っている標準核酸が便利であること
は証明されている。ＤＮＡ量を測定する時には標準核酸
は好ましくはＤＮＡであり、ＲＮＡ量を測定する時には
標準核酸は好ましくはＲＮＡである。標準として好適な
ものは定量すべき核酸とはＰＣＲ生成物において長さで
１％から２０％およびヌクレオチド数で少なくとも３
個、最大５０個違うものである。ＰＣＲ生成物が定量す
べき核酸よりも長い標準核酸を「プラス」（「＋」）標
準と記載し、ＰＣＲ生成物が定量すべき核酸よりも短い
標準核酸を「マイナス」（「−」）標準と記載すること
にする。勿論、標準核酸の精密な配列は判明していなけ
ればならない。
特徴少なくとも１種が異なり、さらに、同一のプライマ
ーにより増幅されることができるものでなければならな
い。定量すべき核酸とはサイズが異なるか、または独特
な制限切断部位を持っている標準核酸が便利であること
は証明されている。ＤＮＡ量を測定する時には標準核酸
は好ましくはＤＮＡであり、ＲＮＡ量を測定する時には
標準核酸は好ましくはＲＮＡである。標準として好適な
ものは定量すべき核酸とはＰＣＲ生成物において長さで
１％から２０％およびヌクレオチド数で少なくとも３
個、最大５０個違うものである。ＰＣＲ生成物が定量す
べき核酸よりも長い標準核酸を「プラス」（「＋」）標
準と記載し、ＰＣＲ生成物が定量すべき核酸よりも短い
標準核酸を「マイナス」（「−」）標準と記載すること
にする。勿論、標準核酸の精密な配列は判明していなけ
ればならない。
【００１６】本発明の方法によれば、好ましくは標準は
いくつかの濃度で使用し、その一つは検出限界の僅かに
上の濃度で添加する。
いくつかの濃度で使用し、その一つは検出限界の僅かに
上の濃度で添加する。
【００１７】増幅過程で使用するプライマーは、好まし
くは増幅核酸の検出限界を増加する基、たとえば螢光基
または放射能活性基または類縁蛋白質と後続検出反応と
で検出できる化学的基（たとえば、ビオチン−アビジ
ン、ＤＩＧ標識その他）を含むが、螢光基を持つプライ
マーは殊に好適である。
くは増幅核酸の検出限界を増加する基、たとえば螢光基
または放射能活性基または類縁蛋白質と後続検出反応と
で検出できる化学的基（たとえば、ビオチン−アビジ
ン、ＤＩＧ標識その他）を含むが、螢光基を持つプライ
マーは殊に好適である。
【００１８】増幅後の核酸量の測定（核酸量とは基本的
にはＤＮＡまたはＲＮＡの量であると理解すべきであっ
て、核酸の量は、たとえば重さ（ｍｇ、μｇ、ｎｇ、ｐ
ｇ）の形で表現しうるし、またはある核酸分子のコピー
数としても示しうる）は種々の方法で実施しうるが、多
くの場合、増幅した定量すべき核酸から増幅した標準核
酸を分離し、分離した核酸の量を個別に測定する段階を
含む。好ましくは、この分離段階はゲル電気泳動または
クロマトグラフィー法から構成しうる。
にはＤＮＡまたはＲＮＡの量であると理解すべきであっ
て、核酸の量は、たとえば重さ（ｍｇ、μｇ、ｎｇ、ｐ
ｇ）の形で表現しうるし、またはある核酸分子のコピー
数としても示しうる）は種々の方法で実施しうるが、多
くの場合、増幅した定量すべき核酸から増幅した標準核
酸を分離し、分離した核酸の量を個別に測定する段階を
含む。好ましくは、この分離段階はゲル電気泳動または
クロマトグラフィー法から構成しうる。
【００１９】自動的で分離と定量との段階を結合した検
出法は殊に適当であることが証明されている。本発明方
法の好適な態様では、増幅した核酸の量の測定を核酸検
出装置、好ましくは螢光感受性核酸検出器を使用して行
うことから構成される。このような核酸検出器の例はレ
ーザー誘発螢光測定装置を持つ自動ＤＮＡシークエンサ
ー（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社のＧｅｎｅ・Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）３７３Ａ）また
はＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動装置である。こ
れら装置によって、長さの違いがｂｐ１個に過ぎない核
酸分子を分離することが可能である。
出法は殊に適当であることが証明されている。本発明方
法の好適な態様では、増幅した核酸の量の測定を核酸検
出装置、好ましくは螢光感受性核酸検出器を使用して行
うことから構成される。このような核酸検出器の例はレ
ーザー誘発螢光測定装置を持つ自動ＤＮＡシークエンサ
ー（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社のＧｅｎｅ・Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）３７３Ａ）また
はＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動装置である。こ
れら装置によって、長さの違いがｂｐ１個に過ぎない核
酸分子を分離することが可能である。
【００２０】Ｇｅｎｅ・Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）の特殊
な長所の一つは一つのレーン上で種々の螢光染料を区別
できることである。これによりゲル上の使えるレーンの
全てを異なる検体に使用できるので多数の検体を一つの
ゲル上で同時に処理できる。さらに、異なる螢光染料で
標識した複数のＰＣＲ生成物を一つのレーン上で分析で
きる（多重ＰＣＲ）。たとえば、検体中の異なる核酸２
種を同時に検出する時には追加的な費用と価格は半分近
くに節約できる。本発明方法をルーチン操作に使用する
時、たとえば血液検体のＨＩＶおよびＨＣＶを検査する
ような時には、このことは殊に有利である。これとは対
照的に、ＰｏｒｃｈｅｒなどがＰＣＲ生成物分析用に使
用した自動レーザー螢光ＤＮＡシークエンサーはレーン
当り螢光染料１種のみ（従ってＤＮＡ１種のみ）が分析
できる。
な長所の一つは一つのレーン上で種々の螢光染料を区別
できることである。これによりゲル上の使えるレーンの
全てを異なる検体に使用できるので多数の検体を一つの
ゲル上で同時に処理できる。さらに、異なる螢光染料で
標識した複数のＰＣＲ生成物を一つのレーン上で分析で
きる（多重ＰＣＲ）。たとえば、検体中の異なる核酸２
種を同時に検出する時には追加的な費用と価格は半分近
くに節約できる。本発明方法をルーチン操作に使用する
時、たとえば血液検体のＨＩＶおよびＨＣＶを検査する
ような時には、このことは殊に有利である。これとは対
照的に、ＰｏｒｃｈｅｒなどがＰＣＲ生成物分析用に使
用した自動レーザー螢光ＤＮＡシークエンサーはレーン
当り螢光染料１種のみ（従ってＤＮＡ１種のみ）が分析
できる。
【００２１】そこで、本発明方法の好適な態様は、得ら
れた増幅検体および標準核酸のいくつかの量を同じ検体
中で多重分析を用いて決定する方法に関する。
れた増幅検体および標準核酸のいくつかの量を同じ検体
中で多重分析を用いて決定する方法に関する。
【００２２】本発明の好適な態様では増幅段階を指数的
生長相の間に停止する。
生長相の間に停止する。
【００２３】そこで、増幅した標準のコピー数の比率は
定量すべき配列のコピー数に直接に比例する。さらに、
単一標準の共増幅によって定量すべき核酸のコピー数を
測定できる。この点で、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法
ではさらに精密な多数の標準が異なる検体について異な
る希釈で使用されるが、本発明方法では異なる標準分子
少なくとも２種またはそれ以上についての一回だけの測
定が検体ごとに必要である点で、頻繁に実用されている
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法よりもずっと有利であ
る。
定量すべき配列のコピー数に直接に比例する。さらに、
単一標準の共増幅によって定量すべき核酸のコピー数を
測定できる。この点で、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法
ではさらに精密な多数の標準が異なる検体について異な
る希釈で使用されるが、本発明方法では異なる標準分子
少なくとも２種またはそれ以上についての一回だけの測
定が検体ごとに必要である点で、頻繁に実用されている
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄなどの方法よりもずっと有利であ
る。
【００２４】本発明方法の殊に好適な応用分野には微生
物からの核酸の定量があり、好ましくはＨＩＶ、パルボ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣ
Ｖ、バキュロウイルス、アデノウイルス、インフルエン
ザウイルス、ワクチニアウイルス、ボレリア菌種、サル
モネラ菌種または酵母からの核酸である。これら微生物
は病原菌として、またワクチン製造と組み換え蛋白質製
造とでの利用の故に、意味がある。
物からの核酸の定量があり、好ましくはＨＩＶ、パルボ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣ
Ｖ、バキュロウイルス、アデノウイルス、インフルエン
ザウイルス、ワクチニアウイルス、ボレリア菌種、サル
モネラ菌種または酵母からの核酸である。これら微生物
は病原菌として、またワクチン製造と組み換え蛋白質製
造とでの利用の故に、意味がある。
【００２５】殊に、本発明方法はバイオ技術的生産物中
の夾雑物として残留しうるウイルス核酸の定量において
応用する。好ましくは、これらバイオ技術的生成物はバ
イオ技術により感染性ウイルスから得られた免疫原的ウ
イルス蛋白質またはウイルス部分であるか、またはそれ
らはウイルスの発現系を用いた組み換え生成物でありう
るし、また発現系のウイルス核酸を夾雑物を含みうるも
のである。
の夾雑物として残留しうるウイルス核酸の定量において
応用する。好ましくは、これらバイオ技術的生成物はバ
イオ技術により感染性ウイルスから得られた免疫原的ウ
イルス蛋白質またはウイルス部分であるか、またはそれ
らはウイルスの発現系を用いた組み換え生成物でありう
るし、また発現系のウイルス核酸を夾雑物を含みうるも
のである。
【００２６】好ましくは、ウイルス核酸は生物学的検体
中、殊にヒト血漿およびその処理物中で、本発明方法に
従って定量する。本方法により、たとえば感染症の経過
またはワクチン化または治療による処置の監視、をより
よく、さらに精密な方法で監視することができる。
中、殊にヒト血漿およびその処理物中で、本発明方法に
従って定量する。本方法により、たとえば感染症の経過
またはワクチン化または治療による処置の監視、をより
よく、さらに精密な方法で監視することができる。
【００２７】ここでは、本発明方法によりこれらウイル
スの感染量の少なくとも十分の一またはそれ以下の濃度
で病原性ウイルスを測定できることが殊に重要である。
スの感染量の少なくとも十分の一またはそれ以下の濃度
で病原性ウイルスを測定できることが殊に重要である。
【００２８】定量すべき検体の操作法に影響されずに、
検体中核酸のできるだけ精密な定量値を得るために、本
発明の好適な態様に従って検体に標準を、好ましくは抽
出工程の前に、直接添加し、続いて検体核酸と標準核酸
とを同じ操作に付す（共抽出）。これで間違いなく再現
性が増すばかりでなく、さらに検体の操作と無関係な定
量結果を得ることが可能になる。
検体中核酸のできるだけ精密な定量値を得るために、本
発明の好適な態様に従って検体に標準を、好ましくは抽
出工程の前に、直接添加し、続いて検体核酸と標準核酸
とを同じ操作に付す（共抽出）。これで間違いなく再現
性が増すばかりでなく、さらに検体の操作と無関係な定
量結果を得ることが可能になる。
【００２９】本発明の別の側面は標準核酸少なくとも１
種を検出限界より僅かに上の濃度で使用する、ある核酸
の検出限界測定法に関する。
種を検出限界より僅かに上の濃度で使用する、ある核酸
の検出限界測定法に関する。
【００３０】好ましくは、次式に従ってコピー数として
核酸の量を算出する：
核酸の量を算出する：
【数１】 Ｎsample＝Ａsample／Ａstandard×Ｎstandard×Ｆ×Ｄ ［式中、Ａsampleは検体の増幅された核酸のピーク面積
である。Ａstandardは増幅された内部標準のピーク面積
である。Ｎstandardは使用した内部標準のコピー数であ
る。Ｆは抽出容積に対する単位容積の比である。Ｄは
（抽出前に検体を希釈した場合の）希釈係数である］
である。Ａstandardは増幅された内部標準のピーク面積
である。Ｎstandardは使用した内部標準のコピー数であ
る。Ｆは抽出容積に対する単位容積の比である。Ｄは
（抽出前に検体を希釈した場合の）希釈係数である］
【００３１】本発明方法の特別な応用分野で夾雑ウイル
ス核酸を定量する場合、核酸の量をＷＨＯおよびＦＤＡ
の規定に合致させるためにｐｇ／ｍＬで表す。そのため
に、本発明により、次式を使用する：
ス核酸を定量する場合、核酸の量をＷＨＯおよびＦＤＡ
の規定に合致させるためにｐｇ／ｍＬで表す。そのため
に、本発明により、次式を使用する：
【数２】 ｍ（検体）＝Ａs／Ａst×Ｎst×Ｆ１×Ｄ×Ｆ２ ［式中、Ａsは検体のＰＣＲ生成物のピーク面積であ
る。Ａstは標準のＰＣＲ生成物のピーク面積である。Ｎ
stは標準プラスミドのコピー数である。Ｆ１は抽出容積
に対する単位容積の比である。Ｄは検体の希釈係数（要
すれば）である。Ｆ２はｐｇで表したウイルス分子の質
量である（ウイルスＤＮＡの分子量／アボガドロ定
数）］
る。Ａstは標準のＰＣＲ生成物のピーク面積である。Ｎ
stは標準プラスミドのコピー数である。Ｆ１は抽出容積
に対する単位容積の比である。Ｄは検体の希釈係数（要
すれば）である。Ｆ２はｐｇで表したウイルス分子の質
量である（ウイルスＤＮＡの分子量／アボガドロ定
数）］
【００３２】本発明方法によれば様々な濃度の標準少な
くとも２種を使用するので、前記の計算式に従えば検体
濃度に計算値少なくとも２個が得られ、これから最終的
には平均値を算出する。ルーチン的操作法によれば、通
例は各検体につき標準少なくとも２個について２組の分
析を行うので最終的に計算値４個からの平均値をその検
体濃度について算出することができる。
くとも２種を使用するので、前記の計算式に従えば検体
濃度に計算値少なくとも２個が得られ、これから最終的
には平均値を算出する。ルーチン的操作法によれば、通
例は各検体につき標準少なくとも２個について２組の分
析を行うので最終的に計算値４個からの平均値をその検
体濃度について算出することができる。
【００３３】本発明方法は殊に高い再現性によって特徴
付けられる。多重測定から得られる標準偏差は大きくと
も１５％であるが、コピー数が１０2の低濃度範囲では
一般には１０％またはそれ以下である。このきわめて小
さな標準偏差は多重測定では個々の検体および標準がそ
れぞれの時に別々の時に調製され、操作における誤差お
よび検体抽出とＰＣＲとの効率の偏差自体がこれらの標
準偏差に含まれていることを考えると殊に驚くべきこと
である。
付けられる。多重測定から得られる標準偏差は大きくと
も１５％であるが、コピー数が１０2の低濃度範囲では
一般には１０％またはそれ以下である。このきわめて小
さな標準偏差は多重測定では個々の検体および標準がそ
れぞれの時に別々の時に調製され、操作における誤差お
よび検体抽出とＰＣＲとの効率の偏差自体がこれらの標
準偏差に含まれていることを考えると殊に驚くべきこと
である。
【００３４】ＷＯ９３／２３５７３およびＷＯ９４／２
０６４０には検体調製後いくつかの部分に分割し、これ
らの部分を再現性測定に用いて標準偏差０．２６±０．
１５または２２％または１５％が得られたと記載してい
る。そこで、検体抽出またはＲＴ−ＰＣＲの各々に起因
する効率変動はこの標準偏差の測定には含まれないの
で、必然的に歪曲されてはいるが高い再現性を示す。
０６４０には検体調製後いくつかの部分に分割し、これ
らの部分を再現性測定に用いて標準偏差０．２６±０．
１５または２２％または１５％が得られたと記載してい
る。そこで、検体抽出またはＲＴ−ＰＣＲの各々に起因
する効率変動はこの標準偏差の測定には含まれないの
で、必然的に歪曲されてはいるが高い再現性を示す。
【００３５】ＰＣＲの効率は、たとえば増幅すべき核酸
分子の型により影響される。本発明方法がＲＮＡウイル
ス測定に使用される時、逆転写は不完全であり、存在す
るＲＮＡの数％だけが実際に転写されているものと思わ
れるという一般的に公知の問題に直面する。さらに、
「＋」標準と「−」標準との各々の増幅効率は各測定に
おいて相違しうるが、平均値では等しいことが証明され
た。これは測定すべき濃度に変動をもたらす。
分子の型により影響される。本発明方法がＲＮＡウイル
ス測定に使用される時、逆転写は不完全であり、存在す
るＲＮＡの数％だけが実際に転写されているものと思わ
れるという一般的に公知の問題に直面する。さらに、
「＋」標準と「−」標準との各々の増幅効率は各測定に
おいて相違しうるが、平均値では等しいことが証明され
た。これは測定すべき濃度に変動をもたらす。
【００３６】本発明の好適態様に従えば、様々な量の標
準核酸少なくとも２種を増幅前に検体に添加すること
で、得られる情報が増加する。
準核酸少なくとも２種を増幅前に検体に添加すること
で、得られる情報が増加する。
【００３７】検体濃度の測定における他の不正確さを排
除するため、ルーチン操作では検体毎に適量２個を測定
し、標準少なくとも２個を共増幅する。こうして、検体
毎に測定値４個を得て、これから平均値を算出できる。
実施例には本方法の精密性と再現性を明示する。本方法
が広範囲の濃度にわたって再現性が得られることも明示
する。
除するため、ルーチン操作では検体毎に適量２個を測定
し、標準少なくとも２個を共増幅する。こうして、検体
毎に測定値４個を得て、これから平均値を算出できる。
実施例には本方法の精密性と再現性を明示する。本方法
が広範囲の濃度にわたって再現性が得られることも明示
する。
【００３８】本発明方法の好適な態様では、定量すべき
核酸とは長さが違う標準核酸２種の中で、好ましくは１
種は定量すべき核酸より短い標準核酸配列、他種は定量
すべき核酸より長い標準核酸配列を使用する。殊に好適
な長さの相違の範囲は１％と２０％との間である。
核酸とは長さが違う標準核酸２種の中で、好ましくは１
種は定量すべき核酸より短い標準核酸配列、他種は定量
すべき核酸より長い標準核酸配列を使用する。殊に好適
な長さの相違の範囲は１％と２０％との間である。
【００３９】本発明方法のためには一本鎖化した型のＰ
ＣＲに内部標準核酸を添加するのが有利であることが証
明されている。そして、増幅すべき核酸の種々の型に基
づく反応効率の相違がさらに相殺される。
ＣＲに内部標準核酸を添加するのが有利であることが証
明されている。そして、増幅すべき核酸の種々の型に基
づく反応効率の相違がさらに相殺される。
【００４０】核酸の定量化における重要問題は−前述の
とおり−感度と再現性である。本発明方法では１から５
００コピーの範囲の核酸の量が実質的に先行技術に記載
されている方法より精密にそして再現性よく測定するこ
とができる。しかしながら、本方法の再現性の限界には
達していない。
とおり−感度と再現性である。本発明方法では１から５
００コピーの範囲の核酸の量が実質的に先行技術に記載
されている方法より精密にそして再現性よく測定するこ
とができる。しかしながら、本方法の再現性の限界には
達していない。
【００４１】本発明方法の使用範囲は、たとえば、殊に
血液および血液製剤およびバイオ技術生成物のような生
物学的検体の核酸に関する定性的および定量的分析を含
む。別の応用分野の例は診断および／または感染症経過
の監視ならびにワクチン化および療法による処置の監視
である。
血液および血液製剤およびバイオ技術生成物のような生
物学的検体の核酸に関する定性的および定量的分析を含
む。別の応用分野の例は診断および／または感染症経過
の監視ならびにワクチン化および療法による処置の監視
である。
【００４２】本発明の重要な側面は生物学的製剤、殊に
本発明方法で測定して用量当り１０または１００ｐｇの
許容限界またはそれ以下の核酸含量、好ましくは検体当
り１から１００コピーまでの範囲またはそれ以下、すな
わち実質上核酸不含と見做すことができるバイオ技術的
製品に関する。
本発明方法で測定して用量当り１０または１００ｐｇの
許容限界またはそれ以下の核酸含量、好ましくは検体当
り１から１００コピーまでの範囲またはそれ以下、すな
わち実質上核酸不含と見做すことができるバイオ技術的
製品に関する。
【００４３】好適な製品はウイルスおよびｇｐ１６０の
ような細菌蛋白質、組み換え血液因子、血漿蛋白質なら
びにワクチン、殊にヘルペス、インフルエンザ、ＴＢ
Ｅ、パルボまたは肝炎ウイルスに対するワクチンおよび
モノクローナル抗体を含む。
ような細菌蛋白質、組み換え血液因子、血漿蛋白質なら
びにワクチン、殊にヘルペス、インフルエンザ、ＴＢ
Ｅ、パルボまたは肝炎ウイルスに対するワクチンおよび
モノクローナル抗体を含む。
【００４４】別の側面では、本発明は生物学的検体中の
核酸の検出に使用する本発明方法の使用に関する。
核酸の検出に使用する本発明方法の使用に関する。
【００４５】さらに背景として、殊にワクチンまたはバ
イオ技術蛋白質製品の分野における品質管理の問題に直
面している。そこで、霊長類の細胞培養物中に夾雑する
核酸（染色体のＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスのＤＮＡおよ
びＲＮＡ）を測定する時に、もし使用するプライマーが
特異的であれば、生産中の操作によるまたは製品調製中
に生じる夾雑物に本発明方法は対応することができる。
しかしながら、もし組み換え蛋白質生産が、たとえばＣ
ＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（幼若ハ
ムスター腎臓細胞）またはＣＥＣ（ニワトリ胚細胞）の
ような非霊長類の細胞培養物中で行われるなら、検体操
作が起こす夾雑物の問題が除かれるので検出限界は本発
明方法ではずっと低い。ＣＨＯ、ｖｅｒｏ（サル細胞
系）、ＢＨＫ、ＳＫ・Ｈｅｐｌ（ヒト肝臓細胞系）、ハ
イブリドーマまたはＣＥＣ細胞などに由来する核酸につ
いては、これら細胞培養物がワクチン生産においてまた
はバイオ技術生産蛋白質の生産にもっとも普通に使用さ
れるので、本発明の定量法の使用は殊に好適である。
イオ技術蛋白質製品の分野における品質管理の問題に直
面している。そこで、霊長類の細胞培養物中に夾雑する
核酸（染色体のＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスのＤＮＡおよ
びＲＮＡ）を測定する時に、もし使用するプライマーが
特異的であれば、生産中の操作によるまたは製品調製中
に生じる夾雑物に本発明方法は対応することができる。
しかしながら、もし組み換え蛋白質生産が、たとえばＣ
ＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（幼若ハ
ムスター腎臓細胞）またはＣＥＣ（ニワトリ胚細胞）の
ような非霊長類の細胞培養物中で行われるなら、検体操
作が起こす夾雑物の問題が除かれるので検出限界は本発
明方法ではずっと低い。ＣＨＯ、ｖｅｒｏ（サル細胞
系）、ＢＨＫ、ＳＫ・Ｈｅｐｌ（ヒト肝臓細胞系）、ハ
イブリドーマまたはＣＥＣ細胞などに由来する核酸につ
いては、これら細胞培養物がワクチン生産においてまた
はバイオ技術生産蛋白質の生産にもっとも普通に使用さ
れるので、本発明の定量法の使用は殊に好適である。
【００４６】勿論、プライマー対の選択は良い定量結果
を得るためには重要な因子である。そこで本発明は他の
側面において、本方法に使用する下記プライマーに関す
る： ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
を得るためには重要な因子である。そこで本発明は他の
側面において、本方法に使用する下記プライマーに関す
る： ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
【化１】 ＨＡＶ−２１７２：ＨＡＶ２１９６〜２１７２（配列番
号４）
号４）
【化２】 （番号付けはＣｏｈｅｎなど（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による） ＨＣＶＥＸＴ３２：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による） ＨＣＶＥＸＴ３２：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
【化３】 ＨＣＶＰＴ４：ＨＣＶ１５８〜１３９（配列番号６）
【化４】 （番号付けはＨａｎなど（ＰＮＡＳ、８８巻：１７１１
〜１７１５頁（１９９１年）による） ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
〜１７１５頁（１９９１年）による） ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
【化５】 ＨＢＶ−１９６０Ｂ：ＨＢＶ１９８３〜１９６０（配列
番号８）
番号８）
【化６】 （番号付けはＦｕｊｉｙａｍａなど（Ｎｕｃｌｅｉｃ・
Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１１巻：４６０１〜４６１０頁
（１９８３年）による） ｏｐｒｌ−ｒ：ワクチニア８４６２５〜８４６４４（配
列番号９）
Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１１巻：４６０１〜４６１０頁
（１９８３年）による） ｏｐｒｌ−ｒ：ワクチニア８４６２５〜８４６４４（配
列番号９）
【化７】 ｏｐｒｌ−ｆ：ワクチニア８４７６１〜８４７４３（配
列番号１０）
列番号１０）
【化８】 （番号付けはＧｏｅｂｅｌなど（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による） ｇＤ１：ＨＳＶ１３８３６４〜１３８３８１（配列番号
１１）
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による） ｇＤ１：ＨＳＶ１３８３６４〜１３８３８１（配列番号
１１）
【化９】 ｇＤ２Ｒ／Ｂ：ＨＳＶ１３８４７７〜１３８４５６（配
列番号１２）
列番号１２）
【化１０】 （ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．など、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢ
ａｎｋ・ＩＤ・ＨＥ１ＣＧ）
ａｎｋ・ＩＤ・ＨＥ１ＣＧ）
【００４７】また、標準製造用プラスミド、すなわち ｐｇａｇ１（既知ｐＢＳ／ＳＫ-プラスミドおよび多重
クローニング部位のＰｓｔＩとＡｐａＩ部位との間の挿
入から構成され、その挿入部はＲａｔｎｅｒなど（Ｎａ
ｔｕｒｅ、３１３巻：２７７〜２８４頁（１９８５
年））によるＨＩＶ−１配列の１４１７から２００８ま
での塩基対（ｂｐ）を含む） ｐｇａｇ−１５（ｐｇａｇ１からＲａｔｎｅｒなどのＨ
ＩＶ−１配列ｂｐ１５９３から始まる１５ｂｐの欠失で
誘導される） ｐｇａｇ＋１２（ｐｇａｇ１からｂｐ１５９３部位での
１２ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＡＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよびｐＣ
ＲＩＩプラスミドの多重クローニング部位での挿入から
構成され、その挿入部はＣｏｈｅｎなどのｃＤＮＡ配列
のｂｐ２０２０から２２２６までを含む） ｐＨＡＶ−１０ｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからＣｏｈｅｎなど
のＨＡＶ配列のｂｐ２１００から始まる１０ｂｐの欠失
で誘導される） ｐＨＡＶ＋９ｂｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからｂｐ２１００部
位での９ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＣＶ−ｗｔ（既知ｐＢＳ／ＳＫ-プラスミドおよび
このプラスミドのＥｃｏＲＶ部位への挿入から構成さ
れ、その挿入部はＨａｎなどによるｃＤＮＡ配列ｂｐ２
７から３１３までを含む） ｐＨＣＶ−７ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからＨａｎなどによ
るＨＣＶ配列ｂｐ１２６から開始する７ｂｐの欠失から
誘導される） ｐＨＣＶ＋８ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからｂｐ１２６部位
への８ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導され
る） ｐＨＢＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよび挿入
から構成され、その挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどによ
るＨＢＶゲノムのｂｐ１７６３から２０３２を含む） ｐＨＢＶ−９ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからＦｕｊｉｙａｍ
ａなどによるＨＢＶ配列ｂｐ１８６８から開始する９ｂ
ｐの欠失から誘導される） ｐＨＢＶ＋１２ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからｂｐ１８６８
部位への１２ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導
される） ｐＶＶ−ｗｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の既知ｐＴＺ１９
ＲプラスミドおよびこのプラスミドのＰｖｕＩＩ部位２
個の間への挿入から構成され、その挿入部はワクチニア
ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子のｂｐ８３８５５か
ら８４７６１まで（Ｇｏｅｂｅｌなど、１９９０年によ
る）を含む） ＰＶＶ−２１（ｐＶＶ−ｗｔから２１ヌクレオチド（ｂ
ｐ８４７１８から８４７３８まで）の欠失で誘導され
る） ＰＶＶ＋２４（ｐＶＶ−ｗｔから８４７１３部位への２
４ｂｐの挿入で誘導される） ｐＨｅｒｐ（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎ製の既知ｐＣＲＩ
Ｉプラスミドおよび挿入から構成され、その挿入部はＭ
ｃＧｅｏｃｈなど、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＤＥ・
１・ＣＧ１によるＨＳＶゲノムのｂｐ１３８３６４から
１３８７８４までを含む） ｐＨｅｒｐ−９（ｐ−Ｈｅｒｐから９ヌクレオチド（ｂ
ｐ１３８３８８から１３８３９６まで）の欠失で誘導さ
れる） ｐＨｅｒｐ＋１０（ｐ−Ｈｅｒｐからｂｐ１３８４０７
への１０ｂｐの挿入で誘導される）
クローニング部位のＰｓｔＩとＡｐａＩ部位との間の挿
入から構成され、その挿入部はＲａｔｎｅｒなど（Ｎａ
ｔｕｒｅ、３１３巻：２７７〜２８４頁（１９８５
年））によるＨＩＶ−１配列の１４１７から２００８ま
での塩基対（ｂｐ）を含む） ｐｇａｇ−１５（ｐｇａｇ１からＲａｔｎｅｒなどのＨ
ＩＶ−１配列ｂｐ１５９３から始まる１５ｂｐの欠失で
誘導される） ｐｇａｇ＋１２（ｐｇａｇ１からｂｐ１５９３部位での
１２ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＡＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよびｐＣ
ＲＩＩプラスミドの多重クローニング部位での挿入から
構成され、その挿入部はＣｏｈｅｎなどのｃＤＮＡ配列
のｂｐ２０２０から２２２６までを含む） ｐＨＡＶ−１０ｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからＣｏｈｅｎなど
のＨＡＶ配列のｂｐ２１００から始まる１０ｂｐの欠失
で誘導される） ｐＨＡＶ＋９ｂｐ（ｐＨＡＶ−ｗｔからｂｐ２１００部
位での９ヌクレオチドの挿入を行って誘導される） ｐＨＣＶ−ｗｔ（既知ｐＢＳ／ＳＫ-プラスミドおよび
このプラスミドのＥｃｏＲＶ部位への挿入から構成さ
れ、その挿入部はＨａｎなどによるｃＤＮＡ配列ｂｐ２
７から３１３までを含む） ｐＨＣＶ−７ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからＨａｎなどによ
るＨＣＶ配列ｂｐ１２６から開始する７ｂｐの欠失から
誘導される） ｐＨＣＶ＋８ｂｐ（ｐＨＣＶ−ｗｔからｂｐ１２６部位
への８ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導され
る） ｐＨＢＶ−ｗｔ（既知ｐＣＲＩＩプラスミドおよび挿入
から構成され、その挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどによ
るＨＢＶゲノムのｂｐ１７６３から２０３２を含む） ｐＨＢＶ−９ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからＦｕｊｉｙａｍ
ａなどによるＨＢＶ配列ｂｐ１８６８から開始する９ｂ
ｐの欠失から誘導される） ｐＨＢＶ＋１２ｂｐ（ｐＨＢＶ−ｗｔからｂｐ１８６８
部位への１２ヌクレオチドの挿入を行うことにより誘導
される） ｐＶＶ−ｗｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の既知ｐＴＺ１９
ＲプラスミドおよびこのプラスミドのＰｖｕＩＩ部位２
個の間への挿入から構成され、その挿入部はワクチニア
ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子のｂｐ８３８５５か
ら８４７６１まで（Ｇｏｅｂｅｌなど、１９９０年によ
る）を含む） ＰＶＶ−２１（ｐＶＶ−ｗｔから２１ヌクレオチド（ｂ
ｐ８４７１８から８４７３８まで）の欠失で誘導され
る） ＰＶＶ＋２４（ｐＶＶ−ｗｔから８４７１３部位への２
４ｂｐの挿入で誘導される） ｐＨｅｒｐ（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎ製の既知ｐＣＲＩ
Ｉプラスミドおよび挿入から構成され、その挿入部はＭ
ｃＧｅｏｃｈなど、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＤＥ・
１・ＣＧ１によるＨＳＶゲノムのｂｐ１３８３６４から
１３８７８４までを含む） ｐＨｅｒｐ−９（ｐ−Ｈｅｒｐから９ヌクレオチド（ｂ
ｐ１３８３８８から１３８３９６まで）の欠失で誘導さ
れる） ｐＨｅｒｐ＋１０（ｐ−Ｈｅｒｐからｂｐ１３８４０７
への１０ｂｐの挿入で誘導される）
【００４８】別の側面では、本発明は検体中の核酸を定
量するためのキットに関し、次のものを含む： 相互にも、定量すべき核酸とも、検出できる特徴の少
なくとも一つが異なる内部標準としての既知核酸少なく
とも２種、 標準核酸と定量すべき核酸とに結合する蛍光標識した
プライマー、 目的とする核酸既知量を含むポジティブコントロー
ル、 目的とするウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネ
ガティブコントロール、 マニュアル（操作法）。 本発明のキットの好適な態様は次の通りである。 １．プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２
から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準
少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＳＫ３８およびＳＫ３９、 ＨＩＶ−１粒子既知量を含むポジティブコントロー
ル、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＩＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ２．プラスミドｐＨＣＶ−７およびｐＨＣＶ＋８から
試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少な
くとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＣＶ３２ＥｘｔおよびＨＣ
ＶＰＴ４、 ＨＣＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ３．プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐＨＡＶ＋９か
ら試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少
なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＡＶ＋２０５８およびＨＡ
Ｖ−２１７２、 ＨＡＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＡＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ４．プラスミドｐＨＢＶ−９およびｐＨＢＶ＋１２を
含む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＢＶ＋１７８０およびＨＢ
Ｖ−１９６０Ｂ、 ＨＢＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＢＶ−ＤＮＡを定量するためのキッ
ト。 ５．内部標識プラスミドｐＨｅｒｐ−９およびＨｅｒ
ｐ＋１０、 蛍光標識したプライマーｇＤＲ／ＢおよびｇＤＲ２Ｒ
／Ｂ、 ＨＳＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＳＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。
量するためのキットに関し、次のものを含む： 相互にも、定量すべき核酸とも、検出できる特徴の少
なくとも一つが異なる内部標準としての既知核酸少なく
とも２種、 標準核酸と定量すべき核酸とに結合する蛍光標識した
プライマー、 目的とする核酸既知量を含むポジティブコントロー
ル、 目的とするウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネ
ガティブコントロール、 マニュアル（操作法）。 本発明のキットの好適な態様は次の通りである。 １．プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２
から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準
少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＳＫ３８およびＳＫ３９、 ＨＩＶ−１粒子既知量を含むポジティブコントロー
ル、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＩＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ２．プラスミドｐＨＣＶ−７およびｐＨＣＶ＋８から
試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少な
くとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＣＶ３２ＥｘｔおよびＨＣ
ＶＰＴ４、 ＨＣＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ３．プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐＨＡＶ＋９か
ら試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む内部標準少
なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＡＶ＋２０５８およびＨＡ
Ｖ−２１７２、 ＨＡＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＡＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。 ４．プラスミドｐＨＢＶ−９およびｐＨＢＶ＋１２を
含む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＢＶ＋１７８０およびＨＢ
Ｖ−１９６０Ｂ、 ＨＢＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＢＶ−ＤＮＡを定量するためのキッ
ト。 ５．内部標識プラスミドｐＨｅｒｐ−９およびＨｅｒ
ｐ＋１０、 蛍光標識したプライマーｇＤＲ／ＢおよびｇＤＲ２Ｒ
／Ｂ、 ＨＳＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＳＶ−ＲＮＡを定量するためのキッ
ト。
【００４９】
【実施例】本発明を次の実施例および関連図面によって
さらに詳細に説明するが、しかしながら、これに限定す
るものでない。殊に実施例では本発明方法が多彩な検体
での優れた迅速かつ精密で高再現性のルーチン用に適す
る核酸の定量法であることを例示する。図１にはｐｇａ
ｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２のクローニングを、図２
にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＩＶの定量結果を、図３および
図４にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＡＶの定量結果を、および
図５、図６、図７、図８および図９にはＨＢＶの定量結
果を例示する。図１０、図１１、図１２および図１３は
配列プロトコールである。
さらに詳細に説明するが、しかしながら、これに限定す
るものでない。殊に実施例では本発明方法が多彩な検体
での優れた迅速かつ精密で高再現性のルーチン用に適す
る核酸の定量法であることを例示する。図１にはｐｇａ
ｇ−１５およびｐｇａｇ＋１２のクローニングを、図２
にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＩＶの定量結果を、図３および
図４にはＲＴ−ＰＣＲでのＨＡＶの定量結果を、および
図５、図６、図７、図８および図９にはＨＢＶの定量結
果を例示する。図１０、図１１、図１２および図１３は
配列プロトコールである。
【００５０】１．一般的実施指針： １．１．方法の原理 種々の起源からの核酸は螢光基を含むプライマーを用い
るＰＣＲによって増幅される（Ｓａｉｋｉなど、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２３９巻：４８７〜４９１頁（１９８５
年））。増幅されたＰＣＲ生成物の分析と定量とはレー
ザー誘発螢光測定器を持つ自動ＤＮＡシークエンサー
（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＤＮＡ・Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｒ・３７３Ａ／Ｇｅｎｅ・Ｓｃａｎ（商
標）ソフトウエアー）を用いて実施した。この装置はポ
リアクリルアミドゲル中で変性条件下にゲル電気泳動す
ることによって螢光標識ＰＣＲ生成物を大きさに従って
分離し、その量を定量的に測定することができる。検体
中のある配列のコピー数は定量すべき核酸および内部標
準少なくとも２個について得られたＰＣＲ生成物の強度
を基にして測定する。
るＰＣＲによって増幅される（Ｓａｉｋｉなど、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２３９巻：４８７〜４９１頁（１９８５
年））。増幅されたＰＣＲ生成物の分析と定量とはレー
ザー誘発螢光測定器を持つ自動ＤＮＡシークエンサー
（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＤＮＡ・Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｒ・３７３Ａ／Ｇｅｎｅ・Ｓｃａｎ（商
標）ソフトウエアー）を用いて実施した。この装置はポ
リアクリルアミドゲル中で変性条件下にゲル電気泳動す
ることによって螢光標識ＰＣＲ生成物を大きさに従って
分離し、その量を定量的に測定することができる。検体
中のある配列のコピー数は定量すべき核酸および内部標
準少なくとも２個について得られたＰＣＲ生成物の強度
を基にして測定する。
【００５１】１．２．１．ウイルス粒子ＤＮＡの抽出 検体５００μＬを超遠心分離器中、毎分７００００回転
で２０分間遠心分離する。ペレットをｐＨ８．０の１０
ｍＭ−トリス／塩酸５００μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２
０ｍｇ／ｍＬ）ならびに２０％ＳＤＳ１０μＬ中に溶解
する。標準核酸一定量とニシン精子ＤＮＡ１μｇを添加
し、検体を１時間５６℃でインキュベートする。次いで
検体をフェノールとクロロホルムとで順次抽出し、グリ
コーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
で２０分間遠心分離する。ペレットをｐＨ８．０の１０
ｍＭ−トリス／塩酸５００μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２
０ｍｇ／ｍＬ）ならびに２０％ＳＤＳ１０μＬ中に溶解
する。標準核酸一定量とニシン精子ＤＮＡ１μｇを添加
し、検体を１時間５６℃でインキュベートする。次いで
検体をフェノールとクロロホルムとで順次抽出し、グリ
コーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
【００５２】１．２．２．プロウイルスＤＮＡの抽出 細胞５×１０5個をライシス緩衝液１００μＬ（１×Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製ＰＣＲ緩衝液、Ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ・Ｋ・０．５ｍｇ／ｍＬ、０．４５％Ｔｗｅｅｎ）
中で５６℃で５時間ライシスする。この適量をＰＣＲに
使用する。
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製ＰＣＲ緩衝液、Ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ・Ｋ・０．５ｍｇ／ｍＬ、０．４５％Ｔｗｅｅｎ）
中で５６℃で５時間ライシスする。この適量をＰＣＲに
使用する。
【００５３】１．２．３．ウイルス残余ＤＮＡの抽出 検体５００μＬをｐＨ８．０の１０ｍＭ−トリス／塩酸
５μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ
とに溶解する。３７℃で一夜または５６℃で４時間イン
キュベーション後に、標準核酸一定量を添加し、検体を
フェノールおよびクロロホルムで順次に抽出し、ｇｌｙ
ｋｏｇｅｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
５μＬとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ・Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ
とに溶解する。３７℃で一夜または５６℃で４時間イン
キュベーション後に、標準核酸一定量を添加し、検体を
フェノールおよびクロロホルムで順次に抽出し、ｇｌｙ
ｋｏｇｅｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製、２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加する。続いてエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離し、ペレットを洗浄し、最
後に水に再溶解する。
【００５４】１．２．４．ＲＮＡの抽出 血漿またはＰＢＳ希釈血漿１ｍＬを毎分７００００回転
で２０分間遠心分離する。上清液を吸引除去する。ペレ
ットをグアニジウム・イソチオシアネート溶液（Ｂｉｏ
ｔｅｃ製ＲＮＡｚｏｌ（商標））１ｍＬに取り、１ｍｇ
／ｍＬ酵母ｔ−ＲＮＡ５μＬおよび標準ＲＮＡ一定量、
たとえば２０μＬを添加する。マイナス−ＲＮＡ標準お
よびプラス−ＲＮＡ標準の所定数、たとえば４００コピ
ーと１２００コピーとを添加し、ふりまぜる。溶液を１
０分間７０℃に加熱し、クロロホルム１／１０容を添加
して１０分間氷上でインキュベーションする。その後、
これを机上遠心分離器で５分間遠心分離し、上清液を新
しいバイアルに移す。イソプロパノール５００μＬを添
加し、−８０℃に１５分間調整する。続いて１０分間遠
心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを
水５０μＬに取る。ＲＴ−ＰＣＲには５μＬを使用す
る。
で２０分間遠心分離する。上清液を吸引除去する。ペレ
ットをグアニジウム・イソチオシアネート溶液（Ｂｉｏ
ｔｅｃ製ＲＮＡｚｏｌ（商標））１ｍＬに取り、１ｍｇ
／ｍＬ酵母ｔ−ＲＮＡ５μＬおよび標準ＲＮＡ一定量、
たとえば２０μＬを添加する。マイナス−ＲＮＡ標準お
よびプラス−ＲＮＡ標準の所定数、たとえば４００コピ
ーと１２００コピーとを添加し、ふりまぜる。溶液を１
０分間７０℃に加熱し、クロロホルム１／１０容を添加
して１０分間氷上でインキュベーションする。その後、
これを机上遠心分離器で５分間遠心分離し、上清液を新
しいバイアルに移す。イソプロパノール５００μＬを添
加し、−８０℃に１５分間調整する。続いて１０分間遠
心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを
水５０μＬに取る。ＲＴ−ＰＣＲには５μＬを使用す
る。
【００５５】１．３．１．ＲＮＡ検出のためのＰＣＲ ＰＣＲ用セットには公知のように抽出核酸一定量、ＰＣ
Ｒ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製）、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、プライマー、Ｔａｑ−Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ製、５．０Ｕ／μＬ）と水とを含む。ＰＣＲは緩
衝液と酵素の製造元の指示書と通常の実施指導書（Ｍｕ
ｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌ
ｏｇｙ、１５５巻：３３５頁（１９８７年））とに従っ
てＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡ
ｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅｍ・９６００）で実施する。
Ｒ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製）、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、プライマー、Ｔａｑ−Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ製、５．０Ｕ／μＬ）と水とを含む。ＰＣＲは緩
衝液と酵素の製造元の指示書と通常の実施指導書（Ｍｕ
ｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌ
ｏｇｙ、１５５巻：３３５頁（１９８７年））とに従っ
てＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡ
ｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅｍ・９６００）で実施する。
【００５６】１．３．２．ＲＮＡ検出のためのＲＴ−Ｐ
ＣＲ ＲＴ−ＰＣＲ用セットには公知のように抽出核酸一定
量、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＲＴ緩衝液、ＭｇＣｌ
2、ｄＮＴＰ、ＲＴプライマーおよびｒＴ.ｔｈ．ポリメ
ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製、２．５Ｕ／μ
Ｌ）と水とを含む。ＲＴは緩衝液と酵素の製造元の指示
書と通常の実施指導書（Ｍｕｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇｙ、１５５巻：３３５
頁（１９８７年））とに従ってＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅ
ｍ・９６００）で実施する。ＰＣＲのためにはＭｇＣｌ
2、キレート緩衝液および第二のプライマーを追加す
る。次に前記指示書に従ってＰＣＲを実施する。
ＣＲ ＲＴ−ＰＣＲ用セットには公知のように抽出核酸一定
量、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＲＴ緩衝液、ＭｇＣｌ
2、ｄＮＴＰ、ＲＴプライマーおよびｒＴ.ｔｈ．ポリメ
ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製、２．５Ｕ／μ
Ｌ）と水とを含む。ＲＴは緩衝液と酵素の製造元の指示
書と通常の実施指導書（Ｍｕｌｌｉｓなど、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇｙ、１５５巻：３３５
頁（１９８７年））とに従ってＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＧｅｎｅＡｍｐ・ＰＣＲ・Ｓｙｓｔｅ
ｍ・９６００）で実施する。ＰＣＲのためにはＭｇＣｌ
2、キレート緩衝液および第二のプライマーを追加す
る。次に前記指示書に従ってＰＣＲを実施する。
【００５７】１．４．生成物の分析 ＰＣＲ生成物の判定および定量のためにはＰＣＲ溶液
０．５から１．０μＬを取り、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ製３７３Ａ装置で製造元の指示書に従っ
て分析する。
０．５から１．０μＬを取り、Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ製３７３Ａ装置で製造元の指示書に従っ
て分析する。
【００５８】１．５．（ＲＴ）−ＰＣＲでの対照群 緊密な内部対照に加えて、一連のポジティブおよびネガ
ティブコントロールがＰＣＲの結果を保証する。種々の
コントロールについて、分析操作の様々な段階で標準を
添加する（リスト１）。 リスト１．（ＲＴ）−ＰＣＲでの対照群 ネガティブコントロール 型 説明 ｋ１＊＊ 試薬ブランクのコントロール。水添加、ＲＴ−ｍｉｘおよびＰＣ Ｒ−ｍｉｘ。保存溶液が貯蔵してある場所で操作する。検体はＰ ＣＲまで氷冷しておく。この対照は試薬中の夾雑に関する情報を 提供する。 ｋ３＊＊ 夾雑物のコントロール。ＲＴ−ｍｉｘへの抽出物に代える水の添 加。他の検体と同様に分析する。この対照はＲＴ−ＰＣＲを行う 場所での操作手順に起因する夾雑に関する情報を提供する。 ｋ４＊ 夾雑物のコントロール。ネガティブコントロール血漿またはＰＢ Ｓから得られる抽出物の分析。この対照は抽出工程に起因する誤 陽性の結果を検出する。内部標準は添加しない。 ポジティブコントロール 型 説明 ｋ５＊ 内部標準／試薬のコントロール。事前に抽出していないＲＴ−Ｐ ＣＲ／ＰＣＲ反応物への内部標準の直接的添加。この対照は内部 標準と試薬の機能との完全性をテストする。 ｋ６＊＊＊ 点検コントロール。試験管内転写による野生型標準プラスミドか ら誘導した点検所定量の分析。この対照は抽出操作と内部標準量 をテストする。 ｋ７＊ ウイルス粒子数コントロール。ネガティブ血漿またはＰＢＳで適 当な濃度にまで希釈したウイルス粒子所定量を含む部分の分析。 この対照は採用した検定法の全能率をテストする。 −−−− ＊：対照実験ｋ４、ｋ５およびｋ７は各抽出ごとに行う。 ＊＊：対照実験ｋ１およびｋ３は誤陽性野生型シグナルが認められたら、直 ちに行う。 ＊＊＊：ｋ６は内部標準調製の度に行う。コントロールｋ２はここに記載する 一酵素一管法導入以来削除した。
ティブコントロールがＰＣＲの結果を保証する。種々の
コントロールについて、分析操作の様々な段階で標準を
添加する（リスト１）。 リスト１．（ＲＴ）−ＰＣＲでの対照群 ネガティブコントロール 型 説明 ｋ１＊＊ 試薬ブランクのコントロール。水添加、ＲＴ−ｍｉｘおよびＰＣ Ｒ−ｍｉｘ。保存溶液が貯蔵してある場所で操作する。検体はＰ ＣＲまで氷冷しておく。この対照は試薬中の夾雑に関する情報を 提供する。 ｋ３＊＊ 夾雑物のコントロール。ＲＴ−ｍｉｘへの抽出物に代える水の添 加。他の検体と同様に分析する。この対照はＲＴ−ＰＣＲを行う 場所での操作手順に起因する夾雑に関する情報を提供する。 ｋ４＊ 夾雑物のコントロール。ネガティブコントロール血漿またはＰＢ Ｓから得られる抽出物の分析。この対照は抽出工程に起因する誤 陽性の結果を検出する。内部標準は添加しない。 ポジティブコントロール 型 説明 ｋ５＊ 内部標準／試薬のコントロール。事前に抽出していないＲＴ−Ｐ ＣＲ／ＰＣＲ反応物への内部標準の直接的添加。この対照は内部 標準と試薬の機能との完全性をテストする。 ｋ６＊＊＊ 点検コントロール。試験管内転写による野生型標準プラスミドか ら誘導した点検所定量の分析。この対照は抽出操作と内部標準量 をテストする。 ｋ７＊ ウイルス粒子数コントロール。ネガティブ血漿またはＰＢＳで適 当な濃度にまで希釈したウイルス粒子所定量を含む部分の分析。 この対照は採用した検定法の全能率をテストする。 −−−− ＊：対照実験ｋ４、ｋ５およびｋ７は各抽出ごとに行う。 ＊＊：対照実験ｋ１およびｋ３は誤陽性野生型シグナルが認められたら、直 ちに行う。 ＊＊＊：ｋ６は内部標準調製の度に行う。コントロールｋ２はここに記載する 一酵素一管法導入以来削除した。
【００５９】２．実施例１：逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）によるＨＩＶの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、野生
型ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１５ｂｐの生成物を与
えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１ １５５１〜１５７８（配列番号
１）
ＣＲ）によるＨＩＶの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、野生
型ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１５ｂｐの生成物を与
えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１ １５５１〜１５７８（配列番号
１）
【化１１】 ＳＫ３９：ＨＩＶ−１ １６６５〜１６３８（配列番号
２）
２）
【化１２】 （番号付けはＲａｔｎｅｒなどによる）を用いる。これ
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００６０】標準プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐｇ
ａｇ＋１２はプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。この
プラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ-（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重クローニン
グ部位への挿入部とから構成され、この挿入部はＲａｔ
ｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２００８ま
でを含む。
ａｇ＋１２はプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。この
プラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ-（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重クローニン
グ部位への挿入部とから構成され、この挿入部はＲａｔ
ｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２００８ま
でを含む。
【００６１】ｐｇａｇ−１５ではｂｐ１５９３から１６
０７までが欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入
部を部位１５９３（図１参照）に挿入する。プラスミド
を精製し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光
学測定により濃度を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス
／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ
ｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈
する。
０７までが欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入
部を部位１５９３（図１参照）に挿入する。プラスミド
を精製し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光
学測定により濃度を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス
／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ
ｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈
する。
【００６２】Ａｓｐ７１８で一本鎖化した後、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋなどによるＴ３ポリメラーゼで試験管内転写し
て６４４ｂ「＋」転写物と６１７ｂ「−」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生型ＤＮＡの長
さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａｇ−１
５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
ｒｏｏｋなどによるＴ３ポリメラーゼで試験管内転写し
て６４４ｂ「＋」転写物と６１７ｂ「−」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生型ＤＮＡの長
さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａｇ−１
５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
【００６３】図２Ａおよび２Ｂは対照実験結果を図示す
る。ｗｔ−ＲＮＡ各１００コピーの検体２種をプラスミ
ドｐｇａｇ１から製造し、前記方法に従って抽出し、
「−」および「＋」標準との共増幅により増幅し、「遺
伝子スキャンニング」により分析する。両レーンには
「−」、「ｗｔ」および「＋」標準を確認できる。これ
らクロマトグラムの定量的評価結果を表１、１および２
行に示す。
る。ｗｔ−ＲＮＡ各１００コピーの検体２種をプラスミ
ドｐｇａｇ１から製造し、前記方法に従って抽出し、
「−」および「＋」標準との共増幅により増幅し、「遺
伝子スキャンニング」により分析する。両レーンには
「−」、「ｗｔ」および「＋」標準を確認できる。これ
らクロマトグラムの定量的評価結果を表１、１および２
行に示す。
【００６４】「Ｎ−添加」および「Ｎ＋添加」の列は添
加した「−」および「＋」標準のコピー数を示す。「希
釈」は検体を希釈した倍率を示し、「容積」は後処理容
積を示す。「検体」は検体コードを示し、「注」は検体
に関するそれ以外の情報を含む。「ＧＳ＃、レーン」は
分析番号とそのレーン番号とを示す。「Ａ−」、「Ａｗ
ｔ」および「Ａ＋」はピーク面積、すなわちＰＣＲ生成
物「−」、「ｗｔ」および「＋」のの強度を示す。「Ｎ
−基準」と「Ｎ＋基準」とには前記の式により算出した
結果を検体ｍＬ当りのコピー数で表したものを含む。
「最終結果」の列にはこれらの値の平均値を示す。
加した「−」および「＋」標準のコピー数を示す。「希
釈」は検体を希釈した倍率を示し、「容積」は後処理容
積を示す。「検体」は検体コードを示し、「注」は検体
に関するそれ以外の情報を含む。「ＧＳ＃、レーン」は
分析番号とそのレーン番号とを示す。「Ａ−」、「Ａｗ
ｔ」および「Ａ＋」はピーク面積、すなわちＰＣＲ生成
物「−」、「ｗｔ」および「＋」のの強度を示す。「Ｎ
−基準」と「Ｎ＋基準」とには前記の式により算出した
結果を検体ｍＬ当りのコピー数で表したものを含む。
「最終結果」の列にはこれらの値の平均値を示す。
【００６５】１００コピーを添加した各検体について１
１４および１０６コピーが観測された。理論値（すなわ
ち、添加ｗｔコピー数）と測定値（すなわち、測定ｗｔ
コピー数）との間に良い相関関係が見られた。変動はお
のおの＋１４および＋６％である。これから未知量のｗ
ｔ−ＲＮＡをこの方法で測定することができると結論す
ることができる。
１４および１０６コピーが観測された。理論値（すなわ
ち、添加ｗｔコピー数）と測定値（すなわち、測定ｗｔ
コピー数）との間に良い相関関係が見られた。変動はお
のおの＋１４および＋６％である。これから未知量のｗ
ｔ−ＲＮＡをこの方法で測定することができると結論す
ることができる。
【００６６】別の対照実験のために陰性血漿と感染状況
を試験管内で測定してあったＨＩＶＩＩＩＢの標本とを
混合した。血漿中ウイルス濃度はｍＬ当り２００ＴＣＩ
Ｄ５０であった。１：１０希釈および１：４０希釈各々
０．５ｍＬを前記のように分析した。結果を図２Ｃおよ
び２Ｄならびに表１の３行および４行目に示す。両検体
について未希釈血漿ｍＬ当りコピー数として３３１８７
および２５８９５の結果を得た。平均値からの偏差は１
２％であった。この実験から検体中に測定されるＨＩＶ
のコピー数は検定に使う量とは無関係であることが判
る。
を試験管内で測定してあったＨＩＶＩＩＩＢの標本とを
混合した。血漿中ウイルス濃度はｍＬ当り２００ＴＣＩ
Ｄ５０であった。１：１０希釈および１：４０希釈各々
０．５ｍＬを前記のように分析した。結果を図２Ｃおよ
び２Ｄならびに表１の３行および４行目に示す。両検体
について未希釈血漿ｍＬ当りコピー数として３３１８７
および２５８９５の結果を得た。平均値からの偏差は１
２％であった。この実験から検体中に測定されるＨＩＶ
のコピー数は検定に使う量とは無関係であることが判
る。
【００６７】図２Ｅおよび２Ｆならびに表１の５行およ
び６行目は未知検体の測定結果を示す。独立の測定２回
において５６１２および５８２８コピーの値を得た。偏
差は２％であった。これから前記方法はＨＩＶの高感度
で精密な測定に適していると結論することができる。
び６行目は未知検体の測定結果を示す。独立の測定２回
において５６１２および５８２８コピーの値を得た。偏
差は２％であった。これから前記方法はＨＩＶの高感度
で精密な測定に適していると結論することができる。
【００６８】同一検体の種々の希釈を測定する時の大き
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
【表１】
【００６９】３．実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによるＨＡＶ
の定量 この定量ではＨＡＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１３９ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
の定量 この定量ではＨＡＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１３９ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＡＶ＋２０５８：ＨＡＶ２０５８〜２０８１（配列番
号３）
【化１３】 ＨＡＶ−２１７２：ＨＡＶ２１９６〜２１７２（配列番
号４）
号４）
【化１４】 （番号付けはＣｏｈｅｎなど、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による）を用いる。こ
れらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤ
ＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製
３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
巻：５０〜５９頁（１９８７年）による）を用いる。こ
れらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤ
ＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製
３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００７０】標準プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐＨ
ＡＶ＋９はプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔから誘導する。こ
のプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＣｏｈｅｎなどのＨＡＶのｂｐ２０２０から２２
２６までを含む。
ＡＶ＋９はプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔから誘導する。こ
のプラスミドｐＨＡＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＣｏｈｅｎなどのＨＡＶのｂｐ２０２０から２２
２６までを含む。
【００７１】ｐＨＡＶ−１０ではｂｐ２１００から２１
０９までが欠失し、ｐＨＡＶ＋９では９ｂｐの挿入部を
部位２１００に挿入する。プラスミドを精製し（ＱＵＩ
ＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度
を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クロ
ーニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏ
ｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈ
ａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈する。
０９までが欠失し、ｐＨＡＶ＋９では９ｂｐの挿入部を
部位２１００に挿入する。プラスミドを精製し（ＱＵＩ
ＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度
を測定し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クロ
ーニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏ
ｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈ
ａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希釈する。
【００７２】ＡｌｗＮＩで一本鎖化した後、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋなどによりＴ７ポリメラーゼで試験管内転写して
１１４０ｂ「＋」転写物と１１２１ｂ「−」転写物と１
１３１ｂ「ｗｔ」転写物とを得て、これらをグアニジノ
イソチオシアネート溶液で抽出し、２６０ｎｍでの分光
光学的測定で定量する。これらのＲＮＡ処理物はＲＴ−
ＰＣＲの標準として使用する。
ｏｏｋなどによりＴ７ポリメラーゼで試験管内転写して
１１４０ｂ「＋」転写物と１１２１ｂ「−」転写物と１
１３１ｂ「ｗｔ」転写物とを得て、これらをグアニジノ
イソチオシアネート溶液で抽出し、２６０ｎｍでの分光
光学的測定で定量する。これらのＲＮＡ処理物はＲＴ−
ＰＣＲの標準として使用する。
【００７３】標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生
型ＤＮＡの長さは１４８（ｐＨＡＶ＋９）、１２９（ｐ
ＨＡＶ−１０）および１３９ｂｐ（ｗｔ）である。
型ＤＮＡの長さは１４８（ｐＨＡＶ＋９）、１２９（ｐ
ＨＡＶ−１０）および１３９ｂｐ（ｗｔ）である。
【００７４】前記方法により血漿２検体（ＰＬ１および
ＰＬ２）ならびにアルブミン２検体（アルブミンおよび
ヒトアルブミン）をＨＡＶについて検定した。表２はコ
ンピュータプログラム（ＭＳ・Ｅｘｃｅｌ（商標））を
用いた核酸検出装置での測定値の評価を示す。１および
２列はマイナス標準とプラス標準の使用量を示す。３お
よび４列は使用した希釈と容積を示す。５列では検体を
示し、６列は検定を実施したウイルスを示す。検体のコ
ピー数はマイナス標準から（Ｎ−基準、７列）およびプ
ラス標準から（Ｎ＋基準、８列）の両方で算出し、両算
出値の平均を測定結果とする。９列は空欄である。１０
列は検体番号を示す。１１、１２および１３列は検出ピ
ークの面積を示す。
ＰＬ２）ならびにアルブミン２検体（アルブミンおよび
ヒトアルブミン）をＨＡＶについて検定した。表２はコ
ンピュータプログラム（ＭＳ・Ｅｘｃｅｌ（商標））を
用いた核酸検出装置での測定値の評価を示す。１および
２列はマイナス標準とプラス標準の使用量を示す。３お
よび４列は使用した希釈と容積を示す。５列では検体を
示し、６列は検定を実施したウイルスを示す。検体のコ
ピー数はマイナス標準から（Ｎ−基準、７列）およびプ
ラス標準から（Ｎ＋基準、８列）の両方で算出し、両算
出値の平均を測定結果とする。９列は空欄である。１０
列は検体番号を示す。１１、１２および１３列は検出ピ
ークの面積を示す。
【００７５】図３および図４はＨＡＶ検定のグラフによ
る評価を示し、各レーンにおいてＰＣＲ生成物（および
副生成物）の螢光シグナル強度を図示する。生成物はそ
の大きさ（ｂｐで）によって確認できる。標準は長さ１
４８および１２９ｂｐを持ち、野生型は長さ１３９を持
つ。
る評価を示し、各レーンにおいてＰＣＲ生成物（および
副生成物）の螢光シグナル強度を図示する。生成物はそ
の大きさ（ｂｐで）によって確認できる。標準は長さ１
４８および１２９ｂｐを持ち、野生型は長さ１３９を持
つ。
【表２】 これら検定結果では血漿１は陽性（７９８コピー／ｍ
Ｌ）であるが、他の検体は検出限界以下であることを示
した。「検出限界ピーク」（プラス標準の抽出物でコピ
ー数３００コピー／ｍＬ）の存在は全測定で明らかに認
められる。
Ｌ）であるが、他の検体は検出限界以下であることを示
した。「検出限界ピーク」（プラス標準の抽出物でコピ
ー数３００コピー／ｍＬ）の存在は全測定で明らかに認
められる。
【００７６】４．実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ
の定量 この定量ではＨＣＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＣＶ３２ＥＸＴ：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
の定量 この定量ではＨＣＶのｃＤＮＡ配列に結合し、野生型Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち ＨＣＶ３２ＥＸＴ：ＨＣＶ４５〜７０（配列番号５）
【化１５】 ＨＣＶＰＴ４：ＨＣＶ１５８〜１３９（配列番号６）
【化１６】 （番号付けはＨａｎなど、ＰＮＡＳ、８８巻：１７１１
〜１７１５頁（１９９１年）による）を用いる。これら
プライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮＡ
合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９
４ＤＮＡ合成器）で製造した。
〜１７１５頁（１９９１年）による）を用いる。これら
プライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮＡ
合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９
４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００７７】標準プラスミドｐＨＣＶ−７とｐＨＣＶ＋
８とはプラスミドｐＨＣＶ−ｗｔから誘導する。このプ
ラスミドｐＨＣＶ−ｗｔは既知のｐＢＳ／ＳＫ−プラス
ミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＨａｎなどのＨＣＶのｂｐ２７から３１３までを
含む。
８とはプラスミドｐＨＣＶ−ｗｔから誘導する。このプ
ラスミドｐＨＣＶ−ｗｔは既知のｐＢＳ／ＳＫ−プラス
ミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多
重クローニング部位への挿入部とから構成され、この挿
入部はＨａｎなどのＨＣＶのｂｐ２７から３１３までを
含む。
【００７８】ｐＨＣＶ−７ではｂｐ１２６から３１３ま
でが欠失し、ｐＨＣＶ＋８では８ｂｐの挿入部を部位１
２６に挿入する。プラスミドを精製（ＱＵＩＡＧＥＮ
法）し、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度を測定
し、これをＸｍｎＩで切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリ
ス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ
ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希
釈する。
でが欠失し、ｐＨＣＶ＋８では８ｂｐの挿入部を部位１
２６に挿入する。プラスミドを精製（ＱＵＩＡＧＥＮ
法）し、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃度を測定
し、これをＸｍｎＩで切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ−トリ
ス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ
ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））中に希
釈する。
【００７９】ＳａｍｂｒｏｏｋなどによるＴ３ポリメラ
ーゼで試験管内転写して１３８５ｂ「＋」転写物と１３
７０ｂ「−」転写物と１３７７ｂ「ｗｔ」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
ーゼで試験管内転写して１３８５ｂ「＋」転写物と１３
７０ｂ「−」転写物と１３７７ｂ「ｗｔ」転写物とを得
て、これらをグアニジノイソチオシアネート溶液で抽出
し、２６０ｎｍでの分光光学的測定で定量する。これら
のＲＮＡ処理物はＲＴ−ＰＣＲの標準として使用する。
【００８０】標準ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さおよび野生
型ＤＮＡの長さは１１２（ｐＨＣＶ＋８）、１０７（ｐ
ＨＣＶ−７）および１１４ｂｐ（ｗｔ）である。
型ＤＮＡの長さは１１２（ｐＨＣＶ＋８）、１０７（ｐ
ＨＣＶ−７）および１１４ｂｐ（ｗｔ）である。
【００８１】ｐＨＣＶ−ｗｔから作製したｗｔ−ＲＮＡ
２００および２０００コピーを含む検体２個を前記方法
で抽出し、「−」および「＋」標準とともに共増幅によ
り増幅し、「遺伝子スキャンニング」により分析した。
両レーンで「−」、「ｗｔ」および「＋」標準は認識で
きる。これらクロマトグラムの定量的評価の結果は表３
の１および２列に示した。この表は実施例１と同様にセ
ットしてある。
２００および２０００コピーを含む検体２個を前記方法
で抽出し、「−」および「＋」標準とともに共増幅によ
り増幅し、「遺伝子スキャンニング」により分析した。
両レーンで「−」、「ｗｔ」および「＋」標準は認識で
きる。これらクロマトグラムの定量的評価の結果は表３
の１および２列に示した。この表は実施例１と同様にセ
ットしてある。
【００８２】２０００および２００コピーを添加した各
検体について１９７２および１９３コピーの結果を得
た。理論値（すなわち、添加ｗｔコピー数）と測定値
（すなわち、測定ｗｔコピー数）との間に良い相関関係
があることが見出された。偏差は各々−１および−３％
であった。これから未知量のｗｔ−ＲＮＡがこの方法で
測定できることが結論づけられた。
検体について１９７２および１９３コピーの結果を得
た。理論値（すなわち、添加ｗｔコピー数）と測定値
（すなわち、測定ｗｔコピー数）との間に良い相関関係
があることが見出された。偏差は各々−１および−３％
であった。これから未知量のｗｔ−ＲＮＡがこの方法で
測定できることが結論づけられた。
【００８３】患者多数から得たＨＣＶ陽性血漿貯蔵標本
を用いてさらに対照実験を行った。１：１２５および
１：６２５希釈各０．５ｍＬを前記のように分析した。
結果を表３の３および４行に示す。両検体について、非
希釈標本ｍＬ当り各１２１５１５７および８９８３２７
コピーの結果を得た。平均値からの偏差は１５％であっ
た。この実験は検体中のＨＣＶコピー数測定値は検定に
用いた量とは無関係であることを示す。さらに、この例
は本発明の方法は低コピー数の範囲のみならず高コピー
数の範囲でも再現性があることを示す。
を用いてさらに対照実験を行った。１：１２５および
１：６２５希釈各０．５ｍＬを前記のように分析した。
結果を表３の３および４行に示す。両検体について、非
希釈標本ｍＬ当り各１２１５１５７および８９８３２７
コピーの結果を得た。平均値からの偏差は１５％であっ
た。この実験は検体中のＨＣＶコピー数測定値は検定に
用いた量とは無関係であることを示す。さらに、この例
は本発明の方法は低コピー数の範囲のみならず高コピー
数の範囲でも再現性があることを示す。
【００８４】表３の５および６行は未知検体の測定結果
を例示する。独立した２回の測定で各々３２７７および
３６７６コピーの結果を得た。偏差は５％であった。こ
れで前記方法はＨＣＶの高感度で精密な測定に適してい
ると結論することができる。
を例示する。独立した２回の測定で各々３２７７および
３６７６コピーの結果を得た。偏差は５％であった。こ
れで前記方法はＨＣＶの高感度で精密な測定に適してい
ると結論することができる。
【００８５】同一検体の種々の希釈の測定における大き
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
な偏差は希釈に起因する追加的誤差に帰することができ
る。
【表３】
【００８６】５．実施例４：ＨＩＶ−プロウイルスＤＮ
Ａの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、ＨＩ
Ｖ−プロウイルスＤＮＡのＰＣＲにより１１５ｂｐの大
きさの生成物を与えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１・１５５１〜１５７８（配列番号
１）
Ａの定量 この定量ではＨＩＶ−１のｃＤＮＡ配列に結合し、ＨＩ
Ｖ−プロウイルスＤＮＡのＰＣＲにより１１５ｂｐの大
きさの生成物を与えるプライマー、すなわち ＳＫ３８：ＨＩＶ−１・１５５１〜１５７８（配列番号
１）
【化１７】 ＳＫ３９：ＨＩＶ−１・１６６５〜１６３８（配列番号
２）
２）
【化１８】 （番号付けはＲａｔｎｅｒなどによる）を用いる。これ
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
らプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いてＤＮ
Ａ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３
９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００８７】標準プラスミドｐｇａｇ−１５とｐｇａｇ
＋１２とはプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。このプ
ラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ- プラスミド
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重ク
ローニング部位への挿入部とから構成され、この挿入部
はＲａｔｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２
００８までを含む。
＋１２とはプラスミドｐｇａｇ１から誘導する。このプ
ラスミドｐｇａｇ１は既知のｐＢＳ／ＳＫ- プラスミド
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）とこのプラスミドの多重ク
ローニング部位への挿入部とから構成され、この挿入部
はＲａｔｎｅｒなどのＨＩＶ−１のｂｐ１４１７から２
００８までを含む。
【００８８】ｐｇａｇ−１５ではｂｐ１５９３〜１６０
７が欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入部を部
位１５９３（図１参照）に挿入した。プラスミドを精製
し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定
により濃度を測定し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＨ８の１
０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液
（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８
９年））中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲ
の標準として使用する。
７が欠失し、ｐｇａｇ＋１２では１２ｂｐの挿入部を部
位１５９３（図１参照）に挿入した。プラスミドを精製
し（ＱＵＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定
により濃度を測定し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＨ８の１
０ｍＭ−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液
（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８
９年））中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲ
の標準として使用する。
【００８９】標準ＰＣＲ生成物の長さおよび野生型ＤＮ
Ａの長さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａ
ｇ−１５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
Ａの長さは１２７（ｐｇａｇ＋１２）、１００（ｐｇａ
ｇ−１５）および１１５ｂｐ（ｗｔ）である。
【００９０】一連の定量結果を表４に示す。ＨＩＶプロ
ウイルスＤＮＡを種々のコピー数で含む一連の陽性検体
と陰性対照検体とを記号化して本発明方法で測定した。
表４は正確な範囲で全陰性対照が陰性として、また、全
陽性検体が陽性として定量されることを示す。殊に注目
に値するのは低コピー範囲での精密な測定値である。殊
に注目すべきはＣＤ−１３およびＣＤ−２６である。両
検体は１０5細胞当り２コピーを含むもので、定量値は
３コピーであった。これは本発明方法の精密さおよび究
極的と言える感度を例示する。
ウイルスＤＮＡを種々のコピー数で含む一連の陽性検体
と陰性対照検体とを記号化して本発明方法で測定した。
表４は正確な範囲で全陰性対照が陰性として、また、全
陽性検体が陽性として定量されることを示す。殊に注目
に値するのは低コピー範囲での精密な測定値である。殊
に注目すべきはＣＤ−１３およびＣＤ−２６である。両
検体は１０5細胞当り２コピーを含むもので、定量値は
３コピーであった。これは本発明方法の精密さおよび究
極的と言える感度を例示する。
【表４】
【００９１】６．実施例５：ＨＢＶの定量 この定量ではＨＢＶのゲノムに結合し、野生型ＤＮＡの
ＰＣＲにより１８２ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
ＰＣＲにより１８２ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ＨＢＶ＋１７８０Ｂ：ＨＢＶ１７８０〜１８０６（配列
番号７）
【化１９】 ＨＢＶ−１９６０Ｂ：ＨＢＶ１９８３〜１９６０（配列
番号８）
番号８）
【化２０】 （番号付けはＦｕｊｉｙａｍａなどによる）を用いる。
これらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いて
ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
製３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
これらプライマーはホスホアミダイト化学反応を用いて
ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
製３９４ＤＮＡ合成器）で製造した。
【００９２】標準プラスミドｐＨＢＶ−９とｐＨＢＶ＋
１２はプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔとから誘導される。こ
のプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）とこのプラスミド
の多重クローニング部位への挿入部とから構成され、こ
の挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどのＨＢＶのｂｐ１７６
３から１８６８までを含む。
１２はプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔとから誘導される。こ
のプラスミドｐＨＢＶ−ｗｔは既知のｐＣＲＩＩプラス
ミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）とこのプラスミド
の多重クローニング部位への挿入部とから構成され、こ
の挿入部はＦｕｊｉｙａｍａなどのＨＢＶのｂｐ１７６
３から１８６８までを含む。
【００９３】ｐＨＢＶ−９ではｂｐ１８６８から１８７
６までが欠失し、ｐＨＢＶ＋１２では１２ｂｐの挿入部
を部位１８６８に挿入した。プラスミドを精製し（ＱＵ
ＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃
度を測定し、制限酵素で一度切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ
−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））
中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準と
して使用する。
６までが欠失し、ｐＨＢＶ＋１２では１２ｂｐの挿入部
を部位１８６８に挿入した。プラスミドを精製し（ＱＵ
ＩＡＧＥＮ法）、２６０ｎｍでの分光光学測定により濃
度を測定し、制限酵素で一度切断し、ｐＨ８の１０ｍＭ
−トリス／塩酸、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋなど、分子クローニング、２版、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂ・Ｐｒｅｓｓ、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年））
中に希釈する。これらのＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準と
して使用する。
【００９４】標準ＰＣＲ生成物の長さと野生型ＤＮＡと
の長さは１９４（ｐＨＢＶ＋１２）、１７３（ｐＨＢＶ
−９）および１８２ｂｐ（ｗｔ）である。
の長さは１９４（ｐＨＢＶ＋１２）、１７３（ｐＨＢＶ
−９）および１８２ｂｐ（ｗｔ）である。
【００９５】一連の定量結果を表５に示し、グラフとし
て図５、図６、図７、図８および図９に描く。増幅反応
は各々ｐＨＢＶ−９は１５０コピー、ｐＨＢＶ＋１２は
５０コピーから、ｐＨＢＶ−ｗｔは種々の量（４００、
２００、１００、５０および０コピー）から出発して実
施した。各セットは４回測定した。
て図５、図６、図７、図８および図９に描く。増幅反応
は各々ｐＨＢＶ−９は１５０コピー、ｐＨＢＶ＋１２は
５０コピーから、ｐＨＢＶ−ｗｔは種々の量（４００、
２００、１００、５０および０コピー）から出発して実
施した。各セットは４回測定した。
【表５】 結果はＤＮＡ含量測定が非常によく再現できることを示
す。
す。
【００９６】７．実施例６：ヘルペス・シンプレックス
ウイルス（ＨＳＶ）ＤＮＡの定量 この定量ではＨＳＶのゲノムに結合し、野生型ＤＮＡの
ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ｇＤＲ１／Ｂ：（配列番号１１）
ウイルス（ＨＳＶ）ＤＮＡの定量 この定量ではＨＳＶのゲノムに結合し、野生型ＤＮＡの
ＰＣＲにより１１４ｂｐの生成物を与えるプライマー、
すなわち ｇＤＲ１／Ｂ：（配列番号１１）
【化２１】 ｇＤＲ２Ｒ／Ｂ：（配列番号１２）
【化２２】 を用いる。
【００９７】標準プラスミドｐＨｅｒｐ−９はプラスミ
ドｐＨｅｒｐから誘導する。このプラスミドｐＨｅｒｐ
は既知のｐＣＲＩＩプラスミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ製）とＨＳＶゲノムのｂｐ１２８３６４から１３８７
８４までの挿入部とから構成される（ＭｃＧｅｏｃｈ，
Ｄ．Ｊ．など、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＩＤＨＥ１
ＣＧ１）。
ドｐＨｅｒｐから誘導する。このプラスミドｐＨｅｒｐ
は既知のｐＣＲＩＩプラスミド（Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ製）とＨＳＶゲノムのｂｐ１２８３６４から１３８７
８４までの挿入部とから構成される（ＭｃＧｅｏｃｈ，
Ｄ．Ｊ．など、ＥＭＢＬ・ＧｅｎＢａｎｋ・ＩＤＨＥ１
ＣＧ１）。
【００９８】ｐＨＢＶ−９では９ｂｐを除去した。プラ
スミドを精製し、２６０ｎｍで分光光学測定により濃度
を測定し、制限酵素で一本鎖化し、ＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で希釈
した。このＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準として使用す
る。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１０５
（ｐＨｅｒｐ−９）および１１４ｂｐ（ｐＨｅｒｐ）で
ある。
スミドを精製し、２６０ｎｍで分光光学測定により濃度
を測定し、制限酵素で一本鎖化し、ＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で希釈
した。このＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準として使用す
る。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１０５
（ｐＨｅｒｐ−９）および１１４ｂｐ（ｐＨｅｒｐ）で
ある。
【００９９】定量結果を表６に示す。検体５個ならびに
ｐＨｅｒｐ野生型ＤＮＡ１．６６ｐｇを４００００コピ
ー（１列）の標準ｐＨｅｒｐ−９の存在下に前記方法に
より分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ量算出用の前
記数式での係数Ｆ２は１／６０００である。２列と３列
は希釈係数ならびに使用した検体の容積を記述する。４
列は検体名を示す。５列は検体に関する追加情報を含む
（要すれば）。６列にはＨＳＶ−ＤＮＡの算出量をｐｇ
／ｍＬで記載する。２回測定の平均値を７列に示す。８
および９列は標準プラスミド（８列）および野生型（９
列）ピーク面積を示す。
ｐＨｅｒｐ野生型ＤＮＡ１．６６ｐｇを４００００コピ
ー（１列）の標準ｐＨｅｒｐ−９の存在下に前記方法に
より分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ量算出用の前
記数式での係数Ｆ２は１／６０００である。２列と３列
は希釈係数ならびに使用した検体の容積を記述する。４
列は検体名を示す。５列は検体に関する追加情報を含む
（要すれば）。６列にはＨＳＶ−ＤＮＡの算出量をｐｇ
／ｍＬで記載する。２回測定の平均値を７列に示す。８
および９列は標準プラスミド（８列）および野生型（９
列）ピーク面積を示す。
【０１００】検体１４、１７とＪＡ１０とはヘルペスＤ
ＮＡの二重測定を行い、平均値からの偏差は０％から
４．３％までであった。この僅かな標準偏差も、もし測
定操作中にｐＨｅｒｐ＋１０標準を共測定すれば劇的に
改良されうる。
ＮＡの二重測定を行い、平均値からの偏差は０％から
４．３％までであった。この僅かな標準偏差も、もし測
定操作中にｐＨｅｒｐ＋１０標準を共測定すれば劇的に
改良されうる。
【表６】N-添加 希釈 容積 検体 注 pg/mL 最終結果 A・ Awt 4000 1 0.5 000.00 ヘルヘ゜ス 1333 - 100 10000 4000 1 0.5 標本 14.11 ・ 3.1 3 7872 1840 4000 1 0.5 標本 14.12 ・ 2.9 - 8171 1774 4000 1 0.5 標本 16.11 ・ 5.5 5.75 11105 4626 4000 1 0.5 標本 16.12 ・ 6 - 7285 3311 4000 1 0.5 標本 17.11 ・ 1.7 1.7 12402 1570 4000 1 0.5 標本 17.12 ・ 1.7 - 9118 1181 4000 1 0.5 YES 10.11 ・ 1.6 1.65 10713 1315 4000 1 0.5 YES 10.12 ・ 1.7 - 9200 1148 4000 1 0.5 H2O ・ 0 0 7843 ・1 4000 1 0.5 H2O ・ 0 - 4077 ・1 4000 1 0.5 PCR ・ 0 0 ・1 ・1 4000 1 0.5 PCR ・ 0 - ・1 ・110000 1 1 1.66pg wt1.2 ・ 1.8 - 3863 4352 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ８．実施例７：ワクチニア−ＤＮＡの定量 この定量ではワクチニアウイルスのゲノムに結合し、野
生型ＤＮＡのＰＣＲにより１３６ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち
生型ＤＮＡのＰＣＲにより１３６ｂｐの生成物を与える
プライマー、すなわち
【化２３】 ｏｐｒｌ−ｒ：ＡＡＡ ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＧＧ Ｃ ｂｐ８４６２６〜８４６４４ ｏｐｒｌ−ｆ：ＡＴＡ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＴ ｂｐ８４７６１〜８４７４３ （番号付けはＧｏｅｂｅｌなど、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による）を用
いる。これらプライマーはＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９４ＤＮＡ合成器）で製
造した。
７９巻：２４７〜２６６頁（１９９０年）による）を用
いる。これらプライマーはＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製３９４ＤＮＡ合成器）で製
造した。
【０１０１】標準的プラスミドｐＶＶ−２１はプラスミ
ドｐＶＶ−ｗｔから誘導する。このプラスミドｐＶＶ−
ｗｔは既知のｐＴＺ１９Ｒプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ製）とこのプラスミドのＰｖｕＩＩ制限切断部位２
個の間の挿入部とから構成される。この挿入部はワクチ
ニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子領域のｂｐ８３
８５５から８４７６１までを含む（Ｇｏｅｂｅｌなど、
１９９０年）。
ドｐＶＶ−ｗｔから誘導する。このプラスミドｐＶＶ−
ｗｔは既知のｐＴＺ１９Ｒプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ製）とこのプラスミドのＰｖｕＩＩ制限切断部位２
個の間の挿入部とから構成される。この挿入部はワクチ
ニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子領域のｂｐ８３
８５５から８４７６１までを含む（Ｇｏｅｂｅｌなど、
１９９０年）。
【０１０２】ｐＶＶ−２１では２１ｂｐ（ｂｐ８４７１
８から８４７３８まで）が欠失している。
８から８４７３８まで）が欠失している。
【０１０３】プラスミドを精製し、２６０ｎｍで分光光
学測定により濃度を測定し、制限酵素で一本鎖化し、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）で希釈した。
学測定により濃度を測定し、制限酵素で一本鎖化し、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ−トリス／塩酸、１ｍＭ−ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）で希釈した。
【０１０４】このＤＮＡ処理物はＰＣＲの標準として使
用する。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１
１５（ｐＶＶ−２１）および１３６（ｐＶＶｗｔ）であ
る。 定量結果を表７に示す。検体、水およびワクチニアＤＮ
Ａ１０ｐｇを標準血漿１００００コピー存在下（１列）
に前記方法により分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ
量算出用の前記数式での係数Ｆ２は１／５０００であ
る。
用する。標準ＰＣＲ生成物と野生型ＤＮＡとの長さは１
１５（ｐＶＶ−２１）および１３６（ｐＶＶｗｔ）であ
る。 定量結果を表７に示す。検体、水およびワクチニアＤＮ
Ａ１０ｐｇを標準血漿１００００コピー存在下（１列）
に前記方法により分析した。この場合にヘルペスＤＮＡ
量算出用の前記数式での係数Ｆ２は１／５０００であ
る。
【０１０５】２列と３列は希釈倍率ならびに使用した検
体の容積を記述する。５列は検体に関する情報を含む
（要すれば）。４列は検体名を示す。６列にはワクチニ
アＤＮＡの算出量をｐｇ／ｍＬで記載する。７列にはＰ
ＣＲ生成物を分析するための遺伝子スキャンニング回数
を示す。８および９列は標準プラスミド（８列）および
野生型（９列）のピーク面積を示す。
体の容積を記述する。５列は検体に関する情報を含む
（要すれば）。４列は検体名を示す。６列にはワクチニ
アＤＮＡの算出量をｐｇ／ｍＬで記載する。７列にはＰ
ＣＲ生成物を分析するための遺伝子スキャンニング回数
を示す。８および９列は標準プラスミド（８列）および
野生型（９列）のピーク面積を示す。
【０１０６】検体３１１４９４ではワクチニアＤＮＡ各
々１．６４ｐｇおよび１．７７ｐｇが測定されたが、平
均値からの偏差は３．８％であった。検体３１０４９４
ではワクチニアＤＮＡ各々７．０ｐｇおよび７．２ｐｇ
が測定されたが、平均値からの偏差は１．４％であっ
た。この僅かな標準偏差も、もし測定操作中にｐＶＶ＋
２４標準を共測定すれば劇的に改良されうる。
々１．６４ｐｇおよび１．７７ｐｇが測定されたが、平
均値からの偏差は３．８％であった。検体３１０４９４
ではワクチニアＤＮＡ各々７．０ｐｇおよび７．２ｐｇ
が測定されたが、平均値からの偏差は１．４％であっ
た。この僅かな標準偏差も、もし測定操作中にｐＶＶ＋
２４標準を共測定すれば劇的に改良されうる。
【表７】N-添加 希釈 容積 検体 注 pg/mL GS# レーン A- A wt 45000 1 0.5 0000.00 ナシ 1800 261 00 100 10000 40000 1 1 10pg ナシ 10.6 259 06 35636 47165 40000 5 0.5 310494 ナシ 7 216 09 55109 4820 40000 5 0.5 310494 ナシ 7.2 216 01 37686 3375 40000 5 0.5 311494 ナシ 1.64 246 18 49362 1013 40000 5 0.5 311494 ナシ 1.77 246 20 48816 1079 40000 1 0.5 H2O ナシ ・1 246 21 41041 ・1 40000 1 0.5 H2O ナシ ・1 246 24 46458 ・1 40000 1 1 PCR ナシ 0 246 27 ・1 ・1 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９
【０１０７】
【配列表】
【０１０８】配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
【０１０９】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
【０１１０】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ACTGCCATTG GGAAGCTTAT TGTG 24
【０１１１】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 CATCCATAGC ATGATAAAGA GGAGC 25
【０１１２】配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 CTGTGAGGAA CTACTGTCTT ACGCAG 26
【０１１３】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 CGGTTCCGCA GACCACTATG 20
【０１１４】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 CATTGATCCT TATAAAGAAT TTGGAGC 27
【０１１５】配列番号：８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 CCAGCAGAGA ATTGCTTGCC TGAG 24
【０１１６】配列番号：９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 AAAATAGGAT CATGATGGC 19
【０１１７】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ATATTAGATG GTGCCACCGT 20
【０１１８】配列番号：１１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 AACTACCCCG ATCATCAG 18
【０１１９】配列番号：１２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 AGGCCCACTA TGACGACA 18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/70 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ (72)発明者 ミヒェーレ・ヒンメルシュパッハ オーストリア、アー−1100ヴィーン、ラク センブルガーシュトラーセ59／13番 (72)発明者 ヨハン・コール オーストリア、アー−1160ヴィーン、シュ ーマイヤープラッツ３／８番 (72)発明者 フリードリッヒ・ドルナー オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番
Claims (23)
- 【請求項１】 核酸増幅の前に、相互にも、定量すべき
核酸とも検出可能な特徴の少なくとも１種が異なる既知
核酸分子少なくとも２種の既知量を内部基準として検体
に添加し、増幅した検体と得られた標準核酸との量を測
定し、得られた量から検体に最初に存在していた定量す
べき核酸の量を決定することを特徴とする、定量すべき
核酸とは検出しうる特徴の少なくとも１種が異なる既知
核酸分子所定量を内部標準として検体に増幅段階の前に
添加することによる、核酸増幅を応用した検体中の核酸
定量法。 - 【請求項２】 螢光基または放射能活性基または類縁蛋
白質と後続検出反応とで検出できる化学基を持つプライ
マー、好ましくは螢光基を持つプライマー、を増幅に使
用することを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項３】 核酸の増幅を指数的生長相の間に停止す
ることを特徴とする請求項１または２の方法。 - 【請求項４】 増幅した核酸の量を核酸検出装置、好ま
しくは螢光感受性核酸検出装置を使用することにより測
定することを特徴とする請求項１から３までのいずれか
の方法。 - 【請求項５】 微生物、好ましくはＨＩＶ、パルボウイ
ルス、ヘルペスウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、バ
キュロウイルス、ワクチニアウイルス、ボレリア菌、サ
ルモネラ菌および酵母である微生物、の核酸を定量する
ことを特徴とする請求項１から４までのいずれかの方
法。 - 【請求項６】 生物学的検体中、殊に血液および血液処
理物中およびバイオ技術製品中、でウイルス核酸を定量
することを特徴とする請求項５の方法。 - 【請求項７】 増幅前に様々な量の標準核酸を検体に添
加することを特徴とする請求項１から６までのいずれか
の方法。 - 【請求項８】 定量すべき核酸とは長さの異なる標準核
酸、好ましくは定量すべき核酸よりも一つの標準核酸配
列は短く、一つの標準核酸配列は長いもの、を使用する
ことを特徴とする請求項１から７までのいずれかの方
法。 - 【請求項９】 増幅した検体と標準核酸との量いくつか
を同じ検体内で多重分析により決定することを特徴とす
る請求項１から８までのいずれかの方法。 - 【請求項１０】 検体を一段階または数段階処理するよ
りも前に検体に標準核酸を添加することを特徴とする請
求項１から９までのいずれかの方法。 - 【請求項１１】 標準核酸少なくとも一つを検出限界よ
り僅かに上の濃度で使用することを特徴とする請求項１
から１０までの方法を用いて、ある核酸の検出限界を測
定する方法。 - 【請求項１２】 請求項１から１０までのいずれかの方
法で測定すると核酸含量が用量当り１０または１００ｐ
ｇの限界またはそれ以下であって、実質的に核酸を含ま
ない生物学的な製品、殊にバイオ技術的な製品。 - 【請求項１３】 核酸含有量が１から１００コピーまで
の範囲またはそれ以下である生物学的な製品、殊にバイ
オ技術的な製品。 - 【請求項１４】 ウイルスおよび細菌の蛋白質、殊にｇ
ｐ１６０の蛋白質、組み換え血液因子、血漿蛋白質なら
びにワクチン、殊にヘルペス、インフルエンザ、ＴＢ
Ｅ、パルボまたは肝炎ウイルスに対するワクチン、およ
びモノクローナル抗体から選択することを特徴とする請
求項１２または１３の生物学的な製品、殊にバイオ技術
的な製品。 - 【請求項１５】 請求項１から１０までのいずれか一つ
の方法の使用であって、生物学的検体中の核酸を検出す
るための使用。 - 【請求項１６】 配列番号３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１および１２の配列を持つプライマー。 - 【請求項１７】 標準プラスミドであるｐｇａｇ１、ｐ
ｇａｇ−１５、ｐｇａｇ＋１２、ｐＨＡＶ−ｗｔ、ｐＨ
ＡＶ−１０ｂｐ、ｐＨＡＶ＋９ｂｐ、ｐＨＣＶ−ｗｔ、
ｐＨＣＶ−７ｂｐ、ｐＨＣＶ＋８ｂｐ、ｐＨＢＶ−ｗ
ｔ、ｐＨＢＶ−９ｂｐ、ｐＨＢＶ＋１２ｂｐ、ｐＶＶ−
２１、ｐＶＶ＋２４、ｐＨｅｒｐ−９およびｐＨｅｒｐ
＋１０。 - 【請求項１８】 相互にも、定量すべき核酸とも、検
出できる特徴の少なくとも一つが異なる内部標準として
の既知核酸少なくとも２種、 標準核酸と定量すべき核酸とに結合する蛍光標識した
プライマー、 目的とする核酸既知量を含むポジティブコントロー
ル、 目的とするウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネ
ガティブコントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中の核酸を定量するためのキット。 - 【請求項１９】 プラスミドｐｇａｇ−１５およびｐ
ｇａｇ＋１２から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを
含む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＳＫ３８およびＳＫ３９、 ＨＩＶ−１粒子既知量を含むポジティブコントロー
ル、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＩＶ−ＲＮＡを定量するための請求
項１８のキット。 - 【請求項２０】 プラスミドｐＨＣＶ−７およびｐＨ
ＣＶ＋８から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含む
内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＣＶ３２ＥｘｔおよびＨＣ
ＶＰＴ４、 ＨＣＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡを定量するための請求
項１８のキット。 - 【請求項２１】 プラスミドｐＨＡＶ−１０およびｐ
ＨＡＶ＋９から試験管内で転写して誘導したＲＮＡを含
む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＡＶ＋２０５８およびＨＡ
Ｖ−２１７２、 ＨＡＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＡＶ−ＲＮＡを定量するための請求
項１８のキット。 - 【請求項２２】 プラスミドｐＨＢＶ−９およびｐＨ
ＢＶ＋１２を含む内部標準少なくとも２種、 蛍光標識したプライマーＨＢＶ＋１７８０およびＨＢ
Ｖ−１９６０Ｂ、 ＨＢＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＢＶ−ＤＮＡを定量するための請求
項１８のキット。 - 【請求項２３】 内部標識プラスミドｐＨｅｒｐ−９
およびＨｅｒｐ＋１０、 蛍光標識したプライマーｇＤＲ／ＢおよびｇＤＲ２Ｒ
／Ｂ、 ＨＳＶ粒子既知量を含むポジティブコントロール、 ウイルス核酸を含まないヒト血漿を含むネガティブコ
ントロール、 マニュアル（操作法） を含む、検体中のＨＳＶ−ＲＮＡを定量するための請求
項１８のキット。
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