JPH08113540A

JPH08113540A - 増殖因子結合剤

Info

Publication number: JPH08113540A
Application number: JP7240737A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Matsunaga; 謙一松永; Yoshiharu Oguchi; 義春小口; Minoru Ohara; 稔大原
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1994-08-25
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 1996-05-07

Abstract

(57)【要約】【課題】トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ
−β）又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に選択的に
結合することによりそれらの生物学的作用を阻害する作
用を有する結合剤を提供する。【解決手段】カワラタケ属に属する菌類より得られ
る、タンパク質を約１８〜３８％含有するタンパク多糖
体を含有することを特徴とする、ＴＧＦ−β及びＰＤＧ
Ｆからなる群から選んだ増殖因子の結合剤。【効果】アレルギー反応や効力低下を伴わずに、ＴＧ
Ｆ−βやＰＤＧＦの生理活性のみを選択的に阻害でき、
それらが関与する種々の疾患の治療や予防に利用でき
る。副作用の極めて少ない薬剤であることが既に実証さ
れている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の増殖因子
〔すなわち、トランスフォーミング成長因子−β（Tran
sforming Growth Factor−β：略称＝ＴＧＦ−β）又は
血小板由来増殖因子（Platelet-Derived Growth Facto
r：略称＝ＰＤＧＦ）〕に対する結合剤に関する。本発
明の結合剤は、前記の特定の増殖因子に選択的に結合す
ることにより、それら増殖因子の生物学的作用を阻害す
る作用を有する。従って、本発明の結合剤は、前記の特
定の増殖因子が関与する種々の疾患の治療や予防に利用
することができる。

【０００２】

【従来の技術】生体内部で産生し、或る種の細胞に作用
してその増殖を促進する各種の因子が次々と明らかにさ
れ、その構造や機能が解明されつつある。それらの増殖
因子の中には、増殖促進作用だけでなく、様々な生物学
的作用を示し、それらの過剰産生や代謝異常が種々の疾
患に係わっていることが明らかになってきた。トランス
フォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）や血小板由来
増殖因子（ＰＤＧＦ）も、そのような増殖因子に属す
る。ＴＧＦ−βは、元来、ラット線維芽細胞の増殖を促
進する因子として発見されたが、その後多くの細胞に対
して増殖抑制作用を示すほか、強い免疫抑制作用や細胞
外基質を増加させる作用をもつことが明らかにされた。
その過剰産生や代謝異常は、癌患者等における免疫抑制
状態、肺線維症、肝線維化、糸球体腎炎、強皮症等、様
々な疾患や症状に関与していることが示唆されている。
また、ＰＤＧＦは、平滑筋細胞、線維芽細胞、又は神経
グリア細胞などに作用してその増殖を促進するが、血管
平滑筋細胞の遊走と増殖が原因である動脈硬化との関連
が注目されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＴＧＦ−βやＰＤＧＦ
の作用を阻害する手段としては、それらの増殖因子に特
異的に結合してその作用を阻害する抗体を用いる可能性
が考えられ、実際にその試みもなされている。しかし、
抗体を生体に投与する場合、投与にともなって惹起され
るアレルギー反応の防止や、投与された抗体に対する中
和抗体の生成による効力低下の防止等、克服すべき問題
点が多い。従って、増殖因子の作用を阻害する作用を有
し、しかも安全に投与することができる薬剤の開発が望
まれている。本発明者は、この課題を解決すべく鋭意研
究した結果、既に制癌剤として臨床応用され、極めて副
作用の少ない薬剤であることが実証されている、担子菌
由来のタンパク質結合多糖体が、前記の増殖因子に結合
してその作用を阻害することを見出した。本発明はこう
した知見に基づくものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、カワ
ラタケ属に属する菌類より得られる、タンパク質を約１
８〜３８％含有するタンパク多糖体を含有することを特
徴とする、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ
−β）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群
から選んだ増殖因子の結合剤に関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明の結合剤において有効成分
として用いるタンパク多糖体は、例えば特公昭４６−１
７１４９号、特公昭５１−３６３２２号、特公昭５６−
１４２７４号、特公昭５６−１４２７５号及び特公昭５
６−１４２７６号各公報などに記載されている。前記タ
ンパク多糖体は、担子菌の一種であるカワラタケ属（Co
liolus）に属する菌類を培養して得られる菌糸体、培養
物（Broth)、又は子実体からの抽出により得られる抽出
物である。前記タンパク多糖体は、約１８〜３８％のタ
ンパク質を含み、分子量（超遠心分離測定法）が５００
０以上、好ましくは５０００〜３００，０００である。
また、前記タンパク多糖体については最近の新薬，第２
８集第１４〜１６頁，１９７７年及び第２９集第９６〜
１０１頁，１９７８年や、医薬品要覧，第１３４６頁，
昭和５４年５月第６版，薬業時報社発行等にも記載され
ている。

【０００６】また、前記タンパク多糖体の代表例はＰＳ
Ｋとも呼称されているものであって、クレスチンという
商品名で三共株式会社から市販されている。その性状の
一端を示せば次のとおりである。ＰＳＫは、カワラタケ
〔ＦＥＲＭ−Ｐ２４１２（ＡＴＣＣ２０５４７）〕の菌
糸体を熱水で抽出し、精製した後に乾燥して得ることが
でき、平均分子量（超遠心分離測定法）は約１００，０
００である。主要画分の糖部分はβ−Ｄ−グルカンで、
このグルカン部分の構造は１→３、１→４及び１→６結
合を含む分枝構造であり、主な構成単糖はグルコース
（７４．６％）やマンノース（１５．５％）である。タ
ンパク質の構成アミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミ
ン酸等の酸性アミノ酸と、バリンやロイシン等の中性ア
ミノ酸が多く、リジンやアルギニン等の塩基性アミノ酸
は少ない。水に可溶であるが、メタノール、ピリジン、
クロロホルム、ベンゼン又はヘキサンには殆ど溶けな
い。約１２０℃から徐々に分解する。前記タンパク多糖
体はその毒性が極めて低く且つ副作用も殆ど無い非常に
安全な物質である。前記ＰＳＫの急性毒性値を表１に示
す。

【０００７】

【表１】

【０００８】なお、表１に記載の急性毒性値は次の方法
で調べたものである。マウスとしてはＩＣＲ−ＪＣＬ系
の、４〜５週令で体重２１〜２４ｇのものを、ラットと
しては呑竜系の、４〜５週令で体重１００〜１５０ｇの
ものを用いた。投与経路は、表１に示すとおり、経口で
投与を実施した。前記タンパク多糖体を生理食塩水に溶
解して投与し、７日間にわたり、死亡ならびに体重につ
いて観察し、観察期間終了後に屠殺剖検した。ラット及
びマウスとも投与可能な最大投与量においてもまったく
死亡例は認められず、ＬＤ₅₀値の算定が事実上不可能で
あった。

【０００９】本発明で有効成分として用いる前記のタン
パク多糖体は、ＴＧＦ−β又はＰＤＧＦと選択的に結合
し、その他の増殖因子を始めとする各種のサイトカイン
とは結合しない。例えば、後記実施例１及び２で具体的
に示すように、上皮増殖因子（Epidermal Growth Facto
r ：略称＝ＥＧＦ）；インターロイキン（Interleukin
：略称＝ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ
−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８及びＩ
Ｌ−１０；腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor ：略
称＝ＴＮＦ）−α及びＴＮＦ−β；インターフェロン
（Interferon：略称＝ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦ
Ｎ−γ；顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte Colony
-stimulating Factor ：略称＝Ｇ−ＣＳＦ）；及び顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macr
ophage Colony-stimulating Factor：略称＝ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）とは結合しない。なお、前記のタンパク多糖体が結
合するＴＧＦ−βは、特に限定されず、例えば、ＴＧＦ
−β₁ 、ＴＧＦ−β₂ 、ＴＧＦ−β₃ 、ＴＧＦ−β₄ 又
はＴＧＦ−β₅ であることができる。

【００１０】また、本発明で有効成分として用いる前記
のタンパク多糖体は、ＴＧＦ−β又はＰＤＧＦと結合す
ることにより、ＴＧＦ−β又はＰＤＧＦの生理活性を阻
害する。この点は、後記実施例３及び４（in vitro）並
びに実施例５（in vivo)で具体的に示す。すなわち、Ｔ
ＧＦ−βに高感受性の細胞（ミンク胎児肺由来細胞株Ｍ
ｖ１Ｌｕ及びマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２）のin vitro
増殖反応系にＴＧＦ−βを添加すると前記各細胞の増殖
が抑制されるのに対し、この系に予め前記タンパク多糖
体を添加しておくと、ＴＧＦ−βの抑制作用が軽減され
る。また、それらの細胞へのＴＧＦ−βの結合が阻害さ
れる。更に、白血病細胞を移植したマウスにおけるin v
ivo の実験においても、ＴＧＦ−β投与にもとづく癌増
殖の促進が、ＰＳＫを投与することにより阻害される。

【００１１】以上のように、前記のタンパク多糖体は特
定の増殖因子（ＴＧＦ−β又はＰＤＧＦ）とのみに選択
的に結合するので、前記タンパク多糖体の作用は、結合
したＴＧＦ−β又はＰＤＧＦの生理活性を阻害すること
のみに限定され、他の増殖因子の作用活性阻害に起因す
る副作用が生じる可能性はないと考えられる。また、前
記タンパク多糖体は毒性の極めて低い物質であり、副作
用が極めて少ない薬剤であることは既に臨床的にも認め
られており、長期にわたって安全に投与することができ
る。

【００１２】本発明の結合剤を、ＴＧＦ−β及び／又は
ＰＤＧＦ活性阻害剤としてヒト又は動物に投与する場合
には、任意慣用の方法で各種経路の投与用製剤に調製す
ることができる。すなわち、経口投与、皮下、静脈内、
筋肉内等への注射、経直腸投与（座剤）等である。経口
投与は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤又はカプ
セル剤などである。それらの組成物中に結合剤、賦形
剤、潤滑剤、崩壊剤又は湿潤剤を含有していてもよい。
また、経口用液体製剤は、内用水剤、振とう合剤、懸濁
液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよく、あるい
は使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であって
もよい。更に、このような液体製剤は、添加剤あるいは
保存剤のいずれを含有していてもよい。注射剤、座剤又
は軟膏等の非経口投与剤においては、その組成物が安定
剤、緩衝剤、保存剤又は等張化剤などの添加剤を含んで
いてもよい。なお、上記組成物は水溶液、懸濁液、溶
液、油性又は水性ビヒクル中の乳液のような形態であっ
てもよく、一方、活性成分は使用する前に適当なビヒク
ル（例えば、発熱物質不含の滅菌した水）で再溶解させ
る粉末であってもよい。

【００１３】投与量は、投与方式、並びに年齢、個人差
及び疾患の程度によって異なるが、一般には体重１ｋ
ｇ、一日当り０．５〜１０００ｍｇ、経口投与の場合は
２０〜１０００ｍｇを１回から３回に分けて投与するこ
とができる。

【００１４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ヒト由来ＴＧＦ−β₁ 凍結乾燥標品（宝酒造）１μｇの
入ったバイアルに、ウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍ
ｌ）を含む５ｍＭ塩酸１００μｌを加えて溶解させた
後、ウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７. ４）９. ９ｍｌを加え、１０
０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β₁ 溶液を調整した。一方、ウ
シ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７. ４）にＰＳＫ（クレスチン；三共）
を溶解させ、ＰＳＫ０. １μｇ／ｍｌ、０. ５μｇ／ｍ
ｌ、１. ０μｇ／ｍｌ、５. ０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／
ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ
／ｍｌ又は１０００μｇ／ｍｌを含むＰＳＫ溶液を調整
した。前記で調整したＴＧＦ−β₁ （１００ｎｇ／ｍ
ｌ）溶液１００μｌとＰＳＫ（０. １〜１０００μｇ／
ｍｌ）の溶液１００μｌとを試験管内にて混合し、２２
℃で３時間反応させた。反応終了後、混合溶液中のＴＧ
Ｆ−β₁ 含量を、市販のEnzyme Immunoassay測定キット
（ＴＧＦ−β₁ ＥＬＩＳＡシステム；アマシャム・ジ
ャパン株式会社）を用いて測定した。結果を図１に●で
示す。また、 ¹²⁵Ｉ標識抗ＴＧＦ−β₁抗体を用いたRad
ioimmunoassayによる結果を図１の○で示す。なお、縦
軸の結合率（％）は、以下の式（Ｉ）によって求めた。

【００１５】

【式１】結合率＝（Ｃｃ−Ｃｐ）／Ｃｃ × １００（Ｉ）（式中、Ｃｃは対照群のＴＧＦ−β₁ 測定値であり、Ｃ
ｐはＰＳＫ反応群のＴＧＦ−β₁ 測定値である。）

【００１６】図１から明らかなように、ＴＧＦ−β測定
値は、対照群（ＰＳＫ非添加）に比し、ＰＳＫ添加群で
用量依存的に低く、ＰＳＫがＴＧＦ−β₁ 抗原決定基と
結合していることが分かる。次に、ＴＧＦ−β以外の各
種サイトカインや増殖因子とＰＳＫの結合性を市販の測
定キットを用いて測定したところ、表２に示すように、
ＰＤＧＦもＴＧＦ−β₁ と同程度に結合し、その他の各
種サイトカインや増殖因子とは結合しないことが明らか
になった。なお、表２に示す結合率（％）は前記式
（Ｉ）によって算出した。

【００１７】

【表２】増殖因子／サイトカイン（入手先）結合率（％）ＰＳＫ濃度（μｇ／ｍｌ）１１０１００ｒｈＴＧＦ−β₁ （１）３２６８９６ｎｈＴＧＦ−β₁ （１）２０６７８３ｒｈＴＧＦ−α （２）０００ｒｈＥＧＦ（３）０００ｒｈＰＤＧＦ（３）１１２６５４ｒｈＩＬ−１α （２）０００ｒｈＩＬ−１β （３）０００ｒｈＩＬ−２（３）０００ｒｈＩＬ−３（３）０００ｒｈＩＬ−４（２）０００ｒｈＩＬ−６（２）０００ｒｈＩＬ−７（２）０００ｒｈＩＬ−８（２）０００ｒｍＩＬ−１０（２）０００ｒｈＴＮＦ−α （２）０００ｒｈＴＮＦ−β （３）０００ｒｈＩＦＮ−β （２）０００ｒｈＩＦＮ−γ （４）０００ｒｈＧ−ＣＳＦ（２）０００ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（５）０００

【００１８】表２において、各種の記号や入手先は以下
のとおりである。ｎ＝天然由来；ｒ＝遺伝子組換え由来；ｈ＝ヒト由来；
ｍ＝マウス由来。入手先：（１）＝アマシャム・ジャパン株式会社製キット（２）＝Ｒ＆Ｄ社（米国）製キット（３）＝大塚製薬株式会社製キット（４）＝東レフジ株式会社製キット（５）＝ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社製キット

【００１９】実施例２ ¹²⁵ Ｉ標識ヒト遺伝子組換えＴＧＦ−β₁ （７４−１６
７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ；第一化学薬品株式会社）３７０ｋ
Ｂｑ（１０μＣｉ）の入ったバイアルに、ウシ血清アル
ブミン（２ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７. ４）を１. ０ｍｌ加えて、 ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ
−β₁ 溶液を調整した。次に、ウシ血清アルブミン（２
ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.
４）にＰＳＫ（三共株式会社）を溶解させ、ＰＳＫ（２
００μｇ／ｍｌ）の溶液を調整した。前記で調整した
¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ 溶液５００μｌとＰＳＫ（２０
０μｇ／ｍｌ）の溶液又はウシ血清アルブミン（２ｍｇ
／ｍｌ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７. ４）５
００μｌとを試験管内にて混合し、２２℃で３時間反応
させた。反応終了後、それぞれの反応液を、Ｂｉｏ−Ｇ
ｅｌＰ−６０（日本バイオラッド・ラボラトリーズ）を
詰めたゲル濾過用カラム（直径＝１ｃｍ；高さ＝５０ｃ
ｍ）にかけてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。な
お、溶出液として、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.
４）（０．１％ウシ血清アルブミン含有）を用いた。フ
ラクション・コレクターにより、溶出液を１ｍｌずつ採
取し、その放射活性をガンマ・カウンターにより測定し
た。結果を図２（ＴＧＦ−β₁ 単独群）及び図３（ＰＳ
Ｋ及びＴＧＦ−β₁ 群）に示す。対照試験（図２）の
¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ 溶液単独反応群では、放射活性
は、主として、フラクション４０（分子量約２. ５万；
活性型ＴＧＦ−βの分子量）に溶出されたが、ＰＳＫと
の反応群（図３）では、その放射活性はフラクション１
０から１８（ＰＳＫの溶出位置）に認められた。すなわ
ち、ゲル濾過クロマトグラフィーに結果からも、ＰＳＫ
とＴＧＦ−β₁ との結合が分かる。

【００２０】実施例３９６ウエルの培養用プレート（Ｆａｌｃｏｎ３０７２；
ベクトン・デイッキンソン・ラブウエア；米国ニュージ
ャージー州）の各ウエルに、ミンク胎児肺由来細胞株Ｍ
ｖ１Ｌｕ（大日本製薬）又はマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２（理化学研究所）を後述の培地に５×１０⁵ ／ｍｌに
なるように懸濁させ、その懸濁液を１００μｌずつ分注
した。ついで、前記実施例１と同様に調整したヒト由来
ＴＧＦ−β₁ 凍結乾燥標品（宝酒造）の溶液を５０ｎｇ
／ｍｌになるように加え、３７℃の５％ＣＯ₂ インキュ
ベーター中で４８時間培養した。Ｍｖ１Ｌｕの培地とし
て１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン及び０. １ｍ
Ｍ非必須アミノ酸を加えたイーグル最少必須培地（Eagl
e's Minimum Essential Medium）を用い、ＣＴＬＬ−２
の培地として１０％ウシ胎児血清と２０ｕｎｉｔｓ／ｍ
ｌのマウスインターロイキン−２と２ｍＭグルタミンと
を加えたＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。培養終了の
４時間前にＭＴＴ試薬〔３−（４，５−ジメチルチアゾ
ール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウ
ムブロマイドを５ｍｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝生
理食塩水に溶解した液〕を各ウエルに１５μｌずつ分注
した。培養終了後、細胞内に生成したホルマザンを４０
ｍＭ塩酸酸性イソプロパノール２００μｌを加えて溶解
させ、５７０ｎｍにおける吸光度をプレート・リーダー
にて測定した（対照培養群試験）。

【００２１】一方、実施例１に記載の方法と同様に調整
したＰＳＫ溶液を、前記の培養系に添加する試験を実施
した。すなわち、ミンク胎児肺由来細胞株Ｍｖ１Ｌｕに
対して、試験（Ａ）では、前記の対照培養試験と同様に
Ｍｖ１Ｌｕ懸濁液を分注したウエルに、ＰＳＫ溶液をＰ
ＳＫが１００μｇ／ｍｌとなるように加えてから、ＴＧ
Ｆ−β₁ を５０ｎｇ／ｍｌになるように加え、前記の対
照培養試験と同様の処理を行い、試験（Ｂ）では、前記
の試験（Ａ）と同様にＰＳＫ溶液を加えてから、細胞を
培地で充分に洗浄して遊離のＰＳＫを除き、次いでＴＧ
Ｆ−β₁ を５０ｎｇ／ｍｌになるように加えて、前記の
対照培養試験と同様の処理を行った。これらの測定結果
を図４に示す。図４において、「ＰＳＫ（−）」はＰＳ
Ｋ無添加の対照培養群、「Ａ」はＰＳＫ添加後に洗浄を
行わないでＴＧＦ−β₁ を添加する実験（Ａ）の培養
群、及び「Ｂ」はＰＳＫ添加後に洗浄して遊離ＰＳＫを
除いてからＴＧＦ−β₁ を添加する実験（Ｂ）の培養群
の各結果である。更に、前記の実験（Ａ）と同様の実験
系で、ＰＳＫの添加濃度を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍ
ｌ、及び１００μｇ／ｍｌとなるように加える実験も実
施した。この結果を図５に示す。

【００２２】また、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２に対し
て、試験（Ａ）では、前記の対照培養試験と同様にＣＴ
ＬＬ−２懸濁液を分注したウエルに、ＰＳＫ溶液をＰＳ
Ｋが１００μｇ／ｍｌとなるように加えてから、ＴＧＦ
−β₁ を５０ｎｇ／ｍｌになるように加え、前記の対照
培養試験と同様の処理を行い、試験（Ｂ）では、前記の
対照培養試験と同様にＣＴＬＬ−２懸濁液を分注したウ
エルに、ＴＧＦ−β₁を５０ｎｇ／ｍｌになるように加
えてから、ＰＳＫ溶液をＰＳＫが１００μｇ／ｍｌとな
るように加え、前記の対照培養試験と同様の処理を行
い、試験（Ｃ）では、前記の試験（Ａ）と同様にＰＳＫ
溶液を加えてから、細胞を培地で充分に洗浄して遊離Ｐ
ＳＫを除いてから、ＴＧＦ−β₁ を５０ｎｇ／ｍｌにな
るように加えて、前記の対照培養試験と同様の処理を行
った。これらの測定結果を図６に示す。図６において、
「ＰＳＫ（−）」はＰＳＫ無添加の対照培養群、「Ａ」
はＰＳＫ添加後に洗浄を行わないでＴＧＦ−β₁ を添加
する実験（Ａ）の培養群、「Ｂ」はＴＧＦ−β₁ 添加後
に洗浄を行わないでＰＳＫを添加する実験（Ｂ）の培養
群、及び「Ｃ」はＰＳＫ添加後に洗浄を行ってからＴＧ
Ｆ−β₁ を添加する実験（Ｃ）の培養群の各結果であ
る。更に、前記の実験（Ａ）と同様の実験系で、ＰＳＫ
の添加濃度を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び１０
０μｇ／ｍｌとなるように加える実験も実施した。この
結果を図７に示す。

【００２３】なお、図４〜図７において、「増殖阻害率
（％）」は、以下の式（II）によって算出した値であ
る。

【式２】増殖阻害率（％）＝（Ａｃ−Ａｐ）／Ａｃ × １００（II）（式中、Ａｃは対照培養群の生成フォルマザンの５７０
ｎｍ吸光度であり、ＡｐはＴＧＦ−β₁ 添加群又はＴＧ
Ｆ−β₁ とＰＳＫとの添加培養群の生成フォルマザンの
５７０ｎｍ吸光度である。）

【００２４】各図に示すように、前記細胞株の増殖はＴ
ＧＦ−β₁ によって阻害された。また、ＴＧＦ−β₁ を
加える前にＰＳＫを添加すると、いずれの細胞において
も、ＴＧＦ−β₁ による阻害は軽減された。更に、ＰＳ
Ｋの作用は用量依存的であった。従って、ＰＳＫの軽減
作用は、ＴＧＦ−β₁ との直接結合によってもたらされ
ることが分かる。

【００２５】実施例４結合実験用培地〔０．１％ウシ血清アルブミン及び２５
ｍＭ Hepesを含むダルベッコ最少必須培地（Dulbecco's
Minimum Essential Medium)〕にミンク胎児肺由来細胞
株Ｍｖ１Ｌｕ（大日本製薬）又はマウスＴ細胞株ＣＴＬ
Ｌ−２（理化学研究所）を１×１０⁶ ／ｍｌになるよう
に懸濁させ、３７℃の５％ＣＯ₂ インキュベーター中で
２時間培養した。培養終了後、前記の結合実験用培地で
３回洗浄し、細胞濃度を再び１×１０⁶ ／ｍｌに調整し
た。この細胞懸濁液に、前記実施例２と同様の方法で調
整した ¹²⁵I 標識ヒト遺伝子組換えＴＧＦ−β₁ （７４
−１６７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ；第一化学薬品株式会社）の
溶液を１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ又
は５０ｎｇ／ｍｌになるように加え，２２℃で３時間培
養した。遠心分離により細胞を洗浄してから、細胞に結
合した放射活性をガンマ・カウンターにて測定した。な
お、細胞の非特異的結合は、非標識ＴＧＦ−β₁ １０ｎ
Ｍ存在下で調べた。結果を図８（ミンク胎児肺由来細胞
株Ｍｖ１Ｌｕ）及び図９（マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２）に示す。図８及び図９から明からなように、細胞に
結合した放射活性は、ＴＧＦ−β₁ 添加濃度に依存して
いた。

【００２６】次に、前記の培養系にＰＳＫを添加する実
験を行った。すなわち、前記の細胞懸濁液に、ＰＳＫを
１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌと
なるように添加してから（洗浄せずに）、ＴＧＦ−β₁
を５０ｎｇ／ｍｌになるように加え、前記と同様の処理
を行った。これらの結果を図１０（ミンク胎児肺由来細
胞株Ｍｖ１Ｌｕ）及び図１１（マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ
−２）に示す。ＴＧＦ−β₁ を加える前にＰＳＫを添加
すると、ＴＧＦ−β₁ の細胞への結合は阻害された。ま
た、ＰＳＫの作用は用量依存的であった。従って、ＰＳ
Ｋの阻害作用は、ＴＧＦ−β₁ との直接結合によりもた
らされることが分かる。

【００２７】なお、図１０及び図１１において、「結合
阻害率（％）」は、以下の式（III)によって算出した値
である。

【式３】結合阻害率（％）＝（Ｒｃ−Ｒｐ）／Ｒｃ × １００（III) 〔式中、ＲｃはＰＳＫ非添加群の放射能活性（ｄｐｍ）
であり、ＲｐはＰＳＫ添加群の放射能活性（ｄｐｍ）で
ある。〕

【００２８】実施例５８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群５匹：日本チ
ャールズリバー株式会社）の皮下にＥＬ４白血病細胞
（防衛医科大学校細菌学教室より分譲）１×１０⁶ 個を
移植し、経時的にノギスにて腫瘍の大きさを測定した。
前記実施例１と同様に調整したＴＧＦ−β₁ 溶液を腫瘍
移植日から連日４回、ＴＧＦ−β₁ １μｇ／匹となる量
で腹腔内投与した。また、前記実施例１と同様に調整し
たＰＳＫ溶液はＰＳＫ１００ｍｇ／ｋｇとなる量で連日
４回腹腔内投与した。移植９日目の腫瘍サイズを図１２
に示す。なお、（−）は非投与を、そして（＋）は投与
を表している。無処置群に比し、ＴＧＦ−β₁ 投与・Ｐ
ＳＫ非投与群では、明らかに腫瘍の増殖促進が見られた
が、ＴＧＦ−β₁ 投与・ＰＳＫ投与群では促進が見られ
ず、無処置群のサイズとほぼ同じであった。なお、ＴＧ
Ｆ−β₁ 非投与群にＰＳＫを投与しても、腫瘍の増殖に
はほとんど影響がなかった。従って、ＰＳＫの作用は、
ＴＧＦ−β₁ との直接作用に由来することが分かる。

【００２９】

【発明の効果】抗体を生体に投与する場合に起きるアレ
ルギー反応や、投与された抗体に対する中和抗体の生成
による効力低下を伴わずに、ＴＧＦ−βやＰＤＧＦの生
理活性のみを選択的に阻害することができる。しかも、
本発明で用いるタンパク質結合多糖体は、既に制癌剤と
して臨床応用され、極めて副作用の少ない薬剤であるこ
とが実証されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で行った、ＴＧＦ−β₁ とＰＳＫとを
反応させて得られた両者の結合を酵素免疫アッセイ
（●）及びラジオイムノアッセイ（○）で測定した結果
を示すグラフである。

【図２】実施例２で行った、 ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ と
ＰＳＫとを反応させ、その反応液をゲル濾過クロマトグ
ラフィーで溶出してから、各フラクションの放射能活性
を測定する実験において、 ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ のみ
を加えた場合（対照実験）の結果を示すグラフである。

【図３】実施例２で行った、 ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ と
ＰＳＫとを反応させ、その反応液をゲル濾過クロマトグ
ラフィーで溶出してから、各フラクションの放射能活性
を測定する実験において、 ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ とＰ
ＳＫとを加えた場合の結果を示すグラフである。

【図４】実施例３で行った、ミンク胎児肺由来細胞株Ｍ
ｖ１Ｌｕのin vitro増殖系にＰＳＫとＴＧＦ−β₁ とを
添加した実験において、ＴＧＦ−β₁ による増殖阻害に
対するＰＳＫの回復効果を示すグラフである。

【図５】実施例３で行った、ミンク胎児肺由来細胞株Ｍ
ｖ１Ｌｕのin vitro増殖系にＰＳＫとＴＧＦ−β₁ とを
添加した実験において、ＴＧＦ−β₁ による増殖阻害に
対するＰＳＫの回復効果の用量依存性を示すグラフであ
る。

【図６】実施例３で行った、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２のin vitro増殖系にＰＳＫとＴＧＦ−β₁ とを添加し
た実験において、ＴＧＦ−β₁ による増殖阻害に対する
ＰＳＫの回復効果を示すグラフである。

【図７】実施例３で行った、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２のin vitro増殖系にＰＳＫとＴＧＦ−β₁ とを添加し
た実験において、ＴＧＦ−β₁ による阻害活性に対する
ＰＳＫの回復効果の用量依存性を示すグラフである。

【図８】実施例４で行った、ミンク胎児肺由来細胞株Ｍ
ｖ１Ｌｕのin vitro結合実験の系に ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−
β₁ を添加した実験において、前記細胞に結合するＴＧ
Ｆ−β₁ の用量依存性を示すグラフである。

【図９】実施例４で行った、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２のin vitro結合実験の系に ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁ を
添加した実験において、前記細胞に結合するＴＧＦ−β
₁ の用量依存性を示すグラフである。

【図１０】実施例４で行った、ミンク胎児肺由来細胞株
Ｍｖ１Ｌｕのin vitro結合実験の系に ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ
−β₁ とＰＳＫとを添加した実験において、ＰＳＫによ
る細胞結合阻害の用量依存性を示すグラフである。

【図１１】実施例４で行った、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ
−２のin vitro結合実験の系に ¹²⁵Ｉ標識ＴＧＦ−β₁
とＰＳＫとを添加した実験において、ＰＳＫによる細胞
結合阻害の用量依存性を示すグラフである。

【図１２】実施例５で行った、白血病細胞移植マウスに
ＴＧＦ−β₁ 及び／又はＰＳＫを投与した場合の効果
を、腫瘍サイズの変化によって示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カワラタケ属に属する菌類より得られ
る、タンパク質を約１８〜３８％含有するタンパク多糖
体を含有することを特徴とする、トランスフォーミング
成長因子−β（ＴＧＦ−β）及び血小板由来増殖因子
（ＰＤＧＦ）からなる群から選んだ増殖因子の結合剤。