JPH0811735B2

JPH0811735B2 - 抗原性遺伝子ワクチン

Info

Publication number: JPH0811735B2
Application number: JP57185912A
Authority: JP
Inventors: ロイ・カ−チス・ザ・サ−ド
Original assignee: リサ−チ・コ−ポレイシヨン
Priority date: 1981-10-22
Filing date: 1982-10-22
Publication date: 1996-02-07
Anticipated expiration: 2011-02-07
Also published as: DE3279824D1; CA1338705C; ATE44765T1; EP0080806B1; GR76769B; JPH06165688A; IE55478B1; EP0080806A1; JPS58126815A; IE822543L; JP2777622B2

Description

【発明の詳細な説明】本発明はワクチンに関し、さらに詳しくは病原性生体
に由来する１種またはそれ以上の組み換え遺伝子を含む
微生物から得られ、その病原生体のワクチンとして有効
な抗原性遺伝子生成物に関する。

細菌に起因した伝染病は、世界の至る所に存在してい
る。公衆衛生の改善や抗生物質の出現により、伝染病の
罹病率が低下し、またその発生率も減少してはいるもの
の、多くの発展途上国においては未だに細菌性疾患が絶
えない。医学の先進国においても、薬物耐性遺伝子を伴
って細菌を転換したり、薬物耐性遺伝子の副体を播種す
る方法がいろいろ行われているが、伝染病発生後にその
影響と対峙するような従来の伝染病防衛方法に優る薬物
耐性を発揮するに至っていない。ここ数点来、伝染病を
撲滅しないまでも予防することのできるワクチンの要望
が高まっている。

健全な表皮面が無傷であることは稀れであり、仮に無
傷であっても細菌の侵入を許す関係で、ほとんどの場
合、粘膜の一つが初期感染点である。これらの粘膜とし
て、結膜系、経口系、呼吸系、胃腸系および性尿器系が
挙げられる。当該粘膜の粘膜分泌物は、侵入する病原体
に対しての抗体を含むので、細菌の第１防衛線として作
用する。従って、粘膜分泌系統の免疫反応を増大させる
ことは、病原体に対する免疫を誘起する際の所望の目的
を達成することになる。

細菌性疾病に対して従来使用されてきたワクチンは一
般に、（１）病院学剤から精製された特異成分、（２）
全面致死の病院学剤または（３）生存ワクチンとしての
病院学剤の無毒誘導体である。これらの三種の型のワク
チン類から選択された例を以下に示す。

ストレプトコツカス・ムタンスからグラコシルトラン
スフェラーゼを回収する方法と、その精製グルコシルト
ランスフェラーゼ（第１型ワクチン）と虫歯の局部免疫
法に使用することが米国特許明細書第4,250,262号に開
示されている。同明細書には、ストレプトコツカス・ム
タンスの血清型ａ、ｃまたはｇに関する細菌の培養、酵
素の精製、その酵素を使用して唾液中における免疫グラ
ブリンＡ（IgA）の抗体を刺激することが詳しく触れて
ある。精製された細菌の特異成分から得られたワクチン
例が米国特許明細書第4,203,971号および第4,239,749号
に記載されている。これらの両米国特許明細書は、ガナ
コツチノ外被物質からの糖蛋白質で構成されたナイセリ
ア・ゴノリアの感染に対して有用なワクチンを開示して
いる。糖蛋白質を注射すれば殺菌性抗体を刺激すること
ができる。

米国特許明細書第3,931,398号に開示されているごと
く、虫歯を免疫にするためにストレプトコツカム・ムタ
ンスノ致死細胞を経口投与により使用することが第２型
ワクチンの一例である。本発明者は、IgA抗体が生産可
能な抗体であり、しかも斑点形勢を減少せしめうること
をすでにい確認している。

エミエリヒア・コリ細菌の選択菌株を含む生存細菌ワ
クチン（第３型ワクチン）が米国特許明細書第3,975,51
7号に開示されている。この細菌は、牝豚の乳腺内に注
射する際、事前に希釈ホルマリン処理により弱化または
部分的に不活性化されたものである。このようにして生
産された抗体は豚の乳中で見い出だされ、新生豚をエシ
エリヒア・コリ感染から保護した。エシエリヒア・コリ
を不活性化するホルマリン処理は細菌の一時的弱化に過
ぎないので、注射前に細菌が回復しないように注意が払
われた。細菌が途中で回復すると、予防というよりは感
染という重大な問題を招来する虞がある。

上記米国特許明細書第3,975,517号の例い示されてい
るように、病原性生体から直接ワクチンを製造する場
合、いくつかの問題が内在する。全細菌（生存または致
死）またはその細菌から得た不純製剤を使用するに当っ
ての主な障害は、その製剤中に不利な交叉反応を起こす
多くの抗原性物質が存在していることである。例えば、
ストレプトコツカム・ムタンスにより産生された蛋白質
抗原は人心筋中の抗原と交叉反応すると報告されてい
る。そのため、他の類似の病原性細菌蛋白質は、人用ワ
クチンとして使用する際、安全性が問題になる。

その他の問題が生ずるのは経口投与可能なワクチンを
開発する場合である。発展途上国において未熟の医者に
よる汎用や、患者側における苦痛のない服用の観点から
すると、経口投与は最も好ましい投与形体である。IgA
反応を刺激するのに経口投与形態を用いると、実際に吸
収されて有効免疫反応を刺激することのできる物質量は
通常は低くなる。一般に経口免疫法に必要な抗原の投与
量は全身免疫誘発法に必要な投与量より多い。その理由
は、抗原の大部分が胃腸内の酵素により減殺され、その
まま体外に放出されるかまたは非免疫形態で吸収される
と想定されるためである。

本発明の目的は、細菌性感染に対して人体内または動
物体内で不利な抗体−抗原反応を起こす抗原性物質を含
まず、また交叉反応の問題を解消して経口投与に適し、
さらに人体または動物の粘膜系統内で接続しかつ分泌系
統内でIgAの産性を刺激するワクチンを提供することに
ある。

本発明の別の目的は、前記ワクチンを製造する方法を
提供することにある。

本発明のこれからの目的およびその他の目的は、温血
動物である生体の組み換え遺伝子を含み、その遺伝子を
表現する生存非病原性担体微生物からなる温血動物免疫
用ワクチンを提供することによって達成される。本発明
の目的は、温血動物の病原体またはその動物のアレルゲ
ンを産生する第一生体から誘動された遺伝子の抗原性遺
伝子生成物からなり、その遺伝子が遺伝子生成物を産生
する第二生体内に表現され、かつ前記第一生体またはア
レルゲンが動物体内に存在するとき、遺伝子生成物が動
物体内で免疫反応を誘発するワクチンを提供することに
よっても達成可能である。

本明細書中に記載された遺伝子組み換え操作によって
生成される微生物と、遺伝子の入手に適する病原性細菌
を以下に例示する。これらの培養物はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、米国、メリーランド、
ロックビル、パークローン・ドライブ12301〔American
type Culture Collection（ATCC）、12301 Parklawn Dr
ive、Rockville、Maryland、U.S.A〕に寄託されてお
り、その副培養物は寄託機関であるATCCか取得可能であ
る。

ストレプトコカム・ムタンスの遺伝子の遺伝子移転お
よび封入により得られた菌株：エシエリヒア・コリ 1274（pYA619）（ATCC No.31984）エシエリヒア・コリ HB101（pYA726）（ATCC No.31985）エシエリヒア・コリ 1274（pYA601）（ATCC No.31986）授体菌株：ストレプトコツカス・ムタンスUAD90 （ATCC No.31987）ストレプトコツカス・ムタンスUAD50 （ATCC No.31988）ストレプトコツカス・ムタンスUAD308 （ATCC No.31989）本発明は、組み換えDNA技術を介して病原体から選択
抗原を産生するのに非病原性抗原を使用し、実質的に病
原性生体の汚染抗原を含まない選択抗原を提供すれば、
従来の抗病原ワクチンに付随した大部分の問題を最小限
に留めうることを確認した。ワクチンを粘膜に直接導入
することによりIgAの産生を刺激するのが好ましい。IgA
前非細胞を抗原刺激するための中枢経路が消化管連合リ
ンパ組織（GALT）と細気管連合リンパ組織（以下BALTと
いう）に存在し、かつ増感細胞の遠隔粘膜部位への播種
を伴うことが最近の研究から明らかになった。入手可能
なデータによれば、消化管、呼吸管、乳腺、口腔腺、性
尿管の固有槽が増感された細胞を介してGALTおよびBALT
から供給される。例えば、リンパ球は遠隔細胞または小
細胞集合体としての腸管の内層全体に拡散される。この
細胞集合体の一部はリンパ上皮組織として知られている
別異の器官に展開される。人体内におけるその主要器官
は（１）扁桃腺（咽頭壁内）、（２）付属体（大腸管と
小腸管の接合部）、（３）パイエル集腺（小腸管の終端
部に主に見られる長楕円形リンパ細胞集合体）である。
例えば、フエリチンを使ってマウスに経口免疫を施す
と、マウスの腸外リンパ組織内に抗体生成細胞の出現を
来たすことが「ジャーナル・オブ・イムノロジー」（Jo
urnal of Immunology）123、1705（1979）に報告されて
いる。さらに、分泌腺内での免疫グロブリン系細胞形成
抗フエリチンの大部分がIgAであり、脾または末梢リン
パ腺内では免疫グロブリンＭ（IgM）と免疫グロブリン
Ｇ（IgM）のフエリチン結合細胞が見い出だされた。こ
の免疫系統の刺激用主要中枢径路はGALTとBALTの増感に
より生起すると想定される。次の図式はＢリンパ球の増
感経路、離隔粘膜組織を誘発する両リンパ球のGALTとBA
LTからの遊走、両リンパIgA生成形質球への分化を示
す。

本発明の好ましい実施例において、選択抗原を回パイ
エル集腺などのGALTに搬送するのに抗体細菌を使用する
ことができる。サルモネラ属などの数種属の細菌はパイ
エル集腺を誘発することが知られている。十分に研究さ
れたエシエリヒア・コリRDEC−１を例に挙げると、パイ
エル集腺に対して特異な種属である当該細菌は家兎の回
腸のパイエル集腺に特異的に付着し、その集腺内に侵入
して持続する。人体に特異なその他のエシエリヒア・コ
リ菌株は人体内のパイエル集腺を隔離することが知ら
れ、またストレプトコツカス・タイフイムラム−エシエ
リヒア・コリ雑種も人体内のパイエル集腺を隔離するこ
とが判明している。これらの担体細菌が病原性生体の組
み換え遺伝子を含み、かつその遺伝子を表現すれば、そ
の病原体に対する抗体が産生される。組み換えDNA技術
の出現に伴い、現在では、病因剤を介するのとは異な
り、抗原に対して遺伝子を表現しうる細菌の別の宿主菌
株を介することにより特異の抗原を産生する極めて特異
なワクチンの製造が可能になった。抗原が哺乳宿主の抗
原と交叉反応して自己免疫を誘発するような場合、組み
換えDNA技術の使用により遺伝子を改変し、交叉反応性
抗原決定因子の生成を防止せしめることもまた可能であ
る。それゆえに、哺乳宿主の抗原と交叉反応し、または
自己免疫を誘引する物質を含まないワクチンの開発に組
み換えDNA技術を採用することができる。

本発明は、局部免疫が重要であって、一防衛線となる
細菌性またはウイルス性疾病に対する有効ワクチン類の
開発に広く適用できることが明らかである。本発明のワ
クチンの例として、腸病原エシエリヒア・コリ菌株、ビ
ブリオ・コレラ、サルモネラ・タイフイ、シゲラ属細菌
に起因した腸疾患を制御するワクチンがある。本発明の
その他のワクチンは、嚢胞性線維症患者の持続性プソイ
ドモナス・アエルギノサ感染の制御、エリジニア・ペス
テスに起因した肺ペストの予防、エシエリヒア・コリ性
尿管感染の予防、ナイセリア・ゴノリア、トレポネマ・
パリダムおよびクラミデア・トラコマテスに起因した性
病の予防と、クラムデに起因した眼感染の予防に使用で
きる。遺伝子の入手が可能なストレプトコツチ属（Ａ
群、Ｂ群）、例えば咽喉病の原因となる属も本発明の範
囲内に含まれる別の細菌例である。流行性感冒ウイルス
用に製造されたワクチンなどのウイルス性ワクチンも本
発明の範疇に入る。DNAウイルス、例えばポパウイル
ス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポクスウイル
ス、レオウイルスピコルナウイルス、ミコソウイルス、
ポラミコソウスまたはレトロウイルスといった類のその
他のウイルスに有効なウイルス性ワクチンを製造するこ
ともできる。

本発明の実施例の一つは、脊椎動物の病原体である生
体またはその動物の抗原を産生する生体から誘動された
組み換え遺伝子を表現でき、生存非病原性微生物からな
る脊椎動物免疫用ワクチンである。この実施例中で用い
られる各技術用語を以下に説明する。ワクチンとは、生
体の免疫系統を刺激することにより後発の病害を予防す
るのに使用される薬剤である。免疫法とは、生体に予め
露出された病原体または抗原に対抗する生体内で高抗体
水準を連続的に誘発せしめる方法でる。免疫系統とは、
例えばインターフエロン生成といった単細胞生体に異体
を内在させる反応を含むが、本発明でいう免疫系統は、
多細胞生体が生体細胞または生体外液に侵入する抗原性
物質に対して抗体を産生する解剖学的特徴と機構に限定
される。このようにして産生した抗体は免疫グロブリン
Ａ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIg
M）などの免疫学的分類のいずれかに属する。IgAが温血
動物の分泌系統から得られる主要免疫グロブリンである
ことに注目すれば、特に興味あるワクチンはIgAの産生
を刺激するワクチンである。しかし、本発明はIgAの産
生を刺激するワクチンに限定されるのではない。例え
ば、いまここで述べた型のワクチンは、IgAの形式に加
えて、単細胞免疫および液素性免疫などの広範囲の免疫
反応を起こす可能性がある。抗原類の免疫反応は仔細に
研究されて広く報告されている。免疫学調査結果が「マ
イクロバイオロジー：イムノロジー・アンド・モレキュ
ラー・ジェネテックス」（「Microbiology:Immuno10gy
and Molecular Geenetics」）（３版、1980年、ハーパ
ー・アンド・ロー社）に発表されている。

脊椎動物は、魚類、水陸両用動物類、爬虫類、鳥類お
よび哺乳類を含んだコルデート門の主要部門である脊椎
動物亜門の一員であり、いずれも軟骨性脊柱を有するこ
とが特徴である。脊椎動物はすべて官能免疫系統を有
し、抗原と反応して抗体を産生する。その結果、全脊椎
動物がワクチン類と反応可能である。ワクチンは一般に
人または犬（狂犬病ワクチン］などの哺乳類に適用され
るが、ここに述べた性質を有すれば、たとえば魚類など
の営利的に飼養された別の部門の脊椎動物も本発明の範
囲に入る。

本発明の実施例における特徴の一つは、遺伝子生成物
として非病原性微生物を使用することである。この遺伝
子生成物は病原体またはアレルギンに対する抗体反応の
刺激に用いられる。非病原性とは、遺伝子の微生物が病
原体として作用しえないことを意味するのではなく、使
用される特定の微生物が特定の非治療動物に対する病原
体であることを意味する。当該微生物は遺伝子または病
原性の種族に属するが、非病原性菌株であってもよい。
病原性とは、疾患の発症または通常の生理機能を阻害す
ることを意味する。微生物にはウイルス類、細菌類、原
中類、単細胞カビ類が含まれる。試験官中で非ウイルス
DNAと組合わせたウイルス被覆蛋白質からなる合成ウイ
ルスを担体として使用することも可能である。

急速に発展しつつある組み換えDNA技術の結果、第一
生体の遺伝子物質を第二生体の遺伝子物質に転換するた
めの多用の技術が細菌では広く利用できるようになっ
た。本発明において第二生体再現により同一遺伝子物質
含んだ卑属親を生起させるために、第一生体から第二生
体に転換された遺伝子物質は組み換え遺伝子と呼称され
る。

本発明での遺伝子とは、広義には生物学遺伝単位体を
示すものとして用いられている。組み換え遺伝子とは親
生体中に存在するような完全遺伝子である必要はなく、
例えば官能ポリペプチドなどの巨大分子を産生または規
制できるものであればよい。この遺伝子は、抗原性生成
物の産生の際に用いる導子の型として作用すれば十分で
ある。遺伝子生成物は必ずしも親生体中におけるものと
厳密に同じ形態でなくともよい。例えば、100アミノ酸
残基から成るポリペプチドを指定する官能遺伝子を部分
的に担体に転換させ、宿主細胞の細胞機構を介してわず
かに75またはそれ以下の10のアミノ酸残基から成るペプ
チドを生成することができる。しかし、この遺伝子生成
物が、親生体中に存在する類似抗原に対して抗体を形成
するような抗原である場合、本発明において定義の遺伝
子の範囲に入ると考えられる。その抗原スペクトルの他
端部には、数種の遺伝子生成物を指定するDNAの長切片
が存在し、これらの遺伝子の一つまたは全部が抗原性を
有する。その結果、本発明でいう遺伝子とは、抗原の産
生可能な遺伝単位体である。この遺伝子は染色体、細胞
質またはウイルスを起源とするものであればよい。

遺伝子の免疫反応誘発を有効ならしめるためには、遺
伝子が表現されねばならない。遺伝子の表現とは、遺伝
子（DNA基部列）の組織に固有の情報が、遺伝子の位置
する細胞の生化学機構によりポリペプチド、RNA分子ま
たはその他の生物学分子の形態の物理的生成物に転移さ
れることを意味する。これらの生化学機構は、微生物が
細菌原虫または酵母菌の場合には担体微生物の細胞機構
であり、微生物がウイルスの場合は感染細胞の細胞機構
であってもよく、このようにして製造された生物学分子
は遺伝子生成物と呼ばれる。ここに用いた遺伝子生成物
とは、遺伝子の制御下で発生する生化学反応の結果によ
り製造されるすべての生物学生成物を指す。例えば、遺
伝子生成物は遺伝子の初期生成物つまり代謝物である酵
母またはその他の分子の制御下で製造されたRNA分子ペ
ブチドまたは生成物である。例えば遺伝子は最初、リボ
ゾームの作用により酵素に移植されるRNA分子の合成を
制御する。この酵素は、遺伝子が存在した原細胞の対外
環境中で多糖類の形成を制御する。上記RNA分子、酵素
およ多糖類はすべて本発明でいう遺伝子生成物である。
これらの遺伝子生成物はいうまでもなく、例えば糖蛋白
質類などの他の多様型遺伝子生成物も動物の免疫系統に
導入されると抗原として作用する。ワクチン中の抗原と
して使用するのに適した遺伝子生成物は、糖蛋白質類を
含んだ蛋白質遺伝子生成物である。

ワクチンの抗体産生を有効ならしめるためには、種痘
動物の抗体産生機構が活動し始めうるように、抗原性物
質が放出されねばならない。従って、遺伝子生成物の微
生物担体を動物体内に導入することが必要である。前記
したように、BALTおよびGALT細胞の好ましい反応を刺激
する際、筋肉注射、皮下注射または腹腔内投与、腔内投
与などのワクチン投与方法も可能であるが、微生物また
は遺伝子生成物を消化管または細気管内に直接導入する
方法が好適である。

担体微生物を用いる場合、一旦その微生物が動物体内
に存在すると、抗原が動物免疫系統内で形成可能な状態
にならなければならない。この状態は、担体微生物が死
滅し、抗原分子が放出されたときに達成される。しか
し、死滅することのない担体微生物により外部環境中で
得られる抗原の形成を制御できるように遺伝子を選択す
るのが好ましい。このように遺伝子の選択を行えば、種
痘動物内、例えばパイエル集腺内で持続しかつ抗原を継
続的に産生し、その結果、抗体形成を連続的に誘発する
生存微生物を使用することが可能である。この場合の好
適遺伝子生成物は、細胞膜を経て外部環境内に移行され
る生成物、あるいは外部膜に付着または封埋され、遺伝
子生成物の全部または一部が外部環境に露出される生成
物である。後者の遺伝子生成物の典型例は通常は予防を
必要とする生体の表面上に見られる抗原である。これら
の抗原を従来のように細胞面に移行させれば、その抗原
に対する抗体形成が大幅に増大される。

しかしながら、死滅して細胞質抗原を放出した非生存
担体を使用してもよい。非生存担体微生物を用いる場
合、生存担体の場合に比し、通常は病原性である細菌な
どの広範囲の担体微生物を採用することができる。他の
病原体からの抗原をGALTまたはBALTに搬送するのに病原
体を用いることは、もしその病原体がパイエル集腺内侵
入能を保持した状態で「無毒化」されない限り適切でな
い。自然界での生存防止のためのエシエリヒア・コリ菌
株の改変は周知であり、例えば米国特許明細書第4,190,
495号に記載されている。特定の栄養素を要求する細菌
を誘起するのに実験室で用いたのと同じ消減（△）突然
変異（例えば△thyA）を使用すればパイエル集腺の侵入
を防止せずに長期間生存を阻止することができる。アス
パラギン酸半アルデヒド脱水素酵素を削減しかつジアミ
ノピメリン酸（DAP）を要求するΔasd突然変異もまた細
胞内蛋白質と外質蛋白質の放出を伴って、生体内でのDA
Pの少ない死に帰着する。さらに、腸内ケリン合成を阻
止するストレプトコツカス・タイフィムラムの削減突然
変異により、無毒でしかもサルモネラ感染に対して有効
な免疫を誘起しうる菌株が生成される。この細菌は「ネ
ーチャー」（Nature）、291、238（1981）に記載されて
おり、担体微生物の至便な供給源である。

組み換え遺伝子を誘導する生体は被種痘動物の病原
体、あるいはその動物のアレルギンまたは他の抗原であ
る。アレルギンとは、被種痘動物体内でアレルギー反応
を起す物質である。動物の毛、花粉などの多種の異なっ
た物質はアレルゲンであるため、個々の動物のアレルギ
ー反応は特定のアレルゲンに依存して変化する。通常、
アレルギー反応を示す動物に対してアレルギン耐性を誘
引することができる。アレルギン耐性誘引方法は周知で
あり、一般にアレルゲンの服用量を増加させながらアレ
ルゲンを動物に投与することからなる。アレルギン耐性
誘引については、前記刊行物「マイクロバイオロジー」
に詳しく記載されている。

上述の型の生存ワクチンは周知技術または標準技術に
より動物に投与され、その方法は、経口摂取、腸管培養
または気管支−経鼻噴霧である。これらの各投与方法
は、生存ワクチンをBALT細胞またはGALT細胞に容易に到
達せしめること、抗体形成を誘発させうる点で好まし
い。担体微生物を動物の血流中に到達せしめる静脈注射
などの投与方法も異常状態下で適用できるが、担体微生
物による全身感染を招くので通常は使用すべきでない。
しかし、後述する本発明の他の実施例の場合のごとく、
精製した抗原を用いれば静脈注射の適用が可能である。

好適な投与方法が経口摂取と腸管培養であるから、好
ましい担体微生物は被感染動物の腸管上皮組織のいずれ
かを選択的に誘発しうる種族に属する微生物である。こ
れらの微生物菌株は、腸病原性菌株の遺伝子操作により
誘導される腸病原性菌株の非病原性誘導体であることが
好ましい。パイエル集腺を誘発し、IgAの産生を直接刺
激する菌株が最適である。人用菌株としてパイエル集腺
を誘発するエシエリヒア・コリ属、サルモネラ属の菌株
ならびにサルモネラ−エシエリヒア・コリ属の雑種が適
する。

組み換えDNA技術は現在では周知であり、広汎に利用
されているので常套手段と考えられている。広義には、
このDNA技術方法は、第一生体の遺伝子物質、通常はそ
の遺伝子物質の一部を第２生体中に転換させ、転換され
た遺伝子物質が転換生体の遺伝子物質の永久部（再結合
により）になるように構成されている。当該方法によれ
ば、遺伝子副体（染色外因子とも呼称される）または親
染色体のいずれか一方の親生体からDNAの小片がまず取
得される。遺伝子の副体は、細胞の染色体から物理的に
分離された遺伝単位体である。DNAは大きさは任意であ
り、制限的内部核酸分解酵素の作用により入手でき、こ
の分解酵素は、DNAを特異の対塩基部位で分裂せしめる
役目を果す。DNA片は、変換（カルシウムイオンなどの
種々の化学剤の存在下で人工的に誘発されうる裸DNAの
外部環境からの摂取）、接合（細菌の有性生殖）、人工
感染（ファージによるかまたはファージ被覆蛋白質の存
在下での非ウイルス性DNAの転移）などの多種の手段を
介して宿主細胞内に転移される。その他の適切な転移手
段は人工的抗原変換などの方法である。親DNAが担体細
胞内に入れば、そのDNAは分離片（一般に完全伝搬遺伝
子副体）として継続的に存在するか、または宿主細胞染
色体中に挿入されて細胞分裂時に染色体とともに生殖さ
れる。

遺伝子物質の転換は比較的単純であるが、その転換によ
り遺伝子が表現されるとの予測は未だ早計である。だか
らといって、本発明の実施が困難な訳けではない。宿主
微生物が転換された遺伝子を表現し、それにより抗原を
産生しなければならない点で、「ショットガン」アプロ
ーチを適切に利用できる。所望の抗原、例えば病原性細
胞膜断片に対し、標準技術によりまず抗体が産生され
る。抗原源である生体からのDNAは内部核酸分解酵素に
より多数の断片に開裂され、これらの断片が担体微生物
中に無差別に挿入される。病原体からの抗原を表現する
微生物は、病原体抗原に対する札付抗体との反応により
容易に同定される。所望の組み換え生体を得るために抗
原表現用微生物を選定して分枝発生させることができ
る。微生物のショットガン隔離法は周知であって、「ア
ニュアル・レビュー・オブ・バイオテクノロジー（Annu
al Review of Biotechnology）」、46、415（1977）に
記載されている。

本発明の範囲に属すると考慮されるのは、非病原性微
生物内で表現される病原性生体から惹起された遺伝子を
含む組み換え生体の産生可能な方法であり、遺伝子転換
技術は本発明の要部ではない。DNA単離、遺伝子隔離お
よびその他の関連技術が「レコンビナント・デー・エヌ
・エー：メソツズ・オブ・エンジモロジー（Recombnant
DNA:Methods of Enzymology）」（68巻、1979年、アカ
デミック・プレス）などに開示されている。

本発明の第二実施例において、脊椎動物の病原体であ
る主体から誘導された組み換え遺伝子を表現する微生物
より産生された遺伝子生成物からなり、その遺伝子生成
物が脊椎動物中で病原体に対して免疫反応を誘起できる
脊椎動物免疫用ワクチンが提供される。

第二実施例で産生された遺伝子生成物には、免疫また
はアレルギン耐性誘引の対象生体から惹起される他の抗
原性物質は存在しない。このことは、感染動物の多様の
細胞または器官と反応可能な抗体を誘起するとして知ら
れている病原性生体を取り扱う際、極めて重要である。
例えば、ストレプトコツカス・ムタンスにより得られた
ある種の蛋白質抗原は人心筋に内在の抗原と交叉反応す
ると報告されている。従って、その他の類似の連鎖球菌
蛋白質を人用ワクチンとして使用する場合、安全性とい
う特別の問題が持ち上る。この安全性の問題は、危険な
交叉反応を呈することのない抗原のみを誘導する組み換
え微生物の分枝系統を選択することにより回避可能であ
る。

前記した両実施例間の主な相違点は、第一実施例にお
ける生存微生物が抗原の担体として作用するのに対し、
第二実施例におけるワクチンが遺伝子生成物を産生する
生存微生物の存在しない状態で遺伝子生成物を含有して
いることである。第二実施例による主な利点は、担体微
生物による無制限感染の危険性がないことである。第一
実施例の場合、微生物の非病原性菌株の選択および非ウ
イルス性菌株産生能力に伴う制御により、無制限感染の
危険はほとんどないが、抗原性遺伝子生成物をワクチン
として直接産生しうる微生物の使用が必要であることは
いうまでもない。第二実施例の場合、実質的に感染動物
を害するような他の抗原の不存在下で遺伝子生成物を産
生するために、病原体つまり抗原生成生物の遺伝子を導
入しうる生体を使用することが可能である。従って、所
望の遺伝子生成物を高収率で産生する生体を成長させて
採取し、、遺伝子生成物を分離した後、その生成物を内
部投与に適した生体形成を必要とすることなくワクチン
として使用できる。その結果、高収率性の非両立生体を
用いたワクチンの製造が可能である。

第二実施例によれば、前記した遺伝子生成物を含めた
いずれの型の抗原性遺伝子生成物をも産生できる。抗体
反応によるショットガン隔離および分枝系選択は第二実
施例にも同様に適切に作用する。

第二生体に内在する他の物質からの抗原の分離は、分
枝選定との成長の後に行われる。複合混合物から特定成
分を物理的化学的に分離せしめる手法は、広く知られて
いる。ある種の混合物から得た画分中に抗原性遺伝子生
成物が存在するかどうかは抗体／抗原反応の試験により
容易に判定できるので、大部分の遺伝子生成物の分離に
は常用の実験手法で間に合う。すべての抗原の分離に適
用可能な方法の一つは、支持物質に結合された抗体から
なるアフィニテイ・カラム・クロマトグラフイの使用で
ある。この方法では、抗原含有粗製剤をカラムに通過せ
しめるとき、抗原をカラムに保持する必要がある。抗体
反応による分子系統のショットガンによる隔離および選
定は適切な分枝系の好ましい選定方法であるから、所定
の抗原用抗体が常に存在し、適切なアフイニテイ・カラ
ム・クロマトグラフイを容易に調整できる。硫酸アンモ
ニウム沈澱、ゲル濾過などの精製方法もまた適切であ
る。

要約すると、本発明のワクチンは微生物の遺伝子操作
により製造され、その製造方法は次の２つの必須工程か
ら成る。

１）病原性生体中の抗原を指定する遺伝子を選定する工
程。

２）前記遺伝子を非病原性担体微生物中に挿入せしめ、
前記病原性生体に対して抗体を誘導しうる遺伝し生成物
またはその代謝生成物を産生するために、前記微生物が
前記遺伝子を表現し、前記病原性生体に対してワクチン
による予防を必要とする脊椎動物にその遺伝子生物（担
体微生物の存在下または不存在下で）を投与せしめる工
程。

上記の両工程に引き続いて起る工程、例えば投与用微
生物培養物の生成、抗原性遺伝子生成物の精製は本発明
の要部ではなく、ワクチン最終形態に調整する常用技術
工程である。本発明をより具体的に説明するために、後
者の常用工程を実施せしめる方法を以下に記載する。

本発明のワクチンは、病原体から誘導された遺伝子を
表現できる担体微生物または無細胞無ウイルス形態の遺
伝子生成物のいずれか一方を含む。投与方法としては、
使用するワクチンの型に合せて自在に選定することが好
ましい。担体微生物を含むワクチンは経口投与に適し、
特にパイエル集腺の隔離が必要な場合に望ましい。服用
量は担体微生物の組み換え遺伝子表現能力および抗原産
生能力に依存して変るが、一般には10²〜10⁷微生物/ml
の濃度で１〜10mlである。好ましい経口製剤は腸溶皮剤
である。この製剤は接種された動物の腸内で溶解する
が、胃内の酸や酵素に対して耐性である。米国特許明細
書第3,241,520号および同第3,253,944号などに開示され
ているように、種々の腸溶皮型製剤が当業界において知
られ、市販もされている。腸溶皮カプセルの製剤に適し
た方法が米国特許明細書第4,152,415号に記載されてい
るが、その方法は本発明の担体微生物を含有するカプセ
ルの製剤用に容易に変形可能である。必要な唯一の変形
点は、生存微生物の過剰の乾燥を防ぐために抗原含有ス
ラリーの水分を調節することである。所定の乾燥量は常
用実験手法により簡単に測定できる。

病原体から惹起された遺伝子組成物を含有する無細胞
無ウイルスワクチンは上述のように経口的に投与しても
よく、または非経口的に投与することもできる（例えば
筋肉注射、皮下注射または静脈注射）。服用量は遺伝子
生成物の抗原性により変化するが、既存ワクチンの代表
的な免疫反応を誘発するのに十分な量であればよく、常
用の実験手法により所定の服用量を簡単に設定できる。
ワクチンの代表的な初期服用量は0.001〜1mg/kg/体重で
あるが、所望の予防度合に応じて服用量を増加したり多
重に服用すればよい。

ワンチンが懸濁または溶解される医薬用担体は、接種
された動物に対して無毒の、担体生体つまり抗原性遺伝
子生成物に対して相溶性の溶剤または固体である。医薬
用担体の好適例は、生理濃度またはその近傍濃度の通常
の生理食塩水や無毒塩などの液体担体、タルクや庶糖な
どの固体担体である。必要に応じて、完全または不完全
なフロインド補助薬などの補助薬を添加することにより
遺伝子生成物の抗原性を向上させてもよい。ワクチンを
気管支管を通して投与する場合、煙霧形状のワクチンが
適する。

以下に本発明の実施例を記載するが、この実施例はも
とより例示を目的とし、本発明を限定するものではな
い。

実施例ストレプトコツカス・ムタンス属の菌株6715（血清型
ｇ、グアニン＋シトシン含量45％）、菌株PS14およびGS
−５（血清型ｃ、グアニン＋シトシン含量35％）からの
DNAを適切なエシエリヒア・コリＫ−12の菌株内に分枝
を発生させた。ショットガン分枝発生実験により、スト
レプトコツカス・ムタンス遺伝子がエシエリヒア・コリ
内で表現されたかどうか、もし表現されたならば、その
遺伝子がエシエリヒア・コリ遺伝子の欠陥を補充したか
どうかを測定した。ストレプトコツカス・ムタンス細胞
をムタノリシン酵素で処理した後、細菌を硫酸ドデシル
ナトリウム洗浄剤で洗浄することにより、ストレプトコ
ツカス・ムタンス菌株UAB50、UAB90、UAB308からDNAを
単離した。エタノール沈澱によりDNAを回収し、EcoRI、
HindIII、BamHI、PstIなどの多種の制限内部核酸分解酵
素により制限し、同族酵素によりpBR322またはpACYC184
ベクトル片焼環に用いた。ポリヌクレオチド結合酵素
（またはDNAリガーゼ）を添加して組み換え分子を形成
し、HB101、χ1274、χ1849などの適切なエシエリヒア
・コリＫ−12菌株を塩化カルシウム冷電撃法により転換
した。その他の実験において、DNAをコスミドベクトルp
JC74に結禁し、組み換えコスミドDNAを熱誘導ラムダプ
ロフアージλcI857に対して溶原性のHB101などの適切な
エシリヒア・コリＫ−12菌株内に導入せしめるための成
分とともに、生体内包装法を介して組み換え分子を包装
することにより組み換え分子を形成した。分枝ベクトル
が適切な耐薬品遺伝子を担持した抗生物質に対する抵抗
用としての転換剤つまり人工感染分枝を選定した。多種
の突然変異エシエリヒア・コリ菌株を用いて試験した結
果、プリン、ピリミジンおよびアミノ酸生合成ならびに
炭水化物用に被験したエシエリヒア・コリの遺伝子欠陥
の約40％をストレプトコツカス・ムタンスの遺伝子情報
により補充可能であることが判明した。ストレプトコツ
カス・ムタンスDNAの存在をサウザン（Sonthern）吸取
分析より確認した。一定の機能を欠いたエシエリヒア・
コリの削減突然変異体は、所望補体の光学量が付与され
た場合と同様に、複転写遺伝子副体pBR322およびpACYC1
84〔ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリー（Bethesda Res
eyrch Laboratory）から入手可能）〕に分枝発生された
ストレプトコツカス・ムタンス遺伝子情報により急速に
成長することがある。

一般に、大部分のストレプトコツカス・ムタンス遺伝
子は構成的に表現され、終局体による抑圧を受けること
なく適切な基体により誘発可能であった。一つの例外は
ガラクトース用ストレプトコツカス・ムタンスの４〜５
個の遺伝子の複合体であった。これらの遺伝子は配位的
に調整され、ストレプトコツカス・ムタンス内における
場合と全く同じ手法によりエシエリヒア・コリ内で適度
に誘発された。その結果、上記試験に基づく仮説に対し
てある一定の自己調整が行われることが判明した。糖の
転移および付燐酸反応に必要でかつストレプトコツカス
・ムタンスの細胞質膜と連合すると思われるストレプト
コツカス・ムタンスの遺伝子生成物は、エシエリヒア・
コリ内で実質的に同じように機能する。ストレプトコツ
カス・ムタンスの細胞面に通常存在するかまたは成長媒
体中に排出されるストレプトコツカス・ムタンスの遺伝
子生成物はエシエリヒア・コリの細胞質膜を通して転移
され、外質空間中に終止した。細胞質から種々の外質蛋
白質を外質内に転移する際に欠陥のあるエシエリヒア・
コリperAの突然変異体は、ストレプトコツカス・ムタン
スのある種の細胞面遺伝子生成物をエシエリヒア・コリ
の外質空間内に転移させた。

エシエリヒア・コリ内でのストレプトコツカス・ムタ
ンス遺伝子の分枝発生は、ストレプトコツカス・ムタン
スの歯面隔離能力に寄与しうる遺伝子を同定することに
よって達成せしめた。グルコシルトランスフェラーゼは
スクロースを開裂してフラクトースを産生する一方で、
グルコースを重合してグルカンに転換する。ストレプト
コツカス・ムタンスは、α１→６結合を有する水溶性グ
ルカンと、分子形成されかつα１→６結合に加えてα１
→３結合を有する水不溶グルカンの両グルカン類を合成
する。ストレプトコツカス・ムタンスPS14およびGS−５
からのグルコシルトランスフェラーゼ用遺伝子をエシエ
リヒア・コリ中に分子発生させた。pYA601（PS14から
の）およびpYA619（GS−５からの）の中のその遺伝子
は、水溶性グルカンを合成する酵素を指定しうる1730bp
DNA断片に含有されている。分子量55,000のグルコシル
トランスフェラーゼは変形されることなくエシエリヒア
・コリ外質中に転移される。ここでグルコシルトランス
フェラーゼはスクロース（エシエリヒア・コリの外質内
に入りうる）を開裂し、成長用として使用されるフラク
トースを遊離させてグルカンを合成する。前述のよう
に、精製グルコシルトランスフェラーゼは、ストレプト
コツカス・ムタンスにより誘発された虫歯に抗して予防
免疫を呈した。

酵素活性を有さない細胞面連合蛋白質用の多種のスト
レプトコツカス・ムタンス遺伝子を確実に分枝発生させ
るために、免疫学予検法を使用した。この方法の実施に
当り、ストレプトコツカス・ムンタス6715の硫酸アンモ
ニウム沈澱細胞外蛋白質に対する抗体を育成した。pJC7
4コスミド分枝発生方法を用いて、λcI857感熱プロファ
ージに対して溶原性のエシエリヒア・コル菌株内に遺伝
子分子を挿入した。この分子発生方法は「プナス（PNA
S）」，75、4242（1978）に記載されている。30℃で成
長された細胞集落中で溶原性細胞を37℃に昇温して誘導
させると、その細胞は崩壊した。当該細胞がエシエリヒ
ア・コリの外表面に転移あれる代りに細胞質に局在とし
たとしても、抗原の遊離を招来した。この方法を使用
し、かつストレプトコツカス・ムタンスの細胞外蛋白質
に対する抗体と交叉反応する抗原を含んだ細胞集落の周
辺にプレシヒ・チン帯を形成させれば、ストレプトコツ
カス・ムタンスの細胞面連合蛋白質抗原を表現する数多
くの分枝系を同定することができた。これらの分枝系を
確認番号pYA701ないしpYA721として同定した。特に興味
ある分枝系はpYA721であった。pYA721分枝系は、当初ス
トレプトコツカス・ムタンスDNAの5.5Mdal断片により指
定された210k蛋白質を特定するものである。この蛋白質
抗原は、ストレプトコツカス・ムタンスのすべての血清
型において蛋白質抗原と交叉反応する。ただし、原則的
に噛歯類動物の細胞を集落し、人には適用されることの
ないストレプトコツカス・ムタンスの１群（正しくはス
トレプトコツカス・フェラスとして知られている）であ
る血清型ｂは除外する。

ストレプトコツカス・ムタンスの血清型ｇから得た21
0k蛋白質は、ストレプトコツカス・ムタンス菌株イング
ブリット（Ingbritt）の血清型ｃから精製した210k蛋白
質の赤毛猿への注射によってストレプトコツカス・ムタ
ンス誘発の虫歯を予防しうることを見い出したラッセル
（Russell）の抗原I/II（図２）に免疫学的に関連して
いることに注目すべきである〔「イムノロジー（Immuol
ogy），40、97（1980）〕。

ノトバイオートラットの下顎領域をストレプトコツ
カス・ムタンスの致死細胞で免疫化すると、ストレプト
コツカス・ムタンスに抗する唾液凝集体が誘引される。
この凝集体はIgAの類に属する。この免疫法は、病原性
ストレプトコツカス・ムタンス菌株によるその後の攻撃
を予防した。つまり、非免疫対象ラット群に比較し、免
疫ラット群における平均虫歯評点が著しく低下した。引
き続いて実験した結果、ストレプトコツカス・ムタンス
の致死細胞の摂取はストレプトコツカス・ムタンスに抗
して唾液分泌物IgAを同様に刺激し、さらにラットが抗
原性ストラプトコツカス・ムタンス菌株に攻撃されたと
き、予防的免疫を付与しうることが判明した。これらの
結果を臨床実験で確認した。臨床実験において、ストレ
プトコツカス・ムタンスの致死菌株を経口摂取したとこ
ろ、涙およびサルビア中にIgAを産生した。この場合の
抗体はストレプトコツカス・ムタンスのワクチン菌株に
抗して特異なものであった。血清凝集体の増加は皆無に
等しく、人心反応性抗体を刺激しないことが上記の実験
から判明した。

エシエヒリア・コリ内で表現され、集中的に研究され
てきたストレプトコツカス・ムタンスの２つの遺伝子生
成物はエス・ピー・エー・エー（spaA）蛋白質とグルコ
シルトランスフェラーゼである。

グルコシルトランスフェラーゼはそのスクロース加水
分解による還元糖の遊離能力により評価分析することが
でき、ソモギイ試薬を使い、520mmの反応を行った。こ
の評価分析は抽出物およびトルエン化細胞について使用
可能である。非変化ポリアクリルアミドゲル中の酵素
活性は、そのゲルを0.1Mスクロース（0.2M緩衝剤中、pH
7.0）に１〜２時間浸漬し、次いで暗所でトリフェニー
ルテトラゾリウムクロライドのアルカリ溶液で処理し、
還元糖生成活性を含む帯体を同定することにより測定で
きる。グルカン合成用のグルコシルトランスフェラーゼ
を評価分析するに当り、均一に札付けした放射性スクロ
ースを使用してもよいが、この方法は高価で煩雑であ
る。放射性免疫分析用として、エシエリヒア・コリによ
り産生されたグルコシルトランスフェラーゼに対する家
兎の単固有抗体および単分枝抗体を使用することがで
き、また細胞面上にグルコシルトランスフェラーゼを有
する細菌細胞を同定するに際し、フルオレンジまたはロ
ーダミンイソシアネートで札付けした抗体を用いること
が可能である。

精製の点から判断すると、グルコシルトランスフェラ
ーゼは33％硫酸アンモニウムに可溶な55k蛋白質（図
３）である。かくして、硫酸アンモニウム沈澱により細
胞抽出物から多種のエシエリヒア・コリ蛋白質を取り出
すことができる。その後、これらの蛋白質をジメチルア
ミノエチルセルロース〔デー・イー52（DE52），ホワッ
トマン・リミテッド（Whatman Ltd.）〕，ウルトロゲル
・エー・シー・エー54（Ultrogel AcA54）およびウルト
ロゲル・エー・シー・エー44（Ultrogel AcA44）（LK
B）の組み合せによるクロマトグラフィーに、アミコン
（Amicon）膜による限外濾過の貯槽濃度で通して均質な
グルコシルトランスフェラーゼを調製した。他の蛋白質
帯が放射性札付および放射性自己皮膚描画法、エス・デ
ー・エス（SDS）ポリアクリルアシダオゲルのコマッ
シー（Commassie）青着色法のいずれの方法からも検出
できないことからして、蛋白質汚染物は数パーセント以
下である。この方法を使用すれば、約50％のグルコシル
トランスフェラーゼを回収することができ、またピー・
ワイ・エー601（pYA601）遺伝子副体を含有するエシエ
リヒア・コリ細胞の培養物1lから10〜15mgのグルコシル
トランスフェラーゼを得ることができる。

グルコシルトランスフェラーゼはエシエリヒア・コリ
χ1849内で合成される。グリコースまたはラフィノース
上で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトピラノシドと
ともに成長するエシエリヒア・コリ細胞は、グルコシル
トランスフェラーゼ分子とβ−ラクタマーゼ分子の双方
をそれぞれ約50％産生する。β−ラクタマーゼ分子はま
たピー・ビー・アール322（pMR322）分枝発生ベクトル
上に指定される。グルコシルトランスフェラーゼ用の遺
伝子は1360と370bp（図４）の２つのヒンドIII（HindII
I）断片に張架し、大型断片がRNAポリメラーゼ結合部位
を有する（両断片ともバム・エッチ・アイ（BamHI）断
片内で分枝発生されている）。一方の断片が促進−停止
制御序列のために100bpを控除すれば、両ヒンド（HindI
II）断片はわずかに55〜58kの分子量の蛋白質を特定す
ることになる。

spaA蛋白質はその大きさに応じて数工程により精製可
能である。その蛋白質をストレプトコツカス・ムンタス
から精製するとき、無細胞培養上澄液を限外濾過により
初期容量の５％まで濃縮せしめ、スクロースを10％（w/
v）の濃度で添加し、次いでその画分を37℃で２時間培
養する。すべてのグルコシルトランスフェラーゼと、デ
キストランに結合されまたはスクロース親和性を有する
他の蛋白質とが一体になって複合体を形成する。この複
合体を低速遠心分離により除去する。次いで、その上澄
液をウルトロゲル・エー・シー・エー44（Ultrogel AcA
44）とウルトロゲル・エー・シー・エー34（Ultrogel A
cA34）に連続的に通過させ、最終的にジエチルアミノエ
チルセルロースのクラマトグラフィーに通した後、均質
な蛋白質を得る。エシエリヒア・コア中の210kエス・ピ
ー・エー・エー（spaA）蛋白質を冷間浸透圧電撃により
その外質液から精製せしめることができる。エシエリヒ
ア・コリ外質にはこの大きさの蛋白質がほとんど存在し
ないため、ジエチルアミノエチルセルロースによるイオ
ン交換クロマトグラフィー、それに引き続くウルトロゲ
ル・エー・シー・エー34（Ultrogel AcA34）によるゲル
濾過クロマトグラフィーを介して210kエス・ピー・エー
・エー（spaA）蛋白質の均質な製剤を得ることができ
る。

エス・ピー・エー・エー（spaA）蛋白質は免疫学法的
に評価分析される。ストレプトコツカス・ムタンスおよ
びエシエリヒア・コリの両属菌株から産生されたspaA蛋
白質に対する家兎の単固有抗体を得た。寒天二重拡散
（図５）およびロケツト電気泳動の両方法を用いて、エ
シエリヒア・コア外質（80％以上）体エシエリヒア・コ
リ細胞質中のエス・ピー・エー・エー（spaA）蛋白質量
を測定するために、上記の単固有抗体を使用した。さら
に、この抗体をローダミンイソシアネートによりspaA蛋
白質に抗して抱合させ、細胞表面上にエス・ピー・エー
・エー（spaA）蛋白質を有する連鎖球菌細胞を選別し
た。この螢光抗体を用いれば、細胞表面上にエス・ピー
・エー・エー（spaA）蛋白質を表現するエシエリヒア・
コリ菌株を同定することができる。

次の遺伝子組み換え仲介物を作成した。

pYA727の作成 pYA727は、pYA721から複分枝されたSpaA蛋白質の生成
を指定するサルモネラ・ムタンスDNAの断片８・35kbを
含む。このDNA断片はプラスミド分枝仲介物pACYC184の
中に含まれているものであるが、その配向は遺伝子組み
換えプラスミドpYA726中のサルモネラ・ムタンスDNAと
同じ８・35kbの配向とは逆である。双方の収率はSpaA蛋
白質に匹敵する。上記の両プラスミドは、エシエリヒア
・コリまたはサルモネラ・ネズミチフスの菌株中に存在
している。サルモネラ菌株中に導入したときの安定性
は、pYA727プラスミドの方がpYA726より優れると思われ
る。

病原性サルモネラ菌株の誘導体の作成アラバマ大学微生物工学部のウイリアム・ベンジヤミ
ンから入手した毒性サルモネラ・ネズミチフス菌株SR−
11を誘導し、x3115とx3137を得た（表＊１＊）。テトラ
サイクリンに対する耐性を有するトランスポゾンTn10を
用いたトランスポゾン突然変異と、フザリン酸耐性の選
択中におけるTn10および隣接する遺伝子組み換え物質の
抹殺は、標準法に準じた（R.Davisほか、「Advanced B
actrial Genetics」1979）。

x3115はアムピシリン抵抗を選択するpYA601 DNAによ
り、次いでクロラムフェニコール抵抗を選択するpYA727
DNAにより変換させた。グルコシルトランスフェラー
ゼＡの合成を特定するプラスミドpYA601と、表面蛋白抗
原Ａ（例えばSpaA蛋白質）の合成を特定するpYA727がそ
れぞれ異なった抗体抵抗を特定し、同一微生物細胞中で
相互に実施することができる。その理由は、初期分枝仲
介物のpBR322とpACYC184とが互換性を有して、同一微生
物細胞中で単独で実施できるからである。

サルモネラ・ネズミチフ菌x3137の生成は、x3115から
二段法で行い（表Ｉ）、代謝物を追加的に導入すること
でthyA遺伝子を抹殺してチミジンを付加した。次いで、
クロラムフエニコール抵抗を選択して、pYA727によりx3
137を変換した。

x3245には、「Nature」291、238（1981）に記載され
ているように、サルモネラ・ネズミチフス菌SL1344を無
毒とし、保護免疫を誘発するものとして、△arcA554代
謝物を含んでいる。アムピリシン抵抗とクロラムフェニ
コール抵抗とを選択することで、χ3245をpYA601とpYA7
27で変換した。

表I:本発明の担体菌株の遺伝子特徴と遺伝子工学 χ3041 サルモネラ・ネズミチフス菌SR−11asd遺伝
子の近傍のzge位置にTn10を含むχ3011上で生長したP22
によりTcrに導入 χ3105 同上SR−11、zge、Tn10 フザル酸抵抗の選択によりTn10と近傍のasd遺伝子の抹
殺 χ3115 同上SR−11、ΔasdA3 Tn10を含み、thyA遺伝子に挿入されたχ3001上で生長し
たP22によりTcrに導入 χ3134 同上SR−11、asdA3、thyA、Tn10 フザル酸抵抗の選択によりTn10とthyA遺伝子部分の抹殺 χ3137 同上SR−11、△asdA3、△thyA42 χ3245 同上SL3261、△arcA554、hisG46 χ3175 サルモネラ・チフス菌Ty21a、galE χ3175はサルモネラ・チフス菌Ty21Aである。この菌
株は「J.Infections Diseases」，131,553（1975）と米
国特許明細書第3,856,935号に開示されており、菌株の
試料はウォルター・リード陸軍研究所のルイス・バロン
から得た。クロラムフェニコール抵抗を選択することに
より、その菌をpYA727プラスミドで変換した。

χ3315とχ3137における△asdA3の代謝は、ジアミノ
ピメリン酸（DAP）を欠く寒天上で10¹⁰の微生物を培養
しても、Asdに復元しない。同様に、χ3137の△thyA42
の代謝、χ3245の△aroA554の代謝は、それぞれチミジ
ン、芳香族アミノ酸、ビタミンを欠く寒天上で10¹⁰微生
物を培養しても復元しない。

χ3115、χ3137、χ3245、χ3175はいずれも相当量の
サルモネラ・ムタンスspaA蛋白質を産生する一方、χ31
15とχ3245はサルモネラ・ムタンスにより特定されたグ
ルコシルトラスフェラーゼＡの蛋白質を相当量産生す
る。サルモネラ・ネズミチフス菌株のχ3115、χ3127、
χ3245は、経口投与または胃挿管法によりマウスに導入
する場合、プラスミドpYA601やpYA727の有無に関係なく
無毒である。つまり、マウスは経口投与で10⁷〜10⁸の細
菌に抗して生存し、病原性サルモネラ・ネズミチフス菌
といった野生型菌株の無毒誘導体に対して悪影響を示さ
なかった。有毒性サルモネラ・ネズミチフス菌SR−11
（χ3041）を用いた対照は、経口または胃挿管で10⁵で
死亡率100％を呈した。サルモネラ・ムタンス蛋白質を
表現する遺伝子組み換えプラスミドの補体を有するχ31
15、χ3137、χ3245は局部的にGALTとなり、パイエル集
腺の外科切開により回収可能である。pYA601とpYA727を
有するχ3245で免疫化されたマウスは、数週間後に有毒
性サルモネラ・ネズミチフス菌SR−11に挑戦しても、十
分に保護することができた。さらに、pYA727中で指定さ
れたサルモネラ・ネズミチフス菌表面抗体とサルモネラ
・ムタンス特定spaA蛋白質に抗しての分泌IgA抗体が、
免疫化されたマウスの耳下腺に検出された。

確認試験として、χ3115、χ3137、χ3245のナリデキ
シ酸抵抗性の誘導体を調べた。この酸抵抗は、各菌株へ
のファージp22の中介変換によって、gyzA1816を導入す
ることで比較した。このようにマーカーを付せば、感染
後のサルモネラ誘導体を選択的に回収でき、実験結果の
分析を促進することになる。gyxA1816マーカーを使用す
れば、上記誘導体を担体細菌として作用させる必要はな
い。

χ3115Nalr、χ3137Nalr、χ3245Nalrを、胃挿管法に
よりマウスに投与し、１時間後にパイエル集腺（GALT）
の微生物を回収した。24時間後、これらの無毒サルモネ
ラ誘導体を５倍に増量し、パイエル集腺で検出した。上
記三種の細胞の１回当りの服用量109でマウスを免疫化
した後の15日、８日、15日目の、サルモネラ抗原とサル
モネラ・ムタンス遺伝子組み換え生成物に抗してのマウ
ス血清中のピーク力価から抗体反応を調べた。

耳下腺の分泌IgAに関し、サルモネラ・ムタンス表面
蛋白質の抗原を表現する上記三種の無毒サルモネラ誘導
体で免疫化したマウスについて、サルモネラ抗原とサル
モネラ・ムタンス抗原の両者に対して免疫後22日目でピ
ーク力価が検出された。

他の実験では、サルモネラ・ムタンス抗原を表現する
無毒サルモネラ・ネズミチフス菌株をマウスに３日連続
して投与した。サルモネラ抗原とサルモネラ・ムタンス
抗原に対する血清抗体の力価は、免疫後30日目でピーク
に達し、分泌IgA抗体も免疫後30日目でピークを示し
た。

結果を表III〜Ｖに示す。血清、分泌抗体力価はELISA
で測定した。サルモネラ・ネズミチフス菌LT2、サルモ
ネラ・ムタンス6715（ステレオタイプｇ）、サルモネラ
・ムタンスMT8148（ステレオタイプＣ）の超音波処理物
を被覆した。前述した通り、spaA遺伝子はステレオタイ
プｇに由来し、この蛋白質の蛋白質抗体はタイプｃ等の
すべてのステレオタイプ交叉反応可能なものである。一
方、atfA遺伝子はセロタイプｃに由来し、GtfAの抗体は
セロタイプｇに由来する遺伝子生成物とは反応しない。
１日当り１回または３回ずつ109の細菌を、マウスに胃
挿管法により投与した。

サルモネラ・ムタンスspaA蛋白の合成を表現する無毒
のサルモネラ・チフス菌誘導体χ3175は、マウスに対す
る病原体ではないため、マウスによる比較試験を省い
た。ボランツティアの被験者に対して試験を行った。そ
の結果、サルモネラ・ネズミチフス菌は人体に経口投与
しても無毒であり、十分な免疫を呈することが判明し
た。

【図面の簡単な説明】

図１は精製spaA蛋白質の抗血清とストレプトコツカス・
ムタンス菌株の血清型a,c,e,f,g,dの濃縮培養上澄液と
の反応に関するオウチャターローニイー（Ouchterlon
y）分析を示す図。図２は、精製spaA蛋白質の抗血清と、精製spaA蛋白質に
よるストレプトコツカス・ムタンス血清型ｃ抗原I/II、
つまりspaA蛋白質を産生するエシエリヒア・コリχ1274
（pYA722）の抽出物および分枝発生ベクトル（pACY18
4）を含むエシエリヒア・コリχ1274の抽出物のオウチ
ャターロニイー分析を示す図。図３は55k蛋白質がグルコシルトランスフェラーゼであ
りかつβ−ラクタマーゼである場合の（１）χ1849（pB
R322），（２）χ1849,（３）χ1849（pYA601）から得
られた単細胞中で合成された放射性札付き蛋白質を示す
図。図４はストレプトコツカス・ムタンスDNA挿入物を長さ1
360,370bpの２つのHindIII制御断片で構成したpYA601の
物理地図を示す図。図５はエシエリヒア・コリHB101（pYA721）の外質
（Ｂ）および細胞質（Ｃ）に存在するspaA蛋白質であ
り、（Ａ）が耐spaA血清を含むオウチャターロニー分析
を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脊椎動物の病原体に由来する抗原性遺伝子
生成物からなり、前記遺伝子生成物がエシエリヒア、サ
ルモネラまたはサルモネラ−エシエリヒアの属の宿主細
胞中で表現され、前記脊椎動物の体内において非エシエ
リヒア・コリ病原体に抗して免疫反応を誘発する脊椎動
物の免疫用ワクチン。
【請求項２】実質的に生存無傷細胞を含まない請求項１
に記載のワクチン。
【請求項３】前記遺伝子が前記病原体の表面抗原を指定
する請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】前記遺伝子が前記病原体の酵素を指定する
請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】前記病原体がエシエリヒア・コリ以外の細
菌である請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】前記細菌がビブリオ・コレラ・シゲラ、プ
シュードモナス・アエルギノサ、ナイセリア・ゴノリ
ア、グラミデア・トラコマテスおよびストラプトコツカ
ス・ムタンスからなる群から選ばれた種属の細菌である
請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】前記病原体がストレプトコツカス・ムタン
スであり、前記宿主細胞がエシエリヒアである請求項５
に記載のワクチン。
【請求項８】前記遺伝子が表面抗原またはグルコシルト
ランスフェラーゼを指定する請求項７に記載のワクチ
ン。