JPH04501351A

JPH04501351A - 細胞の遺伝的集団において所望の組換え遺伝子を維持する方法

Info

Publication number: JPH04501351A
Application number: JP1500124A
Authority: JP
Inventors: カーティス　レイ　ザ　サード
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1988-10-06
Publication date: 1992-03-12
Also published as: EP0381706A4; EP0381706A1; DE3853683T2; WO1989003427A1; AU637969B2; DE3853683D1; CA1339412C; ATE121785T1; JPH11235191A; US5672345A; EP0381706B1; AU2611188A; US5840483A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと、ここで該酵素１は、細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する；ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること、ここで該第１の組換え遺伝子は、該欠損染色体遺伝子に取って替わることはできない：Ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること；そして。

ｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合、ここで、第１の組換え遺伝子の発現による生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときには、該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する。

８、請求項７に記載の方法であって、前記細胞は細菌であリ、そして、前記細胞壁の必須構成成分はペプチドグリカンである。

９、請求項８に記載の方法であって、酵素１はジアミノピメリン酸（口ＡＰ）またはローアラニル−ローアラニンジペプチドの生合成の工程を触媒する。

１０、請求項９に記載の方法であって、前記細菌はグラム陰性細菌であり、そして、酵素１はａｓｄであり、そして酵素２はａｓｄ遺伝子由来の機能性代替物である。

１１、請求項１０に記載の方法であって、酵素２はＳ９ｍｕｔａｎｓ。

またはｔ！、ｃｏｌｉ、またはＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ由来のａｓｄ遺伝子由来である。

１２、細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する酵素をコードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であって、該細胞壁の成分は［ｌＡＰから次のａおよびｂを包含する工程により合成される：ａ）ＤＡＰを含む培地中で親細菌を増殖させ変異させること；およびｂ）栄養要求性の発現を許容するが、　ＤＡＰを含みそして該細菌内で細胞壁の生合成を妨害する抗生物質を含む培地を用いて、変異細菌を選択すること。

１３、　ａｓｄをコードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であって、該方法は。

ａ）　トランスポゾンを用いて欠失を生じさせることにより。

細菌の染色体遺伝子中に欠失を導入すること；およびｂ）ａｓｄをコードする遺伝子に欠失を有する変異体を、　ＤＡＰを含む単離培地を用いて単離すること；を包含する。

１４、　ａｓｄ”’変異体を構築するのに有用であり、　ａｓｄをコードする遺伝子に欠失変異を有する組換え細菌株であって、該組換え細菌株は、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２Ｃｈｉ２１０８およびＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍＣｈｉ３５２０　、およびそれらの変異体でなる群から選択される。

１５、ａｓｄ−表現型を有する細菌株を補足するのに有用な組換えプラスミドであって、該組換えプラスミドは、　ａｓｄをコードする第１の遺伝子を有し、そして所望の生産物をコードする第２の組換え遺伝子が挿入され得る制限部位を有する。

１６、請求項１５に記載の組換えプラスミドであって、前記第１の組換え遺伝子は、　Ｓｏｍｕｔａｎｓまたはｐ、ｃｏｌｉまたはＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｏ＋由来である。

１７、請求項１６に記載の組換えプラスミドであって、前記グラスミドはｐＹＡ２４８およびその変異体、またはｐＹＡ２９２およびその変異体である。

１ｇ、請求項１６または請求項１７のプラスミドにより形質転換された細菌株。

１９、個体を免疫するためのワクチンであって、該ワクチンは次のａ、ｂ、ｃおよびｄにより特徴づけられる非病原性細菌株を含有し。

ａ）細胞の生存に必須な酵素ｌをコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと、ここで該酵素１は、細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する。

ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること、ここで該第１の組換え遺伝子は、該欠損染色体遺伝子に取って替わること？１できな０゜Ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること、およびｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合、ここで、第１の組換え遺伝子の発現ｌこよる生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときに番よ、該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する；そして、該細菌は薬学的に受容され得る賦形剤中に処方され、そして、該細菌は薬理学的に効果的な量で存在する。

２０、請求項１９に記載のワクチンであって、前記非病原性細菌はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）変異体であり、そして天然の遺伝子はａｓｄである。

２１、請求項２０に記載のワクチンであって、前記第１の組換え遺伝子はＳ、　ｍｕｔａｎｓ由来のａｓｄをコードして、そして、前記第２の組換え遺伝子は１Ｍ、レプラ（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）由来の抗原またはＳ、　ｍｕｔａｎｓの５ｐａＡ内にコードされて０る抗原をコードする。

２２、　ｐＹＡ２４ＢまたはｐＹＡ２９２でなる群から選択されるプラスミド、ポリペプチドをコードする遺伝子を告ｕ限酵素部位（こ挿入することにより、それらから誘導されるプラスミド；およびそれらの変異体。

２３、請求項２２のプラスミドにより形質転換された細菌株。

２４、　ＰＹＡ２３２を有するＣｈｉ６０９７　、　Ｃｈｉ２９７８　、　Ｃｈｉ３５２０　、　ＰＹＡ２４８を有するＣｈｉ４０７２　、　Ｃｈｉ３００８　、　Ｃｈｉ２１０８およびｐＹ八へ９２を有するＣｈｉ６０９７でなる群から選択される細菌株。

明細書本発明は、ワクチンおよび組換えＤＮＡ発現産物を調製するための材料および方法論に関する。さらに詳細には、所望の遺伝子産物を発現するのに有用な、遺伝的に操作された微生物に関し、この微生物は、遺伝的に安定な集団において維持され得る。致死平衡（ｂａｌａｎｃｅｄ　１ｅｔｈａｌｓ）であるという理由から、所望の遺伝子産物を発現するのに有用である。

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たとえば、それらは外来のタンパクを生産するために利用され得、そしてそれゆえに、インターフェロン、インシュリン。

生長ホルモン等の生産物の合成のために工業的に利用され得る。それらはまた、免疫応答をひきおこすワクチンとして利用され得る。さらに、それらは環境中に放出され、環境に存在する汚染物を分解し、あるいはさらに農業上重要な作物を悩ます害虫を殺し得る。しかし、遺伝的に操作された微生物は、しばしば利益をもたらさない遺伝子産物を合成するに違いないし１組換え体タンパクの高いレベルの発現は、微生物にとって有害であり得る。このように、遺伝的に操作された微生物は、クローン化された遺伝子産物を生産しない同じタイプの微生物と比べて選択的に不利であり得る。その結果。

所望の遺伝子産物を特徴づけているＤＮＡ配列を失った自然発生的な分離個体により遺伝的に操作された微生物の集団力λ°―ただちに過密なものとなる。これは、微生物が発酵槽中、土壌中、植物上、あるいは動物中で増殖する場合にも起こる。

バクテリアの集団に選択圧を与える１つの方法は、所望のポリペプチドをコードしている組換え遺伝子を、抗生物質耐性をコードしている遺伝子をも含むプラスミドに挿入する方法である。現在使用されているほとんどのクローニングベクターは抗生物質耐性を特定している１またはそれ以上の遺伝子を有する。それゆえに１組換えプラスミドを失っているこれらの細菌を殺すために、遺伝的に操作された微生物の増殖のための培養培地に抗生物質が加えられ得る。この実施はいくつかの欠点を有する。まず第一に、構成物質を増殖培地に加えることは高くつくことである。第二に、抗生物質耐性はしばしば、薬剤を不活化させる酵素の合成に基づいているため、薬剤耐性の遺伝子の消失後、多くの細胞世代にわたって細胞は表現型では薬剤耐性のままである。このことは、所望の組換えＤＮＡの生産物を特定する遺伝子と関連がある。第三に、クローン化された抗生物質耐性遺伝子が、所望の生産物を発現する遺伝子と隣接していなければ、後者の［ｌＮＡ配列は抗生物質耐性を消失することなく、非正統的組換えにより除かれる。その結果として、抗生物質に耐性ではあるが、所望の生産物を合成する能力を欠く細菌が得られる。第四に、遺伝的に操作された細菌が生ワクチンとして使用される場合には１食品医薬品局は抗生物質耐性を発現する菌株を承認することを避けてきた。

遺伝的に操作された微生物中で組換えプラスミドおよび／またはクローン化されたプラスミドを維持するための抗生物質耐性に代わるものは９重大な生合成の酵素が欠損した変異細菌株を用いることであり、そして、プラスミドクローニングベクター上に、その酵素のための野生型の遺伝子を供給することである。Ｋａｈｎら（１９７９）およびＤｅａｎ　（１９８１）。残念なことに、これは多くの状況下において実践的ではない。アミノ酸。

プリン、ピリミジン、ビタミンの生合成に包含される酵素が欠失している変異体の使用は、これらの変異体の増殖をしばしば妨げない。なぜなら、増殖に必要とされる経路の最終産物が、しばしば環境から供給されるためである。たとえば。

培養槽での組換え生物の生長のために使用される安価な培地は、しばしばこれらの最終産物を含んでいる。さらに、特に生ワクチンの場合には、最終産物はワクチンを接種された宿主によりインビボで供給され得る。

プラスミド上にクローン化された遺伝子を有する遺伝的に操作された微生物の遺伝的な不安定さの問題は、微生物の染色体にクローン化された遺伝子を組込むことにより軽減され得ると示唆されてきた。この示唆には少なくとも１つの欠点がある。もし、プラスミド上の外来のクローン化された遺伝子配列が非正統的組換えにより消失し得るならば、クローン化された遺伝子が、細菌の染色体に組込まれた時にもまた同じタイプの組換えがおこり得る。すなわち、非正統的組換えによりＤＮＡ配列の欠失につながるような構造的および酵素的な事柄は、　ＤＮＡ配列がプラスミド上に存在しようが細菌の染色体の組込まれた部分であろうが、基本的には類似している。

さらに１組換えＤＮＡの染色体への組込みにより、プラスミド上にそれが存在するときの潜在的な利点の多くが達成される。

たとえば、クローン化された遺伝子を含んでいるプラスミドのプラスミドコピー数の制御により、生産物の収量を増加させるための機構が提供される。それにより、高いレベルの発現舐増殖周期のより有害性の少ない時期におこるように生産物の発現を一時的に制御するための機構、も提供される。

すべての細菌は形状と硬さを与える細胞壁のペプチドグリカン層を持っている。

ペプチドグリカンは、ムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを繰り返し単位とする重合体からできており、短いペプチドにより架橋されている。すべてのグラのペプチドはＬ−アラニン、Ｄ−グルタミン酸、メソジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）およびローアラニンから構成される。はとんどのグラム陽性微生物では、　ＤＡＰがその脱炭酸された産物であるＬ−リシンでおきかえられている。

ＤＡＰは、β−アスパラギン酸セミアルデヒドから６つの酵素的工程を経て合成され、このβ−アスパラギン酸セミアルデヒドは、Ｌ−アスパラギン酸から２つの工程を経て合成される。第１工程では、Ｌ−アスパラギン酸は、いくつか（通常は３つ）のβ−アスパラギン酸キナーゼの１つによりリン酸化される。このβ −アスパラギン酸キナーゼはいくつか（通常は３つ）の別々の遺伝子によりコードされており、その遺伝子は、究極の最終産物であるし一スレオニン、し−メチオニンおよびし一リシンによる遺伝子産物の抑制および／またはフィードバック阻害により、独立して調節されている。β−アスノく一トフォスフェートは、　ａｓｄ遺伝子の生産物であるβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼによりβ−アスパラギン酸セミアルデヒドに、１工程で変換される。懸先遺伝子に点突然変異あるいは欠失がおこった変異体およびβ−セミアルデヒドをｒｌＡＰに変換する酵素を特定している６つの遺伝子のいくつかに変異がおこった変異体は、すべての培地においてＤＡＰを必ず必要とする。ＤＡＰ要求性突然変異体がＤＡＰを除かれるとＤＡＰがないことにより死滅し、その内容物を放出しながら溶解する。

細菌株にａｓｄ、従ってｄａｐ、の変異を包含させることにより生物的封じ込めをおこなうことができる。なぜなら、そのような変異株は、注意深く制御された実験室の環境以外の環境では生きのこることができないからである。この基本原理は米国特許’ＪＥ４．１９０．４９５号に広範囲にわたり記載されている。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ＰＳ１４　（ＵＡＢ６２）由来の β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子はクローングラム陽性微生物およびグラム陰性細菌では、ムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを繰り返し単位とする重合体を架橋しているペプチドは、トアラニンを含んでいる。Ｄ−アラニンはａｉｒ遺伝子（Ｅ、　ｃｏｌｉ）またはｄａｌ遺伝子（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ＞の産物であるアラニンラセマーゼにより１、−アラニンから合成され９次いで、　ｄｄｌ遺伝子の生産物である酵素ローアラニル−Ｄ−アラニンリガーゼによりＤ−アラニル−Ｄ−アラニンジペプチドに変換される。ひとつのムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン重合体に結合し、ペンタペプチドを形成するし一アラニルＤ−グルタミルロＡＰまたはし一アラニルーＤ−グルタミルーしりシントリペプチドが加えられた後、末端のＤ−アラニンは９次のムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン重合体に対する酵素的架橋反応の間に切断される。Ｄ−アラニンを合成する能力またはトアラ離されたＣＤｕｌら（１９７３））。Ｄ−アラニルローアラニンリガーゼを欠（ｄｄｌ変異体がＥ、　ｃｏｌｉから単離され（Ｗｉｊｓｍａｎ　（１９７２ｂ）。

り生物的封じ込めを行うことができる。なぜなら、そのような変異株は、注意深く側御された実験室の環境以外の環境で生きのびることができないからである。

発明の要旨本発明の様々な実施態様は、遺伝的に安定した集団中で維持され得る平衡致死であるために、所望の遺伝子産物の発現に有用な遺伝的に操作された宿主細胞を特徴づける。

従って９本発明の１つの局面は、所望の組換え遺伝子を発現する細胞の遺伝的集団において、該組換え遺伝子を維持する方法であって、該方法は９次のａ、ｂ、ｃおよびｄにより特徴づけられる遺伝子的に操作された細胞を増殖させることを包含し：ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと、ここで該酵素１は、細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する。

ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること、ここで該第１の組換え遺伝子は、該欠損染色体遺伝子に取って替わることはできない；Ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること。

ｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合、ここで、第１の組換え遺伝子の発現による生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときには、該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する；そして、該増殖は、該第１の組換え遺伝子の欠失により細胞が溶解するような環境により行なわれる。

本発明の他の局面は上述の遺伝的に操作された細胞である。

本発明のさらに他の局面は、細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する酵素をコードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であって、該細胞壁の成分はＤＡＰから次のａおよびｂを包含する工程により合成される：ａ）ＤＡＰを含む培地中で親細菌を増殖させ変異させること；およびｂ）栄養要求性の発現を許容するが、　ＨＡＰを含みそして該細菌内で細胞壁の生合成を妨害する抗生物質を含む培地を用いて、変異細菌を選択すること。

本発明のさらに他の局面は、β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であって、該方法は。

ａ））ランスボゾンを用いて欠失を生じさせることにより。

細菌の染色体遺伝子中に欠失を導入すること；およびｂ）ａｓｄをコードする遺伝子に欠失を有する変異体を、　ＨＡＰを含む単離培地を用いて単離すること；を包含する。

本発明のさらに他の局面は、　ａｓｄ−変異体を構築するのに有用であり、　ａｓｄをコードする遺伝子に欠失変異を有する組換え細菌株であって、該組換え細菌株は、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２Ｃｈｉ２１０８およびＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｃｈｉ３５２０　、およびそれらの変異体でなる群から選択される。

本発明の他の局面は、　ａｓｄ−表現型を有する細菌株を補足するのに有用な組換えプラスミドであって、該組換えプラスミドは、　ａｓｄをコードする第１の遺伝子を有し、そして所望の生産物をコードする第２の組換え遺伝子が挿入され得る制限部位を有する。

さらに本発明の他の局面は、ワクチンであって９次のａ。

ｂ、ｃおよびｄにより特徴づけられる弱毒性細菌株を含有しａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと、ここで該酵素１は、細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する。

ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること、ここで該第１の組換え遺伝子は、該欠損染色体遺伝子に取って替わることはできない。

Ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること、およびｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合、ここで、第１の組換え遺伝子の発現による生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときには、該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する；そして、該細菌は薬学的に受容され得る賦形剤中に存在し。

そして、該細菌は薬理学的に効果的な量で存在する。

さらに本発明の他の局面は、　ｐＹＡ２４８でなる群から選択されるプラスミド、ポリペプチドをコードする遺伝子を制限酵素部位に挿入することにより、それらから誘導されるプラスミド：およびそれらの変異体である。

さらに本発明の他の局面は、　ｐＹＡ２９２でなる群から選択されるプラスミド、ポリペプチドをコードする遺伝子を制限酵素部位に挿入することにより、それらから誘導されるプラスミド：およびそれらの変異体である。

さらに本発明の他の局面は、　ＰＹＡ２３２を有するＣｈｉ６０９７　、　Ｃｈｉ２９７Ｂ　。

Ｃｈｉ３５２０　、　ＰＹＡ２４８を有するＣｈｉ４０７２　、　（ｈｉ３００Ｂ　、　Ｃｈｉ２１０８およびｐＹＡ２９２を有するＣｈ　１６０９７でなる群から選択される細菌株第１図はアミノ酸のアスパラギン酸類の生合成を示すフロ第３図はｐＹＡ２３５の創製に使用されるプラスミドの重要な特徴を示すフローチャートである。

第４図はｐＹＡ２２９の構築に使用されるプラスミドの重要な特徴を示すフローチャートである。

第５図はクローニングベクターｐＹＡ２４８の重要な特徴を示す地図である。

位のヌクレオチド配列を示す。

第７図は組換えベクターｐＹＡ２６０の重要な特徴を示す地図である。

第８図はｐＹＡ２３２の重要な特徴を示す地図である。

第９図はＰＹＡ２６０またはｐＹＡ２４８で形質転換したＡｓｄ−株、またはｐＹＡ２６０およびｐＹＡ２３２で共形質転換したＡｓｄ−株の発現産物を示すポリアクリルアミドゲルの写真である。

第１０図はＳｌｍｕｔａｎｓ　５ｐａＡ遺伝子の構造を示す地図であり。

主な抗原決定基を示す。

第１１図はｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２の重要な特徴を示す地図である。

第１２図は、　Ａｓｄ−株からｐＹＡ２６０．　ｐＹＡ２６１．およびｐＹＡ２６２が自然発生的に消失する割合を示すグラフである。

第１３図はＡｓｄ＋プラスミドｐＹＡ２４８．　ｐＹＡ２６１．およびｐＹＡ２６２を含むＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｃｈｉ４０７２の全細胞タンパクの、クマシーブルー染色された５Ｏ３−ＰＡＧＥのプロフィール（左）およびウェスタンプロット　（右）を示すゲルの写真である。

第１４図はｐＹＡ２７２．　ｐＹＡ２７５　（Ｔｎ１０００挿入物を有する。および有していない）、およびｐＹＡ２７７の構築および性質を示すチャートである。

第１５図はｐＹＡ２８０の重要な特徴を示す地図である。

第１６図はｐＹＡ２９２の重要な特徴を示す地図である。

第１７図は町１ｅｐｒａｅ　ＤＮＡ挿入物を有するｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９１の構築を示すフローチャートである。

（Ｙ叉丁余白）発明を冥施する方法 “組換え宿主細胞”、“宿主細胞”、“細胞”などの微生物を意味する用語は、交換して用いることができ１組換えベクターの受容体もしくは他の挿入されたＤＮＡの受容体として用いられ、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、ゲノムもしくは全ＤＮＡの相補体において、偶然もしくは計画的な変異のために、もとの親細胞と必ずしも完全に同一ではないことは明らかである。親細胞の子孫は、親細胞に十分類似【７ていて、関連する性質９例えば必須の酵素をコードする先天的遺伝子を、所望の遺伝子産物をコードする構造遺伝子に連結されたクローン化遺伝子で置換することによって特徴づけられる。

“制御品ダドは、自らが連結されているコード配列の発現を行うのに必要なりＮＡ配列を意味する。一般にこのような制御配列は、プロモーターとリポソーム結合部位を持っている。

“制御配列”という用語は、その存在が発現に必須な全要素を少なくとも含み、またその存在が有利な付加的要素２例えばオペレーター類も含むことを意味する。

“作用可能に連結された″という用語は、このように記載された要素が、意図された方式で機能できるようにする関係になるような位置に並置されていることを意味する。コード配列に“作用可能に連結された”制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるような仕方で連結されている。

“ゲノム陰性菌”には９球菌（ｃｏｃｃｉ）、非腸管内桿菌および腸管内桿菌が含まれる。ゲノム陰性菌の属としては９例えばナイセリア（Ｎｅ　１ｓｓｅｒ　ｉａ）　、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ｘルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フランジセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　Ｉｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ｘシェリキア（Ｂｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ）　、サルモネラ（ＳａＩｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉ −ｇｅｉｌａ）、　クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）　。

ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、バタテロイデス（Ｂａｃｔ、ｅｒｏ　１ｄｅｓ）　、アエロバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）　。

アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｉ−ｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）　、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、スピリラ（Ｓｐｉ−ｒｉｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ビブリオ（Ｖ　ｉｂｒ　ｉｏ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ）、）リポネー７　（Ｔｒｅｐａｎｅｍａ）およびフッバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）が含まれる。

“ゲノム陽性菌”には１球菌、非胞子形成桿菌および胞子形成桿菌が含まれる。

ゲノム陽性菌の属には９例えば、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バシラス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）　、　エリジペロリツクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌ　１ｓｔｅｒ　ｉａ）、マイコ″クテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）　、ミクソコツカス（Ｍｙｘｏ−ｃｏｃｃｕｓ）　、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄ　ｉａ）、スタビロコツヵス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）　、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）が含まれる。

“マイコバクテリア”は、その特有の染色性に基づいて定義される。すなわち酸性有機溶媒による脱色に耐性であり。

および長連鎖（約６０個の炭素原子）のミコール酸の存在下での脱色に耐性である。

“先天的染色体遺伝子”は、野生型生物体の染色体に生じる遺伝子であり、“先天的染色体遺伝子”には９例えばイー・コリもしくはサルモネラ内のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする遺伝子、アラニンラセ７−　セラコードする遺伝子、およびＤ−アラニル−ローアラニンリガーゼをコードする遺伝子がある。先天的遺伝子の他の例は後で述べる。

本願で用いられる組換え体遺伝子”という用語は、天然のより大きな分子き関連しては見出せないような、このより大きなポリヌクレオチド分子中に存在するポリヌクレオチドの同定可能なセグメントとして定義される。

“細胞壁の必須成分°は、細胞壁のもとの構造をそのまま維持するのに必要な成分であり、この成分がない場合には。

細胞は浸透に対して感受性になる。菌株の浸透感受性は、細胞を低張媒体中に置くことにより測定できる。そして、細胞が溶解する塩の濃度の測定は１例えば細胞の懸濁液の濁度の変化により測定することができる。変異菌株の浸透感受性は。

細胞壁の必須成分を含有する野生型菌株の浸透感受性と比較される。細胞壁必須成分を欠いている結果、生じる浸透圧に敏感な細胞の特性は、細胞タンパクの質量が増大したことである。例えば、タンパク合成の結果、細胞が溶解する。細胞壁必須成分の例としては、グリカン類、特に原核生物のペプチドグリカン類、真菌類の細胞壁のキチンおよび植物の細胞壁のセルロースがある。

“ペプチドグリカン”は、はとんどすべての原核細胞の細胞壁の代表的な成分であって、細胞壁の硬さに関与している。

ペプチドグリカン類は、アシル化アミノ糖類と３〜６種のアミノ酸を含有する一群の巨大分子であり、このヘテロポリマーは、短いペプチドを介して架橋されたグリカン鎖を含有している。ペプチドグリカン類については、　５ｃｈｌｅｉｆｅｒとＫａｎｄｌｅｒが概説している（１９７２年）。

本願で用いる“［ｌＡＰ”という用語は、特に特別な記載がなければ、ジアミノピメリン酸の立体異性体、すなわちＬＬ形とメソ形の両者およびその塩類の両者を意味する。

本願で利用される変異菌株の遺伝子記号は、　Ｂａｃｔ＋ａ＋ａｎｎ　（１９８７年）および５ａｎｄｅｒｓｏｎとＲｏｔｈ　（１９８７年）が記載したのと同じものである。トランスポゾン類、特にＴｎｌＯに用いる記号は。

Ｂｕｋｈａｒｉらが述べた規定（１９７７年）に従っている。

本発明のワクチンで処置される“個体”は９本願では、すべてのを椎動物を含むと定義される。例えば、家畜とヒトを含む哺乳類、特に農業上有用な家禽類を含む色々な種の鳥類が含まれる。さらに軟体動物などのある種の非を椎動物は原始的な免疫系を持っているので“個体”に含まれる。

本願で用いられる“形質転換”という用語は、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入を意味する。“形質転換。

は、挿入に用いる方法１例えば直接取込法９形質導入法もしくは接合法とは無関係である。外因性ポリヌクレオチドは。

プラスミドとして保持されるか。または宿主のゲノムに組み込まれる。

本発明の実施は、特に記載がなけれは、細胞培養法９分子生物学、微生物学９組換え体ＤＮＡおよび免疫学の通常の技術を使用するが９　これらは当業者ｌＪ知られている。このような技術は文献類に充分説明されている〔例えば以下のものを参照のこと：　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｐｒ１ｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＯＮＧ　：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＩＪＡＬ　（１，９８２年）；　ロＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ。

第１巻と１１巻（Ｄ、Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒｍ集、　１９８５年）　；　０ＬＩＧ［１ＮＩＩ［’ＬＥＯＴＩＤＥＳＹＮＴ）ＩＥＳＩＳ　（Ｍｊ、Ｇａｌｔ編集、　１９８４年）　；　ＮＩＩＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩｒ）Ｉ−ＺＡＴＩＯＮ　（Ｂ、口、　ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、　Ｈｉｇｇ　ｉ　ｎｓ編集、　１９８４年）；Ｂ。

Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＩＩＩＤＢ　ＴＯＭＯＬＢＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４年）；ｔｈｅ　５ｅｒｉｅｓ、ＭＥＴＨＯ口Ｓ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬ（］ＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ）；ＶＥＣＴＤＲ５：Ａ　５ｔｌＲＶＥＹ　ＯＦ　ＭＯＬＥＣＩＩＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　ＶＥＣＴＯＲ３ＡＮＤ　ＴＨＥＩＲ［ｌ５ＢＳ　（Ｒ，Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚおよび［）、Ｔ、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ編集、　１９８７年。

Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）　；およびＪ、Ｈ−Ｍｉｌｌｅｒ、　ＥＸＰＢＲＩＭＢＮＴＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＧＥＮＥＴＩＣ３（１９７２年、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］　。

本願に記載した特許、特許出願および刊行物が、すでに記載したもの、以下に記載するものにかかわらずすべて本願に援用される。

本発明は、一部は、遺伝子が安定した集団として保持されることができるように宿主細胞に遺伝子操作をして、該集団の中で、この宿主細胞に所望の組換え体遺伝子産物を発現させることを目的とする。この集団の中の宿主細胞は、細胞の生存に必須の酵素であって細胞壁必須成分の生合成の工程を触媒する酵素をコードする先天的遺伝子を、特徴的に不活性化してさた。さらに、この先天的遺伝子の機能は１組換え体遺伝子によって取り換えられるが、この組換え体遺伝子は欠陥染色体遺伝子を取り換えることができず、欠陥染色体の発現が所望の遺伝子産物の発現に対して作用可能に連結されている。本発明は、適切な宿主細胞である細胞を作製し分離する方法を提供する。また宿主細胞を形質転換するのに適し。

置換組換え体酵素を含有し、所望のポリペプチドをコードする遺伝子が挿入されたプラスミドを提供する。本発明の細胞は、工業用装置１例えば醗酵型中で培養させることにより。

所望のポリペプチド生産に使用するのに適している。またこれらの細胞は、ワクチンの成分、特に生ワクチンの成分である。

本発明の宿主細胞の一つの特徴は、その細胞壁が、ペプチドグリカンもしくはキチンもしくはセルロースのような構造高分子を含有していることである。これらの高分子は、宿主細胞かもとのままの構造を維持するのに必要なもので、これらの高分子がない場合には、細胞が浸透に対して鋭敏になる。

したがって、宿主細胞は９例えばペプチドグリカンを含有する細菌のような原核細胞、または例えばキチンを含有する真菌なような真核細胞、またはセルロースを含有する植物細胞であってもよい。好ましくは９本発明の宿主細胞としては。

細胞壁の一部としてペプチドグリカンを含有する原核細胞である。このペプチドグリカンは２例えば架橋ペプチドにローアラニンを含有するものでもよい。この種の架橋部を有する宿主細胞は、当該技術分野で公知である。本発明の宿主細胞として最も好ましいのは、ペプチドグリカンがＤＡＰを含有している原核細胞である。ペプチドグリカンがＤＡＰを含有する宿主細胞の例は、当業者に公知である〔例えば、　５ｃｈｌｅｉｆｅｒとＫａｎｄｌｅｒ　（１９７２年）の文献参照〕。このような宿主細胞には。

例えば、恐らくすべてのグラム陰性菌と、バシラス（ｂａｃｉｌｌｉ）。

クロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、ラクトバシラｘ　（１ａｃｔｏ− ｂａｃｉｌｌｉ）、　：！リネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉａ）　、プロピオニバクテリウム（ｐｒｏｐ　ｉｏｎ　１ｂａｃｔｅ−ｒ　ｉａ）　、アクチノミセターいくつかの種のような多数の生物が含まれる。ペプチドグリカンがＤＡＰを含有することを特徴とする方法の概説は、　５ｃｈｌｅｉｆｅｒとＫａｎｄｌｅｒ　（１９７２年）の文献に記載されている。

本発明の宿主細胞の他の特徴は、この宿主細胞が、変異させられたために、細胞壁必須成分生合成の工程を触媒する酵素をコードする先天的染色体遺伝子が機能しなくなること。

すなわち機能性酵素を生成しないことである。細胞を生成させて９本発明の宿主細胞を製造する方法は公知であり１例えば、化学的変異誘発法、Ｕｖ変異誘発法およびトランスポゾンの作用によって誘発させる変異法が含まれる〔例えば＊　Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２年）　；　Ｄａｖｉｓ、　ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＲｏｔｈ；およびＭｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙａｉｏｌｏｇｙを参照〕。上記遺伝子中に点変異部分を含有する宿主細胞は本発明に含まれるが、これらの遺伝子中に欠失変異部を有する宿主細胞を使用することが好ましい。なぜならば欠失変異体は一般に復帰しないからである。

細胞壁成分とその前駆体の生合成を触媒する酵素は公知である。例えば、ペプチドグリカンを合成する場合、酵素は。

架橋ペプチドの挿入を触媒する酵素９例えばトアラニルートアラニンリガーゼ、または炭水化物ポリマーを合成する酵素。

または前駆体２例えばＤＡＰを生合成する工程を触媒する酵素でもよい。第１図は、アスパラギン酸系のアミノ酸生合成の過程を示し、　ＤＡＰの両方の立体異性体がメンバーになっている〔このアミノ酸系の生合成の概説についてはＵａ＋ｂａｒｇｅｒ　（１９７８年）の文献参照〕。ＤＡＰの生合成の工程を触媒する酵素をコードする遺伝子の例は９種々の微生物について当該技術分野で公知であるが〔例えばＧＢＮＩＩ！ＮＴＩＣＭＡＰＳ　１９８７　（Ｓ、Ｊ、Ｏ’ｂｒｉｅｎ編集、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）参照〕例えばニスと９例えばイー−１）り中のｄａｐＡ、　ｄａｐＢ、　ｄａｐＣ，ｄａｐＤおよびｄａ酵素は、すなわちＤＡＰの生合成に必須のものであって、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＳＤ）であり。

異を導入する方法と、他のグラム陰性菌とマイコバクテリア列挙するが９列挙したＡｓｄ−菌株は、後述のトランスポゾン技術を利用して他の菌株を構築するのに利用できる菌株の例である。またＡｓｄ−菌株は、米国特許第４．１９０．４９５号にも記載されている。

標準の変異誘発法と変異体の強化プロトコルはａｓｄ変異体の回収に有効ではない。その理由は、　ＤＡＰを必要とする変異体は、　ＤＡＰがなければ溶解して死ぬからである。したがって先に分離されたａｓｄ変異体は１間接的に偶然に発見されたか。

または何百万もの潜在的変異体の自然力によるスクリーニングによって発見されたのである。本発明には、　ａｓｄ変異体の選択的な強化と単離の効率的な方法が含まれる。

オニン、し一トレオニンおよび口ＡＰが必要である。Ｌ−メチオオンとＬ−１− レニオンに対する要求はホモセリンにより満たされる。ホモセリンはメチオニンとトレオニンとの両者の共通の前駆体である（第１図参照）。イー・コリ菌株またはニス・ティフィムリウム菌株の変異誘発に続いてアンピシリン−シクロセリン処理をして栄養素要求型変異体を強化しても、ホモセリンに対する単独の要求をもった変異体を回収することはまれである。Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９６５年）は、栄養素要求株を選択するシクロセリン強化法を報告している。本発明は、この方法を改変してアンピシリンに採用した場合を包含しており。

実施例に挙げられている。ホモセリンを要求する栄養素要求株がまれにしか単離されない理由は、β−アスパラギン酸セミアルデヒドが２つの遺伝子にコードされている２つのデヒドロゲナーゼのいずれかによってホモセリンに変換されるためである。単一の細胞内で両方の遺伝子を不活性化する確率は非常に小さいので、ホモセリンを必要とする栄養素要求株は、ランダムスクリーニング法では検出されない。

この問題は、変異誘発中の全培地にＤＡＰを含有させ、およびアンピシリン−シクロセリン法を用いて強化もしくは選択することによって、ホモセリンとＤＡＰの両方を要求するａｓｄ変異体が回収されるようになることが見出されることによって克服される。アンピシリンとシクロセリンは９両方ともタンパクを合成できる細胞の増殖において細胞壁の合成を阻害するが、タンパクを合成できない栄養素要求型変異体では栄養を要求しないので影響がない。ａｓｄ変異体菌株のＣｈｉ３００８とＣｈｉ２１０８　（表１参照）は、それぞれニス・ティフィムリウムとイー・コリの菌株であるが、この方法を用いて分離された。Ｃｈｉ３００８のＡＳｄ−表現型はａｓｄ遺伝子中の点変異によるものなので、Ａｓｄ＋に復帰する頻度はかなり高い。一方。

Ｃｈｉ２１０８のＡｓｄ−表現型は、　ａｓｄ遺伝了の欠失によるものであるから復帰の頻度は非常に低い。

ａｓｄ遺伝子の変異を有する菌株であって、特に望ましい欠失変異を有するものは、トランスポゾンを利用する方法で生成させることができる。トランスポゾンは、細胞染色体の多くの点に添加することができる。トランスポゾンの挿入と欠失の特徴についてはＫｌｅｃｋｎｅｒ　（１９７７年）の文献に概説されて対する耐性〈およびフザリン酸に対する感受性）を与えるが。

例えばイー・コリとニス・ティフィムリウムを含む色々な細イー・コリとニス・ティフィムリウム中にδ−ａｓｄ変異体を生成させる方法は、後述の実施例で述べる。まず、細菌の染色体へのランダムＴｎｉＯ挿入のライブラリーを、適切なトランスポゾンベクター２例えばイー・コリに対するλ−Ｎに５６１［ＫＩｅｃｋｎｅｒら（１９７７年）］を、ニス・ティフィムリウムのλ−感受性菌株（その例は表１のＣｈ　１３３２４である）に対して用いて作製する。例えば、イー・コリとニス・ティフィムリウムそれぞれに対する適切な形質導入ファージＰＩＬ４もしくはＰ２２ＨＴｉｎｔを適切な種の中のＴｎｌＯｎｌグライブラリ−上させ、その種のＡｓｄ−変異体を形質導入するのに用いて、Ａｓｄ”　Ｔｃｒイー−コリ菌株Ｃｈｉ２１０８とニス・ティフィムリウム菌株Ｃｈｉ３００８である（表１参照）。−重鎮の場合が二重鎖よりも形質導入の確率が高いので、はとんどの形質導入体９例えばＣｈ　１２ｉ３０１３　（表１）から単離した。

欠失変異も９組換えＤＮＡ技術を用いて細菌染色体内に導入することができる。

しだかって、トランスポゾン変異誘発法でサブクローン化してｐＹＡ２７５内でのニス・ティフィムリウムの範囲を決定し９次いでこのニス・ティフィムリウムａｓｄ　ａ転子をｐＵｃ１８内にクローン化してｐＹＡ２７２を得た（第１４図）。

ラム菌株に導入すると、相同組み換えがおこって、染色体とプラスミド内に遺伝子操作によるδ−ａｓｄの変異を有する細胞が得られる。この培養物を１次に約４３℃のような上昇させた温度で、低濃度のノボビオシンの存在下で増殖させ、構成物質の入っていない媒体上にプレートし９次にアンピシリンを含有する培地にレプリカプレートして、アンピリジン耐性を示すｐＵｃ１８由来の組換え体プラスミドを失ったクローンを同定する。

欠失変異体を単離し特性決定した後、欠失部に隣接してＴｎ用いて形質導入され得、非常に多様な細菌菌株および種に。

トランスポゾンを導入することができる。そして、これらの細菌菌株および種は、宿主の範囲が広範囲にわたっている普遍形質導入性ファージＰＩＬ４で形質導入可能である。テトラサイタリン耐性は、フザリン酸に対する感受性を伴うので、δを形質導入することができ９次いでフザリン酸耐性についてされる。この場合、δ−ａｓｄ変異によってｚｈｆ−２：：ＴｎｌＯが取り換えられる。受容体菌株がイー・コリに−１２と異なる制限挙動をもっている場合、このような障壁は、受容体菌株を９例えば５〜１０分間、４５〜５０℃のような簡単な熱ショックに付すことによってなくすことができる。

ニス・ティフィムリウムの各種菌株のδ−ａｓｄ変異体を単離するのに類似の方法を用いることができる。普遍形質導入ができる。トランスポゾンを有するファージは９次に、他の適切な受容体株を形質導入してテトラサイタリン耐性にするのに利用される。Ｐ２２ＨＴｉｎｔの溶解物は、δ−ａｓｄ変異を有する細菌菌株１例えばＣｈ　１３０２１もしくはＣｈ　１３６２８上のファージの増殖が原因であるが、　ｚｈｆ：：ＴｎｌＯ挿入物を有する菌株を形質導入するのに用いることができる。フザリン酸耐性の変異フザリン酸に対する耐性により所望の形質導入体を選択することによって、　ｚｈｆ：：ＴｎｌＯ挿入物を変えてδ−ａｓｄ変異を挿入する形質導入が１０−４〜１０−５の頻度で起こり、一方、欠失型変異によるＴｎｌＯ挿入物の自然喪失は約１０−８の頻度で起こることが示される。したがって所望の菌株を構築する際にδ−よって、新しい欠失変異体が回復する確率は非常に小さいけれでも正しい遺伝子型を保証する。

サルモネラの多くの菌株は、ファージＰ２２で形質導入できらの菌株［：ｈｉ３６２９．　Ｃｈｉ３６３８．　Ｃｈｉ３６３０およびＣｈｉ３６５６はそれぞれ、ガラクトースの存在下で増殖させると、正常でなめらかな、リポ多糖のコー）　（ＬＰＳ）を有し、Ｐ２２に対して感受性になる。しかしガラクトースなしで増殖させると、細胞はＬＰＳの側鎖を欠いたラフなコートを有するようになるが、ガラクトースなしで増殖させた細胞は、　ＰＩＬ４による感染が可能である。

ＰＩＬ４はＣｈｉ３６２９上で増殖可能であり（表１）、その溶解物がＰＩＬ４感受性菌株を形質導入するのに用いられ、その菌株導入するのに用いられ９次いでフザリン酸耐性細胞が選択さ導入される。代わりに、　ＰＩＬ４をＣｈｉ３６５６上で増殖させることができ、適切な受容体がＨＡＰの存在下でＴｃ’に形質導入されさせたＰＩＬ４で形質導入することによって除去することができ（表１）、フザリン酸耐性について選択することによって。

Ｔｃ″に形質導入するのに用いられる。

つを形質導入することが実行できないかまたは不可能な場合は、竺先変異体を単離する前述の方法を利用することができる。細菌菌株を変異誘発し、変異体の集積および選択強化をＤＡＰの存在下で行って、ホモセリンを合成できない変異体を選択して単離する。とり一変異を得た後、変異体の復帰頻度を測定した。欠失変異が所望の場合、当該技術分野で公知の種ボゾンライブラリーを形質導入で導入し、同時に起こるＡｓｄ　”遺伝子に近接して連結されているから、フザリン酸耐性の車種に対して成果が得られない場合は、他のトランスポゾンを用いてと一一遺伝子に連結させることができる。利用可能なトランスポゾンは当該技術分野で公知である（Ｂｕｈｋａｒｉらの文献た４枦−遺伝子は９次に、前述のようにして野生型細菌菌株に戻すことができる。

本発明の宿主細胞のその他の特徴は、２つの遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチド構造で形質転換されたということである。第１の組換え遺伝子は、不活性な先天的遺伝子の酵素活性を機能的に置換するポリペプチドをコードする。

遺伝子をコードする組換えポリヌクＩ／オチドの構築で形質転換することができる。Ｓ、ミュータンスａｓｄ遺伝子の産物が。

イー・コリ遺伝子産物を機能的に置換するということは。

Ｃｕｔｔ、ｉｓｓら（１９８２年）が報告している。さらには、Ｓ、ミュータンス遺伝子は、第」の組換え遺伝子として必要なその他の特性を例示している。すなわち、それは配列の相同性を欠いているため、イー・コリ遺伝子との組み換えは１通常行わない。Ｓ、ミュー・タンスａｓｄ遺伝子配列と、それがイー・コリの配列に対する相同性を欠いていることは、　ＣａｒｄｉｎｅａｕとＣｕｒｔ　１ｓｓ（１９８７年）が報告している。宿主細胞遺伝子と組換え遺伝子との間に組み換えがおこらないということは、第２の組換え遺伝子に対する連鎖した選択圧を維持するのに必要である。

は隣接のヌクレオチド配列のい（らかまたはすべてを有する受容体宿主を提供することができるために、ベクター中のクローン化されたａｓｄ遺伝子との２重交差組換えが不可能となる。この例には、ベクターｐＹＡ２９２中に含まれ、　ｐＹＡ２９２に含まれているいずれかおよびすべてのヌクレオチドが欠けたδ−遺伝子を用いることが含まれている。そして、その系では。

の例は、当該技術分野では公知であり１例えばビー・ラクト遺伝子を含むベクターの構築法は、イー・コリとニス・ティフィムリウムのａｓｄ−菌株を形質転換するのに利用することができ、後述の実施例で考察するように、この構築法にはＰＹＡ２４８とｐＹＬＡ２９２が含まれる。表１は細菌菌株を示し１表２（実施例１０に示す）は、プラスミドを構築するだめの菌株とプラスミドを示す。

ポリヌクレオチド配列中の第２の組換え遺伝子は、所望のポリペプチド、例えばウィルス、細菌、真菌もしくは寄生体の抗原、商業上望ましい酵素もしくはポリペプチドなどの配列をコードし、このコード発現は、第１遺伝子に連結された制御配列によって決まる。この連結はベクター中の２つの遺伝子の配向によるものであるから９両遺伝子は２例えば同じ制御要素９例えば同じプロモーターとオペレーターとの制御下にあり得る。これらの特徴を有するベクターを構築する方法は９組換えＤＮＡ技術を用いる当該技術分野で公知であり。

後述のワクチンの項で充分に考察する。第２遺伝子がβ−ガラクトシダーゼをコードするベクターの例である。Ｓ、ミュータンスの表面タンパク抗原Ａ　（ＳｐａＡ）とエム・レブラエ（Ｍ。

１ｅｐｌａｅ）由来の抗原については、後の実施例の項で述べる。

れており、これらは、ニス・ティフィムリウムとイー・コリ中のＡｓｄ−表現型を捕捉するのに有用である。

（以下余白）本発明のその他の実施態様は、所望のポリペプチドの調製法に本発明の宿主細胞を利用することである。細胞の増殖条件は９選択された宿主細胞の属と菌株によって決まり、このことは当該技術分野で公知である。しかし、この細胞は９組換え遺伝子の欠失によって細胞溶解が起こる環境内で増殖する。この組換え遺伝子の産物は、細胞壁を産生ずる際に欠失している酵素を機能的に補足する。例えば、宿主細胞がイー・転子を含む細胞は、　ＤＡＰを欠いているがホモセリンもしくはトレオニン、およびメチオニンを含有する環境内で増殖する。

こり、　ＤＡＰなしで増殖が続くと細胞溶解が起こる。

本発明のその他の実施態様は、殺虫剤、殺真菌剤などを産生ずるために、または毒性汚染物を分解するために、環境中に放出するのに設計された細菌としての使用についてである。

殺虫剤、殺真菌剤、もしくは毒性廃棄物分解酵素を特定する組換え遺伝子は、細菌の変異を機能的に補足する産物を産生する組換え遺伝子に連結される。この細菌は細胞壁産生に必須の酵素の欠落の原因となる。このことは致死平衡を構成するので、所望の特性を発現する細菌のみが生存して増殖し。

その結果、殺虫剤、殺真菌剤などまたは毒性廃棄物を分解する酵素の連続生産を保証する。

本発明のその他の実施態様は、変異の致死平衡配列を、細絶壁の独特な必須の成分の合成をブロックする染色体中に。

野生型非相同性遺伝子によって構築する用途である。この遺伝子は、その欠陥を補足し、医学、工業もしくは農業に有用な価値のある産物の生産を特定する遺伝子に連結されている。

このような場合、致死平衡構築物は９発酵技術を用いてたいてい増殖されるであろう。

本発明の宿主細胞はまた。生ワクチンの成分として有用である。この場合、第２組換え遺伝子は、真菌、細菌、寄生性もしくはウィルス性病原体の抗原をコードする。生ワクチンは９局所免疫が重要な場合、特に有用であり、これは第」の防御ラインとなる。しかし、この場合、宿主細胞が、予防接種される個体に対して非病原性であることが必須である。適切な宿主細胞が、前述のように１例えばａｓｄ変異の挿入とこれにつづいて２つの組換え遺伝子を含有するポリヌクレオチドで形質転換して誘導される細胞の例は、　ＣｕｒｔｉｓｓとＫｅｌｌｙ無発病性にされると、その微生物は、ワクチンの免疫原性成分として役立てることができ、そして微生物に対する免疫性を誘発する。したがって、非病原性を含めて前記の宿主細胞の特性を有する微生物のいずれもが本発明に用いられる。この微生物としては、サルモネラ、イー・コリーニス・ティフィムリウムのハイブリッド、シゲラ、エルシニア、パスツレるがこれらに限定されない。好ましい微生物は、サルモネラ属に属する微生物で、ニス、ティフィムリウム、ニス・ティ本発明のその他の実施態様において、ここでキャリアー細菌と言われている。病原性微生物の無発病性誘導体は９選択された抗原を、　ＧＡＬＴ、例えば回腸のバイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ　ｐａｔｃｈ）に送るのに利用され得る。サルモネラのようないくつかの属　“の細菌は、バイエル板に向かって進むことが知られている（［：ａｒｔｅｒ、　Ｐ、　Ｂ、とＰ、　Ｍ、　Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｊ、　ＥＸＰｏＭｅｄ、、　１３９：１１８９゜１９７４年）。ニス・ティフィムリウム− イー・コリのハイブリッドも、マウスのバイエル板にコロニーをつくることが分かっている（）ｌｏｂｍａｎｎ、　Ａ、Ｗ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ、ａｎｄ　Ｉｍｏ＋ｕｎ、、　２２ニア６３゜１９７８年）。これらのキャリアー細菌が病原性生物由来の組換え遺伝子を含有し発現する場合、その病原体から産生される抗原性遺伝子産物に対する抗体が誘発される。遺伝子組換え技術の出現によって、全く独特なワクチンを開発することが可能である。このワクチンは、特異的抗原が、病原体からではなくて、その抗原の遺伝子を発現できる他の宿主細菌菌株によって産生される。抗原が哺乳類の宿主の抗原と交差反応して自己免疫の誘発を高める場合には１組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子を変えて、影響する交差反応の抗原決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）が産生されないようにすることもできる。

したがって９組換えＤＮＡ技術は、を椎動物の宿主抗原と交差反応し得る物質。

または自己免疫状態を誘発できる物質のいずれもを含有しないワクチンを開発するのに利用することができる。

本発明は９局所免疫が重要でこれが防御の第１のラインになる場合、細菌、真菌、寄生性もしくはウィルス性病原体に対して有効なワクチンを開発するために広範囲の応用性をもっていることは明らかである。いくつかの例として、エルシによって起こる梅毒、およびクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）によって起こる性病と眼の感染症を制御するワクチンが挙げられる。グループＡとグループＢの両者からのストレプトコツシー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の種の。

例えば咽喉炎もしくは心臓疾患を起こす種であるナイセリア・セラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）、パスツレラ・ヘモリｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ（Ｓｈ　ｉｇｅ　ｌ　Ｉａ）の種、およびレジオネラ・ニューモフィラ化ｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）は、遺伝子を得ることができる本発明の範囲内に含まれる細菌の追加例である。インフルエンザウィルスに対して産生されるようなウィルスワクチンも本発明に含まれる。ウィルスワクチンとしては、他のライスルであるＤＮＡウィルスもしくはＲＮＡウィルスに対するものも調製することができる。これらのウィルスとしては。

例エバ、パボバウイルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、パルボウィルス、レオウィルス、ピコルナウィルス、ミクソウィルス、バラミクソウィルス、またはレトロウィルスが挙げられる。病原性の真菌、原性動物。

および寄生体による感染に対して防御するワクチンも９本発明に期待することができる。

別の態様において、ワクチンの免疫原性成分が宿主のアレルゲンである場合、このようなワクチンは、アレルギー性宿主を特異的に脱感作するよう設計された暴露養生法（ｅｘｐｏｓｕｒｅｒｅｇ　ｉｍｅｎ）に利用される。

１つの実施態様として２本発明は、病原性微生物の生存している無発病性誘導体を含有するを椎動物の免疫化用ワクチンについて説明し得る。この誘導体は９機能性のアデニル酸シクラーゼとＡＭＰ受容体タンパクとを実質的に産生できないが、そのときこの誘導体は前記動物の病原体である微生物か。

または前記動物のアレルゲンを産生ずる微生物由来の組換え遺伝子を発現し得る。

さらにもう１つの実施態様においては９本発明の無発病性微生物は１種々の宿主タンパクの合成のためのベクターとして使用され得る。本発明の無発病性微生物は、宿主に導入された後、この微生物は、　ＧＡＬＴ、腸間膜リンパ節、および膵臓を包含する様々な免疫適格（担当）構造をトラバース（ｔｒａｖｅｒｓｅ）することができるので、このような微生物は種々の免疫調節産物を標的とするために使用しうる。従って、免疫調節タンパクあるいはペプチドをコードする１種またはそれ以上の遺伝子が９組換えによって無発病性微生物に導入され得る。そのため、無発病性微生物が適当な免疫適格組織中に存在する場合、この微生物は宿主における免疫反応を抑制、増大あるいは改変させる組換え産物を発現し得る。免疫調節分子の例には次のものがあげられるが、これらには限定されない：コロニー刺激因子（マクロファージ、ｍ粒球、あるいはこれらの混合物）、マクロファージ・ケモトキシン（ｃｈｅｍｏｔｏｘ　ｉｎ）　。

マクロファージ抑制因子、白血球抑制因子、リンフォトキシン、芽球化因子、インターフェロン、およびインターロイキン。

本発明のこれらの実施態様における各々の語句を以下の記述において分析する。

ワクチンとは、生存する生物の免疫系を刺激して、将来の害に対して保護がなされるようにするのに使用される試薬を意味する。免疫化とは、高いレベルでの抗体および／または細胞の免疫反応が持続することを誘発する工程を示す。この反応において、ＴＩＪンバ球は生物内において病原体を殺し得る。および／または他の細胞（例えば１食細胞）を活性化して病原体を殺し得る。この免疫化は、生物が以前にさらされたことのある病原体あるいは抗原に対して行われる。［免疫系（ｉｏ＋ｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ）　Ｊという語句は、異物の存在に対する単細胞生物の反応１例えば、インターフェロン産生も包括しうるが１本発明においては、この語句は、多細胞生物が、生物の細胞あるいは生物の細胞外液に侵入する抗原性物質に対して、抗体を産生ずる解剖学的特徴および機構に限定される。

そのようにして産生される抗体は、免疫グロブリンＡ、　Ｄ。

Ｅ、　Ｇ、またはＭのような免疫学的クラスのいずれかに属し得る。特に興味深いのは、免疫グロブリンＡ　（ＩｇＡ）の産生を刺激するワクチンである。この理由は、　ＩｇＡが温血動物の分泌系によって産生される主要な免疫グロブリンであるからである。しかし９本発明のワクチンは、　ｒｇＡの産生を刺激するものに限定されるわけではない。例えば、ここで述べる天然のワクチンは、　ｒｇＡ形成に加えて広範囲の他の免疫反応９例えば細胞性免疫および体液性免疫を生じさせると考えられる。

抗原に対する免疫反応は充分に検討され、広範に報告されている。免疫学の概観は、　Ｂａｒｒｅｔｔ　Ｊａｍｅｓ　Ｔ、の免疫学テキストブック（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）：第４版（ＣｏＶｌＭｏｓｂｙ　Ｃｏ。

ミズーリ州、セントルイス、　１９８３年）に示されている。

を椎動物は、魚類９両生類、は上類、鳥類、および哺乳類を含むを索動物量の主要な門であるを椎動物亜門のいずれかに属する。前記のすべての類は分節骨性あるいは軟骨を柱によって特徴付けられる。すべてのを椎動物は機能性免疫系を有し、抗体を産生ずることによって抗原に反応する。従って。

すべてのを椎動物はワクチンに対して反応することができる。

ワクチンは、最も一般的にはヒトまたはイヌのような哺乳類に与えられる（狂犬病ワクチン）が、ここで述べる性質を有するワクチンであれば、魚類および鳥類のような商業的に飼育される他のクラスのを椎動物に対するワクチンも１本発明の範囲内である。

本発明の実施態様の１つとして、病原性微生物の無発病性誘導体が使用される。

この誘導体は、病原体あるいはアレルゲンに対する抗体反応を刺激するために使用される遺伝子産物のキャリアーとして、　ＧＡＬＴあるいはＢＡＬＴに向かって進む。

無発病性とは、その属または種の微生物が全く病原体として機能し得ないということを意味するのではなく、使用される特定微生物が処理される特定動物に関して無発病性であることを意味している。この微生物は９通常病原性である属、あるいはさらに種に属することもあり得るが、無発病性である菌株に属していなければならない。病原性とは、疾病をひき起こす、あるいは正常な生理的機能を損傷する能力を有することを意味する。無発病性菌株は１通常その毒性の病原性相対菌株に関連する疾病に完全に適合した症状を誘発する能力を持たない。ここで使用される微生物には、細菌、原生動物。

および単細胞真菌が含まれる。

第」の生物から第２の生物（通常は第」の生物と遺伝物質を交換しない）に遺伝物質を移入するための技術は、急速に発達している組換えＤＮＡ技術の結果として、最近広く使用されるようになってきた。　本発明において、１つの生物から第２の生物に、この第２の生物の生殖により同じ遺伝物質を含む子孫を生じるように、移入された遺伝物質は９組換え遺伝子と称される。遺伝子という語句は、ここではその最も広い意味で使用され、遺伝の生物学的単位のいずれもを表す。

その組換え遺伝子は、親子物中に存在していたような完全な遺伝子である必要はない。この遺伝子は、高分子１例えば機能性ポリペプチドを産生ずる能力、またはこの産生を調節する能力を有していた。必要なのは、その遺伝子が抗原性産物の産生における誘導装置として使用される鋳型として働く能力を有することだけである。この抗原性産物は、親子物中に正確な形状では見出されなかったものであってもよい。例えば、１００のアミノ酸残基を含有するポリペプチド抗原をコードする機能性遺伝子は、キャリアー微生物中に部分的に移入され得る。このため、宿主細胞の細胞機構によって、７５あるいは１０のアミノ酸残基しか含有しないペプチドが産生される。

しかしながら、この遺伝子産物が親子物中に存在する類似の抗原に対して抗体形成を引きふこさせる抗原である場合には。

その遺伝子は本発明において定義される遺伝子という語句の範囲内であるとみなされる。その代わりに、特定抗原あるいはその断片のアミノ酸配列が周知であれば、自動遺伝子シンセサイザーなどを用いて、　ＤＮＡ断片あるいはその類似体を化学的に合成し得、そしてこのＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに導入することが可能である。スペクトルのもう一方の端にはいくつかの遺伝子産物をコードするＤＮＡの長い区間があって、その遺伝子産物の１つまたは全部は、抗原性であり得る。

従って、ここで定義し、請求の範囲に記載された遺伝子は。

抗原を産生ずることのできるいずれかの遺伝子単位である。

この遺伝子は、染色体、プラスミド、あるいはウィルス由来のものであってもよい。

遺伝子が免疫反応を誘発する上で有効であるためには。

その遺伝子は発現されなければなない。遺伝子の発現とは。

その遺伝子の構造（ＤＮＡ塩基の配列）に固有の情報が、遺伝子の位置する細胞の生化学機構によってＲＮＡ分子、ポリペプチド、あるいは他の生物学的分子の形状で物理的産物中に形質転換されることを意味する。このようにして産生された生物学的分子を遺伝子産物と称する。ここで使用する時の遺伝子産物という語句は、遺伝子の制御下で生じる生化学反応の結果として産生される生物学的産物のいずれもを示す。遺伝子産物は１例えばＲＮＡ分子、ペプチド、あるいは、酵素または遺伝子の初期産物である他の分子の制御下で産生される産物、すなわち代謝産物であってもよい。例えば、遺伝子は最初にリポソームの作用によって酵素内に翻訳されるＲＮＡ分子の合成を制御し得る。この酵素は、遺伝子が見出された最初の細胞の外部環境においてグリカンの形成を制御する。このＲＮＡ分子、酵素、およびグリカンは、すべて遺伝子産物であり、この語句はここで使用される。これらのいずれか、なら。

びに糖タンパクおよび多糖類のような多くの他のタイプの遺伝子産物は、動物の免疫系に導入されると抗原として作用する。糖タンパクおよびリポタンパクを含有するタンパク遺伝子産物は、ワクチン中で抗原として使用するのに好ましい遺伝子産物である。

ワクチンが抗体を産生ずる上で有効であるためには、ワクチン接種された動物の抗体産生機構が作用し始め得るように。

抗原性物質が放出されなければならない。従って、遺伝子産物の微生物キャリアーが動物内に導入されなければならない。

前述したようにＧＡＬＴおよびＢＡＬＴ細胞の好ましい反応を刺激するためには、腸または気管支内に微生物あるいは遺伝子産物を直接導入することが好ましい。例えば、経口投与、胃内挿管あるいはエアロゾルの形状によって導入される。

静脈、筋肉内、皮下注射、あるいは乳房内、陰茎内または膣投与のような、他のワクチン投与の方法も可能である。

無発病性微生物をキャリアー微生物として使用し、一旦そのキャリアー微生物が動物中に存在する場合、その抗原が動物の免疫系にとって有効なものとなる必要がある。これは。

キャリアー微生物が死亡する場合に達成され得、このため抗原分子が放出される。もちろん、溶解しない周縁細胞質の内容物を放出する［漏出］無発病性菌株体の使用も可能である。

その代わり、細胞の死滅前にキャリアー細胞によって外部環境に有効な抗原の産生を制御する遺伝子が選択され得る。

ａｓｄ変異とＡｓｄ＋クローニングベクターの偶発的喪失による無発病性菌株を使用すると、各世代（実施例参照）の間に約１％の細菌の溶解によって細胞内容物が放出される。このため、コロニー形成および病原性抗原を含む、放出された細胞内容物に対しての免疫反応が刺激される。

他の病原体からＧＡＬＴあるいはＢＡＬＴに抗原を送達するために病原体を使用することは、もしかかる病原体が、バイエル板あるいはＢＡＬＴに侵入する能力を保持しながら無発病性になり得るという事実がなければ、不適切であろう。

組換え遺伝子が誘導される生物は、ワクチン接種された動物の何らかの病原体、あるいは動物のアレルゲンまたは他の抗原を産生ずる微生物であってもよい。アレルゲンは、この場合にはアレルゲンに対するワクチン接種が行われる動物においてアレルギー反応を生じさせる物質である。動物のふけや花粉のように、多くの異なる物質はアレルゲンであり得る。

そして９個々の動物のアレルギー反応は特定アレルゲンのいずれもに対して異なる。通常アレルギー反応を示す動物において、アレルゲンに対する耐性を誘発することは可能である。

耐性を誘発する方法は周知であり、この方法は一般にはアレルゲンを漸次増量しながら動物に投与することを包含する。

耐性誘発についてのさらに詳細な解説は、前記に引用したパレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）のテキストブックに示されている。最後に。

免疫調節遺伝子がベクターによって発現される場合には、宿主生物自体が遺伝子物質源としての役割を果たし得る。

上記に開示したタイプの生ワクチンの動物への投与は、公知の方法あるいは標準的方法のいずれかで実施することができる。それらの方法は、経口摂取、胃内挿管、あるいは気管支鼻内噴霧を包含する。これらの方法はすべて、生ワクチンを容易にＧＡＬＴあるいはＨＡＬＴ細胞に到達させて、抗体形成を誘発することができる。これらの方法は、好ましい投与方法である。静脈注射のように、キャリアー微生物を動物の血流に到達させることのできる他の投与方法も許容されうる。静脈。

筋肉あるいは乳房内注射も、後述するように９本発明の他の実施態様に関して許容される。

好ましい投与方法は経口摂取、エアロゾル噴霧および胃内挿管であるので、好ましいキャリアー微生物は、ワクチン接種されている動物の腸あるいは気管支のリンパ上皮構造（１ｙａ＋ｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）のいずれかに好んで向かっていく種に属するものである。これらの菌株は、腸病原性菌株の遺伝子操作によって産生される。腸病原性菌株の無発病性誘導体であることが好ましい。バイエル板に向かって進み。

このためＩｇＡの産生を直接刺激する菌株が最も好ましい。動物においては、これらの菌株には、バイエル板に向かって進むサルモネラの特定菌株およびサルモネラ−イー・コリのハイブリッドが包含される。

組換えＤＮＡ技術は、現在、ルーチンワークであると考えられるほど十分に周知なものであり、広く行きわたっている。

非常に一般的かつ広い意味で、この方法は、１つの生物の遺伝的物質あるいはより多くの場合遺伝的物質の一部が、第２の生物に移入されることからなり、そして移入された遺伝的物質は、移入される生物の遺伝的物質の不変部分となる（組換わる）。この方法は通常、最初に、プラスミドまたは親染色体のいずれかから、親生物からのＤＮＡ小片を得ることからなる。プラスミド（染色体外因子とも呼ばれる）は、細胞の染色体から物理的に離れている遺伝性単位であるｃＩＩＮＡはどんな大きさでもよく、これはしばしば特定の塩基対部位でＤＮＡ分子を分割するのに作用する制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用によって得られる。プラスミド、ファージあるいはコスミドベクターに連結して組換え分子を形成した後、形質転換（カルシウムイオンのような種々の化学的試薬の存在によって人工的に誘発することができる。外部環境からのむき出しのＤＮＡの取込み）のような様々な手段によって、その組換え分子が宿主細胞内に移入され得る。形質導入のようなその他の方法も適している。この場合９組換えＤＮＡは、形質導入ファージあるいはコスミドベクターのようなファージ内にパッケージされている。一旦組換え［ｌＮＡがキャリアー細胞内に入ると、このＤＮＡは分離された小片として存在し続は得る（一般に、完全伝達されたプラスミドがこれにあたる）か、あるいはこのＤＮＡが宿主細胞の染色体内に挿入されて、細胞分裂中に染色体によって再生産され得る。

無発病性微生物の誘導体は本発明の範囲内であると考えられる。誘導体とは、無発病性菌株の変異体の有性または無性的に誘導される子孫、ならびに、単数または複数の塩基の置換、欠失、挿入あるいは逆転を含む変異体を意味し、これらは、自然界に存在する病原性プラスミドを有するかもしくは有しておらず９機能性アデニル酸シクラーゼおよびＡＭＰ受容タンパクを産生ずる能力を欠除したままである。例えば、　Ｃｈｉ４０６２およびＣｈｉ４０６４のような菌株は、ここでは都合のよいマーカーとして使用されるナリジクス酸耐性を付与するｇｙｒＡ変異を有している。しかしながら、薬剤耐性はワクチンとして使用子を菌株に形質導入することによって、容易に除去することができる（実施例を参照されたい）。

その必要用量は遺伝子産物の抗原性によって変化し、既存のワクチンの代表的な免疫反応を誘発するのに十分な量であればよい。ルーチンの実験により必要量を容易に確立することができる。典型的なワクチンの初期用量は０−００１〜ｏ、１Ｗ１１抗原／　ｋｇ体重であり、必要に応じて量を増加するか投与回数を増やして所望する保護レベルを提供することができよう。

ワクチンが懸濁あるいは溶解している薬理学的キャリアーは、接種される動物に対して毒性がなく、キャリアー生物あるいは抗原性遺伝子産物と適合性である。

いかなる溶媒あるいは固体、あるいは物質中に被包されたものであり得る。適当な薬理学的キャリアーには９通常生理食塩溶液および生理的濃度またはそれに近い他の非毒性食塩溶液のような液体キャリアー、ならびにタルクあるいはショ糖のようなヒトには使用されず、家畜の飼料にも使用されない固体キャリアーが含まれる。必要に応じて、抗原性を高めるためにアジュバントを添加し得る。ワクチンが気管支投与に使用される場合。

このワクチンはエアロゾルの形状であることが好ましい。

病原体から誘導した遺伝子産物による免疫化も、病原体からの組換え遺伝子によって特定される遺伝子産物を発現するためのキャリアーとして作用する。病原性微生物の無発病性誘導体による事前免疫化と組み合わせて使用することができる。そのような非経口的免疫化により、一旦その病原体誘導の遺伝子産物に対する分泌免疫系が、病原体誘導の遺伝子産物を発現するキャリアー微生物での免疫化により初回免疫されると、その分泌免疫反応の発現を高めるための追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）として作用し、　ＧＡＬＴあるいはＢＡＬＴのリンパ系細胞を刺激することができる。発現を高められた反応は、二次反応。

追加免疫反応、あるいは既往反応として知られ、宿主の長期的な免疫保護をもたらす。追加免疫の免疫化は、有用な結果を得るために何度も繰り返され得る。

上記の開示は本発明を一般的に述べている。より完全な理解が以下の特定の実施例を参照することにより、得られるであろう。これらの実施例は例証のみを目的として９ここに示されるものであり、特に記載がない限り限定するつもりはない。

本発明の実施に有用な菌株の寄託以下の菌株の生物学的に純粋な培養物を、アメリカン・タイプ−カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１メリーランド州ロツクビル、パークローンドライブ）に寄託した。生存確認試験の後、示された受託番号が割り当てられ、必要な費用が支払われた。この培養物については、特許出願係属中において、米国特許法施行規則第１．１４条および米国特許法第１２２条の規定によりその権限を有する局長の決定した者が入手し得る。この培養物が一般に入手し得るということについてのすべての制限は９本願に基づく特許の認可時において、取消し不能なものとして取り除かれる。さらに、指示された寄託物は、寄託の日から３０年間。

もしくは寄託物に関する最新の請求から５年間または米国特許の有効期間のいずれか長い方の期間の間、保存される。万一培養物が生育不能となるか、あるいは偶発的に破壊された場合、あるいはプラスミド含有菌株の場合にそのプラスミドが喪失した場合には９同じ分類上の種類の生存している培養物と交換される。

菌株　寄託臼　ＡＴＣＣ番号ｐＹＡ２３２を含むＣｈｉ６０９７　１９８７年１０月６日　６７、５３７Ｃｈ　１２９７８　１９８７年１０月６日　５３．６７９Ｃｈ　１３５２０　１９８７年１０月６日　５３．６８１ｐＹＡ２４８を含むＣｈｉ４０７２　１９８７年１０月６日　６７、５３８Ｃｈ　１３００８　１９８７年ＩＯ月６日　５３．６８０Ｃｈ　１２１０８　１９８７年１０月６日　５３．６７８ｐＹＡ２９２を含むＣｈｉ６０９７　１９８８年９月２６日　６７．８１３以下に述べるのは９本発明の実施例であり、それらは例証目的のためにのみ示すものであって９本発明の範囲を限定するものではない。本開示の見地から、特許請求の範囲内での多くの実施態様が当業者にとって明白であろう。

（以下余白）実施例ＤＡＰの存在下でホモセリンまたはトレオニン、およびメチオニンの栄養素要求性である変異体を単離する。（生合成経路を第１図に示す。β−アスパラギン酸セミアルデヒドをホモセリンに転換する能力を持つ２つの異なるホモセリンデヒドロゲナーゼを特定する２つの遺伝子がある。二重の変異は遺伝子における特異的欠失を生じさせる単一の変異のために。

常にＤＡＰも要求する。ホモセリン要求変異体を選択する工程は、変異誘発におけるＤＡＰの存在下および選択培地では、ホモセリンおよびその産物であるメチオニンとトレオニンの除去を可能にし、変異体におけるタンパク合成の停止を引き起こして、この変異体を細胞壁合成を阻害する抗生物質に対して非感受性にするという発見に基づいている。これに対して。

野生型細胞はタンパク合成を続けるので、これらの抗生物質に対して感受性である。

原栄養菌株であるイー・コＵＫ−１２株、　Ｃｈｉ２８９．および野生型厚栄養菌株であるニス・ティフィムリウム株、　Ｃｈｉ３０００のブロス増殖培養物を、エネルギー源として０．５％グルコースを補充した無機塩類培地を含む別々のフラスコ内に接種する。

ミラ（Ｍ　ｉ　ｌ　ｆＣｒ）　（１９７２）がその処方を述べている最小培地のいずれかで十分である。通気しながら培養物を約５Ｘ１０’細胞／ｍｌの密度に増殖させる。

ａｓｄ−変異体の頻度を高めるために培養物を変異誘発する。

変異誘発は、亜硝酸を用いるような化学的方法か、あるいは紫外線照射によって行う。どちらのタイプの手法もミラ（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９７２）によって述べられている。あるいは、トランスポゾン誘発性の変異誘発を使用してもよい。変異誘発のためのトランスポゾン手法はクレックナーら（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）（１９７７）が検討している３、変異誘発が完了した時、培地に１． −ホモセリン６０μｇ／ｍＨｉよびメソ−ＤＡｆ’　５０μｇ／ｍ　Ｉを補充する。培養中の細胞を通気下で約１０世代増殖させ、全ての変異細胞が変異遺伝子型に関して同質になり、変異体の表現型を十分に発現するようになる。各々の変異誘発された細胞から合計１．０×１０８細胞を、あらかじめ湿らせた滅菌ミリポアフィルタ−（孔径０．４５ミクｏン）上での濾過によって採集する。濾過の間、フィルターを乾燥させないようにする。その後ＤＡＰを含むあらかじめ加湿した。ゼラチンを含有する緩衝食塩水（ＢＳＧ）で数回洗浄する。

フィルターを取り、各々をメソ−［ＩＡＰ　５０μｇ／−と０．５％グルコースを補充した合成無機塩類培地２０ｍ　Ｉ中に置く。２５０　ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れたこの培養物を回転振盪によって通気しながら３７℃でインキュベートする。培養物を。

ａｓｄ−変異体がホモセリン及びその誘導体アミノ酸であるトレオニンとメチオニンの内部供給を枯渇させるのに十分な時間。

すなわち約１時間増殖させる。この１時間の増殖の間に、培養物は約５Ｘ１０’ 細胞／ｒｒｌＮから約ｌＸｌ０’細胞／ｒｒＬ１に変化する。野生型細胞が選択工程中に溶解してトレオニンとメチオニンを放出し、それらが変異ａｓｄ−細胞におけるタンパク合成の基質として作用し得るので、細胞をより高い密度まで増殖させてはならない。しかしながら、１０７細胞から放出されるアミノ酸の濃度は、これらの変異体を増殖させるには不十分である。

変異体に関しての選択はローサイクロセリンとアンピシリンの存在下で行う。ｐＨ８，０のリン酸緩衝液中で５０■／Ｔｎｌに調製シタトサイクロセリン（カーテイスら（Ｃｕｒｔｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ）、　１９６５）および無菌水中で５０ ■／ｒＩ１１に調製し７た°γアンピシリン培養物２０献に加え、ローサイクロセリンとアンピシリンの最終濃度を各々１００μｇ　／ｄと５０μｇ／ｄにする。培養物を通気下３７℃で約３時間増殖させる。この時間中、Ｄ−サイクロセリンとアンピシリンは、増殖細胞においては細胞壁合成を阻害し、非増殖細胞においては阻害しないように相乗的に働く。次に生存細胞をあらかじめ湿らせた滅菌ミリポアフィルタ−（孔径０．４５ミクロン）上に採集し、ＤＡＰを含むあらかじめ加湿したＢＳＧによって、抗生物質を含まないように洗浄する。フィルターを、ホモセリン、　ＤＡＰおよびグルコースを補充した無機塩類培地２０コを含むフラスコに移し９回転振盪装置中３７℃で一晩増殖させる。アンピシリン−サイクロセリン集積工程は反復することができる。両方の一連の選択工程後、細菌懸濁液の適当な希釈溶液を、炭素源としてグルコースを含み、ホモセリンとＤＡＰを補充した無機塩類培地上、もしくはＤＡＰ　５０μｇｌｕｔを補充した。Ｌ寒天またはペナ七イ（Ｐｅｎｎａｓｓａｙ）寒天の複合寒天培地上のいずれかにブレーティングする。プレートあたり１００〜２００コロニーを生じるように培養物の希釈溶液を選択する。コロニーが直径２〜３睡になるまでプレートをインキュベートする。通常は一晩インキユベートすれば十分である。そして次に、その上ではａｓｄ−変異体が生育しない。

ＤＡＰを欠いた寒天培地でレプリカブレーティングする。マスタープレートでは生育するがレプリカプレートでは生育しないコロニーを採取して精製し、　ＤＡＰを含む培地に接種して約１０”細胞／−まで増殖させる。推定上の変異体を、　ＤＡＰとホモセリン、あるいはＤＡＰとメチオニンとトレニオンについての栄養素要求性に関して試験する。さらに、Ｌ−ＩＪレシンよって供給することのできないＤＡＰの絶対要求に関して変異体を異株Ｃｈｉ３００８を単離する。上記の工程によって誘発され９分離された変異体は９点変異あるいは欠失変異のいずれかを含一方点変異は可逆性である。実施例１の工程によって単離した変異体の遺伝的安定性を次のように評価する。

変異細胞を２０献の培養物中で増殖させ、約２Ｘ１０’細胞／献の密度にする。

培養物を遠心分離によって約５０倍に濃縮し。

希釈しないものと、　１０−’、　１０〜’、　１０−’の希釈溶液の各々１００μｌを寒天上に、すなわちグルコースを含み、　ＤＡＰを欠くペナセイまたはＬ寒天あるいは無機塩類寒天上にブレーティングする。１組のプレートを３７℃ で２日間インキュベートし。

変異体の自然復帰を測定する。他の１組のプレートに約１．５ジユール／Ｉ１２の紫外線を照射し１次に暗所で２日間インキュベートして、紫外線誘発の復帰を測定する：暗所でのインキュベーションは紫外線誘発変異の光回復を防止する。

復帰は。

口ＡＰについて、およびホモセリンまたはトレオニンとメチオニンについての栄養素要求性の喪失によって測定する。

が本質的に非可逆性であることが測定された；従ってこの菌株は欠失変異を含む。これに対して、ニス・ティフィムリウいファージ遺伝子が欠失したバクチオリファ・−ジトランスポゾンを挿入ｊ−たベクターにおいてしか適応できない。その１つの例が、タレックナーら（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ）（１９７７）が構築したバクテリオファージ２１口１０トランスポゾンベクター、　ＮＫ５６１である。ニス−ティフィムリウムは天然には、λバクテリオファージに耐性である。しかしながら、ニス・ティフィムリウムは、λ付着のための外膜タンパクレセプターをコー含によって、感受性を与えられることができる。そこで、工のトランスポゾンライブラリーは１次の工程を用いて、　ＤＢ４６７３あるいはＣｈ　ｊ３４７７のいずれかをλ−ＮＫ５６１で感染させることによって調製することができる（両菌株の説明および由来については表１を参照のこと）。

菌株を一晩培養したものを、λブロスあるいはグルコースを欠くが、０．２％マルトースを含むｌ、−ブロス中で増殖させ。

ｌａｍＨの発現を誘発する。培養物が約３Ｘ１０”細胞／ｍ／となった時、λ− ＮＫ５６１を１．ＯＸＩＯ’　７ｙ−ジンーノ濃度で、すなわち細菌あたり約３フアージの感染多重度で添加する。λファージはニス・ティフィムリウムにおいては複製せず、従って、λ感染は感染したニス・ティフィムリウム細胞を死亡させないので、イー・コリにおけるよりも高い感染多重度が使つムゲノムの種々の部位に転移するのに十分な時間、一般に６０〜９０分間、３７℃でインキュベータした後、希釈していないものと１０倍に希釈した懸濁液の一部を、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｄを含むし寒天あるいはペナセイ寒天上に直接ブレーティングする。プレートを３７℃で一晩インキユベートシ、約１０プレートの各々に、ブロス１〜２ｍｌを添加する。滅菌ガラススプレッダ−を用いてコロニーを再懸濁させる。懸濁液中の細胞を遠心分離によって採集し、洗浄して、１％ペプトン＋５％グリセロール中に再懸濁させる。ライブラリーを一７０℃で保存する。

（以下余白）４、　ＴｎｌＯ）ランスポゾンライブラリーのファージＰ２２溶解産物ニス、ティフィムリウムにおいてトランスポゾンを移動するには、一般に普遍形質導入型のサルモネラ属ファージ、Ｐ２２を使用することが必要である。実施例３で述べたように、　ＤＢライブラリーに関して、高頻度の形質導入ファージ、　Ｐ２２ＨＴｉｎｔの溶解産物を以下のように調製する。

ＤＢ４６７３およびＣｈｉ３４７７におけるトランスポゾンライブラリーを一晩培養したものをルリアブロス中で増殖させる。各培養物をルリアブロス中で１００倍に希釈し１通気下３７℃で２〜３時間増殖させて、約３Ｘ１０’細胞／ｍ１の指数増殖培養物を得る。Ｐ２２）ＩＴ　ｉｎｔを３フアージ／細胞の感染多重度で添加し。

混合物を通気下９回転振盪により３７℃で９０分間インキュベートする。そのあと、細胞懸濁液に少量のクロロホルムを添加して、残りの生きている細胞の溶解および／あるいは死亡を促進する。さらに１０分間９通気下３７℃でインキュベートした後、溶解産物をツルポール低温遠心分離機において７．　ＯＯＯＲＰＭで１０分間遠心分離し、溶解していない細菌と細菌デブリを除去する。上清を静かに傾瀉し、数滴のクロロホルムを存在下。

４℃で保存する。

の調製に有用であり、以下のようにして調製され、単離され得る。δ−ａｓｄ変異体の生成についてのフローチャートを第２図に示す。図中、変異体の生成に使用され得る菌株を括弧内に示している。

ａｓｄＡ１５点変異を含むニス、ティフィムリウム株、　Ｃｈｉ３００８を、　ＤＡＰ　５０μｇ／μｌを含有するルリアブロス中、３７℃で一晩インキユベートする。−晩培養したものを新鮮培地中で１００倍に希釈し、３Ｘ１０”細胞／艷の力価に達するまで（一般に２〜３時間）インキュベートする。実施例４で述べたように。

力価）で添加する。これを２０分間インキュベートしてファージを付着、注入させた後、希釈していない細胞懸濁液、１０倍希釈および１００倍希釈の細胞懸濁液の１００μｌを、　ＤＡＰを欠き、テトラサイクリン１２．５μｇ／μｌを含むペナセイまたはＬ寒天上のいずれかにブレーティングする。プレートを３７℃ で一晩インキユベートする。

非常にまれにＴｃ’Ａｓｄ＋形質導入体が認められる。これらの形質導入体は、２つの独立した事象のいずれかから生じる。

すなわち、　Ａｓｄ−のＡｓｄ＋への形質導入と別の染色体部位におけるＴｎ　ＬＯの形質導入、あるいは、　ＴｎｌＯがａｓｄ＋遺伝子に隣接して形質導入される単一事象である。単一事象は二つの事象よりもはるかに頻繁に起こる；従って、大多数のＴｃ’Ａｓｄ＋形質導人体はａｓｄ遺伝子に近接したＴｎｌＯを持つことになる。いくつかのＴｃ’Ａｓｄ”コロニーを採取し、コロニーを精製して培養物を調製する。

実施例４中の培養物をＴｃ’Ａｓｄ”培養物に置き換えたこと以外は、実施例４で述べた方法を使用して、Ｐ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物を各々Ｔｃ’Ａｓｄ＋形質導入体上に増殖させる。次に各溶解産物を使用して、　ＯＡＰ　５０μｇ／ｍｌを補足したルリアブロス中で増殖するＣｈｉ　３００８の培養物に形質導入する。形質導入した菌株を、　［ｌＡＰを欠くか、あるいはＤＡＰとテトラサイクリン１２．５μｇ／−を含む、いずれかのベナセイ寒天上にブレーティングする。

前者の場合には、　Ａｓｄ＋形質導入体が選択される；後者の場合には、　ＴｎｌＯを受け継ぐ７Ｃｒ形質導入体について選択が行なわれる。各々の選択から約５０の形質導入体を採取し。

その他の形質の同時導入に関して評価する。ＴｎｌＯとａｓｄ“が連結していれば、高頻度のＡｓｄ＋形質導入体はテトラサイクリン耐性であるはずであり、逆もまた同様である。同時形質導入の頻度はＴｎｌＯとａｓｄ＋遺伝子との距離を評価するために使用できる。

この工程を使用してＣｈｉ３０１３を弔離した（第２図）。Ｃｈｉ３０Ｌ３はＣｈｉ３００８のＴｃ’Ａｓｄ＋形質導入体である（表１参照）。

細胞へのＴｎｌＯの挿入は、フザリン酸感受性ならびにテトラＴｃ’Ａｓｄ＋形質導入体であるＣｈｉ３０１３　（第２図参照）を−晩培養したものを調製し、８〜１０ｄ中の細胞を、　？、ＯＯＯＲＰＭで１０分間遠心分離してペレット化し、Ｌ−ブロス２００μ！中に懸濁する。種々の希釈溶液を、　ＤＡＰ　５０μ ｇ／ｍｅ、　フザリン酸６μｇ／ｒａｌ、および加圧滅菌したクロロテトラサイクリン１２μｇ　／　ｄを含む栄養寒天培地中にブレーティングする。３７℃で一晩インキユベートした後、単離したコロニーを採取し、　ＤＡＰおよびフザリン酸を含む培地上で精製する。精製した菌株から小さな培養物を調製し、各々を、　ＩＩＡＰ不在下での増殖不能性に関して、およびテトラサイクリンに対する感受性に関して試験する。

ＴｎｌＯのすべての痕跡が喪失していること、およびＤＡＰ要求が非可逆性欠失変異によるものであることは、　Ｔｃ５Ａｓｄ−変異体がＴｃ’あるいはＡｓｄ＋のいずれかに復帰することができるかどうかを検査することによって確認される。これは次のようにして達成され得る。

Ｉ）ＡＰを含むし一ブロス中の培養物の１０〜２０ｍ１を通気下で高密度に増殖させ、遠心分離によって細胞を５０倍に濃縮し、適当な希釈溶液を、　ＤＡＰを欠くベナセイ寒天、あるいはＤＡＰとテトラサイクリン１２．５μｇ　／ｗｄ！を含むペナセイ寒天培地の何れかにブレーティングする。プレートを３７℃で１〜２日間インキュベートする。Ｔｃ’あるいはＡｓｄ　”コロニーが不在であれば、その菌株にＴｎ　１０およびａｓｄ遺伝子配列の欠失があることの推定証拠である。これらの必要条件を満たす代表的菌株はＣｈｉ　３０２１である（第２図および表１参照）。

とによって、欠失を他の菌株内に移動させることができる。

Ｔｃ’　Ａｓｄ＋形質導入体の選択の前にＣｂ　１３０２１を受容体として使用すること以外は、その菌株を実施例５に述べたようにびＣｈｉ３５３６　（表１）をこの方法によって構築した。

Ｔｎ　１０がδ−ａｓｄＡ１変異に結合していることを確認した時点で、テトラサイクリン耐性であるが、　ＤＡＰ要求性を維持している形質導入体を回収することができる。１つの例が菌株ｃｈｉ３５２０　（表１）であり、これはδ−ａｓｄＡ１変異を有する。

Ｃｈ　１３５２０　（表１）において増殖させたＰ２２をＣＩ＋１４０６４　（表１）に形質導入した後、　ＤＡＰ存在下でのテトラサイクリン耐性に関して選択し、菌株［ｈｉ４０７０（表１）を生成した（第２図参照）。

１４０７２である。

その代わりに、　Ｃｈｉ３０００（表１）のようなＴｃ’原栄養株において増殖させたファージＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて形質導入し０次いでフザリン酸耐性に関して選択することにより、トランスポゾンの喪失をひき起こすことができる。

上に述べた工程は反復することができ、　Ｃｈｉ３５３６およびｃｈｉ３５３７中に存在するＴｎｌＯ遺伝子欠失に関連したａｓｄ遺伝子の新しい欠失が単離できる。このようにして単離した。フザリン酸耐性のＴｃ’δ−ａｓｄ変異体株がＣｈｉ３６２８とＣｈｉ３６４７である。

これらの菌株の単離および特性付けの工程は、ニス・ティフィムリウムのＡｓｄ −変異体の生成について述べた工程と同様である。ただし、サプレッサー遺伝子を持たない原栄養株Ｃｈｉ２８４２を感染させるのにλ−ＮＫ５６１　トランスポゾンベクタ遺伝子におけるアンバー突然変異のため、　Ｃｈｉ２８４２中で複製することができない。従って、　Ｔｃ’生存生存度生ずることのできる唯一の方法は９　λ−ＮＫ５６１ゲノムからイー・コリに−１２を増殖させ４次にこのファージを使用してＣｈｉ２６３７（表１）のようなイー・コリ菌株に形質導入する。７　ｃ　ｒおよびＡｓｄ’である形質導入体を選択する；このタイプの形質導入体の例がＣｈ　１２９７８　（表１）である。

接挿入して、菌株Ｃｈｉ２９７９（表１）を得た。

Ｃｈ　１２９８１　（表１）由来のｚｈｆ−２：　：Ｔｎｌｏｌこ連結したδ− ａｓｄＡ４変異を、　ＰＩＬ４形質導入によってＪＭ８３　（表１）のようｆｌ他の菌株に移し、　Ｃｈｉ６０９６　（表１）を産生ずること力（できる。そのあと、フザリン酸選択によりＴｎｌＯを除外し、新しく／）δ−とり一株を得る。この工程を用いて、　Ｃｈｉ６０９７（表１）を単離した。

１：　ヨッ’Ｔ：　（Ｃｈ　＋３０２１　（表１）におし）でδ−ａｓｄＡ１変異を精製するのに使用したように）、あるし）番マδ−ａｓｄＡ１のような特異０７０を構築するのに使用したよう１こ９表１参照）　、　ａｓｄ欠失を産生することに加えて、δ−ａｓｄ−変異を導入するための第三の方法も可能である。

第２図のボツクス参照。この方法耐性である形質導入体を選択する。このステップで使用するコピーがある。フザリン酸耐性の完全な形質発現の前に、Ｔｎｌｏのすべてのコピーの喪失が必要である。従って、形質導入された受容菌を、ＤＡＰ、フザリン酸、および加圧滅菌したクロロテトラサイクリンを含有する選択寒天培地にブレーティングする前に、数世代増殖させなければならない。しかし。

充分に特性付けられた欠失変異に置き換えることができる。

るのに対し、　ｉｏ−’から１０−５の頻度で発生することを強調しておかねばならない。従って形質導入後、自然的に発生する新しいδ−ａｓｄＡ変異を生じるよりも、特定のδ−ａｓｄＡ変異を挿入する確率の方が１．０００〜１０．０００倍高い。

イムリウムのＤＡＰ要求Ａｓｄ−変異体は、ニス、ミュータンス由来のａｓｄ” 遺伝子を含むプラスミドで形質転換することにより、Ａｓｄ＋表現型に転換することができる。この遺伝子をち、非相同ポリペプチドをコードする所望の遺伝子を挿入することのできるクローニングベクターは、以下のようにして合成される（第３図および第４図参照）。

特に指示がない限り、以下の構築においては組換えＤＮＡ技術についての標準的手法１例えばマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。

フリッチ（Ｆｒ　１ｔｓｃｈ）とサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　（１９８２）およびｒ　ＤＮＡクローニゲＪ　（１９８２）で述べられているような標準的手法を使用する。本文中で使用するプラスミドの一部の由来。

特性、および遺伝子型を表２に示す。制限酵素についての略語、およびＢｇｌｌＩおよびＢｃｏＲＩについてのＤＮＡリンカ−を表３に示す。

（以下余白）表３ＢｇｌｌＩＢｇＡｖａｌ　Ａｖ旧ｎｃｌｌ　ＨｃＳｍａＩ　ＳｍＥｃｏＲＩ　ＥＢａｍ旧　ＢｃｏＩＨａｅｌＩ　ＨａＨｉｎｄｌｌｌｌｌｓｐｌ用いたＤＮＡ　リンカ− ８ｇｌ１１リンカ−ｄ　（ＩＩＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ）ＥｃｏＲｔリンカ− ｄ　（ｐＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）Ｓｓｔ　Ｉ　リンカ−ｄ（ｐｃＧＡＧｃＴｃＧ）遺伝子を含み、そのＥｃｏＲ１部位は天然遺伝子から除去されている。

ｐＹＡ６３１由来のＢｇｌｌｌからＡｖａｌまでの断片（カルディノーとカーティス（Ｃａｒｄｉｎｅａｕ　ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓｓ）　（１９８７））は、ａｓｄ＋遣遺伝子を含んでおり、この断片は［ｌＮＡポリメラーゼＩのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて充填（ｆｉｌｌ）され、　ｐＵｃｌｇの旧ｎｃ■部位にクローン化された。この断片はＴｃ’遺伝子も含む。

生じる結果的に得られるプラスミドはｐＹＡ２２０である。逆方向のａｓｄ遺伝子による構築は不安定である。

Ｔｃ’遺伝子の大部分、ならびに制限酵素についての多くの開裂部位を次のようにしてｐＹＡ２２０から欠失させた。プラスミドを５ｏｄａ　Ｉで消化し９次にＢａ１３１で消化して、フレノウ断片で処理して突出部を充填し、連結した。得られたプラスミドはｐＹＡ２２４であった。

ＰＹＡ２２４のａｓｄ遺伝子のＥｃｏＲ１部位をＥｃｏＲＴで部分消化して取り除き４次にフレノウ断片で処理して再連結した。得られるプラスミド、　ｐＹＡ２２７は、δ−ａｓｄ変異細胞のＡｓｄ−表現型を補足しない。この処理は４個の塩基の挿入を引き起こし。

Ｔｒｐ、八ｓｎ、　Ｓｅｒ、ｌ１ｅｕをコードするＴＧＧ、　ＡＡＴ、　ＴＣＡ、　ＡＣＴ配列を、　Ｔｒｐ、　Ａｓｎおよび翻訳終止シグナルをコードするＴＧＧ、　ＡＡＴ。

ＴＡＡ、　ＴＴＣ配列に変換する。

に形質転換した。形質転換体をＤＡＰの存在下で高密度に増殖させ、ゼラチンを含む緩衝生理食塩水中で濃縮し、　ＤＡＰを欠ニーは１Ｏ−３の頻度で発生したが、これらのコロニーはＥｃｏＲ１部位も回復していた。ｉｏ−”の頻度で生じた１つのコロニーを単離した。このコロニーはＡｓｄ＋であるがＥｃｏＲ１部位を回復していなかった。このコロニーから単離したプラスミドをｐＹＡ２３３と命名した。

ｐＹＡ２３３中に残存するＥｃｏＲ１部位をＥｃｏＲＩで消化して除去し。

次にフレノウ断片で処理して再連結した。得られたプラスミド、ｐＹＡ２３５はＥｃｏＲ１部位を欠いていた。

ｐＹＡ２３５のａｓｄ遺伝子におけるＢａｍＨＩおよび／あるいはＰｓｔＩ配列も、既知の手法を使用して除去することができる。

よびｒｒｎＢ終止シグナルを含む発現ベクターｐＹＡ２３７を次のようにして構築したく第４図参照）。

ｐＫＫ２３３−２プラスミド発現ベクター（アマンとブロシウス（Ａｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｂｒｏｓｉｕｓ）　（１９８５））をＰｓｔｌで消化し、　Ｔ４　Ｉ）ＮＡポリメラーゼで処理して、連結の前に５ｓｔｌ！Ｊンカー（表３）を添加した。生じたプラスミド、　ｐＹＡ９９を単離した。

ｐＹＡ９９のＨｃｏＲ１部位をＢｇｌＩＩ部位に置換した。ｐＹＡ９９をＥｃｏＲＩで消化し、フレノウ断片で充填して、連結の前にＢｇｌ　ｍリンカ−（表３）を添加した。生じたプラスミド、　ｐＹＡ２２３を単離した。

ＥｃｏＲＩ　リンカ−、ｄ（ｐＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）　（表３）を、　（フレノウ断片で充填後）　ＮｃｏＩ部位でｐＹＡ２２３に挿入した。生じたプラスミド、　ｐＹＡ２２８を単離した。ここで、このベクターのＢｃｏＲ１部位は、δ−ｇｔｌｌにおけるＥｃｏＲ１部位と同じ読み取り枠特異性を有している。

ｐＵｃ８−２のＨａｅ　ＩＩ断片をＰＹＡ２２８のＳｓｔ　１部位（Ｔ４０ＮＡポリメラーゼで処理した）にクローニングした。プラスミド、　ｐＹＡ２■断片を除去した。生じたプラスミド、　ｐＹＡ２３０をＭ２Ｓ（表１）に形質転換した。ｐＹＡ２３０を含む細胞は、β−ガラクトシダーゼについての色素産生Ｘ− ｇａｌ基質を含む寒天培地上で淡青色であった。

ｎｄｍ断片によって置換し、　ｐＹＡ２３７を得た。

ＢｃｏＲＩおよびＢａｍ旧部位を欠くニス、ミュータンスａ、ｓｄ遺伝子を含み、　ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨおよびＰｓｔ　１部位を持たない、　ｐＹＡ２３５の誘導体由来のその他の１ｉｎｄＩＩＩ断片も、　ｐＹＡ２３０の１ａｃＺ　（ α）を置換するように挿入される。

プラスミドｐＹＡ２３７は、　Ｃｈｉ６０９７／ｐＹＡ２３２およびＣｈ　１６０６０　（表２参照）において安定に保持されるが、Ｃｈｉ６０９６およびＬｎ２Ｏ３においては不安定である。

１０、Ｃ０ｐＹＡ２４８の構築クローニングベクターｐＹＡ２４８は、　ＥｃｏＲＩ、　Ｓｍａｌ、　５ｐｈｌ、および５ａｉｌ制限酵素を用いて、クローニングしたＤＮＡ断片の挿入を可能にする。これを次のようにして構築した。

ｐ１５Ａレプリコンは、全体が１．０ｋｂ旧ｎｃＩＩ断片上に含まれている。この断片を、ＢｇｌｌＩＩＪンカーを使用して、　ＰｔｒｃＭＣＳ　ａｓｄ”だ。

得られたプラスミドは、　３．Ｏｋｂのクローニングベクター。

ｐＹＡ２４８である。このベクターの重要な特徴を第５図に示す。

より（実施例１０．Ａ参照）　、　ｐＹＡ２４８の相似クローニングベクターが構築される。これらの部位を除去することによって、これらの酵素をクローニングに使用することができる。

よび多くのクローニング部位を第６図に示す。

５ａ１１部位に挿入した。得られたプラスミドはｐＹＡ２６０である。

ｐＹＡ２６０の重要な特徴を第７図に示す。

体における。β−ガラクトシダーゼおよびＡＳＤをコードする□ Ａｓｄ−株であルＣｈｉ３１１５．　Ｃｈｉ４０７２．　およびＣｈｉ２９８４をＰＹＡ２６０あるいはｐＹＡ２４８で形質転換し、タンパク合成が可能な条件下で、　ＤＡＰを含有しない培地において増殖させる。さらに。

Ｃｈｉ２９８４をｐＹＡ２６０およびＰＹＡ２３２で同時形質転換する。ｐＹＡ２３２レッ号−を特定する。

形質転換した細胞と対照細胞によって合成された産物を。

レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　（ｒ酵素学における方法」を参照のこと）が述べているように５ｎｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。分離された産物を含むゲルの写真を第９図に示す。

ｐＹＡ２６０テ形質転換したＣｈｉ３１１５　、　Ｃｈｉ４０７２．およびＣｈｉ２９８４は、　Ａｓｄタンパクとβ−ガラクトシダーゼの両方を合成する。

しかしながら、　ｐＹＡ２６０およびｐＹＡ２３２で同時形質転換したＣｈｉ２９８４は、ｐＹＡ２３２によって特定される１ａｃｌｑリプレツサーのためβ− ガラクトシダーゼを合成しない。Ａｓｄタンパクは。

ｐＹＡ２４８またはｐＹＡ２６０のいずれかで形質転換されるすべてのδ転子の構造を第１０図に示す。

ｐＹＡ２４８のＤＮＡはＥｃｏＲＩ処理によって線形化される。ＤＮＡの両末端をフレノウ断片および細菌性アルカリボスファターゼをフレノウ断片で処理する。２つのＤＮＡをＴ、Ｕガーゼで連結してｐＹａ２６１を得る。５ｐａＡタンパクの主要抗原決定基は主としてＳｓｔ！断片上に位置するので（第１０図参照）、ｐＹＡ２６１の５ｓｔｌ断片を精製し、　ｐＹＡ２６１の残りの部分に連結して、す遺伝子の読み取り枠を保持しながら、その領域の縦列反復を作製した。５ｓｔｌ断片の３角縦列反復を含むプラスミドｐＹＡ２６２を得た。

ｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２を第１１図に示す。

Ｃｈ　１４０７２におけるｐＹＡ２６０　（白丸、黒丸）　、　ｐＹＡ２６Ｌ　（白三角。

黒三角）、およびｐＹＡ２６２　（白四角、黒四角）のインビトロでの安定性は、　１）ＡＰの存在下（黒い記号）あるいは不在下（白い記号）でＬ−ブロス中で細胞をインキュベートし、子孫世代においてＡｓｄ”　ＬａｃＺ’およびＳｐａ”である細胞の割合を測定することにより決定される。第１２図にその結果を示すように。

ｐＹＡ２６０の喪失の自然発生率は１％／細菌／世代であり、より小さなプラスミドであるｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２はより安定である。

１５、　ｐＹＡ２６１およびｐ　Ｙ　Ａ、２６２由来の５ｐａＡ抗原の発現Ｃｈｉ４０７２は、マウスに経口給餌した場合に高度に免疫原性である。ニス・ティフィムリウムの無発病性誘導体である（カーティスとケリー（Ｃｕｒｔ、ｉｓｓ　ａｎｄ　Ｋｅｌｌｙ）、（１９８７）および申出ら（１９８８）参照）。ｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２をＣｈｉ４０７２に形質転換する。５ｐａＡタンパクの産生は、　ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動プロフィールのクマシーブルー染色、ならびに抗５ｐａＡ血清を使用したウェスタンプロット分析（第１３図参照）の両方により明らかである。δ−ｃｙａδ−ｃｒｐ菌株が５ｐａＡタンパクを非常に多量に産生ずることは明白であり、これは。

イーーコＵＫ−１２の組換え菌株および他の無発病性すルモネラ属ワクチン株による５ｐａＡタンパクの産生量を上回る。

５ｐａＡタンパクはニス、ミコータンス細胞表面上の主たる表面タンパクであり、ニス、ミュータンスが歯表面の唾液タンパクに付着するのに必要である（カーティス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）、　１９８５゜〜２７７）。ニス、ミュータンスの５ｐａＡ欠失変異体は無発病性ラットにコロニー形成することができず、従ってう食（ｄｅｎｔａｌｃａｒ　１ｅｓ）を誘発することができない。それゆえ５ｐａＡ抗原のＧＡＬＴへの送達は、ニス、ミュータンスのコロニー形成を防ぐ、粘膜の免疫反応を刺激する。

最後に、　ｐＹＡ２６２を含むＣｈｉ４０７２で免疫したマウスをショ糖含有の食餌を与え９次に病原性ニス、ミュータンス菌株（ｔＩＡ８６６）で攻撃することができる。まず、　ＵＡ８６６が歯にコロニー形成する能力を調べ１次にう食を防ぐ効果を検討する。コロニー形成は攻撃後１週間または２週間評価し、一方う食防止は攻撃後６〜１２週間目に評価する。

−タが示すように、マウスの初期接種後３週間目までに得ら性の選択的圧力のない環境において組換え遺伝子を安定に保持するようになるという主張を証明している。ｐＹＡ２６２を含有するＣｈｉ４０７２でこのように免疫したマウスは、　５ｐａＡタンパクに対して、唾液中の分泌型１ｇＡおよび血清１ｇＧを発現し、そして、後足直に注入した５ｐａＡタンパクに対して遅延型過敏性（ＤＴＨ）を示す。各世代でプラスミドを喪失する。　ｐＹＡ２６１あるいはｐＹＡ２６２を含有するＣｈｉ４０７２細胞の小画分は、　ＤＡＰ欠乏のために死亡に至り、その細胞内容物を放出して動物宿主の免疫化を促進する。これは本発明の好ましい特性である。

（以下余白）表４ＸＸ−ティフィムリウム５Ｒ−１１ΔｃｙａΔｃｒｐΔａｓｄ株、χ４０７２’ における５ｐａＡタンパクを特定するｐＹＡ２６２のインビボでの安定性１７、ニス・ティフィムリウムａｓｄ　”遺伝子のクローニングおニス・ティフィムリウム５ＲＩＩ　（Ｃｈｉ３３０６）ＤＮＡのＤＮＡライブラリーを、ＤＮＡおよびクローニングベクターを消化する種々の制限酵素を用いて構築した。ニス・ティフィムリウムのａｓｄ”遺伝子を、最初にいくつかのコスミドライブラリーにおいて同定し、　Ｐｔ１Ｃ１８におけるＰｓｔ　Ｉクローニングでこれらの組換え体の１つを消化し、　Ｃｈ　１６０９７におけるＡｓｄ＋形質転換体に関して選択して、　ＰＹＡ２７２を作製した。ＢｃｏＲＩによるサブクローニングを実施してｐＹＡ２７５を作製した（第１４図）。ＴｎｌＯＯＯ変異誘発はｐＹＡ２７５内に多くの挿入部をもたらし、これらをＣｈｉ３６３０に移入させて、挿入されたａｓｄ遺伝子の不活性化に関してスクリーニングした。変異誘発およびスクリーニングは基本的にガイアー（Ｇｕｙｅｒ）　（１９８３）が述べているように実施した。これらの結果に基づき、ニス・ティフィムリウムａｓｄ十遺伝子を含む１．７５ｋｂのＥｃｏＲＩから５ｓｔｌまでの断片をｐｌＪｃ１８にサブクローニングして、　ｐＹＡ２７７を作製した（第１４図）。

ベクターの構築を容易にするために、ベクターｐＹＡ２８０　（第１５の断片をｐＹＡ２７７から取り、取り出した断片を精製し、　５ｓｔｌ部位で５゛側突出を除去し、　ＥｃｏＲ１部位で３“側突出に充填し、さらに平滑末端連結によって８ｇｌｎリンカ−を付加することにより構築された。得られたＤＮＡ断片を、あらかじめＰｓｔ　Ｉ部位がＢｇ１１１部位に転換されている。　ｐＵｃ−４にの誘導体にクローニングした。得られた組換えベクターがｐＹＡ２８０であり、これをＣｈ　１６０９７に導入した。ニス・ティフィムリウムａｓｄ＋遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩ　、　ＢａｍＨＩ、　Ｓａｌ！あるいはＢｇｌＩＩを使用することにより、　ｐＹＡ２８０からカセットとして取り出すことかでクローニングベクターｐＹＡ２９２　（第１６図）を、標準的ＤＮＡクローニング手法を用いる多くのステップによって構築した。

−ド配列を含むＨｉｎｄｌｌｌ断片を添加することによ、て、　ｐＹＡ２９２を含むＣｈｉ６０９７を９色素産生基質Ｘ−ｇａ　１含有培地でブレーティングした場合、青色の発現によって選択することができる。

ｐＹＡ２９２内のいずれか１つの潜在的クローニング部位へＤＮＡ断片を挿入することによって１通常β−ガラクトシドを加水分解する能力が喪失し、これらのブレーティング条件下で白色のコロニーを生成する。しかしながら、このβ〜ガラクトシドを加水分解する能力の喪失は、挿入物が、酵素的に活性なβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクの合成を可能にする場合には生じない。

ｐＹＡ２９２におけるクローニング部位には、　ＥｃｏＲＩ　、　Ｓｍａｌ、　Ｂａ■旧、　５ａｌｌ、およびＰｓｔｌについての制限酵素部位が含まれる。

λ−ｇｔｌｌにおけるＭ、レブラ抗原の細胞は、ミコバクテリアのポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼを含む融合タンパクとして産生されるように１Ｍ、レブラのＤＮＡを任意に剪断し。

ベクターのＥｃｏＲ１部位にそのＤＮＡをクローニングすることによって調製される。β−ガラクトシダーゼライブラリーの発現は１発現がイソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発され得るように、　Ｉａｃオペロンの制御下で行われる。

λ−ｇｔｌｌ：：ｉレブラライブラリーをイー・コリＹ１０９０にプラーク形成させ、プレートあたり約５．０００のプラークを生成する。プレートを４２℃で２時間インキュベートし、バタテリオファージを誘発させる。次にプラークにニトロセルロース膜をかぶせ、　１０ｍＭ　ＩＰＴＧに浸漬し、３７℃でさらに２時間インキュベートする。ニトロセルロース膜を、０．５％ツイーン８０を含むｐＨ８，０のＴｒ　ｉｓ緩衝液中で洗浄し、同じ緩衝液中０．２５％ＢＳＡ　＋０．２５％ゼラチンでブロックする。使用した帽しブラ患者からの血清はトーマスＨ，レイ博士（Ｏｒ、Ｔｈｏｍａｓ　Ｈ，Ｒａｅ）より寄贈された。２１人の患者からの血清をプールし、この血清は、イー・コＵ　Ｙ１０９０由来の全細胞および音波抽出物に広範に吸収される。音波抽出物を、臭化シアン（ｃｙａｎｏｇｅｎ　ｂｒ。

ａｂｉｄｅ）活性化セファロース４Ｂに連結させ、そしてニトロセルロース膜にスポットして、交叉活性抗体を除去するために使用する。プラークを含むニトロセルロースフィルターを、　ＬＬ血清の１　：　１，０００希釈液でインキュベートし、洗浄して９次にアルカリホスファターゼに接合した抗ヒト抗体と共にインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）とブロモクロロインドリルホスフェ−１（ＢＣＩＰ）の色素産生基質混合物を使用することによりその反応性を評価する。陽性シグナルを生じるプラークを同様にして３回単離して精製する。この方法を用いて１合計２ｏの組換えクローンを同定する。異なるクローンは、Ｌｌ、血清に対する反応強度に関して異なる反応性を示す。

ライブラリーを１次のものを用いて発現産物の反応性に関してスクリーニングする＝Ｍ、レプラ６５ｋＤａタンパクに対するモノクローナル抗体（ブキャナンら（Ｂｕｃｈａｎａｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９ｇ？））；らい腫形態の疾患（ＬＬ）および結節形態の疾患（ＴＴ）を有する患者由来の血清。産物はウェスタンプロット分析によっても同定される。

２つのクローン、３−２および７−８の免疫反応性を表５に示す。

表５ λｇｔｌｌ　：　：Ｍ、レプラ免疫反応性クローンの特徴３−’１　２．２＋＋＋＋　十　抗６５ｋＤａ　１３２７−８１゜Ｑ　＋＋＋　＋　−１５８／１５３実施例２０．Ａ−の中で述べた。λ−ｇｔｌｌクローン３−２および７−８からの精製ＥｃｏＲＩ挿入物を、第１７図および第１８図のフローチャートに示すようにして、　ｐＹＡ２４８に挿入する。生じる組換えベクターは、クローン３− ２らの挿入物を含むｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９１．そしてクローン７− ８からの挿入物を含むｐＹＡ１０９２およびｐＹＡ１０９３である。これらのベクターの特徴およびそれらのＭ、レブラ発現産物を表６に示す。ｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９２はＰｔ、ｒｃプロモーターに関して正しい方向性を持ち、患者の血清と反応するポリペプチドを発現する。

（以下余白）表６サブクローンの特徴ｐＹＡ１０９１　λｇｔ夏１３．２　逆方向　５５．　２１ｐＹＡ１０９２　λ ｇｔｌｌ　７−８　正方向　３６”　、　３３”ｐＹＡ１０９３　λｇｔ１１７．８　逆方向　−”　ＬＬ患者血清中の抗体と反応アデニル酸シクラーゼおよび環状へＭＰ受容タンパク質を欠く欠失変異体であり、さらにａｓｄ内に欠失変異を含む、無発病性（７）Ｓ、　−ｒ　４７　イム！Ｊ　ウＡ　Ｃｈｉ４０７２株（表１）を、　ｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９２で形質転換することにより、ワクチン株が構築される。

組しプラはマウスの後足路においてゆっくり複製する。微生物に対するワクチンへの免疫反応は、免疫後に足置において組しプラが複製する能力がないことを測定するか、゛あるいは免疫したマウスの後足路に死滅した剛しブラ抽出物を注入した後の遅延型過敏症（ＤＴＨ）の徴候によってモニターすることができる。シェパードら（Ｓｈｅｐａｒｄ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８０）。

マウスを、上に述べたように経口で与えた１０’個の形質転換体−すなわちＳ、ミュータンス５ｐａＡタンパクを発現するｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２を含むＣｈｉ４０７２についての形質転換体で免疫化する。−、レプラ抗原に対する唾液中のＩｇＡおよび血清中のＩｇＧを、免疫死後毎週１回定量する。免疫化の１か月後に。

数匹のマウスに適量の死滅化レブラ抽出物を２つの後足路のいずれかに注射する。緩衝化生理食塩水をもう一方の後足路に対照として注射する。細胞性免疫反応を９Ｍ、レブラ抽出物を注射した後９足置の腫脹として発現されるＤＴ）１反応によって検出する。もう１群の免疫化マウスは、一方の後足路に１０４個の生存Ｍ、レブラ細胞を接種する。６〜９か月後に、顕微鏡検査あるいはＭ、レブラ特異的ＤＮＡプローブの使用によってＭ。

レプラ細胞の力価（タイター）を測定する。有効な免疫のないマウスは約１０６個の組しプラ細胞（接種物中の１００倍増加）を示すはずである。有効な免疫を有するマウスは、１０４細胞。

あるいは剛しブラがマクロファージによって死滅し、破壊されていればさらに低い数を示す。

この工程は、　Ｌｌ、、およびＴＴ患者からの血清中の抗体との反応によって同定される。異なる剛しブラ抗原を発現する数多くのＣｈｉ４０７２誘導体について反復することができる。最後に。

抗らいワクチンとして最良の抗原候補は、アルマシロ、次にヒトにおいて選択し、評価することができる。

ＥＰＡ、　ｊｌｓＤＡおよびＦＤＡは、生ワクチンとして使用される菌株中に抗生物質耐性についての遺伝子が存在することを許容しない。ｇｙｒＡ１８１６変異を、マウスを使用する実験室の実験においてそ・のような菌株の生存を容易に追跡し、定量できる手段として、多くの無発病性Ｓ８ティフィムリウム変異体に導入した。そのような菌株を認可されつるワクチンとして使用すｚｅｈ−４：：ＴｎｌＯを持つ０８９０３１株（表１）を利用することにより実施されうる。

ＤＢ９０３１においてｐ２２［１’ｒｉｎｔを増殖させ、上に述べた方法によって形質導入溶解産物を作製する。細菌デブリの除去後、溶解産物をクロロホルム上４℃で保存する。ＤＢ９０３１に増殖したるために使用することができる。Ｃｈｉ４０７２は、もちろん、ジアミノピメリン酸を補足したシリアブロス中での増殖を必要とする。　吸着と注入のために２０分装いた後、適当な希釈液を、ＤへＰおよび１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むベナセイ寒天（Ｐｅｎａｓｓａｙ　ａｇａｒ）上にプレートする。これらのプレートを一晩インキユベートする。

１０のテトラサイクリン耐性形質導入体を採取して精製し。

ナリジクス酸（５μｇ／ｍｆ）に対して感受性となり、同時にワクチン株中に存在する他の変異に関連する他のすべての表現型特性を保持しているかどうかを見るために試験する。

テトラサイタリン耐性でありナリジクス酸感受性の分離菌を採取し、菌株Ｃｈｉ３０００に増殖させたｐ２２）ＩＴｉｎｔで形質導入する。細胞が遺伝子型および表現型の発現に関して均質となるように数世代増殖させた後、フザリン酸６μ ｇ／ｍｅおよびクロロテトラサイクリン（加圧滅菌済）、およびＤＡＰのような付加的に必要とされる補足物を含む栄養寒天培地に細胞をプレートする。３７℃ で一晩インキユベートした後、単離したコロニーを採取して精製し７．上に述べたようにしてテトラサイタリン耐性の欠失について試験を行う。ＴｎｌＯの痕跡が存在しないことの付加的な証拠として、高濃度の細菌を、テトラサイタリン耐性に変異する能力の欠如に関して評価する。

いくつかの特定の実施態様により本発明を上記のように例示したが、これらの特定の実施例により、添付の特許請求に述べるような本発明の範囲を制限することを意図してはいない。

組換え二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）無発病性すルモネラ属菌株による有効な免疫は、無発病性微生物が、免疫化された個体の腸管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴまたはバイエル板）中に一定期間残存することを必要とする。連続的なコロニー形成および／または他の病原体由来の遺伝子によって特定される毒性抗原の連続的な産生が、病原体に対する高レベルの保護免疫を誘発する上で必要とされる。抗生物質耐性マーカーを持つ従来の発現ベクターを用いた以前の研究においては、免疫化した動物から分離した無発病性すルモネラ菌の大半が、１週間目までに、免疫抗原をコードする組換えプラスミドを喪失し、従って、もはや病原体に対する保護免疫を誘発することができう属の無発病性菌株、およびＳｏミュータンスまたはＳ、ナイフ、ムリウムのａｓｄ＋遺伝子を含む発現ベクターの使用は、クローン化された遺伝子の安定な保持を保証する。この点に関して、　ｐＹＡ２６２を有するＣｈｉ４０７２はＢａ１ｂｃ　７ウスにおいて、　ｉｏ’〜１０ｓの５ｐａＡ産生細胞の力価が経口免疫後１週間保持されるように、　ＧＡＬＴにコロニー形成する。これらの力価はＳ、ティフタ−を喪失した細胞が時おり溶解することは、所望の抗原を放出し、したがってその抗原に対する免疫反応を高めるので。

有用である。

遺伝的に操作された微生物によって合成される。極めて多様な商業的価値のある副産物の生産が、バイオテクノロジー産業において達成された。遺伝的に操作された微生物の、培養増殖条件下での安定な保持が、　ａｓｄ＋遺伝子を選択マーカーとして有する細胞へ、δ−ａｓｄ変異およびポリヌクレオチド挿入物が挿入された細胞のような９本発明の細胞の使用によって促進されるであろう。増殖し、タンパクを発現することができる唯一の細胞は、所望の抗原をコードする細胞である。

このようにして、所望の産物の収率が高められる。

本発明の細胞は、環境汚染物の破壊、害虫の撲滅、あるいは植物種への何らかの恩恵提供のために環境中に放出することができる微生物としても有用である。あらゆる場合において１本発明は、その生存性が所望のクローン化遺伝子産物の発現に結びついている細胞を生成する。

Ｌ−ア２／ｆ：ラヂン飲 β−ア２ン愕もチη〉ノ、／厳ソシン　ホモセリン　−一　トーオニンＦＩＧ、１ＦＩＧ、　９ＦｆＧｉ２ＦＩＧ、　１３ＦＩＧ、１５ＦＩＧ、Ｉ６補正書の翻訳文提出書く特許法第１８４条の８）平成２年４月６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．所望の紺換え遺伝子を発現する細胞の遺伝的集団において，該組換え遺伝子を維持する方法であって，該方法は，次のａ，ｂ，ｃおよびｄにより特徴づけられる遺伝子的に操作された細胞を増殖させることを包含し，ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと，ここで該酵素１は，細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する，ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること，ここで該第１の組換え遺伝子は，該欠損染色体遺伝子に取って替わることはできない；ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること，ｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合，ここで，第１の組換え遺伝子の発現による生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときには，該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する；そして，該増殖は，該第１の組換え遺伝子の欠失により細胞が溶解するような環境により行なわれる。
２．請求項１に記載の方法であって，前記細胞は細菌であり，そして，前記細胞壁の必須構成成分はペプチドグリカンである。
３．請求項２に記載の方法であって，酵素１はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）またはＤ−アラニル−Ｄ−アラニンジペプチドの生合成の工程を触媒する。
４．請求項３に記載の方法であって，前記細菌はグラム陰性細菌であり，そして，酵素１はａｓｄであり，そして酵素２はａｓｄ遺伝子由来の機能性代替物である。
５．請求項４に記載の方法であって，酵素２はＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ），またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ），またはＳ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のａｓｄ遺伝子由来である。
６．請求項５に記載の方法であって，前記細菌はＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉである。
７．次のａ，ｂ，ｃおよびｄにより特徴づけられる遺伝子操作された細胞：ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと，ここで該酵素１は，細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する；ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること，ここで該第１の組換え遺伝子は，該欠損染色体遺伝子に取って替わることはできない；ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること；そして，ｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合，ここで，第１の組換え遺伝子の発現による生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときには，該第１の紺換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する。
８．請求項７に記載の方法であって，前記細胞は細菌であり，そして，前記細胞壁の必須構成成分はペプチドグリカンである。
９．請求項８に記載の方法であって，酵素１はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）またはＤ−アラエル−Ｄ−アラニンジペプチドの生合成の工程を触媒する。
１０．請求項９に記載の方法であって，前記細菌はグラム陰性細菌であり，そして，酵素１はａｓｄであり，そして酵素２はａｓｄ遺伝子由来の機能性代替物である。
１１．請求項１０に記載の方法であって，酵素２はＳ．ｍｕｔａｎｓ，またはＥ．ｃｏｌｉ，またはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｉｕｍ由来のａｓｄ遺伝子由来である。
１２．細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する酵素をコードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であって，該細胞壁の成分はＤＡＰから次のａおよびｂを包含する工程により合成される：ａ）ＤＡＰを含む培地中で親細菌を増殖させ変異させること；およびｂ）栄養要求性の発現を許容するが，ＤＡＰを含みそして該細菌内で細胞壁の生合成を妨害する抗生物質を含む培地を用いて，変異細菌を選択すること。
１３．ａｓｄをコードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であって，該方法は，ａ）トランスポゾンを用いて欠失を生じさせることにより，細菌の染色体遺伝子中に欠失を導入すること；およびｂ）ａｓｄをコードする遺伝子に欠失を有する変異体を，ＤＡＰを含む単離培地を用いて単離すること；を包含する。
１４．ａｓｄ−変異体を構築するのに有用であり，ａｓｄをコードする遺伝子に欠失変異を有する組換え細菌株であって，該組換え細菌株は，Ｅ．ｃｏｌｉＫ− １２Ｃｈｉ２１０８およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＣｈｉ３５２０，およびそれらの変異体でなる群から選択される。
１５．ａｓｄ−表現型を有する細菌株を補足するのに有用な紺換えプラスミドであって，該組換えプラスミドは，ａｓｄをコードする第１の遺伝子を有し，そして所望の生産物をコードする第２の組換え遺伝子が挿入され得る制限部位を有する。
１６．請求項１５に記載の組換えプラスミドであって，前記第１の組換え遺伝子は，Ｓ．ｍｕｔａｎｓまたはＥ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来である。
１７．請求項１６に記載の組換えプラスミドであって，前記プラスミドはｐＹＡ２４８およびその変異体，またはｐＹＡ２９２およびその変異体である。
１８．請求項１６または請求項１７のプラスミドにより形質転換された細菌株。
１９．個体を免疫するためのワクチンであって，該ワクチンは次のａ，ｂ，ｃおよびｄにより特徴づけられる非病原性細菌株を含有し，ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする天然の染色体遺伝子の機能を欠くこと，ここで該酵素１は，細胞壁の必須構成成分の生合成の工程を触媒する，ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在すること，ここで該第１の組換え遺伝子は，該欠損染色体遺伝子に取って替わることはできない，ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子が存在すること，およびｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間の物理的結合，ここで，第１の組換え遺伝子の発現による生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときには，該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解する；そして，該細菌は薬学的に受容され得る賦形剤中に処方され，そして，該細菌は薬理学的に効果的な量で存在する。
２０．請求項１９に記載のワクチンであって，前記非病原性細菌はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）変異体であり，そして天然の遺伝子はａｓｄである。
２１．請求項２０に記載のワクチンであって，前記第１の組換え遺伝子はＳ．ｍｕｔａｎｓ由来のａｓｄをコードして，そして，前記第２の組換え遺伝子は，Ｍ．レプラ（ｍ．ｌｅｐｒａｅ）油来の抗原またはＳ．ｍｕｔａｎｓのＳｐａＡ内にコードされている抗原をコードする。
２２．ｐＹＡ２４８またはｐ１Ａ２９２でなる群から選択されるプラスミド，ポリペプチドをコードする遺伝子を制限酵素部位に挿入することにより，それらから誘導されるプラスミド；およびそれらの変異体。
２３．請求項２２のプラスミドにより形質転換された細菌株。
２４．ＰＹＡ２３２を有するＣｈｉ６０９７，Ｃｈｉ２９７８，Ｃｈｉ３５２０，ＰＹＡ２４８を有するＣｈｉ４０７２，Ｃｈｉ３００８，Ｃｈｉ２１０８およびｐＹＡ２９２を有するＣｈｉ６０９７でなる群から選択される細菌株。