JPH0811737B2 - 大腸菌のｌｔ―ｂエンテロトキシンサブユニットと莢膜ポリマーとの免疫原性結合体 - Google Patents

大腸菌のｌｔ―ｂエンテロトキシンサブユニットと莢膜ポリマーとの免疫原性結合体

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Description

【発明の詳細な説明】 1. 発明の分野 本発明は、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ
（Haemophilus influenzae）ｂ型、大腸菌（Escherichi
a coil）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria me
ningitidis）血清グループＡおよびＣ、ストレプトコッ
カス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）血清
型3,6,12,14,19,23および51、ならびにシュードモナス
（Pseudomonas）などを含む細菌により引き起こされる
感染および疾患に対する、新規なワクチン組成物、その
製造法およびヒトを含む若い恒温動物の免疫方法の分野
に関するものである。
本発明はさらに、大腸菌のエンテロトキシン産生株の
ヒト単離物からの熱不安定性エンテロトキシンの無毒性
Ｂサブユニット（LT−Ｂ）の製造方法に関するものであ
る。この方法は、必須遺伝子配列が適当なDNAベクター
によって非病原性微生物株中へ挿入される組換えDNA技
術を利用するものである。
LT−Ｂタンパク質の単離および精製方法ならびに免疫
学的予防および治療のためのその使用法が提供される。
LT−Ｂタンパク質に対して調製された抗血清は、エンテ
ロトキシン誘発性下痢症に対する受身免疫に利用し得
る。また、このような抗血清は大腸菌やコレラ金（Vibr
io cholerae）のエンテロトキシンに特異的である免疫
学的診断試験の実験材料にも用いられる。
2. 発明の背景 精製された細菌の莢膜ポリマー（CP）は成熟したヒト
および動物において一般的に免疫原性があり、そして相
応する全身感染症に対するワクチンとして使用できるこ
とが公知である。本明細書中で用いる場合、「莢膜ポリ
マー」なる用語は、糖のポリマー、糖酸のポリマー、ア
ミノ糖のポリマー、多価アルコールのポリマーおよび糖
ホスフェートのポリマーなどのような、糖含有ポリマー
を指し、アミノ酸含有ポリマーを指すものではない。こ
れらの「莢膜ポリマー」は、グリコシド結合以外の結合
および上記に列挙したような糖以外の成分を含むもので
はあるが、医学文献においては「莢膜多糖」と称される
ことが多い。
様々な細菌の莢膜ポリマーは生後１年目における免疫
原性が広範に変化する。いくつかは、ストレプトコッカ
ス・ニューモニエ血清型３およびナイセリア・メニンギ
チジス血清グループＡなどのように適度な活性がある。
被包性細菌による全身性感染に対する感受性は生後１年
目により大きなものとなる。幼児における多くの細菌莢
膜ポリマーに対する免疫原性応答は年齢に依存し、すな
わち莢膜ポリマー（CP）に対する免疫適格性は約６才ま
でに成人のレベルに増加する。
不活性なCPとしては、ヘモフィルス・インフルエンザ
ｂ型、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６およ
び12、ならびにナイセリア・メニンギチジス血清グルー
プＣのものがある。幼児において中間の応答を与えるCP
の例としては、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清
型19および51がある。
2.1.ワクチン中の抗原としての完全な莢膜ポリマー 多数の研究者がワクチン中でまたはワクチンとして有
用である完全な莢膜ポリマーを単離し精製している。例
えば、米国特許第4,220,717号は、ヘモフィルス・イン
フルエンザｂの莢膜ポリマーからの免疫学的に活性なポ
リリボシルリビト−ルホスフェート（PRP）の単離・精
製法を述べている。さらに、米国特許第4,210,641号
は、200,000ダルトンより大きな見かけ分子量を有し、
そして主としてガラクトース、グルコースおよびマンノ
ースからなり、また少量のオサミンを含有するヘモフィ
ルス・インフルエンザの多糖抽出物に関するものであ
る。
一部の研究者が、よりよい免疫学的応答を達成するた
めの処方物において、これらおよびその他の完全な莢膜
ポリマーを利用している。例えば米国特許第4,196,192
号は、精製された完全PRPおよび完全なボルデテラ・パ
ーツシス（Bordetellapertussis）菌を含むワクチンを
開示している。免疫原性を増加させるためのこのアプロ
ーチは、若い哺乳動物において、高レベルの抗PRP抗体
および抗パーツシス抗体をもたらした。
2.2. 結合体を含有するワクチン 他の研究者たちは、いわゆる単体効果（carrer effec
t）により抗体形成を高める努力において、莢膜ポリマ
ーと担体タンパク質との結合について研究している。例
えば、Schneersonら,Journal of Experimental Medicin
e,152:361−376（1980）は、ヘモフィルス・インフルエ
ンザｂポリマー−タンパク質結合体が、ヘモフィルス・
インフルエンザｂによって引き起こされた侵入性疾患に
対する免疫性を賦与することを述べている。この文献
は、幼児における莢膜ポリマーの年齢に関係した免疫学
的挙動を論じており、血清アルブミン、リムルス・ポリ
フェムス・ヘモシアニン（Limulus polyphemus hemocya
nin）およびジフテリア毒素を含む種々のタンパク質と
完全莢膜ポリマーとの結合によりこの年齢依存性を克服
しようと努めるものである。結合の方法は、アジピン酸
ジヒドラジドなどのような結合剤の使用を包含するもの
である。
Geyerら,Med.Microbiol.Immunol.165:171−288（197
9）は、還元アミノ化によってクレブシェラ・ニューモ
ニエ（Klebsiellapneumoniae）莢膜多糖フラグメントと
ニトロ−フェニル−エチルアミンリンカーとの結合体を
調製し、次に、アゾカップリングを用いてこの誘導体化
された糖をタンパク質に結合させた。
2.3 ハプテンに対する抗血清を調製するための担体タ
ンパク質の使用 担体タンパク質は、結合体化した莢膜ポリマーの免疫
原性を高めることができるのみならず、これらはまたハ
プテンを免疫原性にする。ハプテンは、抗体あるいはリ
ンパ球レセプターに対し特異的に結合する能力を有する
が、免疫応答を誘導する能力をもたない（すなわち、免
疫原性がない）分子として定義される。免疫応答を引き
起こすために、一般には、ハプテンは最初に、通常は異
種タンパク質である、より大きな分子ないしは担体と結
合されなければならない。次に、ハプテン−担体結合体
の動物内への注入はＢリンパ球による抗体の産生を生じ
させ、その抗体の一部は遊離した非結合状態のハプテン
分子に特異的に結合する能力を有するだろう。
研究された最初のハプテンの中に、アニリンやｏ−ア
ミノ安息香酸などのようなアゾ染料化合物があった。La
ndsteinerとLampl（Z.ImmunForsch.26:293（1918））
は、これらの化合物をジアゾ化によって血清タンパク質
にカップリングされた。これらの人為的に調製されたア
ゾ−タンパク質を注射した場合、ウサギは、結合させた
化学的成分に特異的である沈降抗体を生じさせた。
ハプテン性化合物の他の例としては、ウシ血清アルブ
ミンあるいはウシγグロブリン（BGG）にジニトロフェ
ニル（DNP）基としてカップリングさせた場合に免疫原
性となるジニトロフェノールや、リゼルグ酸ジエチルア
ミドがある。ホルムアルデヒドもまたハプテンとしてふ
るまうことが示されており、製品からあるいは実験室内
でホルムアルデヒド蒸気にさらされた人々は、生体内で
の内因性巨大分子のホルミル化後に、この化合物に対し
て「感作された」状態になる。
ハプテン性挙動は、小さな有機分子のみに限定される
ものでなく、そして最大インスリンまでの大きさのポリ
ペプチドホルモンは、あったとしても、多くの場合免疫
原性が乏しい。それ故、これらのホルモンに対する高い
抗体価を得るためには、これらを担体分子に結合させる
（あるいはこれらのポリペプチドの多くを互いに架橋す
ることによってより大きな分子を形成させる）必要があ
る。
担体分子の必要性は、担体が単なる輸送以上の役割を
果たすという点で特に興味がもてる。OvaryとBenaceraf
f（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.114:72（1963））はDNP−BG
Gをウサギに注射することによってこのことを示した。
多くの免疫原性物質の動物への注射は暴露の免疫学的
「記憶」をもたらすであろう。それ故、後日２回目の注
射が与えられた場合に、より一層活発な免疫応答が生じ
る。実際、OvaryとBenaceraffがDNP−BGGを再度注射し
た場合、DNPおよびBGGの双方に対して誘導された抗体の
顕著に上昇したレベルとなる強力な２次応答があった。
しかしながら、２回目の注射がDNP−卵アルブミンで置
き換えられて行なわれた場合、かなり弱い抗DNP抗体応
答が現れた。応答における違いは、担体効果と呼ばれて
いるものによるものであり、そしてヘルパーＴ細胞を伴
うものであるらしい。
予備的知見は、すべてのタンパク質が所定のハプテン
に関して必ずしも等しく効果的な担体タンパク質であり
得るものでないことを示している。Robbinsら（Infect.
Immun.40:245−256）は、同じ多糖ハプテンが異なるタ
ンパク質担体に結合されそしてハプテンに対する抗体応
答が定量された実験的タンパク質−多糖結合体ワクチン
に関するデータを提示している。生成した抗ハプテン抗
体の量における有意差が記されており、これは担体の主
たる役割を示すものである。
2.4 エンテロトキシン産生菌および下痢症 いくつかの細菌のエンテロキシン産生株による小腸の
一時的集落形成に起因する急性下痢症は、世界的に重要
な健康上の問題となっている。原因となる細菌の中で、
恐らく最も広く知られているものはコレラ菌である。あ
まりよく知られていないが、実際的により重要なものは
大腸菌（E.Coli）の特定の株であり、これらはロタウイ
ルスと一緒になって発展途上の熱帯の国々に住む1000万
人と見積もられる幼児に致命的である急性下痢症を毎年
もたらすのである（Blackら,Lancet i:141（1981））。
これらの大腸菌株はまた一般に、熱帯への旅行者を悩
ます急性下痢症の高い発病率の原因ともなるものであ
る。さらにまた、Kchler（J.Am.Vet.Med.Assoc.173:588
（1978））が、乳離れした動物の子、特に子ウシ、子ヒ
ツジおび子ブタは同様の病気に冒され得ることを報告し
ているゆえに、これらは家畜に対しても大きな影響を有
している。
コレラ菌およびエンテロトキシン産生性の大腸菌株は
いずれも、これらの下痢作用をエンテロトキシンの産生
により生じるものである。コレラエンテロトキシンはFi
nkelstein（Crit.Rev.Microbiol.2:553（1973））によ
って単離され、そして均質に精製されている。さらにま
た、FinkelsteinとLoSpalluto（J.Exp.Med.130:185（19
69））は、生物学的活性が低減されたコレラ毒素由来の
タンパク質サブユニットを分離している。これらの研究
よりあるいはその他の研究より明らかになったことは、
コレラエンテロトキシンがＡおよびＢサブユニットから
なる84,000ダルトンのタンパク質であるということであ
る。
Ａサブユニット（28,000ダルトン）は、毒素の生物学
的作用の原因となるものであるが、それのみでは標的レ
セプターに結合することができない。Ａサブユニット
は、SH試薬（スルフヒドリル試薬）の作用によって、7,
000ダルトンおよび21,000ダルトンの分子サイズを有す
る２つのポリペプチド鎖に開裂される。A1と呼ばれる、
これらの鎖のうちの大きい方のみが活性なものである。
56,000ダルトンのサイズを有するＢサブユニットは、
Ａサブユニットの活性の発現に必須のものである。おそ
らくは、これは標的細胞へ結合し、そして次に活発なＡ
サブユニットによる侵入を促進することにより作用する
と思われる。Finkelstein（J.Immunol.113:145（197
4））は、Ｂサブユニットが、ドデシル硫酸ナトリウム
でのあるいは低いpHにおける尿素での激しい処理により
５つのポリペプチド鎖に解離し得る非共有結合的に会合
したサブユニットから構成されていることを示した。
コレラ毒素の作用は、Sheerら（Gastroenterology 6
5:895（1973））によってウサギの空腸において明らか
にされている。この系において、該毒素は、内腔への血
液ナトリウムの一定方向の流れを引き起こす。結果とし
て、腸液は、標準血清レベルと比較して、タンパク質、
Mg++およびCa++が低くなり、またK+、Na+およびHCO3 -が
高くなる。このようなイオン変化により、血漿との浸透
圧平衡維持のために、内腔への水の付随した流出が生じ
る。
コレラ毒素セレプターの正確な構造は不明であるが、
糖脂質であると思われる。この観察結果は、膜へのコレ
ラ毒素の結合が種々のグリコスフィンゴリピドによって
阻止されるというKingとvan Heyningen（J.Infect.Dis.
131:643（1975））による知見に基づくものである。調
べられたこのタイプの化合物の中で、GM1（ガラクトシ
ル−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−（シアリル）−ガ
ラクトシルグルコシルセラミド）が最も効力のあるもの
である。
コレラ毒素の結合が起こると、アデニル酸シクラーゼ
活性の刺激がありそして活性化状態におけるその酵素の
ロッキングがある。その結果は、ある方法で上記のイオ
ン変化を生じさせるcAMPの細胞内レベルの上昇である。
大腸菌のエンテロトキシン産生株はまた、エンテロト
キシンの産生により下痢作用をもたらす。これらの毒素
は２つのタイプのものがあり、その一方は、2,000ダル
トンの比較的低分子量種である。これは100℃での処理
にも生き残るので、この種は熱安定生毒素（ST）と呼ば
れる。熱不安定性な他方の毒素（LT）はコレラ毒素と著
しく似ている。
Gillら（Infect.Immun.33:677（1981））によって示
されるように、大腸菌のLTはコレラ毒素と同様なタイプ
および数のサブユニットから構成されており、この対応
するサブユニットはほぼ同様の分子量を有している。コ
レラ毒素の場合のように、LTのＢサブユニットは、腸管
粘膜糖脂質レセプターに結合し、それ故に、生物学的活
性Ａサブユニットによる細胞の侵入を可能にする。この
時点以後に生じた連続した現象もまた同様のものであ
る。最も重要なこととして、ClementsとFinkelstein（I
nfect.Immun.21:1036（1978））は、大腸菌のLTがコレ
ラエンテロトキシンのＡおよびＢサブユニットの双方に
免疫学的に関係があることを示している。
2.5. エンテロトキシン性下痢症の予防および治療に対
する免疫学的アプローチ 微生物毒素誘発性下痢症がもたらす広範な患者数およ
び死亡数と戦うための最も実践的な手段は防御的予防接
種であろう。エンテロトキシン産生性大腸菌株の場合に
おいて、３つのアプローチが考えられる。
第１に、菌対抗原を免疫処置に用いることができる。
死滅化ないし弱毒化された細菌がこの目的のために用い
られるが、このアプローチはいくらかの危険性を伴なう
ものであり、また限定された効果のものとなりがちであ
る。細胞の死滅化ないし弱毒化が不完全であると、臨床
的疾患が発症してくる。これが起こらなかったとして
も、抗原的に異なる菌体血清型が認識されないだろうゆ
えに、防御は不完全なものとなるであろう。
第２に、Acresら（Infect.Immun.25:121（1979））
は、線毛（ピリ）仲介定着がエンテロトキシン分泌性大
腸菌のある株による下痢症の誘発に必須条件であること
を示している。それ故、細胞接着を妨げることは予防効
果を有するものであろう。このような妨害は、線毛抗原
を接種することにより生じさせることができるが、この
ように賦与された防御はまた、抗原的に類似した細菌に
のみ適用できるものである。Morganら（Infect.Immun.2
2:771（1978））は、動物およびヒトのエンテロトキシ
ン産生性大腸菌株の中に多数の抗原的に異なる線毛抗原
を見つけている。
最後に、エンテロトキシンそれ自体で動物を予防接種
することが可能である。このように確立された免疫は、
毒素を産生する関連した大腸菌株による能動攻撃に対す
る防御を与える。その理由は明確には理解されていない
が、LT毒素での免疫感作は、LTおよびSTの双方を産生す
る株に対する防御を与えるものであるらしい。STのみを
産生する株に対する防御はないであろうが、これらの株
は少数派に属するものである。KlipsteinとEngert（Inf
ect.Immun.23:592（1979））は、精製されたLTタンパク
質でのラットの能動免疫を述べている。
免疫感作はLTそれ自体の使用によって達せられるが、
生物学的に不活性なＢサブユニット（LT−Ｂ）のみの使
用もほぼ同様に効果的であり、もちろん、より安全であ
るだろう。このアプローチの効能は、ラットにおいて、
KlipsteinとEngert（Infect.Immun.31:144（1981））に
より示されている。このような免疫感作また、上で述べ
たLTとコレラエンテロトキシンとの免疫学的関係ゆえ
に、コレラ誘発性下痢症の発病に対する防御も賦与する
ものである。
Klipsteinらはまた、LTに結合したSTで（Infect.Immu
n.32:1100（1981））あるいはLT−Ｂタンパク質に結合
したSTで（J.Infect.Disease147:318（1983））ラット
を免疫している。このような結合体およびこれらのワク
チンとしての使用に基づく特許が、Klipsteinらに対し
て発行されている（米国特許第4,411,888号）。
2.6. 組換えDNA技術 現在における組換えDNA法は、宿主細胞内で複製し得
る組換えDNA分子を形成するために、特定のDNA配列が適
当なDNA運搬体あるいはベクター中に挿入されるもので
ある。プラスミドと呼ばれる環状二本鎖DNAがベクター
として頻繁に用いられており、そしてこのような組換え
DNA形態の調製は、DNAを特定の塩基配列部位で切断し得
る制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用を伴うものであ
る。プラスミドにおいて、そして挿入すべき外来DNAセ
グメントにおいて制限酵素による切断が行なわれると、
２つのDNA分子はリガーゼとして知られる酵素により共
有結合される。このような組換えDNA分子の調製に関す
る一般的方法は、CohenとBoyerによって米国特許第4,23
7,224号中に述べられている。その他の有用な一般的方
法が、CollinsとHohnによって米国特許第4,304,863号中
に述べられている。これらの広い利用性ゆえに、これら
の特許は参考として本明細書中に組み込まれる。
ひとたび調製されると、組換えDNA分子は、多くの条
件が合致された場合のみに、挿入された遺伝子配列によ
り特定化される産物を産生するために用いられる。第１
には、組換え分子が宿主細胞と適合し得るものであり、
そしてそれゆえに宿主細胞中で自立複製し得る必要があ
る。最近の研究の多くは、大腸菌が広範な組換えプラス
ミドと適合し得るゆえに大腸菌を宿主生物として用いて
いる。用いられたベクター／宿主細胞系に応じて、組換
えDNA分子は、形質転換、形質導入あるいはトランスフ
ェクションによって宿主中へ導入される。
宿主細胞中における組換えプラスミドの存在の検知
は、例えば抗生物質耐性などのような、プラスミドマー
カー活性の使用により首尾よく達せられ得る。それゆ
え、アンピシリン分解酵素の産生をコードするプラスミ
ドを保持する宿主は、アンピシリンを含有する倍地中で
宿主を培養することによって、非形質転換細胞から選び
出すことができる。更なる利点は、選択された制限エン
ドヌクレアーゼにより切断され、そして外来の遺伝子配
列が挿入される部位において、プラスミドが第２の抗生
物質分解活性をコードする抗生物質耐性マーカーにより
もたらされる。組換えプラスミドを適当に含有する宿主
細胞は、その後、第１の抗生物質に対する耐性および第
２の抗生物質に対する感受性により特徴づけられるであ
ろう。
宿主細胞への組換えプラスミドの単なる挿入および修
飾宿主の単離は、望まれる遺伝子産物の有意な量が産生
されることをそれ自体において保証するものではない。
これを生じさせるためには、外来の遺伝子配列は、プロ
モーターと呼ばれるDNA転写のためのプラスミド中のシ
グナル領域に、特有の関係において融合されなければな
らない。あるいはまた、外来DNAは、宿主によって認識
される限り、それと共にそれ自身のプロモーターを担う
こともできる。その起源が何であっても、プロモーター
は、RNAポリメラーゼの結合を導くDNA配列であり、それ
ゆえDNAのメッセンジャーRNA（mRNA）への転写を「プロ
モートする」ものである。
大量のmRNAを提供し得る強力なプロモーションを与え
ると、望まれる遺伝子産物の最終的な産生は、mRNAから
タンパク質への翻訳の効率に依存したものとなる。これ
は、言い換えれば、mRNAへのリボソーム結合の効率に依
存するものである。大腸菌において、mRNA上のリボソー
ム結合部位は、開始コドン（AUG）および上流のシャイ
ン−ダルガルノ（SD）配列を含むものである。３〜９ヌ
クレオチドを含み、そしてAUGから３〜11ヌクレオチド
に位置するこの配列は、大腸菌の1SリボソームRNA（rRN
A）の３′未満に相補的である（Shine and Dalgarno,Na
ture254:34（1975））。mRNAへのリボソーム結合は、お
そらく、mRNA中のSD配列と16SrRNAの３′末端配列との
塩基対合により促進されている。遺伝子の発現を最大化
するためには、Roberts and Lauer,Methods in Enzymol
ogy68:473（1979））を参照されたい。
最近、ヒトおよびブタ起源のエンテロトキシン産生大
腸菌株からのLTプラスミドと他の細菌中への導入がNeil
lら（Infect.Immun.41:1056（1983））によって示され
ている。この研究において、大腸菌からのLTプラスミド
は、大腸菌Ｋ−12株中への、ならびにシゲラ・フレクス
ネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（shige
lla sonnei）、シトロバクター・フロインディ（Citrob
akter freundii）、エンテロバクター・クロアカエ（En
terobacter cloacae）、クレブシェラ・ニューモニエ
（Klebsiella pneumoniae）およびサルモネラ・チフィ
ムリウム（Salmonella typhimurium）の株中への接合に
より移入されている。このトランスコンジュガント（被
接合体）の分析は、すべての場合において、移入された
プラスミドがこれらの宿主において安定に維持されてい
たことを示した。固相ラジオイムノアッセイによって測
定されたLT遺伝子の発現は広く変化したが、大腸菌にお
いて最大のLT産生が生じた。
LTのＢサブユニットを産生するために遺伝子工学的技
法を用いることもできる。Dallas（欧州特許出願第0060
129号）は、ブタ起源の大腸菌単離物からのLT−Ｂをコ
ードする遺伝子のクローニングを述べている。LTのＢサ
ブユニットをコードするシストロンは、EWD299をEcoRI
で切断し、そしてEcoRI切断されたpJJS500にこのDNAを
連結反応させることによりベクターpJJS500中にクロー
ニングされた。この出願は、見かけ上はLT−Ａ汚染のな
いLT−Ｂ産生を特定化するプラスミドがこれにより得ら
れたことを述べている。この請求の範囲を支持する証拠
が何ら示されていないこと、in vivoまたはin vitro研
究を何らあげていないこと、およびこの遺伝子産物に基
づいた成功した抗体産生の開示がないことは指摘される
べきである。
Yamamotoらは（J.Bacteriol.148:983（1981））は、
ヒトの大腸菌単離物からのLT−Ｂ遺伝子のプラスミドpB
R322中へのクローニングを述べている。遺伝子産物のい
くつかの発現は、放射性標識化アミノ酸混合物中で修飾
細菌を培養し、次にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により粗細胞溶解物を分析することによって検知さ
れた。しかしながら、LT−Ｂタンパク質を精製したり特
徴づける努力が何らなされておらず、遺伝子発現のレベ
ルが有意なものか否かも不明である。
その他の研究において、Sanchezら（FEMS Microbiol.
Lett.14:1（1982））はヒト単離物からのLT−Ｂ遺伝子
をベクターpACYC184中へクローニングした。この場合
も、遺伝子産物を精製することも特徴づけることもなさ
れなかった。
3. 発明の概要 本発明は、細菌莢膜ポリマー由来の莢膜のポリマーフ
ラグメントを細菌の毒素、トキソイドあるいは結合サブ
ユニットへ還元アミノ化により共有結合させることに関
するものである。本出願において用いられる「トキサイ
ド」なる用語は、毒性なしに毒素の抗原性を有している
毒素の形態を意味するものである。
本発明の免疫原性結合体は、莢膜ポリマーのフラグメ
ントに還元末端基を最初に形成し、そしてそれを細菌の
毒素、トキソイドあるいは結合サブユニットのアミン基
と還元アミノ化によって反応させることによって調製さ
れる。還元末端基は、選択的加水分解（例えば酸または
酵素による）を含む任意の適当な方法によって、あるい
は酸化的開裂（例えば過ヨウ素酸塩による）によって形
成され得る。この結合は、シアノボロハイドライドアニ
オンを含有する水溶液中における還元アミノ化によって
達成することが好ましい。
本発明の免疫原性結合体は、ヒトを含む若い哺乳動物
において有効なレベルの抗莢膜抗体の形成を誘起するワ
クチンを製造するために、薬理学的に許容できる担体と
処方され得る。このワクチンは、それぞれの被包性細菌
によって引き起こされた若い哺乳動物における全身性感
染に対する能動免疫を、哺乳動物に免疫原量の該結合体
を投与することによって誘導することに利用され得る。
この免疫原性結合体は、莢膜ポリマー単独よりも年齢
依存性でないことが見い出されており、また非常に若い
恒温哺乳動物のそれぞれの被包性細菌による全身性感染
に対する能動免疫に有効である。
さらにまた、本発明の免疫原性結合体は、炭水化物と
タンパク質を結合させるのに用いられてきたアジピン酸
ジヒドラジドあるいはｐ−ニトロフェニルエチルアミン
のような潜在的に毒性のある結合剤を含まないものであ
る。
最後に、本発明の免疫原性結合体は、莢膜ポリマーの
フラグメントを含むものであって、完全な莢膜ポリマー
を含むものではない。莢膜ポリマーの高度な反復構造
は、幼児において抗体産生能を高めることに失敗した原
因の一つでありうる。完全な（高度に重合された）CPと
タンパク質の結合体は、CPのみの場合の免疫学的欠点を
ほんの部分的にしか克服しないであろう。
一方、担体上の莢膜ポリマーフラグメントの使用は反
復構造の欠点を回避するものである。さらにCPフラグメ
ントを有する結合体のCP抗原設定基は、完全なCPを有す
る結合体のCP抗原決定基よりも概して担体により近接し
ており、そして担体へのこの近接は、より効果的な「担
体効果」に必要とされるものである。
更なる利点は、幼児が、日常的に予防接種される、例
えば破傷風あるいはジフテリアなどのような、細菌の毒
素、トキソイドまたは結合サブユニットをタンパク質担
体として使用することにある。選択されたタンパク質担
体に対する望まれた免疫は、莢膜ポリマーに関連した病
原体に対する免疫と一緒に誘導される。
上述したように、ハプテンに対する最適応答を生み出
すことにおけるタンパク質−ハプテン結合体ワクチンの
タンパク質担体の役割は、重要なものであると思われ
る。抗体産生における最初のステップは、抗原の抗体産
生細胞への結合を含むものであるから、高い結合能を有
するタンパク質の使用は、結合体ワクチンに対する抗体
応答を最適化するだろう。細菌毒素、特にこれらのタン
パク質の結合サブユニットは、哺乳動物細胞に対して例
外的な結合親和性を有する。腸内細菌の熱不安定性エン
テロトキシンの結合サブユニット（LT−Ｂ）は、これら
の結合サブユニットの最も研究されたものの１つであ
る。本発明によると、これらの結合サブユニットは、結
合体ワクチンにおけるハプテンの担体としてかなり効果
的である。
また、エンテロトキシン産生性大腸菌株の熱不安定性
エンテロトキシンの無毒性サブユニット（LT−Ｂ）をコ
ードする遺伝子の単細胞宿主生物によるクローニングお
よび発現のための方法ならびに組成物が提供される。LT
−Ｂを産生する収縮宿主の選択および培養の方法、なら
びにこの産物の単離・精製法もまた述べられる。
このように産生されたLT−Ｂは、いくつかの重要な免
疫学的プロセスのために本発明の方法によって利用され
得る。それは、家畜およびヒトの医療において利用され
るワクチンの製造のために処方される。受動的投与によ
って、このようなワクチンからの抗体は、コレラ様エン
テロトキシンの予防および／または治療に用いられ得る
ものである。本出願において用いられる「コレラ様エン
テロトキシン」なる用語は、コレラ毒素およびLT、なら
びに大腸菌、コレラ菌もしくはその他のグラム陰性腸内
細菌によって自然産生された免疫学的に関連したエンテ
ロトキシン、ないしはコレラ毒素、LTあるいはサルモネ
ラ（Salmonella）、エルジニア（Yersina）、シュード
モナス（Pseudomonas）、シゲラ（Shigella）、シトロ
バクター（Citrobacter）、クレブシェラ（Klebsiell
a）などの菌株を含めた任意の微生物による関連エンテ
ロキシンをコードする遺伝子の発現によって産生された
免疫学的に関連したエンテロトキシンを意味するもので
ある。
完全なLTエンテロトキシンのそのＡおよびＢサブユニ
ットへの化学的分離によりあるいは遺伝子クローニング
により誘導された、今までに考察されてきたすべての他
のLT−Ｂタンパク質とは異なり、本発明の産物は無毒生
である。この毒生作用からの一般的でない開放は、免疫
感作法における使用に本発明が唯一好ましいものである
ことを示すものである。本発明のLT−Ｂをその他の方法
によって産生された毒性形態と区別するために、これを
無毒性LT−Ｂ（LT−BNT）と呼ぶことにする。
4. 図面の簡単な説明 本発明は、以下の図面（比例尺でない）に関連させる
ことによってより簡易に理解されるであろう。
第１図は、大腸菌のヒト単離物のEntプラスミドから
のLT遺伝子を含有する5.2kbフラグメントが挿入されて
いる、pBR322から誘導されるLT発現プラスミドであるpD
F82の作製を示す模式図である。
第２図は、LT−Ｂ遺伝子を含みかつHind III切断によ
ってプラスミドpDF82から誘導された0.8Kbフラグメント
のpBR322の単一のHind III部位への挿入によるプラスミ
ドpDF87の構築を示す模式図である。
第３図は、LT−Ｂ遺伝子を含みかつプラスミドpDF87
から誘導された0.8kbフラグメントのpUC8の単一のHind
III部位への挿入によるプラスミドpJC217の作製を示す
模式図である。
5. 発明の詳細な説明 本発明の結合体は、担体タンパク質に共有結合した莢
膜ポリマーの抗原決定基を得るために、莢膜ポリマーフ
ラグメントの還元末端基を細菌毒素またはトキソイドの
第１アミノ基に反応させることによって形成される。該
還元基は選択的加水分解または特定の酸化的開裂によっ
て形成され得る。
少なくとも１つの還元末端を有する抗原性フラグメン
トは、個々の莢膜ポリマーの構造的特徴に応じて、種々
の方法によって莢膜ポリマーから生成させることができ
る。過ヨウ素酸塩（あるいは関連試薬）による限定され
た酸化的開裂は、アルデヒド末端を残す。このようなア
プローチは、非環状残基上に隣接ジヒドロキシ基を有す
るポリマーに限られるであろう。グリコシド結合の加水
分解は、還元糖末端を生成する。このような加水分解
は、グリコシダーゼによっても最も特異的に行なわれ得
るが、この適用は、例えばストレプトコッカス・ニュー
モニエ（Streptococcus pneumoniae）８のような、関連
するグリコシダーゼが知られている比較的少数の莢膜ポ
リマーに限定されるであろう。酸による加水分解は、グ
リコシド結合の加水分解に一般的に用いられる。このア
プローチの利用性は、ポリマーが酸感受性非グリコシド
結合を有する場合あるいはポリマーが抗原特異性に重要
な酸感受性分岐結合を含む場合には制限される。
結合体の形成は、Schwartz and Gray,Arch.Biochem.B
iophys.181:542−549（1977）に記載される還元アミノ
化法によって行なわれる。簡単に述べると、この方法
は、還元莢膜ポリマーフラグメントと細菌の毒素または
トキソイドを、シアノボロハイドライドイオンの存在下
で、あるいは対象の還元末端を還元することも毒素また
はトキソイドあるいは莢膜ポリマーに悪影響を及ぼすこ
ともないその他の還元剤の存在下で、反応させることを
含むものである。シアノボロハイドライドイオン（ある
いはその同等物）は、加水分解された莢膜ポリマーフラ
グメントのカルボニル基とタンパク質のアミノ基との間
で形成されるシッフ塩基中間体の緩和な選択的還元剤と
してのみ作用する。それゆえに、活性な分子が最終製品
の一部を形成する結合剤によって連結される従来用いら
れていた連結法とは異なり、本発明において利用される
シアノボロハイドライド還元アニオンは、最終製品中に
取り込まれない。これは最終製品の潜在的特性を制御す
る見地から重要なことである。共有結合の証拠は、例え
ばPRP部分と担体タンパク質との間の会合が、非共有結
合を破壊する極めて高い能力を有する8M尿素の存在下で
のタンパク質の塩析にもかかわらず、持続するという事
実によって証明される。
好ましい担体タンパク質は、若い哺乳動物への投与に
安全でありかつ担体として免疫学的に有効なものであ
る。安全性は、一次毒性の欠如およびアレルギー性合併
症の最小化された危険性を含むものである。ジフテリア
および破傷風トキソイドはこれらの基準を満たすもので
ある。すなわち、適切に調製されると、これらは無毒性
であり、またアレルギー性反応の発生率も十分に検討さ
れている。アレルギー性反応の危険性は成人にとっても
かなり重要になってくるが、それは幼児に対して最小化
されている。
「担体効果」において、弱い抗原またはハプテンは、
担体としてのより強い抗原（すなわち、異種タンパク
質）に結合されることによって、単独のときよりも強い
免疫原性をもつようになる。動物が予め該担体のみで免
疫されている場合、担体抗原のみならず結合したより弱
い抗原に対する高められた応答に関してその動物は感作
されたことになる。幼児は破傷風およびジフテリアトキ
ソイドで慣例的に免疫感作される。それゆえに、彼ら
は、これらのトキソイドのいずれかに結合された莢膜ポ
リマー抗原のその後の提示に関して感作されるだろう。
通常、任意の異種タンパク質が担体抗原として役立ち
得る。しかしながら、破傷風およびジフテリアのような
いくつかの細菌毒素は、これらが２つの部分から構成さ
れ、その一方（結合サブユニット）が、哺乳動物細胞表
面へ結合するための強い親和力を有しているということ
において付加的な利点を有する。考えられるところで
は、このような「結合」タンパク質への結合は、担持さ
れた抗原に、免疫系の細胞による応答をより効果的に開
始させるであろう。
莢膜ポリマーが結合される担体タンパク質は、天然の
毒素または無毒化された毒素（トキソイド）であり得
る。また、比較的最近の突然変異技術によって、毒素と
抗原的に類似しているが無毒性である遺伝的に変更され
たタンパク質が産生されている。これらは「交差反応物
質」またはCRMと呼ばれている。CRM197は、これが天然
のジフテリア毒素からの単一アミノ酸変化を有するもの
であり、それと免疫学的に区別のつかないものであるこ
とから注目に値する。
莢膜ポリマーの天然の毒素への結合は毒性を低減する
であろうが、有意な毒性が残存するかもしれない。それ
ゆえに、さらに脱毒性化が必要とされる。タンパク質毒
素の周知の脱毒性化は、タンパク質の遊離アミノ基と反
応するホルマリンを用いるものである。しかし、残留毒
性が依然として考慮される。さらにまた自然再毒性化が
個々のロットのワクチンの場合に起こることがあり、こ
のアプローチに関係した論争を残している。
あるいはまた、天然の毒素は、莢膜ポリマーへの結合
の前に、従来のトキソイドを生成するためにホルマリン
で脱毒性化され得る。しかしながら、従来のホルマリン
処理は、莢膜ポリマーフラグメントの還元基との反応に
有効な遊離アミノ基の数を低減する。それゆえに、CRM
類は、それらのアミノ基のいずれもホルマリンによって
占有されておらず、しかも従来の毒性を有していないと
いう点で顕著な利点を有する。更なる利点はCRM類を用
いる作業には何ら生物災害が存在しないことである。
免疫学的に天然の毒素と同一であるCRM197の場合、
（無毒化する必要はないにもかかわらず）ホルマリンで
の処理は免疫学的応答を極めて高めるものである。これ
は、生体機構による分解に対する分子の安定化および／
または架橋による凝集（粒子の免疫原性はサイズと共に
増加する）に起因するものであると考えられる。
すべての上記の理由により、破傷風およびジフテリア
毒素が担体タンパク質として最良の候補であるが、さら
に、また好ましいものであるその他のものもある。これ
らその他のものは、ジフテリアおよび破傷風で見い出さ
れた安全性の歴史を有していないであろうが、これらを
使用するためのその他の圧倒的な理由があるだろう。例
えば、それらは担体としてさらにより一層効果的であ
る、あるいは製造上の経済性が顕著であるなどである。
担体としてその他の候補は、シュードモナス、スタフィ
ロコッカス、ストレプトコッカス、百日咳菌および大腸
菌の毒素を含むものである。
ワクチンを処方するための好ましい担体物質には、リ
ン酸ナトリウム緩衝化食塩水（pH7.4）あるいはpH6のリ
ン酸ナトリウム緩衝化食塩水中に懸濁された0.125Mリン
酸アルミニウムゲルならびにその他の周知の媒質が含ま
れる。
一般的に、約５〜約100μｇ、好ましくは約10〜50μ
ｇを含有するワクチンが、若い恒温哺乳動物において莢
膜ポリマーに対する抗体の有効なレベルを引き出すのに
望ましい。もちろん、正確な投与量は、日常的な投与量
／応答実験によって決定されるであろう。連続的に与え
られた数回の少ない投与量が１回注射として与えられた
結合体の同量よりも優れたものであることが期待され
る。
本発明のワクチンは、任意の年齢の恒温哺乳動物中へ
注射によって投与され、そして特に、ヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型、大腸菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、スト
レプトコッカスおよびシュードモナス病原体によって引
き起こされる若い哺乳動物における全身性感染に対する
能動免疫を誘導するために適用される。
本発明はまた、エンテロトキシン産生性細菌株のエン
テロトキシンの完全に無毒性の生物学的不活性なサブユ
ニットを産生するための遺伝子スプライシング方法論の
使用に関するものである。精製後に、このLT−Ｂサブユ
ニットは多価抗血清の製造のための免疫原として使用さ
れ得る。このような抗血清は、大腸菌、コレラ菌あるい
はコレラ様エテロトキシンを産生するその他の細菌株に
よる腸内感染をその原因として有する下痢症のヒトある
いはその他の哺乳動物種における予防および治療への用
途を有する。この抗血清はまた、このような微生物のコ
レラ様エンテロトキシンの存在に関する診断試験の製剤
として有用である。あるいはまた、LT−Ｂサブユニット
は免疫原生結合対の製造に関する担体として使用され
る。
説明のために、本発明の手法は、１つの実施例として
大腸菌の１つの特定のエンテロトキシン産生性株を用い
て詳述される。この微生物がヒト単離物であるという事
実は、ヒトへの使用により効力のある抗血清へと導くも
のである。しかしながら、ヒトの、ブタのあるいは他の
起源のものであろうとなかろうと、多くのエンテロトキ
シン産性株の毒素の匹敵するサブユニット間には強力な
交差反応性があることを強調しなければならない。それ
ゆえ、本発明は、この目的のためのこれらの任意のもの
の潜在的使用を意図するものであり、そして本明細書中
で述べられた方法はこれらすべてに均等に適用できるも
のである。
本発明の方法は、論理的筋道において、（１）LT−Ｂ
をコードする遺伝子またはそのフラグメントの同定およ
び単離、（２）この遺伝子またはそのフラグメントの適
当なクローニングベクターへの挿入、（３）この遺伝的
に変更されたクローニングベクターの適合性単細胞宿主
生物への移入、（４）挿入された遺伝子配列を複製しか
つ発現し得る適当に修飾された宿主の選択および培養、
（５）遺伝子産物の同定および精製、（６）抗体産生の
ための遺伝子産物の使用、ならびに（７）治療、予防お
よび診断目的への特異的抗体の使用、を含むいくつかの
段階を伴うものである。
5.1. LT遺伝子の同定および単離 LTおよびそのサブユニットの産生に関する遺伝子は、
エンテロトキシン産生性大腸菌株のプラスミド（Entプ
ラスミド）上に担持される。それゆえ、エンテロトキシ
ン誘発性下痢症に悩まされているヒトあるいは他の哺乳
動物種からの糞便試料は必須な遺伝子配列の粗製の供給
源として役立つ。これらの源からの単離物は、当業者に
十分公知である標準微生物学的技術を用いて十分な量で
増殖され得る。残念ながら、エンテロトキシンをつくる
能力は、Entプラスミドを担持しかつエンテロトキシン
を産生する大腸菌株に何ら選択的価値を付与しない。そ
れゆえ、大腸菌Ｋ−12のような安定な実験室株中へEnt
プラスミドの移入を監視するために、望まれる第１段階
として、ある方法でプラスミドを標識することが必要で
ある。
本発明の例示的実施態様において、大腸菌H10407のヒ
ト単離物のプラスミドは、Sansonettiら（Infect.Immu
n.34:75（1981））によって述べられたようなF'tslac::
Tn5プラスミドからの転位によって表現型的に標識をつ
けられた。この標識されたプラスミドは、次に、Ｋ−12
株711への接合によって移入され、そしてLT産生性トラ
ンスコンジュガントが選択された。このトランスコンジ
ュガントは、Gylesら（J.Infect.Dis.130:40（1974））
がH10407においてエンテロトキシンを産生するプラスミ
ドに特有なものであることを示したサイズ（６×107ダ
ルトン）の２つの大きなプラスミドを含むものであっ
た。
トランスコンジュガントがLTを産生した事実の証明
は、LTに対して産生された抗体を用いて、酵素結合免疫
吸着検定法（ELISA）によって、および培養マウスＹ−
１副腎細胞における形態学的変化の誘導により測定され
るような生物学的活性によってなされた。このように移
入されたプラスミドは、BolivarとBackmanの清澄化溶解
物技術（cleared lysate technique）（Methods in Enz
ymology68:245−267（1979））によって単離され、そし
て特定のLT遺伝子配列が制限エンドヌクレアーゼ切断に
よって単離された。
例示的実施態様においては、精製されたENTプラスミ
ドは、制限エンドヌクレアーゼPst Iで切断されたが、L
T産生（その後のLT−Ｂ産生）が重要な遺伝子領域の切
除によって破壊されない限り、どのような制限酵素また
はこれらの組合せを用いてもよい。選択された特定の酵
素は、用いられたクローニングベクターを１回切断する
ものであることが好ましい。この第２の要求を満たすこ
とは、多くの常用されるクローニングベクターの詳細な
制限マップが得られるゆえに、容易に達せられる。
適当な切断が、ENTプラスミドおよびクローニングベ
クター（本実施例ではプラスミドpBR322）においてPst
Iによってなされると、LT遺伝子フラグメントを、適当
な結合酵素の使用によってクローニングベクターに結合
させた。代表的な結合酵素としては、大腸菌およびバク
テリオファージT4由来のDNAリガーゼがある。このよう
な酵素は補因子としてのATPあるいはNAD+と共に、新し
いホスホジエステル結合を形成する。
LTのDNAフラグメントを含むこれらの組換え型DNA分子
での宿種細菌細胞の形質転換は必要なコピー数のDNAの
形成をもたらし、次に該DNAは上記したようなLTの産生
について分析されたり、あるいはLT−Ｂのみの産生をコ
ードする特定の遺伝子フラグメントのその後の単離のた
めのプラスミドDNAの供給源として使用される。
LTのDNAの制限フラグメントのクローニングベクター
への挿入は、ENTプラスミドおよび上述のクローニング
ベクターが同じ制限酵素で切断された場合には相補的DN
A末端が形成されることから、容易に達成することがで
きる。これが達成されない場合には、一本鎖DNAを消化
して平滑末端を形成させることにより、あるいは一本鎖
末端を適当なDNAポリメラーゼで修復して同様の結果を
達成することにより、得られた切断末端を修飾する必要
がある。この方法では、T4リガーゼのような酵素での平
滑末端の連結反応が行なわれる。あるいはまた、DNA末
端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結させることに
よって希望の部位を形成することもできる。このような
リンカーは、制限部位認識配列をコードする特定のオリ
コヌクレオチド配列から構成される。切断されたベクタ
ーおよびLTのDNAフラグメントはまた、Mollow（Methods
in Enzymology68:3（1979））によって述べられるよう
なホモポリマーテイリング（homopolymeric tailing）
によっても修飾され得る。
LT遺伝子またはそのフラグメントの別の単離法として
は、遺伝子配列（公知である場合）の化学的合成あるい
はLT遺伝子をコードするメッセンジャーDNAに相補的で
あるDNAの調製などが含まれるが、もちろんこれらに限
定されるものではない。
5.2. LT−Ｂ遺伝子の同定および単離 LT−Ｂの産生をコードする遺伝子フラグメントは、LT
−Ａの産生をコードする遺伝子フラグメントに隣接しそ
して下流に位置する。これらの特定の遺伝子フラグメン
トに隣接する制限エンドヌクレアーゼ部位はLT遺伝子内
に多数存在する。それゆえ、制限酵素は、研究下にフラ
グメント（LT−Ｂ）の構造遺伝子を切断しないものが選
ばれる。
ひとたび同定されて単離されたら、LT−Ｂ遺伝子また
は遺伝子フラグメントは、挿入された遺伝子配列の転写
および翻訳に必要な要素を含む適当な発現ベクター中へ
挿入される。LT−Ｂサブユニットのためのプロモーター
領域は、通常Ａサブユニット遺伝子によって供給され、
そしてこの毒性産物は回避されるべきであるがゆえに、
発現ベクターは、LT−Ｂ遺伝子と連続して読まれ得るそ
れ自体のプロモーターを含むべきである。LT−Ｂ遺伝子
が挿入され得るプラスミドの多くは、このようなプロモ
ーター領域、プラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性
遺伝子およびプラスミドpUC8の1ac遺伝子（これらは２
つの例にすぎない）を含むものである。
さらに、LT−Ｂ遺伝子または遺伝子フラグメントの効
率のよい転写は特定の開始信号の存在に依存する。通常
用いられる１つの信号はATG配列である。ATG配列の供給
源は大腸菌ファージλのcroもしくはＮ遺伝子および大
腸菌のトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢもしくはＡ遺伝子
などを含むが、もちろんこれらに限定されるものではな
い。このような開始配列はLT−Ｂ遺伝子またはフラグメ
ントが挿入され得る他の遺伝子配列の多くの中に見い出
され、また合成的に製造することもできる。
強力な翻訳は、十分なリボゾーム結合を促進するシャ
イン−ダルガルノ（SD）配列の利用可能性に結びつけら
れる。このようなSD配列は、効率のよいメッセージ読み
出しのために、プロモーターと開始信号の間に挿入され
ねばならない。目的とするLT−Ｂタンパク質の高レベル
の産生は、それゆえ、プロモーター、SDおよび開始配列
より下流のLT−Ｂ遺伝子配列の挿入に依存する。
これらの要求に合致する数多くのクローニングベクタ
ーを用いることができ、SV40、アデノウイルス、酵母、
ラムダgt−WES−ラムダＢシャロン4Aおよび28、ラムダg
t−１−ラムダＢ、M13誘導ベクター、例えばpUC8、pUC
9、pUC18およびpUC19、pBR313、pBR322およびpBR325、p
AC105、pVA51、pACY177、pKH47、pACYC184、pUB110、pM
B9、ColE1、pSC101、pML21、RSF2124、pCR1またはRP4が
これに含まれるが、もちろんこれらに何ら限定されるも
のではない。
これらのクローニングベクターの多くは、pBR322にお
けるアンピリシンおよびテトラサイクリン耐性ならびに
pUC8におけるアンピリシン耐性およびβ−ガラクトシダ
ーゼ活性などのような、希望する形質転換体の選択に用
いられ得る１ないしそれ以上のマーカー活性を含んでい
る。かかるベクターを挿入する宿主細胞が、このような
活性を全く含んでいない場合、および活性の１つがLT−
Ｂ遺伝子または遺伝子フラグメントの挿入によって失な
われた場合に、選択は非常に容易になる。
組換えクローニングベクターの宿主細胞への移入は種
々の方法において実施され得る。選ばれた特定のベクタ
ー／宿主細胞系に依存して、このような移入は形質転
換、形質導入またはトランスフェクションによってもた
らされる。
産生されたLT−Ｂサブユニットの質および量に応じ
て、１ないしそれ以上のクローンが調製されるべきであ
る。本発明の例示的実施態様においては、LT−Ｂ遺伝子
を連続して２つのプラスミドpBR322中にそして最終的に
プラスミドpUC8中に移入することが必要であった。この
複数のクローニング連続工程は、すべてのクローンがLT
−Ｂタンパク質が産生したが、pBR322組換え体が低レベ
ル（約1mg/L）のLT−Ｂを産生しそして毒性の遺伝子産
物をもたらしたという事実によって必要とされた。この
毒性は、下記第6.7.2節において詳述されるY1副腎細胞
検定系における分析によって明らかにされた。この毒性
の根拠は理解されていないが、毒性を示すLT−Ａサブユ
ニットは調製物中に検出されなかった。
本明細書中に述べる特定の実施態様においては、野生
型エンテロキシン産生性大腸菌株中に存在するよりも50
倍高いレベルで最終LT−BNT産生が達せられた。
5.3. LT−BNTの精製 大腸菌Ｋ−12において産生された場合、LT−BNTは細
胞周辺腔にとどまる。それゆえ、本発明の望まれるサブ
ユニット産物を遊離させるために外膜を破壊することが
必要となる。これは好ましくは、音波処理によって、あ
るいは、フレンチプレッシャーセルのような他の機械的
破壊手段によって達せられる。
細胞破壊はまた、化学的または酵素的手段によっても
達成され得る。２価カチオンが細胞膜完全性にしばしば
要求されるゆえに、EDTAやEGTAのような適当なキレート
化剤での処理は、細胞からのLT−BNTの漏出を促進する
のに十分な破壊を与えるであろう。同様に、リゾチーム
のような酵素がLT−BNT以外のタンパク質で同様の結果
をもたらすために用いられている。この酵素は細胞壁の
ペプチドグリカン主鎖を加水分解する。しかしながら、
以下に述べる本発明の特定の例示においては、リゾチー
ムの回収可能なLT−BNTの60％損失をもたらした。
浸透圧ショック法もまた用いられ得る。簡単に言え
ば、これは、初めに、細胞から水を失わせてそれを収縮
される高張液中へ細胞を入れることによって達せられ
る。これに続いて低張「ショック」液中へ細胞を入れる
と、細胞への水の急激な流入が起こって所望のLT−BNT
が放出されるだろう。
細胞から放出されると、LT−BNTは、硫酸ナトリウム
あるいは硫酸アンモニウムのような塩を用いての沈降反
応、限外濾過あるいは当業者に公知であるその他の方法
によって濃縮され得る。更なる精製は、ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、分離用ディスクゲルあ
るいはカーテン電気泳動法、等電点分画電気泳動法、低
温有機溶媒分画法または向流分配法などを含む（もちろ
んこれらに限定されるわけではない）周知のタンパク質
精製技術によって達成され得る。しかし、精製は、LT、
LT−ＢおよびLT−BNTの固有の特性、つまりアガロース
への結合親和性を利用することによって行なうことが好
ましい。
完全毒素とＢサブユニットの双方がアガロースのガラ
クトシル残基に強固に結合する。それゆえ、LT−BNT
は、アガロースカラムにLT−BNTを含む溶液を通過させ
た後の該サブユニットの選択的保持によって最もよく精
製される。結合させそして緩衝液でカラムを洗浄して他
のタンパク質を除去すると、該サブユニットは、カラム
にガラクトース含有溶液を通過させることにより遊離さ
れる。このアフィニティークロマトグラフィー技術は、
大腸菌Ｋ−12が、ラフ型細菌株であるゆえに、この菌株
の場合に十分に作用する。野生型株は、それらの外膜中
のガラクトシル残基に産生されたLT−BNTを結合し、そ
して極めて少ない量の該サブユニットがこれらの株より
アガロースカラムで回収されるにすぎない。それゆえ、
この技術は野生型株の場合に時折首尾よく用いられた
が、最良の結果は、LT−BNT遺伝子が挿入された大腸菌
Ｋ−12の場合に得られる。
5.4. LT−Ｂに対する抗体の調製および使用 本発明の１つの目的は、組換えDNA技術によるエンテ
ロトキシン産生性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン
の無毒性サブユニットの産生にある。このようなサブユ
ニットは、次にヒトあるいは他の動物の細菌誘発性下痢
感染症に対する防御免疫学的応答を生むためのワクチン
における免疫原として用いられ得る。LT−BNTサブユニ
ットは、すべてのエンテロトキシン産生性大腸菌および
コレラ菌の熱不安定性エンテロトキシンに対し抗原的に
関係するゆえに、このような予防接種は広範な免疫を賦
与する。本発明の産物が生物学的に不活性でかつ完全に
無毒性であるという事実は、完全毒素あるいは微生物を
用いては、たとえ後者が死滅されたあるいは弱毒化され
たものであったとしても、得ることのできない安全性で
使用し得ることを保証するものである。
上記の第5.3.節において述べたような精製の後に、単
離したLT−BNTサブユニットは、ワクチンとして直接に
用いることができ、また適当な濃度で予防接種用のアジ
ュバント中に添加することもできる。このような適当な
濃度は当業者に公知であるか、または日常的な実験によ
って決定できるものである。
動物の予防接種に適当なアジュバントはフロインド完
全もしくは不完全アジュバント（ヒトもしくは家畜の使
用に適さない）、アジュバント65（ピーナッツ油、マン
ニドモノオレエートおよびアルミニウムモノステレート
を含む）、および例えば水酸化アルミニウム、リン酸ア
ルミニウムおよびミョウバンのようなミネラルゲル；例
えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレ
シチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミ
ド、N1−Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ′−Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサ
デシルグリセロールおよびプルロニックポリオール類の
ような界面活性剤；例えば、ピラン、デキストラン硫
酸、ポリIC、ポリアクリル酸、カルボポルのようなポリ
アニオン；例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシ
ン、タフトシンのようなペプチド；ならびに油エマルジ
ョンを含むが、これらに限定されるわけではない。LT−
BNTはまた、リポソームもしくは他のマイクロキャリア
ー中への封入後に、またはポリサッカライド、その他の
タンパク室もしくはポリマーへの結合の後に投与され得
る。
本発明の例示的実施態様は、非常に免疫原性があると
判明したので、高い抗体価がマウスにおいてアジュバン
トの使用なしに得られた（下記第6.11.1.節参照のこ
と）。
この様式における能動免疫によって、家畜、その他の
飼育動物およびヒトの防御が達成され得る。このような
防御は、主として十分量の分泌型IgA応答の発生による
ものである。この理由のため、そして最も下痢感染症を
受けやすいときにヒトおよび他の哺乳類新生児があまり
免疫学的にコンピテントでないゆえに、受動免疫アプロ
ーチを採用することが好ましい。従って、抗LT−BNT抗
血清がヤギ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ウマなどのよう
に広範な哺乳動物種において、あるいは鳥類種において
調製され、そしてIgG分画がプラズマフェレシスあるい
は他の手段によって単離された。この分画は、次に適当
な単体あるいは例えば幼児処理物または幼児穀物などの
ような幼児食物を介してヒト幼児に投与することができ
た。家畜に関しては、免疫グロブリンは、家畜試料ある
いは適当な薬理学的賦形剤中への混合の後に与えること
ができた。特別に関心のある家畜は、新生子ブタ、子ウ
シおよび子ヒツジである。
本発明の免疫グロブリンは、液体または固体の薬理学
的担体のいずれとも混合することができる、また、この
組成物は錠剤、カプセル、粉末、顆粒、懸濁液または溶
液の形態であり得る。この組成物はまた、適当な保存
剤、着色剤および風味剤、あるいは徐放をもたらす試薬
を含むことができる。本発明の薬理学的組成物の調製に
用いられる担体としては、ゼラチンカプセル、糖、カル
ボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース
誘導体、ゼラチン、タルク、ステアリン酸マグネシウ
ム、ピーナッツ油のような植物油、グリセリン、ソルビ
トール、寒天および水などが含まれるが、もちろんこれ
らに限定されるわけではない。担体は、また便利な経口
投与用の組成物の錠剤化を容易にするための結合剤とし
ても作用する。
もちろん、モノクローナル抗体も同様の結果を達成す
るためにこの技術によって調製され得る。Ｂ細胞のよう
な抗体産生能を有する体細胞が、ハイブリドーマ細胞を
形成するために、Ｂ細胞骨髄腫系細胞と融合される。こ
のような細胞は、試験管内であるいは腹水腫として、大
量の特異的抗体を産生するために無限に培養することが
できる。ハイブリドーマ細胞は容易にクローン化される
ため数多くの細胞を迅速に調製することができ、この細
胞のすべてが共通の抗原決定基に対する同一の特異的抗
体分子を産生する。抗体産生におけるこの例外的な均一
性は、抗体を特異的診断試験に用いる必要がある場合に
有利である。
抗原の注射によって感作された動物のリンパ節および
脾臓はＢ細胞の有効な供給源であり、一方、これらの細
胞を感作されていない動物から取り出し、これらを単離
の後に試験管内で感作することも同様に可能である。マ
ウスおよびラットのＢリンパ球がハイブリドーマの形成
にもっとも頻繁に用いられるが、ウサギ、ヒト、カエル
または他の動物からの細胞も代わりに用いられ得る。本
発明の好ましい実施態様においては、試験管内でLT−BN
Tに感作されたマウス脾臓細胞を用いて融合細胞ハイブ
リッドを形成する。
多くの特殊な骨髄腫細胞系が、ハイブリドーマの形成
に使用するためにリンパ球性腫瘍から開発された（Kohl
er and Milstein,Europe.J.Immunol.6:511−519（197
6）;Shulmanら,Nature576:269−270（1978））。開発さ
れた多くのこのような細胞系の中で、P3/X63−Ag8、P3/
NSI/1−Ag4−１、Sp2/0−Ag14およびS194/5,XXO.BU.1が
頻繁に用いられている。本発明の実施例においては、X6
3−Ag8.653と呼ばれるマウス骨髄腫細胞系が好ましい。
ハイブリドーマを形成するための、抗体産生脾臓ある
いはリンパ節細胞と骨髄腫細胞との融合は、20:1程度の
高さでありうる骨髄腫細胞よりも脾細胞またはリンパ球
過剰な状態において通常行なわれるが、典型的にはより
低い割合が用いられる。融合は、紫外線不活化センダイ
ウイルスまたはポリエチレングリコール（PEG）などの
ような融合促進剤の使用によって促進される。Gefterら
（Sonatic Cell Gennt.3:231−236（1977））は、ジメ
チルスルホキシドとPEGとの組合せがさらに細胞融合を
高めることを報告している。紫外的に高い効率で細胞を
融合し得る電気的用具も利用できる。
融合が起こると、ハイブリドーマ細胞は融合されなか
った親細胞株から選択されねばならない。この選択プロ
セスは、ハイブリドーマ細胞の増殖を支持するが親細胞
の増殖を支持しない培地中での細胞培養によって容易に
達成される。融合に用いられた体細胞のＢ細胞は限定さ
れた培養寿命を有し、それゆえにこれらが老衰および死
滅を受ける時に失なわれるが、無限に培養寿命を有する
親骨髄腫細胞は特別の選択技術によって排除する必要が
ある。
本発明の実施例においては、ヒポキサンチンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼを欠いた（HPRT-）骨髄腫細
胞が用いられた。これらの細胞は、ヒポキサンチン遊離
塩基の再利用に関するスカベンジャー経路を欠き、そし
てアミノプテリンのような阻害剤をプリン合成経路の阻
止のために用いる場合には、生存できないものである。
かくして、骨髄腫親細胞はヒポキサンチン／アミノプテ
リン／チミジン（HAT）培地中で融合混合物を培養する
ことによって選択され、一方ハイブリドーマ細胞は抗体
産生性融合親細胞によるHPRTの貢献により生き残るだろ
う。
選択培養期間の後、生存するハイブリドーマ細胞はク
ローン化され、株は標準細胞培養法によって増殖され、
そして所望の特異的免疫グロブリンを産生するクローン
は、抗原（これに対して抗体が誘導された）の使用に基
づいた酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、あるいはそ
の他の試験によって検出される。
本発明の使用によって得られる抗LT−BNT抗体はさら
にエンテロトキシン診断試験の材料として用いられ得
る。このような診断系は、遊離溶液あるいは固相におけ
るラジオイムノアッセイ（放射線免疫検定法）の形態を
取り得る。あるいはまた、酵素結合免疫吸着検定法がイ
ムノブロット分析に基づく検定法と同じく作成され得
る。これらの検定法は直接のものであっても、あるいは
抗LT−BNT抗体に対して誘導された第２抗体を用いる間
接のものであってもよい。多数の酵素活性を抗体に結合
させることができ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホス
ファターゼなどがその例である。当業者はまた、例えば
いくつかの凝集試験の１つにおけるような、診断学的立
場において抗LT−BNT抗体が利用されるその他の多くの
用途があることを認識できよう。このような凝集検定に
おいては、抗体と任意のコレラ様エンテロトキシン産生
性細菌のエンテロトキシン（あるいはその結合サブユニ
ット）との相互作用は、粒子が抗LT−BNT抗体で被覆さ
れている系を用いて検出される。このような粒子は、ラ
テックスビーズ、リポソーム、赤血球、ポリアクリルア
ミドビース、あるいはいくつかの適当なポリマーの任意
のものであり得る。
以下は、本発明のおよびLT−Ｂの典型的な免疫原性結
合体の調製に関する方法、ならびにこれらのワクチンに
おける使用の非限定的な実施例である。
6. 実施例 6.1. 還元末端基を含むPRPの大、中および小フラグメ
ントの作製ならびにCRM197への結合 ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の莢膜ポリマー
は、繰返し単位［−３−β−Ｄ−リボシル（１−１）リ
ビトール（５−ホスフェート）−］を有する線状ポリマ
ー（PRP）である。一般に、PRPの加水分解は、全リボー
ス対還元リボースの比が25ないしそれ以下に下降するま
で行なわれる。得られたサイズ混合フラグメントは、結
合のために、望まれるサイズ範囲のフラグメントを単離
する分子ふるいカラムクロマトグラフィーによって分画
化される。フラグメントを得るための方法は以下の通り
である。
a.リボース28.6mgを含有するナトリウムPRP（核酸含量
0.006％）の試料を、蒸留水で溶解して125mlエルレンマ
イヤーフラスコ中に全容量9.2mlとなし、そして氷中で
冷却した。
b. 0.1NのH2SO4を1.02ml加えた。
c.酸性化PRPの0.01mlの２通りの試料を、氷上に保持し
た試験管へ移した（０分）。
d.このフラスコを沸騰水浴中へ３分間移し、次に氷水浴
中で冷却した。
e.ステップｃを繰り返した（３分試料）。
f.試料は、Ｄ−リボースを標準化されたアルカリフェリ
シアン化物法によって還元力について検定した。
g.この結果（第１表参照）に基づいて、ステップｄを繰
り返した。
h.ステップｃを繰り返した（６分試料）。
i.ステップｆを繰り返した。
結果（第１表参照）は、加水分解の唯一の形式が（１
−１）グリコシド結合で起こったと仮定すると、数平均
鎖長は21.4モノマー単位、すなわち（リビトール−５−
ホスフェート−３−リボース）であることを示した。
j. 1NのNaOHを0.102ml加え、そしてpHを試験紙によって
測定した（約pH6）。
k.中性化した加水分解物を凍結乾燥した。
l.バイオ−ゲルP10（Bio−Rada社）を0.1Mトリエチルア
ンモニウムアセテート中で平衡化し、そして直径1.5cm
のクロマトグラフィーカラムに注入し、98cmのゲル床の
高さを得た。
m.凍結乾燥した物質（ステップｋ）を水2.7mlで再水和
し、そして1Mトリエチルアンモニウムアセテート0.3ml
を加えた。この溶液を該カラムに入れ、溶出して3.5ml
画分を集めた。
n.リボシル残留物の溶出は、Ｄ−リボースを標準として
用いるオルシノール反応によりリボース含量についてそ
れぞれの画分の0.005ml試料を検定することによって測
定した。
o.画分を合わせて、第２表に示すようなＬ、ＭおよびＳ
の３つのプールとなし、そして該プールを全リボースお
よび還元リボースについて検定した。
p.該プールを凍結乾燥し、水10mlで再水和し、再凍結乾
燥し、そして水1.5mlで再水和した。最終溶液1.2mlを微
量遠心分離管へ移し、そして結合反応のための調製物に
凍結乾燥した。
PRPの還元フラグメントへのCRM197の結合 a.凍結乾燥したフラグメントＬ、ＭおよびＳを含有する
微量遠心分離管ならびに空の遠心分離管（Ｃまたは対
照）へ、リン酸カリウム緩衝液pH8、CRM1972.7mgおよび
ナトリウムシアノボロハイドライド4mgを添加し、そし
て最終容量を0.2mlとなし、リン酸緩衝液を0.2Mとし
た。
b.該管を毎日混合しながら37℃でインキュベートした。
c. 18日後に、該管を7000Gで２分間遠心分離した。
d.タンパク質の大部分が沈澱したことを確認した後、沈
澱物を1ml以下の水で４回洗浄した。
e.洗浄した沈澱物は尿素中8Mとなし、50℃に温め、食塩
水に対して４℃で１晩透析し、そして遠心分離した。上
澄み液を分離しそして硫酸アンモニウムで95％飽和とな
し、４℃で１晩保持し、そして遠心分離した。得られた
沈澱物は95％飽和硫酸アンモニウム0.4mlで３回洗浄
し、そして水1mlに懸濁した。これらのコロイド状懸濁
液は、それぞれCRM197−PRP−Ｌ、CRM197−PRP−Ｍ、CR
M197−PRP−ＳおよびCRM197−Ｃと表記された。
f.該調製物は、ウシアルブミンを標準として用いるフォ
リンフェノール反応によってタンパク質に関して、また
Ｄ−リボースを標準として用いるオルシノール反応によ
ってリボシル残基に関して検定した。結果を第３表に示
す。該調製物は、PRP抗原活性に関して、ヒト抗PRP抗体
への標識天然PRPの結合を阻止するそれらの能力（50μ
ｇタンパク質/mlの濃度において）によって検定した
（第３表）。
このようにCRM197をPRPフラグメントなしにシアノボ
ロハイドライドにさらした対照調製物が予想したとおり
に不活性であったのに対し、試験したすべてのPRPフラ
グメントとCRM197との結合体は抗原的に活性であった。
調製物は、高分子量の精製PRPと比較して、ウサギに
おける免疫原性について検定され、その結果を第４表に
示す。PRP対照またはCRM197−Ｃ対照を与えられたウサ
ギは、抗PRP抗体の検出可能な増加をほとんどもたらさ
なかった。３種のCRM197−PRP結合体のいずれかを与え
られたウサギは、それぞれの注射の後に漸進的な増加を
もたらし、３回目の注射の後の力価は免疫前よりも1000
倍も大きなものであった。示してない実験において、CR
M197とPRPフラグメント調製物Ｌの単純混合物をウサギ
において検定したところ、抗PRP抗体を誘起しないこと
が分かった。
結合体によって誘導された抗PRP抗体の防御能は、第
４表のウザギ血清の殺菌活性を試験することによって評
価された。殺菌価は、Andersonら,Journal of Clinical
Investigation,Volume65,pp.885−891（1980）に記載
される方法によってヘモフィルス・インフルエンザｂ株
Eagに対して測定された。第５表は、予防接種前に、血
清が細菌を殺すことができなかった（逆力価＜２）こと
を示す。３回の注射の後、CRM197−PRP結合体を与えら
れたウサギの逆力価は16ないしそれ以上に上昇したが、
一方CRM197対照を与えられたウサギの力価は２未満にと
どまった。
6.2. CRM197に対するPRPフラグメント比の変化 この実施例では、CRM197に対するPRPフラグメントＳ
の比を変化させ、そしてPRP成分に加えてCRM197成分の
抗原活性の保持を調べた。
CRM197−PRP−Ｓ＃２、ＡおよびＢの調製 a.微量遠心分離管ＡおよびＢに、上記（すなわちステッ
プｏおよびｐ）のフラグメントＳの溶液0.15mlをそれぞ
れ加えた。該溶液を凍結乾燥させた。
b.管Ａに、2Mリン酸カリウム緩衝液pH8の0.015ml、0.01
Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中の5mg/mlCRM197の0.1m
l、および200mg/mlナトリウムシアノボロハイドライド
の0.015mlを加えた。
c.管Ｂに該pH8緩衝液0.002mlおよびCRM197溶液0.1mlを
加えた。得られた溶液を凍結乾燥させた。この固体を水
0.015mlで懸濁させ、そしてpH8緩衝液0.002mlを加え
た。
d.管ＡおよびＢは37℃で13日間インキュベートした。管
Ｂに追加のシアノボロハイドライド0.002mlを添加し
た。双方の管を37℃でさらに３日間インキュベートし
た。（減少した反応容量のために、Ｂにおける反応物の
濃度はＡのものよりも高くなったことに注意された
い。） e. Aに対し、水0.06mlおよび飽和硫酸アンモニウム（SA
S）0.8mlを加えた。Ｂに対しては、水0.175mlおよびSAS
0.8mlを加えた。
f.該管を０℃で１時間インキュベートし、そして8000G
で20分間遠心分離した。上澄み液を除去した。
g.沈澱物を80％SAS1ml中に懸濁させ、8000Gで20分間遠
心分離し、そして上澄み液の除去によって洗浄した。
h.沈澱物を水0.1mlで懸濁し、そしてSAS0.4mlを添加し
た。
i.ステップｆと同じ。
j.ステップｇと同じ。
k. Bにおける沈澱物を9.5M尿素0.084mlで溶解し（最終
濃度は8Mと見積られた）、水0.1mlおよびSAS0.8mlを添
加し、そして沈澱物をステップｆのようにして単離し
た。この沈澱物はステップｇのようにして洗浄した。
l. AおよびＢにおける沈澱物を水0.2mlで懸濁させた。
懸濁液は8000Gで30分間遠心分離することによって可溶
性（ｓ）画分および不溶性（ｉ）画分へ分離し、そして
ｓ画分（上澄み液）を0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液pH
となし、貯蔵した。
m. i画分（沈澱物）を、以下のようにしてより可溶性に
した:i画分を尿素中8Mとなし、その後0.01Mリン酸ナト
リウム緩衝液pH7に対する透析によって段階的に尿素を
除去した。得られた溶液はそれぞれのｓ画分と合わせ
た。
n.調製物ＡおよびＢは、フォリンフェノール試薬でタン
パク質含量について、また上記した検定法によってPRP
抗原活性について試験した。以下に示すように、双方と
もPRP活性を有するが、ＢはＡよりも約13倍優れてい
た。 調製物 ngPRP当量／μｇ CRM197−PRP−Ｓ＃2,A 0.038 CRM197−PRP−Ｓ＃2,B 0.50 o.調製物ＡおよびＢはマサチューセッツ・デパートメン
ト・オブ・パブリック・ヘルスによって供給された精製
ジフテリアトキソイド試料への抗体の結合の阻止によっ
てCRM抗原性（ジフテリアトキソイド（DT）としての活
性）について試験した。以下に示すように、双方とも、
重量に基づいた場合、概ねDTと等しい活性を有するが、
ＢはＡよりも約４倍近く優れていた。
p.調製物ＡおよびＢを、16μｇタンパク質/mlで0.0125M
リン酸アルミニウム緩衝液pH6中に懸濁し、第４表に記
載したプロトコール（ただし、動物は開始時に８週齢で
あり、またジフテリアトキソイドの予備注射によって感
作されていなかった）において、３回の0.5ml注射をウ
サギに与えた。血清はステップｏに記載した結合検定法
において抗体について試験した。ＡおよびＢの双方と
も、第６表に示すように、DTに対するならびにPRPに対
する抗体を誘導した。別の対照実験から、CRM197調製物
を注射しない状態において同じ宿舎で同様に飼育したウ
サギは抗DT抗体価のこのような増加を示さないことが分
かった。
6.3. PRPの非常に小さなフラグメントのジフテリア毒
素、ジフテリアトキソイド,CRM197およびLT−BNTへの結
合 還元末端基を有するPRPの非常に小さなフラグメントの
形成 a. PRPロット20の溶液12mlを０℃でHCl中0.1Mとなし、
ガラス製フラスコ中に封入した（０分）。
b.該フラスコを沸騰水浴中に４分間移し、次に氷水浴中
で冷やした。
c.少量の生成した白色コロイドをエーテル抽出によって
除去し、得られた透明な溶液を凍結乾燥した。
d.バイオ−ゲルP10（Bio Rad社）を0.01M酢酸アンモニ
ウムで平衡化し、そして直径1.5cmのクロマトグラフカ
ラム中に注入し、98cmのゲル床高さを得た。
e.凍結乾燥した物質を水1.5mlで再水和し、そしてNH4OH
で中和した。この溶液を該カラムにかけて、溶出を行っ
た。
f. 2.0〜2.4のVe/Vo範囲で溶出するフラグメントを集
め、画分vsと名づけた。
g.画分vsの供給量を２倍とするために、ステップａ〜ｆ
を繰り返した。
h.合わせた画分vsを凍結乾燥し、再水和して、Ｄ−リボ
ースで標準化したアルカリフェリシアン化物法によって
検定した場合に合計47μmolの還元糖活性を含む溶液4ml
を得た。
PRP−vzフラグメントと天然ジフテリア毒素、天然ジフ
テリアトキソイド、CRM197およびLT−BNTとの結合体の
調製 以下のタンパク質を本実施例において担体として使用
した。
（１）DTx−精製ジフテリア毒素、ロット１。Massachus
ettes Public Health Biologic Laboratoriesより入
手。部分的脱毒性化をPRPvsへの結合により行う。残留
毒性はPappenheimerら,Immunochemistry,9:891（1972）
の方法によってリシンの存在下におけるホルマリン処理
によって除去する。
（２）DTd−通常の（公式）トキソイド、ロットDCP−2
7。Massachusettes Public Health Biologic Laborator
iesより入手。
（３）CRM197−抗原的に変異された毒素タンパク質で、
毒素と抗原的に区別できないが無毒性である。
（４）LT−BNT−大腸菌LTエンテロトキシンの精製した
無毒性の結合サブユニット。下記の第6.7〜6.10節にお
いて述べるようにして調製される。
結合方法は以下の通りである。
a.タンパク質、リン酸カリウム緩衝液（25℃でpH8.0に2
M KOHで滴定された2M KH2PO4）およびPRPvsを、次に
示す様式においてガラス製遠心分離管中で組み合わせ
た。
b.溶液（１）〜（３）を凍結乾燥し、そして凍結乾燥物
を以下に表として示されるように２％w/v NaCNBH2水溶
液で溶解した。溶液（４）は凍結乾燥せず、単に表示し
た成分を用いて指示容量に調製した。溶液（４）pHは8.
0であった。溶 液 ２％ NaCNBH3 （１） 1.2ml （２） 1.2ml （３） 0.4ml （４） 0.5ml c.該管を37℃でインキュベートした。
d. 14日（LT−BNTに関しては38℃で18日）後に、飽和硫
酸アンモニウムの４倍容量当量を添加した。これらの懸
濁液を０℃で３時間保持し、次に9000Gで20分間遠心分
離した。
e.沈澱物を中性の70％飽和硫酸アンモニウム10mlずつで
２回洗浄した。
f.洗浄した沈澱物は、9.5M尿素の最小容量で溶解し、そ
して0.067Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.8に対して透析
した。
結合体のホルマリン処理 a.結合体を0.025Mリシンを含むリン酸ナトリウム緩衝液
に対してさらに透析した。（ホルマリン処理前の毒性試
験のために少量の試料を取っておいた。） b.ホルマリンを添加して0.2％v/vの最終濃度とした。
c.約24℃で17日間（LT−BNTに関しては７日間）のイン
キュベーションの後、溶液をリン酸ナトリウム緩衝液に
対して十分に透析した。
d.遠心分離を行って少量の不溶性物質を除去した。
完成容器製品を得るための手順 a.等張リン酸ナトリウム緩衝液中の抗原溶液（１）〜
（４）を0.22ミクロン“ミレックス（Millex）”フィル
ターユニット（Millipore社）を通過させ、そして滅菌
リン酸緩衝食塩水を含有する瓶に注入した。
b.調製物はローリー法（Lowry method）を用いてタンパ
ク質について検定した。
c.チメロサールを濾過し、そして新たに調製された１％
w/v溶液の1/100容量として該溶液中に注入した。10mlの
試料の滅菌試験のために取っておいた。手動の無菌単回
使用充填具（Multiple Additive Set,Travenol Laborat
ories）へ瓶を取り付けた。2mlガラス瓶を満たし、栓を
し、密封し、そして迅速に移動して４℃で貯蔵した。
結合体調製物に関する検定 a.タンパク質画分のホスフェート含量 PRPはリボシル−リビトール−ホスフェートの繰返し
単位から構成される。それゆえに、５％トリクロロ酢酸
（TCA）によって沈澱可能な画分中のホスフェートの比
色定量検定は、タンパク質へのPRPフラグメントの取込
みの感度のよい指標となる。
タンパク質100μｇを含有する試料を3mlの容量におい
てTCA中５％となるように調製し、氷上に20分間保持
し、そして４℃において2000×ｇで15分間遠心分離し
た。沈澱物を５％TCAの別の3mlで洗浄し、次にエタノー
ル5mlで洗浄した。洗浄した沈澱物は、有機ホスフェー
トを無機ホスフェート（Pi）に変換するために灰化し、
そしてChenら,Anal.Chem.,28:1756（1956）の方法によ
って該Piを定量した。結果は以下の通りである。
b.電気泳動分析 結合体化した抗原の試料を、メルカプトエタノール−
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ME−SDS−PAGE）により、同じゲルにそれぞれの
出発担体タンパク質調製物を並べて分析した。
Dtd−PRPvsは、DTdと同様に、分子量61,000ダルトン
での分散バンドを示した。これに対し、DTx−PRPvsおよ
びCRM197−PRPvsは出発タンパク質とはかなり異なるも
のであった。これら２つの結合体のタンパク質は、スタ
ッキングゲル（４％アクリルアミド）の開始点あるいは
分離ゲル（10％アクリルアミド）の開始点に集まってい
た。かくして、結合体は、恐らくホルマリン処理からの
架橋結合により、巨大分子の凝集体に転化されたと思わ
れる。DTd−PRPvsもいくらかの凝集物質を含んでいる。
LT−BNT−PRPvsの電気泳動分析は、本質的にすべてが
凝集形態にあることを示した。
c.タンパク質１単位あたりのPRP抗原当量 抗PRP抗体と結合する結合体の能力は、PRPロット19で
キャリブレートされた、ヒト抗PRP抗血清による標識PRP
の結合の阻止によって測定した。（タンパク質に結合し
たポリマーフラグメントは高分子量ポリマーに対する重
量−当量形式で抗体に結合すると仮定し得ないので、こ
れらのデータから定量的化学組成を推論することはでき
ない。） d.タンパク質１単位あたりのジフテリアトキソイド抗原
当量 抗DTd抗体と対応する調製物の能力の維持は、LT−BNT
−PRPvs結合体を除くすべてのものに関して、酸素結合
免疫吸着検定（ELISA）（精製DTdを検定用のチューブ
（固相）に付着してある）の阻止によって測定した。付
着したDTdへの抗体結合の阻止は、液相中で用いた同じD
Tdによってキャリブレートされる。
e.ジフテリア毒性活性 もとのDTxならびにホルマリン処理の前および後の結
合体DTx−PRPvsの毒性活性について、非免疫成熟ウサギ
の皮膚への注射によって調べた。0.002μｇおよび0.02
μｇの投与量で、DTxは予期された皮膚病変をもたらし
た。ホルマリン処理前のDTx−PRPvsは投与量依存的病変
をもたらし、0.2μｇが0.002μｇのDTxとほぼ等しかっ
た（結合体形成による毒性の100倍低下）。ホルマリン
処理の後、２μｇ程度の高い投与量によっても病変は発
生しなかった（DTxと比較して少なくとも1000倍の低
下）。結合体DTd−PRPvsおよびCRM197−PRPvsの最高２
μｇまでの投与量を同様に試験したが、病変は発生しな
かった。LT−BNT−PRPvsについては試験は行わなかっ
た。
f.放射性抗原結合により測定された、離乳ウサギにおけ
る抗PRP抗体応答の誘導 抗原をリン酸アルミニウムアジュバント（0.0125MのA
l、pH6）と混合し、0.5mlの投与量がタンパク質25μｇ
を含むようにした。（それぞれの抗原に対して）２匹の
ウサギに７週齢で開始して１週間おきに３回の注射を投
与したが、該ウサギには仮説の「担体感作」効果のため
に５週齢でDTdのみを注射しておいた。すべての動物
は、３回目の予防接種の後に少なくとも10μg/mlの力価
を有して、既往パターンでの抗PRP上昇を示した。ま
た、抗原CRM197−PRPvs、LT−BNT−PRPvsおよびDTd−PR
Pvsは、DTdで「感作」していない１対のウサギにおいて
25μｇのタンパク質レベルで試験した。これらのウサギ
はすべての抗原に関して「感作」ウサギと同様の強力な
抗PRP応答を生起した。
g. ELISAによって測定された、離乳ウサギにおける抗DT
d抗体応答の誘導 前述の分節と同じ「非感作」ウサギ（７〜10）におけ
る抗DTd抗体応答は次の通りである:2回目の注射の後約1
0倍上昇し、３回目の注射の後さらに２〜５倍上昇し
た。
h.試料調製物の無菌生 試料は、増殖培地としてFluid Thioglycollate（BBL
カタログ番号11260、ロットD4D LKL）を用いて測定した
ところ、無菌であることが判明した。
6.4. 幼児用ワクチンとしてのジフテリアトキソイドお
よびCRM197に結合させたPRPフラグメントの使用 １〜２才の年齢範囲の８人の幼児からなる２つのグル
ープ（18カ月でジフテリアトキソイドタンパク質による
定型的予防接種を受けるのを特に免除されている幼児）
は、以下のように一次および二次の予防接種を受けた。
グループＩは前節に記載した調製物のCRM197−PRPvsの
注射（食塩水中にタンパク質25μｇ、皮下）を受け、グ
ループIIは前節に記載した調製物のDTd−PRPvsの注射
（食塩水中にタンパク質25μｇ、皮下）を受けた。
最初の訪問の際に、予防接種前の血液検体を採取し、
幼児に予防接種を施し、その後アナフィラキシー反応の
徴候について20分間観察した。２回目の訪問では、最初
の訪問の際の手順を繰り返した。３回目の訪問では、二
次接種後の血液検体を採取した。各グループから１人ず
つの２人の幼児には、親との相談の後に、PRPに対する
抗体を防御レベルへ高めることを試みるために３回目の
予防接種を施した。予防接種の間の間隔は１±1/2カ月
であった。
グループIIIは、別の部位でジフテリアトキソイドタ
ンパク質と同時にワクチンを受ける約18カ月齢の幼児か
ら構成されていた。このグループは２人の幼児を含み、
１人にはCRM197−PRPvsワクチンを接種し、もう１人に
はDTd−PRPvsワクチンを接種した。
体温の測定、全身性疾病の挙動示唆の表記、および注
射部位の炎症の観察によって、連続４日間にわたり徴候
を記録した。これらの徴候を第７表に要約してある。
CRM197−PRPvsの予防接種後に、１人の幼児が初回予
防接種の晩に軽い熱（99.8゜Ｆ）を出し、また初回と２
回目の予防接種後に１例ずつ、そして３回目の予防接種
後に１例軽い局部的炎症が見られた。DTd−PRPvsの予防
接種後では、初回の１例、２回目の１例に軽い局部的炎
症が見られた。該ワクチンの投与は、他の点では有害反
応がないようだった。
血清抗体応答 PRPに対する抗体ならびにジフテリアトキソイドに対
するIgG抗体を測定した。CRM197−PRPvsによる予防接種
後に、一貫した抗PRP応答パターンが見られた。第８表
を参照のこと。初回の注射の後にはっきりとした上昇が
見られ、２回目の注射の後に通常より大きな上昇が見ら
れ、そして１つの３回目の注射の後に大きな上昇が見ら
れた。最終的力価は、PRPのみでの予防接種によっても
たらされるものをかなり超えており、許容される概算防
御最小レベル0.15μg/mlをかなり超えていた。高められ
た応答は、18カ月齢未満（PRPのみに対する応答が防御
にとって通常不十分である）の４人の幼児において特に
明白であり、そしてこれらの４人における最終力価の幾
何平均（8.4μg/ml）は、PRPワクチンのみによる12〜７
カ月齢幼児の予防接種後に見られるものの175倍であ
る。ジフテリアトキソイドタンパク質と同時に初回予防
接種を受けた幼児も優れた応答を示した。
ジフテリアトキソイドに対するIgG抗体は、８人の幼
児のうち６人（ならびに、処置の一部としてジフテリア
トキソイドをも受け取った９番目の幼児）において増加
した。該抗体レベルはしばしば非常に大きく増加したの
で、用いられた予防接種後の血清の希釈率（1/1000）は
上昇の全範囲を示すのに不十分であった。
DTd−PRPvsによる予防接種に関して、抗PRP応答は一
般的に初回と２回目の双方の予防接種後に増加した（第
９表参照）。しかしながら、全く応答が検知されなかっ
た２人の幼児（12カ月齢および14カ月齢）があり、１人
の幼児は３回目の注射が与えられるまで防御的レベルに
近づかなかった。ジフテリアトキソイドタンパク質と同
時に初回予防接種を受けた幼児は優れた応答を示した。
ジフテリアトキソイドに対するIgG抗体の上昇はすべて
の幼児において見られた。
この実施例は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の
莢膜ポリマーフラグメントとジフテリアトキソイドまた
はCRM197との結合体の注射が危険性のないものらしいこ
とを示すものである。CRM197−PRPvsの予防接種は、高
い力価ばかりでなく２回目の予防接種後の上昇により認
められる、担体効果により抗PRP応答の高まりの明白な
徴候を与えた。
DTd−PRPvsはあまり印象的な抗PRP応答の高まりを示
さなかった。その説明としては、CRM197−PRPvsが多分
子凝集体であるのに対し、DTd−PRPvsはもとのトキソイ
ドと同様な単分子形態で主に存在していることが挙げら
れる。
6.5. ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜ポリマ
ーフラグメントのCRM197への結合 いくつかの他の細菌は、それらが敗血症および髄膜炎
を特に乳児において引き起こすことにおいて、それらが
莢膜ポリマーを有し、それに対する抗体が防御的である
ことにおいて、そしてそれらの莢膜ポリマーが成熟した
ヒトでは免疫原性であるのに乳児においては免疫原性で
ないことにおいて、ヘモフィルス・インフルエンザｂと
類似している。重要な例はストレプトコッカス・ニュー
モニエ（Sp）血清型６である。これは上述のような命を
脅かす感染症を引き起こすのみならず、幼児の中耳炎の
かなり有力な原因菌でもある（Grayら,Journal of Infe
ctious Diseases,Volume142,pp.923−33,1980）。
PRPに関して述べられたアプローチがまた、抗原特異
性を維持しつつ選択的加水分解により還元基を生成し得
る任意の莢膜ポリマーに対して適用可能である。以下の
非限定的実施例においては、莢膜ポリマーフラグメント
を選択的酸加水分解によってSp.6の莢膜ポリマーフラグ
メントから作製し、そしてCRM197に結合させた。該生成
物はSp莢膜ポリマーとCRM197成分の双方の抗原特異性を
保持していた。
莢膜ポリマー（CP）からの還元フラグメントの形成 1. Sp.6のCPの試料（Danish type6A,Eli Lilly社）は、
Ｄ−グルコースで標準化されたフェノール−硫酸法によ
って全ヘキソースについて、そしてやはりＤ−グルコー
スで標準化されたアルカリフェリシアン化物法によって
還元活性について検定した。
2.パイレックス管に水0.66mlで溶解したSp.6のCP3.3mg
を入れた。この試料を０℃に冷し、0.1NのHClを0.073ml
加え、そして該管を密封した。
3.該管を沸騰水浴中へ10分間浸し、次に０℃に再び冷や
した。少量の試料をステップ１に記載したように還元活
性について検定した。
4.加水分解した調製物（検定に用いられた２％を除く）
を凍結乾燥した、乾燥物を水0.1mlで溶解し、微量遠心
分離管に移し、そして再度凍結乾燥した。
CRM197への結合 1.再乾燥した加水分解物に、0.004mlの2Mリン酸カリウ
ム緩衝液pH8、および0.2mlの0.01Mリン酸ナトリウム緩
衝液pH7中に溶解したCRM1971mgを加えた。得られた混合
物を凍結乾燥し、そして水0.05mlで再懸濁した（見積り
全容量0.063ml）。
2.該管に200mg/mlナトリウムシアノボロハイドライド0.
007mlを加え、そして該調製物を37℃で18日間インキュ
ベートした。
3.80％飽和硫酸アンモニウム（SAS）0.6mlを添加した。
4.該管を０℃で１時間インキュベートし、そして8000G
で15分間遠心分離した。上澄み液を除去した。
5.沈澱物を0.01Mリン酸ナトリウムでpH8で緩衝化した80
％SAS0.6ml中へ懸濁し、続いて8000Gで15分間遠心分離
して洗浄した。
6.沈澱物を0.02mlの0.5M Na2HPO4および0.2mlの9.5M尿
素で懸濁した。
7.1mlのSASを加え、沈澱物をステップ４のようにして単
離し、そしてステップ６のようにして約8Mの尿素中に懸
濁した。
8.懸濁液を8000Gで15分間遠心分離した。
9.上澄み液を分離し、0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7
に対して４℃で透析した。
10. CRM197−Sp.6と称される、この透析された調製物を
次のものについて検定した： フォリンフェノール反応によりタンパク質；放射性標識
SpCPへの抗体結合の阻止によりSp抗原性（第３票にPRP
に関して述べたものと同様）；ジフテリアトキソイド
（DT）への抗体結合の阻止によりCRM197抗原性（CRM197
−PRP−Ｓ＃２の記載のステップｏにおいて述べたもの
と同様）；ならびにジフテリアトキソイド（DT）への抗
体結合の阻止により抗CP免疫原性（CRM197−PRP−Ｓ＃
２の記載のステップｐにおいて述べたものと同様）。第
７表を参照のこと。
6.6. 過ヨウ素酸塩酸化によるPRP結合体ワクチンの製
造 6.6.1. PRPの過ヨウ素酸塩酸化 20μmol/mlのリボース溶液3mlを４℃に冷却し、この
時点で0.4mlの2Mリン酸緩衝液pH8.0および水0.6ml中の
メタ過ヨウ素酸ナトリウム18mgを急速に混合しながら添
加した。暗所において４℃で１晩インキュベーションし
た後、反応混合物を1.5×90cmのバイオゲルＰ−10カラ
ムにかけ、0.2Mトリエチルアンモニウムアセテート、pH
8.0を用いて9ml/hrの流速で溶出した。集めた4.2ml画分
のアリコートをオルシノール検定（Mikro.Chimica.Acta
2:13（1937））によりリボースについて、またパーク−
ジョンソン［Park−Johnson］検定法（J.Biol.Chem.18
1:149（1949））により還元基について分析した。これ
らの分析に基づいて、６および10（あるいはその他の希
望する数値）の平均重合度（DP）を有する画分の組をプ
ールし、該プールを凍結乾燥した。
6.6.2. ジフテリアトキソイド−PRP結合体 ジフテリアトキソイド（水0.5ml中8.4mg）の72μｌア
リコートを、凍結乾燥DP6または10プールの形で、1.4μ
molの還元基とガラス製試験管中で混合した。2MのpH8リ
ン酸緩衝液８μｌを添加し、この溶液を均質性となるま
でボルテックス混合し、そして0.4g/mlナトリウムシア
ノボロハイドライド水溶液２μｌを添加した。37℃で５
日間インキュベーションした後、飽和硫酸アンモニウム
300μｌを添加し、そして混合物を４℃で一晩放置し
た。
沈澱した混合物は次に４℃において12000×ｇで30分
間遠心分離し、上澄み液を除去し、そしてペレットを80
％硫酸アンモニウム500μｌ中に懸濁した。２回目の遠
心分離の後、ペレットを塩溶液500μｌ中に溶解し、そ
して４℃で８時間塩溶液に対して透析した。オルシノー
ル検定によりリボースについて、そしてLowryらの方法
（J.Biol.Chem.193:265（1951））によりタンパク質に
ついて透析物を分析したところ、DP6結合体は511μｇの
タンパク質を含み、タンパク質１モルあたりリボース5
1.5モルであった。同様に製造されたDP10結合体は315μ
ｇのタンパク質を含み、タンパク質１モルあたりリボー
ス59モルであった。
6.6.3. LT−BNT−PRPおよびCRM−PRP結合体 凍結乾燥したLT−BNT（第6.7〜6.10節に述べるように
調製された）あるいはCRMタンパク質の1mgを、水70μｌ
およびリン酸緩衝液pH8 10μｌ中に溶解し、そしてDP1
0またはDP20PRPオリゴ糖の形で0.06μmol/μｌの還元基
25μｌと混合した。混合しながら0.4g/mlナトリウムシ
アノボロハイドライド２μｌを添加した後、混合物を37
℃で３日間インキュベートした。混合物は次に塩溶液2m
l中のセントリコン（Centricon）限外濾過セル（マサチ
ューセッツ州デンバーのAmicon Instruments社、30,000
MNカットオフ）に移し、そして膜上にわずか200μｌの
溶液が残るまで４℃において6000×ｇで遠心分離した。
このプロセスに新たな2mlの塩溶液を用いて繰り返し、
次に濾液がリボースに関して陰性と判定されるまで、結
合体をリン酸緩衝溶液、pH7.4中の5M尿素の限外濾過に
かけた。保持物を限外濾過により0.5ml容量に濃縮し、
そしてリボースおよびタンパク質について分析した。こ
れらの値を第11表に示してある。
6.6.4 PRP−タンパク質結合体ワクチンに対する免疫応
答 第6.6.3節の過ヨウ素酸塩酸化結合体ワクチンを塩溶
液で希釈し、そして第12表に示す投与量で、６〜８週齢
のBalb/cマウスあるいは12週齢のニュージーランド白ウ
サギに皮下注射した。追加の予防接種を１週間おきに最
初の投与量で施し、そして最初のチャレンジの３週間後
に血液試料を抗PRP抗体の存在についてラジオイムノア
ッセイ（第6.1節）によって調べた。第12表に示したデ
ータは４匹の実験動物の幾何平均力価を表すものであ
る。
6.7. 組換えプラスミド調製物の一般的手順 本発明においては、LT−BNT遺伝子の供給源は、ヒト
のエンテロトキシン産生性単離物H10407のLT−STプラス
ミドを含むＫ−12トランスコンジュガントである、大腸
菌711（10407）であった。この株は、F'ts lac::Tn5プ
ラスミドからの転位により大腸菌H10407のエンテロトキ
シンプラスミドを表現型的に標識し、そしてTn5標識化
プラスミドを大腸菌−12株711に接合移入することによ
って誘導されたものである。
このプラスミドを制限酵素によって切断し、LT遺伝子
を含む小さなDNAフラグメントを得た。このDNAフラグメ
ントを、次にpBR322プラスミドへ連結させ、pDF82と称
されるプラスミドを作製した。このプラスミドを含む大
腸菌Ｋ−12トランスフォーマントは次に抗生物質耐性マ
ーカーに基づいて選択した。このトランスフォーマント
によるLTの生産は酵素結合免疫吸着検定および副腎細胞
検定系を用いて実証された。
クローン化LT−Ｂ DNA領域は、同定の後、最初にプ
ラスミドpDF87を得るためにpBR322プラスミド中へ、次
にM13由来のクローニングベクターpUC8中へと２度再ク
ローニングされた。得られた組換え型プラスミドpJC217
は、大腸菌Ｋ−12中への形質転換ならびに抗生物質耐性
および酵素活性マーカーの欠損による選択ののちクロー
ニングされた。pJC217から回収されるLT−BNTは、pDF87
および天然LT−Ｂと免疫学的に区別できないが完全に無
毒性であり、次に免疫原としての使用のために宿主細胞
溶解物から単離された。
構築のそれぞれの段階の詳細な説明は次のとおりであ
る。
6.7.1. 制限酵素消化の条件 用い制限酵素は、メリーランド州ガイサースバーグの
Bethesda Research Laboratories社の製品であった。１
単位の酵素活性、適当な温度および50μｌの反応混合物
全量において、１時間で1.0μｌのλDNAを完全に消化す
るために必要とされる酵素の量として定義された。
消化は、緩衝液20μｌ中で30分間37℃でDNA2μｇを酵
素10単位とインキュベートすることによって行った。70
℃に５分間加熱することにより反応を停止させ、そして
この全条件がベクタープラスミドDNA1分子あたり１つの
切断をもたらした。Pst IおよびHind IIIに関しては、
緩衝液は、50mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2お
よび50mM NaClから成るものであった。他の反応は、本
質的にメーカーの指示どおりに実施した。
6.7.2. DNA消化産物の精製 pDF87の制限酵素処理に続き、消化混合物を40mMトリ
ス、0.2M酢酸ナトリウムおよび2mM EDTA（pH7.8）中に
1.2％低融点アガロースを含む垂直ゲルスラブにおいて
電気泳動分離にかた。電気泳動は10V/cmで行い、次にBo
livarとBeckman（Methods in Enzymology68:245（197
9））に述べられるように、スラブを臭化エチジウムで
染色し、紫外光の下で視覚化した。
その後、分離したDNAフラグメントをゲルから切り出
し、ゲルを溶融して、LT−Ｂ DNAフラグメントをフェ
ノールで抽出した。
6.7.3. T4 DNA連結反応 連結反応は、メリーランド州ガイサースバーグのBeth
esda Research Laboratories社から得られたT4 DNAリ
ガーゼを用いて行った。１単位のT4 DNAリガーゼ活性
は、1nmolの32PPiを〔α／β32P〕−ATPへ37℃、20分間
で変換するのを触媒するのに要求される量として定義さ
れる。
DNA連結反応は、DNA1μｇあたり10単位の酵素を用い
て４℃６で18時間行った。緩衝液は、66mMトリス−HC
l、6.6mM MgCl2、10mMジチオトレイトールおよび66μ
Ｍ ATPを含むもの（pH7.6）であった。
再環状化を減らすために、いくつかの場合において、
プラスミドpBR322を、連結反応の前に、スファロースに
結合させたアルカリ性ホスファターゼで処理した。用い
た酵素は、メリーランド州ガイサースバーグのBethesda
Research Laboratories社から得られたMATE−BAPであ
った。１単位のMATE−BAPは、37℃、30分間で1nmolのAT
Pを加水分解する酵素の量として定義される。酵素は、1
0mMトリス−HCl、pH8.0中で65℃、１時間、DNA1μｌあ
たり500単位の濃度で用いた。反応に続いて、酵素を遠
心分離ペレット化によって除去した。
6.7.4. 形質転換および組換え体の単離 大腸菌Ｋ−12株の形質転換は、BolivarとBeckman（Me
thods in Enzymology68:245（1979））に記載されると
おりに行った。細胞を30mM CaCl2中で０℃、20分間イ
ンキュベートすることによりコンピテントにした。次に
10倍濃縮細胞の0.2mlアリコールを、30mM CaCl2を補給
した低温連結反応緩衝液0.1ml中のDNAへ添加し、そして
０℃で１時間インキュベートした。次に細胞を37℃へ２
分間加熱し、10分間室温に保ち、そしてルリアブロス
（Ｌブロス）4ml中へ希釈した。１リットルあたり、Ｌ
ブロスはバクトトリプトン10g、バクト酵母エキス5gお
よびNaCl10gを含み、すべて1MのNaOHを用いてpH7.5に調
整した。
37℃での３時間のインキュベーションの後、形質転換
体は、トリプチカーゼ・ソイ・アガー（Trypticase soy
agar）（メリーランド州コッキースビル、BBL Microbi
ology Systems）あるいはYTプレートにおいて、下記に
述べるような適当な抗生物質または酵素活性マーカーを
用いて選択した。
6.8. LT遺伝子産物の分析方法 クローニング手順のそれぞれの段階で、大腸菌Ｋ−12
形質転換体は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によ
ってLTまたはLT−Ｂ産生の質および量について分析し
た。さらに、これらの遺伝子産物の毒性を測定するた
め、エンテロトキシン産生性大腸菌にあるいはそれらの
毒素に曝された細胞が容易に検知可能な形態学的変化を
示すマウス副腎細胞検定系によって形質転換体を分析し
た。
6.8.1. 酵素結合免疫吸着検定法（ELISA） Clementsら（Infect.Immuno.40:653（1983））によっ
て述べられたように、分析すべきクローンをトリプチカ
ーゼ・ソイ・ブロス（メリーランド州コッキースビル、
BBL Microbiology Systems）20ml中に37℃で一晩培養
し、遠心分離し、0.05Mトリス、0.001M EDTA、0.003M
アジ化ナトリウムおよび0.2M NaClを含む緩衝液（pH
7.5）2ml中に懸濁し、そしてブランソンソニケーター
（Branson Sonicator）を用いて100〜150ワットにセッ
トした電力で12秒間音波処理することにより破壊した。
得られた溶解物を遠心分離によって清澄化し、そして分
析のために0.05％ツゥイーン20を含むpH7.4のリン酸緩
衝溶液（PBS−Tween）中に連続的に希釈した。
ELISAは２つの基本的方法を用いて行った。１つの方
法においては、ポリスチレン製のマイクロタイタープレ
ート（マサチューセッツ州ケンブリッジ、Coster社）の
ウェルに50μg/mlのIII型ガングリオシド（ミズーリ州
セントルイス、Sigma Chemical社）を予め被覆すること
により、LT−Ｂサブユニットの結合を改善し、その結果
として感度を高めた。次に、マイクロタイタープレート
のウェルに希釈した溶解物試料を含む0.2mlアリコート
を満たし、そして室温で１時間インキュベートした。イ
ンキュベーションに続き、マイクロタイタープレートの
ウェルを空にし、PBS−Tweenを用いて３回洗浄した。そ
の後、LTに対する単一特異的ヤギ高度免疫抗血清（Clem
ntsら,Infect.Immu.29:91（1980））を用いて、次にア
ルカリ性ホスファターゼに結合させたウサギ抗ヤギ抗血
清（Miles Research Laboratories）を用いて、それぞ
れ室温にて１時間ウェルを連続的に処理した。なお、そ
れぞれの添加に続いて、３回のPBS−Tween洗浄を行っ
た。
次いで、10％ジエタノールアミン緩衝液（pH9.8）中
の1mg/ml p−ニトロフェニルホスフェート基質の200μ
ｌアリコートを添加し、室温で60分間プレートをインキ
ューベートし、3M NaOHの25μｌアリコートの添加によ
り反応を停止させ、そして結果を400nmで分光測光的に
測定することによってアルカリ性ホスファターゼ分析を
実施した。
いくつかの場合には、HolmgrenとSvennerholm（Scan
d.J.Immunol.8,Suppl.7:11−118（1987））のELISA法の
変法を代わりに用いた。マイクロタイタープレートにII
I型ガングリオシドを予め被覆しておき、そして0.5％ゼ
ラチンを含むPBS（PBS−Ｇ）中の試験すべき試料の100
μｌアリコートをマイクロタイタープレートのウェルの
中へピペットで入れた。次にプレートを37℃で45分間イ
ンキュベートし、ウェルにPBS−Ｇを満たし、イキュベ
ーションを37℃でさらに30分間続け、そしてプレートを
PBS−Tweenで洗浄した。その後、最初にLTな対する抗血
清を含むPBS−Ｇ、次に西洋ワサビペルオキシダーゼに
結合させた抗LT免疫グロブリンに対する抗血清を含むPB
S−Ｇの100μｌアリコートを用いて37℃で45分間連続的
にウェルを処理した。それぞれのインキュベーション期
間後に、PBS−Tweenでウェルを３回洗浄した。
その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ分析を、基質と
してｏ−フェニレンジアミンを用いて行った。この基質
は、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）1mlあたり
ｏ−フェニレンジアミン（ミズーリ州セントルイス、Si
gma Chemical社）1mgを溶解することによって使用の直
前に調製した。次に、このクエン酸塩緩衝液50μｌあた
り0.3％H2O2を1ml含む溶液の等容量を添加し、0.006％H
2O2の最終濃度を得た。基質200μｌを各ウェルに添加
し、プレートを暗所において室温で30分間インキュベー
トし、そして各ウェルに4M H2O4を75μｌ添加してペル
オキシダーゼ反応を停止させた。結果は、492nmでの吸
光度を測定することにより分光測光的に測定した。
西洋ワサビペルオキシダーゼを用いるELISAは、アル
カリ性ホスファターゼを用いるものよりもかなり感度の
よいものであった。しかしながら、その他の点において
は、この２つの系は匹敵するものであった。
6.8.2. Y1副腎細胞エンテロトキシン検定法 上記の第6.8.1節で述べたようにして調製された清澄
化細胞溶解物は、SackとSackのマウスY1副腎細胞系（In
fect.Immun.11:334（1975））において毒性について分
析した。12.5％ウマ血清、2.5％ウシ胎児血清および40
μg/μｌゲンタマイシンを含むハム（Ham）のF10培地に
維持されたY1副腎細胞を、同じ培地を含む75cm2培養皿
中に植え継ぎ、細胞が集密に達するまで37℃でインキュ
ベートした。
細胞が集密に達したら、培地を、大腸菌LT−Ｂクロー
ン溶解物の連続希釈アリコートを含む新鮮な培地と置き
換え、そして培養物をさらにインキュベートした。イン
キュベーションの18〜24時間後に、培養物の細胞形態に
ついて位相差倒立顕微鏡を用いて調べた。LT毒素の影響
下においては、正常な平たい副腎細胞が丸くなる。この
検定法の感度は、培地200μｌあたり粗大腸菌毒素0.2μ
ｇあるいは精製LT10pgほどが検知され得るようなもので
ある。
6.8.3. エンテロトキシン活性のラット回腸ループ検定
法 KlipsteinとEngertの方法（Infect.Immun.23:592−59
9（1979））を用いて、離乳Sprague−Dawleyラット（マ
サチューセッツ州ウィルミントン、Charles River Bree
ding Laboratories）は、回腸に露出され、遠位部分で1
0cmループを結紮することによって外科的に調製した。
次に、各動物に、滅菌食塩水0.5ml中のLT、LT−Ｂまた
はLT−BNTをループ中に直接接種することによってチャ
レンジした。
18時間後に動物を犠牲にし、液体蓄積についてループ
を調べた。それぞれのエンテロトキシン濃度で５〜８匹
のラットの値から導き出されたデータを、回腸1cmあた
りの液体蓄積として表した。回腸1cmあたり50μｌより
多い液体蓄積によって示されるポジティブ応答が、１μ
ｇ程度に少ないLTで観察された。
6.9. 特異的LT−Ｂ産生クローンの調製および単離 第一代クローンにより産生されたLT−Ｂの毒性ゆえ
に、LT−Ｂ遺伝子を、プラスミドpBR322中に、次にM13m
p7由来のpUC8プラスミド（Vieira and Messing,Gene19:
259（1982））中に連続的に移入した。
6.9.1. pDF82の単離 ヒト単離物H10407のLT+ST+エンテロトキシンプラスミ
ドを制限酵素Pst Iで切断し、5.2KbDNAフラグメントを
得た（第１図参照）。LT遺伝子を含んだこのフラグメン
トを、次にPst Iで切断し、そしてアルカリ性ホスファ
ターゼで処理したプラスミドpBR322中へ挿入した。連結
反応はT4 DNA リガーゼを用いて行い、pDF82と称され
る10.4Kbプラスミドを作製した。次に、連結反応混合物
を用いて大腸菌MM294を形質転換した。
プラスミドpBR322はアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性をコードしている。このプラスミドを制限酵素
Pst Iで切断してDNAフラグメントを挿入すると、アンピ
リシン耐性は失なわれるが、テトラサイクリン耐性は失
なわれない。かくして、これらの形質転換体は、これら
の抗生物質を含む培地における増殖あるいは増殖不能に
より判定されるアンピリシン感受性（ApS）およびテト
ラサイクリン耐性（Tcr）についてのスクリーニングに
よって単離された。25μg/mlテトラサイクリンを含有す
るトリプチカーゼ・ソイ・アガーにプレートした後に、
培養物を37℃で18時間インキュベートした。増殖してい
るコロニーを、次にＬブロス中にてクローニングし、ア
リコートを100μg/mlアンピシリンを含有するトリプチ
カーゼ・ソイ・アガープレート上へ点在させ、そして37
℃で18時間インキュベートした。
APsTcr形質転換体は次に、Y1副腎細胞系およびELISA
によってLT産生について検定した。プラスミドDNAを、B
olivarとBackmanの方法（Methods in Enzymology68:245
（1979））によっていくつかのLT+形質転換体から単離
し、そして0.7％アガロースでの電気泳動にかけた。電
気泳動およびDNA視覚化の条件は上記第6.6.2節に記載し
たとおりである。pDF82と称される１つの単離物は両方
の検定系に陽性であり、また電気泳動において単一プラ
スミドを示した。
Pst Iでの再切断の際、プラスミドpDF82は、4.3Kbのp
BR322クローニングベクターおよび5.2KbのLTコード化DN
Aフラグメントに相当する２つのフラグメントしか生成
しなかった。Pst I、EcoR I,Hind III,Hinc II,Hinf I
およびAva IIによる組換え型プラスミドの更なる分析に
より、DNAフラグメントのサイズおよび内部Pst I部位の
不在を確認した。
6.9.2. pDF87の単離 pDF82からのクローン化LT DNA領域を、プラスミドpB
R322のテトラサイクリン耐性遺伝子中の単一のHind III
部位に再クローニングした（第２図参照）。プラスミド
pDF82およびpBR322をHind IIIで切断し、混合しそしてT
4 DNA リガーゼで連結させた。この連結反応混合物を
再び大腸菌MM294に形質転換し、そして形質転換体を抗
生物質耐性および感受性に基づいて選択した。
Hind IIIによる切断ならびにDNAフラグメントの挿入
はテトラサイクリン耐性を破壊するものの、アンピリシ
ン耐性には影響を及ぼさないので、AprTcs細胞が選択さ
れた。これは、増殖する大腸菌細胞を殺すシクロセリン
の使用によってさらに促進される選択アプローチによっ
て達成された。50μg/μｌアンピリシンを含むＬブロス
中で18時間のインキュベーションの後、培養物を４μg/
mlテトラサイクリンを含む新鮮培地中で1:100に希釈し
た。45分間のインキュベーションの後、Ｄ−シクロセリ
ンを100μg/mlの濃度へと添加し、さらに２時間インキ
ュベーションを続けた。
次に、培養物を遠心分離し、ペレットをＬブロス20ml
中に再懸濁した。さらに３時間のインキュベーションの
後、0.1mlアリコートを50μg/mlアンピリシンを含むト
リプチカーゼ・ソイ・アガー上にプレートし、得られた
コロニーを単離した。形質転換体は次に、LT−Ｂ産生に
ついてELISAにより、またLT−Ａの不在についてY1副腎
細胞検定での毒性の欠如により検定した。これらの用件
にほぼ合致するが、重量基準でpDF82からのLTの毒性の1
/1000が残存する１つのクローンをpDF87と名づけた。ST
Sポリアクリドアミドゲル電気泳動法、ELISAあるいは解
離状態下でのゲル濾過によっては、pDF87中にLT−Ａを
全く検出できなかったので、この毒性の理由は不明であ
る。
pDF87をHind IIIで処理したところ、DNAが２つのフラ
グメント、すなわちpBR322とLT−Ｂをコードするより小
さな（0.8Kb）フラグメントに切断された。重要なこと
は、LT−Ａの産生をコードする1.5Kb Hind III遺伝子フ
ラグメントが存在しなかったことである。
6.9.3. pJC217の単離 pDF87からのクローン化LT−Ｂ DNAを、クローニング
ベクターpUC8の単一のHind III部位に再クローニングし
た（第３図参照）。VieiraとMessing（Gene19:259（198
2））によって作られたこのベクターはM13mp7由来のも
のである。プラスミドpDF87をHind IIIで切断し、そし
て0.8KbのLT−Ｂ DNAフラグメントを低融点アガロース
での電気泳動（上記第6.1.2節参照）によって分離し、
さらにフェノールで抽出した。次にpUC8をHind IIIで切
断し、精製したLT−Ｂ遺伝子フラグメントと混合し、連
結させ、そして大腸菌Ｋ−12に形質転換した。pUC8のHi
nd III部位へのDNAフラグメントの挿入はβ−ガラクト
シダーゼ活性の構造遺伝子を破壊するものであり、これ
はプラスミド中の未変化のアンピリシン耐性と共に形質
転換体を選択する際の土台を提供する。
形質転換体は、100μg/mlアンピリシンを含み200μg/
mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ
−ガラクトシド（Ｘ−gal）を補給したYTプレート（水
１リットルあたりバクトトリプトン8g、NaCl5g、酵母エ
キス5gおよび寒天1.5g）にまいた。Ruthere（Mol.Gen.G
enet.178:475（1980））によって記載されるように、Ｘ
−galはβ−ガラクトシダーゼ基質の１つであって、該
酵素の存在下において無色から青色に変化する。Ｘ−ga
l−TY上で37℃にて18時間インキュベーションした後、
無色のコロニー（プラスミド関連β−ガラクトシダーゼ
活性が挿入により不活性化されている）を単離した。
Aprβ−ガラクトシダーゼ−形質転換体は、次にLT−B
NT産生についてELISAによって検定した。pJC217と称さ
れる１つの陽性クローンからのLT−BNTをY1副腎細胞に
おいて試験したところ、完全に無毒性であることが分か
った。このプラスミドを担う細菌を大腸菌株JM83（pJC2
17）と命名した。
6.10.LT−BNTの回収 6.10.1. pJC217プラスミドを含む大腸菌Ｋ−12の増殖 株JM83（pJC217）の継代培養は２つのタイプのコロニ
ーをもたらした。Ｏ型と称される一方のものは、外観が
小さく、膨れており、不透明であった。Ｔ型と称される
他方のものは、より大きく、平らで、半透明であった。
Ｔ型コロニーがＯ型コロニーに比べて50〜100倍も多く
のLT−BNTを産生するために、LT−BNTの産生に関しては
Ｔ型コロニーのみを利用することが重要である。Ｏ型コ
ロニーはＴ型コロニーから自然発生し得るために、単一
のＴ型コロニーを選択すべきである。
大腸菌株JM83（pJC217）の増殖用の培地の選択は限定
的なものではなく、トリプチカーゼ・ソイ・ブロス、ML
培地およびエバンス（Evans）のCAYE培地は満足できる
ものである。本発明の一実施態様では、プラスミドpJC2
17により形質転換された生物を、該プラスミドを安定化
するために、100μg/mlアンピシリンを含むトリプチカ
ーゼ・ソイ・ブロスを入れた10×1.5cm培養皿において
集密的に画線培養した。37℃での18時間インキュベーシ
ョンの後に、それぞれのプレートは、10リットルの増殖
培地に対する接種物として十分な量の細胞を含んでい
た。
インキュベーションの後、トリプチカーゼ・ソイ・ア
ガープレートからの細菌を滅菌0.85％NaCl5mlで収穫
し、そして0.5グルコースを含むCAYE培地に約106CFU/ml
のレベルで接種するために使用した。CAYE培地は、蒸留
水１リットルあたりカザミノ酸20g、酵母エキス6g、NaC
l2.5g、K2HPO48.71gおよび極微量の塩類（５％MgSO4、
0.5％MnCl2および0.5％FeCl3）1mlからなるものであ
る。接種に続き、培養物は37℃で18〜24時間攪拌しなが
らインキュベートした。
6.10.2. 細胞破壊 インキュベーション培地からの細胞を、４℃で20分
間、5,000×ｇで遠心分離して回収した。上澄み液をClo
rox殺菌剤中に廃棄し、細胞ペレットを0.05Mトリス、0.
001MジナリウムEDTA、0.003Mアジ化ナトリウムおよび0.
2M NaClを含む緩衝液pH7.5（TEAN緩衝液）の最小容量中
に懸濁した。次に、これらの細胞懸濁液をプールし、そ
して必要になるまで−60℃で凍結保存した。
細胞の凍結は、一般にLT−BNT回収用の大腸菌Ｋ−12
の十分な破壊をもたらす。音波処理やフレンチプレスの
ような機械的破壊技術は、試料における熱の上昇をなく
すように細心の注意を払うならば使用できるだろう。溶
解剤としてリゾチームを用いたとき最終LT−BNT回収率
が60％近くまで減少したために、リゾチームは避けるべ
きである。
37℃の水浴中に保存容器を最少時間旋回させることに
より、凍結細胞懸濁液を急速に解凍した。次に、懸濁液
を等容量のTEAN緩衝液と合わせ、混合するためにゆっく
りと旋回し、そして次に膜および非溶解細胞を沈降させ
るために5,000×ｇで20分間遠心分離した。この凍結解
凍法の１回使用からのLT−BNTの代表的回収率は50％で
あった。より高い回収率が、溶解しにくい細胞に対しこ
のサイクルを繰返すかあるいは他の破壊技術を使用する
ことによって得られるだろう。遠心分離段階からの上澄
み画分はすべて更なる精製のために合わせておいた。
6.10.3. LT−BNTのアフィニティークロマトグラフィー 遠心分離された細胞溶解物からの透明な上澄み液を、
あらかじめ４℃でTEAN緩衝液で平衡化しておいた2.5×8
0cmセファロース4B（ニュージャージー州ピスカタウェ
イ、PharmaciaFineChemicals）カラムの上部に直接適用
した（緩衝液の下に重層されることはない）。次に、28
0nmで監視される流出液が基底レベルに達するまで、20m
l/時の流速でTEAN緩衝液を用いてカラムをパージした。
この時点で、TEAN緩衝液中の0.2Mガラクトースを加え、
20ml/時の流速を維持し、その間に6ml画分を集めた。LT
−BNTはガラクトースのフロントにわずかに先行する280
nmで吸光度の単一ピークとして検出された。
すべての操作は４℃で行い、完了時にLT−BNT画分を
プールし、大量のTEAN緩衝液に対して透析し、保存のた
めに凍結乾燥した。
6.11. 毒性に関するLT−BNTの分析 LT、クローンpDF87からのLT−Ｂ、およびクローンpJC
217からのLT−BNTの試料を上記第6.8.2節において述べ
たようなY1副腎細胞検定系で分析した。試料のタンパク
質含量はLowryらの方法（J.Biol.Chem.193:265−275（1
951））によって測定した。結果を第13表に示す。 第 13 表 エンテロトキシン活性の副腎細胞検定 調製物 生物学的活性＊ LT 0.038 LT−Ｂ（pDF87） 39 LT−BNT（pJC217） 25,000 ＊活性は、50％の細胞の丸い形状化に必要とされたそれ
ぞれの調製物のノナグラム量として表される。
第13表のデータは、LTがLT−BNTよりも650,000倍も活
性が大きいことから、LT−BNTの毒性がLTのそれと比較
して劇的に低減されていることを示すものである。LT−
Ｂに関する結果は、それがLTよりも実質的に低い毒性で
はあるが、かなりの毒性をとどめていることを示すもの
である。完全LTエンテロトキシンのそのサブユニットへ
のクロマトグラフィー的分離により生成されるＢサブユ
ニットの毒性に匹敵するこの毒性からすると、LT−Ｂは
ワクチンとしての使用に不適当であろう。
第6.8.3節において述べたようなラット回腸ループ検
定におけるLTおよびLT−BNTの分析も、LT−BNTの注目す
べき無毒性の特徴を表わすものであった。結果を第14表
に示すが、それぞれの値は５〜８匹のラットからの平均
値である。
第14表に示されるように、LT−BNTの100μｇ量は、ラ
ット回腸ループ検定において完全に不活性であった。こ
れに対して、LTの同量は、最小の有意レベルよりも16倍
も高い回腸ループ液体蓄積の刺激をもたらした。
6.12. LT−BNTに対する抗血清の調製 6.12.1. マウスにおけるLT−BNTに対する抗血清の調製 １群10匹の４〜６週齢のBalb/cj雌マウス（Jackson L
aboratories）に0.1mlの食塩水（蒸留水１リットルあた
り9gのNaCl）を、比較対照としてそれのみで、またはあ
る量のLT−BNTを加えて、皮下注射した。いくつかの場
合には、１週間後にブースター注射を行った。ワクチン
接種の直前およびその後の様々な時間に、血液検体を尾
部スニッピングによって採取し、そして血清を希釈し、
上記第6.8.1節に記載したようにELISAによって抗体活性
を検定した。抗体活性は、吸光度曲線の直線領域に吸光
度降下をもたらすのに必要とされる全試料希釈率として
表わされる。
予備実験では、様々な量のLT−BNTを用いたワクチン
接種の効果が観察された。結果を第15表に示す。
第15表に示したように、LT−BNTに対する抗体は、ワ
クチン接種前には、いずれの動物からも検出されなかっ
た。ワクチン接種１週間後近くで、抗LT−BNT抗体が検
出された。予期されたように、抗体活性はLT−BNTへの
暴露を増すにつれて増加した。
多重ワクチン接種に対する二次抗体応答があり得るか
否かを調べるために、マウスのグループに上述したと同
様にLT−BNTを注射し、再度１週間後に等用量を注射し
た。結果を第16表に示す。
第16表のデータは、抗LT−BNT活性が、LT−BNTを注射
した動物においてのみ検知され得ることを示すものであ
る。この活性は、LT−BNTによる２回目のチャレンジ後
に顕著に増加した。これに対して、LT−BNTの追加投与
を行わなかった場合は、抗体価の増加がかなり低いもの
であった。
LT−BNTチャレンジに応答して生産された抗体活性は
持続することが、10匹のBalb/cj雌マウスにアジュバン
トを加えてない食塩水中のLT−BNT10μｇを注射した実
験において示された。その後、異なる時間に尾部スニッ
ピングにより採取した血液試料は、抗LT−BNT抗体活性
について、西洋ワサビペルオキシダーゼELISAによって
分析した。第17表に示すように、抗体活性は免疫感作の
２週間後にピークに達するが、20週間後においてすら実
質的に残っていた。この強烈でかつ持続された応答は、
ブースターを投与せずかつアジュバントを用いなかった
場合ですら見られた。
6.12.2. ヤギにおけるLT−BNTに対する抗血清の調製 標準方法を用いて精製LT−BNT2mgを皮下注射すること
によって６ヶ月齢の異系交配ヤギにおいて抗血清を産生
させた。同量の追加ワクチン接種を４週間後に与え、そ
して血液試料を最初のワクチン接種から10週間後に採取
した。このようにして採取した血液は凝固するまで放置
し、凝血を5,000×ｇで30分間遠心分離することによっ
て沈降させ、そして得られた血清を４℃で一晩50％硫酸
アンモニウムで処理した。生成した沈澱物は10,000×ｇ
で５分間遠心分離することによってペレット化し、この
ペレットをTEAN緩衝液（第6.10.2節）10ml中に溶解し、
そして200倍容量の同じ緩衝液に対して４℃で合計24時
間の間３回透析した。
得られた抗血清をLT−BNTに対して高度に特異的とす
るために、調製物をアフィニティークロマトグラフィー
によって２度精製した、この精製法のために、LT−BNT
セファロースおよびCT−Ｂセファロースを、メーカーの
指示どおりに、臭化シアン活性化セファロース4B（ニュ
ージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia Fine Chemi
cals）に精製LT−BNTあるいはCT−Ｂ（List Biological
Laboratories社）を共有結合することにより調製し
た。透析した抗血清は、最初に、TEAN緩衝液で十分に洗
浄したLT−BNTセファロースの1.5×18cmカラムに通し
た。固定化LT−BNTに結合した免疫グロブリンを次に、
0.2Mグリシン−HCl緩衝液pH3.5を用いてカラムより溶出
し、これを集めて0.25Mトリスで中和した。
溶出した免疫グロブリンは、上記のようにTEAN緩衝液
に対して透析し、次に、１×5cmのCT−Ｂセファロース
カラムにかけた。該カラムを通過する免疫グロブリンを
集めてELISAで検査したところ、それはLT−BNTに対して
特異的であるがCT−Ｂに対しては非反対性であることが
分かった。
6.12.13. モノクローナル抗体の調製 LT−BNTに対する抗体を産生し得る脾細胞を得るため
に、６〜８週齢のBalb/cマウス（Jackson Loboratorie
s）を犠牲にし、脾臓を無菌的に取り出した。脾臓をワ
イヤーメッシュ（フロリダ州セントペータースバーグ、
Collector,E−C Apparatus Corp.）に強制的に通して押
し出すことによって単細胞浮遊液を得た。このようにし
て調製した脾細胞を、4,500mg/Lグルコース、20％ウシ
胎児血清、10％NCTC109、１％非必須アミノ酸類、100単
位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.3m
M ８−ブロモグアノシン、５×10-5M ２−メルカプト
エタノールおよび50％胸腺細胞ならし培地（TCM）を含
有する完全ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中の無
菌LT−BNT1μg/mlにさらした。
脾細胞の試験管内免疫化に必要とされ、また細胞クロ
ーニングにおけるフィーダー層の必要生を排除するTCM
は、４〜６週齢のBALB/Cマウスから胸腺を無菌的に取り
出すことによって調製した。次いで、単離した胸腺を上
述したようにして破壊し、細胞を完全DMEM中で37℃にて
加湿した10％CO2インキュベーターにおいて３日間培養
し、細胞を1,000×ｇで10分間遠心分離してペレット化
することによって培地を回収し、そして必要になるまで
−20℃で凍結保存した。
37℃で10％CO2において４日間培養の後、LT−BNT処理
脾細胞を1,000×ｇで10分間遠心分離することによって
回収した。ハイブリドーマをつくるために、それらをマ
ウス骨髄腫細胞（X63−Ag8.653）と４倍過剰で混合し、
そして40％ポリエチレングリコール（PEG1300,MCB Chem
icals）および５％ジメチルスルホキシドの添加によっ
て融合させた。25℃での１分間のゆっくりした混合に続
いて、懸濁液をゆっくりとDEAMで希釈し、そして細胞を
遠心分離によって培地から取り出した。
細胞は次に、５×10-5Mの２−メルカプトエタノー
ル、30％TCMおよびHAT（10-4Mヒポキサンチン,10-5アミ
ノプロテイン,3×10-5Mチミジン）を補給した完全DMEM
中に５×105骨髄腫細胞/mlの希釈度で懸濁した。この懸
濁液を96ウェルの組織培養更に分配し、37℃、10％CO2
において１週間に２回の培地交換を行ってインキュベー
トすることにより細胞を培養した。１週間後に目視でき
るコロニーが30〜60％のウェルに現れ、そして３週間後
にウェル中の上澄み培地を、西洋ワサビペルオキシダー
ゼELISAによってLT−BNT特異的抗体の存在について、第
6.8.1節に記載したようにして試験した。その後、培地
がELISAによって陽性であったウェル中の細胞は限界希
釈によって、あるいはアガロースにプレートすることに
よってクローニングした。
限界希釈クローニングは、所望のハイブリドーマ細胞
を40％TCMを補給した完全DMEM中に500、50および５細胞
/mlの濃度に希釈し、この懸濁液のアリコートを多重ウ
ェル組織培養皿にプレートすることによって行った。ク
ローンをおおう培地は、２〜３週間のインキュベーショ
ンの後にELISAによって再試験し、そして陽性クローン
を同じ培地での継代培養によって増やした。
アガロースでのクローニングは、本質的にCoffinoとS
charrf（Proc.Natl.Acad.Sci.USA68:219−223（197
1））によって記載されるとおりに行った。DMEM中の４
％シープラークアガロース（Sea Plaque Agarose）4ml
を被覆した組織培養皿（15×60mm Corning）に、40％T
CMを補給した完全DMEM中に1000細胞/mlを含む0.35％ア
ガロース1mlを置いた。このプレートを加湿した10％CO2
インキュベータにおいて37℃で、コロニーが８〜16細胞
の大きさになるまでインキュベートした。次に、抗マウ
スIgM/IgGの1:50希釈率を有するDMEM中の0.4％アガロー
スを含むオーバーレイ1mlをそれぞれの皿に加えた。２
〜３日のインキュベーションの後、目視できる沈澱物を
免疫グロブリン分泌コロニーとしてマークし、そして最
も活発に分泌しているコロニーを無菌パスツールピペッ
トを使って96ウェルプレートに移した。特に強力な抗LT
−BNT抗体産生細胞をELISAによって同定し、所望により
ストック細胞を継代培養によって生育させた。しかしな
がら、誘導されクローン化されたストック細胞は、90％
ウシ胎児血清を含む10％ジメチルスルホキシド中に−17
0℃で凍結貯蔵することによって保存した。
診断試験に使用するために、あるいは他の目的のため
に大量のモノクローナル抗体を生産するために、ハイブ
リトーマ細胞を腹水腫として増殖さてあ。８週齢のBALB
/Cマウスをプリスタン（0.5ml/マウス、ウィスコンシン
州ミルウォーキー、Aldrich Chemical社）で感作し、10
日後に107個のハイブリドーマ細胞を注入した。７〜10
日間で生産された腹水液を、麻酔した動物の腹部に挿入
された18ゲージ針で捕集した。次に、この液体を2,000
×ｇで10分間遠心分離することにより清澄化し、0.1％
アジ化ナトリウムの添加によって保存し、そして４℃で
貯蔵した。
6.13. LT−BNTに対する抗血清によるエンテロトキシン
活性の中和 LT−BNTに対する抗血清がコレラ菌および大腸菌のエ
ンテロトキシンの活性を中和し得るか否かを調べるため
に、Y1副腎細胞系において細胞を丸くするのに必要とさ
れる量の100倍の毒素量を、種々の希釈度のヤギ抗血清
（第6.6.2節）と37℃にて１時間インキュベートした。
このインキュベーションに続いて、第6.6.2節に記載さ
れるように、副腎細胞系で毒性について試料を分析し
た。第18表に示すように、LT−BNTに対する希釈抗血清
は両方のエンテロトキシンを完全に中和した。
6.14. LT−BNTに基づく分析系 6.14.1 ELISA検定 上記第6.8.1節では、試料中のLT−BNTのELISA検出の
ための手順を記載した。ELISA系は、ヒトあるいは免疫
動物からの血清中のLTまたはLT−Ｂに対する特異的抗体
の検出に同様に適用できる。抗体の検出にELISAを使用
するために、50mM炭酸ナトリウムを含む被覆緩衝液pH9.
6中の１μg/mlLT−BNTの100μｌアリコートを、96ウェ
ルポリビニルプレート（Costar）のウェルにピペットで
添加した。このプレートを室温で２時間インキュベート
し、この時点でウェルに被覆緩衝液中の0.5％ゼラチン
を満たし、そして一晩４℃でインキュベートした。次
に、0.05％ツゥイーン20を含むリン酸緩衝溶液（PBS−
Ｔ）で３回洗浄して非付着抗原を除去した。
ヤギ、ヒトあるいはマウス血清またはマウスハイブリ
ドーマ上澄み液のような、分析すべき抗体を含有する試
料を0.5％ゼラチンを含有するPBSで希釈し、そして10μ
ｌアリコートとして抗原被覆ウェルに添加した。プレー
トを37℃で45分間インキュベートし、上澄み液を除去
し、そしてウェルをPBS−Ｔで３回洗浄した。次に、西
洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた第２抗体（適当
な抗ヤギ、ヒトあるいはマウス免疫グロブリン抗血清）
を100μｌアリコートとしてウェルに添加し、そしてプ
レートを37℃で45分間インキュベートした。
第２抗体のインキュベートの後に、プレートをPBS−
Ｔで洗浄し、そして基質（0.006％H2O2を含む0.1Mクエ
ン酸ナトリウム緩衝液pH5.0 1ml中のｏ−フェニレンジ
アミン1mg）の200μｌアリコートをウェルに添加した。
25℃で30分間のインキュベーションの後、酵素反応を、
4M H2SO475μｌの添加によって停止した。その後、ウ
ェルの内容物の吸光度を492nmで測定した。第１の抗体
を添加しなかった対照の吸光度の少なくとも２倍の吸光
度のものを陽性の試料とした。
この方法の実施に際しては、第19表に示すように、血
清試料を幼児および成人から採取し、そしてLT−BNTに
対する抗体の存在について分析した。
第19表のデータは、表示した年齢範囲の個体からある
いはロチェスター大学、医療センター、小児感染症部門
で働いているヘルスケア専門家から採取した血清試料の
分析に基づくものである。限られた暴露歴を有する幼児
の場合には、予期されたように、LT−BNTに対する抗体
の発生が低かった。一般的成人母集団の場合には発生が
やや高く、そして小児健康専門家グループの場合にはよ
り一層高いものであった。後者のグループの９個体中の
７固体の血清が陽性であり、エンテロトキシン誘発生下
痢症を示す患者に接触する機会が多いことは考慮すると
予期されない発見であった。
6.14.2. イムノブロット分析 LTまたはLT−Ｂを含むタンパク質の混合物は電気泳動
で分離することができ、そしてホロ毒素またはＢサブユ
ニットはイムノブロット法によって同定し得る。この方
法の１つの例として、LT−BNT10μｇを、５％スペーサ
ーおよび13％分離ゲルを用いて、Laemmliの方法（Natur
e227:680−685（1970））によってスタッキングドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリドアミドゲル電気泳動に
かけた。
電気泳動に続いて、ゲルを、192mMグリシンおよび20
％メタノールと共に、25mMトリス−HCl（pH8.3）を含む
電気溶出緩衝液中に４℃で45分間浸した。Hoeffer Scie
ntific Transphor電気移動装置で最大電流量を用いて４
℃で２時間電気泳動を行うことによってタンパク質を膨
潤ゲルからニトロセルロース紙（BA85、Schleicher and
Schuell）に移した。
LT−BNTを検出するために、ニトロセルロースシート
を２つの方法で展開させた。シートの一部分をアミドブ
ラック（Amido Black）で染色し、移したすべてのタン
パク質を発色させた。シートの残りの部分は、残存する
タンパク質結合部位をブロックするために、0.1％アジ
化ナトリウムおよび１％オボアルブミンを含有するPBS
緩衝液（PBS−Az−Ｏ）中に４℃で一晩浸した。その
後、ブロックしたニトロセルロースをPBS−Ｔで３度、
それぞれ10分間かけて洗浄した。LT−BNTを含有するレ
ーンは、アフィニティークロマトグラフィーにより精製
ヤギ抗LT−BNT抗血清（第6.12.2節）に、またはアフィ
ニティークロマトグラフィーによりLT−BNT結合抗体の
凅渇した血清に室温にて２時間さらした。これらの血清
調製物は、使用前に、PBS−Az−Ｏを用いてそれぞれ１
〜500および１〜106に希釈した。
血清への暴露が完了した後に、このシートをPBS−Ｔ
用いて３度それぞれ10分間かけて洗浄し、次に１％アボ
アルブミンを含有するPBSで1000倍に希釈した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ結合抗ヤギ免疫グロブリンと室温で
１時間インキュベートした。このシートを再びPBS−Ｔ
で３度、10分間かけて洗浄し、その後基質（0.005％H2O
2を含む50mMトリス−HCl pH7.6 1mlあたり3,3′−ジア
ミノベンジジン塩酸塩0.3mg）と室温で30分間インキュ
ベートした。シートを水中に浸し、これを風乾すること
によって反応を停止させ、LT−BNTの位置は茶色のバン
ドとして現れた。
6.14.3. ラテックスビーズ凝集反応 抗原または抗体のいずれかを被覆したラテックスビー
ズは対応する特異的抗体または抗原を検出するために用
いられる。LT−BNTに対する抗体の検出のためにこの試
験を実施するにあたり、0.8μラテックスビーズ（ミシ
ガン州デトロイト、Difco Laboratories）を0.15M NaC
lを含む0.1Mグリシン緩衝液pH8.2中の１μg/ml精製LT−
BNTの等容量に添加した。懸濁液を穏やかに振盪しなが
ら37℃で２時間インキュベートし、ビーズを確実に被覆
した。
インキュベーションの後に、ビーズを1,000×ｇで12
分間ゆっくりと遠心分離することによって洗浄した。上
澄み液を0.1％ウシ血清アルブミンを含むPBSで置き換
え、ブロモフェノールブルーおよびアジ化ナトリウム
を、それぞれ最終濃度0.04％および0.1％となるように
添加した。抗LT−BNT抗体についての凝集検定を行うた
めに、感作ビーズ懸濁液５μｌを、PBS対照緩衝液ある
いはPBSで希釈した試験サンプル15μｌと混合した。混
合直後に示された凝集反応は、乳状（対照）懸濁液から
澄明なバックグラウンドを有する粒状懸濁液への変化と
して定義された。
凝集検定はまた、0.25mg/mlのアフィニティー精製ヤ
ギ抗血清あるいは01mg/mlのLT−BNTに対するマウスモノ
クローナル抗体を含有する等容量のグリシン緩衝液中で
ビーズを感作することによって、サンプル中のLT−BNT
の検出にも使用された。
6.15. 微生物の寄託 プラスミドpJC217を保有するLT−BNT産生性大腸菌株
は、イリノイ州ペオリアのアグリカルチュラル・リサー
チ・カルチャー・コレクション（NRRL）に寄託され、そ
して受託番号NRRL Ｂ−15757を指定された。寄託微生
物の培養株は、本出願に基づく特許の認可によって公衆
に入手可能なものとなるであろう。ここに説明しそして
請求の範囲に記載した発明は、寄託された実施態様が本
発明の単なる例示として意図されたものであるから、寄
託微生物の株によって発明の範囲を限定されるものでは
ない。機能的に等価のエンテロトキシンサブユニットを
産生する任意の等価の微生物は本発明の範囲内に含まれ
るものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ Ｓ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭59−501360（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−171926（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−500998（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｇ．Ｃｈｉｎ．Ｒｅｓ．，47 （1980），Ｐ．77−94 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，152（1980）, Ｐ．361−376 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，127［３ ］（1981），Ｐ．1011−1018 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，40［１ ］（1983），Ｐ．245−256 Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ ｙｓ．，181（1977），Ｐ．542−549 Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．，165（1979），Ｐ．271−288 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．148（1981）, Ｐ．983−987 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，31［１ ］（1981），Ｐ．144−150 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ ｔ．，14（1982），Ｐ．１−５ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｉｓ．，147［２ ］（1983），Ｐ．318−326

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】還元末端を有しかつ細菌病原体の莢膜ポリ
    マーから誘導された莢膜ポリマーフラグメントと、大腸
    菌の熱不安定性エンテロトキシンのLT−Ｂサブユニット
    の１つ以上の免疫反応性抗原決定基を有する無毒性ポリ
    ペプチドである細菌性結合サブユニットと、の還元アミ
    ノ化産物から成り、莢膜ポリマーフラグメントの還元末
    端が細菌性結合サブユニットに直接結合されている、免
    疫原性結合体。
  2. 【請求項２】結合サブユニットは無毒性LT−Ｂサブユニ
    ットであり、NRRLに寄託されて受託番号Ｂ−15757を指
    定されたLT−BNT産生性大腸菌、またはその突然変異
    体、組み換え体、もしくは遺伝子工学的に操作された均
    等誘導体により生産される、請求項１に記載の免疫原性
    結合体。
  3. 【請求項３】細菌病原体はヘモフィルス・インフルエン
    ザ（Haemophilusinfluenzae）ｂ型である、請求項１に
    記載の免疫原性結合体。
  4. 【請求項４】細菌病原体は大腸菌（Escherichia coil）
    である、請求項１に記載の免疫原性結合体。
  5. 【請求項５】細菌病原体はナイセリア・メニンギチジス
    （Neisseria meningitibis）である、請求項１に記載の
    免疫原性結合体。
  6. 【請求項６】細菌病原体はナイセリア・メニンギチジス
    血清グループＡである、請求項１に記載の免疫原性結合
    体。
  7. 【請求項７】細菌病原体はナイセリア・メニンギチジス
    血清グループＣである、請求項１に記載の免疫原性結合
    体。
  8. 【請求項８】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュー
    モニエ（Streptococcus pneumoniae）である、請求項１
    に記載の免疫原性結合体。
  9. 【請求項９】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュー
    モニエ血清型３である、請求項１に記載の免疫原性結合
    体。
  10. 【請求項１０】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュ
    ーモニエ血清型６である、請求項１に記載の免疫原性結
    合体。
  11. 【請求項１１】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュ
    ーモニエ血清型12である、請求項１に記載の免疫原性結
    合体。
  12. 【請求項１２】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュ
    ーモニエ血清型14である、請求項１に記載の免疫原性結
    合体。
  13. 【請求項１３】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュ
    ーモニエ血清型19である、請求項１に記載の免疫原性結
    合体。
  14. 【請求項１４】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュ
    ーモニエ血清型23である、請求項１に記載の免疫原性結
    合体。
  15. 【請求項１５】細菌病原体はストレプトコッカス・ニュ
    ーモニエ血清型51である、請求項１に記載の免疫原性結
    合体。
  16. 【請求項１６】細菌病原体はシュードモナス（Pseudomo
    nase）である、請求項１に記載の免疫原性結合体。
  17. 【請求項１７】前記フラグメントは酸化的切断により莢
    膜ポリマーから誘導される、請求項１−16のいずれか１
    項に記載の免疫原性結合体。
  18. 【請求項１８】前記フラグメントは過ヨウ素酸酸化によ
    り莢膜ポリマーから誘導される、請求項１−16のいずれ
    か１項に記載の免疫原性結合体。
  19. 【請求項１９】前記フラグメントはグリコシド結合の加
    水分解により莢膜ポリマーから誘導される、請求項１−
    16のいずれか１項に記載の免疫原性結合体。
  20. 【請求項２０】前記加水分解を酵素により行う、請求項
    19に記載の免疫原性結合体。
  21. 【請求項２１】前記加水分解を化学的に行う、請求項19
    に記載の免疫原性結合体。
  22. 【請求項２２】前記加水分解を酸により行う、請求項19
    に記載の免疫原性結合体。
  23. 【請求項２３】前記フラグメントは1.08のVe/Vo比でア
    クリルアミドとＮ−Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルア
    ミドとの共重合により製造された多孔質ポリアクリルア
    ミドビーズのカラムから溶離する、請求項22に記載の免
    疫原性結合体。
  24. 【請求項２４】前記フラグメントは1.09−1.38のVe/Vo
    比でアクリルアミドとＮ−Ｎ′−メチレン−ビス−アク
    リルアミドとの共重合により製造された多孔質ポリアク
    リルアミドビーズのカラムから溶離する、請求項22に記
    載の免疫原性結合体。
  25. 【請求項２５】前記フラグメントは1.39−1.99のVe/Vo
    比でアクリルアミドとＮ−Ｎ′−メチレン−ビス−アク
    リルアミドとの共重合により製造された多孔質ポリアク
    リルアミドビーズのカラムから溶離する、請求項22に記
    載の免疫原性結合体。
  26. 【請求項２６】前記フラグメントは2.0−2.4のVe/Vo比
    でアクリルアミドとＮ−Ｎ′−メチレン−ビス−アクリ
    ルアミドとの共重合により製造された多孔質ポリアクリ
    ルアミドビーズのカラムから溶離する、請求項22に記載
    の免疫原性結合体。
  27. 【請求項２７】還元アミノ化産物がホルマリンで処理さ
    れたものである、請求項１に記載の免疫原性結合体。
  28. 【請求項２８】前記結合サブユニットは無毒性LT−Ｂサ
    ブユニットであり、NRRLに寄託されて受託番号Ｂ−1575
    7を指定されたLT−BNT産生性大腸菌、またはその突然変
    異体、組み換え体、もしくは遺伝子工学的に操作された
    均等誘導体により生産される、請求項27に記載の免疫原
    性結合体。
  29. 【請求項２９】還元末端を有しかつ細菌病原体の莢膜ポ
    リマーから誘導された莢膜ポリマーフラグメントと、大
    腸菌の熱不安定性エンテロトキシンのLT−Ｂサブユニッ
    トの１つ以上の免疫反応性抗原決定基を有する無毒性ポ
    リペプチドである細菌性結合サブユニットと、の還元ア
    ミノ化産物を形成することから成り、前記還元アミノ化
    がシアノボロハイドライドイオンの存在下に行われ、前
    記莢膜ポリマーフラグメントの還元末端が無毒性の細菌
    性結合サブユニットに直接結合されることを特徴とす
    る、免疫原性結合体の製造方法。
  30. 【請求項３０】前記結合サブユニットはNRRLに寄託され
    て受託番号Ｂ−15757を指定された大腸菌（LT−BNT）、
    またはその突然変異体、組み換え体、もしくは遺伝子工
    学的に操作された均等誘導体により生産される無毒性LT
    −Ｂサブユニットである、請求項29に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記病原体はヘモフィルス・インフルエ
    ンザｂ型である、請求項29に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記病原体は大腸菌である、請求項29に
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記病原体はナイセリア・メニンギチジ
    スである、請求項29に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記病原体はストレプコッカス・ニュー
    モニエである、請求項29に記載の方法。
  35. 【請求項３５】前記病原体はシュードモナスである、請
    求項29に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記フラグメントは酸化的切断により莢
    膜ポリマーから誘導される、請求項29−35のいずれか１
    項に記載の方法。
  37. 【請求項３７】前記フラグメントは過ヨウ素酸酸化によ
    り莢膜ポリマーから誘導される、請求項29−35のいずれ
    か１項に記載の方法。
  38. 【請求項３８】前記フラグメントはグリコシド結合の加
    水分解により莢膜ポリマーから誘導される、請求項29−
    35のいずれか１項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記加水分解を酵素により行う、請求項
    38に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記加水分解を化学的に行う、請求項38
    に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記加水分解を酵により行う、請求項38
    に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記還元アミノ化産物をホルマリンで処
    理することから成る、請求項29−41のいずれか１項に記
    載の方法。
  43. 【請求項４３】還元末端を有しかつ細菌病原体の莢膜ポ
    リマーから誘導された莢膜ポリマーフラグメントと、大
    腸菌の熱不安定性エンテロトキシンのLT−Ｂサブユニッ
    トの１つ以上の免疫反応性抗原決定基を有する無毒性ポ
    リペプチドである細菌性結合サブユニットと、の還元ア
    ミノ化産物から成り、莢膜ポリマーフラグメントの還元
    末端が細菌性結合サブユニットに直接結合されている免
    疫原性結合体を含有する、ヒトにおいて有効レベルの抗
    莢膜ポリマー抗体を誘導しうるワクチン。
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