JPH0812197B2 - 体液中のリンの定量方法 - Google Patents

体液中のリンの定量方法

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JPH0812197B2
JPH0812197B2 JP1184405A JP18440589A JPH0812197B2 JP H0812197 B2 JPH0812197 B2 JP H0812197B2 JP 1184405 A JP1184405 A JP 1184405A JP 18440589 A JP18440589 A JP 18440589A JP H0812197 B2 JPH0812197 B2 JP H0812197B2
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Description

【発明の詳細な説明】 体液中のリンの構成の測定は、リンの貯留を生じる尿
毒症や慢性腎疾患のような疾患の診断を可能にするの
で、体液中たとえば血清または尿中のリンの量の定量は
重要である。
体液中のリンの定量的測定は従来、モリブデンブルー
反応を用いて光学的に行われてきた（I.M.Kolthoff ＆
P.D.Elving編、第II部、第Ｖ巻、第317〜402頁、1961
年）。この反応は、リンモリブデン酸複合体の生成、つ
いでそのフエニルヒドラジン、アスコルビン酸、アミノ
ナフトールスルホン酸または他の還元剤からなる群より
選ばれる還元剤による還元を包含する。還元によつて異
種多酸の青色複合体が生成し、この複合体の吸収を約70
0nmで測定するものである。
体液中のリンを定量的に測定するこの慣用方法にはい
くつかの欠点である。第一に、この試験を実施するため
には蛋白質を含まない血清サンプルが必要で、このよう
な蛋白質を含まない血清サンプルの調製は繁雑である。
第二に、この試験の感度は低い。最後に、この試験を実
施するためには試薬を２回連続して添加する必要があ
る。すなわち、最初にリンモリブデン酸複合体を生成さ
せ、ついで上述のように還元する。このような２工程方
法のためにリンの定量試験のスピードは遅くなる。多く
の試験について迅速かつ正確な完了のための努力がなさ
れていることから、最後に挙げた欠点はとくに重要であ
る。
この最後の欠点の克服の試みとしては、非還元リンモ
リブデン酸複合体を約340nmで測定するリンの定量を開
示した米国特許第3,795,484号がある。
さらに詳しくは、この米国特許第3,795,484号の方法
は、次の各工程からなるものである。
（ａ）リン含有液体とモリブデン酸アンモニウム溶液の
混合物の生成、 （ｂ）上記混合物生成後２秒以内に340nmにおける第一
の吸収の読みの、遠心分離分析光度計による測定 （ｃ）上記混合物生成後10分以内に340nmにおける第二
の吸収の読みの測定 （ｄ）吸収の差を、既知濃度のリンを含有する液体から
同時に同一条件で得られた少なくとも１つの他の吸収の
差の比較 （ｅ）リン含有液体中のリンの量の決定 この方法にもいくつかの欠点がある。第一に、この方
法は最初の吸収の読みを、試薬と体液サンプルの混合後
２秒以内に測定しなければならない。このような制限が
従来方法の実施を繁雑なものとしている。第二に、蛋白
質基質サンプル（たとえば血清）と水基質サンプルの間
には、タンパク質基質サンプルの方が水性サンプルより
も速やかに反応が起こるという差があるため、この従来
技術では、水性サンプルの体液たとえば尿と、蛋白質サ
ンプルの体液たとえば血清とでは、リンの定量のために
別個の較正が必要である。
本発明の目的は、体液サンプル中のリンをモリブデン
酸複合体生成反応を光学的に測定するリンの定量方法に
おいて、反応の進行を、２回の読み取りの最初の読み取
りを試薬と試験すべき体液の混合後10秒までとゆつくり
行えるように十分緩徐にした方法を提供することにあ
る。
本発明の他の目的は、尿のような水性体液または血清
のような蛋白質基質体液のいずれを試験する場合でも同
じ較正が使用できるような体液中のリンの定量方法を提
供することにある。このような方法の提供により、水性
および血清サンプルのリンの定量を同時に行うことが可
能になる。
本発明は、界面活性剤、強酸、式(NH4)6MO7O2・4H2O
のモリブデン酸アンモニウム、重金属キレート剤、抗酸
化剤、所望により消泡剤、および脱イオン水からなる体
液中のリンの定量のための試薬およびそれを用いる方法
に関する。本発明の方法および試薬キツトによれば、２
回、光吸収を読み取ることによるリンの定量方法が与え
られる。最初の読み取りは、体液と試薬の混合後10秒ま
でに行えばよい。また、本発明の方法によれば、尿のよ
うな水性体液でも、また血清のような蛋白質基質体液で
も較正を変えないで実施できる体液中のリンの定量手段
が提供される。
本発明は、体液中のリンの定量方法に関する。本発明
はまた、体液中のリンの定量を実施するための試薬に関
する。本発明によれば、試薬は、リンの光学的定量方法
の従来技術に比べてリンモリブデン酸複合体の生成が著
しく緩徐になるように選ばれているので、体液と試薬の
混合後10秒までとゆつくり第一の吸収の読み取りを行え
ばよい、リンモリブデン酸複合体の生成によつて生じる
吸収を光学的に読み取るリンの定量方法が提供される。
本発明はまた、尿のような水性体液でも、血清のよう
な蛋白質基質体液でも、いずれも同じ較正を用いて測定
できる体液中のリンの定量のための方法および試薬を提
供する。
体液中のリンの定量的測定は、リンの貯留が起こる尿
毒症や慢性腎疾患のようないくつかの疾患の診断に重要
である。
本発明の試薬では、体液中のいわゆる無機リン酸量の
みが測定される。本明細書において、リンの濃度または
量といつた場合には、これらの無機リン酸中のリンを意
味するものである。
有機リン、たとえばリン脂質、リン酸エステルおよび
リン酸ヌクレオチドの変動の意義は実際、臨床的問題に
容易には結びつかない。
本発明の試薬は、以下に述べるように構成される。与
えられた濃度は、試薬が完全に処方されたのちの特定の
成分の濃度である。約0.01％w/v〜約５％w/vの界面活性
剤、約0.001％w/v〜約0.5％w/vの重金属キレート剤であ
るＮ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、およ
び約0.0001％w/v〜約0.01％w/vの抗酸化剤としてのブチ
ル化ヒドロキシアニソールを脱イオン水中に含有する溶
液に、約0.675M〜約1.25Mの濃度の硫酸を添加する。こ
れに、約1.75mM〜約6.25mMの濃度のモリブデン酸アンモ
ニウムを加え、ついで所望により、最後に約0.001％〜
0.1％w/vの範囲の消泡剤を添加する。
本明細書において用いられるＭは１あたりのモル
を、mMは１あたりのmMを、％w/vは溶液100ml中のグラ
ムを意味する。同様に、溶液100ml中0.5gは0.5％w/vで
ある。
本発明の試薬の界面活性剤は、同じリン濃度の血液お
よび水性体液で同じ吸収の読みを与えるような界面活性
剤でなければならない。本発明の試薬の界面活性剤は、
試験される体液からの蛋白質の沈殿も防止するものでな
ければならない。このような界面活性剤の例には、化学
式C12H25(OCH2CH2)23OHを有する非イオン界面活性剤、
ポリオキシエチレン（23）ラウリルエーテルがある。と
くに好ましい界面活性剤は、化学式C18H35(OCH2CH2)20O
Hを有する非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレン（2
0）オレイルエーテルである。
重金属キレート化合物の例には、クエン酸、さらに特
定すれば、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸である。
本発明の試薬の抗酸化剤は、界面活性剤の酸化を防止
できる任意の抗酸化剤である。とくに好ましい抗酸化剤
としてはブチル化ヒドロキシアニソールがある。
本発明の試薬の強酸は、水溶液中でほぼ完全にイオン
化する大部分の酸であつてよい。強酸の例としては、ア
ルキルおよび芳香族スルホン酸、とくにメタンスルホン
酸およびエタンスルホン酸のようなアルキルスルホン酸
ならびにフエニルスルホン酸およびナフタレンスルホン
酸のようなアリールスルホン酸を挙げることができる。
トリニトロ安息香酸のような安息香酸も使用できる。そ
の他の強酸には、塩酸、トリフルオロ酢酸、フルオホウ
酸、ヨウ化水素酸、硫酸、ヨード酸、過ヨード酸、セレ
ン酸、シユウ酸、マレイン酸、ジクロロ酢酸およびシク
ロプロパン−1,1−ジカルボン酸が包含される。本発明
の試薬における強酸としては硫酸がとくに好ましい。
本発明の特定の試薬は次のように製造された。
１の試薬は、約500mlの脱イオン水に、まず7gのBri
j 99、ブチル化ヒドロキシアニソール0.01gおよびＮ−
ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸0.15gを溶解
することにより調製した。これに、濃硫酸41.7mlを加え
た。2.55gのモリブデン酸アンモニウムをついで試薬に
溶解し、最後に100μｌの消泡剤、Colloid 1010を溶か
した。試薬の総容量が１になるように、十分の脱イオ
ン水を追加した。
上記例の調製に用いた界面活性剤、 Brij 99は、化学式C18H35(OCH2CH2)20OHのポリオキシ
エチレン（20）オレイルエーテルで、分子量1149.56、
融点25〜30℃である。
Colloid 1010はColloid,Inc.（394、Freling huysen
Avenue,Newark,N.J.07114）から販売されている。Collo
id 1010は、以下の性質を有するシリコン基剤の発泡抑
制剤である。
外観：不透明安定な液体 色：白色 種類：安定な乳化液 非揮発性残分（105℃、％）:15.0 比重（25℃、％）:1.0 シリコン液含量％:10.0 発泡による問題を回避するため、本発明の試薬の好ま
しい態様では消泡剤が包含される。
本発明の試薬は、以下の濃度の試薬で処方することが
できる。与えられた濃度は、試薬が完全に処方されたの
ちの特定の成分の濃度である。
約0.01％w/v〜約５％w/vの界面活性剤、約0.001％w/v
〜約0.5％w/vのＮ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン
三酢酸、および約0.0001％w/v〜約0.01％w/vのブチル化
ヒドロキシアニソールを脱イオン水中に含有する溶液
に、硫酸を濃度約0.675M〜約1.25Mに加える。これに、
モリブデン酸アンモニウムを濃度約1.75mM〜約6.25Mを
加え、ついで最後に、所望により、約0.001％w/v〜約0.
1％w/vの範囲の消泡剤を加える。
本発明の試薬の利点は次の通りである。すなわち、本
発明の試薬は、従来技術の２種試薬混合物に対して、単
一試薬混合物である。したがつて、本発明の試薬は、定
量に際して、混合の必要がない。
さらに、サンプルと本発明の試薬の反応は従来技術の
試薬の場合よりある程度遅いので、最初の吸収の読み取
りを行うまでに10秒までが経過してもよい。したがつ
て、米国特許第3,795,484号のように、最初の吸収の読
み取りを、試薬とサンプルの混合物の生成後２秒以内に
行つてリンの測定値を得る従来技術に比べて便利であ
る。上述したように、本発明においては、最初の吸収の
読みは試薬とサンプルの混合後10秒までに行えばよく、
好ましくは最初の吸収の読みは試薬とサンプルを混合し
てから約4.5秒後に行われる。
最後に、従来技術に比して本発明の決定的な利点は、
水性および血清の両サンプルが、水性または血清標準の
いずれにも使用できる唯一の較正を必要とするのみで一
緒に検定できることである。等濃度の水性および血清サ
ンプルの反応速度はわずかに相違するが、本発明の試薬
ではリン濃度が等しい水性および血清サンプルの吸収の
変化は同じだからである。
本発明の試薬は任意の非遠心分離または遠心分離分析
光度計、とくにCOBASTM診断システムBIO 、FARA およ
びMIRA に使用できるように設計されている。
体液中のリン量は、本発明の方法により、体液、希釈
用脱イオン水および試薬の混合物を生成させることによ
つて定量的に測定される。体液と希釈液プラス試薬の容
量比は約1:125〜1:30の範囲に変化させることができ、
約1:50が好ましい。ついで最初の340nmでの吸収の読み
取りを行う。最初の吸収の読み取りは、混合物の生成か
ら10秒後までに行う。この吸収の読み取りは、非遠心分
離、または好ましくは遠心分離分析光度計によつて行わ
れる。
第二の吸収の読み取りは混合物の生成後10分以内に行
われる。本発明の試薬の場合、体液と試薬の反応は比較
的遅いので、この最初の吸収の読み取りはサンプルブラ
ンクとして役立つ。
次に、２回の吸収の読みの間の差を既知濃度の液体の
吸収と比較して、試験体液中のリンの量を定量する。
本発明の試薬の効力を明らかにする以下の試験では、
サンプル５μｌ、希釈液（脱イオン水）50μｌ、プラス
試薬200μｌを、COBAS BIO 遠心分離分析計のキユベツ
トローター上それぞれの各コンパートメントに平行して
添加した。ついで、反応を340nmでモニタリングした。
最初の吸収の読み取りは、混合後4.5秒に実施した。
この時点では、反応はわずかしか起こつておらず、した
がつてこの読みはサンプルブランクとして用いることが
できる。第二の読み取りは、反応がほぼ完了した混合後
３分に行われた。最後と最初の吸収の読みの差に、既知
リン濃度の標準から計算された較正フアクターを乗じる
ことによつて、リンの濃度が計算された。
反応の初期に読み取つた吸収の値は自動サンプルブラ
ンクを提供し、これは検定される血脂性、黄疸性および
溶血サンプルについても妨害のない正確な値を与える。
本発明の試薬のサンプル盲検能を示す試験 この試験には以下の材料を使用した。
１）水性標準−無機リン（3,6および12mg/dlのリン）を
含む水性標準 ２）正常ヒト血清−（熱不活化、濾過、0.1％アジド）
−KH2PO4（リン酸カルシウム）を補充しリン1.5、４、
６、８、10、12、14、16および18mg/mlを含有するサン
プルを調製 ３）血脂性および溶血サンプル ４）以下に記載の無機リン用試薬−（サンプルブランク
との２試薬系） ５）本発明の１試薬系 最初に、血脂性および溶血患者サンプルをサンプルブ
ランクを与えることが知られている２試薬系を用いて検
定した。２試薬系では、サンプルを、0.36モル/lの硫酸
を含有する第一の試薬と混合し、サンプルブランク吸収
の測定を340nmで行う。ついで5.4ミリモル/lのモリブデ
ン酸アンモニウムを含む第二の試薬を加え、15秒後に第
二の吸収測定を340nmで行う。第二の吸収の読みから第
一の吸収の読みを差し引くと、サンプル中に存在するリ
ンによる正味の吸収変化が得られる。次に同じサンプル
を用いて、本発明の１試薬系を用いて定量を行つた。
結果： 第Ｉ表は、上述の２試薬系および本発明の１試薬系の
両者で、脂血性および溶血サンプルからほぼ等しい結果
が得られ、本発明の１試薬系が、サンプルブランク吸収
の測定を包含する、確立された従来技術のリン検定法
と、その正確さにおいて匹敵するものであることを示し
ている。第Ｉ表には、本発明の試薬のサンプル盲検能を
示す。
水性および血清基質サンプルが水性標準で定量できる
ことを示す試験 この試験では以下の材料を使用した。
１）無機リン（3,6および12mg/dlのリン）を含有する水
性標準 ２）水性サンプル−蒸留水にリン酸カリウムを補給し、
リン1.5、４、６、８、10、12、14、16および18mg/dlの
サンプルを与える ３）血清サンプル−正常ヒト血清（熱不活化、濾過、0.
1％アジド）にリン酸カリウムを添加し、リン1.5、４、
６、８、10、12、14、16および18mg/dlのサンプルを得
る ４）上述の無機リンに対する試薬−（サンプルブランク
と２試薬系） ５）本発明の１試薬系 結果： 同じリン濃度の水性および血清サンプルを上述の２試
薬系および本発明の１試薬系の両者で、装置の較正には
水性標準のみを用い、COBAS BIO で測定した。
第II表には、較正に用いた水性標準のリン濃度、なら
びにこの検量曲線に対して検定した水性および血清サン
プルのリン濃度を示す。各リン濃度の次は、最初の4.5
秒後の読みから最後の３分後の読みへの340nmの吸収の
変化である。同じまたは類似のリン濃度の水性および血
清サンプルにおける変化は等しいかまたは比例し、水性
および血清サンプルの反応速度は異なるにもかかわら
ず、較正には水性標準のみを用い、本発明の試薬で、水
性および血清サンプルを定量できることが明らかであ
る。
水性および血清サンプルが水性または血清標準のいず
れによつても試験できることを示す試験 この試験には以下の材料を使用した。
１）リン（3,6および12mg/dlのリン）を含有する水性標
準 ２）既知リンレベルのヒト血清サンプル ３）正常ヒト血清（熱不活化、濾過、0.1％アジド）に
リン酸カリウムを添加し、リン1.5、４、６、８、10、1
2および14mg/dlのサンプルを得る ４）脱イオン水で1:10に希釈した尿サンプル ５）正常および脂血性ヒト血清サンプル この試験の実施に際しては、サンプルを最初、上述の
２試薬系で、較正には水性標準を用いて検定した。同じ
サンプルを本発明の１試薬系で、最初水性標準による較
正で、次に血清標準による較正で検定した。
第III表には３種の異なる検定は、サンプルが正常血
清、脂血性血清または尿のいずれであつても、結果がよ
く相関することを示している。本発明の１試薬系に対す
る較正フアクターは、水性または血清標準のいずれを用
いてもほぼ同じであつた。
結果：
フロントページの続き (72)発明者 デニス ザウンクズコウスキー アメリカ合衆国ニュージャージー州，ウォ ーリントン マウント プレザント アベ ニュー 46 (56)参考文献 特開 昭53−3391（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−153167（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501225（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】約0.01％w/v〜約５％w/vの範囲の界面活性
    剤、約0.675M〜約1.25Mの範囲の強酸、約1.75mM〜約6.2
    5mMの範囲のモリブデン酸アンモニウム、重金属キレー
    ト剤、抗酸化剤および脱イオン水からなる体液中のリン
    の定量用組成物
  2. 【請求項２】界面活性剤は化学式C18H35(OCH2CH2)20OH
    のポリオキシエチレン（20）オレイルエーテルである特
    許請求の範囲第１項に記載の組成物
  3. 【請求項３】強酸は硫酸である特許請求の範囲第１項に
    記載の組成物
  4. 【請求項４】重金属キレート剤は約0.001％w/v〜約0.5
    ％w/vの範囲のＮ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン
    三酢酸であり、抗酸化剤は約0.0001％w/v〜0.01％w/vの
    範囲のブチル化ヒドロキシアニソールである特許請求の
    範囲第３項に記載の組成物
  5. 【請求項５】化学式C18H35(OCH2CH2)20OHのポリオキシ
    エチレン（20）オレイルエーテル約7g/l、濃硫酸約41.7
    ml/l、モリブデン酸アンモニウム約2.55g/l、Ｎ−ヒド
    ロキシエチルエチレンジアミン三酢酸約0.15g/l、ブチ
    ル化ヒドロキシアニソール約0.01g/l、消泡剤約100μl/
    l、および残部の脱イオン水からなる特許請求の範囲第
    １項に記載の組成物
  6. 【請求項６】リン含有体液とモリブデン酸アンモニウム
    溶液の混合物を界面活性剤の存在下に生成させ、遠心分
    離または非遠心分離アナライザーを用いてリン含有体液
    中の水性または血清リンを定量する方法において、界面
    活性剤として化学式C18H35(OCH2CH2)20OHのポリオキシ
    エチレン（20）オレイルエーテルを、抗酸化剤としてブ
    チル化ヒドロキシアニソールを、重金属キレート剤とし
    てＮ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸を使用
    する改良
  7. 【請求項７】（ａ）体液と、約0.01％w/v〜約５％w/vの
    範囲の界面活性剤、約0.675M〜約1.25Mの範囲の強酸、
    約1.75mM〜約6.25mMの範囲のモリブデン酸アンモニウ
    ム、重金属キレート剤、抗酸化剤および脱イオン水から
    なる組成物との混合物を生成させ、（ｂ）工程（ａ）の
    混合物の生成後10秒以内に、光度計を用いて340nmにお
    ける第一の吸収を読み取り、（ｃ）工程（ａ）の混合物
    の生成後10分以内に340nmにおける第二の吸収を読み取
    り、（ｄ）２つの吸収の読みの差を既知リン濃度の液体
    からの吸収の読みと比較して体液中のリンを定量的に測
    定することを特徴とする体液中のリンの定量方法
  8. 【請求項８】界面活性剤は化学式C18H35(OCH2CH2)20OH
    のポリオキシエチレン（20）オレイルエーテルである特
    許請求の範囲第７項に記載の方法
  9. 【請求項９】強酸は硫酸である特許請求の範囲第８項に
    記載の方法
  10. 【請求項１０】金属キレート剤は約0.001％w/v〜約0.5
    ％w/vの範囲のＮ−ヒドキロシエチルエチレンジアミン
    三酢酸であり、抗酸化剤は約0.0001％w/v〜約0.01％w/v
    の範囲のブチル化ヒドロキシアニソールである特許請求
    の範囲第９項に記載の方法
JP1184405A 1988-07-18 1989-07-17 体液中のリンの定量方法 Expired - Lifetime JPH0812197B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

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