JPH0812700A - マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0812700A JPH0812700A JP6173718A JP17371894A JPH0812700A JP H0812700 A JPH0812700 A JP H0812700A JP 6173718 A JP6173718 A JP 6173718A JP 17371894 A JP17371894 A JP 17371894A JP H0812700 A JPH0812700 A JP H0812700A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 マウスのＣＤ４０に特異的に反応するモノク
ローナル抗体、その活性フラグメント、該モノクローナ
ル抗体の製造方法、及び該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの提供。 【構成】 マウスの細胞表面抗原であるＣＤ４０分子に
特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活性フ
ラグメント。ＷＥＨＩ２３１細胞で免疫感作した齧歯類
動物から脾臓を摘出して常法に従ってマウスのミエロー
マ細胞と融合、所望の抗体を生成するハイブリドーマを
選択した後、限界希釈法により、単一クローンにし、
（７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収することを特徴とするマ
ウスのＣＤ４０に対するモノクローナル抗体の製造方
法。マウスの細胞表面に存在するＣＤ４０分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。
ローナル抗体、その活性フラグメント、該モノクローナ
ル抗体の製造方法、及び該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの提供。 【構成】 マウスの細胞表面抗原であるＣＤ４０分子に
特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活性フ
ラグメント。ＷＥＨＩ２３１細胞で免疫感作した齧歯類
動物から脾臓を摘出して常法に従ってマウスのミエロー
マ細胞と融合、所望の抗体を生成するハイブリドーマを
選択した後、限界希釈法により、単一クローンにし、
（７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収することを特徴とするマ
ウスのＣＤ４０に対するモノクローナル抗体の製造方
法。マウスの細胞表面に存在するＣＤ４０分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体に
関し、さらに詳しくは、マウスのＣＤ４０分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体、その活性フラグメン
ト、該モノクローナル抗体の製造方法、及び該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。なお、
本発明において、モノクローナル抗体の活性フラグメン
トとは、抗原抗体反応活性を有するフラグメントを指称
し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、
Ｆｖ、及び組み替えＦｖ体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）な
どである。
関し、さらに詳しくは、マウスのＣＤ４０分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体、その活性フラグメン
ト、該モノクローナル抗体の製造方法、及び該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。なお、
本発明において、モノクローナル抗体の活性フラグメン
トとは、抗原抗体反応活性を有するフラグメントを指称
し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、
Ｆｖ、及び組み替えＦｖ体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）な
どである。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ細胞の増殖、分化に対するＴ細胞の作
用様式には、２通りあり、そのひとつは、インターロイ
キン（ＩＬ）などの種々のサイトカインを産生、分泌し
て、Ｂ細胞の増殖と抗体産生細胞への分化を誘導するも
のである。Ｔ細胞によるもうひとつの作用様式は、Ｂ細
胞と接触することによって、Ｂ細胞を活性化する働きで
ある。特に、Ｂ細胞が、Ｔ細胞依存性抗原に対する特異
抗体を産生する際には、Ｂ細胞に対するＴ細胞の物理的
な接触が不可欠である。この場合、Ｔ細胞は、抗原分子
を仲介として、Ｂ細胞と接触することにより、Ｂ細胞を
活性化させる。すなわち、Ｔ細胞は、特異抗原の存在下
に、ＭＨＣクラスＩＩの一致したＢ細胞と結合し、こう
したＢ細胞のみがＴ細胞の補助によって、増殖、分化す
ることができる。このように、Ｂ細胞の活性化には、Ｔ
細胞との特異抗原依存性の接触が必要であることから、
Ｔ細胞の表面に存在する何らかの分子が、Ｂ細胞の表面
に存在する分子と結合することにより、Ｂ細胞に活性化
シグナルを伝達すると想定されている。
用様式には、２通りあり、そのひとつは、インターロイ
キン（ＩＬ）などの種々のサイトカインを産生、分泌し
て、Ｂ細胞の増殖と抗体産生細胞への分化を誘導するも
のである。Ｔ細胞によるもうひとつの作用様式は、Ｂ細
胞と接触することによって、Ｂ細胞を活性化する働きで
ある。特に、Ｂ細胞が、Ｔ細胞依存性抗原に対する特異
抗体を産生する際には、Ｂ細胞に対するＴ細胞の物理的
な接触が不可欠である。この場合、Ｔ細胞は、抗原分子
を仲介として、Ｂ細胞と接触することにより、Ｂ細胞を
活性化させる。すなわち、Ｔ細胞は、特異抗原の存在下
に、ＭＨＣクラスＩＩの一致したＢ細胞と結合し、こう
したＢ細胞のみがＴ細胞の補助によって、増殖、分化す
ることができる。このように、Ｂ細胞の活性化には、Ｔ
細胞との特異抗原依存性の接触が必要であることから、
Ｔ細胞の表面に存在する何らかの分子が、Ｂ細胞の表面
に存在する分子と結合することにより、Ｂ細胞に活性化
シグナルを伝達すると想定されている。
【０００３】最近、このような接触依存性のシグナル伝
達において、Ｂ細胞上のＣＤ４０分子が重要な働きをし
ていることが判明した。さらに、このＣＤ４０に対応す
るＴ細胞上の分子が、ＣＤ４０リガンドとして同定され
た。ＣＤ４０を通して活性化されたＢ細胞は、分化、増
殖、クラススイッチをＴ細胞の非存在下に起こすことか
ら、抗ＣＤ４０抗体による刺激が、Ｔ細胞の接触依存性
のヘルパー活性を代替しているのではないかと考えられ
た。
達において、Ｂ細胞上のＣＤ４０分子が重要な働きをし
ていることが判明した。さらに、このＣＤ４０に対応す
るＴ細胞上の分子が、ＣＤ４０リガンドとして同定され
た。ＣＤ４０を通して活性化されたＢ細胞は、分化、増
殖、クラススイッチをＴ細胞の非存在下に起こすことか
ら、抗ＣＤ４０抗体による刺激が、Ｔ細胞の接触依存性
のヘルパー活性を代替しているのではないかと考えられ
た。
【０００４】ＣＤ４０は、４５〜５０ｋＤａの膜糖蛋白
であり、そのｃＤＮＡは、８３１塩基対の読み取り枠
（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を持ち、そ
して、細胞外部分は１９３アミノ酸、膜貫通部は２２ア
ミノ酸、細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄ
ｏｍａｉｎ）は２２アミノ酸からなっている。ＣＤ４０
は、構造的には、神経成長因子受容体（ＮＧＦ受容体：
ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）ファミリーに属しており、ＮＧＦ受容体、腫瘍
壊死因子受容体（ＴＮＦ受容体）、Ｔ細胞上のＣＤ２
７、及びＦａｓ抗原と類似性を有している。
であり、そのｃＤＮＡは、８３１塩基対の読み取り枠
（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を持ち、そ
して、細胞外部分は１９３アミノ酸、膜貫通部は２２ア
ミノ酸、細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄ
ｏｍａｉｎ）は２２アミノ酸からなっている。ＣＤ４０
は、構造的には、神経成長因子受容体（ＮＧＦ受容体：
ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）ファミリーに属しており、ＮＧＦ受容体、腫瘍
壊死因子受容体（ＴＮＦ受容体）、Ｔ細胞上のＣＤ２
７、及びＦａｓ抗原と類似性を有している。
【０００５】ＣＤ４０は、Ｂ細胞関連抗原であり、正常
Ｂ細胞、腫瘍Ｂ細胞などに発現している。ＣＤ４０は、
Ｂ細胞以外にも、胸腺上皮細胞や、濾胞樹状細胞（ｆｏ
ｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、
相互連結細胞（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｉｎｇ ｃｅｌ
ｌ）に発現が見られる。しかし、これらの細胞における
ＣＤ４０の機能は、不明である。ＣＤ４０は、膀胱腫
瘍、肺癌、乳癌、結腸癌などの腫瘍細胞にも発現する場
合があり、腫瘍細胞の増殖にも関係している可能性があ
る。
Ｂ細胞、腫瘍Ｂ細胞などに発現している。ＣＤ４０は、
Ｂ細胞以外にも、胸腺上皮細胞や、濾胞樹状細胞（ｆｏ
ｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、
相互連結細胞（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｉｎｇ ｃｅｌ
ｌ）に発現が見られる。しかし、これらの細胞における
ＣＤ４０の機能は、不明である。ＣＤ４０は、膀胱腫
瘍、肺癌、乳癌、結腸癌などの腫瘍細胞にも発現する場
合があり、腫瘍細胞の増殖にも関係している可能性があ
る。
【０００６】ＣＤ４０リガンドは、活性化Ｔ細胞に発現
する。活性化Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンドがＢ細胞上の
ＣＤ４０と結合することにより、Ｂ細胞を活性化すると
考えられている。抗ＣＤ４０抗体刺激によって、Ｂ細胞
の増殖、分化、クラススイッチ、アポトーシスの抑制と
いった現象が見られるが、これらの現象は、Ｔ細胞上の
ＣＤ４０リガンドによって接触依存性に調節されている
と考えられる。
する。活性化Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンドがＢ細胞上の
ＣＤ４０と結合することにより、Ｂ細胞を活性化すると
考えられている。抗ＣＤ４０抗体刺激によって、Ｂ細胞
の増殖、分化、クラススイッチ、アポトーシスの抑制と
いった現象が見られるが、これらの現象は、Ｔ細胞上の
ＣＤ４０リガンドによって接触依存性に調節されている
と考えられる。
【０００７】Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化とは逆方向
に、活性化Ｂ細胞に発現されるＢ７抗原は、Ｔ細胞上の
ＣＤ２８と結合することにより、Ｔ細胞を活性化するこ
とが知られている。ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、及び
Ｂ７／ＣＤ２８の組み合わせ以外にも、ＣＤ２２、ＣＤ
１１ａ／ＣＤ１８などＴ−Ｂ相互作用をつかさどる分子
が見いだされている。そして、これらの分子によって、
Ｔ−Ｂ間の接触依存性の情報交換が行われている。
に、活性化Ｂ細胞に発現されるＢ７抗原は、Ｔ細胞上の
ＣＤ２８と結合することにより、Ｔ細胞を活性化するこ
とが知られている。ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、及び
Ｂ７／ＣＤ２８の組み合わせ以外にも、ＣＤ２２、ＣＤ
１１ａ／ＣＤ１８などＴ−Ｂ相互作用をつかさどる分子
が見いだされている。そして、これらの分子によって、
Ｔ−Ｂ間の接触依存性の情報交換が行われている。
【０００８】ＩＬ−４、ＩＬ−１０などのサイトカイン
は、接触非依存性にＣＤ４０／ＣＤ４０リガンドを介し
て、活性化されたＢ細胞を増殖分化させる。この場合、
Ｂ細胞は、抗ＣＤ４０抗体のみでは抗体産生は起きず、
ＩＬ−１０の添加によりＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ産生細
胞に分化し、また、ＩＬ−４添加によりＩｇＥ産生細胞
に分化することが知られている。したがって、Ｂ細胞の
抗体産生細胞への分化は、接触依存性の分子と非依存性
の分子によって調節されているといえる。
は、接触非依存性にＣＤ４０／ＣＤ４０リガンドを介し
て、活性化されたＢ細胞を増殖分化させる。この場合、
Ｂ細胞は、抗ＣＤ４０抗体のみでは抗体産生は起きず、
ＩＬ−１０の添加によりＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ産生細
胞に分化し、また、ＩＬ−４添加によりＩｇＥ産生細胞
に分化することが知られている。したがって、Ｂ細胞の
抗体産生細胞への分化は、接触依存性の分子と非依存性
の分子によって調節されているといえる。
【０００９】野々山 恵章らは、血清Ｉｇ全般が低値を
示す分類不能型免疫不全症（ｃｏｍｍｏｎ ｖａｒｉａ
ｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）やＩｇＭ
は正常ないし高値を示すが、ＩｇＧやＩｇＡへのクラス
スイッチが起きずに低値を示す高ＩｇＭ症候群（ｈｙｐ
ｅｒ−ＩｇＭ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの免疫不全患者
のＢ細胞を、抗ＣＤ４０抗体とサイトカインで刺激する
と、ＩｇＭとＩｇＥ産生が誘導されることを明らかにし
た（臨床免疫第２５巻第５号第６１１〜６１５頁）。こ
のことから、これらの免疫不全患者のＴ細胞にＣＤ４０
リガンドの異常があると推定された。そこで、Ｔ細胞を
ＰＭＡ、ＰＨＡで活性化し、ＣＤ４０リガンドを検討し
た結果、発現低下や機能異常が見られたことが報告され
ている。ＣＤ４０リガンド発現不全は、低グロブリン血
症やクラススイッチ障害の原因になっている可能性があ
り、ｉｎ ｖｉｖｏでもＣＤ４０／ＣＤ４０リガンドに
よるＢ細胞の活性化が重要であることが示唆されてい
る。
示す分類不能型免疫不全症（ｃｏｍｍｏｎ ｖａｒｉａ
ｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）やＩｇＭ
は正常ないし高値を示すが、ＩｇＧやＩｇＡへのクラス
スイッチが起きずに低値を示す高ＩｇＭ症候群（ｈｙｐ
ｅｒ−ＩｇＭ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの免疫不全患者
のＢ細胞を、抗ＣＤ４０抗体とサイトカインで刺激する
と、ＩｇＭとＩｇＥ産生が誘導されることを明らかにし
た（臨床免疫第２５巻第５号第６１１〜６１５頁）。こ
のことから、これらの免疫不全患者のＴ細胞にＣＤ４０
リガンドの異常があると推定された。そこで、Ｔ細胞を
ＰＭＡ、ＰＨＡで活性化し、ＣＤ４０リガンドを検討し
た結果、発現低下や機能異常が見られたことが報告され
ている。ＣＤ４０リガンド発現不全は、低グロブリン血
症やクラススイッチ障害の原因になっている可能性があ
り、ｉｎ ｖｉｖｏでもＣＤ４０／ＣＤ４０リガンドに
よるＢ細胞の活性化が重要であることが示唆されてい
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、マウ
スのＣＤ４０に特異的に反応するモノクローナル抗体、
その活性フラグメント、該モノクローナル抗体の製造方
法、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを提供することにある。前記したとおり、Ｔ細胞上の
ＣＤ４０リガンドは、Ｂ細胞上のＣＤ４０と結合してＢ
細胞を活性化し、一方、Ｂ細胞上のＢ７は、Ｔ細胞上の
ＣＤ２８と結合しＴ細胞を活性化する。これらの２つの
経路は、Ｔ細胞受容体によるＴ細胞の活性化、あるいは
表面ＩｇによるＢ細胞の活性化という、抗原特異的では
あるが、それだけでは不十分なシグナルを、ＣＤ４０等
の分子が補助分子として増幅する役割を果たしているこ
とを示している。特に、これら２つの経路は、活性化が
強力であることから、最も主要な補助因子であると考え
られる。
スのＣＤ４０に特異的に反応するモノクローナル抗体、
その活性フラグメント、該モノクローナル抗体の製造方
法、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを提供することにある。前記したとおり、Ｔ細胞上の
ＣＤ４０リガンドは、Ｂ細胞上のＣＤ４０と結合してＢ
細胞を活性化し、一方、Ｂ細胞上のＢ７は、Ｔ細胞上の
ＣＤ２８と結合しＴ細胞を活性化する。これらの２つの
経路は、Ｔ細胞受容体によるＴ細胞の活性化、あるいは
表面ＩｇによるＢ細胞の活性化という、抗原特異的では
あるが、それだけでは不十分なシグナルを、ＣＤ４０等
の分子が補助分子として増幅する役割を果たしているこ
とを示している。特に、これら２つの経路は、活性化が
強力であることから、最も主要な補助因子であると考え
られる。
【００１１】コグネイトＴ−Ｂ相互作用という古くから
認められる現象について、新しい方法による解析が可能
になってきた。ＣＤ４０リガンド及びＢ７は、発現して
いる各細胞自体には活性化シグナルを送らずに、接触す
る相手方の細胞にシグナルを送る分子として存在するよ
うである。ＣＤ４０リガンドは、活性化によって初めて
発現するが、その調節機構は未だ明らかでない。従来、
抗ヒトＣＤ４０抗体、ＩＬ−４を用いることにより、Ｃ
Ｄ４０の機能やＢ細胞活性化におけるＣＤ４０の役割等
の解明が進められてきたが、これは、Ｂ細胞に抗ヒトＣ
Ｄ４０抗体を添加し培養するというｉｎ ｖｉｔｒｏで
の解析にすぎなかった。
認められる現象について、新しい方法による解析が可能
になってきた。ＣＤ４０リガンド及びＢ７は、発現して
いる各細胞自体には活性化シグナルを送らずに、接触す
る相手方の細胞にシグナルを送る分子として存在するよ
うである。ＣＤ４０リガンドは、活性化によって初めて
発現するが、その調節機構は未だ明らかでない。従来、
抗ヒトＣＤ４０抗体、ＩＬ−４を用いることにより、Ｃ
Ｄ４０の機能やＢ細胞活性化におけるＣＤ４０の役割等
の解明が進められてきたが、これは、Ｂ細胞に抗ヒトＣ
Ｄ４０抗体を添加し培養するというｉｎ ｖｉｔｒｏで
の解析にすぎなかった。
【００１２】本発明者らは、マウスＣＤ４０に反応する
抗体を作製すればｉｎ ｖｉｖｏでの解析ができ、ＣＤ
４０の機能や役割の解明が進むのではないかと考え、抗
体の作製を試みた。そして、マウスＣＤ４０と反応する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
抗体を作製すればｉｎ ｖｉｖｏでの解析ができ、ＣＤ
４０の機能や役割の解明が進むのではないかと考え、抗
体の作製を試みた。そして、マウスＣＤ４０と反応する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、マウスの細胞表面抗原であるＣＤ４０分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体またはその活性フラグメ
ントが提供される。また、本発明によれば、（１）齧歯
類動物をＷＥＨＩ２３１細胞で免疫感作し、（２）免疫
した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞の懸濁液を
形成し、（３）該脾細胞懸濁をマウスのミエローマ細胞
と融合促進剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、
（４）融合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持し
ない媒質中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞が融合したハイブリドーマを選別し、（５）ハ
イブリドーマを含有する各培養穴中の上清液について、
免疫感作したＷＥＨＩ２３１（ＣＤ４０）との反応性を
指標として、抗体の存在を確認し、（６）所望の抗体を
生成するハイブリドーマを選択した後、限界希釈法によ
り、単一クローンにし、（７）この単一クローンのハイ
ブリドーマの培養上清液からモノクローナル抗体を回収
することを特徴とするマウスＣＤ４０に対するモノクロ
ーナル抗体の製造方法が提供される。さらに、本発明に
よれば、マウスの細胞表面に存在するＣＤ４０分子に特
異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマが提供される。
ば、マウスの細胞表面抗原であるＣＤ４０分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体またはその活性フラグメ
ントが提供される。また、本発明によれば、（１）齧歯
類動物をＷＥＨＩ２３１細胞で免疫感作し、（２）免疫
した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞の懸濁液を
形成し、（３）該脾細胞懸濁をマウスのミエローマ細胞
と融合促進剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、
（４）融合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持し
ない媒質中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞が融合したハイブリドーマを選別し、（５）ハ
イブリドーマを含有する各培養穴中の上清液について、
免疫感作したＷＥＨＩ２３１（ＣＤ４０）との反応性を
指標として、抗体の存在を確認し、（６）所望の抗体を
生成するハイブリドーマを選択した後、限界希釈法によ
り、単一クローンにし、（７）この単一クローンのハイ
ブリドーマの培養上清液からモノクローナル抗体を回収
することを特徴とするマウスＣＤ４０に対するモノクロ
ーナル抗体の製造方法が提供される。さらに、本発明に
よれば、マウスの細胞表面に存在するＣＤ４０分子に特
異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマが提供される。
【００１４】以下、本発明について詳述する。本発明の
モノクローナル抗体は、マウスのＣＤ４０に特異的に反
応するモノクローナル抗体である。該モノクローナル抗
体は、ＩｇＧ型のハムスター抗体である。サブクラス
は、ＩｇＧ1型である。このモノクローナル抗体の活性
フラグメントとは、抗原抗体反応活性を有するフラグメ
ントを指称し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａ
ｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組み替えＦｖ体、一本鎖Ｆｖ
（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。生体内におけるＣＤ４
０のＢ細胞活性化における役割を解明する等の目的のた
めには、必ずしも、モノクローナル抗体分子の全体を用
いる必要がなく、活性を有する限り、分子の一部を用い
ることができ、また、場合によっては、その方が好まし
いことがある。
モノクローナル抗体は、マウスのＣＤ４０に特異的に反
応するモノクローナル抗体である。該モノクローナル抗
体は、ＩｇＧ型のハムスター抗体である。サブクラス
は、ＩｇＧ1型である。このモノクローナル抗体の活性
フラグメントとは、抗原抗体反応活性を有するフラグメ
ントを指称し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａ
ｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組み替えＦｖ体、一本鎖Ｆｖ
（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。生体内におけるＣＤ４
０のＢ細胞活性化における役割を解明する等の目的のた
めには、必ずしも、モノクローナル抗体分子の全体を用
いる必要がなく、活性を有する限り、分子の一部を用い
ることができ、また、場合によっては、その方が好まし
いことがある。
【００１５】本発明に係るマウスのＣＤ４０に対するモ
ノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、以下の工程を含む方法により製造
することができる。 （１）ＣＤ４０を発現しているＷＥＨＩ２３１細胞を抗
原として、齧歯類動物（例えば、アルメニアンハムスタ
ー）を免疫感作する。 （２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を形成する。 （３）該脾細胞懸濁液を、あらかじめ培養しておいたマ
ウスのミエローマ細胞と融合促進剤（例えば、ポリエチ
レングリコール）の存在下で混合して、両細胞を融合さ
せる。ここで用いるミエローマ細胞としては、次の選択
培養において、抗体産生細胞と識別可能なもの（例え
ば、８−アザグアニン耐性株）を用いる。
ノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、以下の工程を含む方法により製造
することができる。 （１）ＣＤ４０を発現しているＷＥＨＩ２３１細胞を抗
原として、齧歯類動物（例えば、アルメニアンハムスタ
ー）を免疫感作する。 （２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を形成する。 （３）該脾細胞懸濁液を、あらかじめ培養しておいたマ
ウスのミエローマ細胞と融合促進剤（例えば、ポリエチ
レングリコール）の存在下で混合して、両細胞を融合さ
せる。ここで用いるミエローマ細胞としては、次の選択
培養において、抗体産生細胞と識別可能なもの（例え
ば、８−アザグアニン耐性株）を用いる。
【００１６】（４）融合した細胞を未融合のミエローマ
細胞を支持しない媒質中で希釈して培養して、抗体産生
細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを選別
する。すなわち、抗体産生細胞は生存できるが、ミエロ
ーマ細胞は死滅する選択培地（例えば、ヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジン培地；ＨＡＴ培地）中で培
養することにより、ハイブリドーマを選別する。 （５）ハイブリドーマを含有する各培養穴（ウエル）中
の上清液について、前記免疫感作に用いたＷＥＨＩ２３
１（ＣＤ４０）との反応性を指標として、抗体の存在を
確認する（例えば、ＥＬＩＳＡ法）。これにより、選択
培地中で増殖した細胞の培養上清中に分泌されている抗
体が、所望の抗原に対するものか否かを決定する。
細胞を支持しない媒質中で希釈して培養して、抗体産生
細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを選別
する。すなわち、抗体産生細胞は生存できるが、ミエロ
ーマ細胞は死滅する選択培地（例えば、ヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジン培地；ＨＡＴ培地）中で培
養することにより、ハイブリドーマを選別する。 （５）ハイブリドーマを含有する各培養穴（ウエル）中
の上清液について、前記免疫感作に用いたＷＥＨＩ２３
１（ＣＤ４０）との反応性を指標として、抗体の存在を
確認する（例えば、ＥＬＩＳＡ法）。これにより、選択
培地中で増殖した細胞の培養上清中に分泌されている抗
体が、所望の抗原に対するものか否かを決定する。
【００１７】（６）所望の抗体を生成するハイブリドー
マを選択した後、限界希釈法によりクローニングして、
単一クローンにする。 （７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収する。 （８）回収したモノクローナル抗体が細胞表面のマウス
ＣＤ４０分子と特異的に反応することを確認する。
マを選択した後、限界希釈法によりクローニングして、
単一クローンにする。 （７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収する。 （８）回収したモノクローナル抗体が細胞表面のマウス
ＣＤ４０分子と特異的に反応することを確認する。
【００１８】
【実施例】以下、本発明について、実施例を挙げて具体
的に説明する。
的に説明する。
【００１９】［実施例１］ （１）免疫感作 マウスＢ細胞株であるＷＥＨＩ２３１細胞（マウスＣＤ
４０分子を発現している細胞）１×１０7個をＰＢＳに
懸濁し、ｐｏｌｙＡｐｏｌｙＵアジュバンドと共に、ア
ルメニアンハムスターの腹腔に免疫感作した。次いで、
１週間後、ＷＥＨＩ２３１ １×１０7コをｐｏｌｙＡ
ｐｏｌｙＵと混合し、同一ハムスターの腹腔に追加免疫
感作した。この操作を１週間に一回、合計４回繰り返し
て、免疫感作を実施した。
４０分子を発現している細胞）１×１０7個をＰＢＳに
懸濁し、ｐｏｌｙＡｐｏｌｙＵアジュバンドと共に、ア
ルメニアンハムスターの腹腔に免疫感作した。次いで、
１週間後、ＷＥＨＩ２３１ １×１０7コをｐｏｌｙＡ
ｐｏｌｙＵと混合し、同一ハムスターの腹腔に追加免疫
感作した。この操作を１週間に一回、合計４回繰り返し
て、免疫感作を実施した。
【００２０】（２）細胞融合 上記で免疫感作したハムスターから脾臓を取り出した。
取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ
１６４０培地に浮遊させ、脾細胞１×１０8個を得た。
この脾細胞を、マウス由来の８−アザグアニン耐性株
（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損株）Ｐ３Ｕ１（２×１０7個）と、約５：１
の割合で混合し、遠心した（１５００ｒｐｍ、５分
間）。得られた細胞のペレットに、融合促進剤として５
０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）／
ＲＰＭＩ１６４０溶液２ｍｌを、３７℃の温水中で攪拌
しながら６分間を要して加え、細胞融合を行った。細胞
融合後、大量（約４０ｍｌ）のＲＰＭＩ１６４０液を加
え、遠心分離して上清を除去した。次いで、ヒポキサン
チン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、
及びチミジン（１０μＭ）を含む１０％ＦＢＳ−ＲＭＰ
Ｉ１６４０培地（ＨＡＴ）培地にて、脾細胞が１×１０
6コ／ｍｌになるように調製した。
取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ
１６４０培地に浮遊させ、脾細胞１×１０8個を得た。
この脾細胞を、マウス由来の８−アザグアニン耐性株
（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損株）Ｐ３Ｕ１（２×１０7個）と、約５：１
の割合で混合し、遠心した（１５００ｒｐｍ、５分
間）。得られた細胞のペレットに、融合促進剤として５
０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）／
ＲＰＭＩ１６４０溶液２ｍｌを、３７℃の温水中で攪拌
しながら６分間を要して加え、細胞融合を行った。細胞
融合後、大量（約４０ｍｌ）のＲＰＭＩ１６４０液を加
え、遠心分離して上清を除去した。次いで、ヒポキサン
チン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、
及びチミジン（１０μＭ）を含む１０％ＦＢＳ−ＲＭＰ
Ｉ１６４０培地（ＨＡＴ）培地にて、脾細胞が１×１０
6コ／ｍｌになるように調製した。
【００２１】（３）ハイブリドーマの選択 上記で調製した細胞浮遊液を、９６ウェル（培養穴）マ
イクロプレート５枚に２００μｌずつ分注し、３７℃、
ＣＯ2下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。
２週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成
し、増殖していることが確認できた。
イクロプレート５枚に２００μｌずつ分注し、３７℃、
ＣＯ2下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。
２週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成
し、増殖していることが確認できた。
【００２２】（４）抗体の検出 ハイブリドーマが十分増殖していることが確認されたの
で、その培養上清を用い、得られたハイブリドーマが産
生する抗体が、ＣＤ４０分子と反応するか否かをＦＡＣ
Ｓで調べ、抗体の検出を行った。まず、免疫感作に用い
たＷＥＨＩ２３１細胞との反応性を調べ、さらに、マウ
スＣＤ４０トランスフェクタントと反応するものを選別
した。ＷＥＨＩ２３１細胞を回収後、フィッシャーチュ
ーブに細胞を１×１０6個ずつ入れ、次いで、ハイブリ
ドーマの培養上清を２００μｌ入れて、氷上で３０分間
反応させた。次に、ＰＢＳで遠心洗浄（３０００ｒｐ
ｍ、１分間、３回）し、ＦＩＴＣ−抗ハムスターＩｇ′
Ｓ［カルタグ製］（１００倍希釈）を１００μｌ入れ、
氷上で２０分間反応させた。その後、ＰＢＳで遠心洗浄
を２回行い、ＰＢＳ２００μｌに懸濁し、ＦＡＣＳｃａ
ｎで測定した。その結果、ＷＥＨＩ２３１細胞との反応
が確認されたハイブリドーマについて、さらに、マウス
ＣＤ４０トランスフェクタントを用い、同様の方法でＦ
ＡＣＳ染色した。これにより、トランスフェクタントと
反応するクローンが確認でき、細胞表面に発現するマウ
スＣＤ４０に特異的に反応する抗体を産生するハイブリ
ドーマを取得することができた。
で、その培養上清を用い、得られたハイブリドーマが産
生する抗体が、ＣＤ４０分子と反応するか否かをＦＡＣ
Ｓで調べ、抗体の検出を行った。まず、免疫感作に用い
たＷＥＨＩ２３１細胞との反応性を調べ、さらに、マウ
スＣＤ４０トランスフェクタントと反応するものを選別
した。ＷＥＨＩ２３１細胞を回収後、フィッシャーチュ
ーブに細胞を１×１０6個ずつ入れ、次いで、ハイブリ
ドーマの培養上清を２００μｌ入れて、氷上で３０分間
反応させた。次に、ＰＢＳで遠心洗浄（３０００ｒｐ
ｍ、１分間、３回）し、ＦＩＴＣ−抗ハムスターＩｇ′
Ｓ［カルタグ製］（１００倍希釈）を１００μｌ入れ、
氷上で２０分間反応させた。その後、ＰＢＳで遠心洗浄
を２回行い、ＰＢＳ２００μｌに懸濁し、ＦＡＣＳｃａ
ｎで測定した。その結果、ＷＥＨＩ２３１細胞との反応
が確認されたハイブリドーマについて、さらに、マウス
ＣＤ４０トランスフェクタントを用い、同様の方法でＦ
ＡＣＳ染色した。これにより、トランスフェクタントと
反応するクローンが確認でき、細胞表面に発現するマウ
スＣＤ４０に特異的に反応する抗体を産生するハイブリ
ドーマを取得することができた。
【００２３】（５）クローニング 抗体産生細胞を、限界希釈法により１個／ウェルとなる
ように、９６ウェル・マイクロプレートに分注し、培養
した。１０日間の培養後、シングルコロニーの増殖が確
認できたため、再び（４）の抗体検出の操作を施した。
その結果、マウスＣＤ４０に対するクローンが得られ
た。得られたクローンは、ＩｇＧ1型のモノクローナル
抗体であり、これをＨＭ４０−３と命名した。
ように、９６ウェル・マイクロプレートに分注し、培養
した。１０日間の培養後、シングルコロニーの増殖が確
認できたため、再び（４）の抗体検出の操作を施した。
その結果、マウスＣＤ４０に対するクローンが得られ
た。得られたクローンは、ＩｇＧ1型のモノクローナル
抗体であり、これをＨＭ４０−３と命名した。
【００２４】
【発明の効果】本発明のマウスＣＤ４０に対するモノク
ローナル抗体は、以下に述べるような用途が考えられ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、
生体内におけるＣＤ４０のＢ細胞活性化における役割が
分かると共に、未だ不明である胸腺上皮細胞や濾胞樹状
細胞、相互連結細胞におけるＣＤ４０の機能についての
解明に役立つ。ＣＤ４０は、広くＴ細胞−抗原提示細胞
間の相互作用において、また、Ｂ細胞の分化において、
なんらかの役割を果たしていることが予想され、これら
の解明に役立つ。また、ＣＤ４０は、腫瘍細胞の増殖に
も関係している可能性があるため、本発明のモノクロー
ナル抗体は、腫瘍細胞増殖機構を解明する有用な手がか
りを与えることになる。したがって、本発明のモノクロ
ーナル抗体は、生体内におけるＣＤ４０の生理的役割等
を解明するための薬剤等として、免疫系分野における研
究と関連産業分野において有用である。また、本発明の
ハイブリドーマは、この有用なＣＤ４０に特異的に反応
するモノクローナル抗体を産生することができる。
ローナル抗体は、以下に述べるような用途が考えられ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、
生体内におけるＣＤ４０のＢ細胞活性化における役割が
分かると共に、未だ不明である胸腺上皮細胞や濾胞樹状
細胞、相互連結細胞におけるＣＤ４０の機能についての
解明に役立つ。ＣＤ４０は、広くＴ細胞−抗原提示細胞
間の相互作用において、また、Ｂ細胞の分化において、
なんらかの役割を果たしていることが予想され、これら
の解明に役立つ。また、ＣＤ４０は、腫瘍細胞の増殖に
も関係している可能性があるため、本発明のモノクロー
ナル抗体は、腫瘍細胞増殖機構を解明する有用な手がか
りを与えることになる。したがって、本発明のモノクロ
ーナル抗体は、生体内におけるＣＤ４０の生理的役割等
を解明するための薬剤等として、免疫系分野における研
究と関連産業分野において有用である。また、本発明の
ハイブリドーマは、この有用なＣＤ４０に特異的に反応
するモノクローナル抗体を産生することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 奥村 康 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部免疫学教室内
Claims (5)
- 【請求項１】 マウスの細胞表面抗原であるＣＤ４０分
子に特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活
性フラグメント。 - 【請求項２】 ＩｇＧ型のハムスター抗体である請求項
１記載のモノクローナル抗体またはその活性フラグメン
ト。 - 【請求項３】 （１）齧歯類動物をＷＥＨＩ２３１細胞
で免疫感作し、（２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘
出して、脾細胞の懸濁液を形成し、（３）該脾細胞懸濁
をマウスのミエローマ細胞と融合促進剤の存在下で混合
して、両細胞を融合し、（４）融合した細胞を未融合の
ミエローマ細胞を支持しない媒質中で希釈して培養し
て、抗体産生細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリ
ドーマを選別し、（５）ハイブリドーマを含有する各培
養穴中の上清液について、免疫感作したＷＥＨＩ２３１
（ＣＤ４０）との反応性を指標として、抗体の存在を確
認し、（６）所望の抗体を生成するハイブリドーマを選
択した後、限界希釈法により、単一クローンにし、
（７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収することを特徴とするマ
ウスのＣＤ４０に対するモノクローナル抗体の製造方
法。 - 【請求項４】 該齧歯類動物がアルメニアンハムスター
に属し、該ミエローマ細胞がＰ３Ｕ１である請求項３記
載の製造方法。 - 【請求項５】 マウスの細胞表面に存在するＣＤ４０分
子に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6173718A JPH0812700A (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6173718A JPH0812700A (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0812700A true JPH0812700A (ja) | 1996-01-16 |
Family
ID=15965862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6173718A Pending JPH0812700A (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0812700A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7288251B2 (en) | 2001-11-09 | 2007-10-30 | Abgenix, Inc. | Antibodies to CD40 |
-
1994
- 1994-07-01 JP JP6173718A patent/JPH0812700A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7288251B2 (en) | 2001-11-09 | 2007-10-30 | Abgenix, Inc. | Antibodies to CD40 |
| US7338660B2 (en) | 2001-11-09 | 2008-03-04 | Abgenix, Inc. | Methods of treating cancer and enhancing immune responses with antibodies that bind CD40 |
| US7563442B2 (en) | 2001-11-09 | 2009-07-21 | Abgenix, Inc. | Antibodies to CD40 and methods of treating cancer and enhancing immune responses |
| US7618633B2 (en) | 2001-11-09 | 2009-11-17 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies that bind CD40 and methods of treating cancer and enhancing immune responses |
| US7626012B2 (en) | 2001-11-09 | 2009-12-01 | Amgen Fremont Inc. | Nucleic acid molecules which encode antibodies that bind CD40 |
| US8388971B2 (en) | 2001-11-09 | 2013-03-05 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies that bind CD40 and methods of treating cancer and enhancing immune responses |
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