JPH08127595A - 神経突起伸長活性を有する蛋白質 - Google Patents

神経突起伸長活性を有する蛋白質

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JPH08127595A
JPH08127595A JP6292346A JP29234694A JPH08127595A JP H08127595 A JPH08127595 A JP H08127595A JP 6292346 A JP6292346 A JP 6292346A JP 29234694 A JP29234694 A JP 29234694A JP H08127595 A JPH08127595 A JP H08127595A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】神経突起伸長活性を有する蛋白質、該蛋白質を
コードするＤＮＡ、該蛋白質を有効成分とする神経突起
伸長剤；抗痴呆剤；記憶改善剤。 【効果】神経突起伸長活性を有する蛋白質を得ることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、神経突起伸長活性を有
する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を
有効成分とする神経突起伸長剤、抗痴呆剤及び記憶改善
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】神経細胞は、発生過程において外部環境
の影響を受けて神経突起をのばし、神経回路を形成す
る。また、情報処理過程においてシナプスの形態変化、
特に発芽と呼ばれる新しい神経終末の伸長と新たな場所
へのシナプス形成が大切であると考えられている。この
神経突起の伸長に伴うシナプス形成は記憶と密接な関係
があると考えられており、痴呆患者に神経突起の消失が
みられることから、神経突起を形成させることにより記
憶の改善ないし痴呆の治療を行うことが可能である。
【０００３】この神経突起の伸長に、神経突起伸長活性
を持つ蛋白質の役割が重要視されているが、その実態は
解明されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経突起伸
長活性を有する蛋白質及び該蛋白質をコードするＤＮＡ
に関する。
【０００５】また、本発明は、神経突起伸長剤、記憶改
善剤及び抗痴呆剤に関する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み検討を重ねた結果、新規な蛋白質をコードするＤＮ
Ａ単離し、該ＤＮＡ配列から発現された蛋白質が神経突
起の伸長を顕著に促進することを見出した。
【０００７】すなわち、本発明は、以下の項１〜項５の
蛋白質、ＤＮＡ、抗痴呆剤及び記憶改善剤を提供するも
のである。
【０００８】項１． 下記式（Ａ）
【０００９】
【化４】 （Ａ） Met Lys Lys Ala Gln Glu Asp Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Val Met 1 5 10 15 Pro Met Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ile Glu Ala 20 25 30 Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Lys Val Lys Glu Leu Asn 35 40 45 His Tyr Leu Glu Ala Glu Lys Ser Cys Arg Gln Asp Leu Glu Met Tyr 50 55 60 Val Ala Val Leu Asn Thr Gln Lys Ser Val Leu Gln Glu Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Lys Glu Leu His Glu Val Cys His Leu Leu Glu Gln Glu 85 90 95 Arg Gln Gln His Asn Gln Leu Lys His Thr Trp Gln Lys Ala Asn Asp 100 105 110 Gln Phe Leu Glu Ser Gln Arg Leu Leu Met Arg Asp Met Gln Arg Met 115 120 125 Glu Ile Val Leu Thr Ser Glu Gln Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Lys 130 135 140 Lys Lys Asp Gln Glu Glu Asp Asp Gln Gln Arg Leu Ser Lys Arg Lys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Gln Lys Asp Ser Asp Asp Glu Thr Lys Ala Ser Cys Ser 165 170 175 Leu Ala His Glu Glu Ser Leu Thr Gln Phe Ser Asn Glu Glu Val His 180 185 190 Leu Asn Ser Thr His Ser Ser Val His Ser Leu Asp Ala Asp Leu Leu 195 200 205 Leu Ser Ser Gly Glu Ser Phe Asn Lys Ser Glu Asn Asp Met Phe Lys 210 215 220 Asp Gly Leu Arg Arg Ala Gln Ser Thr Asp Ser Leu Gly Thr Ser Gly 225 230 235 240 Ser Leu Gln Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Ala Lys Ser Ala 245 250 255 Gly Asn Leu Asp Glu Ser Asp Phe Gly Pro Leu Val Gly Ala Asp Ser 260 265 270 Val Ser Glu Asn Tyr Asp Thr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Gln Met Pro 275 280 285 Ser Gly Phe Met Leu Thr Lys Asp Gln Glu Lys Ala Ile Lys Ala Met 290 295 300 Thr Pro Glu Gln Glu Glu Thr Ala Ser Leu Leu Ser Ser Val Thr Gln 305 310 315 320 Gly Val Glu Ser Ala Tyr Val Ser Pro Ser Gly Tyr Arg Leu Val Ser 325 330 335 Glu Thr Glu Trp Asn Leu Leu Gln Lys Glu Val Gln Asn Ala Gly Asn 340 345 350 Lys Leu Gly Arg Arg Cys Asp Met Cys Ser Asn Tyr Glu Lys Gln Leu 355 360 365 Gln Gly Ile Gln Ile Gln Glu Ala Glu Thr Arg Asp Gln Val Lys Lys 370 375 380 Leu Gln Val Met Leu Arg Gln Ala Asn Asp Gln Leu Glu Lys Thr Met 385 390 395 400 Lys Asp Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Met Lys Gln Ser Ala Glu Asp 405 410 415 Ser Ser Asn Gln Ile Ser Leu Leu Met Val Lys Cys Gln Lys Ser Glu 420 425 430 Asn Phe Leu Asn Glu Leu Gln Gln Ala Phe Ser Gln Ala Lys Arg Ser 435 440 445 Val Gln Glu Gln Met Ala Val Leu Thr Gln Ser Arg Glu Gln Val Ser 450 455 460 Glu Glu Leu Val Arg Leu Gln Lys Asp Asn Glu Ser Leu Gln Gly Lys 465 470 475 480 His Ser Leu His Val Ser Leu Gln Gln Ala Glu Asp Phe Ile Leu Pro 485 490 495 Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys Tyr Arg Glu Asp 500 505 510 Ile Ile Ser Val Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Glu Glu Lys Leu Lys 515 520 525 Ala Glu Ile Leu Phe Leu Lys Glu Gln Ile Gln Ala Glu Gln Tyr Leu 530 535 540 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Leu Gln Leu Glu Ile Glu Asn Cys Lys 545 550 555 560 Glu Glu Ile Ala Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ile 565 570 575 Lys Val Glu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu Tyr Leu Gln 580 585 590 Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Thr Lys Asn Thr Leu Glu Glu Gln Leu 595 600 605 Lys Lys Glu Thr Ala Ala Lys Ala Asn Leu Glu Gln Leu Val Phe Glu 610 615 620 Glu Lys Asn Lys Ala Gln Arg Leu Gln Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu 625 630 635 640 Gln Val Gln Arg Asp Phe Val Lys Leu Ser Gln Thr Leu Gln Val Gln 645 650 655 Leu Glu Arg Ile Arg Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Ile 660 665 670 Leu Asn Asp Thr Lys Leu Thr Asp Ile Asn Gln Leu Pro Glu Thr 675 680 685 687 で表されるポリペプチドあるいは該ポリペプチドの一部
が置換又は欠失された神経突起伸長活性を有する蛋白
質。
【００１０】項２． 一般式（Ａ）で表されるポリペプ
チドの６５〜６８７、２８２〜６８７又は４３６〜６８
７をそのアミノ酸配列中に含む蛋白質。
【００１１】項３． 上記式（Ａ）で表されるポリペプ
チドあるいは該ポリペプチドの一部が置換又は欠失され
た神経突起伸長活性を有する蛋白質をコードする核酸配
列を含むＤＮＡ。
【００１２】項４． 一般式（Ａ）で表されるポリペプ
チドの６５〜６８７、２８２〜６８７又は４３６〜６８
７をコードする核酸配列を含む項３に記載のＤＮＡ。
【００１３】項５． 下記式（Ｂ） （Ｂ） ATG AAA AAG GCC CAG GAA GAT GCT GAG AAG CTT CGT TCG GTT GTG ATG 48 CCT ATG GAG AAA GAG ATT GCA GCA CTA AAG GAG AAG TTG ATA GAG GCT 96 GAA GAA AAA ATA AAG GAG TTA GAA GCA TCA AAG GTT AAA GAA CTG AAC 144 CAT TAT CTG GAA GCT GAG AAG TCC TGT AGG CAA GAC TTA GAG ATG TAC 192 GTG GCT GTC CTC AAC ACG CAG AAA TCT GTC CTG CAA GAG GAT GCA GAG 240 AAG TTG CGG AAA GAG CTG CAT GAA GTC TGC CAT CTC TTA GAG CAA GAG 288 CGA CAA CAG CAC AAC CAG TTG AAA CAC ACG TGG CAA AAA GCC AAT GAC 336 CAG TTC TTG GAG TCC CAG CGT TTG CTG ATG AGA GAC ATG CAA CGT ATG 384 GAG ATT GTC CTG ACC TCT GAG CAG CTT CGA CAG GTC GAA GAA CTG AAA 432 AAA AAA GAT CAG GAA GAA GAT GAT CAG CAG AGA CTT AGC AAA AGA AAG 480 GAA CAG AAA CAG AAA GAT TCA GAC GAT GAA ACA AAA GCT TCG TGT TCT 528 TTA GCC CAC GAG GAA TCC CTT ACC CAG TTC TCT AAT GAA GAG GTG CAT 576 TTA AAT AGC ACC CAC AGC TCA GTC CAT TCG TTG GAC GCA GAC TTG CTT 624 CTG TCT TCT GGT GAA TCG TTC AAT AAA TCA GAA AAC GAT ATG TTT AAA 672 GAT GGA CTA CGG AGA GCA CAG TCA ACA GAC AGT CTA GGG ACA TCT GGA 720 TCT TTA CAG TCC AAA GCT TTA GGA TAC AAC AAC AAA GCA AAA TCT GCT 768 GGG AAC CTG GAT GAG TCA GAT TTT GGA CCA CTT GTT GGA GCA GAT TCA 816 GTG TCT GAG AAC TAT GAT ACA GCT TCC CTT GGG TCT CTG CAA ATG CCT 864 AGT GGG TTT ATG TTA ACC AAA GAT CAG GAG AAA GCA ATC AAA GCA ATG 912 ACA CCA GAG CAA GAA GAG ACT GCT TCA CTT CTT TCC AGT GTT ACA CAA 960 GGA GTT GAA AGC GCA TAT GTG TCT CCT AGC GGT TAC CGC TTG GTG AGC 1008 GAG ACA GAG TGG AAT CTG CTG CAG AAA GAG GTG CAG AAT GCA GGG AAC 1056 AAG CTG GGT AGG CGC TGC GAT ATG TGC TCG AAT TAT GAG AAG CAG TTG 1104 CAA GGT ATC CAG ATT CAG GAG GCT GAA ACA AGA GAC CAG GTG AAA AAG 1152 CTG CAG GTG ATG CTG AGG CAG GCT AAT GAC CAG CTG GAA AAA ACA ATG 1200 AAA GAT AAA CAG GAA TTG GAG GAG TAT ATG AAA CAA AGT GCT GAA GAC 1248 TCC TCT AAT CAG ATC TCT TTG CTA ATG GTT AAA TGT CAG AAG TCA GAG 1296 AAT TTC CTC AAT GAA CTG CAG CAG GCG TTT TCT CAA GCA AAG AGA AGT 1344 GTG CAG GAG CAA ATG GCT GTT CTG ACG CAG TCA AGG GAG CAG GTT TCA 1392 GAA GAG TTG GTG AGA CTG CAG AAA GAT AAT GAA AGT CTT CAA GGA AAA 1440 CAT AGC TTA CAT GTG TCT TTA CAA CAA GCT GAA GAT TTC ATT CTA CCA 1488 GAA GCA GCA GAG GAG CTC CGG GAG CTG ATT TTA AAG TAT CGT GAA GAC 1536 ATC ATT AGT GTA CGG ACA GCA GCA GAT CAC CTG GAG GAG AAA CTT AAG 1584 GCA GAG ATT TTA TTC TTA AAA GAA CAG ATT CAA GCT GAA CAG TAT TTG 1632 AAA GAA AAC ATA GAA GAA ACT CTA CAG CTG GAA ATA GAG AAT TGC AAA 1680 GAG GAA ATC GCT TCC ATT TCC AGT TTA AAA GCT GAA CTG GAA AGA ATA 1728 AAA GTG GAG AAA GAG CAG TTA GAA AGT TCT TCA CAG GAA TAC CTG CAG 1776 CAG CTG GAG AGT CTG CAG GAA ACA AAA AAC ACT CTG GAA GAA CAG CTG 1824 AAG AAG GAA ACA GCA GCA AAG GCA AAC CTT GAA CAG CTG GTG TTT GAA 1872 GAG AAG AAT AAA GCT CAG AGG CTG CAG ACT GAA TTA GAT GTC AGT GAG 1920 CAA GTT CAG AGA GAT TTT GTA AAG CTT TCT CAG ACA CTT CAG GTG CAG 1968 CTG GAG CGG ATC CGG CAG GCA GAT TCC CTG GAG AGA ATC CGT GCA ATC 2016 CTG AAT GAC ACA AAA CTG ACG GAC ATT AAT CAG CTT CCT GAA ACA TGA 2064 で表される項４に記載のＤＮＡ。
【００１４】項６． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する神経突起伸長剤。
【００１５】項７． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する抗痴呆剤。
【００１６】項８． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する記憶改善剤。
【００１７】本発明の蛋白質の神経突起伸長活性に関
し、Ｎ末端側の１〜４３５の配列は必須ではなく、他の
アミノ酸で置換し、又は欠失しても良い。従って、本発
明は、式（Ａ）において４３６〜６８７の配列を含む蛋
白質；並びに式（Ａ）において４３６〜６８７の配列を
含む蛋白質をコードするＤＮＡにも関する。
【００１８】本発明の蛋白質は、一般式（Ａ）で表され
るポリペプチドを１カ所又は複数箇所で特定部位の又は
ランダムな置換又は欠失したものも、神経突起伸長活性
を有する限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】特定のアミノ酸を置換又は欠失する方法と
しては、ポイントミューテーション法、ＰＣＲを利用し
たdeletion/Insertion法などの従来公知の方法が用いら
れる。
【００２０】本発明の蛋白質は、例えば、ニワトリ胚終
脳神経細胞初代培養系をアッセイ系として用い、ヒヨコ
除神経筋抽出液中から得ることができるが、ヒヨコ由来
の蛋白質に限定されることはない。神経突起を形成させ
る活性を有する該蛋白質の配列は本発明者により初めて
明らかにされたものであり、ニワトリなどの鳥類、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター等の哺乳類な
どのあらゆる動物由来の神経突起伸長活性を有し、該蛋
白質に相同性のある蛋白質が、いずれも本発明に包含さ
れる。
【００２１】本発明の蛋白質は、例えば、神経突起伸長
活性を有する該蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ
ベクターを細胞に導入して形質転換体とし、該形質転換
体を培地中で培養することを特徴とする前記項１で表さ
れる蛋白質の製造法により製造される。
【００２２】本発明者は、ヒヨコ除神経筋抽出液を用い
て、神経突起伸長活性を有する蛋白質に対するモノクロ
ーナル抗体を単離し、該モノクローナル抗体を用いてｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、図１に示すｃ
ＤＮＡを得、該ｃＤＮＡを制限酵素で切断し、６５−６
８７、２８２−６８７および４３６−６８７の配列を有
する蛋白質を単離し、これらがいずれも神経突起伸長活
性を有することを確認した。
【００２３】上記の神経突起伸長活性を有する該蛋白質
をコードするＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換さ
れる細胞としては、特に限定されず、従来公知の形質転
換用の細胞が広く用いられるが、例えば大腸菌等の細菌
類、酵母などの真核微生物、マウス、ラット、ハムスタ
ー、ヒト、等の各種哺乳動物の培養細胞が挙げられる。
【００２４】大腸菌等へのベクターの導入も、公知の方
法に従い行うことができる。
【００２５】本発明の蛋白質の製造に用いられるベクタ
ーとしては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの翻訳
に必要なプロモーター等を備えている限り特に限定され
ないが、例えば、pBluescript、pGEX等が挙げられる。
【００２６】本発明は、神経突起伸長活性を有する該蛋
白質をコードするＤＮＡを組み込んだベクターが前記細
胞に組み込まれた形質転換体にも関する。
【００２７】該形質転換体が培養される培地は、形質転
換される細胞の種類にもよるが、例えば大腸菌などの微
生物の場合には、炭素源（グルコース等）、窒素源（硫
酸アンモニウムなど）、無機物（リン酸ナトリウム、硫
酸鉄、硫酸マンガンなど）を含む培地が挙げられる。温
度、ｐＨ、時間などの培養条件は、各種細胞の通常の培
養条件がそのまま用いられる。
【００２８】本発明の蛋白質は神経突起を伸長させる活
性があり、該蛋白質は神経突起伸長剤として使用でき
る。また、神経突起の伸長による神経回路の形成は、記
憶及び痴呆とも密接な関係があることが明らかになって
おり、該蛋白質は、抗痴呆剤、記憶改善剤、神経繊維の
修復剤、神経細胞賦活剤、学習改善剤、情緒障害改善剤
等としても使用される。
【００２９】本発明の蛋白質は、上記の生物活性を示す
ために、１〜１０μｇ／ｍｌ程度の濃度になるように投
与される。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、神経突起の伸長活性を
示す新規蛋白質を単離し、その構造を明らかにした。
【００３１】該蛋白質は、遺伝子工学の方法により容易
に大量生産できる。
【００３２】該蛋白質は、抗痴呆剤、記憶改善剤、神経
繊維の修復剤、神経細胞賦活剤、学習改善剤、情緒障害
改善剤等として有用である。
【００３３】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
【００３４】実施例１ （１）モノクローナル抗体の作成 (1ー1)抗原の調製 ５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配している坐骨神経を切断
し、その３日後脚筋を切り取りプロテアーゼ阻害剤を含
むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中でミキサーを用い
てホモゲナイズし、次いで遠心分離(100,000g、１時
間、４℃)して、得られた上清を抗原とした。
【００３５】(1ー2)マウス免疫 フロイントアジュバントと等量混合した抗原(2mg/ml)を
マウス(BALB/c)腹腔内へ0.2ml注射することにより、免
疫を行った。エーテル麻酔したマウスの尾から少量の血
液を採取し、これを用いて血清を調製した。抗体価の上
昇は、通常のＥＬＩＳＡ法を用いて確認した。
【００３６】(1-3)ハイブリドーマの作成 抗体価が１：１０００に上昇したマウスの脾臓（本実験
例においては１：２５００）を切り出し、無菌状態でこ
れを切断し、ステンレスメッシュ（＃１００）上で5ml
シリンジのピストンを用いてつぶすことにより解離脾細
胞を得た。ミエローマ細胞（ＰＡＩ細胞）は、脾細胞調
製の１０日前より増殖を開始した。調製した解離脾細胞
とミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール１５００
（最終濃度9%(v/v)）を用いて融合された。
【００３７】(1-4)スクリーニング 融合後のハイブリドーマは、４細胞／ウエルの密度でＣ
Ｏ2インキュベーター内で培養され、コロニー形成の確
認されたウエルの培養液の一部を採取し、ＥＬＩＳＡ法
により抗体の産生を確認した。抗体産生の確認された陽
性ウエルの細胞は、クローニング、２次スクリーニング
へと進めた。最終的に得られたクローンは、３次スクリ
ーニングの後に分離されたものである。
【００３８】(1-5)活性阻害抗体の選択 得られたモノクローナル抗体の中で、神経突起伸長活性
を阻害するものを以下の方法で選択した。培養皿中に抗
原を入れ、神経突起伸長活性を有する蛋白質を底面に接
着させ、さらにモノクローナル抗体を添加し、１時間静
置した。培養皿中の溶液を培養液に交換し、ニワトリ胚
の終脳神経細胞を加えて２４時間培養の後、神経突起伸
長の様子を観察した。伸長活性を最も強く抑制したのが
４Ｄ２ａモノクローナル抗体である。
【００３９】（２）ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮ
Ａの単離 (2-1)ｃＤＮＡライブラリーの作製 ５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配している坐骨神経を切断
し、その３日後脚筋を取り出し、ホモゲナイズの後Ｃｓ
Ｃｌを用いた密度勾配遠心(45,000 rpm; 40時間）でＲ
ＮＡを分離した。さらに、オリゴｄＴカラムを用いて常
法に従いｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素（ストラタジー
ン社製）によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを
λＺＡＰベクターに組み込んだ。in vitroパッケージン
グによりλファージ粒子を形成させ、これを大腸菌に感
染させｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００４０】(2-2)スクリーニング プラークスクリーニング法により、目的のクローンを単
離した。この際に、４Ｄ２ａモノクローナル抗体を用い
た。スクリーニングは２回行い、確実にこの抗体で認識
される蛋白質を発現するクローンを選択した。ヘルパー
ファージ（ｆ１）を作用させることによりファージベク
ター中のpBluescript部分を単離した。
【００４１】（３）大腸菌への該ＤＮＡを含むベクター
の導入 (3-1)発現ベクターへのサブクローニング (436〜687のアミノ酸配列を持つ蛋白質の発現の場合）
クローニングしたｃＤＮＡの1307bp−2600bpの５’端に
ＥｃｏＲＩアダプター、３’端にpoly Aテール＋Xho I
サイトを付加し、このＤＮＡを発現ベクターpGEX4T3のE
coRI−Xho Iサイトにサブクローンした。
【００４２】(65〜687のアミノ酸配列を持つ蛋白質の発
現の場合）クローニングしたｃＤＮＡの191bp−2600bp
の３’端にpoly Aテール＋Xho Iサイトを付加し、この
ＤＮＡを発現ベクターpGEX2TのSmaI-XhoIサイトにサブ
クローニングした。
【００４３】(282〜687のアミノ酸配列を持つ蛋白質の
発現の場合）クローニングしたｃＤＮＡの844bp−2600b
pの３’端にpoly Aテール＋Xho Iサイトを付加し、この
ＤＮＡを発現ベクターpGEX2TのSmaI-XhoIサイトにサブ
クローニングした。
【００４４】(3-2)発現 上記３種のプラスミドを各々用いて、コンピテント大腸
菌JM105を形質転換し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシドでグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと
目的蛋白質の融合蛋白を発現させた。
【００４５】（４）目的蛋白質の単離 融合蛋白質を発現させた大腸菌を超音波により破壊し、
可溶性分画を分離した。この分画をグルタチオン−セフ
ァロース４Ｂカラムに通し、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）とグルタチオンの親和性を利用
して組換え蛋白質を精製した。
【００４６】436-687の配列を持つ蛋白質、282-687の配
列を持つ蛋白質の場合には、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼとの融合蛋白質として精製し、65-687の配
列を持つ蛋白質の場合には、カラム中でトロンビンを作
用させて組換え蛋白質のみを精製した。
【００４７】（５）単離した蛋白質の神経突起伸長活性
の測定法 精製した各組換え蛋白質｛（65-687＋GST）、（282-687
＋GST）及び（436-687＋GST）｝をHam's F12培地（但
し、10mMグルコース、2.5μg/mlインシュリンを追加）
で各々希釈し、培養皿（16mm直径）に加え、３７℃で２
時間静置した。一方、ふ卵５日目のニワトリ胚より終脳
を切り出し、0.0125%トリプシンで３７℃、３０分間処
理し、上記F12培地で洗浄後、ピペッティングで細胞を
分散させた。先の培養皿の各ウエルに4×104の神経細胞
を入れ、37℃、5%CO2、100%湿度の条件下で24時間培養
した。培養後、細胞を位相差顕微鏡で観察し、細胞体の
２倍以上の長さの神経突起を持つ神経細胞の割合を計測
した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で得られた神経突起伸長活性を有する蛋
白質をコードするＤＮＡ及び該蛋白質のアミノ酸配列を
示す図である。
【図２】本発明のＤＮＡの３種のオープンリーディング
フレームを示す。１、２、３の各欄において、長い縦線
は、ストップコドンを示し、短い縦線は開始コドン（メ
チオニン）を示す。
【図３】65-687（●）、282-687＋GST（○）及びネガテ
ィブコントロール（□；蛋白質を何も添加しなかった場
合）の存在下での神経突起を持つ神経細胞の割合を示す
グラフである。
【図４】436-687＋GST（○）、GSTのみ（●）、ポジテ
ィブコントロール（□；５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配
している坐骨神経を切断し、その３日後脚筋を取り出
し、ホモゲナイズしたもの）及びネガティブコントロー
ル（×；蛋白質を何も添加しなかった場合）を示すグラ
フである。
【配列表】
配列番号：1 配列の長さ：2894 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 ATG AAA AAG GCC CAG GAA GAT GCT GAG AAG CTT CGT TCG GTT GTG ATG 48 Met Lys Lys Ala Gln Glu Asp Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Val Met 1 5 10 15 CCT ATG GAG AAA GAG ATT GCA GCA CTA AAG GAG AAG TTG ATA GAG GCT 96 Pro Met Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ile Glu Ala 20 25 30 GAA GAA AAA ATA AAG GAG TTA GAA GCA TCA AAG GTT AAA GAA CTG AAC 144 Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Lys Val Lys Glu Leu Asn 35 40 45 CAT TAT CTG GAA GCT GAG AAG TCC TGT AGG CAA GAC TTA GAG ATG TAC 192 His Tyr Leu Glu Ala Glu Lys Ser Cys Arg Gln Asp Leu Glu Met Tyr 50 55 60 GTG GCT GTC CTC AAC ACG CAG AAA TCT GTC CTG CAA GAG GAT GCA GAG 240 Val Ala Val Leu Asn Thr Gln Lys Ser Val Leu Gln Glu Asp Ala Glu 65 70 75 80 AAG TTG CGG AAA GAG CTG CAT GAA GTC TGC CAT CTC TTA GAG CAA GAG 288 Lys Leu Arg Lys Glu Leu His Glu Val Cys His Leu Leu Glu Gln Glu 85 90 95 CGA CAA CAG CAC AAC CAG TTG AAA CAC ACG TGG CAA AAA GCC AAT GAC 336 Arg Gln Gln His Asn Gln Leu Lys His Thr Trp Gln Lys Ala Asn Asp 100 105 110 CAG TTC TTG GAG TCC CAG CGT TTG CTG ATG AGA GAC ATG CAA CGT ATG 384 Gln Phe Leu Glu Ser Gln Arg Leu Leu Met Arg Asp Met Gln Arg Met 115 120 125 GAG ATT GTC CTG ACC TCT GAG CAG CTT CGA CAG GTC GAA GAA CTG AAA 432 Glu Ile Val Leu Thr Ser Glu Gln Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Lys 130 135 140 AAA AAA GAT CAG GAA GAA GAT GAT CAG CAG AGA CTT AGC AAA AGA AAG 480 Lys Lys Asp Gln Glu Glu Asp Asp Gln Gln Arg Leu Ser Lys Arg Lys 145 150 155 160 GAA CAG AAA CAG AAA GAT TCA GAC GAT GAA ACA AAA GCT TCG TGT TCT 528 Glu Gln Lys Gln Lys Asp Ser Asp Asp Glu Thr Lys Ala Ser Cys Ser 165 170 175 TTA GCC CAC GAG GAA TCC CTT ACC CAG TTC TCT AAT GAA GAG GTG CAT 576 Leu Ala His Glu Glu Ser Leu Thr Gln Phe Ser Asn Glu Glu Val His 180 185 190 TTA AAT AGC ACC CAC AGC TCA GTC CAT TCG TTG GAC GCA GAC TTG CTT 624 Leu Asn Ser Thr His Ser Ser Val His Ser Leu Asp Ala Asp Leu Leu 195 200 205 CTG TCT TCT GGT GAA TCG TTC AAT AAA TCA GAA AAC GAT ATG TTT AAA 672 Leu Ser Ser Gly Glu Ser Phe Asn Lys Ser Glu Asn Asp Met Phe Lys 210 215 220 GAT GGA CTA CGG AGA GCA CAG TCA ACA GAC AGT CTA GGG ACA TCT GGA 720 Asp Gly Leu Arg Arg Ala Gln Ser Thr Asp Ser Leu Gly Thr Ser Gly 225 230 235 240 TCT TTA CAG TCC AAA GCT TTA GGA TAC AAC AAC AAA GCA AAA TCT GCT 768 Ser Leu Gln Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Ala Lys Ser Ala 245 250 255 GGG AAC CTG GAT GAG TCA GAT TTT GGA CCA CTT GTT GGA GCA GAT TCA 816 Gly Asn Leu Asp Glu Ser Asp Phe Gly Pro Leu Val Gly Ala Asp Ser 260 265 270 GTG TCT GAG AAC TAT GAT ACA GCT TCC CTT GGG TCT CTG CAA ATG CCT 864 Val Ser Glu Asn Tyr Asp Thr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Gln Met Pro 275 280 285 AGT GGG TTT ATG TTA ACC AAA GAT CAG GAG AAA GCA ATC AAA GCA ATG 912 Ser Gly Phe Met Leu Thr Lys Asp Gln Glu Lys Ala Ile Lys Ala Met 290 295 300 ACA CCA GAG CAA GAA GAG ACT GCT TCA CTT CTT TCC AGT GTT ACA CAA 960 Thr Pro Glu Gln Glu Glu Thr Ala Ser Leu Leu Ser Ser Val Thr Gln 305 310 315 320 GGA GTT GAA AGC GCA TAT GTG TCT CCT AGC GGT TAC CGC TTG GTG AGC 1008 Gly Val Glu Ser Ala Tyr Val Ser Pro Ser Gly Tyr Arg Leu Val Ser 325 330 335 GAG ACA GAG TGG AAT CTG CTG CAG AAA GAG GTG CAG AAT GCA GGG AAC 1056 Glu Thr Glu Trp Asn Leu Leu Gln Lys Glu Val Gln Asn Ala Gly Asn 340 345 350 AAG CTG GGT AGG CGC TGC GAT ATG TGC TCG AAT TAT GAG AAG CAG TTG 1104 Lys Leu Gly Arg Arg Cys Asp Met Cys Ser Asn Tyr Glu Lys Gln Leu 355 360 365 CAA GGT ATC CAG ATT CAG GAG GCT GAA ACA AGA GAC CAG GTG AAA AAG 1152 Gln Gly Ile Gln Ile Gln Glu Ala Glu Thr Arg Asp Gln Val Lys Lys 370 375 380 CTG CAG GTG ATG CTG AGG CAG GCT AAT GAC CAG CTG GAA AAA ACA ATG 1200 Leu Gln Val Met Leu Arg Gln Ala Asn Asp Gln Leu Glu Lys Thr Met 385 390 395 400 AAA GAT AAA CAG GAA TTG GAG GAG TAT ATG AAA CAA AGT GCT GAA GAC 1248 Lys Asp Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Met Lys Gln Ser Ala Glu Asp 405 410 415 TCC TCT AAT CAG ATC TCT TTG CTA ATG GTT AAA TGT CAG AAG TCA GAG 1296 Ser Ser Asn Gln Ile Ser Leu Leu Met Val Lys Cys Gln Lys Ser Glu 420 425 430 AAT TTC CTC AAT GAA CTG CAG CAG GCG TTT TCT CAA GCA AAG AGA AGT 1344 Asn Phe Leu Asn Glu Leu Gln Gln Ala Phe Ser Gln Ala Lys Arg Ser 435 440 445 GTG CAG GAG CAA ATG GCT GTT CTG ACG CAG TCA AGG GAG CAG GTT TCA 1392 Val Gln Glu Gln Met Ala Val Leu Thr Gln Ser Arg Glu Gln Val Ser 450 455 460 GAA GAG TTG GTG AGA CTG CAG AAA GAT AAT GAA AGT CTT CAA GGA AAA 1440 Glu Glu Leu Val Arg Leu Gln Lys Asp Asn Glu Ser Leu Gln Gly Lys 465 470 475 480 CAT AGC TTA CAT GTG TCT TTA CAA CAA GCT GAA GAT TTC ATT CTA CCA 1488 His Ser Leu His Val Ser Leu Gln Gln Ala Glu Asp Phe Ile Leu Pro 485 490 495 GAA GCA GCA GAG GAG CTC CGG GAG CTG ATT TTA AAG TAT CGT GAA GAC 1536 Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys Tyr Arg Glu Asp 500 505 510 ATC ATT AGT GTA CGG ACA GCA GCA GAT CAC CTG GAG GAG AAA CTT AAG 1584 Ile Ile Ser Val Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Glu Glu Lys Leu Lys 515 520 525 GCA GAG ATT TTA TTC TTA AAA GAA CAG ATT CAA GCT GAA CAG TAT TTG 1632 Ala Glu Ile Leu Phe Leu Lys Glu Gln Ile Gln Ala Glu Gln Tyr Leu 530 535 540 AAA GAA AAC ATA GAA GAA ACT CTA CAG CTG GAA ATA GAG AAT TGC AAA 1680 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Leu Gln Leu Glu Ile Glu Asn Cys Lys 545 550 555 560 GAG GAA ATC GCT TCC ATT TCC AGT TTA AAA GCT GAA CTG GAA AGA ATA 1728 Glu Glu Ile Ala Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ile 565 570 575 AAA GTG GAG AAA GAG CAG TTA GAA AGT TCT TCA CAG GAA TAC CTG CAG 1776 Lys Val Glu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu Tyr Leu Gln 580 585 590 CAG CTG GAG AGT CTG CAG GAA ACA AAA AAC ACT CTG GAA GAA CAG CTG 1824 Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Thr Lys Asn Thr Leu Glu Glu Gln Leu 595 600 605 AAG AAG GAA ACA GCA GCA AAG GCA AAC CTT GAA CAG CTG GTG TTT GAA 1872 Lys Lys Glu Thr Ala Ala Lys Ala Asn Leu Glu Gln Leu Val Phe Glu 610 615 620 GAG AAG AAT AAA GCT CAG AGG CTG CAG ACT GAA TTA GAT GTC AGT GAG 1920 Glu Lys Asn Lys Ala Gln Arg Leu Gln Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu 625 630 635 640 CAA GTT CAG AGA GAT TTT GTA AAG CTT TCT CAG ACA CTT CAG GTG CAG 1968 Gln Val Gln Arg Asp Phe Val Lys Leu Ser Gln Thr Leu Gln Val Gln 645 650 655 CTG GAG CGG ATC CGG CAG GCA GAT TCC CTG GAG AGA ATC CGT GCA ATC 2016 Leu Glu Arg Ile Arg Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Ile 660 665 670 CTG AAT GAC ACA AAA CTG ACG GAC ATT AAT CAG CTT CCT GAA ACA TGA 2064 Leu Asn Asp Thr Lys Leu Thr Asp Ile Asn Gln Leu Pro Glu Thr 675 680 685 687
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、神経突起伸長活性を有
する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を
有効成分とする神経突起伸長剤、抗痴呆剤及び記憶改善
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】神経細胞は、発生過程において外部環境
の影響を受けて神経突起をのばし、神経回路を形成す
る。また、情報処理過程においてシナプスの形態変化、
特に発芽と呼ばれる新しい神経終末の伸長と新たな場所
へのシナプス形成が大切であると考えられている。この
神経突起の伸長に伴うシナプス形成は記憶と密接な関係
があると考えられており、痴呆患者に神経突起の消失が
みられることから、神経突起を形成させることにより記
憶の改善ないし痴呆の治療を行うことが可能である。
【０００３】この神経突起の伸長に、神経突起伸長活性
を持つ蛋白質の役割が重要視されているが、その実態は
解明されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経突起伸
長活性を有する蛋白質及び該蛋白質をコードするＤＮＡ
に関する。
【０００５】また、本発明は、神経突起伸長剤、記憶改
善剤及び抗痴呆剤に関する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み検討を重ねた結果、新規な蛋白質をコードするＤＮ
Ａ単離し、該ＤＮＡ配列から発現された蛋白質が神経突
起の伸長を顕著に促進することを見出した。
【０００７】すなわち、本発明は、以下の項１〜項５の
蛋白質、ＤＮＡ、抗痴呆剤及び記憶改善剤を提供するも
のである。
【０００８】項１． 下記式（Ａ）
【０００９】
【化４】 （Ａ） Met Lys Lys Ala Gln Glu Asp Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Val Met 1 5 10 15 Pro Met Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ile Glu Ala 20 25 30 Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Lys Val Lys Glu Leu Asn 35 40 45 His Tyr Leu Glu Ala Glu Lys Ser Cys Arg Gln Asp Leu Glu Met Tyr 50 55 60 Val Ala Val Leu Asn Thr Gln Lys Ser Val Leu Gln Glu Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Lys Glu Leu His Glu Val Cys His Leu Leu Glu Gln Glu 85 90 95 Arg Gln Gln His Asn Gln Leu Lys His Thr Trp Gln Lys Ala Asn Asp 100 105 110 Gln Phe Leu Glu Ser Gln Arg Leu Leu Met Arg Asp Met Gln Arg Met 115 120 125 Glu Ile Val Leu Thr Ser Glu Gln Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Lys 130 135 140 Lys Lys Asp Gln Glu Glu Asp Asp Gln Gln Arg Leu Ser Lys Arg Lys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Gln Lys Asp Ser Asp Asp Glu Thr Lys Ala Ser Cys Ser 165 170 175 Leu Ala His Glu Glu Ser Leu Thr Gln Phe Ser Asn Glu Glu Val His 180 185 190 Leu Asn Ser Thr His Ser Ser Val His Ser Leu Asp Ala Asp Leu Leu 195 200 205 Leu Ser Ser Gly Glu Ser Phe Asn Lys Ser Glu Asn Asp Met Phe Lys 210 215 220 Asp Gly Leu Arg Arg Ala Gln Ser Thr Asp Ser Leu Gly Thr Ser Gly 225 230 235 240 Ser Leu Gln Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Ala Lys Ser Ala 245 250 255 Gly Asn Leu Asp Glu Ser Asp Phe Gly Pro Leu Val Gly Ala Asp Ser 260 265 270 Val Ser Glu Asn Tyr Asp Thr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Gln Met Pro 275 280 285 Ser Gly Phe Met Leu Thr Lys Asp Gln Glu Lys Ala Ile Lys Ala Met 290 295 300 Thr Pro Glu Gln Glu Glu Thr Ala Ser Leu Leu Ser Ser Val Thr Gln 305 310 315 320 Gly Val Glu Ser Ala Tyr Val Ser Pro Ser Gly Tyr Arg Leu Val Ser 325 330 335 Glu Thr Glu Trp Asn Leu Leu Gln Lys Glu Val Gln Asn Ala Gly Asn 340 345 350 Lys Leu Gly Arg Arg Cys Asp Met Cys Ser Asn Tyr Glu Lys Gln Leu 355 360 365 Gln Gly Ile Gln Ile Gln Glu Ala Glu Thr Arg Asp Gln Val Lys Lys 370 375 380 Leu Gln Val Met Leu Arg Gln Ala Asn Asp Gln Leu Glu Lys Thr Met 385 390 395 400 Lys Asp Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Met Lys Gln Ser Ala Glu Asp 405 410 415 Ser Ser Asn Gln Ile Ser Leu Leu Met Val Lys Cys Gln Lys Ser Glu 420 425 430 Asn Phe Leu Asn Glu Leu Gln Gln Ala Phe Ser Gln Ala Lys Arg Ser 435 440 445 Val Gln Glu Gln Met Ala Val Leu Thr Gln Ser Arg Glu Gln Val Ser 450 455 460 Glu Glu Leu Val Arg Leu Gln Lys Asp Asn Glu Ser Leu Gln Gly Lys 465 470 475 480 His Ser Leu His Val Ser Leu Gln Gln Ala Glu Asp Phe Ile Leu Pro 485 490 495 Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys Tyr Arg Glu Asp 500 505 510 Ile Ile Ser Val Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Glu Glu Lys Leu Lys 515 520 525 Ala Glu Ile Leu Phe Leu Lys Glu Gln Ile Gln Ala Glu Gln Tyr Leu 530 535 540 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Leu Gln Leu Glu Ile Glu Asn Cys Lys 545 550 555 560 Glu Glu Ile Ala Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ile 565 570 575 Lys Val Glu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu Tyr Leu Gln 580 585 590 Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Thr Lys Asn Thr Leu Glu Glu Gln Leu 595 600 605 Lys Lys Glu Thr Ala Ala Lys Ala Asn Leu Glu Gln Leu Val Phe Glu 610 615 620 Glu Lys Asn Lys Ala Gln Arg Leu Gln Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu 625 630 635 640 Gln Val Gln Arg Asp Phe Val Lys Leu Ser Gln Thr Leu Gln Val Gln 645 650 655 Leu Glu Arg Ile Arg Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Ile 660 665 670 Leu Asn Asp Thr Lys Leu Thr Asp Ile Asn Gln Leu Pro Glu Thr 675 680 685 687 で表されるポリペプチドあるいは該ポリペプチドの一部
が置換又は欠失された神経突起伸長活性を有する蛋白
質。
【００１０】項２． 一般式（Ａ）で表されるポリペプ
チドの６５〜６８７、２８２〜６８７又は４３６〜６８
７をそのアミノ酸配列中に含む蛋白質。
【００１１】項３． 上記式（Ａ）で表されるポリペプ
チドあるいは該ポリペプチドの一部が置換又は欠失され
た神経突起伸長活性を有する蛋白質をコードする核酸配
列を含むＤＮＡ。
【００１２】項４． 一般式（Ａ）で表されるポリペプ
チドの６５〜６８７、２８２〜６８７又は４３６〜６８
７をコードする核酸配列を含む項３に記載のＤＮＡ。
【００１３】項５． 下記式（Ｂ） （Ｂ） ATG AAA AAG GCC CAG GAA GAT GCT GAG AAG CTT CGT TCG GTT GTG ATG 48 CCT ATG GAG AAA GAG ATT GCA GCA CTA AAG GAG AAG TTG ATA GAG GCT 96 GAA GAA AAA ATA AAG GAG TTA GAA GCA TCA AAG GTT AAA GAA CTG AAC 144 CAT TAT CTG GAA GCT GAG AAG TCC TGT AGG CAA GAC TTA GAG ATG TAC 192 GTG GCT GTC CTC AAC ACG CAG AAA TCT GTC CTG CAA GAG GAT GCA GAG 240 AAG TTG CGG AAA GAG CTG CAT GAA GTC TGC CAT CTC TTA GAG CAA GAG 288 CGA CAA CAG CAC AAC CAG TTG AAA CAC ACG TGG CAA AAA GCC AAT GAC 336 CAG TTC TTG GAG TCC CAG CGT TTG CTG ATG AGA GAC ATG CAA CGT ATG 384 GAG ATT GTC CTG ACC TCT GAG CAG CTT CGA CAG GTC GAA GAA CTG AAA 432 AAA AAA GAT CAG GAA GAA GAT GAT CAG CAG AGA CTT AGC AAA AGA AAG 480 GAA CAG AAA CAG AAA GAT TCA GAC GAT GAA ACA AAA GCT TCG TGT TCT 528 TTA GCC CAC GAG GAA TCC CTT ACC CAG TTC TCT AAT GAA GAG GTG CAT 576 TTA AAT AGC ACC CAC AGC TCA GTC CAT TCG TTG GAC GCA GAC TTG CTT 624 CTG TCT TCT GGT GAA TCG TTC AAT AAA TCA GAA AAC GAT ATG TTT AAA 672 GAT GGA CTA CGG AGA GCA CAG TCA ACA GAC AGT CTA GGG ACA TCT GGA 720 TCT TTA CAG TCC AAA GCT TTA GGA TAC AAC AAC AAA GCA AAA TCT GCT 768 GGG AAC CTG GAT GAG TCA GAT TTT GGA CCA CTT GTT GGA GCA GAT TCA 816 GTG TCT GAG AAC TAT GAT ACA GCT TCC CTT GGG TCT CTG CAA ATG CCT 864 AGT GGG TTT ATG TTA ACC AAA GAT CAG GAG AAA GCA ATC AAA GCA ATG 912 ACA CCA GAG CAA GAA GAG ACT GCT TCA CTT CTT TCC AGT GTT ACA CAA 960 GGA GTT GAA AGC GCA TAT GTG TCT CCT AGC GGT TAC CGC TTG GTG AGC 1008 GAG ACA GAG TGG AAT CTG CTG CAG AAA GAG GTG CAG AAT GCA GGG AAC 1056 AAG CTG GGT AGG CGC TGC GAT ATG TGC TCG AAT TAT GAG AAG CAG TTG 1104 CAA GGT ATC CAG ATT CAG GAG GCT GAA ACA AGA GAC CAG GTG AAA AAG 1152 CTG CAG GTG ATG CTG AGG CAG GCT AAT GAC CAG CTG GAA AAA ACA ATG 1200 AAA GAT AAA CAG GAA TTG GAG GAG TAT ATG AAA CAA AGT GCT GAA GAC 1248 TCC TCT AAT CAG ATC TCT TTG CTA ATG GTT AAA TGT CAG AAG TCA GAG 1296 AAT TTC CTC AAT GAA CTG CAG CAG GCG TTT TCT CAA GCA AAG AGA AGT 1344 GTG CAG GAG CAA ATG GCT GTT CTG ACG CAG TCA AGG GAG CAG GTT TCA 1392 GAA GAG TTG GTG AGA CTG CAG AAA GAT AAT GAA AGT CTT CAA GGA AAA 1440 CAT AGC TTA CAT GTG TCT TTA CAA CAA GCT GAA GAT TTC ATT CTA CCA 1488 GAA GCA GCA GAG GAG CTC CGG GAG CTG ATT TTA AAG TAT CGT GAA GAC 1536 ATC ATT AGT GTA CGG ACA GCA GCA GAT CAC CTG GAG GAG AAA CTT AAG 1584 GCA GAG ATT TTA TTC TTA AAA GAA CAG ATT CAA GCT GAA CAG TAT TTG 1632 AAA GAA AAC ATA GAA GAA ACT CTA CAG CTG GAA ATA GAG AAT TGC AAA 1680 GAG GAA ATC GCT TCC ATT TCC AGT TTA AAA GCT GAA CTG GAA AGA ATA 1728 AAA GTG GAG AAA GAG CAG TTA GAA AGT TCT TCA CAG GAA TAC CTG CAG 1776 CAG CTG GAG AGT CTG CAG GAA ACA AAA AAC ACT CTG GAA GAA CAG CTG 1824 AAG AAG GAA ACA GCA GCA AAG GCA AAC CTT GAA CAG CTG GTG TTT GAA 1872 GAG AAG AAT AAA GCT CAG AGG CTG CAG ACT GAA TTA GAT GTC AGT GAG 1920 CAA GTT CAG AGA GAT TTT GTA AAG CTT TCT CAG ACA CTT CAG GTG CAG 1968 CTG GAG CGG ATC CGG CAG GCA GAT TCC CTG GAG AGA ATC CGT GCA ATC 2016 CTG AAT GAC ACA AAA CTG ACG GAC ATT AAT CAG CTT CCT GAA ACA TGA 2064 で表される項４に記載のＤＮＡ。
【００１４】項６． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する神経突起伸長剤。
【００１５】項７． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する抗痴呆剤。
【００１６】項８． 項１に記載の蛋白質を有効成分と
する記憶改善剤。
【００１７】本発明の蛋白質の神経突起伸長活性に関
し、Ｎ末端側の１〜４３５の配列は必須ではなく、他の
アミノ酸で置換し、又は欠失しても良い。従って、本発
明は、式（Ａ）において４３６〜６８７の配列を含む蛋
白質；並びに式（Ａ）において４３６〜６８７の配列を
含む蛋白質をコードするＤＮＡにも関する。
【００１８】本発明の蛋白質は、一般式（Ａ）で表され
るポリペプチドを１カ所又は複数箇所で特定部位の又は
ランダムな置換又は欠失したものも、神経突起伸長活性
を有する限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】特定のアミノ酸を置換又は欠失する方法と
しては、ポイントミューテーション法、ＰＣＲを利用し
たdeletion/Insertion法などの従来公知の方法が用いら
れる。
【００２０】本発明の蛋白質は、例えば、ニワトリ胚終
脳神経細胞初代培養系をアッセイ系として用い、ヒヨコ
除神経筋抽出液中から得ることができるが、ヒヨコ由来
の蛋白質に限定されることはない。神経突起を形成させ
る活性を有する該蛋白質の配列は本発明者により初めて
明らかにされたものであり、ニワトリなどの鳥類、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター等の哺乳類な
どのあらゆる動物由来の神経突起伸長活性を有し、該蛋
白質に相同性のある蛋白質が、いずれも本発明に包含さ
れる。
【００２１】本発明の蛋白質は、例えば、神経突起伸長
活性を有する該蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ
ベクターを細胞に導入して形質転換体とし、該形質転換
体を培地中で培養することを特徴とする前記項１で表さ
れる蛋白質の製造法により製造される。
【００２２】本発明者は、ヒヨコ除神経筋抽出液を用い
て、神経突起伸長活性を有する蛋白質に対するモノクロ
ーナル抗体を単離し、該モノクローナル抗体を用いてｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、図１に示すｃ
ＤＮＡを得、該ｃＤＮＡを制限酵素で切断し、６５−６
８７、２８２−６８７および４３６−６８７の配列を有
する蛋白質を単離し、これらがいずれも神経突起伸長活
性を有することを確認した。
【００２３】上記の神経突起伸長活性を有する該蛋白質
をコードするＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換さ
れる細胞としては、特に限定されず、従来公知の形質転
換用の細胞が広く用いられるが、例えば大腸菌等の細菌
類、酵母などの真核微生物、マウス、ラット、ハムスタ
ー、ヒト、等の各種哺乳動物の培養細胞が挙げられる。
【００２４】大腸菌等へのベクターの導入も、公知の方
法に従い行うことができる。
【００２５】本発明の蛋白質の製造に用いられるベクタ
ーとしては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの翻訳
に必要なプロモーター等を備えている限り特に限定され
ないが、例えば、pBluescript、pGEX等が挙げられる。
【００２６】本発明は、神経突起伸長活性を有する該蛋
白質をコードするＤＮＡを組み込んだベクターが前記細
胞に組み込まれた形質転換体にも関する。
【００２７】該形質転換体が培養される培地は、形質転
換される細胞の種類にもよるが、例えば大腸菌などの微
生物の場合には、炭素源（グルコース等）、窒素源（硫
酸アンモニウムなど）、無機物（リン酸ナトリウム、硫
酸鉄、硫酸マンガンなど）を含む培地が挙げられる。温
度、ｐＨ、時間などの培養条件は、各種細胞の通常の培
養条件がそのまま用いられる。
【００２８】本発明の蛋白質は神経突起を伸長させる活
性があり、該蛋白質は神経突起伸長剤として使用でき
る。また、神経突起の伸長による神経回路の形成は、記
憶及び痴呆とも密接な関係があることが明らかになって
おり、該蛋白質は、抗痴呆剤、記憶改善剤、神経繊維の
修復剤、神経細胞賦活剤、学習改善剤、情緒障害改善剤
等としても使用される。
【００２９】本発明の蛋白質は、上記の生物活性を示す
ために、１〜１０μｇ／ｍｌ程度の濃度になるように投
与される。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、神経突起の伸長活性を
示す新規蛋白質を単離し、その構造を明らかにした。
【００３１】該蛋白質は、遺伝子工学の方法により容易
に大量生産できる。
【００３２】該蛋白質は、抗痴呆剤、記憶改善剤、神経
繊維の修復剤、神経細胞賦活剤、学習改善剤、情緒障害
改善剤等として有用である。
【００３３】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
【００３４】実施例１ （１）モノクローナル抗体の作成 (1ー1)抗原の調製 ５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配している坐骨神経を切断
し、その３日後脚筋を切り取りプロテアーゼ阻害剤を含
むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中でミキサーを用い
てホモゲナイズし、次いで遠心分離(100,000g、１時
間、４℃)して、得られた上清を抗原とした。
【００３５】(1ー2)マウス免疫 フロイントアジュバントと等量混合した抗原(2mg/ml)を
マウス(BALB/c)腹腔内へ0.2ml注射することにより、免
疫を行った。エーテル麻酔したマウスの尾から少量の血
液を採取し、これを用いて血清を調製した。抗体価の上
昇は、通常のＥＬＩＳＡ法を用いて確認した。
【００３６】(1-3)ハイブリドーマの作成 抗体価が１：１０００に上昇したマウスの脾臓（本実験
例においては１：２５００）を切り出し、無菌状態でこ
れを切断し、ステンレスメッシュ（＃１００）上で5ml
シリンジのピストンを用いてつぶすことにより解離脾細
胞を得た。ミエローマ細胞（ＰＡＩ細胞）は、脾細胞調
製の１０日前より増殖を開始した。調製した解離脾細胞
とミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール１５００
（最終濃度9%(v/v)）を用いて融合された。
【００３７】(1-4)スクリーニング 融合後のハイブリドーマは、４細胞／ウエルの密度でＣ
Ｏ2インキュベーター内で培養され、コロニー形成の確
認されたウエルの培養液の一部を採取し、ＥＬＩＳＡ法
により抗体の産生を確認した。抗体産生の確認された陽
性ウエルの細胞は、クローニング、２次スクリーニング
へと進めた。最終的に得られたクローンは、３次スクリ
ーニングの後に分離されたものである。
【００３８】(1-5)活性阻害抗体の選択 得られたモノクローナル抗体の中で、神経突起伸長活性
を阻害するものを以下の方法で選択した。培養皿中に抗
原を入れ、神経突起伸長活性を有する蛋白質を底面に接
着させ、さらにモノクローナル抗体を添加し、１時間静
置した。培養皿中の溶液を培養液に交換し、ニワトリ胚
の終脳神経細胞を加えて２４時間培養の後、神経突起伸
長の様子を観察した。伸長活性を最も強く抑制したのが
４Ｄ２ａモノクローナル抗体である。
【００３９】（２）ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮ
Ａの単離 (2-1)ｃＤＮＡライブラリーの作製 ５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配している坐骨神経を切断
し、その３日後脚筋を取り出し、ホモゲナイズの後Ｃｓ
Ｃｌを用いた密度勾配遠心(45,000 rpm; 40時間）でＲ
ＮＡを分離した。さらに、オリゴｄＴカラムを用いて常
法に従いｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素（ストラタジー
ン社製）によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを
λＺＡＰベクターに組み込んだ。in vitroパッケージン
グによりλファージ粒子を形成させ、これを大腸菌に感
染させｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００４０】(2-2)スクリーニング プラークスクリーニング法により、目的のクローンを単
離した。この際に、４Ｄ２ａモノクローナル抗体を用い
た。スクリーニングは２回行い、確実にこの抗体で認識
される蛋白質を発現するクローンを選択した。ヘルパー
ファージ（ｆ１）を作用させることによりファージベク
ター中のpBluescript部分を単離した。
【００４１】（３）大腸菌への該ＤＮＡを含むベクター
の導入 (3-1)発現ベクターへのサブクローニング (436〜687のアミノ酸配列を持つ蛋白質の発現の場合）
クローニングしたｃＤＮＡの1307bp−2600bpの５’端に
ＥｃｏＲＩアダプター、３’端にpoly Aテール＋Xho I
サイトを付加し、このＤＮＡを発現ベクターpGEX4T3のE
coRI−Xho Iサイトにサブクローンした。
【００４２】(65〜687のアミノ酸配列を持つ蛋白質の発
現の場合）クローニングしたｃＤＮＡの191bp−2600bp
の３’端にpoly Aテール＋Xho Iサイトを付加し、この
ＤＮＡを発現ベクターpGEX2TのSmaI-XhoIサイトにサブ
クローニングした。
【００４３】(282〜687のアミノ酸配列を持つ蛋白質の
発現の場合）クローニングしたｃＤＮＡの844bp−2600b
pの３’端にpoly Aテール＋Xho Iサイトを付加し、この
ＤＮＡを発現ベクターpGEX2TのSmaI-XhoIサイトにサブ
クローニングした。
【００４４】(3-2)発現 上記３種のプラスミドを各々用いて、コンピテント大腸
菌JM105を形質転換し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシドでグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと
目的蛋白質の融合蛋白を発現させた。
【００４５】（４）目的蛋白質の単離 融合蛋白質を発現させた大腸菌を超音波により破壊し、
可溶性分画を分離した。この分画をグルタチオン−セフ
ァロース４Ｂカラムに通し、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）とグルタチオンの親和性を利用
して組換え蛋白質を精製した。
【００４６】436-687の配列を持つ蛋白質、282-687の配
列を持つ蛋白質の場合には、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼとの融合蛋白質として精製し、65-687の配
列を持つ蛋白質の場合には、カラム中でトロンビンを作
用させて組換え蛋白質のみを精製した。
【００４７】（５）単離した蛋白質の神経突起伸長活性
の測定法 精製した各組換え蛋白質｛（65-687＋GST）、（282-687
＋GST）及び（436-687＋GST）｝をHam's F12培地（但
し、10mMグルコース、2.5μg/mlインシュリンを追加）
で各々希釈し、培養皿（16mm直径）に加え、３７℃で２
時間静置した。一方、ふ卵５日目のニワトリ胚より終脳
を切り出し、0.0125%トリプシンで３７℃、３０分間処
理し、上記F12培地で洗浄後、ピペッティングで細胞を
分散させた。先の培養皿の各ウエルに4×104の神経細胞
を入れ、37℃、5%CO2、100%湿度の条件下で24時間培養
した。培養後、細胞を位相差顕微鏡で観察し、細胞体の
２倍以上の長さの神経突起を持つ神経細胞の割合を計測
した。
【００４８】
【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：2894 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 ATG AAA AAG GCC CAG GAA GAT GCT GAG AAG CTT CGT TCG GTT GTG ATG 48 Met Lys Lys Ala Gln Glu Asp Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Val Met 1 5 10 15 CCT ATG GAG AAA GAG ATT GCA GCA CTA AAG GAG AAG TTG ATA GAG GCT 96 Pro Met Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ile Glu Ala 20 25 30 GAA GAA AAA ATA AAG GAG TTA GAA GCA TCA AAG GTT AAA GAA CTG AAC 144 Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Lys Val Lys Glu Leu Asn 35 40 45 CAT TAT CTG GAA GCT GAG AAG TCC TGT AGG CAA GAC TTA GAG ATG TAC 192 His Tyr Leu Glu Ala Glu Lys Ser Cys Arg Gln Asp Leu Glu Met Tyr 50 55 60 GTG GCT GTC CTC AAC ACG CAG AAA TCT GTC CTG CAA GAG GAT GCA GAG 240 Val Ala Val Leu Asn Thr Gln Lys Ser Val Leu Gln Glu Asp Ala Glu 65 70 75 80 AAG TTG CGG AAA GAG CTG CAT GAA GTC TGC CAT CTC TTA GAG CAA GAG 288 Lys Leu Arg Lys Glu Leu His Glu Val Cys His Leu Leu Glu Gln Glu 85 90 95 CGA CAA CAG CAC AAC CAG TTG AAA CAC ACG TGG CAA AAA GCC AAT GAC 336 Arg Gln Gln His Asn Gln Leu Lys His Thr Trp Gln Lys Ala Asn Asp 100 105 110 CAG TTC TTG GAG TCC CAG CGT TTG CTG ATG AGA GAC ATG CAA CGT ATG 384 Gln Phe Leu Glu Ser Gln Arg Leu Leu Met Arg Asp Met Gln Arg Met 115 120 125 GAG ATT GTC CTG ACC TCT GAG CAG CTT CGA CAG GTC GAA GAA CTG AAA 432 Glu Ile Val Leu Thr Ser Glu Gln Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Lys 130 135 140 AAA AAA GAT CAG GAA GAA GAT GAT CAG CAG AGA CTT AGC AAA AGA AAG 480 Lys Lys Asp Gln Glu Glu Asp Asp Gln Gln Arg Leu Ser Lys Arg Lys 145 150 155 160 GAA CAG AAA CAG AAA GAT TCA GAC GAT GAA ACA AAA GCT TCG TGT TCT 528 Glu Gln Lys Gln Lys Asp Ser Asp Asp Glu Thr Lys Ala Ser Cys Ser 165 170 175 TTA GCC CAC GAG GAA TCC CTT ACC CAG TTC TCT AAT GAA GAG GTG CAT 576 Leu Ala His Glu Glu Ser Leu Thr Gln Phe Ser Asn Glu Glu Val His 180 185 190 TTA AAT AGC ACC CAC AGC TCA GTC CAT TCG TTG GAC GCA GAC TTG CTT 624 Leu Asn Ser Thr His Ser Ser Val His Ser Leu Asp Ala Asp Leu Leu 195 200 205 CTG TCT TCT GGT GAA TCG TTC AAT AAA TCA GAA AAC GAT ATG TTT AAA 672 Leu Ser Ser Gly Glu Ser Phe Asn Lys Ser Glu Asn Asp Met Phe Lys 210 215 220 GAT GGA CTA CGG AGA GCA CAG TCA ACA GAC AGT CTA GGG ACA TCT GGA 720 Asp Gly Leu Arg Arg Ala Gln Ser Thr Asp Ser Leu Gly Thr Ser Gly 225 230 235 240 TCT TTA CAG TCC AAA GCT TTA GGA TAC AAC AAC AAA GCA AAA TCT GCT 768 Ser Leu Gln Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Ala Lys Ser Ala 245 250 255 GGG AAC CTG GAT GAG TCA GAT TTT GGA CCA CTT GTT GGA GCA GAT TCA 816 Gly Asn Leu Asp Glu Ser Asp Phe Gly Pro Leu Val Gly Ala Asp Ser 260 265 270 GTG TCT GAG AAC TAT GAT ACA GCT TCC CTT GGG TCT CTG CAA ATG CCT 864 Val Ser Glu Asn Tyr Asp Thr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Gln Met Pro 275 280 285 AGT GGG TTT ATG TTA ACC AAA GAT CAG GAG AAA GCA ATC AAA GCA ATG 912 Ser Gly Phe Met Leu Thr Lys Asp Gln Glu Lys Ala Ile Lys Ala Met 290 295 300 ACA CCA GAG CAA GAA GAG ACT GCT TCA CTT CTT TCC AGT GTT ACA CAA 960 Thr Pro Glu Gln Glu Glu Thr Ala Ser Leu Leu Ser Ser Val Thr Gln 305 310 315 320 GGA GTT GAA AGC GCA TAT GTG TCT CCT AGC GGT TAC CGC TTG GTG AGC 1008 Gly Val Glu Ser Ala Tyr Val Ser Pro Ser Gly Tyr Arg Leu Val Ser 325 330 335 GAG ACA GAG TGG AAT CTG CTG CAG AAA GAG GTG CAG AAT GCA GGG AAC 1056 Glu Thr Glu Trp Asn Leu Leu Gln Lys Glu Val Gln Asn Ala Gly Asn 340 345 350 AAG CTG GGT AGG CGC TGC GAT ATG TGC TCG AAT TAT GAG AAG CAG TTG 1104 Lys Leu Gly Arg Arg Cys Asp Met Cys Ser Asn Tyr Glu Lys Gln Leu 355 360 365 CAA GGT ATC CAG ATT CAG GAG GCT GAA ACA AGA GAC CAG GTG AAA AAG 1152 Gln Gly Ile Gln Ile Gln Glu Ala Glu Thr Arg Asp Gln Val Lys Lys 370 375 380 CTG CAG GTG ATG CTG AGG CAG GCT AAT GAC CAG CTG GAA AAA ACA ATG 1200 Leu Gln Val Met Leu Arg Gln Ala Asn Asp Gln Leu Glu Lys Thr Met 385 390 395 400 AAA GAT AAA CAG GAA TTG GAG GAG TAT ATG AAA CAA AGT GCT GAA GAC 1248 Lys Asp Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Met Lys Gln Ser Ala Glu Asp 405 410 415 TCC TCT AAT CAG ATC TCT TTG CTA ATG GTT AAA TGT CAG AAG TCA GAG 1296 Ser Ser Asn Gln Ile Ser Leu Leu Met Val Lys Cys Gln Lys Ser Glu 420 425 430 AAT TTC CTC AAT GAA CTG CAG CAG GCG TTT TCT CAA GCA AAG AGA AGT 1344 Asn Phe Leu Asn Glu Leu Gln Gln Ala Phe Ser Gln Ala Lys Arg Ser 435 440 445 GTG CAG GAG CAA ATG GCT GTT CTG ACG CAG TCA AGG GAG CAG GTT TCA 1392 Val Gln Glu Gln Met Ala Val Leu Thr Gln Ser Arg Glu Gln Val Ser 450 455 460 GAA GAG TTG GTG AGA CTG CAG AAA GAT AAT GAA AGT CTT CAA GGA AAA 1440 Glu Glu Leu Val Arg Leu Gln Lys Asp Asn Glu Ser Leu Gln Gly Lys 465 470 475 480 CAT AGC TTA CAT GTG TCT TTA CAA CAA GCT GAA GAT TTC ATT CTA CCA 1488 His Ser Leu His Val Ser Leu Gln Gln Ala Glu Asp Phe Ile Leu Pro 485 490 495 GAA GCA GCA GAG GAG CTC CGG GAG CTG ATT TTA AAG TAT CGT GAA GAC 1536 Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys Tyr Arg Glu Asp 500 505 510 ATC ATT AGT GTA CGG ACA GCA GCA GAT CAC CTG GAG GAG AAA CTT AAG 1584 Ile Ile Ser Val Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Glu Glu Lys Leu Lys 515 520 525 GCA GAG ATT TTA TTC TTA AAA GAA CAG ATT CAA GCT GAA CAG TAT TTG 1632 Ala Glu Ile Leu Phe Leu Lys Glu Gln Ile Gln Ala Glu Gln Tyr Leu 530 535 540 AAA GAA AAC ATA GAA GAA ACT CTA CAG CTG GAA ATA GAG AAT TGC AAA 1680 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Leu Gln Leu Glu Ile Glu Asn Cys Lys 545 550 555 560 GAG GAA ATC GCT TCC ATT TCC AGT TTA AAA GCT GAA CTG GAA AGA ATA 1728 Glu Glu Ile Ala Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ile 565 570 575 AAA GTG GAG AAA GAG CAG TTA GAA AGT TCT TCA CAG GAA TAC CTG CAG 1776 Lys Val Glu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu Tyr Leu Gln 580 585 590 CAG CTG GAG AGT CTG CAG GAA ACA AAA AAC ACT CTG GAA GAA CAG CTG 1824 Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Thr Lys Asn Thr Leu Glu Glu Gln Leu 595 600 605 AAG AAG GAA ACA GCA GCA AAG GCA AAC CTT GAA CAG CTG GTG TTT GAA 1872 Lys Lys Glu Thr Ala Ala Lys Ala Asn Leu Glu Gln Leu Val Phe Glu 610 615 620 GAG AAG AAT AAA GCT CAG AGG CTG CAG ACT GAA TTA GAT GTC AGT GAG 1920 Glu Lys Asn Lys Ala Gln Arg Leu Gln Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu 625 630 635 640 CAA GTT CAG AGA GAT TTT GTA AAG CTT TCT CAG ACA CTT CAG GTG CAG 1968 Gln Val Gln Arg Asp Phe Val Lys Leu Ser Gln Thr Leu Gln Val Gln 645 650 655 CTG GAG CGG ATC CGG CAG GCA GAT TCC CTG GAG AGA ATC CGT GCA ATC 2016 Leu Glu Arg Ile Arg Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Ile 660 665 670 CTG AAT GAC ACA AAA CTG ACG GAC ATT AAT CAG CTT CCT GAA ACA TGA 2064 Leu Asn Asp Thr Lys Leu Thr Asp Ile Asn Gln Leu Pro Glu Thr 675 680 685 687
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】436-687＋GST（○）、GSTのみ（●）、ポジテ
ィブコントロール（□；５日齢のヒヨコ脚筋を神経支配
している坐骨神経を切断し、その３日後脚筋を取り出
し、ホモゲナイズしたもの）及びネガティブコントロー
ル（×；蛋白質を何も添加しなかった場合）を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 16/22 8318−4Ｈ 19/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記式（Ａ） 【化１】 （Ａ） Met Lys Lys Ala Gln Glu Asp Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Val Met 1 5 10 15 Pro Met Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ile Glu Ala 20 25 30 Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Lys Val Lys Glu Leu Asn 35 40 45 His Tyr Leu Glu Ala Glu Lys Ser Cys Arg Gln Asp Leu Glu Met Tyr 50 55 60 Val Ala Val Leu Asn Thr Gln Lys Ser Val Leu Gln Glu Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Lys Glu Leu His Glu Val Cys His Leu Leu Glu Gln Glu 85 90 95 Arg Gln Gln His Asn Gln Leu Lys His Thr Trp Gln Lys Ala Asn Asp 100 105 110 Gln Phe Leu Glu Ser Gln Arg Leu Leu Met Arg Asp Met Gln Arg Met 115 120 125 Glu Ile Val Leu Thr Ser Glu Gln Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Lys 130 135 140 Lys Lys Asp Gln Glu Glu Asp Asp Gln Gln Arg Leu Ser Lys Arg Lys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Gln Lys Asp Ser Asp Asp Glu Thr Lys Ala Ser Cys Ser 165 170 175 Leu Ala His Glu Glu Ser Leu Thr Gln Phe Ser Asn Glu Glu Val His 180 185 190 Leu Asn Ser Thr His Ser Ser Val His Ser Leu Asp Ala Asp Leu Leu 195 200 205 Leu Ser Ser Gly Glu Ser Phe Asn Lys Ser Glu Asn Asp Met Phe Lys 210 215 220 Asp Gly Leu Arg Arg Ala Gln Ser Thr Asp Ser Leu Gly Thr Ser Gly 225 230 235 240 Ser Leu Gln Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Ala Lys Ser Ala 245 250 255 Gly Asn Leu Asp Glu Ser Asp Phe Gly Pro Leu Val Gly Ala Asp Ser 260 265 270 Val Ser Glu Asn Tyr Asp Thr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Gln Met Pro 275 280 285 Ser Gly Phe Met Leu Thr Lys Asp Gln Glu Lys Ala Ile Lys Ala Met 290 295 300 Thr Pro Glu Gln Glu Glu Thr Ala Ser Leu Leu Ser Ser Val Thr Gln 305 310 315 320 Gly Val Glu Ser Ala Tyr Val Ser Pro Ser Gly Tyr Arg Leu Val Ser 325 330 335 Glu Thr Glu Trp Asn Leu Leu Gln Lys Glu Val Gln Asn Ala Gly Asn 340 345 350 Lys Leu Gly Arg Arg Cys Asp Met Cys Ser Asn Tyr Glu Lys Gln Leu 355 360 365 Gln Gly Ile Gln Ile Gln Glu Ala Glu Thr Arg Asp Gln Val Lys Lys 370 375 380 Leu Gln Val Met Leu Arg Gln Ala Asn Asp Gln Leu Glu Lys Thr Met 385 390 395 400 Lys Asp Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Met Lys Gln Ser Ala Glu Asp 405 410 415 Ser Ser Asn Gln Ile Ser Leu Leu Met Val Lys Cys Gln Lys Ser Glu 420 425 430 Asn Phe Leu Asn Glu Leu Gln Gln Ala Phe Ser Gln Ala Lys Arg Ser 435 440 445 Val Gln Glu Gln Met Ala Val Leu Thr Gln Ser Arg Glu Gln Val Ser 450 455 460 Glu Glu Leu Val Arg Leu Gln Lys Asp Asn Glu Ser Leu Gln Gly Lys 465 470 475 480 His Ser Leu His Val Ser Leu Gln Gln Ala Glu Asp Phe Ile Leu Pro 485 490 495 Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys Tyr Arg Glu Asp 500 505 510 Ile Ile Ser Val Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Glu Glu Lys Leu Lys 515 520 525 Ala Glu Ile Leu Phe Leu Lys Glu Gln Ile Gln Ala Glu Gln Tyr Leu 530 535 540 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Leu Gln Leu Glu Ile Glu Asn Cys Lys 545 550 555 560 Glu Glu Ile Ala Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ile 565 570 575 Lys Val Glu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu Tyr Leu Gln 580 585 590 Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Thr Lys Asn Thr Leu Glu Glu Gln Leu 595 600 605 Lys Lys Glu Thr Ala Ala Lys Ala Asn Leu Glu Gln Leu Val Phe Glu 610 615 620 Glu Lys Asn Lys Ala Gln Arg Leu Gln Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu 625 630 635 640 Gln Val Gln Arg Asp Phe Val Lys Leu Ser Gln Thr Leu Gln Val Gln 645 650 655 Leu Glu Arg Ile Arg Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Ile 660 665 670 Leu Asn Asp Thr Lys Leu Thr Asp Ile Asn Gln Leu Pro Glu Thr 675 680 685 687 で表されるポリペプチドあるいは該ポリペプチドの一部
    が置換又は欠失された神経突起伸長活性を有する蛋白
    質。
  2. 【請求項２】一般式（Ａ）で表されるポリペプチドの６
    ５〜６８７、２８２〜６８７又は４３６〜６８７をその
    アミノ酸配列中に含む蛋白質。
  3. 【請求項３】下記式（Ａ） （Ａ） Met Lys Lys Ala Gln Glu Asp Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Val Met 1 5 10 15 Pro Met Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ile Glu Ala 20 25 30 Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Lys Val Lys Glu Leu Asn 35 40 45 His Tyr Leu Glu Ala Glu Lys Ser Cys Arg Gln Asp Leu Glu Met Tyr 50 55 60 Val Ala Val Leu Asn Thr Gln Lys Ser Val Leu Gln Glu Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Lys Glu Leu His Glu Val Cys His Leu Leu Glu Gln Glu 85 90 95 Arg Gln Gln His Asn Gln Leu Lys His Thr Trp Gln Lys Ala Asn Asp 100 105 110 Gln Phe Leu Glu Ser Gln Arg Leu Leu Met Arg Asp Met Gln Arg Met 115 120 125 Glu Ile Val Leu Thr Ser Glu Gln Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Lys 130 135 140 Lys Lys Asp Gln Glu Glu Asp Asp Gln Gln Arg Leu Ser Lys Arg Lys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Gln Lys Asp Ser Asp Asp Glu Thr Lys Ala Ser Cys Ser 165 170 175 Leu Ala His Glu Glu Ser Leu Thr Gln Phe Ser Asn Glu Glu Val His 180 185 190 Leu Asn Ser Thr His Ser Ser Val His Ser Leu Asp Ala Asp Leu Leu 195 200 205 Leu Ser Ser Gly Glu Ser Phe Asn Lys Ser Glu Asn Asp Met Phe Lys 210 215 220 Asp Gly Leu Arg Arg Ala Gln Ser Thr Asp Ser Leu Gly Thr Ser Gly 225 230 235 240 Ser Leu Gln Ser Lys Ala Leu Gly Tyr Asn Asn Lys Ala Lys Ser Ala 245 250 255 Gly Asn Leu Asp Glu Ser Asp Phe Gly Pro Leu Val Gly Ala Asp Ser 260 265 270 Val Ser Glu Asn Tyr Asp Thr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Gln Met Pro 275 280 285 Ser Gly Phe Met Leu Thr Lys Asp Gln Glu Lys Ala Ile Lys Ala Met 290 295 300 Thr Pro Glu Gln Glu Glu Thr Ala Ser Leu Leu Ser Ser Val Thr Gln 305 310 315 320 Gly Val Glu Ser Ala Tyr Val Ser Pro Ser Gly Tyr Arg Leu Val Ser 325 330 335 Glu Thr Glu Trp Asn Leu Leu Gln Lys Glu Val Gln Asn Ala Gly Asn 340 345 350 Lys Leu Gly Arg Arg Cys Asp Met Cys Ser Asn Tyr Glu Lys Gln Leu 355 360 365 Gln Gly Ile Gln Ile Gln Glu Ala Glu Thr Arg Asp Gln Val Lys Lys 370 375 380 Leu Gln Val Met Leu Arg Gln Ala Asn Asp Gln Leu Glu Lys Thr Met 385 390 395 400 Lys Asp Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Met Lys Gln Ser Ala Glu Asp 405 410 415 Ser Ser Asn Gln Ile Ser Leu Leu Met Val Lys Cys Gln Lys Ser Glu 420 425 430 Asn Phe Leu Asn Glu Leu Gln Gln Ala Phe Ser Gln Ala Lys Arg Ser 435 440 445 Val Gln Glu Gln Met Ala Val Leu Thr Gln Ser Arg Glu Gln Val Ser 450 455 460 Glu Glu Leu Val Arg Leu Gln Lys Asp Asn Glu Ser Leu Gln Gly Lys 465 470 475 480 His Ser Leu His Val Ser Leu Gln Gln Ala Glu Asp Phe Ile Leu Pro 485 490 495 Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys Tyr Arg Glu Asp 500 505 510 Ile Ile Ser Val Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Glu Glu Lys Leu Lys 515 520 525 Ala Glu Ile Leu Phe Leu Lys Glu Gln Ile Gln Ala Glu Gln Tyr Leu 530 535 540 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Leu Gln Leu Glu Ile Glu Asn Cys Lys 545 550 555 560 Glu Glu Ile Ala Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ile 565 570 575 Lys Val Glu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu Tyr Leu Gln 580 585 590 Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Thr Lys Asn Thr Leu Glu Glu Gln Leu 595 600 605 Lys Lys Glu Thr Ala Ala Lys Ala Asn Leu Glu Gln Leu Val Phe Glu 610 615 620 Glu Lys Asn Lys Ala Gln Arg Leu Gln Thr Glu Leu Asp Val Ser Glu 625 630 635 640 Gln Val Gln Arg Asp Phe Val Lys Leu Ser Gln Thr Leu Gln Val Gln 645 650 655 Leu Glu Arg Ile Arg Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Ile 660 665 670 Leu Asn Asp Thr Lys Leu Thr Asp Ile Asn Gln Leu Pro Glu Thr 675 680 685 687 で表されるポリペプチドあるいは該ポリペプチドの一部
    が置換又は欠失された神経突起伸長活性を有する蛋白質
    をコードする核酸配列を含むＤＮＡ。
  4. 【請求項４】一般式（Ａ）で表されるポリペプチドの６
    ５〜６８７、２８２〜６８７又は４３６〜６８７をコー
    ドする核酸配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ。
  5. 【請求項５】下記式（Ｂ） （Ｂ） ATG AAA AAG GCC CAG GAA GAT GCT GAG AAG CTT CGT TCG GTT GTG ATG 48 CCT ATG GAG AAA GAG ATT GCA GCA CTA AAG GAG AAG TTG ATA GAG GCT 96 GAA GAA AAA ATA AAG GAG TTA GAA GCA TCA AAG GTT AAA GAA CTG AAC 144 CAT TAT CTG GAA GCT GAG AAG TCC TGT AGG CAA GAC TTA GAG ATG TAC 192 GTG GCT GTC CTC AAC ACG CAG AAA TCT GTC CTG CAA GAG GAT GCA GAG 240 AAG TTG CGG AAA GAG CTG CAT GAA GTC TGC CAT CTC TTA GAG CAA GAG 288 CGA CAA CAG CAC AAC CAG TTG AAA CAC ACG TGG CAA AAA GCC AAT GAC 336 CAG TTC TTG GAG TCC CAG CGT TTG CTG ATG AGA GAC ATG CAA CGT ATG 384 GAG ATT GTC CTG ACC TCT GAG CAG CTT CGA CAG GTC GAA GAA CTG AAA 432 AAA AAA GAT CAG GAA GAA GAT GAT CAG CAG AGA CTT AGC AAA AGA AAG 480 GAA CAG AAA CAG AAA GAT TCA GAC GAT GAA ACA AAA GCT TCG TGT TCT 528 TTA GCC CAC GAG GAA TCC CTT ACC CAG TTC TCT AAT GAA GAG GTG CAT 576 TTA AAT AGC ACC CAC AGC TCA GTC CAT TCG TTG GAC GCA GAC TTG CTT 624 CTG TCT TCT GGT GAA TCG TTC AAT AAA TCA GAA AAC GAT ATG TTT AAA 672 GAT GGA CTA CGG AGA GCA CAG TCA ACA GAC AGT CTA GGG ACA TCT GGA 720 TCT TTA CAG TCC AAA GCT TTA GGA TAC AAC AAC AAA GCA AAA TCT GCT 768 GGG AAC CTG GAT GAG TCA GAT TTT GGA CCA CTT GTT GGA GCA GAT TCA 816 GTG TCT GAG AAC TAT GAT ACA GCT TCC CTT GGG TCT CTG CAA ATG CCT 864 AGT GGG TTT ATG TTA ACC AAA GAT CAG GAG AAA GCA ATC AAA GCA ATG 912 ACA CCA GAG CAA GAA GAG ACT GCT TCA CTT CTT TCC AGT GTT ACA CAA 960 GGA GTT GAA AGC GCA TAT GTG TCT CCT AGC GGT TAC CGC TTG GTG AGC 1008 GAG ACA GAG TGG AAT CTG CTG CAG AAA GAG GTG CAG AAT GCA GGG AAC 1056 AAG CTG GGT AGG CGC TGC GAT ATG TGC TCG AAT TAT GAG AAG CAG TTG 1104 CAA GGT ATC CAG ATT CAG GAG GCT GAA ACA AGA GAC CAG GTG AAA AAG 1152 CTG CAG GTG ATG CTG AGG CAG GCT AAT GAC CAG CTG GAA AAA ACA ATG 1200 AAA GAT AAA CAG GAA TTG GAG GAG TAT ATG AAA CAA AGT GCT GAA GAC 1248 TCC TCT AAT CAG ATC TCT TTG CTA ATG GTT AAA TGT CAG AAG TCA GAG 1296 AAT TTC CTC AAT GAA CTG CAG CAG GCG TTT TCT CAA GCA AAG AGA AGT 1344 GTG CAG GAG CAA ATG GCT GTT CTG ACG CAG TCA AGG GAG CAG GTT TCA 1392 GAA GAG TTG GTG AGA CTG CAG AAA GAT AAT GAA AGT CTT CAA GGA AAA 1440 CAT AGC TTA CAT GTG TCT TTA CAA CAA GCT GAA GAT TTC ATT CTA CCA 1488 GAA GCA GCA GAG GAG CTC CGG GAG CTG ATT TTA AAG TAT CGT GAA GAC 1536 ATC ATT AGT GTA CGG ACA GCA GCA GAT CAC CTG GAG GAG AAA CTT AAG 1584 GCA GAG ATT TTA TTC TTA AAA GAA CAG ATT CAA GCT GAA CAG TAT TTG 1632 AAA GAA AAC ATA GAA GAA ACT CTA CAG CTG GAA ATA GAG AAT TGC AAA 1680 GAG GAA ATC GCT TCC ATT TCC AGT TTA AAA GCT GAA CTG GAA AGA ATA 1728 AAA GTG GAG AAA GAG CAG TTA GAA AGT TCT TCA CAG GAA TAC CTG CAG 1776 CAG CTG GAG AGT CTG CAG GAA ACA AAA AAC ACT CTG GAA GAA CAG CTG 1824 AAG AAG GAA ACA GCA GCA AAG GCA AAC CTT GAA CAG CTG GTG TTT GAA 1872 GAG AAG AAT AAA GCT CAG AGG CTG CAG ACT GAA TTA GAT GTC AGT GAG 1920 CAA GTT CAG AGA GAT TTT GTA AAG CTT TCT CAG ACA CTT CAG GTG CAG 1968 CTG GAG CGG ATC CGG CAG GCA GAT TCC CTG GAG AGA ATC CGT GCA ATC 2016 CTG AAT GAC ACA AAA CTG ACG GAC ATT AAT CAG CTT CCT GAA ACA TGA 2064 で表される請求項４に記載のＤＮＡ。
  6. 【請求項６】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
    神経突起伸長剤。
  7. 【請求項７】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
    抗痴呆剤。
  8. 【請求項８】請求項１に記載の蛋白質を有効成分とする
    記憶改善剤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1999013074A1 (fr) * 1997-09-08 1999-03-18 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Proteine activant des fonctions de cellules nerveuses

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