JPH08134096A - 新規なポリペプチド及びその用途 - Google Patents
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なポリペプチド及びその抗菌剤としての
用途を提供する。 【構成】 一般式 (I) Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa2-Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-R (式中 Xaa1 は Val、Leu、Phe 又は Ile を意味し、Xaa
2 は Val 又は Leu を意味し、R は OH 又は NH2 を意
味する)にて示されるポリペプチド又はその塩。 【効果】 このポリペプチドは一般細菌のみならず、真
菌に対して優れた抗菌活性を示し且つ毒性が極めて低
く、構成アミノ酸の数が僅か 9 個であり且つ合成上課
題のあるアミノ酸を有していないので化学合成法により
容易に、比較的廉価に且つ大量に調製することが可能で
ある。
用途を提供する。 【構成】 一般式 (I) Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa2-Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-R (式中 Xaa1 は Val、Leu、Phe 又は Ile を意味し、Xaa
2 は Val 又は Leu を意味し、R は OH 又は NH2 を意
味する)にて示されるポリペプチド又はその塩。 【効果】 このポリペプチドは一般細菌のみならず、真
菌に対して優れた抗菌活性を示し且つ毒性が極めて低
く、構成アミノ酸の数が僅か 9 個であり且つ合成上課
題のあるアミノ酸を有していないので化学合成法により
容易に、比較的廉価に且つ大量に調製することが可能で
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なポリペプチド及び
その用途に係る。本発明によるポリペプチド又はその塩
は一般細菌のみならず、真菌に対しても優れた抗菌活性
を有しており且つ毒性が極めて低いので、一般細菌性疾
患又はカンジダ症等の真菌性疾患治療剤の有効成分とし
て、更には食品又は飼料用の抗菌性添加剤として使用す
ることができる。
その用途に係る。本発明によるポリペプチド又はその塩
は一般細菌のみならず、真菌に対しても優れた抗菌活性
を有しており且つ毒性が極めて低いので、一般細菌性疾
患又はカンジダ症等の真菌性疾患治療剤の有効成分とし
て、更には食品又は飼料用の抗菌性添加剤として使用す
ることができる。
【０００２】
【従来の技術】抗菌活性を有するペプチド類の開発に関
するの研究は従来から盛んに行われている。例えば、環
状ペプチド誘導体 (特開昭 58 - 213744 号公報)、酵母
類に対する抗菌ポリペプチド (特開昭 60 - 130599 号
公報)、新規グリコペプチド (特開昭61- 251699 号公
報)、グラム陽性菌に効果を示すオリゴペプチド (特開
昭 62 -22798 号公報)、ペプチド系抗生物質 (特開昭 6
3 - 17897 及び特開平 6 -56889 号公報) 等を例示する
ことができる。しかしながら、これらのペプチド類の内
で、殊に真菌に対して充分な抗菌効果を発揮するものは
存在しないようである。尚、近年に至り臨床の場では A
IDS 等による真菌症が問題になってきている。抗真菌剤
としてはアムホテリシン B やトリアゾール系のものが
主として用いられているが、その効果が充分でなかった
り副作用が強い等の点で満足し得る抗真菌剤は得られて
いないのが現状である。従って、安全性に優れ、効果が
充分に期待できるペプチド性の抗真菌剤が求められてい
る。
するの研究は従来から盛んに行われている。例えば、環
状ペプチド誘導体 (特開昭 58 - 213744 号公報)、酵母
類に対する抗菌ポリペプチド (特開昭 60 - 130599 号
公報)、新規グリコペプチド (特開昭61- 251699 号公
報)、グラム陽性菌に効果を示すオリゴペプチド (特開
昭 62 -22798 号公報)、ペプチド系抗生物質 (特開昭 6
3 - 17897 及び特開平 6 -56889 号公報) 等を例示する
ことができる。しかしながら、これらのペプチド類の内
で、殊に真菌に対して充分な抗菌効果を発揮するものは
存在しないようである。尚、近年に至り臨床の場では A
IDS 等による真菌症が問題になってきている。抗真菌剤
としてはアムホテリシン B やトリアゾール系のものが
主として用いられているが、その効果が充分でなかった
り副作用が強い等の点で満足し得る抗真菌剤は得られて
いないのが現状である。従って、安全性に優れ、効果が
充分に期待できるペプチド性の抗真菌剤が求められてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】本発明
は従来技術におけるこのような困難をふまえてなされた
ものであり、本発明の目的は、ポリペプチド系抗菌剤を
開発する上で従来課題とされてきた生産コストを低く抑
え且つ合成が容易であり、しかも正常細胞に対しては毒
性が極めて低く且つ抗菌活性、殊に抗真菌活性において
も優れた新規なポリペプチドを提供することにある。
は従来技術におけるこのような困難をふまえてなされた
ものであり、本発明の目的は、ポリペプチド系抗菌剤を
開発する上で従来課題とされてきた生産コストを低く抑
え且つ合成が容易であり、しかも正常細胞に対しては毒
性が極めて低く且つ抗菌活性、殊に抗真菌活性において
も優れた新規なポリペプチドを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】本発明
者等は鋭意検討を重ねた結果、正電荷を有するリジン残
基を基本とし、これに主としてバリン又はロイシン残基
を組み合わせた 10 個以下の構成アミノ酸からなるポリ
ペプチドがカンジタ菌等に対しても強い抗真菌活性を示
すと共に、赤血球やミドリザル由来の腎細胞等の正常細
胞に対する毒性が極めて低いことを見い出し、これによ
って本発明を基本的には完成するに至った。
者等は鋭意検討を重ねた結果、正電荷を有するリジン残
基を基本とし、これに主としてバリン又はロイシン残基
を組み合わせた 10 個以下の構成アミノ酸からなるポリ
ペプチドがカンジタ菌等に対しても強い抗真菌活性を示
すと共に、赤血球やミドリザル由来の腎細胞等の正常細
胞に対する毒性が極めて低いことを見い出し、これによ
って本発明を基本的には完成するに至った。
【０００５】従って、本発明は一般式 (I、配列番号 :
1) Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa2-Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-R (式中 Xaa1 は Val、Leu、Phe 又は Ile を意味し、Xaa
2 は Val 又は Leu を意味し、R は OH 又は NH2 を意
味する)にて示されるポリペプチド又はその塩を提供す
ると共に、これらの内の少なくとも 1 種を有効成分と
して含有する抗菌剤乃至食品及び飼料用の抗菌性添加剤
を提供するものである。
1) Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa2-Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-R (式中 Xaa1 は Val、Leu、Phe 又は Ile を意味し、Xaa
2 は Val 又は Leu を意味し、R は OH 又は NH2 を意
味する)にて示されるポリペプチド又はその塩を提供す
ると共に、これらの内の少なくとも 1 種を有効成分と
して含有する抗菌剤乃至食品及び飼料用の抗菌性添加剤
を提供するものである。
【０００６】本明細書において、アミノ酸は本技術分野
において慣用されている 3 文字又は 1 文字略号で示さ
れ、例示すれば下記の通りである。 リジン : Lys 又は K、ロイシン : Leu 又は L、バリン
: Val 又は V、フェニルアラニン : Phe 又は F、イソ
ロイシン : Ile 又は I。
において慣用されている 3 文字又は 1 文字略号で示さ
れ、例示すれば下記の通りである。 リジン : Lys 又は K、ロイシン : Leu 又は L、バリン
: Val 又は V、フェニルアラニン : Phe 又は F、イソ
ロイシン : Ile 又は I。
【０００７】本発明によるポリペプチドは、上記の一般
式 (I) から明らかなようにLys- Xaa1-Lys (Xaa1 は上
記の疎水性アミノ酸を意味する) なる配列を有するトリ
ペプチドを N 及び C 末端に有し、中央の部位にロイシ
ン又はバリンを 3 個有している比較的単純な構造を有
するポリペプチドである。尚、C 末端がカルボキシル基
であっても、アミド化されていてもポリペプチドの抗菌
活性は殆ど同じであり、アミド化されている場合の方が
若干高い。本発明によるポリペプチドは、その構成アミ
ノ酸の数が僅か 9 個であり、合成上に課題のあるトリ
プトファン、システイン、メチオニン等を含有していな
いので、化学合成法により容易に且つ廉価に大量生産す
ることが可能でき、これにより既述の課題を解決すると
共に本発明の目的を達成することができる。これらのポ
リペプチドは塩の形であることが可能であり、例えば塩
酸、トリフルオロ酢酸や燐酸等の無機又は有機酸の付加
塩であることができる。
式 (I) から明らかなようにLys- Xaa1-Lys (Xaa1 は上
記の疎水性アミノ酸を意味する) なる配列を有するトリ
ペプチドを N 及び C 末端に有し、中央の部位にロイシ
ン又はバリンを 3 個有している比較的単純な構造を有
するポリペプチドである。尚、C 末端がカルボキシル基
であっても、アミド化されていてもポリペプチドの抗菌
活性は殆ど同じであり、アミド化されている場合の方が
若干高い。本発明によるポリペプチドは、その構成アミ
ノ酸の数が僅か 9 個であり、合成上に課題のあるトリ
プトファン、システイン、メチオニン等を含有していな
いので、化学合成法により容易に且つ廉価に大量生産す
ることが可能でき、これにより既述の課題を解決すると
共に本発明の目的を達成することができる。これらのポ
リペプチドは塩の形であることが可能であり、例えば塩
酸、トリフルオロ酢酸や燐酸等の無機又は有機酸の付加
塩であることができる。
【０００８】本発明による抗菌剤はペプチドであるため
に経口投与等された場合においては、毒性の発現は殆ど
ない。その他の投与経路であっても、他の化学物質であ
る抗生物質のように残留性が問題になることはない。従
って、本発明によるポリペプチドはヒト又は他の動物に
おける細菌性疾患、特に真菌症に対して有効であり、又
食品や飼料用の抗菌性添加物としても使用することがで
きる。本発明によるポリペプチドを医薬品として用いる
場合には、主として注射剤として製剤化されるが、錠剤
等の経口剤、クリーム剤乃至軟膏剤、ローション剤、ゲ
ル剤、膣剤又はトローチ剤とすることもできる。
に経口投与等された場合においては、毒性の発現は殆ど
ない。その他の投与経路であっても、他の化学物質であ
る抗生物質のように残留性が問題になることはない。従
って、本発明によるポリペプチドはヒト又は他の動物に
おける細菌性疾患、特に真菌症に対して有効であり、又
食品や飼料用の抗菌性添加物としても使用することがで
きる。本発明によるポリペプチドを医薬品として用いる
場合には、主として注射剤として製剤化されるが、錠剤
等の経口剤、クリーム剤乃至軟膏剤、ローション剤、ゲ
ル剤、膣剤又はトローチ剤とすることもできる。
【０００９】
【実施例等】次に、製造例及び薬理活性試験例に関連し
て本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。製造例 (1) 抗菌性ポリペプチドの合成と精製 ポリペプチドの合成は、パーキンエルマー社製のペプチ
ド合成装置 (model431A) を使用し、t-Boc アミノ酸を
用いた固相法により行った。アミノ酸は、α-アミノ基
が t-ブトキシカルボニル基 (t-Boc 基) にて保護され
たもので、その他 ε-アミノ基は 2-クロロベンジルオ
キシカルボニル基等で保護されたものを用いた。樹脂
は、C 末端がアミドのペプチドを与える p-メチルベン
ズヒドリルアミン (MBHA) 樹脂又は C 末端がカルボキ
シルのペプチドを与えるフェニルアセトアミドメチル
(PAM) 樹脂を用いた。MBHA 樹脂または t-Boc リジンが
導入された PAM 樹脂 0.5 mmol をトリフルオロ酢酸／
塩化メチレンにより t-Boc 基を除去し、保護アミノ酸
2 mmol とジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)／ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)で縮合反応を行う
ことによりペプチド結合を形成させた。塩化メチレンに
て洗浄後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシ
ル末端から順次アミノ酸を導入することにより本発明に
よる各種のペプチドを合成していった。合成したペプチ
ドについてはトリフルオロメタンスルホン酸法にて脱保
護基、脱樹脂を行なった。即ち、ペプチド 500 mg に対
しトリフルオロメタンスルホン酸 1ml、トリフルオロ酢
酸 5ml、チオアニソール 1ml 及びエタンジチオール0.5
ml を氷冷しながら 2 - 3 時間反応させた。粗ペプチド
を下記に示す条件の逆相 HPLC により精製した。 カラム：ウォーターズ社製の μ-ボンダスフェア C-18
(19mm x 15cm)、 溶出液：0.012N 塩酸中 15% から 50% のアセトニトリ
ルの直線勾配、35 分間、 流速 ：7.0ml/min。 HPLC によるメインピーク部分を回収して凍結乾燥し
た。その一部をパーキンエルマー社製のペプチドシーク
ェンサーにて調べた処、サンプルはすべて正しく化学合
成されていることが確認された。尚、本発明の範畴に属
しない各種のアミノ酸配列を有する抗菌性ポリペプチド
も同様に合成され、精製された。
て本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。製造例 (1) 抗菌性ポリペプチドの合成と精製 ポリペプチドの合成は、パーキンエルマー社製のペプチ
ド合成装置 (model431A) を使用し、t-Boc アミノ酸を
用いた固相法により行った。アミノ酸は、α-アミノ基
が t-ブトキシカルボニル基 (t-Boc 基) にて保護され
たもので、その他 ε-アミノ基は 2-クロロベンジルオ
キシカルボニル基等で保護されたものを用いた。樹脂
は、C 末端がアミドのペプチドを与える p-メチルベン
ズヒドリルアミン (MBHA) 樹脂又は C 末端がカルボキ
シルのペプチドを与えるフェニルアセトアミドメチル
(PAM) 樹脂を用いた。MBHA 樹脂または t-Boc リジンが
導入された PAM 樹脂 0.5 mmol をトリフルオロ酢酸／
塩化メチレンにより t-Boc 基を除去し、保護アミノ酸
2 mmol とジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)／ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)で縮合反応を行う
ことによりペプチド結合を形成させた。塩化メチレンに
て洗浄後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシ
ル末端から順次アミノ酸を導入することにより本発明に
よる各種のペプチドを合成していった。合成したペプチ
ドについてはトリフルオロメタンスルホン酸法にて脱保
護基、脱樹脂を行なった。即ち、ペプチド 500 mg に対
しトリフルオロメタンスルホン酸 1ml、トリフルオロ酢
酸 5ml、チオアニソール 1ml 及びエタンジチオール0.5
ml を氷冷しながら 2 - 3 時間反応させた。粗ペプチド
を下記に示す条件の逆相 HPLC により精製した。 カラム：ウォーターズ社製の μ-ボンダスフェア C-18
(19mm x 15cm)、 溶出液：0.012N 塩酸中 15% から 50% のアセトニトリ
ルの直線勾配、35 分間、 流速 ：7.0ml/min。 HPLC によるメインピーク部分を回収して凍結乾燥し
た。その一部をパーキンエルマー社製のペプチドシーク
ェンサーにて調べた処、サンプルはすべて正しく化学合
成されていることが確認された。尚、本発明の範畴に属
しない各種のアミノ酸配列を有する抗菌性ポリペプチド
も同様に合成され、精製された。
【００１０】(2) 生理活性の試験法 抗菌活性は、微量液体希釈法により最小発育阻止濃度
(MIC) として求めた。測定は National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS,Villanova, 19
88) from USA に従って行った。即ち、各菌体を Cation
Supplemented Mueller-Hinton Broth (CSMHB) 培地で振
盪培養後、650nm における吸光度が 0.3 になるように
菌の濃度を調整し、更に培地で 106 CFU/ml になるよう
に希釈する。この菌体溶液と培地で希釈した抗菌物質の
サンプルを各々50μl 添加し、35℃ で 20 - 24 時間培
養し最小発育阻止濃度を求めた。
(MIC) として求めた。測定は National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS,Villanova, 19
88) from USA に従って行った。即ち、各菌体を Cation
Supplemented Mueller-Hinton Broth (CSMHB) 培地で振
盪培養後、650nm における吸光度が 0.3 になるように
菌の濃度を調整し、更に培地で 106 CFU/ml になるよう
に希釈する。この菌体溶液と培地で希釈した抗菌物質の
サンプルを各々50μl 添加し、35℃ で 20 - 24 時間培
養し最小発育阻止濃度を求めた。
【００１１】抗菌活性の測定例 1 (中央部の Leu の数
が異なるアナログの抗菌活性) N 末端と C 末端におけるアミノ酸配列が RLK の場合と
KLK の場合について、中央の部位が L であって、その
数が異なるポリペプチドの抗菌活性を調べた結果は、下
記の表 1 に示される通りであった。この表 1 から、N
及び C 末端が RLK の場合には、Leu の数が 5 個の場
合に最も活性が高く 4 個 、3 個になると活性は弱くな
る傾向がある。一方、本発明が関与する KLK を基本に
した場合には 4 個や 3 個の方が活性において優れてい
ることが明らかになった。
が異なるアナログの抗菌活性) N 末端と C 末端におけるアミノ酸配列が RLK の場合と
KLK の場合について、中央の部位が L であって、その
数が異なるポリペプチドの抗菌活性を調べた結果は、下
記の表 1 に示される通りであった。この表 1 から、N
及び C 末端が RLK の場合には、Leu の数が 5 個の場
合に最も活性が高く 4 個 、3 個になると活性は弱くな
る傾向がある。一方、本発明が関与する KLK を基本に
した場合には 4 個や 3 個の方が活性において優れてい
ることが明らかになった。
【００１２】
【表１】 表 1 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。
【００１３】抗菌活性の測定例 2 (KLK の部位を変換し
たアナログの抗菌活性) MIC の測定結果が下記の表 2 に示されている。この表
2 から明らかなように、KLK の K (リジン) の部位を正
電荷を有する他のアミノ酸に変換した場合に、R (アル
ギニン) への変換では活性は保持されるが、H (ヒスチ
ジン) への変換では活性は消失する。又、表 2 には明
示されていないが、アミノ酸配列における中央部に L
(ロイシン) を有しないものは活性を有しないことが判
明した。尚、KLKLLLKLK-NH2 を基本として KLK の Leu
の部位を他のアミノ酸に変換したアナログでは Gly (グ
リシン) に変換したものでは活性は殆ど消失し、A(アラ
ニン) 又は C (システイン) に変換したものでは MRSA
等の耐性菌に対する活性が大幅に減少し、他の疎水性ア
ミノ酸である V (バリン)、I (イソロイシン) 又は F
(フェニルアラニン) に変換したものでは活性が保持さ
れることも判明した。
たアナログの抗菌活性) MIC の測定結果が下記の表 2 に示されている。この表
2 から明らかなように、KLK の K (リジン) の部位を正
電荷を有する他のアミノ酸に変換した場合に、R (アル
ギニン) への変換では活性は保持されるが、H (ヒスチ
ジン) への変換では活性は消失する。又、表 2 には明
示されていないが、アミノ酸配列における中央部に L
(ロイシン) を有しないものは活性を有しないことが判
明した。尚、KLKLLLKLK-NH2 を基本として KLK の Leu
の部位を他のアミノ酸に変換したアナログでは Gly (グ
リシン) に変換したものでは活性は殆ど消失し、A(アラ
ニン) 又は C (システイン) に変換したものでは MRSA
等の耐性菌に対する活性が大幅に減少し、他の疎水性ア
ミノ酸である V (バリン)、I (イソロイシン) 又は F
(フェニルアラニン) に変換したものでは活性が保持さ
れることも判明した。
【００１４】
【表２】 表 2 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。
【００１５】抗菌活性の測定例 3 (C 末端に KLK の部
位を有しないポリペプチドの抗菌活性） C 末端に KLK のトリペプチドを有しないポリペプチド
の S. aureus に対する抗菌活性は Leu の数に拘らず、
C 末端に KLK を有する場合の活性と比較して1/2 - 1/8
程度に低下した (下記の表 3 参照)。
位を有しないポリペプチドの抗菌活性） C 末端に KLK のトリペプチドを有しないポリペプチド
の S. aureus に対する抗菌活性は Leu の数に拘らず、
C 末端に KLK を有する場合の活性と比較して1/2 - 1/8
程度に低下した (下記の表 3 参照)。
【００１６】
【表３】 表 3 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。
【００１７】抗菌活性の測定例 4 (カンジタ菌に対する
活性測定) 真菌に対する活性は、Candida albicans を用い培地は
サブロー培地を用いてMIC の測定を行った。その結果 K
LKLLLKLK-NH2 及び KVKLLLKVK-NH2 が他のペプチドと比
較して極めて抗真菌活性の高いことが明らかになった
(下記の表 4 参照)。
活性測定) 真菌に対する活性は、Candida albicans を用い培地は
サブロー培地を用いてMIC の測定を行った。その結果 K
LKLLLKLK-NH2 及び KVKLLLKVK-NH2 が他のペプチドと比
較して極めて抗真菌活性の高いことが明らかになった
(下記の表 4 参照)。
【００１８】
【表４】 表 4 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。
【００１９】抗菌活性の測定例 5 抗菌活性の測定例 3 及び 4 の結果から KLKLLLKLK-NH2
(配列番号 7) は S.aureus や E. coli に対してのみ
でなく真菌に対しても強い抗真菌活性を示し、又 KVKLL
LKVK-NH 2 (配列番号 2) も強い抗真菌活性を示すので、
アミノ酸配列のN 及び C 末端が KLK 又は KVK であり
且つ中央の部位が LLL のみ ではなく、VVV 又は V と
L の組合せからなる各種のポリペプチドを合成して MIC
を求めた結果を下記の表 5 に示す (この表 5 には上
記の配列番号 2 及 び 7 に該当するポリペプチドの抗
細菌及び抗真菌活性も併せて示されている)。
(配列番号 7) は S.aureus や E. coli に対してのみ
でなく真菌に対しても強い抗真菌活性を示し、又 KVKLL
LKVK-NH 2 (配列番号 2) も強い抗真菌活性を示すので、
アミノ酸配列のN 及び C 末端が KLK 又は KVK であり
且つ中央の部位が LLL のみ ではなく、VVV 又は V と
L の組合せからなる各種のポリペプチドを合成して MIC
を求めた結果を下記の表 5 に示す (この表 5 には上
記の配列番号 2 及 び 7 に該当するポリペプチドの抗
細菌及び抗真菌活性も併せて示されている)。
【００２０】
【表５】 表 5 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。
【００２１】表 5 から明らかなように、本発明による
ポリペプチドはグラム陽性菌及びグラム陰性菌の広い範
囲の微生物に対してのみならず、真菌である C. albica
nsに対しても強い抗菌活性を示すことが判明した。
ポリペプチドはグラム陽性菌及びグラム陰性菌の広い範
囲の微生物に対してのみならず、真菌である C. albica
nsに対しても強い抗菌活性を示すことが判明した。
【００２２】正常細胞に対する細胞障害活性の測定 (1) 培養細胞における細胞障害活性 ミドリザル腎 (GMK) 由来の細胞を 96 穴プレートでコ
ンフルエントになるまで培養する。培地を捨てて新たに
検体である抗菌性ポリペプチドを含有する培地を添加す
る。37℃、5% CO2で 20 - 24 時間培養する。培地を除
去し、PBS(-)100μl にて洗浄する。1mM の臭化 3-(4,5
-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H テトラゾ
リウム (MTT) を含有する培地 50μl を添加し、37
℃、5% CO2 で 1 時間培養する。その後、10% ドデシル
硫酸ナトリウムと 0.04N 塩酸を含有する 50% イソブタ
ノール溶液 100μl を添加した後に、540nm で吸光度を
測定する。この場合に、生細胞の酵素により MTT が呈
色物質のホルマザンに還元され、このホルマザンの量は
細胞数に比例して増加するので、特異的吸光度を測定す
ることにより障害を受けていない細胞の量が判明する。
結果は、50% の細胞障害性を示す抗菌性ペプチド濃度で
表した (後記の表 6 参照)。表 6 から明かな通り、本
発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が
3 個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドは
50% の細胞障害性値が何れも 200μg/ml 以上であり、
正常細胞に対して作用する蜂毒のメリチンと比較する場
合に細胞障害活性は弱く 1/40 以下であり、中央部が 5
個 の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドと比
較する場合にも 1/3 以下 であり毒性は少なく安全性に
優れたペプチドであることが判明した。
ンフルエントになるまで培養する。培地を捨てて新たに
検体である抗菌性ポリペプチドを含有する培地を添加す
る。37℃、5% CO2で 20 - 24 時間培養する。培地を除
去し、PBS(-)100μl にて洗浄する。1mM の臭化 3-(4,5
-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H テトラゾ
リウム (MTT) を含有する培地 50μl を添加し、37
℃、5% CO2 で 1 時間培養する。その後、10% ドデシル
硫酸ナトリウムと 0.04N 塩酸を含有する 50% イソブタ
ノール溶液 100μl を添加した後に、540nm で吸光度を
測定する。この場合に、生細胞の酵素により MTT が呈
色物質のホルマザンに還元され、このホルマザンの量は
細胞数に比例して増加するので、特異的吸光度を測定す
ることにより障害を受けていない細胞の量が判明する。
結果は、50% の細胞障害性を示す抗菌性ペプチド濃度で
表した (後記の表 6 参照)。表 6 から明かな通り、本
発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が
3 個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドは
50% の細胞障害性値が何れも 200μg/ml 以上であり、
正常細胞に対して作用する蜂毒のメリチンと比較する場
合に細胞障害活性は弱く 1/40 以下であり、中央部が 5
個 の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドと比
較する場合にも 1/3 以下 であり毒性は少なく安全性に
優れたペプチドであることが判明した。
【００２３】(2) 羊赤血球 (SRBC) の溶血反応 羊保存血液 (羊血液にアルセバー氏液を等量添加したも
の) 0.2ml に PBS を0.8ml 添加し、2000 x g で 5 分
間遠心し、上清を除去することにより洗浄を行う。PBS
を 10ml 添加した後、この赤血球溶液 25μl に検体で
ある抗菌性ポリペプチド溶液 25μl を添加し、37℃ で
2 時間インキュベーションする。 2000x g で 5 分間
遠心を行い、上清の吸光度を 576nm で測定する。結果
は、10% の溶血性を示す抗菌性ポリペプチド濃度で表し
た (下記の表 6 参照)。表 6 から明かな通り、本発明
によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が 3
個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドでは溶
血作用濃度が何れも 250μg/ml 以上であり、蜂毒のメ
リチンと比較する場合に赤血球に対する溶血活性は 1/6
0 以下であり、中央部が 5 個の疎水性アミノ酸から構
成されるポリペプチドと比較する場合にも有意に低く、
毒性が少ない安全性に優れたペプチドであることが判明
した。
の) 0.2ml に PBS を0.8ml 添加し、2000 x g で 5 分
間遠心し、上清を除去することにより洗浄を行う。PBS
を 10ml 添加した後、この赤血球溶液 25μl に検体で
ある抗菌性ポリペプチド溶液 25μl を添加し、37℃ で
2 時間インキュベーションする。 2000x g で 5 分間
遠心を行い、上清の吸光度を 576nm で測定する。結果
は、10% の溶血性を示す抗菌性ポリペプチド濃度で表し
た (下記の表 6 参照)。表 6 から明かな通り、本発明
によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が 3
個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドでは溶
血作用濃度が何れも 250μg/ml 以上であり、蜂毒のメ
リチンと比較する場合に赤血球に対する溶血活性は 1/6
0 以下であり、中央部が 5 個の疎水性アミノ酸から構
成されるポリペプチドと比較する場合にも有意に低く、
毒性が少ない安全性に優れたペプチドであることが判明
した。
【００２４】
【表６】
【００２５】製剤例 本発明によるポリペプチド (KVKLLLKVK-NH2、配列番号
2) を 50mg 宛含有するようにバイアルに無菌的に分配
し、凍結乾燥により水分を除去して密封する。この製剤
は用時は注射用生理食塩水に溶解せしめられる。尚、本
発明によるポリペプチドの安定化剤としてアルギニン等
のアミノ酸類やクエン酸等の有機酸及びヒト血清アルブ
ミン等を用いることができる。
2) を 50mg 宛含有するようにバイアルに無菌的に分配
し、凍結乾燥により水分を除去して密封する。この製剤
は用時は注射用生理食塩水に溶解せしめられる。尚、本
発明によるポリペプチドの安定化剤としてアルギニン等
のアミノ酸類やクエン酸等の有機酸及びヒト血清アルブ
ミン等を用いることができる。
【００２６】
【発明の効果】本発明によるポリペプチドは、正常細胞
に対する毒性が極めて低く、幅広い抗菌活性を有してお
り、殊に真菌に対しても強い抗菌活性を示すので一般細
菌性感染症のみならず真菌症の治療剤の有効成分とし
て、更には食品及び飼料用の抗菌性添加剤として利用す
ることが可能である。尚、本発明によるポリペプチド
は、その構成アミノ酸の数が僅か 9 個であり且つ合成
上等において課題のあるアミノ酸を有していないので化
学合成法により比較的廉価に調製することができる。
に対する毒性が極めて低く、幅広い抗菌活性を有してお
り、殊に真菌に対しても強い抗菌活性を示すので一般細
菌性感染症のみならず真菌症の治療剤の有効成分とし
て、更には食品及び飼料用の抗菌性添加剤として利用す
ることが可能である。尚、本発明によるポリペプチド
は、その構成アミノ酸の数が僅か 9 個であり且つ合成
上等において課題のあるアミノ酸を有していないので化
学合成法により比較的廉価に調製することができる。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド Xaa1 : Val、Leu、Phe 又は Ile Xaa2 : Val 又は Leu R : OH 又は NH2 配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Val Lys Val Leu Leu Lys Val Lys NH2 1 5 配列番号：４ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：７ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：９ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１０ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１１ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１２ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１３ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１４ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１５ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１６ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１７ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１８ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１９ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２０ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２１ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２２ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２３ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２４ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
フロントページの続き (72)発明者 星野 正治 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 一般式 (I、配列番号 : 1) Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa2-Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-R (式中 Xaa1 は Val、Leu、Phe 又は Ile を意味し、Xaa
2 は Val 又は Leu を意味し、R は OH 又は NH2 を意
味する)にて示され且つ抗菌活性を有していることを特
徴とする、ポリペプチド又はその塩。 - 【請求項２】 請求項 1 に記載のポリペプチド又はそ
の塩を有効成分とする抗菌剤。 - 【請求項３】 請求項 1 に記載のポリペプチド又はそ
の塩を有効成分とする細菌性疾患治療剤。 - 【請求項４】 請求項 1 に記載のポリペプチド又はそ
の塩を有効成分とする抗真菌剤。 - 【請求項５】 請求項 1 に記載のポリペプチド又はそ
の塩を有効成分とする真菌性疾患治療剤。 - 【請求項６】 請求項 1 に記載のポリペプチド又はそ
の塩を有効成分とする、食品又は飼料用の抗菌性添加
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26872394A JP3547504B2 (ja) | 1994-11-01 | 1994-11-01 | 新規なポリペプチド及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26872394A JP3547504B2 (ja) | 1994-11-01 | 1994-11-01 | 新規なポリペプチド及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08134096A true JPH08134096A (ja) | 1996-05-28 |
| JP3547504B2 JP3547504B2 (ja) | 2004-07-28 |
Family
ID=17462457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26872394A Expired - Fee Related JP3547504B2 (ja) | 1994-11-01 | 1994-11-01 | 新規なポリペプチド及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3547504B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT410635B (de) * | 2000-10-18 | 2003-06-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Vakzin-zusammensetzung |
-
1994
- 1994-11-01 JP JP26872394A patent/JP3547504B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT410635B (de) * | 2000-10-18 | 2003-06-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Vakzin-zusammensetzung |
| US8361476B2 (en) | 2000-10-18 | 2013-01-29 | Intercell Ag | Vaccine composition comprising an antigen and a peptide having adjuvant properties |
| US8900564B2 (en) | 2000-10-18 | 2014-12-02 | Valneva Austria Gmbh | Vaccine composition comprising an antigen and a peptide having adjuvant properties |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3547504B2 (ja) | 2004-07-28 |
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