CH637111A5

CH637111A5 - Composes polypeptidiques a activite thymique ou antagoniste et leurs procedes de synthese.

Info

Publication number: CH637111A5
Application number: CH567478A
Authority: CH
Inventors: Jean-Francois Bach; Mireille Dardenne; Jean-Marie Pleau; Jean Hamburger; Evanghelos Bricas; Jean Martinez; Didier Blanot; Genevieve Auger
Original assignee: Anvar; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1977-05-25
Filing date: 1978-05-24
Publication date: 1983-07-15
Also published as: JPS5416425A; NL7805717A; IT7849520A0; GB1572889A; IT1156766B; CA1126261A; US4301065A; DE2822951A1

Description

La présente invention concerne des composés peptidiques dont la structure chimique est apparentée à celle de l'hormone possédant une activité thymique isolée à partir du sérum sanguin de porc, des procédés de préparation de ces nouveaux composés par voie de synthèse chimique et l'application de ces nouveaux composés en thérapeutique.

Il est bien établi que les lymphocytes T acquièrent leur immuno-compétence sous l'influence du thymus. Cette action différenciatrice du thymus a fait l'objet de nombreuses recherches depuis la découverte des effets immunosuppresseurs de la thymectomie néonatale. Des expériences montrant la restauration de la compétence immunitaire de souris thymectomisées à la naissance par des greffes de thymus placées dans des chambres de diffusion imperméables aux cellules ou par des extraits thymiques acellulaires ont suggéré que le thymus joue un rôle de glande endocrine et élabore une hormone introduite dans la circulation sanguine.

L'isolement et la caractérisation d'une hormone appelée facteur thymique sérique (FTS) présente dans le sérum de plusieurs espèces de mammifères, en particulier de porc, ont fait l'objet de publications récentes.

Il a été ainsi montré que le facteur thymique sérique est un nona-peptide caractérisé par la séquence d'acides aminés suivantes:

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (I)

Or, la synthèse chimique du facteur thymique sérique de la structure (I) ci-dessus vient d'être réalisée ainsi que celle d'une famille de composés peptidiques de structure apparentée, y compris celle d'une autre forme active du facteur thymique sérique correspondant à la structure suivante:

Gin—Ala—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (II) 40

Ces synthèses ont permis soit d'obtenir des polypeptides possédant une activité thymique égale ou supérieure à celle de l'hormone naturelle, mais ayant un effet plus prolongé par leur résistance à l'action des enzymes qui dégradent l'hormone thymique dans l'organisme, soit d'effectuer la transformation partielle de la structure chi- 45 mique de l'hormone naturelle conduisant à des composés manifestant éventuellement une action antagoniste ou inhibitrice vis-à-vis de l'hormone thymique.

Etant donné que l'action de l'hormone thymique permet le développement de réactions de défense immunitaire conduisant au rejet des greffes, une action antagoniste ou inhibitrice exercée par de tels composés peut éventuellement jouer un rôle important dans la prévention d'un rejet des greffes.

L'invention concerne les composés polypeptidiques répondant à la séquence (I), caractérisés à la revendication 1.

L'invention concerne également des procédés de synthèse de ces composés polypeptidiques, caractérisés aux revendications 10 et 11.

Les acides aminés de remplacement pour les acides aminés modifiés sont: Ala, Cyano—Ala, Asn, Thio—Asn, Asp, D—Lys, Orn, Lys(N6-acétyl), Glu, D—Gin, Glu(y-cyano), Glu(y—CS—NH2), les radicaux 2-aminohexanoyle, 2,6-diaminohexynoyle et 2,6-diamino-hexenoyle, D—Ser, N-méthyl—Ser, Thr, Sar, <Aad,

ß—Ala—NH2, Asn—NH2, Arg, Cys(S-CONH2), Har, Hep, Leu, Met(O), Nva et Pro.

Les groupes de protection temporaire ou de groupements d'acti-vation des carboxyles des acides aminés sont: Z, BOC, Mbh, But,

OBut, OTcp, ONp, OSu, Ac, Nps et OPcp dont les abréviations sont explicitées plus loin.

Pour les acides aminés:

PyroGlu = acide-L-pyroglutamique,

Ala = L-alanine,

D—Ala = D-alanine,

Lys = L-lysine,

Ser = L-serine,

Gin = L-glutamine,

Asn = L-asparagine,

Asp = acide L-aspartique,

Glu = acide L-glutamique,

Orn = L-ornithine,

Thr = L-thréonine,

Sar = L-sarcosine,

<Aad = acide L-pyro-2 aminoadipique, acide homo-

pyroglutamique,

ß—Ala—NH2 = amide de la ß-alanine,

Asn—NH2 = 1,4-diamide de l'acide L-aspartique,

Arg = L-arginine,

Cys(S—CONH2) = S-carbamoyl-L-cystéine,

Har = L-homoargine,

Hep = L-heptyline, acide L-2-aminoheptanoïque,

Leu = L-leucine,

Met(O) = L-méthioninesulfoxyde,

Nva = L-norvaline,

Pro = L-proline.

Pour les groupements de protection temporaire des fonctions rèacti-

50

ves:

Z =

benzyloxycarbonyle,

BOC =

terbutyloxycarbonyle,

MbH =

4,4'-diméthoxybenzhydryle,

But =

terbutyle,

OMe =

méthylester,

OBut =

terbutylester,

OTcp =

2,4,5-trichlorophénylester,

ONp =

4-nitrophénylester,

OSu =

N-hydroxysuccinimide-ester,

Ac =

acétyle,

Nps =

2-nitrophénylsulfényle,

OPcp =

pentachlorophénylester.

Réactifs et solvants:

NMM =

N-méthylmorpholine,

DCHA =

dicyclohexylamine,

DMF =

diméthylformamide,

THF =

tétrahydrofuranne,

AcOEt acétate d'éthyle,

MeOH =

méthanol,

ButOH =

n-butanol.

Les peptides contenant de 6 à 8 résidus d'acides aminés (hexa-, hepta- ou octapeptides), dont la séquence en acides aminés correspond à la séquence C-terminale ou N-terminale de l'hormone Polypeptide naturelle de structure (I), synthétisés selon l'invention, sont les suivants :

l'hexapeptide: Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (36)

l'heptapeptide: Lys —Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (37)

637 111

4

les octapeptides : Ala — Lys—Ser—Gin — Gly—Gly—

Ser—Asn (38)

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly— Gly-Ser (42)

A titre d'exemples de peptides qui ont été synthétisés en modifiant partiellement la structure de l'hormone polypeptidique naturelle par remplacement d'un ou de deux acides aminés de configuration L soit par son antipode optique de configuration D, soit par un autre acide aminé de structure plus ou moins analogue, soit par le même acide aminé protégé par un groupe de protection temporaire dans la fonction de sa chaîne latérale, on peut citer les suivants, dans lesquels l'acide aminé modifié est en caractères italiques :

PyroGlu—D—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (47)

D—Ala—Lys — Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (45)

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asp (53)

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ala—Asn (59)

PyroGlu—Ala—Lys—A la—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (60)

Z — Gin—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (34)

PyroGlu—Ala—D—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly — Ser—Asn (61 )

PyroGlu—Ala—Lvs(N6-acétyl) —Ser—Gin—Gly—Ser—Asn (62)

PyroGlu—Ala—Orn—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (63) PyroGlu—Ala—Lys — ( N-méthyl) Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (64)

PyroGlu—Ala—Lys—Ala—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (65)

PyroGlu—Ala—Lys—D — Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (66)

PyroGlu—Ala—Lys — Thr—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (67)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Glu—Gly—Gly—Ser—Asn (68) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Glu( y-cyano ) — Gly—Gly—

Ser—Asn (69) PyroGlu - Ala - Lys - Ser -Glu(y- CS-NH2) - Gly - Gly -

Ser—Asn (70)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—D—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (71 )

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin — Ala—Gly — Ser—Asn (72)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Ala—Ser—Asn (73)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Ala—Ala—Ser—Asn (74)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin — Sar—Sar—Ser—Asn (75) PyroGlu—Ala— f 2-aminohexanoylj — Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (76) PyroGlu—Ala — ( 2,6-diaminohexynoylJ — Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (77) PyroGlu—Ala — ( 2,6-diaminohexenoylJ — Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (78)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Gin (79) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Cyano Ala (80)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser -Thio—Asn (81)

Lys( N6-acétvl) — Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (82)

D—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (83)

Orn—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (84)

A'—a—Z—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (85) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—

ß—AIa—NH2 (86)

Hep—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (87)

Lys—Ser—Gin—D—A la—Gly—Ser—Asn (88)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—D—A la—Gly—Ser—Asn (89)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—D—Asn (90)

PyroGlu—Ala—Hep—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (91)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—D—Leu—Gly—Ser—Asn (92) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn—NH2 (93)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Thr—Asn (94)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—D—Ser—Asn (95)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Asn—Gly—Gly—Ser—Asn (96) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Nva—Gly—Gly—Ser—Asn - (97) PyroGlu - Ala—Lys—Ser - Cys(S— CONH2) - Gly - Gly -

Ser—Asn (98)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Met(O) —Gly—Gly—Ser—Asn (99)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser- Gin—Gly-Z>—,4/a—Ser—Asn (100)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Sar—Ser—Asn (101)

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—D—Leu—Ser—Asn (102) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin — Gly—Gly—Gly—Ser—Asn ( 103) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin — Gly—Ser—Asn ( 104)

Z—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Ser—Asn (105)

D—PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (106) D—Gin—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn ( 107)

Cys(S- CONHJ - Ala - Lys - Ser - Gin - Gly - Gly -

Ser—Asn (108)

Pro—Ala— Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (109)

<Aad— Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (110)

PyroGlu—Ala—Arg—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (111) PyroGlu—Ala—Har—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (112) PyroGlu—Ala—Lys ( N('-acétyl) —Ser—Gin—D—Ala—Gly—

Ser—Asn (113)

PyroGlu—Ala—D—Lys ( N6-acétyl )— Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (114)

PyroGlu—Ala—Lys ( N6-acétyl) —Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—

D-Asn (115)

Ac—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (116)

Les composés (103) et (104) répondent à la définition générale avec la condition supplémentaire relative à la modification des acides aminés, selon laquelle on peut soit ajouter un acide aminé à la séquence, soit retirer un acide aminé de la séquence.

SYNTHÈSE DU FACTEUR THYMIQUE (FTS) ET DE SES DÉRIVÉS

La synthèse des deux formes du FTS : PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (I)

Gin—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (II)

est effectuée selon l'invention par des voies différentes.

Dans une première voie, on utilise un dérivé de la glutamine protégée sur sa fonction y-amide par le groupe 4,4'-diméthoxybenzy-hydryle (Mbh), alors que, dans une seconde voie, la synthèse est effectuée sans la protection du groupement y-amide des résidus glutamine.

Dans la première et la seconde voie, le dipeptide C-terminal protégé est couplé respectivement au tétrapeptide Ser—Gin— Gly—Gly protégé et à l'hexapeptide Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly protégé.

Ainsi, la préparation des polypeptides de séquence X—Gin— Gly—Gly—Y, où Y représente —Ser—Asn, et X représente Ser— ou Ala—Lys — Ser — est effectuée par couplage du dipeptide Ser—Asn protégé avec le peptide X—Gin—Gly—Gly protégé et par élimination éventuelle subséquente des groupements protecteurs.

Dans la seconde voie, on obtient ainsi l'octapeptide Ala—Lys— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn alors que, dans la première voie, ce même octapeptide est préparé à partir de l'hexapeptide Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn en passant par l'heptapeptide Lys— Ser — Gin—Gly—Gly—Ser—Asn.

L'octapeptide Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn permet alors de préparer les deux formes du FTS par couplage du premier résidu PyroGlu ou Gin.

Le procédé utilisé pour le couplage du résidu PyroGlu sur la séquence Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Y est le même pour les différentes significations possibles de Y, à savoir — Ser, et —Ser—Asn, et les significations possibles qui en dérivent par modification d'un acide aminé, par exemple pour — Ser—Asp, —Ala—Asn.

Ce couplage est réalisé de façon avantageuse au moyen du dérivé PyroGlu—OTcp sur la séquence Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Y, dans laquelle certains acides aminés sont éventuellement protégés dans leur fonction de la chaîne latérale.

Description des étapes de la synthèse du FTS par la première voie Aj) Synthèse du dipeptide C-terminal protégé: Z—Ser(But)—Asn— OBut (1), par couplage du Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka, Buchs sous forme de sel de DCHA) et du Asn—OBut (préparé selon

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E. Schnabel et H. Schüssler, «Liebigs Ann. Chem.», 1965, 686, p. 229), transformé par la suite en acétate de Ser(But) —Asn—OBut (2) par élimination sélective du groupement de protection temporaire.

B, ) Synthèse du dipeptide Z—Gly—Gly—OMe (3), transformé par la suite en acétate de Gly—Gly—OMe (4) par élimination du groupement Z.

C, ; Synthèse du dérivé tripeptidique: Z—Gln(Mbh)—Gly—Gly— OMe (5) par couplage du dérivé Z—Gln(Mbh) (obtenu selon W.Köning et R. Geiger, «Chem. Ber.», 1970,103 p. 2041) avec le dérivé Gly—Gly—OMe (4) précédemment obtenu, et transformation du dérivé tripeptidique (5) en son acétate (6).

D, ) Synthèse du dérivé tétrapeptidique: Z — Ser(But) — Gln(Mbh) — Gly—Gly—OMe (7) par couplage du dérivé Z—Ser(But) (obtenu sous forme de Z—Ser(But) —DCHA chez Fluka, Buchs), avec le dérivé tripeptidique (6).

Ex) Préparation du dérivé: Z—Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly— OH (8) par saponification du dérivé (7).

Fj ) Synthèse du dérivé hexapeptidique : Z—Ser(But)—Gln(Mbh)— Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (9) par couplage du dérivé dipep-tidique C-terminal (2) et du dérivé tétrapeptidique (8). Transformation du dérivé hexapeptidique (9) en son acétate (10) par élimination sélective du groupement Z.

G, ) Synthèse du dérivé heptapeptidique: Z—Lys(BOC)— Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (11) par couplage du dérivé Z—Lys(BOC) (obtenu sous forme de Z—Lys(BOC—DCHA, chez Fluka, Buchs), et du dérivé hexapeptidique (10). Transformation du dérivé heptapeptidique (11) en son acétate (12) par élimination sélective du groupement Z.

//, ) Synthèse du dérivé octapeptidique: Z — Ala — Lys(BOC) — -Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut ( 13) par couplage du dérivé Z—Ala et du dérivé heptapeptidique (12). Transformation du dérivé octapeptidique (13) en son acétate (14) par élimination du groupe Z.

ï\ ) Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala—

Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - Ser(But) - Asn— OBut (15) par couplage du dérivé PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson, M.A. Barton, D.M. Hardy, G.W. Kenner,

J. Preston et R.C. Sheppard, «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108), et du dérivé octapeptidique (14).

7, ) Obtention du nonapeptide libre : PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (16) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape. Le nonapeptide libre ainsi obtenu correspond à la structure (I) du FTS.

Kt J Synthèse du dérivé nonapeptidique : Z—Gln(Mbh)—Ala— Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - Ser(But) - Asn— OBut (17) par couplage du dérivé Z—Gln(Mbh) (obtenu selon W. Köning et R. Geiger, «Chem. Ber.», 1970, p. 2041), et celui du dérivé octapeptidique (14) précédemment obtenu (voir paragraphe Ht).

Lx) Obtention du nonapeptide libre: Gin—Ala—Lys—Ser—Gin— Gly—Gly—Ser—Asn (18) par élimination, en premier de tous les groupements de protection temporaire des fonctions de la chaîne latérale des acides aminés et celui du carboxyle C-terminal, puis du groupement Z de la fonction amine N-terminale. Le nonapeptide libre (18) correspond à la structure (II) du FTS.

Description des étapes de la synthèse du FTS par la seconde voie

A2) Synthèse du dérivé tripeptidique : BOC—Gin—Gly—Gly—OMe

(19) par couplage du dérivé BOC—Gin—ONp (obtenu chez Serva,

Heidelberg) et du dérivé Gly—Gly—OMe (4) précédemment obtenu

(voir paragraphe Bt). Transformation du dérivé (19) en son tri-

fluoroacétate (20) par élimination du groupe BOC.

B2) Synthèse du dérivé tétrapeptidique: Z—Ser(But)—Gin—Gly—

Gly—OMe (21) par couplage du dérivé Z—Ser(But) et du dérivé (20) Gin—Gly—Gly—OMe. Transformation du dérivé tétrapeptidique (21) en son acétate (22) par élimination du groupe Z.

C2) Synthèse du dérivé pentapeptidique: Z —Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—Gly—Gly—OMe (23) par couplage du dérivé Z—Lys(BOC) et du dérivé tétrapeptidique (22). Transformation du dérivé (23) en son acétate (24).

D2 ) Synthèse du dérivé hexapeptidique : Z—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gin—Gly—Gly—OMe (25) par couplage du dérivé Z—Ala et du dérivé pentapeptidique (24).

E2 ) Préparation du dérivé : Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But)—Gin — Gly—Gly—NHNH2 (26) par hydrazinolyse de l'ester méthylique du dérivé précédent (25).

F2) Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (27) par couplage de l'azide Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—Gly—Gly— N3, obtenu à partir du dérivé (26) et du dérivé Ser(But)—Asn — OBut (2) (voir paragraphe A,). Transformation du dérivé octapeptidique (27) en son acétate (28) par élimination du groupement Z.

G2) Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala —

Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut

(29) par couplage du dérivé PyroGlu — OTcp (préparé selon J.C. Andersen, M.A. Barton, O.M. Hardy, G.W. Kenner,

J. Preston et R.C. Sheppard, «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108), et du dérivé octapeptidique (28).

H2) Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (30) par élimination en une seule étape des groupements de protection temporaire. Le nonapeptide libre

(30) ainsi obtenu est identique au nonapeptide (16) précédemment obtenu selon la première voie (voir paragraphe JJ et correspond à la structure (I) du FTS.

I2) Synthèse du dérivé nonapeptidique: BOC—Gin—Ala— Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut

(31) par couplage du dérivé BOC—Gin—ONp (obtenu chez Serva, Heidelberg) et du dérivé octapeptidique (27) (voir paragraphe F2).

J2) Obtention du nonapeptide libre: Gin—Ala—Lys—Ser—Gin — Gly—Gly—Ser—Asn (32) par élimination en une seule étape des groupements de protection temporaire. Le nonapeptide ainsi obtenu est identique au nonapeptide (18) préparé précédemment selon la première voie (voir paragraphe LJ et correspond à la structure (II) du FTS.

K2) Synthèse du dérivé nonapeptidique: Z—Gin —Ala —

Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (33) par couplage du dérivé Z—Gin—OSu (préparé selon J. Beacham, J. Dupuis, G. Finn, F.M. Storey, H.T. Yanaihara, C. Yanaihara et K. Hofmann, «J. Amer. Chem. Soc.», 1971, 93, p. 5526) et du dérivé octapeptidique (28) (voir paragraphe F2).

L2) Obtention du dérivé nonapeptidique: Z—Gin—Ala—Lys— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (34) par élimination des groupements de protection temporaire des fonctions de la chaîne latérale des acides aminés et celui du carboxyle C-terminal du dérivé (33).

M2) Obtention du nonapeptide libre: Gin —Ala—Lys—Ser—Gin — Gly—Gly—Ser—Asn (35) par élimination de tous les groupements de protection temporaire du dérivé nonapeptidique (33). Ce nonapeptide est identique au nonapeptide (18) obtenu par la première voie (voir paragraphe Lj).

Description des étapes de la synthèse des fragments peptidiques du FTS et des analogues de structures de ce facteur

A3) Obtention de l'hexapeptide libre: Ser—Gin—Gly—Gly—Ser— Asn (36) par élimination des groupements de protection temporaire du dérivé hexapeptidique Z—Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly— Ser(But)—Asn—OBut (9) synthétisé selon la première voie (voir paragraphe F,).

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Bì) Obtention de l'heptapeptide libre: Lys—Ser—Gin—Gly—Gly— Ser—Asn (37) par élimination des groupements de protection temporaire du dérivé heptapeptidique Z—Lys(BOC)—Ser(But)— Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (11) synthétisé selon la première voie (voir paragraphe G,).

C3) Obtention de l'octapeptide libre: Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn (38) par élimination des groupements de protection temporaire des dérivés octapeptidiques correspondants (13) et (27) synthétisés respectivement selon la première voie et la deuxième voie (voir paragraphes H] et F2). Ce même octapeptide libre a été obtenu par l'action de l'enzyme pyroglutamylaminopeptidase (obtenu chez Boehringer, Mannheim) sur le nonapeptide synthétique PyroGlu— Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn et séparation des produits d'hydrolyse enzymatique par rhéophorèse préparative sur papier.

D3) Synthèse du dérivé heptapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But) —OBut (39) par couplage du dérivé azide de l'hexapeptide Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But) — Gin—Gly—Gly—NHNHj (26) obtenu selon la deuxième voie (voir paragraphe E2) et du dérivé: Ser(But)—OBut (préparé selon E. Schroeder, «Liebigs. Ann. Chem.», 1963,127, p. 670). Transformation du dérivé heptapeptidique (39) en son acétate (40) par élimination du groupe Z.

E3) Synthèse du dérivé octapeptidique: PyroGlu—Ala— Lys(BOC)—Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—OBut (41) par couplage du PyroGlu—OTcp (voir paragraphe Ii), et du dérivé heptapeptidique (40).

F3) Obtention de l'octapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser (42) par élimination des groupements de protection temporaire du dérivé octapeptidique (41).

G3) Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—D—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (43) par couplage du dérivé Z—D—Ala (préparé selon M. Bergmann et L. Zervas, «Ber.», 1932, 65, p. 1192) et du dérivé heptapeptidique Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - Ser(But) - Asn -OBut (12) préparé selon la première voie (voir paragraphe Gj). ■Transformation du dérivé octapeptidique (43) en son acétate (44) par élimination du groupe Z.

H3) Obtention de l'octapeptide libre: D—Ala—Lys—Ser—Gin— Gly—Gly—Ser—Asn (45) par élimination des groupes de protection temporaire du dérivé octapeptidique (43).

I3j Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—D—Ala— Lys(BOC)—Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn— OBut (46) par couplage du dérivé PyroGlu—OTcp (voir paragraphe Ij) et du dérivé octapeptidique D—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (43) obtenu précédemment.

J3) Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—D—Ala—Lys— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (47) par élimination des groupements de protection temporaire.

K3) Synthèse du dérivé dipeptidique: Z—Ser(But)—Asp—(OBut)— OBut (46) obtenu par couplage du Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka, Buchs) et du Asp—di(OBut) (obtenu chez Fluka sous forme de sel de dibenzolsulfimide). Transformation du dérivé dipeptidique (48) en son acétate (49) par élimination du groupe Z.

L3) Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asp—di(OBut) (50) obtenu par couplage de l'azide de l'hexapeptide hydrazide (26) (voir paragraphe E2), et du dérivé dipeptidique (49) obtenu précédemment. Transformation du dérivé octapeptidique (50) en son acétate (51) par élimination du groupe Z.

M3 ; Synthèse du dérivé nonapeptidique : PyroGlu—Ala— Lys(BOC)—Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asp—di(OBut)

(52), obtenu par couplage du dérivé PyroGlu—OTcp (voir paragraphe I,) et du dérivé octapeptidique (51) préparé précédemment.

N3) Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asp (53) par élimination des groupements de protection temporaire.

03) Synthèse du dérivé dipeptidique: Z—Ala—Asn—OBut (54) par couplage du dérivé Z—Ala (préparé selon M. Bergmann et L. Zervas, «Ber.», 1932,65, p. 1192), et du dérivé Asn—OBut (voir paragraphe Ai). Transformation du dérivé dipeptidique (54) en son acétate (55) par élimination du groupe Z.

P3) Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ala—Asn—OBut (56) par couplage de l'azide du dérivé hexapeptidique Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But) — Gin—Gly—Gly—NHNH2 (26) (voir paragraphe E2) et du dérivé dipeptidique (55) préparé précédemment. Transformation du dérivé octapeptidique (56) en son acétate (57) par élimination du groupe Z.

Q3 ) Synthèse du dérivé nonapeptidique : PyroGlu—Ala—

Lys(BOC) - Ser(But) - Gin - Gly - Gly- Ala - Asn - OBut (58) obtenu par couplage du dérivé PyroGlu—OTcp (voir paragraphe I,) et du dérivé (57) préparé précédemment.

R3) Obtention du nonapeptide libre : PyroGlu—Ala—Lys—Gin— Gly—Gly—Ala—Asn (59) par élimination des groupements de protection temporaire du dérivé nonapeptidique (58).

La synthèse des composés peptidiques de l'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre purement il-lustratif et nullement limitatif des moyens de mise en œuvre de l'invention.

Dans ces exemples, l'abréviation CCM désigne la Chromatographie sur couche mince et les abréviations utilisées pour les mélanges de solvants sont les suivantes:

A : acétate d'éthy le/méthanol 5:1 (v/v)

B: acétonitrile/benzéne 1:1 (v/v)

C : n-butanol/acide acétique/eau 3:1:1 (v/v/v)

D: n-butanol/pyridine/acide acétique/eau 60:40:12:48 (v/v/v)

E: n-butanol saturé d'eau

F: chloroforme/méthanol 10:1 (v/v)

G: méthanol/chloroforme/NH4OH concentré 2:2:1 (v/v/v)

M : acétate d'ammonium N/éthanol 3:7 (v/v)

I : chloroforme/méthanol 3:1 (v/v)

J : acétate d'éthyle/méthanol 2:1 (v/v)

Exemple 1:

Préparation du nonapeptide PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn

Etape a Préparation de l'acétate de Gly—Gly—OMe (4)

A 20,92 g de Z—Gly—OH, produit commercial vendu par la société Fluka en solution dans 50 ml de DMF, on ajoute 14 ml de triéthylamine en refroidissant à — 20° C et, par la suite, 9,54 ml de chlorocarbonate d'éthyle, vendu par la société Fluka. Après agitation 5 min à — 20° C, on ajoute 12,56 g de chlorhydrate de glycine-méthylester (vendu par Fluka) dissous dans 250 ml de DMF, puis 14 ml de triéthylamine. On laisse le mélange sous agitation pendant une nuit à température ambiante. On filtre la partie insoluble et on évapore le solvant sous le vide de la pompe à palettes. On extrait le résidu par 100 ml d'acétate d'éthyle et on lave la solution successivement par 20 ml de solution N de KHS04, par 20 ml d'eau, par 20 ml de solution de KHC03 et par 2 x 20 ml d'eau. Après séchage sur MgS04, on évapore le solvant sous vide de la trompe à eau. On cristallise le produit obtenu dans le mélange AcOEt/éther de pétrole entre chaud et froid.

On obtient ainsi 22,4 g de Z—Gly—Gly—OMe (3) (Rdt 80%). F = 67-68°C. Par Chromatographie sur couche mince de gel de silice dans le mélange de solvants J, le produit est homogène, et il est utilisé directement pour l'étape suivante.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

637 111

A 8,9 g du Z—Gly—Gly—OMe (3) ainsi obtenu, en solution dans 400 ml de méthanol contenant 8 ml d'acide acétique, 8 ml d'eau et 0,9 g de Pd/C à 5%, on passe un courant d'hydrogène pendant 4 h. On filtre sur célite et verre fritté le catalyseur et on évapore les solvants sous le vide de la trompe à eau. On reprend le résidu alternativement par du benzène et du méthanol et à la fin par de l'éther. Par trituration du résidu dans l'éther après évaporation des solvants, le produit se solidifie. Par recristallisation dans le mélange méthanol/éther, on obtient 5,6 g d'acétate de Gly —Gly— OMe (4) sous forme d'aiguilles (Rdt 85%). F = 95-98' C. Par Chromatographie sur couche mince de gel de silice dans le mélange de solvants C, le produit est homogène.

Etape b Préparation de l'acétate de Gin ( Mbh )—Gly—Gly — OMe

(6)

A 7,4 g de Z—Gln(Mbh) (préparé selon le procédé décrit par W. Köning et R. Geiger, «Chem. Ber.», 1970,103,2041) en solution dans 100 ml de DMF refroidi à —20' C, on ajoute 1,7 ml de NMM et 1,4 ml de chlorocarbonate d'éthyle (vendu par la société Fluka). Après 5 min, on ajoute 3,29 g d'acétate de Gly—Gly—OMe (4) dissous dans 100 ml de DMF contenant 2 ml de NMM. Après V2 h à froid, on laisse revenir à la température ambiante pendant une nuit. On évapore le solvant sous le vide de la pompe à palettes jusqu'à 50 ml et on filtre. En ajoutant lentement de l'eau dans le filtrat et en agitant, on obtient la précipitation du tripeptide Z—Gln(Mbh)— Gly—Gly—OMe (5) sous forme de poudre blanche. On filtre et on lave le précipité par 2 x 100 ml de solution N de KHCO3, par 2 x 100 ml d'eau, par 2 x 100 ml de KHSO4, par 2 x 100 ml d'eau, puis par 2 x 100 ml d'acétate d'éthyle et par de l'éther. Après séchage au dessiccateur, on obtient 8,6 g de Z—Gln(Mbh)—Gly—Gly— OMe (5) (Rdt 90%). Très peu de produit est dissous dans l'AcOEt. Recristallisation dans le mélange DM F/H 20, F = 189-191 C,

faJD = + 1,85° (C = 1, DMF). Produit homogène en Chromatographie sur couche mince de gel de silice dans les mélanges A et B. Le produit est utilisé directement pour l'étape suivante.

A 8,3 g du Z—Gln(Mbh)—Gly—Gly—OMe (5) ainsi obtenu, en solution dans 500 ml de méthanol chaud contenant 5 ml de CH3COOH, 5 ml d'eau et 1 g de Pd/C à 5%, on passe un courant d'hydrogène jusqu'à ce que l'on n'ait plus de produit de départ (révélé par Chromatographie sur couche mince), ce qui demande environ 6 h d'hydrogénolyse. On filtre sur célite et verre fritté le catalyseur et on rince par MeOH. On évapore le filtrat sous le vide de la trompe à eau et on reprend plusieurs fois par MeOH que l'on évapore par la suite. Lorsque le produit est bien sec, on le fait dissoudre dans 50 ml de méthanol et on le précipite par l'éther. On obtient l'acétate de Gln(Mbh)—Gly—Gly—OMe (6) avec un rendement de 90% sous la forme de poudre blanche. Le produit est utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape c Préparation du Z—Ser (But) — Gin (Mbh) — Gly—Gly— OH( 8)

A 2,95 g de Z—Ser(But) (produit vendu par la société Fluka), en solution dans 100 ml de DMF contenant 1,1 ml de NMM et 1 ml de chlorocarbonate d'éthyle (vendu par la société Fluka), on ajoute, après refroidissement, 5,6 g d'acétate de Gln(Mbh)—Gly—Gly— OMe (6) en solution dans 50 ml de DMF contenant 1,2 ml de NMM.

La suite des opérations est identique à celle employée précédemment pour isoler le tripeptide Z—Gln(Mbh)—Gly—Gly—OMe.

On obtient 6,5 g de Z-Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-OMe

(7) (Rdt 85%). F = 199-202°C, déc. [a]D = + 3,2° (C = 1, DMF). Le produit est homogène par Chromatographie, dans les mélanges A et B, et il est utilisé directement pour l'étape suivante.

A 5 g de Z—Ser(But)—Gln(Mbh) — Gly—Gly—OMe (8) ainsi obtenu, en solution dans 350 ml de MeOH à 90% agitée vigoureusement, on ajoute 10 ml de solution N de NaOH. La solution trouble s'éclaircit graduellement. La saponification est terminée après 2 h. On ajoute 1000 ml d'eau et on acidifie par CH3COOH. On obtient un précipité solvaté après avoir laissé 2 h à froid. On filtre le précipité et on le rince à l'eau. On met en suspension le produit dans 300 ml d'AcOEt et on filtre. On rince plusieurs fois à l'éther, on obtient un premier précipité de 3,4 g de Z—Ser(But)—Gln(Mbh) — 5 Gly—Gly—OH (8). Après avoir concentré le filtrat, on obtient un second précipité de 0,8 g. Les deux fractions sont identiques. (Rdt 85%). Recristallisation dans le mélange MeOH/éther (produit solvaté). F = 170-172" C, [aJD = + 2,6 (C = 1, DMF). Produit homogène par Chromatographie dans les mélanges C et D.

10 Etape d Préparation du Z—Ser(But) — Gln(Mbh) —Gly—Gly— Ser(But) —Asn—OBut (9)

1. Préparation du fragment dipeptidique Ser( But) — Asn— OBut (2)

A 2,95 g de Z —Ser(But) commercial, vendu par la société Fluka,

I5 en solution dans 50 ml de THF et refroidi à —15 ou —20°C, on ajoute 1 ml de chlorocarbonate d'éthyle et 1,1 ml de NMM, vendus par la société Fluka. Après 15 min, on ajoute 2,6 g d'acétate de Asn—OBut (préparé selon le procédé décrit par E. Schnabel et H. Schüssler, «Liebigs. Ann. Chem.», 1965, 685, 229) en solution 20 dans 50 ml de THF contenant 2 ml de NMM. Après lA h à froid, on laisse 16 h à la température ambiante. On évapore le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous le vide de la trompe à eau. On extrait le résidu par 100 ml d'AcOEt et on lave la solution organique successivement par 20 ml de solution N de KHSO4, par 20 ml d'eau, 25 par 20 ml de solution N de KHCO3 et par 2 x 20 ml d'eau. Après séchage sur MgS04, on évapore le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous le vide de la trompe à eau. On obtient une huile incolore qui se solidifie par trituration avec de l'éther de pétrole.

On obtient ainsi 4,2 g de dipeptide protégé: Z—Ser(But) — 30 Asn—OBut (1). Après recristallisation dans le mélange AcOEt/éther de pétrole, les constantes physiques de ce produit sont: F = 117-119 C, [a]D = + 2,0 (C = 1, DMF). Par Chromatographie sur couche mince de gel de silice dans les mélanges des solvants A et B, ce produit est homogène. A 4 g du Z—Ser(But)—Asn—OBut, ainsi 35 obtenu, en solution dans 60 ml de MeOH, on ajoute 2 ml d'eau, 2 ml de CH3COOH et 0,4 g de Pd/C à 5%. On hydrogénolyse jusqu'à la disparition du produit initial (environ 4 h). On filtre et on concentre à l'évaporateur rotatif, on reprend plusieurs fois par du méthanol et on concentre jusqu'à l'obtention d'un produit sec. On dessèche au 40 dessiccateur. Rendement quantitatif de l'acétate de Ser(But) — Asn—OBut (2).

Par Chromatographie sur couche mince de gel de silice dans les mélanges des solvants C et E, le produit obtenu est homogène et il est utilisé directement pour la synthèse de l'hexapeptide Ser—Gin— 45 Gly—Gly—Ser—Asn.

2. Préparation du fragment hexapeptidique (9)

A 1,68 g du Z—Ser(But)—Gln(Mbh) — Gly—Gly—OH (8) préparé à l'étape c en solution dans 20 ml de DMF contenant 0,25 ml de NMM et 0,28 ml de chlorocarbonate d'isobutyle (vendu par 50 Fluka), on ajoute, après refroidissement pendant 5 min, 0,98 g d'acétate de Ser(But)—Asn—OBut (2) dont la préparation est décrite ci-dessus (étape d 1), en solution dans 10 ml de DMF contenant 0,5 ml de NMM.

Les opérations qui suivent sont identiques à celles décrites pour 55 la préparation du tripeptide Z—Gln(Mbh)—Gly—Gly—OMe (5). On obtient 2,07 g de Z—Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly— Ser(But)—Asn—OBut (9) (Rdt 87%). Recristallisation dans DMF/H20. F = 210-215 C, déc. [a]D = -3,2e (C = 0,75, DMF).

m Etape e Préparation de l'acétate de Ser(But) — Gin (Mbh) — Gly— Gly—Ser(But)—Asn — OBut ( 10)

A 1,74 g de l'hexapeptide ester (9) préparé à l'étape d, en solution dans 80 ml de MeOH chaud contenant 1 ml d'eau, 0,8 ml de CH3COOH et 0,25 g de Pd/C à 5%, on passe un courant d'hydro-65 gène jusqu'à ce que l'on n'ait plus de produit de départ. Par la suite, on opère comme pour le produit (6) (Rdt 90%). Produit homogène dans les solvants C et E, utilisé sans autre purification pour l'étape suivante.

637 111

Etape f Préparation de Z—Lys(BOC) — Ser(But) — Gln(Mbh) — Gly—Gly—Ser(But) —Asn—OBut (11)

A 0,6 g de Z — Lys(BOC)—DCHA, en solution dans 10 ml de DMF, on ajoute, après refroidissement à — 20°C, 0,165 ml de NMM et 0,185 ml de chlorocarbonate d'isobutyle. Par la suite, on ajoute 1,41 g de l'acétate de l'hexapeptide (10) préparé à l'étape e en solution dans 10 ml de DMF contenant 0,20 ml de NMM et on opère comme précédemment pour le tripeptide (5) (Rendement 90%). Recristallisation dans le mélange MeOH/éther. Produit homogène dans les mélanges C, E et F. F = 208-211JC, déc. [a]D = -3,2 (C = 0,75, DMF).

Etape g Préparation de l'acétate de Lys( BOC)—Ser( But) — Gln(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But) -Asn-OBut (12)

A 1,21 g de l'heptapeptide ester (11) préparé à l'étape f en solution dans 30 ml de MeOH contenant 0,3 ml d'eau, 0,3 ml de CH3COOH et 0,1 g de Pd/C à 5%, on passe un courant d'hydrogène et on procède comme précédemment pour le produit (6). On obtient 1,05 g (Rdt 90%) de produit sous forme de poudre blanche, qui est utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape h Préparation du Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But) — Gin ( Mbh ) — Gly—Gly—Ser (But)—Asn—OBut (l'i)

A 0,2 g de Z—Ala (de provenance Fluka) en solution dans 10 ml de DMF, contenant 0,10 ml de NMM et 0,117 ml de chlorocarbonate d'isobutyle, on ajoute 1,16 g de l'acétate de l'heptapeptide (12) préparé à l'étape g en solution dans 10 ml de DMF contenant 0,200 ml de NMM et on opère de la même manière que pour le dérivé (5). Par recristallisation dans le mélange DMF/H20, on obtient 0,961 g de produit homogène dans les mélanges des solvants C, E et F. F = 210-215 C, déc. [a]D = -5,4° (C = 0,5, DMF).

Etape i Préparation de l'acétate d'Ala—Lys(BOC)—Ser(But) — Gln( Mbh) — Gly—Gly—Serf But ) — Asn—OBut ( 14)

On obtient ce dérivé avec un rendement de 90% en opérant comme précédemment pour le produit (6). Le produit obtenu, homogène dans les mélanges des solvants C et E, est utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape j Préparation du PyroGlu—Ala—Lys( BOC)-Ser(But) — Gin(Mbh) — Gly—Gly—Ser(But) — Asn —OBut (15)

A 0,162 g de PyroGlu—OTcp (préparé selon le procédé décrit par J.C Anderson, M. A. Barton, D.M. Hardy, G.W. Kenner, J. Preston et R.C. Sheppard, «J. Chem. Soc. série C.», 1967, p. 108), en solution dans 10 ml de DMF et après refroidissement à 0°C, on ajoute 0,650 g d'acétate d'octapeptide ester (14), préparé à l'étape i, en solution dans 10 ml de DMF contenant 0,11 ml de NMM. Après

1 h au bain de glace, on laisse pendant 20 h à la température ambiante. On évapore le solvant sous le vide de la pompe à palettes jusqu'à la moitié de son volume et on précipite le produit en ajoutant lentement de l'eau. Après filtration du précipité, on le lave par 20 ml d'eau, puis par 20 ml d'acétate d'éthyle et par 4 x 20 ml d'éther.

On obtient le produit sous forme de poudre blanche avec un rendement de 70%. Recristallisation dans un mélange DMF/H20. F = 224-228°C, déc. [a]D = -4,8° (C = 1,45, DMF). Produit homogène dans les mélanges C, D et E, utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape k Obtention du nonapeptide libre PyroGlu—Ala—Lys— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser— Asn (16)

0,10 g de l'octapeptide ester protégé (14) est dissous dans 5 ml d'un mélange de l'acide trifluoroacétique/anisole (10:1 v/v). Après 3 h, on concentre au dessiccateur et à la température ambiante en . présence de P2Os et de KOH. On reprend le résidu par 30 ml d'eau et on extrait la solution aqueuse par 10 ml d'AcOEt puis par

2 x 10 ml d'éther. On obtient le produit par lyophilisation de la phase aqueuse, avec un rendement de 80 à 90%. Le produit obtenu est homogène dans les mélanges G et H. Après 1 h de migration par

électrorhéophorèse dans un tampon de pH 2,3 (acide formique 0,1 M) sur papier-filtre Whatman N° 3 MM et sous tension de 1000 V (15-30 m A), on révèle une seule tache positive à la nin-hydrineà —3,2 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide: Asp 1,07 ; Ser 1,95; Glu 2; Gly 2; Ala 0,92.

Exemple 2:

Préparation du nonapeptide: Gin—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn (18)

Etape a Préparation du Z— Gln(Mbh) —Ala—Lys(BOC) — Ser( But) — Gin ( Mbh ) — Gly — Gly—Serf But) — Asn— OBut (17)

A 0,121 g du Z—Gln(Mbh) (préparé selon le procédé décrit par W. Köning et R. Geiger, «Chem. Ber.», 1960,103, 2041) en solution dans 10 ml de DMF après refroidissement à — 20" C, on ajoute 0,027 ml de NMM et 0,031 ml de chlorocarbonate d'isobutyle. Par la suite, on ajoute à ce mélange 0,270 g de l'acétate d'octapeptide (14) préparé à l'étape i de l'exemple 1, en solution refroidie de 10 ml de DMF contenant 0,027 ml de NMM. Après 30 min à froid, on laisse 14 h à la température ambiante. On évapore le solvant jusqu'à environ 5 ml et on ajoute 50 ml d'eau, lentement, on obtient un précipité fin que l'on filtre et qu'on lave par 2 x 10 ml de solution N de KHCO3, par 2 x 10 ml d'eau, par 2 x 10 ml de solution N de KHSO4, par 2 x 10 ml d'eau, puis par 20 ml d'AcOEt et par de l'éther. On reprend le produit obtenu par du méthanol à chaud. Le produit qui reste insoluble est le nonapeptide-ester protégé. Après filtration et rinçage à l'éther, on obtient 0,200 g (Rdt 50%) du produit. F = 221-225°C, [aJD = -5,8° (C = 0,6, DMF). Homogène dans le mélange E.

Etape b Préparation du nonapeptide libre : Gin—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (18)

100 mg du nonapeptide ester protégé (17) préparé à l'étape a sont dissous dans 5 ml du mélange acide trifluoroacétique/anisole (10:1 v/v). Après 3 h, on concentre le mélange au dessiccateur sous vide en présence de P2Os et de KOH. On reprend le résidu par 20 ml d'eau et on lave la solution aqueuse par 10 ml d'AcOEt et par 2 x 10 ml d'éther. On concentre la phase aqueuse jusqu'à environ 1 ml. La solution aqueuse du peptide Z—Gin—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn donne une tache unique dans les mélanges G et H et, par rhéophorèse dans les mêmes conditions que celles utilisées précédemment pour le produit (16) à l'étape k de l'exemple 1, on révèle à la ninhydrine une seule tache qui migre à —2,7 cm dans le tampon de pH 2,5.

On ajoute à cette solution 10 ml de MeOH, 0,1 ml d'acide acétique et 10 mg de Pd/C à 5% et on fait passer un courant d'hydrogène pendant 4 h. On filtre le catalyseur et on concentre sous le vide de la trompe à eau. On reprend le résidu par 20 ml d'eau et on lave la solution aqueuse par 2 x 10 ml d'éther. Le produit est obtenu par lyophilisation de la phase aqueuse. Il est homogène dans les mélanges G et H et, à la rhéophorèse dans les conditions décrites précédemment, donne une seule tache qui migre à —5,8 cm à pH 2,5.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 0,98; Ser 1,62; Glu 1,95; Gly 2,00; Ala 1,02.

Exemple 3:

Préparation de l'hexapeptide libre: Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn

Ce fragment peptidique correspondant à l'hexapeptide C-termi-nal du facteur thymique du sérum est obtenu à partir du dérivé Z—Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut, préparé à l'étape d de l'exemple 1, par élimination des groupements de protection temporaire dans des conditions décrites précédemment pour le peptide (16) à l'étape k de l'exemple 1. Le produit obtenu est homogène dans les mélanges G et H.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,02; Ser 1,75; Glu 1,0; Gly 2,00.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

637 111

Exemple 4:

Préparation de l'heptapeptide libre: Lys—Ser—Gin —Gly —Gly— Ser—Asn

Ce fragment peptidique correspond à l'heptapeptide C-terminal du facteur thymique du sérum. Il est obtenu à partir du dérivé Z— Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - Ser(But) - Asn— OBut (11) préparé à l'étape f de l'exemple 1, par élimination des groupements de protection temporaire dans les conditions décrites précédemment pour le peptide (16) à l'étape k de l'exemple 1. Le produit obtenu est homogène dans les solvants G et H et, par rhéophorèse dans les conditions décrites pour les produits ( 16) et ( 18), donne une seule tache qui migre à —6,25 cm à pH 2,5.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,04; Ser 1,73; Glu 1,03; Gly 2,00.

Exemple 5:

Préparation de l'octapeptide libre: Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn (38)

Ce fragment correspond à l'octapeptide C-terminal du facteur thymique du sérum. Il est obtenu comme les fragments précédents à partir du dérivé protégé correspondant (13) obtenu à l'étape h de l'exemple 1. Le produit ainsi obtenu est homogène dans les mélanges G et H et, par rhéophorèse, donne une unique tache qui migre à —4,65 cm à pH 2,5, dans les conditions précédemment décrites.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,0; Ser 0,94; Glu 1,02; Gly 2,00; Ala 0,96.

Ce même octapeptide libre peut être obtenu également par l'action de l'enzyme pyroglutamylaminopeptidase, d'origine commerciale, sur le nonapeptide synthétique PyroGlu—Ala—Lys— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn et séparation des produits de l'hydrolyse enzymatique par rhéophorèse préparative sur papier Whatman N° 3 MM.

Exemple 6:

Préparation de l'octapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser (42)

Ce fragment correspond à l'octapeptide N-terminal du FTS. Il est obtenu par synthèse en suivant les étapes suivantes:

Etape a Préparation du dérivé tripeptidique: BOC—Gin—Gly— Gly —OMe (19)

A 10,96 g de BOC—Gin—ONp commercial vendu par la société Serva, en solution dans 10 ml de DMF contenant 4,18 ml de triéthylamine, on ajoute 6,15 g d'acétate de Gly—Gly—OMe (4), préparé à l'étape a de l'exemple 1. Après agitation du mélange pendant une nuit à température ambiante, on évapore le DMF sous le vide de la pompe à palettes et on dissout le résidu dans 125 ml d'eau. On lave la solution aqueuse 4 fois par l'éther, puis on sature la solution au NaCl, puis on extrait le produit par 2,5 1 d'acétate d'éthyle au total. On évapore à sec la solution d'acétate d'éthyle et on sèche le résidu au dessiccateur sur H2S04. Après trituration du résidu à l'éther, on obtient 8,65 g (Rdt 78%) du BOC—Gin—Gly— Gly—OMe sous forme de poudre hygroscopique utilisée directement pour l'étape suivante. Le produit est homogène par CCM dans le mélange J (MeOH/AcOEt, 1:2).

Etape b Préparation du trifluoracétate de Gln — Glv—Gly—OMe (20)

On prépare le dérivé (20) à partir de 8,65 g du dérivé (19) préparé à l'étape a par l'action de 125 ml d'acide trifluoròacétique à 95% à la température ambiante pendant 15 min et évaporation sous vide de l'acide. Après trituration dans l'éther, le produit se solidifie. On recristallise dans le mélange méthanol/acétate d'éthyle. On obtient 7,25 g de produit (Rdt 81 %). Produit homogène par CCM dans le mélange C But0H/CH3C00H/H20 (3:1:1). F = 165-167 C, [a]D = + 13,8 (C = 1, MeOH).

Etape c Préparation du dérivé tétrapeptidique: Z—Ser(But) — Gin - Gly - Gly - OMe (21 )

12,57 g de Z—Ser(But)—DCHA (provenance Fluka) sont désalifiés selon le procédé de Spagenberg et al. (Hoppe Seyler, «Zts. Physiol. Chem.», 1971, 352, 655).

Au résidu obtenu dissous dans 100 ml de THF, on ajoute 3,7 ml de triéthylamine et, après refroidissement de la solution à — 15 C, on ajoute 2,3 ml de chlorocarbonate d'éthyle. Après 5 min, on ajoute 8,54 g de trifluoracétate de Gin—Gly— Gly—OMe (20) préparé à l'étape b et 3,1 ml de triéthylamine dissous préalablement dans un mélange de DMF et de THF.

On laisse sous agitation à la température ambiante. Après filtration du chlorhydrate de triéthylamine formé, on évapore sous le vide de la trompe à eau le THF, puis on ajoute à la solution qui reste 200 ml de KHC03 1M. Par extraction du mélange par 1 1 de chloroforme, on obtient une solution chloroformique que l'on lave par de l'eau saturée au NaCl, par KHS04 IN, puis par de l'eau jusqu'à la neutralité.

Après évaporation à sec de la solution chloroformique, on sèche le résidu au dessiccateur sur H2S04. Par cristallisation du résidu dans le mélange méthanol/éther, le produit est homogène par CCM dans le mélange MeOH/AcOEt 1:2. On obtient 9,1 g de produit (Rdt 75%). Après recristallisation dans le mélange DMF/éther, F = 163-167°C, [a]D = + 3,4 (C = 1,16, DMF).

Etape d Préparation de l'acétate de Ser(But) — Gln—Gly—Gly — OMe (22)

3,3 g de Z—Ser(But)—Gin—Gly—Gly—OMe (21) préparé à l'étape c en solution dans 150 ml de MeOH contenant 1,5 ml d'eau et 1,5 ml de CH3COOH sont hydrogénés en présence de Pd/C à 5% pendant 5 h. Par la suite, on opère comme il est décrit pour le produit (6) à l'étape b de l'exemple 1. Le produit bien sec est rincé plusieurs fois à l'éther (Rdt 2,8 g). Produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et E.

Etape e Préparation du dérivé: Z—Lys(BOC) —Ser(But) —Gin — Gly-Gly-OMe (23)

A une solution de 1,9 g de Z —Lys(BOC) dans 30 ml de DMF refroidie à —15 C, on ajoute 0,55 ml de NMM et 0,65 ml de chlorocarbonate d'isobutyle. Après 5 min, on ajoute une solution froide dans 30 ml de DMF contenant 2,4 g d'acétate de Ser(But) —Gin — Gly—Gly—OMe (22) préparé à l'étape d et 1 ml de NMM. Après 30 min à — 15~C et une nuit à la température ambiante, on ajoute I 1 de chloroforme et 200 ml de KHC03 IN. Après agitation, on laisse décanter et on sépare la couche chloroformique qu'on lave par 2 x 100 ml d'eau. Les phases aqueuses sont réextraites par 1 1 de chloroforme. On réunit les phases organiques et on les sèche sur MgS04. La solution chloroformique est concentrée sous vide et le résidu est trituré dans l'éther. On obtient 2,9 g d'une poudre blanche (Rdt 75%). Le produit obtenu est homogène par CCM dans les mélanges de solvants E et J. F = 194-198 C, déc. [a]D = —1,9 (C = 2, DMF).

Etape f Préparation de l'acétate de Lys( BOC)— Ser( But) — Gin — Gly — Gly—OMe (24)

2,9 g du dérivé (23) obtenu à l'étape 3 sont hydrogénés comme il est décrit précédemment dans 50 ml de MeOH, 0,5 ml de CH3COOH et 0,5 ml d'eau, en présence de 50 mg de Pd/C à 5% pendant 5 h. On obtient 2,8 g d'un produit homogène par CCM dans les solvants C et E, utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape g Préparation du Z— Ala—Lys f BO C)—Serf But) —Gin— Gly -Gly -OMe (25)

A une solution de 0,892 g de Z—Ala dans 30 ml de DMF refroidie à —15 C, on ajoute 0,522 ml de chlorocarbonate d'isobutyle et 0,44 ml de NMM. Après 5 min, on ajoute une solution de 70 ml de DMF contenant 2,8 g d'acétate de Lys(BOC) —Ser(But) —Gin —-Gly —Gly—OMe (24) préparé à l'étape f et 0,8 ml de NMM. Après 30 min à froid, on laisse une nuit à la température ambiante et on

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concentre la solution jusqu'à un volume de 50 ml sous le vide de la pompe à palettes. Puis on ajoute lentement 450 ml d'eau. Le précipité formé est filtré, lavé à l'eau, puis par une solution N de KHC03 et de nouveau par l'eau. On rince, à l'éther, et on sèche au dessiccateur. On obtient 2,7 g (Rdt 80%) d'un produit homogène par CCM dans les solvants F et J. F = 210-220° C, déc. [a]D = 1,7° (C- = 2,2, DMF).

Etape h Préparation duZ— Ala—Lys (BOC) —Ser (But) — Gin— Gly - Gly - NHNH2 (26)

2,3 g du dérivé (25) préparé à l'étape g sont dissous dans 150 ml de méthanol en chauffant. Après refroidissement, on ajoute 2,6 ml d'hydrazine hydrate à 98% et on agite vigoureusement la solution. On laisse une nuit à la température ambiante, puis on refroidit à —20 C et on filtre le précipité obtenu. Ce premier précipité est lavé à l'éther. Les eaux mères sont concentrées: le second précipité est trituré dans l'éther. Les deux produits ainsi obtenus sont identiques: séchés sous vide au dessiccateur sur H2S04, ils donnent 2,2 g d'un produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants I et J. F = 191-195 C, déc. [a]D = -3,8° (C = 2,2, DMF).

Etape i Préparation du Z— Ala—Lys(BOC)—Ser(But) — Gin— Gly—Gly—Serf But) — OBut (39)

A une solution de 0,85 g du dérivé (26) préparé à l'étape h dans 30 ml de DMF fefroidie à —40: C, on ajoute 0,63 ml (5 Eq) d'une solution anhydre de HC1/THF 8N et 0,16 ml de nitrile d'isoamyle. On maintient la solution sous agitation à —40°C pendant 30 min, puis on ajoute 1,4 ml de triéthylamine et 0,366 g du chlorhydrate de Ser(But)—OBut préparé selon E. Schroeder («Liebigs. Ann.

Chem.», 1963,127, p. 670). Après 1 h à —40°C, on laisse au congélateur pendant 48 h. On concentre sous le vide de la pompe à palettes jusqu'à un volume de 10 ml et on ajoute lentement 200 ml d'eau. Après 4 h à froid, on filtre le précipité que l'on rince à l'eau puis à l'éther. On obtient une poudre blanche homogène par CCM dans les mélanges de solvants E, F et J. Recristallisation dans le mélange méthanol/éther. F = 225-230'C, déc. [a]D = —4,0° (C = 1, DMF). Etape j Préparation de l'acétate d'Ala—Lysf BOC) —Serf But) — Gin - Gly - Gly - Ser (But) - OBut (40)

Ce dérivé est obtenu à partir de 0,50 g du dérivé (39) préparé à l'étape i dans les conditions décrites précédemment pour les dérivés (22) et (24) (étapes d et 0- Rendement quantitatif. Produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et E, utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape k Préparation du PyroGlu—Lys(BOC) — Ser(But) — Gin— Gly—Gly—Ser (But) — OBut (41)

A une solution de 0,25 g du produit (40) préparé à l'étape j dans 10 ml de DMF refroidie à 0 C, on ajoute 0,03 ml de NMM puis, après 5 min, 0,088 g de PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108). Après 30 min à froid, on laisse 18 h à la température ambiante. On concentre la solution sous vide (pompe à palettes). Le résidu est trituré dans l'acétate d'éthyle à chaud, puis dans l'éther. On obtient 0,195 g (Rdt 70%). Recristallisation dans le mélange méthanol/éther: produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants E, F et J. F = 219-222° C, [a]D = -3,0 (C = 0,9, DMF).

Etape l Préparation de l'octapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys— Ser-Gin - Gly - Gly - Ser (42)

0,020 g du dérivé (41) préparé à l'étape k sont dissous dans 5 ml d'un mélange de CF3COOH/anisole 10:1 (v/v). Après 3 h à la température ambiante, on concentre au dessiccateur sous vide. On reprend le résidu dans 40 ml d'eau. On extrait par 20 ml d'acétate d'éthyle et par 20 ml d'éther. La phase aqueuse est lyophilisée. Le produit obtenu est homogène par CCM dans les mélanges de solvants G et H.

Par rhéophorèse dans un tampon de pH 2,3 (acide formique 0,1M) sur papier Whatman N° 3 MM et sous tension de 1000 V (15-30 mA), on révèle une seule tache à —2,9 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Ser 1,87; Glu 1,92; Gly 2,00; Ala 1,01.

Exemple 7:

Préparation de l'analogue octapeptidique: D—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (45)

Cet analogue de structure correspond à l'octapeptide C-terminal (38) précédemment décrit (exemple 5) à la seule différence que le résidu L—Ala est remplacé par le résidu D—Ala. Il est obtenu par synthèse selon les étapes suivantes:

Etape a Préparation du dérivé: Z—D—Ala—Lys(BOC) — Ser (But) — Gin (Mbh) — Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (43)

A une solution de 0,03 g de Z—D—Ala (préparé selon M. Bergmann et L. Zervas, «Ber.», 1932,65,1192) en solution dans 1 ml de DMF refroidie à — 15°C, on ajoute sous agitation 0,015 ml de NMM et 0,018 ml de chlorocarbonate d'isobutyle, puis, après 5 min, une solution de 0,172 g de l'acétate de Lys(BOC)—Ser(But)— Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (12) dont la préparation est décrite à l'étape g de l'exemple 1 et de 0,03 ml de NMM dans 5 ml de DMF. Après 30 min à —15° C, on laisse à la température ambiante toute une nuit. On concentre la solution jusqu'à un volume de 1 ml et on ajoute lentement 20 ml d'une solution d'acide citrique à 10%. Il se forme un précipité sous la forme d'une poudre fine que l'on filtre et que l'on rince plusieurs fois à l'eau, puis par une solution N de KHC03 et encore à l'eau. On rince plusieurs fois à l'éther et on sèche dans le dessiccateur sous vide. On obtient 0,16 g du produit sous la forme d'une poudre fine (Rdt 85%). Recristallisation dans le mélange méthanol/éther. Produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C, E et F. F = 211-215°C, déc. [a]D = -3,3° (C = 0,45, DMF).

Etape b Préparation de l'acétate de D—Ala—Lysf BOC) — Ser (But) —Glnf Mbh)—Gly—Gly—Ser (But) —Asn—OBut (44)

0,11 g du dérivé (43) préparé à l'étape a sont hydrogénés dans les conditions décrites précédemment, dans 10 ml de MeOH, 0,1 ml de CH3COOH et 0,1 ml d'eau et en présence de 10 ml de Pd/C à 5% pendant 4 h. On obtient un produit homogène que l'on utilise directement pour l'étape suivante.

Etape c Préparation de l'octapeptide libre: D—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (45)

A partir du dérivé (44) préparé à l'étape b, on obtient l'octapeptide libre en opérant selon le procédé décrit pour l'obtention du nonapeptide PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Asn ( 16) à l'étape k de l'exemple 1. On obtient un produit homogène par CCM dans les mélanges G et H. Par rhéophorèse dans les mêmes conditions décrites précédemment pour le peptide (42) à l'étape 1 de l'exemple 6, on obtient une seule tache qui migre à —4,65 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,02; Ser 1,77; Glu 1,0; Gly 2,00; Ala 0,91.

Exemple 8:

Préparation de l'analogue nonapeptidique: PyroGlu—D— Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (Al)

Cet analogue de structure correspond au nonapeptide (16) de l'exemple 1 ayant la structure de l'hormone thymique sérique, à la seule différence que le résidu L—Ala est remplacé par le résidu D—Ala. Il est obtenu par synthèse à partir du dérivé (44) décrit précédemment (étape b de l'exemple 7) selon les étapes suivantes:

Etape a Préparation du PyroGlu—D—Ala—Lys(BOC) — Ser(But) —Gln(Mbh) —Gly—Gly—Ser(But) —Asn—OBut (46)

A une solution de 0,104 g d'acétate de Lys(BOC)—Ser(But)—-Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut (44) décrit précédemment (étape b de l'exemple 7) dans 3 ml de DMF refroidie à 0"C, on ajoute 30 jj.1 de NMM puis après 5 min, une solution de 29 mg de PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J.

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Chem. Soc. C.», 1967, p. 108) dans 5 ml de DMF. On laisse 24 h à température ambiante, puis on concentre la solution jusqu'à un volume de 1 ml et on ajoute lentement 20 ml d'eau jusqu'à l'obtention d'un précipité fin que l'on filtre. On rince à l'acétate d'éthyle et à l'éther, on obtient 0,078 g (Rdt 70%) d'un produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C, D et E. F = 210-215°C, [a]D = 5,0° (C = 0,4, DMF).

Etape b Préparation du nonapeptide libre (47)

A partir du dérivé précédent (46), on obtient le nonapeptide libre en opérant selon le procédé employé pour l'obtention de l'octapeptide (45) et le nonapeptide (16). On obtient un produit homogène par CCM dans les solvants G et H. Par rhéophorèse à pH 2,3, on révèle une seule tache migrant à —3,2 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 0,97; Ser 1,67; Glu 1,84; Gly 2,00; Ala 0,98.

Exemple 9:

Préparation de l'analogue de structure nonapeptidique: PyroGlu— Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asp (53)

Cet analogue correspond aux nonapeptides (16) et (30) ayant la structure de l'hormone thymique sérique, à la seule différence du résidu L-asparagine (Asn) C-terminal remplacé par le résidu L-aspartique (Asp).

Il est obtenu par synthèse selon les étapes suivantes:

Etape a Préparation du dérivé: Z—Ser (But)—Asp—di—OBut (48)

A une solution de 0,295 g de Z—Ser(But) (provenance Fluka) dans 10 ml de DMF, refroidie à — 153C, on ajoute 0,12 ml de NMM et 0,13 ml de chlorocarbonate d'isobutyle. Après 5 min, on ajoute une solution froide de 10 ml de DMF contenant 0,54 g de diterbutyl aspartate sous forme de sel de dibenzosulfimide (provenance Fluka) et 0,15 ml de NMM. On laisse sous agitation 30 min à froid et une nuit à température ambiante. Puis on concentre la solution sous vide et on reprend le résidu dans 100 ml d'acétate d'éthyle. On lave avec 50 ml de solution N de KHS04, d'eau, de sel N de KHC03 et de nouveau d'eau. La phase organique est séchée sur MgS04, puis concentrée sous vide. On obtient une huile qui cristallise par addition d'éther de pétrole. Par recristallisation dans l'éther de pétrole, on obtient 0,43 g (Rdt 80%) d'un produit homogène par CCM dans le mélange éther/éther de pétrole 1:1 v/v. F = 83-85 C, [a]D = —4,9° (C = 1,25, DMF).

Etape b Préparation de l'acétate de Ser(But) —Asp—di—OBut (49)

0,26 g du dérivé (48) préparé à l'étape a dissous dans 10 ml de méthanol contenant 0,1 ml de CH3COOH et 0,1 ml d'eau sont hydrogénés en présence dfe 0,1 g de Pd/C à 5% pendant 2 h. L'acétate de Ser(But)—Asp—di—OBut obtenu avec un rendement quantitatif est homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et E et il est utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape c Préparation du Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But) — Gin— Gly—Gly—Ser(But)—Asp—di— OBut (50)

A une solution du dérivé Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But)— Gin—Gly—Gly—NHNH2 (26) (obtenu à l'étape h de l'exemple 6) dans 10 ml de DMF, on ajoute 0,175 ml d'une solution 8N de HCl/ THF et on refroidit à —40 C. Puis on ajoute 0,045 ml de nitrite d'isoamyle et on laisse la solution sous agitation à — 40' C pendant 30 min. On ajoute alors une solution refroidie de 10 ml de DMF contenant 0,18 g de l'acétate de Ser(But)—Asp—di—OBut (49) préparé à l'étape b, et 0,1 ml de triéthylamine. On laisse à — 40 C pendant 30 min et pendant 48 h au congélateur. Puis on concentre la solution sous vide et on triture le résidu dans 20 ml d'eau. On filtre le précipité et on rince à l'éther. On reprend le précipité dans 5 ml de méthanol, on reprécipite par l'éther, et on filtre la poudre obtenue.

Par recristallisation dans le méthanol entre chaud et froid, on obtient 0,25 g (Rdt 75%) d'un produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants I et J. F = 220 C, déc. [a]D = —8,0° (C = 0,6, DMF).

Etape d Préparation de l'acétate d'Ala—Lys(BOC)-Ser(But)—-Gln—Gly—Gly —Serf But)—Asp—di—OBut (51)

L'hydrogénation catalytique de 0,15 g du dérivé (50) de l'étape c dans 10 ml de méthanol contenant 0,1 ml de CH3COOH et 0,1 ml d'eau et 10 mg de Pd/C à 5% donne, après 3 h, un produit homogène par CCM dans les solvants C et I, avec un rendement quantitatif. Ce produit est utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape e Préparation du PyroGlu—Ala—Lys(BOC) — Ser(But) — Gin—Gly—Gly—Ser(But) — Asp—di— OBut (52)

A une solution de 0,126 g du dérivé précédent (51) dissous dans 4 ml de DMF, refroidie à 0'C, on ajoute 0,038 ml de NMM, puis, après 5 min, 0,038 g de PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108). On laisse 30 min à froid, puis 24 h à la température ambiante, puis on concentre sous vide la solution et on triture le résidu dans l'eau, dans l'acétate d'éthyle et dans l'éther. On filtre le précipité que l'on dissout dans le minimum de méthanol chaud et on reprécipite par l'éther. Par recristallisation dans le méthanol entre chaud et froid, on obtient 0,085 g (Rdt 65%) d'un produit homogène dans les mélanges de solvants C et I. F = 225 C, déc. [a]D = -5,8 (C = 0,4, DMF).

Etape f Préparation du PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin —Gly— Gly—Ser—Asp (53)

0,02 g du dérivé (52) de l'étape e dissous dans 5 ml d'un mélange de CF3COOH/anisole 10:1 v/v est laissé pendant 3 h à température ambiante. On concentre au dessiccateur la solution et on reprend le résidu dans 40 ml d'eau, on extrait par 20 ml d'acétate d'éthyle et 20 ml d'éther et on lyophilise la phase aqueuse. Le produit obtenu est homogène par CCM dans les solvants G et H. Par rhéophorèse dans les conditions décrites précédemment pour le peptide (42) à l'exemple 6, on obtient une seule tache qui migre à —2,8 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,05; Ser 1,73; Glu 1,97; Gly 2,00; Ala 1,02.

Exemple 10:

Préparation de l'analogue nonapeptidique: PyroGlu—Ala—Lys— Ser—Gin—Gly—Gly—Ala—Asn (59)

Cet analogue correspond au nonapeptide ayant la structure de l'hormone thymique sérique, à la seule différence du résidu Ser8 en position pénultième qui est remplacé par le résidu Ala.

Il est obtenu par synthèse selon les étapes suivantes:

Etape a Préparation du dérivé Z—Ala—Asn—OBut (54)

0,461 g de Z—Ala (provenance Fluka) en solution dans du THF, on ajoute 0,23 ml de NMM, puis on refroidit à —15 C et on ajoute 0,25 ml de chlorocarbonate d'isobutyle. Après 5 min, on ajoute une solution dans du THF d'acétate d'Asn—OBut (préparé selon E. Schnabel et H. Schüssler, «Liebigs Ann. Chem.», 1965, 685, 229) et 0,38 ml de NMM. Après une nuit à température ambiante sous agitation, on évapore le solvant et on reprend le résidu par l'acétate d'éthyle. La solution organique est lavée par une solution M de KHS04, par de l'eau, par une solution M de KHC03 et de nouveau par de l'eau. La phase organique est séchée sur MgS04. Par évaporation de l'acétate d'éthyle, on obtient un résidu qui cristallise par addition d'éther de pétrole. On recristallise dans le mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole. On obtient 0,635 g (Rdt 94%) d'un produit homogène dans le mélange de solvants A. F = 156-158' C, [a]D = —9,0' (C = 1,13, DMF).

Etape b Préparation de l'acétate d'Ala—Asn —OBut (55)

Une solution de 0,25 g du dérivé (54) de l'étape a dans 15 ml de méthanol, de 0,5 ml de CH3COOH et de 0,5 ml d'eau contenant 20 mg de Pd/C à 5% est hydrogénée pendant 5 h. On filtre sur verre fritté et célite, on évapore à sec et on reprend le résidu successivement par du benzène et du méthanol. Rendement quantitatif d'un

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produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et E.

Le produit obtenu est utilisé directement pour l'étape suivante. Etape c Préparation de Z—Ala — Lys(BOC) —Ser(But) — Gin — Gly—Gly—Ala—Asn—OBut (56)

A une solution de 0,28 g du dérivé Z—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gin—Gly—Gly—NHNH2 (26) (obtenu à l'étape h de l'exemple 6) dans 10 ml de DMF, on ajoute, après refroidissement à —40° C, 0,208 ml d'une solution 8N de HC1/THF, puis 0,058 ml de nitrite d'isoamyle. Après 30 min à — 40° C, on ajoute 0,50 ml de triéthylamine et une solution de 0,14 g d'acétate d'Ala—Asn—OBut (55) préparé à l'étape b dans 5 ml de DMF. Après 1 h à —40°C sous agitation, on laisse 48 h dans le congélateur. On concentre la solution sous vide et on triture le résidu dans 20 ml d'eau, puis dans 20 ml d'acétate d'éthyle et dans 30 ml d'éther. Après filtration, on obtient une poudre blanche que l'on recristallise dans le méthanol entre chaud et froid. Le produit est homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et I. F = 210°C, déc. [a]D = —12,9° (C = 0,9, DMF).

Exemple 11:

Préparation du nonapeptide : Gin —Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn (32) et des dérivés de ce peptide

Le nonapeptide (32) est équivalent de l'hormone thymique sérique, à la seule différence du résidu N-terminal glutaminyle qui remplace le résidu pyroglutamyle.

Il est obtenu par synthèse selon les étapes suivantes:

Etape a Préparation du Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But) —Gin— Gly—Gly—Serf But )—Asn—OBut (27)

Ce dérivé est l'équivalent du dérivé (13) dont la synthèse est décrite précédemment (étape h de l'exemple 1), le résidu Gin n'étant pas masqué par le groupement 4,4-diméthoxybenzhydryle (Mbh), et sa préparation suit une voie différente de celle employée pour la synthèse du dérivé (13). A une solution de 0,080 g de Z—Ala— Lys(BOC)—Ser(But)—Gin—Gly—Gly—NHNH2 (26) obtenu à l'étape h de l'exemple 6, dans 2 ml de DMF, refroidie à — 40° C, on ajoute 0,056 ml d'une solution 8,3N de HC1/THF, puis 0,016 ml de nitrite d'isoamyle. On laisse 20 min sous agitation à — 40° C, puis on ajoute 0,13 ml de triéthylamine et 0,0445 g de l'acétate de Ser(But)—Asn—OBut (2) (préparé à l'étape d 1 de l'exemple 1). On laisse sous agitation pendant 2 h à — 40° C et pendant 48 h à —20: C. On évapore le solvant sous vide et on triture le résidu dans de l'eau. On filtre et on sèche dans le dessiccateur la poudre obtenue. Le produit (69 mg, Rdt 64%) est pratiquement homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et J. F = 210 C, décomposition sans fusion. Ce produit est utilisé directement pour l'étape suivante.

Etape b Préparation de l'acétate d'Ala—Lys(BOC) —Ser(But) — Gin—Gly—Gly—Ser (But)—Asn—OBut (28)

Une solution de 0,0322 g du dérivé (27) de l'étape a, en solution dans 4 ml de méthanol, 0,1 ml de CH3COOH et 0,1 ml d'eau, est soumise à une hydrogénation en présence de Pd/C à 5%. Après la fin de la réaction (contrôle par CCM), on filtre et on concentre à sec le filtrat. Le résidu est séché dans le dessiccateur sur P2Os. Rendement quantitatif d'un produit pratiquement homogène dans le mélange de solvants J.

Etape d Préparation de l'acétate d'Ala—Lys(BOC) —Serf But) — Gin—Gly—Gly—Ala—Asn — OBut (57)

0,115 g du dérivé (56) de l'étape c, en solution dans 10 ml de méthanol, 0,1 ml de CH3COOH et 0,5 ml d'eau contenant 10 ml de Pd/ C à 5%, est hydrogéné pendant 4 h. On obtient un produit, avec un rendement quantitatif, homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et E que l'on utilise pour l'étape suivante.

Etape e Préparation du PyroGlu—Ala—Lysf BOC) —Serf But) — Gin - Gly - Gly -Ala- Asn - OBut (58)

A une solution de 0,10 g du dérivé (57) de l'étape d dans 5 ml de

DMF, après refroidissement à 0e C, on ajoute 0,02 ml de NMM et, après 10 min, 0,033 g de PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108). Après 24 h à la température ambiante sous agitation, on évapore sous vide le solvant et on triture le résidu dans le chloroforme chaud. On filtre la poudre obtenue que l'on rince à l'éther. Par recristallisation dans le méthanol entre chaud et froid, on obtient 0,065 g d'un produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et E. F = 210°C, déc. [a]D = -13,7° (C = 0,95, DMF).

Etape f Préparation du nonapeptide libre (59)

Une solution de 0,020 g du dérivé (58) de l'étape e dans 5 ml d'un mélange de CF3COOH/anisole 10:1 (v/v) après 3 h à la température ambiante sous agitation est concentrée dans le dessiccateur sous vide. Le résidu est repris dans 40 ml d'eau. La solution aqueuse est extraite par 20 ml d'acétate d'éthyle et par 20 ml d'éther. La phase aqueuse est lyophilisée. Le produit obtenu est homogène par CCM dans les mélanges de solvants G et H.

Par rhéophorèse dans les conditions décrites précédemment (pour les peptides (16), (36), (37), (38), etc.), on obtient une seule tache qui migre à —3,15 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 0,98; Ser 0,87; Glu 1,95; Gly 2,00; Ala 1,99.

Le produit est utilisé directement pour les étapes suivantes.

Etape c Préparation du BOC — Gin—Ala—Lysf BOC) —

Serf But) — Gin—Gly—Gly—Ser (But)—Asn—OBut (31 )

A une solution de 0,0278 g du dérivé (28) de l'étape b dans 2 ml de DMF, on ajoute 0,016 g de BOC—Gin—ONp (provenance Serva) et 6 |il de triéthylamine. On laisse sous agitation une nuit à la température ambiante. On évapore sous vide le solvant et on triture le résidu dans l'éther. On obtient 28 mg (Rdt 78%) d'un produit qui présente de faibles impuretés par CCM. 13 mg de ce produit sont recristallisés dans le méthanol/eau. On obtient un produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants C et J. F = 218°C, déc.

Etape d Préparation du nonapeptide libre (32)

2 mg du dérivé (31) purifié sont traités pendant 3 h par 0,5 ml d'acide trifiuoracétique. On évapore l'acide à la température ambiante au dessiccateur et on sèche le résidu sur P2Os et KOH. Le produit obtenu est redissous dans l'eau et lavé 3 fois par l'acétate d'éthyle, puis lyophilisé. Par CCM dans les mélanges de solvants H et G on révèle, en plus du nonapeptide (32), une très faible tache de même valeur de Rf que le nonapeptide PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly —Ser—Asn (16) et (30).

Par rhéophorèse sur papier Whatman N° 3 MM sous tension de 600 V pendant 45 min dans le tampon eau/pyridine/acide acétique: 1000/2,5/9, de pH 4,0, le glutaminylenonapegtide (32) migre à —0,5 cm et l'impureté (pyroglutamylnonapeptide) à +0,7 cm. Dans le tampon acide formique 0,01N de pH 2,3, le Gln-nonapeptide migre à —4,9 cm et l'impureté (pyroGlu-nonapeptide) à —2,2 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,12; Ser 1,99; Glu 2,00; Gly 2,10; Ala 1,06; Lys 0,82; NH3 3,45.

Exemple 12:

Préparation du PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin —Gly—Gly—Ser— Asn (30) à partir du dérivé (28) de l'étape b de l'exemple 11

A une solution de 0,0213 g du dérivé (28) dans 2 ml de DMF, on ajoute 10 mg de PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 18) et 5 ni de triéthylamine. On laisse sous agitation à la température ambiante 24 h. On filtre le précipité formé, on évapore le DMF sous vide et on triture le résidu dans l'acétate d'éthyle. On obtient 14,2 mg (Rdt 57%) d'un produit qui, par CCM, présente une très faible impureté négative à la nin-hydrine, révélée par la méthode au chlore dans les mélanges de solvants A et C. 5 mg de ce produit sont purifiés par Chromatographie préparative sur couche mince (plaque de silice Merck de 2 mm d'épaisseur) dans le mélange de solvants C. Le produit ainsi obtenu est chromatographiquement pur dans les solvants C et A et corres5

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pond au dérivé PyroGlu—Lys(BOC)—Ser(But) — Gin—Gly— Gly—Ser(But)—Asn—OBut (29).

A partir de ce produit purifié, on obtient le nonapeptide libre PyroGlu—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (30) par traitement avec une solution 4N de HCl/acétate d'éthyle. Après évaporation des solvants et séchage sur P2Os et KOH, le résidu est redissous dans l'eau et après lavage 3 fois avec l'acétate d'éthyle de la solution aqueuse, le peptide libre (30) est obtenu par lyophilisation. Le produit est homogène par CCM dans les mélanges de solvants H et G.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,00; Ser 1,72; Glu 1,89; Gly 1,94; Ala 0,96.

Exemple 13:

Préparation du dérivé Z—Gin —Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly— Ser—Asn (34)

Ce dérivé est obtenu à partir du dérivé (28) obtenu à l'étape b de l'exemple 11.

A une solution de 0,107 g du dérivé (28) dans 5 ml de DMF, après refroidissement à 0°C, on ajoute 0,03 ml de NMM puis, après 5 min, 0,04 mg de Z—Gin—OSu (préparé selon J. Beacham et al., «J. Amer. Chem. Soc.», 1971, 93, 5526) et on laisse à la température ambiante. Le mélange réactionnel se prend en masse. On concentre sous vide et on reprend le résidu par le minimum de méthanol à chaud. Après refroidissement à 0°C, on filtre le précipité et on le rince à l'éther. Le produit obtenu est homogène par CCM dans les mélanges de solvants C, E et I.

Ce produit correspond au dérivé Z—Gin—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gin—Gly—Gly—Ser(But) — Asn—OBut (33).

A partir de ce dérivé et par élimination des groupements de protection temporaire BOC et But par CF3COOH/anisole 10:1 (v/v) dans les mêmes conditions que pour le dérivé homologue (18) de l'exemple 2, on obtient le dérivé nonapeptidique Z—Gin—Ala— Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (34).

Le produit ainsi obtenu est homogène par CCM dans les mélanges de solvants G et H. Par rhéophorèse dans les conditions utilisées pour les autres nonapeptides libres, on obtient une seule tache qui migre à —2,7 cm.

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,02; Ser 1,89; Glu 1,92; Gly 2,00; Ala 0,94.

Par hydrogénation catalytique du dérivé nonapeptidique (34) dans les conditions décrites pour l'obtention du nonapeptide (18) (étape b de l'exemple 2), on obtient un produit homogène par CCM dans les mélanges de solvants G et H et identique au nonapeptide (18) obtenu par synthèse par une voie différente.

Le produit ainsi obtenu correspond au nonapeptide: Gin — Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (35).

Analyse en acides aminés après hydrolyse acide totale: Asp 1,01 ; Ser 1,83; Glu 1,85; Gly 2,00; Ala 0,97.

Exemple 14:

Préparation des analogues nonapeptidiques de structure

PyroGlu—Ala—Lys—Ala—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (65) PyroGlu—Ala—Lys—Z)—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (66) PyroGlu—Ala—Lys — Thr—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (67)

PyroGlu—Ala—Lys — ( N-méthyl—Ser) — Gin—Gly—Gly —

Ser—Asn (64)

qui correspondent au nonapeptide ayant la structure de l'hormone thymique sérique à la seule différence que le résidu sérine de la quatrième position est remplacé par les résidus L-alanine, D-sérine, L-thréonine ou N-méthylsérine.

Ces analogues sont obtenus par synthèse selon les étapes décrites précédemment pour la synthèse du nonapeptide PyroGlu—Ala— Lys —Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (16) (exemple 1), à la seule différence que, à l'étape c, au lieu de Z—Ser(But), on utilise les dérivés Z—Ala, Z — D—Ser(But), Z — L—Thr(But) et Z—(N-méthyl) —Ser.

Les nonapeptides libres ainsi obtenus sont homogènes par CCM dans les mélanges de solvants G et H et par rhéophorèse dans les conditions utilisées pour le nonapeptide (16) (exemple 1) donnent une seule tache.

L'obtention des analogues de structure par remplacement du résidu L-lysine par des résidus D-lysine, N6-acétyl-L-lysine, L-ornithine est réalisée également selon les mêmes étapes que précédemment pour la synthèse de nonapeptide (16) (exemple 1), à la seule différence que, à l'étape, au lieu du Z—Lys(BOC), on utilise les dérivés Z—D —Lys(BOC), Z—Lys(Acet), Z—Orn(BOC).

Il en est de même pour les analogues de structure nonapeptidique préparés par synthèse par remplacement du résidu glutaminyle en cinquième position par un résidu glutamyle ou D-glutaminyle, du résidu Gly—Gly en sixième et septième position par des résidus L-analine ou D-alanine et du résidu Asn en position C-terminale par les résidus L-glutamine ou D-asparagine.

Afin de mettre à l'épreuve la validité et l'efficacité des procédés de la synthèse peptidique utilisés pour préparer les nouveaux polypeptides de l'invention, qui sont des fragments ou des analogues de structure de l'hormone thymique sérique, on a également synthétisé en parallèle, en utilisant ces mêmes procédés, le nonapeptide PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin — Gly—Gly—Ser—Asn ( 16) et (30) correspondant à l'hormone thymique sérique.

Les caractéristiques physico-chimiques et les propriétés biologiques in vitro et in vivo de l'hormone thymique sérique et du nonapeptide ainsi obtenu par synthèse se sont révélées identiques.

En plus des deux voies de synthèse décrites précédemment, on a utilisé, pour obtenir une série d'autres dérivés du FTS, les voies de synthèse numérotées 3, 4, 5, 6, 7 et 8, dont les étapes sont décrites ci-après.

Les détails de préparation des intermédiaires de synthèse selon ces dernières voies sont tout à fait semblables à ceux des exemples 1 à 14.

Description des étapes de la synthèse des dérivés du FTS par la troisième voie (peptides Nos 61, 62, 63, 82, 83, 84, 87, 91)

A — Préparation du dérivé tétrapeptidique: Z—Ser(But) —Gin —-Gly—Gly—OH par saponification du dérivé Z—Ser(But) —-Gin-Gly-Gly-OMe (21)

B — Synthèse du dérivé hexapeptidique : Z—Ser(But)—Gin—Gly — Gly — Ser(But)—Asn — OBut par couplage du dérivé dipeptidique C-terminal (2) (acétate de Ser(But) —Asn—OBut) avec l'anhydride mixte au chlorocarbonate d'isobutyle du dérivé tétrapeptidique précédent et transformation du dérivé hexapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z. C — Synthèse du dérivé heptapepditique: Z—Lys(Ac) — Ser(But) — Gin—Gly—Gly — Ser(But)—Asn — OBut par couplage du dérivé Z—Lys(Ac) (préparé selon L. Benoiton, «Can. J. Chem.», 1963, 41, 1718) avec l'acétate du dérivé hexapeptidique précédent par la méthode aux anhydrides mixtes et transformation du dérivé heptapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

D — Préparation de l'acétate d'Ala—NHNHBOC par hydrogénolyse du dérivé Z—Ala—NHNHBOC (préparé selon N. Yanaihara, C.Yanaihara, T. Sakagami, T. Nakajima, T. Nakayama et K. Matsumoto, «Chem. Pharm. Bull. Jap.», 1973, 21, 616). E — Synthèse du dérivé PyroGlu—Ala—NHNHBOC par couplage du dérivé précédent avec le dérivé PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson, M. A. Barton, D.M. Hardy, G.W. Kenner, J. Preston et R.C. Sheppard, «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108).

F— Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala—Lys(Ac) — Ser( But) — Gin—Gly—Gly — Ser(But)—Asn—OBut par :

a) préparation du dérivé PyroGlu—Ala—NHNH2 par acidolyse du groupement BOC du dérivé préparé en E;

b) préparation de l'azide PyroGlu—Ala—N3, à partir de l'hydr-azide précédent, par la méthode de K-Medzihradszky et al. («Acta Chim. Acad. Sci. Hung.», 1962, 30, 105);

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c) couplage de cet azide avec l'acétate du dérivé heptapeptidique préparé en C.

G — Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys(Ac) — Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (62) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape comme décrit à l'étape f de l'exemple 10.

H — Obtention de l'heptapeptide libre: Lys(Ac) —Ser—Gin—

Gly—Gly—Ser—Asn (82) à partir de l'acétate du dérivé heptapeptidique préparé en C par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape.

/—En employant à la place du dérivé Z—Lys(Ac), les dérivés Nps—D—Lys(BOC) et Nps—Orn(BOC) (préparés selon la méthode de I. Barrai et J. Savrda, «Synthesis», 1973, p. 795 par action du thiocyanate d'o-nitrophénylsulfényle sur les complexes cuivriques de la N6—BOC—D—lysine [obtenue selon R. Schwyzer et W. Rittel, «Helv. Chim. Acta», 1961, 20,159] et de la N5—BOC—Ornithine [obtenue selon F. Marchiori, R. Rocchi, G. Vivaldi, A. Tamburro et E. Scoffone, «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 81] respectivement) et Z—Hep (synthétisé par benzyloxycarbonylation de la L-heptyline préparée selon B. Sanborn et G. Hein, «Biochemistry», 1968, 7, 3616), on obtient, en suivant la même voie de synthèse [l'élimination sélective du groupement Nps est effectuée selon W. Köning («Happe-Seyler's Z. Physiol. Chem.», 1971,352, 2, et H. Klos-termeyer et E. Schwertner [«Z. Naturforschung», 1973, 28b, 334]) les heptapeptides:

D—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (83)

Orn—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (84)

Hep—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (87)

et les nonapeptides:

PyroGlu—Ala—D—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (61)

PyroGlu—Ala—Orn—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (63) PyroGlu—Ala—Hep—Ser—Gin—Gly—Gly — Ser—Asn (91 )

Description des étapes de la synthèse des dérivés du FTS par la quatrième voie (peptides Nos 65, 66, 67)

A — Synthèse du dérivé tripeptidique: Z—Gin—Gly—Gly—OMe par couplage de l'acétate de Gly—Gly—OMe (4) avec le dérivé Z—Gin—ONp (obtenu chez Fluka).

B— Préparation du dérivé: Z—Gin—Gly—Gly—NHNH2 par hydrazinolyse de l'ester méthylique précédent.

C — Synthèse du dérivé pentapeptidique : Z—Gin—Gly—Gly— Ser(But)—Asn—OBut par couplage de l'azide Z—Gin— Gly—Gly—N3 (obtenu à partir de l'hydrazide précédent selon R.H. Mazur et J.M. Schlatter, «J. Org. Chem.», 1964, 29, 3212) avec le dérivé dipeptidique C-terminal (2) (acétate de Ser(But)—Asn—OBut). Transformation du dérivé pentapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

D — Synthèse du dérivé hexapeptidique: Z—Ala—Gin—Gly— Gly—Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé Z—Ala (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé pentapeptidique précédent par la méthode aux anhydrides mixtes. Transformation du dérivé hexapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

E— Synthèse du dérivé tripeptidique: PyroGlu—Ala—Lys(BOC)— NHNHZ par couplage de l'azide PyroGlu—Ala—N3 (voir troisième voie, étape F b) avec le dérivé Lys(BOC)—NHNHZ (préparé selon C. Sakarellos, M. Sakarellos-Daïtsiotis, D. Blanot, I. Barrai, J. Savrda et E. Bricas, «Bull. Soc. Chim. Fr.», 1976, p. 781)

F— Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala—

Lys(BOC)—Ala—Gin—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut par:

a) préparation du dérivé PyroGlu—Ala—Lys(BOC)—NHNH2 par hydrogénolyse sélective du groupement Z;

b) préparation de l'azide PyroGlu—Ala—Lys(BOC) —N3, à partir de l'hydrazide précédent par la méthode de

R.H. Mazur et J.M. Schlatter («J. Org. Chem.», 1964,29, 3212);

c) couplage de cet azide avec l'acétate du dérivé hexapeptidique préparé en D.

G— Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ala— Gin— Gly—Gly—Ser—Asn (65) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape comme décrit dans l'étape f de l'exemple 10.

H— En employant, à la place du dérivé Z—Ala (étape D), les dérivés Z—Thr(But) (obtenu chez Fluka) et Z—D—Ser— OPcp (préparé selon J. Kovacs, M.Q. Ceprini, C. A. Dupraz et G.N. Schmit, «J. Org. Chem.», 1967,32, 3696), on obtient respectivement les nonapeptides:

PyroGlu—Ala—Lys— Thr—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (67) PyroGlu—Ala—Lys—D—Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (66)

Description des étapes de la synthèse des dérivés du FTS par la cinquième voie (peptides Nos 72, 88, 89, 92)

A — Synthèse du dipeptide: Z—D—Ala—Gly—OMe par couplage du Z—D—Ala (préparé selon M. Bergmann et L. Zervas, «Ber.», 1932, 65,1192) avec le glycineméthylester (vendu sous forme de chlorhydrate par la société Fluka). Transformation du dipeptide en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

B— Synthèse du dérivé tripeptidique: Z—Gln(Mbh)—D—Ala— Gly—OMe par couplage du dérivé Z—Gln(Mbh) (obtenu selon W. König et R. Geiger, «Chem. Ber.», 1970,103, 2041) avec l'acétate du dipeptide obtenu précédemment. Transformation de ce dérivé tripeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

C— Synthèse du dérivé tëtrapepditique: Z—Ser(But)—

Gln(Mbh)—D—Ala—Gly—OMe par couplage du dérivé Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé tripeptidique obtenu précédemment. Transformation de ce dérivé tétrapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

D — Synthèse du dérivé pentapeptidique: Z—Lys(BOC) —

Ser(But)—Gln(Mbh)—D—Ala—Gly—OMe par couplage du dérivé Z—Lys(BOC) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé tétrapeptidique obtenu précédemment.

E— Préparation du dérivé pentapeptidique: Z—Lys(BOC)—

Ser(But)—Gln(Mbh)—D—Ala—Gly—OH par saponification du dérivé pentapeptidique méthylester obtenu précédemment.

F— Synthèse du dérivé heptapeptidique: Z—Lys(BOC)—

Ser(But)—Gln(Mbh)—D—Ala—Gly—Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé dipeptidique C-terminal (2) (acétate de Ser(But)—Asn—OBut) avec l'anhydride mixte au chlorocarbonate d'isobutyle du dérivé pentapeptidique précédent. Transformation du dérivé heptapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

G— Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC)—

Ser(But)—Gln(Mbh)—D—Ala—Gly—Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé Z—Ala (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé heptapeptidique obtenu précédemment. Transformation du dérivé octapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

H— Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala—

Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) -D-Ala- Ser(But) - -Asn—OBut par couplage du dérivé PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108) avec l'acétate du dérivé octapeptidique obtenu précédemment.

/— Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—D—Ala—Gly— Ser—Asn (89) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape comme décrit à l'étape f de l'exemple 10.

J— Obtention de l'heptapeptide libre: Lys—Ser—Gin—D—Ala— Gly—Ser—Asn (88) à partir de l'acétate du dérivé heptapepti-

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dique préparé en F par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape.

K — En employant, à la place du dérivé Z—D—Ala à l'étape A, les dérivés Z—Ala et Z—D—Leu, on obtient en suivant la même voie de synthèse les nonapeptides :

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—A la—Gly—Ser—Asn (72) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—D—Leu—Gly—

Ser—Asn (92)

Description des étapes de la synthèse des dérivés du FTS par la sixième voie (peptides Nos 86, 90, 93, 94, 95)

A — Synthèse du dipeptide C-terminal protégé: Z—Ser(But)—Z)— Asn—OBut par couplage du Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka sous forme de sel de DCHA) et de l'acétate de D—Asn —OBut (obtenu par hydrogénolyse du Z—D—Asn—OBut, lui-même obtenu selon E. Schnabel et H. Schüssler, «Liebigs Ann. Chem.», 1965, 686, 229). Transformation du dipeptide protégé en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

B— Préparation de l'acétate du dérivé tétrapeptidique:

H — Ser(But)—Gin—(Mbh)—Gly—Gly—OMe par hydrogénolyse du groupement Z du dérivé tétrapeptidique Z - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - OMe (7).

C — Synthèse du dérivé pentapeptidique: Z—Lys(BOC)—

Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—OMe par couplage du Z—Lys(BOC) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé tétrapeptidique obtenu précédemment. Transformation du dérivé pentapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

D — Synthèse du dérivé hexapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But)—Gin—(Mbh)—Gly—Gly—OMe par couplage du Z—Ala (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé pentapeptidique obtenu précédemment.

E— Préparation du dérivé: Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But)—

Gln(Mbh)—Gly—Gly—NHNH2 par hydrazinolyse de l'ester méthylique du dérivé précédent.

F— Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—Ala — Lys(BOC) —

Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly—Ser(But)—D—Asn—OBut par couplage de l'azide Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But)— Gln(Mbh)—Gly—Gly—N3 obtenu à partir de l'hydrazide précédent avec l'acétate de dipeptide obtenu en A. Transformation du dérivé octapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

G— Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala —

Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - Ser(But) - -D—Asn—OBut par couplage du dérivé PyroGlu—OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108) et de l'acétate du dérivé octapeptidique précédent.

H — Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—Gly—Ser—D—Asn (90) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape comme décrit à l'étape f de l'exemple 10.

I— En employant, à la place de l'acétate de D—Asn—OBut dans l'étape A, l'acétate de ß—Ala—NH2 (obtenu selon H.T. Hanson et E.L. Smith, «J. Biol. Chem.», 1948, 175, 833) et le bromhydrate de H—Asn—NH2 (obtenu selon M. Bo-danszky, Y.S. Klausmer et V. Mutt, «Bioorg. Chem.», 1972, 2, 30), on obtient respectivement, en employant la même voie de synthèse, les nonapeptides:

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—

ß—Ala—NH2 (86)

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly — Ser—

Asn—NHZ ' (93)

J— Synthèse des dipeptides C-terminaux: Z—Thr(But)—Asn — OBut, Z—D—Ser—Asn—OBut, par couplage du dérivé Asn—OBut (obtenu selon E. Schnabel et H. Schüssler,

«Liebigs Ann. Chem.», 1965, 686, 229) avec, respectivement, les dérivés Z—Thr(But) (obtenu chez Fluka) et Z—D—Ser— OPcp (préparé selon J. Kovacs et al., «J. Org. Chem.», 1967,

32, 3696). A partir de ces deux dérivés dipeptidiques, on obtient par la même voie de synthèse les nonapeptides: PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly — Thr—Asn (94) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—D—

Ser—Asn (95)

Description des étapes de la synthèse des dérivés du FTS par la septième voie (peptides Nos 68, 71, 96, 97, 98, 99)

A — Synthèse du dérivé tétrapeptidique: Z—Gly—Gly—Ser(But)— Asn—OBut par couplage du dérivé dipeptidique C-terminal (2) (acétate de Ser(But)—Asn—OBut) avec le dérivé Z—Gly—Gly (préparé par benzyloxycarbonylation de la gly-cylglycine obtenue chez Sigma). Transformation du dérivé tétrapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

B— Synthèse du dérivé pentapeptidique: Z—G/«(OBut)—Gly— Gly—Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé Z—Glu(OBut) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé tétrapeptidique précédent. Transformation du dérivé pentapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z. C — Synthèse du dérivé hexapeptidique:

Z—Ser(But) — G/w(OBut)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé pentapeptidique précédent. Transformation du dérivé hexapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

D — Synthèse du dérivé heptapeptidique: Nps —Lys(BOC)—

Ser(But)—G/«(OBut)—Gly—Gly—Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé Nps-Lys(BOC) (obtenu selon J. Barrai et J. Savrda, «Synthesis», 1973, p. 795) avec le dérivé hexapeptidique précédent. Transformation du dérivé heptapeptidique en son bromhydrate par élimination sélective du groupement Nps selon W. König («Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.», 1971, 352, 2) et H. Klostermeyer et E. Schwertner («Z. Naturforschung», 1973, 28b, 334).

E— Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala—

Lys(BOC) - Ser(But) - G/«(OBut) - Gly - Gly - Ser(But) - -Asn—OBut par couplage de l'azide PyroGlu—Ala —N3 (voir troisième voie, étape F b) avec le bromhydrate du dérivé heptapeptidique précédent.

F— Obtention du nonapeptide libre: PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Glu—Gly—Gly—Ser—Asn (68) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape comme décrit à l'étape f de l'exemple 10.

G — En employant, à la place du dérivé Z —Glu(OBut) dans l'étape B, les dérivés Z—D—Gln(Mbh), Z—Asn(Mbh), Z—Nva, Nps—Cys(S—CONH2) et Nps—Met(O), on obtient respectivement les nonapeptides:

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—D — Glu—Gly—Gly—

Ser—Asn (71)

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Asn—Gly—Gly—Ser—Asn (96) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Nva—Gly—Gly—Ser—Asn (97) PyroGlu - Ala - Lys - Ser- Cys(S-CONH2 J - Gly - Gly -

Ser—Asn (98)

PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Met( O)— Gly—Gly—

Ser—Asn (99)

Description des étapes de la synthèse des dérivés du FTS par la huitième voie (peptides Nos 73, 100, 101, 102, 103, 104)

A — Synthèse du dérivé tripeptidique: Z — D — Ala—Ser(But) — Asn—OBut par couplage du Z—D —Ala (préparé selon M. Bergmann et L. Zervas, «Ber.», 1932, 65, 1192) avec le dérivé dipeptidique C-terminal (2) (acétate de Ser(But)— Asn—OBut). Transformation du dérivé tripeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

B— Synthèse du dérivé dipeptidique: Z—Gln(Mbh) —Gly —OMe par couplage du Z—Gln(Mbh) (obtenu selon W. König et R Geiger, «Chem. Ber.», 1970, 103, 2041) avec le glycine-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

637 111

16

méthylester (vendu sous forme de chlorhydrate par la société Fluka). Transformation du dérivé dipeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

C — Synthèse du dérivé tripeptidique: Z—Ser(But)—Gln(Mbh)— Gly—OMe par couplage du Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé dipeptidique précédent. Transformation du dérivé tripeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

D — Synthèse du dérivé tétrapeptidique: Z — Lys(BOC)— Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—OMe par couplage du Z—Lys(BOC) (obtenu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé tripeptidique précédent. Transformation du dérivé tétrapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

E— Synthèse du dérivé pentapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC)— Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—OMe par couplage du Z—Ala (vendu chez Fluka) avec l'acétate du dérivé tétrapeptidique précédent.

F— Préparation du dérivé pentapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC) — Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—OH par saponification de l'ester méthylique du dérivé pentapeptidique précédent.

G — Synthèse du dérivé octapeptidique: Z—Ala—Lys(BOC) —

Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—D—Ala—Ser(But)—Asn—OBut par couplage de l'acétate du dérivé tripeptidique préparé en A avec l'anhydride mixte au chlorocarbonate d'isobutyle du dérivé pentapeptidique précédent. Transformation du dérivé octapeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

H— Synthèse du dérivé nonapeptidique: PyroGlu—Ala—

Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - D - Ala— Ser(But)—Asn—OBut par couplage du dérivé PyroGlu— OTcp (préparé selon J.C. Anderson et al., «J. Chem. Soc. C.», 1967, p. 108) avec l'acétate du dérivé octapeptidique obtenu précédemment.

I — Obtention du nonapeptide libre : PyroGlu—Ala—Lys—Ser— Gin—Gly—D—Ala—Ser—Asn ( 100) par élimination de tous les groupes de protection temporaire en une seule étape comme décrit à l'étape f de l'exemple 10.

J— En employant, à la place du dérivé Z—D—Ala dans l'étape A, les dérivés Z—Ala, Z—Sar, Z—D—Leu et Z—Gly—Gly, on obtient respectivement les nonapeptides: PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly —Ala—Ser—Asn (73) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Sar—Ser—Asn (101) PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—D—Leu—

Ser—Asn (102)

et le décapeptide:

PyroGlu—Ala—Lys — Ser—Gin—Gly—Gly—Gly—

Ser—Asn (103)

K — En employant, à la place du dérivé tripeptidique dans l'étape G, le dérivé dipeptidique (2) (acétate de Ser(But)—Asn — OBut) on obtient l'octapeptide:

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin — Gly—Ser—Asn ( 104)

Autres dérivés du FTS préparés par la première voie (peptides Nos 85,

105, 106, 107, 108, 109, 110)

A — Par acidolyse sélective des groupements BOC et But du dérivé Z - Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly— Ser(But)—Asn—OBut (11) et du dérivé Z—Ala—

Lys(BOC) - Ser(But) - Gln(Mbh) - Gly - Gly - Ser(But) - -Asn—OBut (13), on obtient l'heptapeptide: Z—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (85)

et l'octapeptide:

Z—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (105)

B —■ Par remplacement, dans l'étape 11 de la voie 1, du dérivé PyroGlu—OTcp par les dérivés D—PyroGlu—OTcp, Z—D—Gln(Mbh), Nps-Cys(S-CONH2), BOC-Pro et L—Aad—OTcp, on obtient respectivement les nonapeptides: D—PyroGlu — Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—

Ser—Asn (106)

D—Gin—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (107) Cys(S- CONH2) - Ala - Lys - Ser - Gin - Gly - Gly -

Ser—Asn (108)

Pro—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (109)

< Aad— Ala—Ly s—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (110)

Autre dérivé du FTS préparé par la deuxième voie (peptide N° 79)

A — Synthèse du dérivé dipeptidique: Z—Ser(But)—Gin—OBut par couplage du dérivé Z—Ser(But) (obtenu chez Fluka) et du dérivé Gin—OBut (préparé selon E. Schnabel et H. Schüssler, «Liebigs Ann. Chem.», 1965, 686, 229). Transformation du dérivé dipeptidique en son acétate par hydrogénolyse du groupement Z.

B — En suivant la deuxième voie de synthèse, on obtient par l'emploi du dérivé précédent le nonapeptide: PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Gin (79)

Préparation de dérivés du FTS par guanidination de composés synthétiques (peptides Nos 111 et 112)

Par guanidination à pH 10,5 et 4°C, au moyen de l'o-méthyl (- iso) urée (vendue sous forme de sulfate par la société Serva), du peptide (63) et du FTS synthétique (16), puis purification par élec-trophorèse préparative à haute tension, on obtient respectivement les peptides:

PyroGlu—Ala—Arg— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (111) PyroGlu—Ala—Har—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (112)

Préparation de dérivés du FTS par acétylation de composés synthétiques (peptides Nos 113, 114, 115, 116)

A — Par acétylation (selon M. Reboud-Ravaux et C. Ghélis («Eur. J. Biochem.», 1976, 65,25), au moyen de l'acétylbenzotriazole, des nonapeptides (89), (61) et (90), on obtient respectivement les nonapeptides N6-acétylés suivants:

PyroGlu—Ala—Lys (Ac) — Ser—Gin—D—Ala—Gly—

Ser-Asn (113)

PyroGlu—Ala—£>—Lysf Ac)—Ser—Gin—Gly—Gly -

Ser—Asn (114)

PyroGlu—Ala—Lys (Ac) —Ser—Gin—Gly—Gly—Ser— D-Asn (115)

B — Cette méthode, appliquée au dérivé (14) (acétate de

Z—Ala—Lys(BOC)—Ser(But)—Gln(Mbh)—Gly—Gly— Ser(But)—Asn—OBut) et suivie d'une acidolyse sélective des groupements BOC et But, fournit l'octapeptide N-a-acétylé suivant:

Ac—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn (116) Propriétés pharmacologiques et applications thérapeutiques

Comme indiqué précédemment, les polypeptides de l'invention soit possèdent une activité thymique égale ou supérieure à celle de l'hormone thymique naturelle, soit manifestent une action antagoniste ou inhibitrice vis-à-vis de l'hormone thymique.

Des essais in vivo et in vitro ont été effectués sur les polypeptides de l'invention.

Pour les essais in vitro, on fait appel à l'essai des rosettes décrit ci-dessous.

Détermination de l'activité thymique des polypeptides par l'essai des rosettes

L'essai des rosettes a été décrit antérieurement par J. F. Bach et M. Dardenne dans «Immunology», 25, 353 (1973), le contenu de cet article étant incorporé ici par référence.

On détermine l'activité thymique du polypeptide en le mettant en incubation dans un tube à hémolyse avec 3 x 106 cellules de la rate provenant de souris C 57/B1 6 adultes (fournies par le Centre d'élevage des animaux de laboratoire du CNRS, 45 Orléans, La Source) thymectomisées 10 à 20 d plus tôt. La méthode de thymectomie est décrite par M. Dardenne et J.F. Bach dans «Immunology», 25, 343 (1973), p. 344. Le contenu de cet article est incorporé ici par référence.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

637 111

L'incubation est effectuée pendant 90 min à 37 C en présence d'azathioprine (As) à une concentration de 10 jig/'ml.

Cette concentration est intermédiaire entre la concentration minimale de Az inhibant 50% des cellules de la rate formant des rosettes (RFC) provenant de souris normales (1 |ig/ml) et provenant de s souris thymectomisées adultes (25-10 |ig/ml). A la fin de l'incubation, 12 x 106 cellules rouges de sang de mouton (SRBC) sont ajoutées aux cellules dans l'échantillon d'essai. Les cellules dans l'échantillon sont centrifugées pendant 6 min à 200 g et remises en suspension doucement et avec précaution par rotation sur un rouleau io (10 cm de diamètre) à petite vitesse (10 tr/min). On compte les RFC dans un hématocytomètre. En l'absence d'activité thymique, le nombre de RFC est de 1210/106 cellules + 120 (écart type, SD). En présence d'activité thymique, la quantité de RFC est réduite à un niveau de 200 à 400/106 cellules. En l'absence de Az, les peptides ne is provoquent pas d'inhibition des RFC. L'activité thymique est définie comme l'inhibition de plus de 50% des cellules formant des rosettes.

Les peptides ont été testés in vitro dans l'essai des rosettes décrit ci-dessus où certains se sont montrés actifs à des concentrations infé- 20 rieures à 1 pg/ml. Cet effet est spécifique puisque des peptides témoins de poids moléculaire analogue, comme l'angiotensine et la substance P, sont inactifs.

Les peptides actifs in vitro ont également été éprouvés dans des expériences in vivo. Injectés à des souris thymectomisées à l'âge de 25 6 semaines et utilisées 8 semaines après la thymectomie, les peptides entraînent l'apparition dans le sérum, à la quinzième minute, d'une activité biologique conférant la sensibilité à l'azathioprine des cellules spléniques formant des rosettes. Cette activité, qui est également observée avec le peptide initial, est retrouvée pour les dilutions de peptide supérieures à 1/1000.

Parallèlement, les cellules spléniques de souris traitées par les peptides voient se corriger la sensibilité des cellules formant des rosettes vis-à-vis de l'azathioprine et du sérum anti-0, ce qui indique que ces cellules ont acquis l'expression de marqueurs de cellules T qu'elles n'avaient pas auparavant. Ces expériences ont été répétées à différentes doses de peptide: 10 et 100 pg, 1 et 10 ng, ce qui a permis de démontrer une relation dose-effet et montrer l'absence de toxicité aiguë, que le produit soit injecté seul (dans du sérum physiologique) ou absorbé sur de la carboxyméthylcellulose.

Les résultats des essais obtenus pour certains composés de l'invention sont consignés dans les tableaux I à IV.

Les essais utilisés sont les suivants :

1) Activité in vitro dans l'essai des rosettes.

2) Activité in vivo (étude du sérum 2 h et 4 h après injection chez des souris thymectomisées de différentes quantités (0,1, 1, 10 ng) de peptide absorbé sur de la carboxyméthylcellulose).

3) Correction de la réactivité anormale des cellules formant les rosettes de la rate à l'azathioprine chez les souris thymectomisées 24 h après l'injection du peptide (0,1, 1, 10 ng) lié à la carboxyméthylcellulose.

4) Cinétique de l'activité dans le sérum après injection de 0,1 ou

1 ng de peptide sans carboxyméthylcellulose en vue de rechercher les peptides actifs présentant une activité retard.

5) Recherche in vitro de l'activité inhibitrice ou antagoniste des polypeptides inactifs.

Tableau I

No

Peptide

Activité

Liaison aux in vitro in vivo anticorps

38

Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

+

42

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser

-

53

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp

-

59

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-/4/«-Asn

-

+

18

Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

+

34

Z-G/n-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

+

37

Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

+

47

PyroGlu-£M/«-Lys-Ser-Gln-Gly-Ser-Asn

-

+

45

£M/fl-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

—

+

36

Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

—

-

79

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-67«

-

66

PyroGlu-Ala-Lys-/)-5cc-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

65

PyroGlu-Ala-Lys-/4/«-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

82

Lys (N6-acétvl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

+

83

fl-Lv.î-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

+

84

On;-Ser-Gln-GIy-Gly-Ser-Asn

-

+

85

A,''Z-jLv.s-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

+

62

PyroGlu-Ala-Lrs( N6-acétvl J -Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

■ R

+

61

PyroGlu-Ala-O-Lv.î-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

+

+ R

+

63

PyroGlu-Ala-O/vi-Ser-Ora-Gly-Gly-Ser-Asn

-

+

86

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-/?/f/«-iV//2

+

:

-

87

/fep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

-

+

88

Lys-Ser-Gln-ZM /«-Gly-Ser-Asn

-

+

89

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-£M/c/-Gly-Ser-Asn

-

+ R

+

90

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Z)-/f.yH

—

+ R

+

Dans le tableau I, les peptides selon la présente addition sont identifiés par leurs numéros respectifs 82 à 116 et les peptides du brevet principal par leurs numéros respectifs employés dans le brevet principal.

En ce qui concerne l'activité, les signes + et — signifient respectivement que le peptide est actif ou inactif. Le symbole R signifie que le peptide présente une activité retard.

L'aptitude des peptides à se lier à des anticorps est consignée par 65 les signes + et — signifiant respectivement que le peptide se lie ou ne se lie pas aux anticorps.

Les résultats du tableau I sont détaillés dans les tableaux II, III et IV.

637 111

18

Tableau II

Concentration active (ng/ml) (essai in vivo)

Sérums (essai in vivo) 2 h après injection

Rates (essai in vivo) 24 h après injection

Liaison

N°

Quantité injectée (ng)

Dilutions actives

Quantité injectée (ng)

Quantité d'azathioprine

(ng)

aux anticorps

38

2-IO-6

1

7-IO"6

1

0,3

64000

256000

+

2- IO""6

10

1

10

0,3

128000

512000

<0,03

1

25

50

1000

42

<0,03

10

<

1

6

25

6

1000

2000

<0,03

0,1

1

0,1

50

25

50

1000

53

<0,03

1

25

50

1000

2000

0,03

0,1

1

0,1

50

25

50

+

4000

8000

59

<0,03

1

(

1

50

25

50

1000

4000

8000

18

7- IO"6

0,1

1

0,1

0,3

0,7

0,3

128000

256000

512000

+

7•IO-6

1

0,3

3-IO-6

512000

34

2- IO-6

0,1

1

0,1

0,3

0,7

+

128000

256000

2- IO"6

1

0,3

0,7

0,3

256000

0,03

0,1

1

0,1

25

+

64000

32000

37

0,007

10

1

10

6 12

3

3 6

256000

128000

<0,03

1

50

+

125

250

500

47

<0,03

10

1

10

25

50

25

125

45

<0,03

0,1

1

1 1

0,1

25 25 25

50

50 50 12

+

500

500 1000

1000 1000

0,3

1

50

!

<

125

^ 125

36

0,6

79

<0,03

0,1

1

0,1

25

50

250

" 250

66

<0,03

0,1

1

0,1

50

+

<

250

65

<0,03

0,1

1

0,1

50

+

250

" 250

^ 250

82

<0,03

0,1

1

0,1

50

+

<

250

^ 250

83

<0,03

0,1

1

0,1

50

+

250

84

<0,03

0,1

1

0,1

50

+

250

" 250

^ 250

85

1 - IO-3

0,1

1

0,1

50

+

<

250

^ 250

" 250

19 637 111

Tableau III

N°

Concentration active (ng/ml) (essai in vivo)

Sérums (essai in vivo) 2 h après injection

Sérums (essai in vivo) 4 h après injection

Quantité injectée (ng)

Dilutions actives

Quantité injectée (ng)

Dilutions actives

62

<0,06

0,1

1 1 1 2000 4000 4000

1 1 8000 4000

0,1

1 1 1 128000 128 000 256000

61

2-10"6

0,1

1 1 1

0,1

1 1 1

256000 512000 512000

63

<0,03

0,1

1 1 1 1000 1000 1000

0,1

1 1 1 < 1000 1000 1000

86

7-10"3

0,1

1 1 1

0,1

1 1 1

64000 64000 64000

32000 32000 32000

87

<0,03

0,1

1 1 1 4000 4000 4000

0,1

1 1 1 8000 8000 8000

88

0,1

1111

0,1

1111

500 1000 1000 1000

1000 2000 1000 1000

89

<0,03

0,1

1111

0,1

1 1 1

500 1000 1000 500

32000 128000 128000

90

<0,03 <0,03

0,1

1 1 128000 128000

0,1

1 1 128000 64000

1 1 128000 128000

Tableau IV

No

Rates (essai in vivo) 24 h après injection

Rates (essai in vivo) 48 h après injection

Liaison aux anticorps

Quantité injectée (ng)

Quantité d'azathioprine (US)

Quantité injectée

(ng)

Quantité d'azathioprine (^g)

62

0,1

6 6 3 1,5 3 6

1

10 50

12 12 12 3 12 6

3 3 1,5 0,7 0,7 0,7 1,5 1,5

+

61

0,1

0,7 0,7 1,5

1

10 50

50 50 50 25 25 50 6 12 12

+

63

0,1

50 50 50

+

86

0,1

12

-

87

0,1

3 3

+

88

0,1

50 50 25 25

+

89

0,1

6 6 12

1

10 50

25 25 25 12 6 6 3 3 1,5

+

90

0,1

6 12 12

+

Dans les tableaux II et III, on a rapporté les résultats de l'essai des rosettes (essai in vitro) en exprimant pour chacun des peptides testés la concentration de peptide (en ng/ml) active dans ce test. Cette concentration active dans l'essai des rosettes a été déterminée de la façon indiquée dans le brevet principal.

Les résultats des essais in vivo sur le sérum et sur la rate, consignés dans les tableaux II, III et IV, ont été établis selon le processus indiqué ci-dessus. Les essais sur le sérum ont été effectués en injec-65 tant à des souris thymectomisées une quantité déterminée de Polypeptide (0,1, 1 ou 10 ng) absorbé sur de la carboxyméthylcellulose, en prélevant leur sérum au bout d'un temps déterminé (2 h après l'injection et éventuellement aussi 4 h après l'injection) et en déter

637 111

20

minant les dilutions de sérum présentant une activité biologique conférant la sensibilité à l'azathioprine des cellules spléniques formant des rosettes.

Les essais sur la rate ont été effectués en déterminant la quantité d'azathioprine nécessaire pour inhiber les cellules formant des rosettes de la rate de souris thymectomisées au bout d'un temps déterminé (24 h et éventuellement aussi 48 h) après l'injection d'une quantité déterminée de polypeptide (0,1, 1 ou 10 ng).

Après étude des résultats des tableaux précédents, il résulte que les polypeptides actifs sont les composés 38, 18, 34, 37, 62, 61, 86, 89 et 90.

Les polypeptides inactifs sont les composés 42, 53, 59,47,45, 36, 79, 66, 65, 82, 83, 84, 85, 63, 87 et 88.

Parmi les polypeptides actifs, certains présentent encore une activité notable 4 h après injection dans l'essai in vivo sur le sérum (tableau III) et 48 h après injection dans l'essai in vivo sur la rate (tableau IV). Ces polypeptides présentant cette activité retard sont les polypeptides 62, 61, 89 et 90.

Ces polypeptides ont été soumis à l'essai N° 4 indiqué plus haut pour suivre la cinétique de l'activité dans le sérum après injection de 0,1 ou 1 ng de peptide sans carboxyméthylcellulose à des souris thymectomisées en suivant les dilutions de sérum actives en fonction du temps après l'injection.

Cette cinétique a été également établie pour des produits actifs mais non retard, à titre de comparaison.

Les résultats de ces essais ont été représentés sous forme de courbes sur les fig. 1, 2 et 3 des dessins annexés.

Sur la fig. 1, on a représenté les courbes exprimant les variations des dilutions de sérum actives en fonction du temps après injection de 1 ng de polypeptide (non lié à la carboxyméthylcellulose) à des souris thymectomisées. Les courbes établies correspondent à 4 polypeptides actifs, mais non retard, à savoir le FTS et les polypeptides 34, 37 et 45.

On constate que ces 4 polypeptides présentent un pic d'activité environ 15 min après injection et que cette activité diminue ensuite très rapidement au cours du temps.

La fig. 2 montre 4 courbes établies dans des conditions analogues pour le FTS seul, le FTS lié à la carboxyméthylcellulose et les polypeptides 61 et 62 non liés à la carboxyméthylcellulose.

Le FTS seul présente un pic d'activité vers 15 min et l'activité décroît ensuite très rapidement. Le FTS lié à la carboxyméthylcellulose présente un pic d'activité vers 90 min, la carboxyméthylcellulose permettant de retarder l'activité du FTS.

Les polypeptides 61 et 62 présentent respectivement un pic d'activité vers 30 min et 45 min.

La fig. 3 montre 3 courbes établies dans des conditions analogues pour le FTS lié à la carboxyméthylcellulose et les polypeptides 89 et 90.

Les polypeptides 89 et 90 présentent un pic d'activité vers 60 min et constituent de ce fait des produits retard particulièrement intéressants.

Les polypeptides inactifs ont été soumis à l'essai N° 5 indiqué plus haut.

Cet essai in vitro pour rechercher l'activité inhibitrice ou antagoniste des peptides analogues inactifs consiste à incuber le polypeptide inactif avec le FTS et les cellules spléniques de souris thymectomisées pour déterminer si ce polypeptide inhibe l'effet du facteur thymique sur ces mêmes celluloses.

Les polypeptides antagonistes in vitro du FTS particulièrement intéressants sont les polypeptides 42, 53, 59, 36, 79 et 66.

Par ailleurs, les polypeptides ont été soumis à un essai N° 6 consistant à réaliser des homogreffes en utilisant des souris de souche A comme donneurs de greffe et des souris de souche CBA comme receveurs.

Les souris receveurs ont été traitées 8 d avant la greffe (3 injections par semaine) par 10 ou 100 ng de FTS lié à la carboxyméthylcellulose ou d'un polypeptide retard non lié à la carboxyméthylcellulose. Les témoins ont été traités par la carboxyméthylcellulose seule.

La greffe a été réalisée au huitième jour du traitement qui a été poursuivi jusqu'au rejet. Le FTS et les polypeptides retard se sont révélés capables de retarder de façon très significative le rejet des greffes de peau.

Les polypeptides actifs sont utilisables à la place de l'hormone thymique dans un but thérapeutique en raison de leur meilleure résistance aux agents de dégradation. Ces polypeptides possèdent, par conséquent, les mêmes applications thérapeutiques que l'hormone thymique naturelle et sont utiles dans le traitement de maladies d'auto-immunisation comme les maladies du genre lupus et spécifiquement pour le traitement du lupus érythémateux disséminé chez l'homme. Ces polypeptides sont utiles également pour stimuler sélectivement l'activité des. cellules T au cours de certaines infections bactériennes et virales, aiguës et chroniques, et chez les sujets vieillissants. Ces polypeptides pourraient également trouver une indication dans le traitement de certains états néoplasiques.

Les polypeptides inactifs ou très peu actifs manifestent généralement une action inhibitrice ou antagoniste de l'activité thymique et agissent sur les cellules T en les empêchant de jouer leur rôle de défense immunitaire. Ces polypeptides peuvent être utilisés pour déprimer certaines réactions immunitaires, comme dans la prévention du rejet des greffes.

Les nouveaux polypeptides de la présente invention peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire. Des véhicules appropriés qui peuvent être utilisés dans la composition comprennent, par exemple, des liquides stériles comme l'eau ou un soluté physiologique ou des substances prolongeant la durée de vie des peptides. En plus d'un véhicule, les présentes compositions peuvent aussi comprendre d'autres ingrédients tels que des stabilisateurs, des antioxydants, des agents de suspension ou des agents de conservation comme du phénol ou du chlorobutanol et les agents du même genre. La solution finie peut être stérilisée facilement par des techniques classiques de filtration.

La composition utilisée dans la présente invention contient en solution aqueuse une quantité suffisante de l'agent thérapeutique pour être médicalement utile. Les doses à administrer dépendent dans une large mesure de l'état du sujet que l'on traite et du poids de l'hôte. La voie parentérale est préférée. En général, les doses journalières utiles sont comprises entre 0,00001 mg environ et 0,1 mg environ d'ingrédient actif par kilo de poids du corps du sujet en une seule ou plusieurs applications par jour. Des doses journalières préférées sont comprises entre environ 0,0001 et 0,001 mg environ d'ingrédient actif par kilo de poids du corps. Une dose injectable particulièrement intéressante est de 0,01 mg de matière active administré chaque jour. Dans l'administration parentérale, la forme de dosage unitaire est habituellement le composé pur dans une solution aqueuse stérile ou sous la forme d'une poudre soluble prévue pour dissolution.

Les exemples suivants décrivent une composition pour administration parentérale présentée en ampoules, en flacons et en flacons à doses multiples.

Exemple 15:

Solution parentérale contenant 0,1 mg de polypeptide

Polypeptide 0,1 mg

Eau distillée stérile exempte de pyrogènes 1,0 ml

Stérilisée par filtration et conditionnée en ampoules, flacons ou flacons à doses multiples.

Exemple 16:

Ampoules contenant 0,1 mg de polypeptide lyophilisé Ampoule:

Polypeptide 0,1 mg

Ampoule:

Diluant: Eau stérile pour injection 1 ml

Des multiples appropriés des quantités ci-dessus sont utilisés suivant les besoins.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

R

3 feuilles dessins

Claims

637 111

2

REVENDICATIONS

1. Compose polypeptidique, caractérisé par la séquence (I) :

X—Gin—Gly—Gly—Y (I)

dans laquelle Y représente — Ser—Asn et X représente Ser—, Lys—Ser—, Ala—Lys—Ser, Glx—Ala—Lys—Ser — ; Glx représentant PyroGlu ou Gin; et, lorsque X représente Glx—Ala—Lys—Ser—, Y peut représenter en outre —Ser; ainsi que ses dérivés comportant un ou deux acides aminés modifiés, à l'exception du composé PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn non modifié, dérivés dans lesquels les acides aminés modifiés sont les acides aminés remplacés par leurs antipodes optiques ou bien ceux protégés par des groupes de protection temporaire ou d'activation des carboxyles des acides aminés choisis parmi les suivants: benzyloxycarbonyle, terbutyloxycarbonyle, 4,4'-diméth-oxybenzhydryle, terbutyle, méthylester, terbutylester, 2,4,5-tri-chlorophénylester, 4-nitrophénylester, N-hydroxysuccinimide-ester, acétyle, 2-nitrophénylsulfényle, pentachlorophénylester, ou ceux remplacés par d'autres acides aminés choisis parmi les suivants: Ala, Cyano—Ala, Asn, Thio—Asn, Asp, D —Lys, Orn, Lys(N6-acêtyl), Glu, D—Gin, Glu(y—cyano), Glu(y—CS—NH2), les radicaux 2-aminohexanoyle, 2,6-diaminohexynoyle et 2,6-diaminohexénoyle, D —Ser, N—méthyl—Ser, Thr, Sar, <Aad, ß—Ala—NH2, Asn—NH2, Arg, Cys(S—CONH2), Har, Hep, Leu, Met(0), Nva et Prop, et ses dérivés dans lesquels un acide aminé a été ajouté à la séquence, ou ses dérivés dans lesquels un acide aminé a été retiré de la séquence.
2. Composé polypeptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences:

Gin—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn Z—Gln—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser — Asn Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn
3. Composé polypeptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences: PyroGlu—D—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asp PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ala—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser

Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn D—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn
4. Composé polypeptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences: PyroGlu—Ala—Lys—Ala—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—D—Lys—Ser—Gin — Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys ( N6-acétyl )— Ser—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala — Orn—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys — ( N-mèthyl)Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala — Lys—A la—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—D—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys — Thr—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-G/w—Gly—Gly—Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Glu( y-cyano ) — Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Glu(y—CS— NH2) — Gly—Gly Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—D—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—A la—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Ala—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Ala—Ala—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Sar—Sar — Ser—Asn PyroGlu—Ala — ( 2-aminohexanoyl) — Ser—Gin—Gly—Gly— Ser—Asn

PyroGlu—Ala— (2,6-diaminohexynoyl) — Ser—Gin—Gly—Gly— Ser—Asn

PyroGlu—Ala — ( 2,6-diaminohexenoyl) — Ser—Gin—Gly—Gly— Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Gin

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Cyano A la PyroGlu—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser — Thio—Asn
5. Composé polypeptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences:

Lys( N6-acêtyl)— Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn

D—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn

Orn—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn

N—a—Z Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—ß — Ala—NH2

Hep—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn

Lys—Ser—Gin—D—A la—Gly—Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—D—A la—Gly—Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—D—Asn
6. Composé polypeptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences: PyroGlu—Ala—Hep—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—D—Leu—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn—NH2 PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly — Thr—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly — Gly—D—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Asn—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Nva—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu - Ala- Lys - Ser- CysfS- CONHJ - Gly-Gly -

Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Met( O)— Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—D—A la—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Sar—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—D—Leu—Ser—Asn Z— Ala—Lys — Ser—Gin—Gly—Ser—Asn D—PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn D—Gin—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn Cys (S— CONH2) — Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn Pro—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn <Aad—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Arg—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Har—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys ( N6-acêtyl) —Ser—Gin—D—Ala—Gly— Ser—Asn

PyroGlu—Ala—D—Lys( N6-acétyl) —Ser—Gin—Gly—Gly— Ser—Asn

PyroGlu—Ala—Lys(N6-acétylJ —Ser—Gin—Gly—Gly—Ser— D—Asn

Ac—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn
7. Composé polypeptidique selon la revendication 1 de séquence (I)

X—Gin—Gly—Gly—Y (I),

dans laquelle Y représente —Ser—Asn et X représente Ser—, Lys—Ser, Ala—Lys—Ser—, Glx—Ala—Lys—Ser— ; Glx représentant PyroGlu ou Gin; et, lorsque X représente Glx—Ala—Lys— Ser—, Y peut représenter en outre —Ser; à l'exception du composé PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn non modifié, caractérisé par le fait qu'un acide aminé a été ajouté à la séquence ou retiré de la séquence.
8. Composé polypeptidique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :

PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Gly—Ser—Asn PyroGlu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Ser—Asn
9. Procédé de préparation des composés polypeptidiques selon la revendication 1 de séquence (I)

X—Gin—Gly—Gly—Y (I),

caractérisé en ce qu'on effectue le couplage du composé dipeptidique Ser—Asn protégé avec le composé peptidique X—Gin—Gly—Gly protégé et qu'on élimine ensuite éventuellement les groupements protecteurs.
10. Procédé de préparation des composés polypeptidiques de séquence I selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue le couplage de PyroGlu protégé avec le composé peptidique

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

637 111

Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Y et qu'on élimine ensuite éventuellement les groupements protecteurs.
11. Utilisation du composé polypeptidique selon la revendication 1 comme agents à activité thymique ou antagoniste dans des compositions pharmaceutiques avec des véhicules pharmaceutique-ment acceptables.

L'expression séquence N-terminale entend désigner toute séquence partielle de la séquence Glx—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly— Gly—Ser—Asn dont le premier résidu d'acide aminé est Glx, et l'expression séquence C-terminale entend désigner toute séquence par-5 tielle de la séquence Glx—Ala — Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—-Asn dont le dernier résidu d'acide aminé est Asn.

Les abréviations présentement utilisées pour les acides aminés de même que pour les groupements de protection temporaire des fonctions réactives et les réactifs et solvants utilisés pour la synthèse des io peptides de l'invention sont les suivantes:

25

30

35