JPH08140680A - 組換え型ヒトｃｒｆレセプター蛋白質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ヒトＣＲＦレセプターアゴニスト／アンタゴニ
ストのスクリーニングに有用なヒトＣＲＦレセプター蛋
白質を高発現できるＣＨＯ細胞の提供。 【構成】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを保持する発現ベクター、発現ベクターを含有するＣ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分、ＣＨＯ細胞から製造さ
れる組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質またはその部
分ペプチド。該ＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分また
は組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質もしくはその部
分ペプチドを用いるヒトＣＲＦレセプターアゴニスト／
アンタゴニストのスクリーニング方法。 【効果】本発明のスクリーニング方法によれば、例え
ば、種々のストレス不適応症、不安を伴う神経症、心身
症、および関節リウマチなどの免疫系疾患の予防・治療
剤などの医薬品を早期に開発する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＣＲＦレセプター
蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクター、該
発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画
分、該ＣＨＯ細胞から製造される組換え型ヒトＣＲＦレ
セプター蛋白質またはその部分ペプチド、該ＣＨＯ細胞
または組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を用いるＣ
ＲＦレセプターアゴニスト／アンタゴニストのスクリー
ニング方法、該スクリーニング方法で得られるアゴニス
トまたはアンタゴニストおよび該アゴニストまたはアン
タゴニストを含有する医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】Corticotropin-Releasing Factor（以
下、ＣＲＦと略称する）は、はじめ１９８１年にヒツジ
視床下部から単離されたアミノ酸４１個から成るペプチ
ドで、下垂体からＡＣＴＨ／β-endorphin 分泌を促進
する活性を有する。その作用機構は、ＣＲＦが下垂体前
葉のＡＣＴＨ産生細胞（Corticotroph）などのＣＲＦ標
的細胞の細胞膜表面に存在するＣＲＦレセプターに結合
後、guanine nucleotide protein を介して adenylate
cyclase-cyclic ＡＭＰ-protein kinase 系を活性化す
ることによることが明らかにされている〔Vale, W. et
al.、サイエンス（Science）213巻、1394頁、1981
年〕。臨床的にも、合成ＣＲＦが下垂体機能低下症や C
ushing 症候群の診断に広く応用されている。一方、Ｃ
ＲＦレセプターは下垂体のみならず、大脳皮質灰白質、
大脳基底核、視床下部室傍核、中央隆起外層、脳幹大脳
神経核、オリーブ核、小脳神経核、小脳皮質、嗅索、前
障、扁桃、脊髄角など中枢神経系内に広く分布している
〔Vale, W.、コルチコトロピン・リリージング・ファク
ター（Corticotropin Releasing Factor）、172巻、1-2
1頁、1993年〕。この分布はＣＲＦニューロン終末の分
布とほとんど一致しており、ＣＲＦがこれらの部分で n
eurotransmitter あるいは neuromodulater として作用
しているものと考えられている。その他、ＣＲＦレセプ
ターは、副腎髄質、交感神経節、前立腺、脾臓、肝臓、
腎臓、睾丸、赤血球膜、脾マクロファージにも存在し、
ストレス時には、下垂体ＡＣＴＨ／β-endorphin 分泌
促進作用のみならず、これらのレセプターを介して、行
動、自律神経あるいは免疫系の反応などすべてのストレ
ス適応反応に関与しているものと推測されている。

【０００３】一般に、内因性生理活性物質に対する拮抗
薬（アンタゴニスト）や作動薬（アゴニスト）は、内因
性生理活性物質の異常に起因するさまざまな病気に対す
る医薬として利用することができる。これらアンタゴニ
ストやアゴニストを開発しようとするとき、一般には最
初に膨大な数の化合物、発酵生産物、天然物などから特
定のレセプター蛋白質に親和性を持つ物質をスクリーニ
ングして、リード化合物を選び出すことが行われてい
る。ＣＲＦレセプターとしては、現在ウシあるいはラッ
トの下垂体膜画分、マウス由来のＡｔＴ２０細胞などが
用いられているが、動物種が異なるため、これらを用い
たスクリーニングで得られた化合物がヒトに効くという
保証はない。ヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡはクローニ
ングされており、動物細胞（ＣＯＳ ７細胞〔Natalio V
ita et al.、フェブス・レターズ（FEBS Letters）、33
5巻、1-5頁、1993年〕、ＣＯＳ ６Ｍ細胞〔Ruoping Che
n et al.、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA）、90巻、8967-8971頁、1993年〕）
での発現も報告されているが、発現量は極めて低く、ま
た一過性の発現であるためスクリーニングに用いるため
のレセプター標品としては不十分で、より実用的なヒト
ＣＲＦレセプターの産生方法およびそれを用いたスクリ
ーニング方法の確立が望まれていた。

【０００４】一方、効率よくＣＲＦアゴニストやアンタ
ゴニストをスクリーニングするためには、感度がよく、
しかも大量処理が可能なスクリーニング系の構築が不可
欠である。しかし、ＣＲＦは４１個のアミノ酸残基から
なる比較的分子量の大きいペプチドであるため、結合実
験の際の反応容器やピペットなどに吸着しやすく、正確
で感度の高い測定は容易ではなかった。そのために、Ｃ
ＲＦレセプターに対するＣＲＦの特異的結合量を容易に
評価できる測定方法が求められていた。ヒトＣＲＦレセ
プター蛋白質を使用してＣＲＦレセプターのアゴニスト
／アンタゴニストをスクリーニングすることができれ
ば、実験動物を用いることの欠点（例えば、種が異なる
ことにより、ヒトに対して効果を発揮できない化合物が
得られる可能性があることなど）を克服することがで
き、ヒトに対して有効な医薬の開発が効率よく行えるよ
うになると期待される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトＣＲＦ
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベ
クター、該発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞またはそ
の細胞膜画分、該ＣＨＯ細胞から製造される組換え型ヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質またはその部分ペプチド、該
ＣＨＯ細胞または組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質
を用いるＣＲＦレセプターアゴニスト／アンタゴニスト
のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られ
るアゴニストまたはアンタゴニストおよび該アゴニスト
またはアンタゴニストを含有する医薬組成物を提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題に鑑み、ヒトに有効なＣＲＦレセプターアゴニスト／
アンタゴニストをスクリーニングする方法につき鋭意研
究した結果、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を高発現する
ＣＨＯ細胞株を製造することに成功し、そして該ＣＨＯ
細胞株を用いることにより効率よく確実にＣＲＦレセプ
ターアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングでき
ることを見いだした。さらに、本発明者らは、ＣＲＦレ
セプターアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング
方法の至適条件を明らかにすることに成功した。本発明
者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）ヒトＣＲＦレ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡを保持することを特
徴とするｐＡＣ０２で標示される発現ベクター、（２）
第（１）項記載の発現ベクターを含有することを特徴と
するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、（３）ＣＨＯ細
胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を欠損しているＣＨＯ
細胞である第（２）項記載のＣＨＯ細胞、（４）第
（２）項記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で培養す
ることを特徴とする組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白
質の製造法、（５）組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白
質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、（６）
第（５）項記載の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質
を含有するＣＨＯ細胞から単離され得る組換え型ヒトＣ
ＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩、（７）第（５）項記載のＣＨＯ細胞またはその細
胞膜画分を用いることを特徴とするヒトＣＲＦレセプタ
ーアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
法、

【０００８】（８）第（６）項記載の組換え型ヒトＣＲ
Ｆレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩を用いることを特徴とするヒトＣＲＦレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
（９）第（５）項記載のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜
画分、または第（６）項記載の組換え型ヒトＣＲＦレセ
プター蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩を
含有することを特徴とするヒトＣＲＦレセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
（１０）第（７）項もしくは第（８）項記載のスクリー
ニング方法または第（９）項記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られるヒトＣＲＦレセプターアゴニスト
またはその塩、（１１）第（７）項もしくは第（８）項
記載のスクリーニング方法または第（９）項記載のスク
リーニング用キットを用いて得られるヒトＣＲＦレセプ
ターアンタゴニストまたはその塩、（１２）第（１０）
項記載のヒトＣＲＦレセプターアゴニストまたはその塩
を含有することを特徴とするストレスに対する適応促進
剤、ＡＣＴＨ，β−エンドルフィン，β−リポトロピン
もしくはα−ＭＳＦの分泌促進剤、血圧降下剤、気分や
行動の調節剤、胃腸機能の調節剤、自律神経系の調節
剤、または下垂体，心血管系，消化管もしくは中枢神経
の機能検査薬、および（１３）第（１１）項記載のヒト
ＣＲＦレセプターアンタゴニストまたはその塩を含有す
ることを特徴とするストレスからくる鬱病・不安・頭
痛、炎症性疾患、免疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツハイマー
病、胃腸障害、食欲不振、出血性ストレス、薬物・アル
コールの禁断症状、薬物依存症、生殖障害、クッシング
病または低血圧症の予防・治療剤を提供する。

【０００９】より具体的には、本発明は、（１４）ＣＨ
Ｏ／ＨＣ２−１、ＣＨＯ／ＨＣ４−１またはＣＨＯ／Ｈ
Ｃ１４−３で標示される第（３）項記載のＣＨＯ細胞、
（１５）ＣＨＯ細胞が、第（２）項記載のＣＨＯ細胞を
ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現
が可能な条件下で培養することにより製造され得る組換
え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞
またはその細胞膜画分である第（５）項記載のＣＨＯ細
胞、（１６）組換え型ＣＲＦレセプター蛋白質が、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸
が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、または配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第
（６）項記載の組換え型ＣＲＦレセプター蛋白質、（１
７）組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質の部分ペプチ
ドが、第（６）項記載の組換え型ヒトＣＲＦレセプター
蛋白質の分子のうち、細胞膜の外に露出している部分ペ
プチドである第（６）項記載の部分ペプチド

【００１０】（１８）（ｉ）標識したＣＲＦを、第
（５）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触
させた場合と、（ii）標識したＣＲＦおよび試験化合物
を第（５）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に
接触させた場合における、標識したＣＲＦの該ＣＨＯ細
胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とする第（７）項記載のヒトＣＲＦレセ
プターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニン
グ方法、（１９）（ｉ）ＣＲＦを、第（５）項記載のＣ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、
（ii）ＣＲＦおよび試験化合物を第（５）項記載のＣＨ
Ｏ細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合におけ
る、組換え型ヒトＣＲＦレセプターを介した細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下、細胞遊走活性などを促進する活性または抑制
する活性など）を測定し、比較することを特徴とする第
（７）項記載のヒトＣＲＦレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング方法、（２０）（ｉ）
第（６）項記載の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＣＲＦを接
触させた場合と（ii）第（６）項記載の組換え型ヒトＣ
ＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩に、ＣＲＦおよび試験化合物を接触させた場合との
比較を行なうことを特徴とする第（８）項記載のヒトＣ
ＲＦレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、

【００１１】（２１）（ｉ）標識したＣＲＦを第（６）
項記載の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合と、（i
i）標識したＣＲＦおよび試験化合物を第（６）項記載
の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩に接触させた場合における、標識
したＣＲＦの該組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測
定し、比較することを特徴とする第（８）項記載のヒト
ＣＲＦレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのス
クリーニング方法、（２２）スクリーニング方法におい
て使用するＣＲＦとヒトＣＲＦレセプターとの反応バッ
ファーが、約０.０１〜０.２％ ＣＨＡＰＳ、約０.０１
〜０.３％ ジギトニン、約０.０１〜５％ ＢＳＡまたは
（および）約０.０１〜５％ ゼラチンを含有する反応バ
ッファーであることを特徴とする第（１８）項、第（２
０）項または第（２１）項記載のスクリーニング方法、
（２３）スクリーニング方法における反応温度が約２５
℃である第（１８）項、第（２０）項、第（２１）項ま
たは第（２２）項記載のスクリーニング方法、および
（２４）スクリーニング方法における反応時間が約２時
間である第（１８）項、第（２０）項、第（２１）項、
第（２２）項または第（２３）項記載のスクリーニング
方法を提供する。

【００１２】本発明において、ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクターを作製
する場合、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが用いられてい
るが、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質またはヒトＣＲＦレ
セプター蛋白質と実質的に同等のリガンド結合活性を有
する部分ペプチドをコードする塩基配列を有するもので
あれば、必ずしもこれに制約されるものではない。例え
ば、公知のヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡやゲノムＤＮＡなどを用いることができるが、合
成ＤＮＡなどであってもよい。具体的には、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列を有するヒトＣＲＦレセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられ、具体的に
は、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するｃＤＮ
Ａ〔図１〕などが挙げられる。これらのＤＮＡは、それ
自体公知の遺伝子工学的手法を用いてクローニングする
ことができるし、あるいはヌクレオチド合成装置を用い
て製造することもできる。例えば、後述する参考例１の
方法あるいはそれに準ずる方法に従ってクローニングす
ることもできる。

【００１３】発現ベクターとしては、例えば、ｐＡＫＫ
Ｏ１．１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩＮｅｏなどが用いられ、なかでもｐＡ
ＫＫＯ１．１１などが好ましい。プロモーターとして
は、宿主となる細胞で効率よく機能するものであれば何
でもよく、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモータ
ー、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、ＳＲαプロモーター、
ＲＳＶプロモーターなどが挙げられ、なかでもＣＭＶプ
ロモーター、ＳＲαプロモーター、ＲＳＶプロモーター
などが好ましく、特にＳＲαプロモーターが好ましい。
発現ベクターには、以上の他にエンハンサー、スプライ
シングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等
を含有しているものを用いるのが好ましい。選択マーカ
ーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと
略称する場合がある）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
〔Ｇ４１８耐性〕などが挙げられ、なかでもＤＨＦＲ遺
伝子などが好ましい。特に、ＤＨＦＲ遺伝子が欠損して
いるＣＨＯ細胞を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカ
ーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっ
ても選択できる。

【００１４】本発明のヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡを保持する発現ベクターとしては、具体
的には、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａの上流に前記のプロモーター（特に、ＣＭＶプロモー
ター、ＳＲαプロモーター、ＲＳＶプロモーターなど）
を挿入し、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡの下流にポリＡ付加シグナルを挿入し、その下流に
ＤＨＦＲ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択マ
ーカーを挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐性遺
伝子を挿入したものなどが好ましい。より具体的には、
例えばヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮＡ
の上流にＳＲαプロモーターを挿入し、ヒトＣＲＦレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡの下流にポリＡ付加シ
グナルを挿入し、その下流にＤＨＦＲ遺伝子を挿入し、
さらにその下流にアンピシリン耐性遺伝子を挿入したｐ
ＡＣ０２で標示される発現ベクター〔図２〕、ヒトＣＲ
Ｆレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの上流にＣＭＶ
プロモーターを挿入し、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡの下流にポリＡ付加シグナルを挿入
し、その下流にネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さら
にその下流にアンピシリン耐性遺伝子を挿入したｐＡＣ
０２−ＣＭＶで標示される発現ベクター〔図３〕、ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの上流にＲ
ＳＶプロモーターを挿入し、ヒトＣＲＦレセプター蛋白
質をコードするＤＮＡの下流にポリＡ付加シグナルを挿
入し、その下流にネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さ
らにその下流にアンピシリン耐性遺伝子を挿入したｐＡ
Ｃ０２−ＲＳＶで標示される発現ベクター〔図４〕など
が好ましく、なかでもｐＡＣ０２で標示される発現ベク
ター〔図２〕などが好適である。

【００１５】このようにして作製したヒトＣＲＦレセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクター
を宿主細胞に導入することによって、ヒトＣＲＦレセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを高発現できる細胞を作
製することができる。宿主細胞としては、動物細胞が好
ましく、例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、ミ
エローマ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞、Ｓｐ-２／Ｏ細胞などが挙げられ、なかでもＣＨＯ
細胞またはＳｐ-２／Ｏ細胞などが好ましく、特にＣＨ
Ｏ細胞などが好適である。さらに、ＣＨＯ細胞のなかで
も、特にＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞（以
下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略称する場合があ
る）、ＣＨＯ Ｋ−１細胞などが好ましい。特に、発現
ベクター中にＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして挿入
する場合は、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞が好適である。
発現ベクターと宿主細胞の組み合わせとしては、適宜好
ましい組み合わせを選択することができるが、例えば、
ｐＡＣ０２で標示される発現ベクター〔図２〕の宿主細
胞としてはＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞などが好適であ
り、ｐＡＣ０２−ＣＭＶで標示される発現ベクター〔図
３〕およびｐＡＣ０２−ＲＳＶで標示される発現ベクタ
ー〔図４〕の宿主細胞としてはＣＨＯ Ｋ−１細胞など
が好適である。

【００１６】発現ベクターの宿主細胞への導入方法とし
ては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法〔Graha
m, F. L. and van der Eb, A. J. ヴィロロジー(Virolo
gy) 52, 456-467 (1973)〕、電気穿孔法〔Neumann, E.
et al. エンボ・ジャーナル(EMBO J.) 1, 841-845 (198
2)〕等が用いられる。ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を高
発現できる細胞は、上記の発現ベクターが染色体に組込
まれた細胞をクローン選択によって選択することによっ
て得ることができる。具体的には、まず、上記の選択マ
ーカーを指標として形質転換体を選択する。さらに、こ
のようにして選択マーカーを用いて得られた形質転換体
に対して、繰り返しクローン選択を行うことにより、ヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質の高発現能を安定に有する細
胞株を得ることができる。また、ＤＨＦＲ遺伝子を選択
マーカーとして用いた場合、メソトレキセート（ＭＴ
Ｘ）の濃度を漸次上げて培養して耐性細胞を選択するこ
とにより、導入遺伝子を細胞内で増幅することにより、
さらに高発現の細胞株を得ることもできる。なお、宿主
としてＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いた場合であって
も、例えばｐＡＣ０２で標示される発現ベクターにはＤ
ＨＦＲ遺伝子が導入されているので〔図２〕、ｐＡＣ０
２で標示される発現ベクターを含有するＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞は、結果として、ＤＨＦＲ遺伝子を有してい
ることになる。本願明細書においては、ＤＨＦＲ遺伝子
を含有する発現ベクター（例えば、ｐＡＣ０２など）を
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞に含有せしめて得られるＣＨ
Ｏ細胞を「ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞」と表記する場合
がある。

【００１７】本発明において、ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを高発現できる細胞としては、
例えば、後述する実施例１で得られるｐＡＣ０２で標示
される発現ベクターをＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞に含有
せしめて得られるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞などが挙げ
られる。具体的には、ＣＨＯ／ＨＣ２−１で標示される
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞、ＣＨＯ／ＨＣ４−１で標示
されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞、ＣＨＯ／ＨＣ１４−
３で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺）細胞などが挙げら
れ、なかでもＣＨＯ／ＨＣ２−１で標示されるＣＨＯ
（ｄｈｆｒ⁺）細胞などが好適である。これらのＣＨＯ
（ｄｈｆｒ⁺）細胞は、天然のＣＲＦレセプター蛋白質
を含有する組織（例えば、ラットの脳など）に比べて約
１０〜３００倍、好ましくは約２００倍〜３００倍のレ
セプター活性（例えば、リガンド結合活性など）を有す
るものである。本発明のヒトＣＲＦレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを保持する発現ベクターを含有する細
胞を、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮＡ
の発現が可能な条件下で培養することにより組換え型ヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質を製造することができる。

【００１８】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡを保持する発現ベクターを含有する細胞を培養す
る際、培地としては約０.５〜２０％のウシ胎児血清を
含むＥＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培
地、α-ＭＥＭ培地などが挙げられる。特に、ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞およびＤＨＦＲ選択マーカー遺伝子
を用いる場合、チミジンを含まない透析ウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地あるいはα-ＭＥＭ培地を用いるのが
好ましい。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は、通常約３０〜４０℃で、約１５〜２００時間行い、
必要に応じて培地の交換、通気、撹拌などを加える。こ
のようにして、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを保持する発現ベクターを含有する細胞から組
換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有する細胞を製
造することができる。

【００１９】組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含
有する細胞の細胞膜画分は、上記の組換え型ヒトＣＲＦ
レセプター蛋白質を含有する細胞を破砕した後、それ自
体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこ
とをいう。細胞の破砕方法としては、例えば、Potter−
Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワー
リングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）によ
る破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧
しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破
砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離
法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主
として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００
ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１
０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜
３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得ら
れる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋
白質などの膜成分が多く含まれる。本発明の組換え型ヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質を含有する細胞やその細胞膜
画分中のヒトＣＲＦレセプター蛋白質の量は、１細胞当
たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１
０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほ
ど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くな
り、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか
りでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるように
なる。

【００２０】上記で得られた組換え型ヒトＣＲＦレセプ
ター蛋白質を含有する細胞から組換え型ヒトＣＲＦレセ
プター蛋白質を単離するには、例えば下記の方法により
行なうことができる。組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質を細胞から抽出するのに際しては、培養後、公知の
方法で細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、ホモジナイザーまたは凍結融解などによって細胞を
破壊したのち、遠心分離やろ過により組換え型ヒトＣＲ
Ｆレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用
いられる。緩衝液の中にＰＭＳＦ、ペプスタチン、ロイ
ペプチンなどの蛋白分解酵素阻害剤や、ＣＨＡＰＳ、ジ
ギトニン、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭ
と省略することがある。）などの界面活性剤が含まれて
いてもよい。得られた抽出液中に含まれる組換え型ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質の精製は、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これら
の公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法など
の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ
過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性
を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなど
の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの
等電点の差を利用する方法などが用いられる。

【００２１】かくして得られる組換え型ヒトＣＲＦレセ
プター蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の
方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換するこ
とができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あ
るいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に
変換することができる。なお、組換え体が産生する組換
え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を、精製前または精製
後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意
に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去するこ
ともできる。蛋白修飾酵素としては、トリプシン、キモ
トリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイ
ンキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。以上の
ごとく、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを保持する発現ベクターを含有する細胞を、ヒトＣＲ
Ｆレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な
条件下で培養することにより製造され得る組換え型ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質は、天然型のヒトＣＲＦレセプ
ター蛋白質と実質的に同質の活性を有するものである。
実質的に同質の活性としては、例えばリガンド結合活
性、シグナル情報伝達などが挙げられる。リガンド結合
活性としては、ヒトＣＲＦ、ヒツジＣＲＦ、またはα−
helical ＣＲＦ（９−４１）などのアンタゴニストなど
との結合活性が挙げられる。実質的に同質とは、リガン
ド結合活性などが性質的に同質であることを示す。した
がって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプタ
ー蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。

【００２２】本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質の具体例としては、例えば配列番号：１で表わされ
る塩基配列を有するｃＤＮＡを発現させて製造される配
列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する組換え型
ヒトＣＲＦレセプター蛋白質などが挙げられる。さら
に、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１また
は２個以上のアミノ酸が欠失したもの、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸
が付加したもの、配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置
換されたものなどが挙げられる。さらに、これら組換え
型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質は、Ｎ末端のシグナルペ
プチドが切断されていてもよいし、分子内のアミノ酸の
側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ_1-6アシル基など）で保護されていてもよい
し、あるいは糖鎖などが結合していてもよい。

【００２３】本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質の塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付
加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明の組換
え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質の部分ペプチドとして
は、例えば、本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質の分子のうち、細胞膜の外に露出している部位など
が用いられる。具体的には、疎水性プロット解析におい
て細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると
分析された部分ペプチドである。また、疎水性（Hydrop
hobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いること
ができる。さらに、個々のドメインを個別に含むペプチ
ドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分ペプ
チドでもよい。本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター
蛋白質の部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的
に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いら
れる。

【００２４】本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチ
ドの合成法に従って、あるいは本発明の組換え型ヒトＣ
ＲＦレセプター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断する
ことによって製造することができる。ペプチドの合成法
としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部
分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、
生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することに
より目的のペプチドを製造することができる。公知の縮
合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の〜
に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００２５】本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、ある
いは単離した組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質、そ
の部分ペプチドまたはそれらの塩は、ヒトＣＲＦレセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
に有用である。すなわち、本発明は、 （１）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＣＲＦを
接触させた場合と（ii）本発明の組換え型ヒトＣＲＦレ
セプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
に、ＣＲＦおよび試験化合物を接触させた場合との比較
を行なうことを特徴とするヒトＣＲＦレセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、およ
び （２）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、Ｃ
ＲＦを接触させた場合と（ii）本発明の組換え型ヒトＣ
ＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその
細胞膜画分に、ＣＲＦおよび試験化合物を接触させた場
合との比較を行なうことを特徴とするヒトＣＲＦレセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
方法を提供する。 具体的には、本発明のスクリーニング方法においては、
（ｉ）と（ii）の場合における、例えば該組換え型ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプチドもしくはそ
れらの塩、または組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質
を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に対する
ＣＲＦの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較す
ることを特徴とするものである。

【００２６】より具体的には、本発明は、 （１ａ）（ｉ）標識したＣＲＦを、本発明の組換え型ヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩に接触させた場合と、（ii）標識したＣＲＦお
よび試験化合物を、本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプ
ター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触
させた場合における、標識したＣＲＦの該レセプター蛋
白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合
量を最適化した方法で測定し、比較することを特徴とす
るヒトＣＲＦレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニング方法 （２ａ）（ｉ）標識したＣＲＦを、本発明の組換え型ヒ
トＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞または
その細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）標識したＣ
ＲＦおよび試験化合物を、本発明の組換え型ヒトＣＲＦ
レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞
膜画分に接触させた場合における、標識したＣＲＦの該
ＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を最適
化した方法で測定し、比較することを特徴とするヒトＣ
ＲＦレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、および

【００２７】（２ｂ）（ｉ）ＣＲＦを、本発明の組換え
型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞ま
たはその細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ＣＲＦ
および試験化合物を、本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセ
プター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画
分に接触させた場合における、ヒトＣＲＦレセプターを
介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセ
チルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡ
ＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進
する活性または抑制する活性など）を測定し、比較する
ことを特徴とするヒトＣＲＦレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。 上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法に
おいて、組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質に結合し
て、ＣＲＦと組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質との
結合を阻害する化合物がヒトＣＲＦレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストとして選択できる。

【００２８】さらに、上記（２ｂ）のスクリーニング方
法において、ヒトＣＲＦレセプターに結合し、該レセプ
ターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細
胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活
性、ホルモン分泌などを促進する活性または抑制する活
性など）を有する化合物をヒトＣＲＦレセプターアゴニ
ストとして選択することができる。一方、上記の（１
ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、Ｃ
ＲＦと組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質との結合を
阻害する活性が認められた試験化合物の中で、該細胞刺
激活性を有しない化合物をヒトＣＲＦレセプターアンタ
ゴニストとして選択することができる。アゴニストまた
はアンタゴニスト活性の指標となるホルモンとしては、
例えば、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、α−ＭＳＨな
どが挙げられる。本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプタ
ー蛋白質を含有するＣＨＯ細胞が得られる以前は、ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質を高発現できる動物細胞がなか
ったため、ヒトＣＲＦレセプターアゴニストまたはアン
タゴニストを効率良くスクリーニングすることができな
かった。

【００２９】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。本発明のスクリーニング方法におい
て、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞
を用いる場合、該ＣＨＯ細胞をグルタルアルデヒド、ホ
ルマリンなどで固定化することができる。固定化方法
は、それ自体公知の方法に従って行うことができる。リ
ガンドとして使用するＣＲＦとしては、市販のものなど
を用いることができる。また、ＣＲＦの代わりに、公知
のＣＲＦレセプターアゴニストやアンタゴニストなどを
使用することもできる。標識したＣＲＦとしては、例え
ば、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標
識したＣＲＦなどを用いることができ、さらには、〔³
Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した
公知のＣＲＦアゴニストやアンタゴニストなどを用いる
こともできる。例えば、〔¹²⁵Ｉ〕で標識されたヒツジ
・ＣＲＦ（ＮＥＮ Research Products社、ＮＥＸ−２１
７）やヒト・ＣＲＦ（ＮＥＮ Research Products社、Ｎ
ＥＸ−２１６）などが好適である。試験化合物として
は、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動
物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化
合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。

【００３０】具体的には、上記の（１ａ）または（２
ａ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発
明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分、あるいは組換え型ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質またはその部分ペプチドを、ス
クリーニングに適した反応バッファーに懸濁することに
よりレセプター標品を調製する。反応バッファーには、
ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）で約１ｍ
Ｍ〜２００ｍＭ（好ましくは、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ）
のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、
ＣＲＦとレセプターとの結合を阻害しないバッファーで
あればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させ
る目的で、約０.０１〜０.２％（好ましくは、約０.０
１〜０.０５％）のＣＨＡＰＳ、約０.０１〜０.３％
（好ましくは、約０.０５％）のジギトニンなどの界面
活性剤をバッファーに加えることもできる。また、これ
とは別に、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、
デオキシコレートなどの界面活性剤を加えてもよい。さ
らに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解
を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシ
ン、アプロチニン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペ
プスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することも
できる。さらに、蛋白質成分として、約０.０１〜５％
（好ましくは、０．１〜１％）のＢＳＡ、約０.０１〜
５％（好ましくは、０.０５〜０.５％）のゼラチンなど
を加えることもできる。

【００３１】従来、ＣＲＦは４１個のアミノ酸からなる
比較的分子量の大きいペプチドであるため、リガンド結
合実験の際の反応容器やピペットなどに吸着しやすく、
正確で感度の高い測定は容易ではなかった。そこで、本
発明の上記（１ａ）および（２ａ）のスクリーニング方
法において、ＣＲＦの特異的結合量を測定するための反
応条件としては、本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプタ
ー蛋白質またはその部分ペプチド、あるいは本発明の組
換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細
胞またはその細胞膜画分にＣＲＦを接触させる際の反応
バッファーの組成、反応時間、反応温度などをそれぞれ
適切に設定することが望ましい。後述の実施例４および
実施例５に記載したとおり、反応バッファーの組成中に
非特異的結合を低減させる目的で、界面活性剤や蛋白質
を添加することが効果的で、特に界面活性剤としては、
例えば約０.０１〜０.０５％のＣＨＡＰＳ、約０.０５
％のジギトニンを添加することが望ましい。また、蛋白
質成分としては、例えば、約０.２％のＢＳＡまたは約
０.３％のゼラチンを添加することが望ましい。また、
反応温度と反応時間としては、それぞれ約２５℃、約２
時間であることが望ましい。

【００３２】一方、上記スクリーニング方法に組換え型
ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を用
いる場合、培養器に付着させたまま、つまりＣＨＯ細胞
を生育させた状態で、あるいはグルタルアルデヒドやパ
ラホルムアルデヒドで固定化した細胞を用いて、ＣＲＦ
とＣＲＦレセプター蛋白質を結合させることができる。
この場合、該反応バッファーとしては、例えば培地やハ
ンクス液などが用いられる。そして、０.０１ｍｌ〜１
０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（例えば、２２０
０Ｃｉ／ｍｍｏｌの場合、約１００００ｃｐｍ〜１００
００００ｃｐｍ）の標識したＣＲＦ（例えば、
〔¹²⁵Ｉ〕ＣＲＦ）を添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10
Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳ
Ｂ）を知るために大過剰の未標識のＣＲＦを加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾
過し、適量の洗浄用バッファーで洗浄した後、ガラス繊
維濾紙に残存する放射活性（例えば、〔¹²⁵Ｉ〕の量）
を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンタ
ーで測定する。濾過には、マニホールドやセルハーベス
ターを用いることができるが、セルハーベスターを用い
ることが大量の試験化合物を処理するためには望まし
い。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特
異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳ
Ｂ）を１００％とした時、試験化合物を入れた時の特異
的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えばカウント（Ｂ₀−Ｎ
ＳＢ）の５０％以下になる試験化合物をアゴニストまた
はアンタゴニスト候補化合物として選択することができ
る。

【００３３】また、上記（２ｂ）のスクリーニング方法
を実施するためには、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を介
する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進す
る活性または抑制する活性など）を公知の方法または市
販の測定用キットを用いて測定することができる。具体
的には、まず、組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を
含有するＣＨＯ細胞をマルチウェルプレート等に培養す
る。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮
な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファー
に交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュ
ベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、
生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞
刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰやアラキ
ドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によっ
て検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加
してアッセイを行なってもよい。

【００３４】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣ
ＨＯ細胞またはその細胞膜画分、あるいは本発明の組換
え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプチドま
たはその塩を含有するものである。本発明のスクリーニ
ング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質標品 組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ
細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、
３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識ＣＲＦ 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したＣＲＦ溶液の状態のものを４℃あるいは−２０
℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて５ｎＭに希釈す
る。 ＣＲＦ標準液 ＣＲＦを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃
で保存する。

【００３５】〔測定法〕 １２穴組織培養用プレートにて培養した組換え型ヒト
ＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を、測定
用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用
緩衝液を各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、５ｎＭ標識ＣＲＦを５μｌ加え、室温にて１時間反
応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の
かわりに１０^-4ＭのＣＲＦを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識ＣＲＦを０．５ｍｌの０.２Ｎ
ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチ
レーターＡ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。なお、
〔^{1 25}Ｉ〕で標識されている場合は、液体シンチレータ
ーと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定
できる。

【００３６】

【数１】 ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００３７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、ＣＲＦと本発明の組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋
白質との結合を阻害する化合物であり、具体的には、ヒ
トＣＲＦレセプターを介して細胞刺激活性を有する化合
物またはその塩（いわゆる、ヒトＣＲＦレセプターアゴ
ニスト）、あるいは該細胞刺激活性を有しない化合物ま
たはその塩（いわゆる、ヒトＣＲＦレセプターアンタゴ
ニスト）である。ヒトＣＲＦレセプターアゴニストは、
ＣＲＦが有する生理活性の全部または一部を有している
ので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物と
して有用である。例えば、ストレスに対する適応促進
剤、ＡＣＴＨ，β−エンドルフィン，β−リポトロピン
もしくはα−ＭＳＦの分泌促進剤、血圧降下剤、気分や
行動の調節剤、胃腸機能の調節剤、自律神経系の調節
剤、下垂体，心血管系，消化管もしくは中枢神経の機能
検査薬などとして有用である。一方、ヒトＣＲＦレセプ
ターアンタゴニストは、ＣＲＦが有する生理活性の全部
または一部を抑制することができるので、該生理活性を
抑制する安全で低毒性な医薬組成物として有用である。
例えば、ストレスからくる鬱病・不安・頭痛、炎症性疾
患、免疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、胃腸障
害、食欲不振、出血性ストレス、薬物・アルコール等の
禁断症状、薬物依存症、生殖障害、クッシング病、低血
圧症の予防・治療剤などとして有用である。

【００３８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはア
ンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って実施することができる。例えば、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に
認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、
安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施
に要求される単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は指
示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので
ある。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添
加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方す
ることができる。

【００３９】注射用の水溶液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、
Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム
など）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばア
ルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（た
とえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補
助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど
と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩
衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩
化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤
（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコー
ルなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェ
ノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整
された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。こ
のようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、
例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒ
ト）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
である。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異
なるが、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００４０】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン

【００４１】Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン

【００４２】後述の実施例１で得られたプラスミドｐＡ
Ｃ０２を保持する形質転換体 エシェリヒア コリ
（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＡＣ０２は、平
成６年１１月１１日から通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４８８９として寄託されており、また平成６年１１月
１１日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １
５７５９として寄託されている。後述の実施例２で得ら
れた形質転換体 ＣＨＯ／ＨＣ２−１は、平成６年１１
月１１日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８７
として寄託されており、また平成６年１１月１５日から
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ ５０４４８と
して寄託されている。

【００４３】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明がそれに限定される
ものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、成書（Maniatisら、モレキュラー・クローニング
〔Molecular Cloning〕、ColdSpring Harbor Laborator
y、1989年）に記載されている方法に従った。

【００４４】

【参考例１】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質ｃＤＮＡのク
ローニング 公知のヒトＣＲＦｃＤＮＡの塩基配列〔Chen, R. et a
l. プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA）、90巻、8967-8971頁、1993年〕に基づ
き、ＤＮＡオリゴマーＰＴ-５およびＰＴ-６を合成し
た。ＰＴ-５は、５'−ＧＧＴＣＧＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧ
ＧＧＡＧＧＧＣＡＣ−３'（配列表の配列番号：３）で
あり、５'末端に制限酵素ＳａｌＩの認識配列と−５〜
＋１２（翻訳開始部位を＋１とする）のセンス配列を含
むオリゴマーである。ＰＴ-６は、５'−ＧＧＴＣＧＡＣ
ＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣ−３'（配
列表の配列番号：４）であり、５'末端に制限酵素Ｓａ
ｌＩの認識配列と＋１２６４〜＋１２８３のアンチセン
ス配列を含むオリゴマーである。ヒト下垂体ｃＤＮＡ
（クロンテック社、カタログ番号7173-1）を鋳型として
用いた。該ｃＤＮＡ１ｎｇに上記ＤＮＡオリゴマーをそ
れぞれ２５pmolずつ加え、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造（株））２.５単位を用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行なった。反応液組成は、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼに添付された指示書に従った。

【００４５】反応条件は、９４℃で３０秒間、５２℃で
２０秒間、７２℃で６０秒間を１サイクルとして、３０
サイクル繰り返した。反応液を１％アガロースゲルで電
気泳動したところ、目的とするサイズ（約１.３ｋｂ）
のＤＮＡ断片が特異的に増幅されていた。該ＤＮＡ断片
をアガロースゲルから常法にしたがって回収し、Ｈｉｎ
ｃIIサイトで開裂したｐＵＣ１１８に接続し、宿主細胞
であるエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０
９に形質転換した。該ＤＮＡ断片を含むプラスミドを有
する形質転換体を２株（Ｎｏ.４８およびＮｏ.４９）選
抜し、蛍光色素を用いた自動塩基配列解析装置３７３Ａ
（アプライドバイオシステムズ社）で挿入ＤＮＡ断片の
塩基配列を確認したところ、Ｎｏ.４８株のBsrGI-AccII
I断片の配列中に２カ所の点変異が存在したので、該Ｄ
ＮＡ断片には変異がなかったＮｏ.４９株のBsrGI-AccII
I断片、およびＮｏ.４８株のBsrGI-AccIII断片を除いた
残りの断片を、それぞれアガロースゲル電気泳動で精製
し、これらをライゲーション反応で繋げたプラスミドを
構築した。該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を
確認したところ、前記のChenらの報告に記載されたヒト
ＣＲＦｃＤＮＡの塩基配列と完全に一致するＤＮＡ断片
を有するクローン（Ｎｏ.４８４９）が得られた。Ｎｏ.
４８４９の塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸
配列を〔図１〕に示した。

【００４６】

【実施例１】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質ｃＤＮＡの発
現プラスミドの構築 ＣＨＯ細胞での発現ベクターとしては、ｐＡＫＫＯ１．
１１を用いた。ｐＡＫＫＯ１．１１は次のようにして構
築した。特開平５−０７６３８５公報に記載のｐＴＢ１
４１７からＨｉｎｄIIIおよびＣｌａＩ処理によってＳ
ＲαプロモーターおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルを含む
１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、ｐＴＢ３４８
〔Naruo, K. et al. バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioche
m. Biophys. Res. Commun.）128巻,256-264頁(1985)〕
からＣｌａＩおよびＳａｌＩ処理によりジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む４．５ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。これらのＤＮＡ断片をＴ４ポリメラーゼ処理
により末端を平滑末端にした後、Ｔ４リガーゼにより連
結し、ｐＡＫＫＯ１．１１プラスミドを構築した。次
に、参考例１で得られたヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡ
断片を有するプラスミド ５μｇを制限酵素ＳａｌＩで
消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ヒト
ＣＲＦレセプターをコードする１．３ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。そして、上記の発現ベクターｐＡＫＫＯ
１．１１（５．５ｋｂ）１μｇをＳａｌＩで消化し、ヒ
トＣＲＦレセプターｃＤＮＡ断片を挿入するためのクロ
ーニング部位を作製した。該発現ベクター断片と１．３
ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
し、反応液を塩化カルシウム法にて大腸菌ＪＭ１０９に
導入し、形質転換体の中からヒトＣＲＦレセプターｃＤ
ＮＡ断片がプロモーターに対して順方向に挿入された発
現プラスミドｐＡＣ０２を得た〔図２〕。この形質転換
体をエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０
９／ｐＡＣ０２と標示する。

【００４７】

【実施例２】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質ｃＤＮＡのＣ
ＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞への導入と発現 ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞１×１０⁶細胞を、直径８cmの
シャーレを用いて、１０％ウシ胎児血清を含むハムＦ１
２培地で２４時間培養し、この細胞に実施例１で得たヒ
トＣＲＦレセプターｃＤＮＡ発現プラスミドｐＡＣ０２
１０μｇをリン酸カルシウム法（Cell Phect Transfec
tion Kit；Pharmacia）で導入した。導入２４時間後、
培地を１０％透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に換
えて、本培地でコロニーを形成する細胞（すなわち、Ｄ
ＨＦＲ⁺細胞）を選択した。さらに、選択された細胞を
限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒト
ＣＲＦレセプターを発現する細胞株を複数得た。上記の
細胞株のうち、ＣＨＯ／ＨＣ２−１、ＣＨＯ／ＨＣ４−
１、ＣＨＯ／ＨＣ１４−３株のＣＲＦレセプター蛋白質
活性を以下の方法で測定した。ヒトＣＲＦレセプターｃ
ＤＮＡ発現細胞株（ＨＣ２−１、４−１、１４−３株）
を測定用緩衝液〔１０ｍＭ トリス-塩酸、１ｍＭ ＥＧ
ＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、０.３％ ゼラチン、
４μｇ／ｍｌ Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、０.１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、０.０３％ ＮａＮ₃、０.１％CHAPS(pH7.５）〕で希
釈し、細胞数を２００μｌあたり２×１０⁴個に調整し
た。２００μｌをチューブに分注し、５ｎＭ〔¹²⁵Ｉ〕-
ヒツジＣＲＦ（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，NEN Research
Products）２μｌを添加し、２５℃、６０分間インキ
ュベーションした。また、非特異的結合量（ＮＳＢ）を
測定するために、ヒトＣＲＦ（１０^-4Ｍ）２μｌを加え
たチューブもインキュベーションした。洗浄用緩衝液
〔５０ｍＭ トリス-塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩
化マグネシウム（ｐＨ７.５）〕（１.５ｍｌ）を添加
し、ＧＦ／Ｆガラス繊維濾紙（Whatman社）で濾過、さ
らに同緩衝液（１.５ｍｌ）で洗浄した。濾紙の
〔¹²⁵Ｉ〕をγ-カウンターで測定した。結果を〔表１〕
に示す。

【００４８】

【表１】 〔表１〕より、ＨＣ２−１株が最も高い発現量を示すこ
とが判明した。

【００４９】

【実施例３】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣ
ＨＯ細胞膜画分の調製およびＣＲＦ結合活性の測定 実施例２で得たヒトＣＲＦレセプター発現ＣＨＯ細胞
（ＣＨＯ／ＨＣ２-１）、１５０ｃｍ²のフラスコ４枚分
を０.０２％ ＥＤＴＡを添加したリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ-ＥＤＴＡ）で回収し、３,０００ｒｐｍで５分
間遠心した。細胞のペレットに細胞用ホモジネートバッ
ファー〔１０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃，１ｍＭＥＤＴＡ，０.
５ｍＭ ＰＭＳＦ，２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン，４μ
ｇ／ｍｌＥ-６４，１μｇ／ｍｌ ペプスタチン〕を５ｍ
ｌ加え、ポリトロンホモジナイザーを用いて細胞を破砕
（２０,０００ｒｐｍ、２０sec×３回）した。次に、
３,０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清をさらに
３０,０００ｒｐｍで１時間遠心した。膜画分の沈殿物
に懸濁バッファー〔２０ｍＭ トリス-塩酸（ｐＨ７.
４），０.２５Ｍ シュクロース，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０.
５ｍＭ ＰＭＳＦ，２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１μ
ｇ／ｍｌ ペプスタチン〕を５ml加え、分注して、−８
０℃で保存し、使用の都度、解凍して用いた。

【００５０】該細胞膜画分のＣＲＦレセプター活性は、
以下の方法で測定した。測定用緩衝液〔１０ｍＭ トリ
ス-塩酸（ｐＨ７.５），１ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ 塩化
マグネシウム，０.３％ ゼラチン，２０μｇ／ｍｌ ロ
イペプチン，１μｇ／ｍｌ ペプスタチン，４μｇ／ｍ
ｌ Ｅ-６４，０.１ｍＭ ＰＭＳＦ，０.０３％ Ｎａ
Ｎ₃，０.１％ ＣＨＡＰＳ〕で膜画分を懸濁し、同緩衝
液で希釈して蛋白量が２００μｌ当たり１μｇから１０
０μｇになるように調製した。各２００μｌをチューブ
に分注し、５ｎＭの〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦを２μｌ添
加し、２５℃、６０分間インキュベーションした。非特
異的結合（ＮＳＢ）を測定するために同時に１００μＭ
のヒトＣＲＦを２μｌ添加したチューブもインキュベー
ションした。洗浄用緩衝液〔５０ｍＭ トリス-塩酸（ｐ
Ｈ７.５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ塩化マグネシウ
ム〕を１.５ｍｌ加え、ＧＦ／Ｆガラス繊維濾紙（Whatm
an 社）で濾過し、さらに同緩衝液（１.５ｍｌ）で洗浄
した。γ-カウンターを用いて、濾紙に残存する
〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの放射活性を測定した。その結
果を〔図５〕に示す。〔図５〕において、−○−は全結
合量を、−□−は非特異的結合量を、−●−は特異的結
合量をそれぞれ示す。この結果、ヒトＣＲＦレセプター
がＣＨＯ細胞の膜表面に十分量発現していることが確認
された。

【００５１】

【実施例４】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質の結合実験の
至適化（チューブ法） 組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を用いて、高感度
なスクリーニング系を構築するために、反応溶液として
チューブを使用する時の結合実験の至適化を行った。結
合反応の条件として、測定用緩衝液のｐＨ、界面活性
剤、反応温度と時間を検討した。ｐＨの検討は次のよう
にして行った。実施例３に記載の測定用緩衝液でトリス
-塩酸のｐＨを５.５から９まで変えた緩衝液で膜画分を
懸濁し、同緩衝液で希釈して蛋白量が２００μｌ当たり
２μｇになるように調製した。各２００μｌをチューブ
に分注し、５ｎＭの〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦを２μｌ添
加し、２５℃で６０分間インキュベーションした。非特
異的結合（ＮＳＢ）を測定するために同時に１００μＭ
のヒトＣＲＦを２μｌ添加したチューブもインキュベー
ションした。反応後、実施例３に記載の方法でＧＦ／Ｆ
ガラス繊維濾紙（Whatman 社）で濾過した後に、γ-カ
ウンターを用いて、濾紙に残存する〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣ
ＲＦの放射活性を測定した。その結果を〔図６〕に示
す。〔図６〕において、−●−は特異的結合量を示す。
この結果、ｐＨ６から７の弱酸性がヒトＣＲＦレセプタ
ーの特異的結合量の至適範囲であった。よって、弱酸性
付近では緩衝能の弱いトリス-塩酸バッファーに変え
て、緩衝能の強い２０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７.
０）を使用することとした。界面活性剤の検討は次のよ
うに行った。測定用緩衝液〔２０ｍＭ Ｎａ-リン酸バッ
ファー，１ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ 塩化マグネシウム，
０.３％ ゼラチン，２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１
μｇ／ｍｌ ペプスタチン，４μｇ／ｍｌ Ｅ-６４，０.
１ｍＭ ＰＭＳＦ，０.０３％ ＮａＮ₃（ｐＨ７.０）〕
にＣＨＡＰＳまたはジギトニンまたはその両方を加え、
実施例３に記載の方法でヒト・ＣＲＦレセプターを含有
する膜画分に対する〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの結合量を
求めた。その結果を〔表２〕に示す。

【００５２】

【表２】 この結果から、０.０５％ ＣＨＡＰＳと０.０５％ ジギ
トニンを測定用緩衝液に添加することが感度よく結合活
性を評価するのに有効であることが判明した。特に、ジ
ギトニンはＣＲＦが反応チューブに吸着するのを抑制
し、正確な測定値を得るために効果的であった。

【００５３】レセプターを含有する該ＣＨＯ細胞膜画分
を用いた結合実験における反応温度と反応時間の検討
は、以下の方法で行った。測定用緩衝液〔２０ｍＭ Ｎ
ａ-リン酸バッファー，１ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ 塩化
マグネシウム，０.３％ ゼラチン，２０μｇ／ｍｌ ロ
イペプチン，１μｇ／ｍｌ ペプスタチン，４μｇ／ｍ
ｌＥ-６４，０.１ｍＭ ＰＭＳＦ，０.０３％ ＮａＮ₃，
０.０５％ ＣＨＡＰＳ，０.０５％ ジギトニン（ｐＨ
７.０）〕で膜画分を懸濁し、同緩衝液で希釈して蛋白
量が２００μｌ当たり２μｇになるように調製した。各
２００μｌをチューブに分注し、５ｎＭの〔¹²⁵Ｉ〕-ヒ
ツジＣＲＦを２μｌ添加し、反応温度は４℃、２５℃、
３７℃で、反応時間は１０分間から３００分間インキュ
ベーションした。非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するた
めに同時に１００μＭのヒトＣＲＦを２μｌ添加したチ
ューブも同様にインキュベーションした。反応後、実施
例３に記載の方法でＧＦ／Ｆガラス繊維濾紙（Whatman
社）で濾過し、γ-カウンターを用いて、濾紙に残存す
る〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの放射活性を測定した。その
結果を〔図７〕に示す。〔図７〕において、▲は４℃、
●は２５℃、□は３７℃の特異的結合量をそれぞれ示
す。この結果、反応温度は２５℃が適していることが判
明した。また、反応時間は６０分間のインキュベーショ
ンではヒトＣＲＦレセプターの特異的結合量は一定にな
らず、２時間以上必要であることが明らかになった。以
上の結果から、チューブ法で測定する場合は、測定用緩
衝液として〔２０ｍＭ Ｎａ-リン酸バッファー，１ｍＭ
ＥＧＴＡ，５ｍＭ 塩化マグネシウム，０.３％ ゼラチ
ン，２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１μｇ／ｍｌ ペプ
スタチン，４μｇ／ｍｌ Ｅ-６４，０.１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ，０.０３％ ＮａＮ₃，０.０５％ＣＨＡＰＳ，０.０
５％ ジギトニン（ｐＨ７.０）〕を用い、反応を２５℃
で２時間行うこととした。

【００５４】

【実施例５】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質の結合実験の
至適化（プレート法） 実施例４で決定したチューブ法での測定用緩衝液では、
反応溶液に９６穴マルチタイタープレートをプレート法
でのセルハーベスター（ＰＨＰセルハーベスターモデル
２９０；Cambridge Technology 社）による吸引濾過が
十分できないことが判明したため、プレート法での測定
用緩衝液の組成を検討した。セルハーベスターによる吸
引速度を指標にして検討した結果、チューブ法の測定用
緩衝液中のＣＨＡＰＳとゼラチンが吸引を阻害している
ことが判明したため、これらを変更した。すなわち、プ
レート法での測定用緩衝液の組成は、〔２０ｍＭ Ｎａ-
リン酸バッファー，１ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム，０.２％ ＢＳＡ，２０μｇ／ｍｌ ロイペプ
チン，１μｇ／ｍｌ ペプスタチン，４μｇ／ｍｌＥ-６
４，０.１ｍＭ ＰＭＳＦ，０.０３％ ＮａＮ₃，０.０１
％ ＣＨＡＰＳ，０.０５％ ジギトニン（ｐＨ７.０）〕
とした。該測定用緩衝液を用いて膜画分を懸濁し、蛋白
量が２００μｌ当たり０.５〜１０μgになるように調製
した。各２００μlを９６穴マルチタイタープレートの
ウェルに分注し、５nMの〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦを２μ
l添加し、２５℃で２時間反応させた。非特異的結合
（ＮＳＢ）を測定するために同時に１００μＭのヒト・
ＣＲＦを２μｌ添加したウェルも用意した。反応後、セ
ルハーベスターを用いてＧＦ／Ｂガラス繊維濾紙（What
man 社）で濾過し、濾紙に残存する［¹²⁵Ｉ］-ヒツジＣ
ＲＦをγ-カウンターで測定した。その結果、プレート
法でも十分な特異的結合が検出できることが判明した
〔図８〕。

【００５５】

【実施例６】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣ
ＨＯ細胞を用いた結合阻害実験 実施例３で得られたヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡ発現
細胞株ＨＣ２−１の細胞膜画分を用いて、〔¹²⁵Ｉ〕-ヒ
ツジＣＲＦに対するヒツジＣＲＦ、α−helicalＣＲＦ
（９−４１）、ソマトスタチンおよびＧＨＲＨの結合阻
害実験をチューブ法で行なった。１μｇの膜蛋白を含む
２００μｌの測定用緩衝液をチューブに分注し、５ｎＭ
〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦを２μｌ添加し、同時に１ｎ
Ｍから１００μＭの可変量の競合物を２μｌ加え、２５
℃、２時間インキュベーションした。次に、実施例３に
記載の方法で細胞膜画分に結合した〔¹²⁵Ｉ〕活性を測
定し、下記の〔数２〕の計算式にしたがって、Percent
Maximum Binding（ＰＭＢ）を求めた。

【００５６】

【数２】 Ｂ ：結合量 ＮＳＢ：非特異的結合量 Ｂ₀ ：最大結合量 その結果を〔図９〕に示す。〔図９〕から、ヒトＣＲＦ
レセプターｃＤＮＡ発現細胞株ＨＣ２−１由来の組換え
型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質は、天然のＣＲＦレセプ
ター蛋白質と同等のリガンド特異性を有することが明ら
かになった。

【００５７】

【実施例７】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質の発現量およ
び解離定数の測定 実施例２で得られたヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡ発現
細胞株ＨＣ２−１由来の細胞膜画分を用いてリガンド飽
和実験を行なった。実施例４に記載の測定用緩衝液で該
ＣＨＯ細胞膜画分を希釈して蛋白量が２.５μｇ／ｍｌ
になるように調製した。これを２００μｌずつチューブ
に分注し、〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦまたは〔¹²⁵Ｉ〕-ヒ
トＣＲＦの終濃度が５ｐＭから４００ｐＭまでの９段階
になるように加え、２５℃、２時間インキュベーション
した。各段階での非特異的結合量（ＮＳＢ）を測定する
ためにヒツジＣＲＦを１μＭ加えたチューブも同時にイ
ンキュベーションした。インキュベーション後、実施例
３に記載の方法で膜画分に結合した〔¹²⁵Ｉ〕活性を測
定した。これに基づきスキャッチャード解析を行った結
果、〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの最大結合量は膜蛋白質１
ｍｇあたり１６.８ｐｍｏｌ、およびその解離定数（Ｋ
ｄ）は９７ｐＭであった。結果を〔図１０〕に示す。〔
¹²⁵Ｉ〕-ヒトＣＲＦを用いた場合も同様の結果を得た。
〔図１０〕から、ＨＣ２−１由来の細胞膜画分は、ＣＲ
Ｆレセプター蛋白質の比活性が極めて高く、しかもＣＲ
Ｆに対する親和性が極めて高いことが判明した。これら
のことから、ＨＣ２−１由来の細胞膜画分は、結合阻害
実験のためのレセプター標品として最適であることが分
かった。

【００５８】

【発明の効果】本発明のヒトＣＲＦレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを保持する発現ベクターｐＡＣ０２
は、ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を高発現するように構
築された発現ベクターである。該発現ベクターｐＡＣ０
２を含有するＣＨＯ細胞は、ヒトＣＲＦレセプター蛋白
質を高発現することができる。また、本発明の組換え型
ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞もし
くはその細胞膜分画または組換え型ヒトＣＲＦレセプタ
ー蛋白質もしくはその部分ペプチドを用いて、ヒトＣＲ
Ｆレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率良
くスクリーニングすることができる。本発明のスクリー
ニング方法によれば、アゴニストまたはアンタゴニスト
を有利に、かつ早期に選択することができる。該アゴニ
ストは、例えば、ストレスに対する適応促進剤、ＡＣＴ
Ｈ，β−エンドルフィン，β−リポトロピンもしくはα
−ＭＳＦの分泌促進剤、血圧降下剤、気分や行動の調節
剤、胃腸機能の調節剤、自律神経系の調節剤、下垂体，
心血管系，消化管もしくは中枢神経の機能検査薬などと
して有用であり、該アンタゴニストは、例えば、ストレ
スからくる鬱病・不安・頭痛、炎症性疾患、免疫抑制、
ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、胃腸障害、食欲不振、出
血性ストレス、薬物・アルコール等の禁断症状、薬物依
存症、生殖障害、クッシング病、低血圧症などの予防・
治療剤などとして有用であるの医薬品を早期に開発する
ことができる。

【００５９】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：１２４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGGGAGGGC ACCCGCAGCT CCGTCTCGTC AAGGCCCTTC TCCTTCTGGG GCTGAACCCC 60 GTCTCTGCCT CCCTCCAGGA CCAGCACTGC GAGAGCCTGT CCCTGGCCAG CAACATCTCA 120 GGACTGCAGT GCAACGCATC CGTGGACCTC ATTGGCACCT GCTGGCCCCG CAGCCCTGCG 180 GGGCAGCTAG TGGTTCGGCC CTGCCCTGCC TTTTTCTATG GTGTCCGCTA CAATACCACA 240 AACAATGGCT ACCGGGAGTG CCTGGCCAAT GGCAGCTGGG CCGCCCGCGT GAATTACTCC 300 GAGTGCCAGG AGATCCTCAA TGAGGAGAAA AAAAGCAAGG TGCACTACCA TGTCGCAGTC 360 ATCATCAACT ACCTGGGCCA CTGTATCTCC CTGGTGGCCC TCCTGGTGGC CTTTGTCCTC 420 TTTCTGCGGC TCAGGAGCAT CCGGTGCCTG CGAAACATCA TCCACTGGAA CCTCATCTCC 480 GCCTTCATCC TGCGCAACGC CACCTGGTTC GTGGTCCAGC TAACCATGAG CCCCGAGGTC 540 CACCAGAGCA ACGTGGGCTG GTGCAGGTTG GTGACAGCCG CCTACAACTA CTTCCATGTG 600 ACCAACTTCT TCTGGATGTT CGGCGAGGGC TGCTACCTGC ACACAGCCAT CGTGCTCACC 660 TACTCCACTG ACCGGCTGCG CAAATGGATG TTCATCTGCA TTGGCTGGGG TGTGCCCTTC 720 CCCATCATTG TGGCCTGGGC CATTGGGAAG CTGTACTACG ACAATGAGAA GTGCTGGTTT 780 GGCAAAAGGC CTGGGGTGTA CACCGACTAC ATCTACCAGG GCCCCATGAT CCTGGTCCTG 840 CTGATCAATT TCATCTTCCT TTTCAACATC GTCCGCATCC TCATGACCAA GCTCCGGGCA 900 TCCACCACGT CTGAGACCAT TCAGTACAGG AAGGCTGTGA AAGCCACTCT GGTGCTGCTG 960 CCCCTCCTGG GCATCACCTA CATGCTGTTC TTCGTCAATC CCGGGGAGGA TGAGGTCTCC 1020 CGGGTCGTCT TCATCTACTT CAACTCCTTC CTGGAATCCT TCCAGGGCTT CTTTGTGTCT 1080 GTGTTCTACT GTTTCCTCAA TAGTGAGGTC CGTTCTGCCA TCCGGAAGAG GTGGCACCGG 1140 TGGCAGGACA AGCACTCGAT CCGTGCCCGA GTGGCCCGTG CCATGTCCAT CCCCACCTCC 1200 CCAACCCGTG TCAGCTTTCA CAGCATCAAG CAGTCCACAG CAGTC 1245

【００６０】

【配列番号：２】 配列の長さ：４１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列 Met Gly Gly His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Asn Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser 20 25 30 Leu Ser Leu Ala Ser Asn Ile Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val 35 40 45 Asp Leu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val 50 55 60 Val Arg Pro Cys Pro Ala Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr 65 70 75 80 Asn Asn Gly Tyr Arg Glu Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg 85 90 95 Val Asn Tyr Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser 100 105 110 Lys Val His Tyr His Val Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys 115 120 125 Ile Ser Leu Val Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu 130 135 140 Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser 145 150 155 160 Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met 165 170 175 Ser Pro Glu Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr 180 185 190 Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly 195 200 205 Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp 210 215 220 Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe 225 230 235 240 Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu 245 250 255 Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr 260 265 270 Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe 275 280 285 Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser 290 295 300 Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu 305 310 315 320 Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu 325 330 335 Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu 340 345 350 Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser 355 360 365 Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys 370 375 380 His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser 385 390 395 400 Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val 405 410 415

【００６１】

【配列番号：３】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTCGACCGA GGATGGGAGG GCAC 24

【００６２】

【配列番号：４】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTCGACGAC CTGCCAGCTC AGACTGC 27

【００６３】

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１で調製したヒトＣＲＦレセプターｃＤ
ＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列
を示す。

【００６４】

【図２】ヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡを保持する発現
ベクターｐＡＣ０２の構築図を示す。黒塗りの部分はヒ
トＣＲＦレセプターｃＤＮＡを示す。PolyＡ signalは
ポリＡ付加シグナルを示す。ＤＨＦＲはジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子を示す。Ａｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子
を示す。

【００６５】

【図３】ヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡを保持する発現
ベクターｐＡＣ０２−ＣＭＶを示す。黒塗りの部分はヒ
トＣＲＦレセプターｃＤＮＡを示す。PolyＡ signalは
ポリＡ付加シグナルを示す。Ｎｅｏはネオマイシン耐性
遺伝子を示す。Ａｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子を示
す。

【００６６】

【図４】ヒトＣＲＦレセプターｃＤＮＡを保持する発現
ベクターｐＡＣ０２−ＲＳＶを示す。黒塗りの部分はヒ
トＣＲＦレセプターｃＤＮＡを示す。PolyＡ signalは
ポリＡ付加シグナルを示す。Ｎｅｏはネオマイシン耐性
遺伝子を示す。Ａｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子を示
す。

【００６７】

【図５】チューブ法によるヒトＣＲＦレセプター蛋白質
を含有するＣＨＯ／ＨＣ２−１の細胞膜画分に対する〔
¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの結合実験の結果を示す。縦軸は
〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの結合量を示し、横軸は細胞膜
画分の蛋白量を示す。●は特異的結合量を示し、○は全
結合量は、□は非特異的結合量を示す。

【００６８】

【図６】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ
／ＨＣ２−１の細胞膜画分に対する〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣ
ＲＦの結合実験の最適ｐＨを調べた結果を示す。縦軸は
〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの特異的結合量を示し、横軸は
反応液のｐＨを示す。

【００６９】

【図７】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ
／ＨＣ２−１の細胞膜画分に対する〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣ
ＲＦの結合実験の最適反応時間および最適反応温度を調
べた結果を示す。縦軸は〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの特異
的結合量を示し、横軸は反応時間を示す。▲は４℃、●
は２５℃、□は３７℃を示す。

【００７０】

【図８】プレート法によるヒトＣＲＦレセプター蛋白質
を含有するＣＨＯ／ＨＣ２−１の細胞膜画分に対する〔
¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの結合実験の結果を示す。縦軸は
〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの結合量を示し、横軸は細胞膜
画分の蛋白量を示す。●は特異的結合量を示し、○は全
結合量は、□は非特異的結合量を示す。

【００７１】

【図９】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨＯ
／ＨＣ２−１の細胞膜画分と〔¹²⁵Ｉ〕-ヒツジＣＲＦの
結合に対する各種化合物の結合阻害実験を調べた結果
を、リガンド結合阻害曲線で示したものである。縦軸は
〔¹²⁵Ｉ〕−ヒツジＣＲＦ単独の場合の結合量を１００
％とした時の相対的結合量を示す。横軸は各種化合物の
濃度を示す。○はＣＲＦ、△はα-helicalＣＲＦ、□は
ソマトスタチン、●はＧＨＲＨを示す。

【００７２】

【図１０】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含有するＣＨ
Ｏ／ＨＣ２−１の細胞膜画分のスキャッチャード解析を
示す。Ｂ(pM)はレセプターに結合したリガンドの濃度を
示す。Ｂ／Ｆはレセプターに結合したリガンド量と遊離
したリガンド量の比を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＭ ＡＢＣ ＡＢＥ ＡＣＬ ＡＣＶ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/705 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＬ ＡＡＭ ＡＢＣ ＡＢＥ ＡＣＬ ＡＣＶ 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトＣＲＦレセプター蛋白質をコードする
   ＤＮＡを保持することを特徴とするｐＡＣ０２で標示さ
   れる発現ベクター。
2. 【請求項２】請求項１記載の発現ベクターを含有するこ
   とを特徴とするＣＨＯ細胞。
3. 【請求項３】ＣＨＯ細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
   を欠損しているＣＨＯ細胞である請求項２記載のＣＨＯ
   細胞。
4. 【請求項４】請求項２記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＣＲＦ
   レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条
   件下で培養することを特徴とする組換え型ヒトＣＲＦレ
   セプター蛋白質の製造法。
5. 【請求項５】組換え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質を含
   有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分。
6. 【請求項６】請求項５記載の組換え型ヒトＣＲＦレセプ
   ター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞から単離され得る組換
   え型ヒトＣＲＦレセプター蛋白質、その部分ペプチドま
   たはそれらの塩。
7. 【請求項７】請求項５記載のＣＨＯ細胞またはその細胞
   膜画分を用いることを特徴とするヒトＣＲＦレセプター
   アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
   法。
8. 【請求項８】請求項６記載の組換え型ヒトＣＲＦレセプ
   ター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を用い
   ることを特徴とするヒトＣＲＦレセプターアゴニストま
   たはアンタゴニストのスクリーニング方法。
9. 【請求項９】請求項５記載のＣＨＯ細胞もしくはその細
   胞膜画分、または請求項６記載の組換え型ヒトＣＲＦレ
   セプター蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩
   を含有することを特徴とするヒトＣＲＦレセプターアゴ
   ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キッ
   ト。
10. 【請求項１０】請求項７もしくは請求項８記載のスクリ
    ーニング方法または請求項９記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られるヒトＣＲＦレセプターアゴニスト
    またはその塩。
11. 【請求項１１】請求項７もしくは請求項８記載のスクリ
    ーニング方法または請求項９記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られるヒトＣＲＦレセプターアンタゴニ
    ストまたはその塩。
12. 【請求項１２】請求項１０記載のヒトＣＲＦレセプター
    アゴニストまたはその塩を含有することを特徴とするス
    トレスに対する適応促進剤、ＡＣＴＨ，β−エンドルフ
    ィン，β−リポトロピンもしくはα−ＭＳＦの分泌促進
    剤、血圧降下剤、気分や行動の調節剤、胃腸機能の調節
    剤、自律神経系の調節剤、または下垂体，心血管系，消
    化管もしくは中枢神経の機能検査薬。
13. 【請求項１３】請求項１１記載のヒトＣＲＦレセプター
    アンタゴニストまたはその塩を含有することを特徴とす
    るストレスからくる鬱病・不安・頭痛、炎症性疾患、免
    疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、胃腸障害、食欲
    不振、出血性ストレス、薬物・アルコールの禁断症状、
    薬物依存症、生殖障害、クッシング病または低血圧症の
    予防・治療剤。