JPH08140692A - フォンウイルブランド因子の製造方法 - Google Patents
フォンウイルブランド因子の製造方法Info
- Publication number
- JPH08140692A JPH08140692A JP6291663A JP29166394A JPH08140692A JP H08140692 A JPH08140692 A JP H08140692A JP 6291663 A JP6291663 A JP 6291663A JP 29166394 A JP29166394 A JP 29166394A JP H08140692 A JPH08140692 A JP H08140692A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vascular endothelial
- culturing
- culture
- von willebrand
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】ミクロキャリヤー上に付着せしめ、２０〜１３
０ダイン／ｃｍ2 の範囲のズリ応力を加えつつ血管内皮
細胞を培養することを特徴とするフォンウイルブランド
因子の製造方法。 【効果】従来は困難であったフォンウイルブランド因子
の培養細胞による大量生産が可能となった。
０ダイン／ｃｍ2 の範囲のズリ応力を加えつつ血管内皮
細胞を培養することを特徴とするフォンウイルブランド
因子の製造方法。 【効果】従来は困難であったフォンウイルブランド因子
の培養細胞による大量生産が可能となった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は医薬として用いられる可
能性のあるフォンウイルブランド因子の血管内皮細胞に
よる製造方法に関する。
能性のあるフォンウイルブランド因子の血管内皮細胞に
よる製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】フォンウイルブランド因子は血漿糖蛋白
質の一つであり、先天性出血性疾患フォンウイルブラン
ド病の治療に有用と考えられ、現実にフォンウイルブラ
ンド因子を含有する第VIII因子濃縮製剤が有効であるこ
とが知られている。しかしながら本製剤は血液を原料と
するため、肝炎ウイルス、エイズウイルスなどの危険因
子の混入の可能性および原料供給面での不安がある。一
方、フォンウイルブランド因子は分子量２７０ｋＤａの
糖蛋白質モノマーが会合したマルチマーであり、モノマ
ーのｃＤＮＡはクローニングされているものの、活性の
ある組換体の発現には至っていない。
質の一つであり、先天性出血性疾患フォンウイルブラン
ド病の治療に有用と考えられ、現実にフォンウイルブラ
ンド因子を含有する第VIII因子濃縮製剤が有効であるこ
とが知られている。しかしながら本製剤は血液を原料と
するため、肝炎ウイルス、エイズウイルスなどの危険因
子の混入の可能性および原料供給面での不安がある。一
方、フォンウイルブランド因子は分子量２７０ｋＤａの
糖蛋白質モノマーが会合したマルチマーであり、モノマ
ーのｃＤＮＡはクローニングされているものの、活性の
ある組換体の発現には至っていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血管内皮細
胞の大量培養および血管内皮細胞によるフォンウイルブ
ランド因子の効率的生産を目的とする。
胞の大量培養および血管内皮細胞によるフォンウイルブ
ランド因子の効率的生産を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の目的、すなわち血
管内皮細胞の大量培養および血管内皮細胞によるフォン
ウイルブランド因子の効率的生産は以下に説明する手段
により一挙に解決されることを見出し本発明を完成し
た。
管内皮細胞の大量培養および血管内皮細胞によるフォン
ウイルブランド因子の効率的生産は以下に説明する手段
により一挙に解決されることを見出し本発明を完成し
た。
【０００５】すなわち本発明は、先に本発明者らが考案
した血管内皮細胞の培養方法（特開平４−１７９４７
６）をフォンウイルブランド因子の生産に適用すること
により、まさに課題の解決に成功したもので、ミクロキ
ャリヤー上に付着せしめた血管内皮細胞を培養液の撹拌
により２０〜１３０ダイン／ｃｍ2 の範囲のズリ応力を
加えつつ培養し、フォンウイルブランド因子を産生せし
めることを特徴とするフォンウイルブランド因子の製造
方法である。
した血管内皮細胞の培養方法（特開平４−１７９４７
６）をフォンウイルブランド因子の生産に適用すること
により、まさに課題の解決に成功したもので、ミクロキ
ャリヤー上に付着せしめた血管内皮細胞を培養液の撹拌
により２０〜１３０ダイン／ｃｍ2 の範囲のズリ応力を
加えつつ培養し、フォンウイルブランド因子を産生せし
めることを特徴とするフォンウイルブランド因子の製造
方法である。
【０００６】血管内皮細胞は血管内壁の最内層を構成す
る細胞で、血液−組織間の物質透過を制御したり、血液
凝固阻止や造血、血圧調整などに関連する多くの生理活
性物質（コロニー刺激因子、インターロイキン類、エン
ドセリン、プラスタグランジン類など）を産生し、生体
維持に深くかかわっている。また損傷血管の修復や組織
での血管新生には血管内皮細胞の増殖が必須である。
る細胞で、血液−組織間の物質透過を制御したり、血液
凝固阻止や造血、血圧調整などに関連する多くの生理活
性物質（コロニー刺激因子、インターロイキン類、エン
ドセリン、プラスタグランジン類など）を産生し、生体
維持に深くかかわっている。また損傷血管の修復や組織
での血管新生には血管内皮細胞の増殖が必須である。
【０００７】ヒト血管内皮細胞の機能や産生物を有効利
用するためには、この細胞を生体外で培養、増殖させる
必要があるが、ヒト血管内皮細胞は増殖因子要求性とコ
ラーゲンなどの細胞外マトリクス要求性があり、経済性
の面から困難視されてきた。さらに、血管内皮細胞は接
着依存性であり、一般的には単層培養条件が適用されて
きたが、このような条件下では増殖因子や細胞外マトリ
クス存在下でも、その増殖性は弱く物質生産に利用する
ことはほとんど不可能と考えられた。
用するためには、この細胞を生体外で培養、増殖させる
必要があるが、ヒト血管内皮細胞は増殖因子要求性とコ
ラーゲンなどの細胞外マトリクス要求性があり、経済性
の面から困難視されてきた。さらに、血管内皮細胞は接
着依存性であり、一般的には単層培養条件が適用されて
きたが、このような条件下では増殖因子や細胞外マトリ
クス存在下でも、その増殖性は弱く物質生産に利用する
ことはほとんど不可能と考えられた。
【０００８】適切なズリ応力を加えてミクロキャリアー
培養した内皮細胞はコンフルエントに増殖後は、増殖期
と異なり無血清条件下でも７日以上生存維持されること
が確認されている。
培養した内皮細胞はコンフルエントに増殖後は、増殖期
と異なり無血清条件下でも７日以上生存維持されること
が確認されている。
【０００９】フォンウィルブランド因子の産生は、ズリ
応力の付与下で血清添加培養液を用いた場合より、無血
清条件でより増強されるため好ましい。
応力の付与下で血清添加培養液を用いた場合より、無血
清条件でより増強されるため好ましい。
【００１０】細胞の大量培養の成否のポイントは、１．
まず増殖可能であること、２．継代可能であること、の
２点であり、現実に増殖可能ではあるが継代が困難なた
め大量培養できない長期骨髄細胞培養系（いわゆるDext
er cueture）による血液幹細胞の例がある。さらに継代
培養により大量培養化は可能であるが、細胞の性質が変
化し、例えば目的とする物質の生産能が低下し、実用上
の意味を失うケースも多い。
まず増殖可能であること、２．継代可能であること、の
２点であり、現実に増殖可能ではあるが継代が困難なた
め大量培養できない長期骨髄細胞培養系（いわゆるDext
er cueture）による血液幹細胞の例がある。さらに継代
培養により大量培養化は可能であるが、細胞の性質が変
化し、例えば目的とする物質の生産能が低下し、実用上
の意味を失うケースも多い。
【００１１】このような状況の下で、本発明は実用上意
味の大きいヒト血管内皮細胞を細胞外マトリクス成分を
含有するミクロキャリヤー上にて継代培養することに成
功し、しかも継代培養を繰り返した細胞のフォンウイル
ブランド因子産生能も一定水準を維持することを見い出
し、以って培養血管内皮細胞によるフォンウイルブラン
ド因子の製造の基礎を提供するものである。
味の大きいヒト血管内皮細胞を細胞外マトリクス成分を
含有するミクロキャリヤー上にて継代培養することに成
功し、しかも継代培養を繰り返した細胞のフォンウイル
ブランド因子産生能も一定水準を維持することを見い出
し、以って培養血管内皮細胞によるフォンウイルブラン
ド因子の製造の基礎を提供するものである。
【００１２】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。
明する。
【００１３】
実施例１ ヒト臍帯静脈より酸素灌流法にて分離した血管内皮細胞
を、コラーゲンコートしたフラスコ中でウシ胎児血清１
０％とＥＣＧＦ活性を含むヒト正常２倍体線維芽細胞の
培養上清２０％を添加したＭ１９９培地で培養し、増殖
させた。０．３ｗｔ％のミクロキャリヤーとして用いた
ゼラチンビーズ（Gelibead, Hazleton）を含む図１に示
したスピナー培養ビン（５００ｍｌ容量）に上記培養液
２００ｍｌを入れ、平面培養で増殖させた内皮細胞を１
×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう接種した。３７℃
で撹拌回転数を５０〜６００ｒｐｍ（１１〜１２８ダイ
ン／ｃｍ2 ）に設定し、８日間培養してその増殖を調
べ、図２に示した。これより、血管内皮細胞の増殖は、
ズリ応力に依存していることが示された。
を、コラーゲンコートしたフラスコ中でウシ胎児血清１
０％とＥＣＧＦ活性を含むヒト正常２倍体線維芽細胞の
培養上清２０％を添加したＭ１９９培地で培養し、増殖
させた。０．３ｗｔ％のミクロキャリヤーとして用いた
ゼラチンビーズ（Gelibead, Hazleton）を含む図１に示
したスピナー培養ビン（５００ｍｌ容量）に上記培養液
２００ｍｌを入れ、平面培養で増殖させた内皮細胞を１
×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう接種した。３７℃
で撹拌回転数を５０〜６００ｒｐｍ（１１〜１２８ダイ
ン／ｃｍ2 ）に設定し、８日間培養してその増殖を調
べ、図２に示した。これより、血管内皮細胞の増殖は、
ズリ応力に依存していることが示された。
【００１４】実施例２ ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞を実施例１と同様にスピ
ナー培養ビンにて３００ｒｐｍ、６５ダイン／ｃｍ2 の
シェアストレス条件下、２日に１度の頻度で培地交換を
繰り返し８日間培養しコンフルエントまで増殖させた。
回転を止め、細胞の付着したゼラチンビースを沈降さ
せ、培養上清を除去後ダルベッコーリン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ−）にて３回洗浄した。
ナー培養ビンにて３００ｒｐｍ、６５ダイン／ｃｍ2 の
シェアストレス条件下、２日に１度の頻度で培地交換を
繰り返し８日間培養しコンフルエントまで増殖させた。
回転を止め、細胞の付着したゼラチンビースを沈降さ
せ、培養上清を除去後ダルベッコーリン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ−）にて３回洗浄した。
【００１５】０．２５％トリプシンを含む細胞剥離液を
用いてゼラチンビースから細胞を遊離させる。遊離した
細胞を計数し、新たなゼラチンビースを含むスピナー培
養ビンに１．５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように
接種し、再び前述した条件下で培養を継続し、この操作
を繰り返した。図３に示したように、１２回の継代まで
は細胞の到達密度は約６．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
であり、８日間ごとに４倍程度の増殖を示したが、その
以降は細胞の増殖速度、到達密度とも低下した。各回の
継代前の培養液中のフォンウイルブランド因子の量を酵
素免疫法で定量した結果を図４に示す。少なくとも９回
目の継代まではフォンウイルブランド因子の産生量に大
きな変化はなかった。
用いてゼラチンビースから細胞を遊離させる。遊離した
細胞を計数し、新たなゼラチンビースを含むスピナー培
養ビンに１．５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように
接種し、再び前述した条件下で培養を継続し、この操作
を繰り返した。図３に示したように、１２回の継代まで
は細胞の到達密度は約６．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
であり、８日間ごとに４倍程度の増殖を示したが、その
以降は細胞の増殖速度、到達密度とも低下した。各回の
継代前の培養液中のフォンウイルブランド因子の量を酵
素免疫法で定量した結果を図４に示す。少なくとも９回
目の継代まではフォンウイルブランド因子の産生量に大
きな変化はなかった。
【００１６】このことは少なくとも９回目までの継代操
作で培養された細胞は大部分、血管内皮細胞であり、混
入の可能性が考えられる線維芽細胞ではないことを示唆
している。さらに本実施例では各継代ごとに同一サイズ
のスピナー培養ビンを用いたため、毎回の継代で得られ
た細胞の１／４しか用いなかったが、培養された全細胞
を無駄なく利用し、培養の規模を拡大しつづけたと仮定
すると９回の継代で１０００リットル以上に到達する計
算となり、物質生産系として十分考慮に値する水準に達
っしている。
作で培養された細胞は大部分、血管内皮細胞であり、混
入の可能性が考えられる線維芽細胞ではないことを示唆
している。さらに本実施例では各継代ごとに同一サイズ
のスピナー培養ビンを用いたため、毎回の継代で得られ
た細胞の１／４しか用いなかったが、培養された全細胞
を無駄なく利用し、培養の規模を拡大しつづけたと仮定
すると９回の継代で１０００リットル以上に到達する計
算となり、物質生産系として十分考慮に値する水準に達
っしている。
【００１７】実施例３ 実施例２と同様な方法で８日間培養して得た血管内皮細
胞が付着したゼラチンビーズを沈降させ、血清無添加、
ヒト正常２倍体線維芽細胞培養上清無添加のＭ１９９培
地で３回洗浄後、再び２００ｍｌの血清無添加、ヒト正
常２倍体線維芽細胞培養上清無添加のＭ１９９培地に懸
濁した。均一に懸濁した懸濁液６ｍｌずつ直径６０ｍ／
ｍのシャーレ３枚に加え、ゼラチンビースを平面的に均
一化した後、炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、５
％ＣＯ2 条件下で５日間静置培養を行なった。残りの懸
濁液（約１８０ｍｌ）はスピナー培養ビン中で３００ｒ
ｐｍ、６５ダイン／ｃｍ2 の条件下、３７℃で培養を継
続した。培養０、１、２および５日目に培養上清を、シ
ャーレからはそれぞれ０．２ｍｌずつ取りプール、スピ
ナー培養ビンからは１ｍｌを採取し各々についてフォン
ウイルブランド因子の量を酵素免疫法で測定した結果を
図５に示した。図から明らかなように静置培養条件下で
はフォンウイルブランド因子は２日でほぼ産生されなく
なるのに対し、スピナー培養でシェアストレスを受ける
培養条件下では少なくとも５日目までは直線的に産生さ
れ続け、５日目の時点で静置培養条件の３倍以上とな
り、培養液当りの濃度では１４μｇ／ｍｌとなりフォン
ウイルブランド製剤の原料としての利用価値が大幅に高
まった。
胞が付着したゼラチンビーズを沈降させ、血清無添加、
ヒト正常２倍体線維芽細胞培養上清無添加のＭ１９９培
地で３回洗浄後、再び２００ｍｌの血清無添加、ヒト正
常２倍体線維芽細胞培養上清無添加のＭ１９９培地に懸
濁した。均一に懸濁した懸濁液６ｍｌずつ直径６０ｍ／
ｍのシャーレ３枚に加え、ゼラチンビースを平面的に均
一化した後、炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、５
％ＣＯ2 条件下で５日間静置培養を行なった。残りの懸
濁液（約１８０ｍｌ）はスピナー培養ビン中で３００ｒ
ｐｍ、６５ダイン／ｃｍ2 の条件下、３７℃で培養を継
続した。培養０、１、２および５日目に培養上清を、シ
ャーレからはそれぞれ０．２ｍｌずつ取りプール、スピ
ナー培養ビンからは１ｍｌを採取し各々についてフォン
ウイルブランド因子の量を酵素免疫法で測定した結果を
図５に示した。図から明らかなように静置培養条件下で
はフォンウイルブランド因子は２日でほぼ産生されなく
なるのに対し、スピナー培養でシェアストレスを受ける
培養条件下では少なくとも５日目までは直線的に産生さ
れ続け、５日目の時点で静置培養条件の３倍以上とな
り、培養液当りの濃度では１４μｇ／ｍｌとなりフォン
ウイルブランド製剤の原料としての利用価値が大幅に高
まった。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、従来は困難であったフォ
ンウイルブランド因子の培養細胞による大量生産が可能
となった。本発明はさらにフォンウイルブランド因子の
遺伝子を組換えた内皮細胞の培養にも適用可能と考えら
れ、さらに効率的なフォンウイルブランド因子の製造方
法を提供する可能性を有している。
ンウイルブランド因子の培養細胞による大量生産が可能
となった。本発明はさらにフォンウイルブランド因子の
遺伝子を組換えた内皮細胞の培養にも適用可能と考えら
れ、さらに効率的なフォンウイルブランド因子の製造方
法を提供する可能性を有している。
【図１】本発明で好ましく用いられる培養ビンを示すも
のであり、ａは撹拌子先端からビン内壁までの距離を示
し、ｂは培養ビンの内径を示す。
のであり、ａは撹拌子先端からビン内壁までの距離を示
し、ｂは培養ビンの内径を示す。
【図２】実施例１の血管内皮細胞の増殖に及ぼすズリ応
力の影響を示すものである。
力の影響を示すものである。
【図３】実施例２に記載したヒト臍帯静脈内皮細胞の継
代培養に対する増殖曲線を示したものである。括弧内の
数字はＰＤＬを示す。
代培養に対する増殖曲線を示したものである。括弧内の
数字はＰＤＬを示す。
【図４】実施例２に記載した継代培養ヒト臍帯静脈内皮
細胞によるフォンウイルブランド因子の産生量を示した
ものである。
細胞によるフォンウイルブランド因子の産生量を示した
ものである。
【図５】実施例３で示した静置培養およびスピナー培養
血管内皮細胞によるフォンウイルブランド因子産生量の
対比を示したものである。
血管内皮細胞によるフォンウイルブランド因子産生量の
対比を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 ミクロキャリヤー上に付着せしめ、２０
〜１３０ダイン／ｃｍ2 の範囲のズリ応力を加えつつ血
管内皮細胞を培養することを特徴とするフォンウイルブ
ランド因子の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6291663A JPH08140692A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | フォンウイルブランド因子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6291663A JPH08140692A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | フォンウイルブランド因子の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140692A true JPH08140692A (ja) | 1996-06-04 |
Family
ID=17771843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6291663A Pending JPH08140692A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | フォンウイルブランド因子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08140692A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006509502A (ja) * | 2002-12-11 | 2006-03-23 | フェローサン アクティーゼルスカブ | スワブとしてのゼラチンベースの材料 |
| US10920185B2 (en) | 2016-05-31 | 2021-02-16 | Corning Incorporated | Vessels and spinner flasks with reduced impeller wobble for culturing cells |
-
1994
- 1994-11-25 JP JP6291663A patent/JPH08140692A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006509502A (ja) * | 2002-12-11 | 2006-03-23 | フェローサン アクティーゼルスカブ | スワブとしてのゼラチンベースの材料 |
| US10920185B2 (en) | 2016-05-31 | 2021-02-16 | Corning Incorporated | Vessels and spinner flasks with reduced impeller wobble for culturing cells |
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