JPH08154691A - アミド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】ニトリル化合物に、ニトリル化合物をアミド化
合物に変換させる水和活性を有する微生物を固定化して
得られる固定化微生物を作用させ、該ニトリル化合物を
アミド化合物に変換させる方法において、該固定化微生
物をニトリル化合物に作用させる前に、該固定化微生物
を直径２５０μｍから１０００μｍに粒子化し、得られ
る微粒子を終濃度０．２重量％から１．０重量％の水溶
性ジアルデヒドで処理する工程を含むことを特徴とする
アミド化合物の製造方法、及び、ニトリル化合物をアミ
ド化合物に変換させる水和活性の安定性向上方法、によ
ってニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活
性の安定性が向上された固定化微生物。 【効果】アミド化合物を反応液中に高濃度蓄積させる場
合にも、より安定したアミド化合物の製造が可能にな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニトリル化合物に、ニ
トリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有
する微生物を固定化して得られる固定化微生物を作用さ
せ、該ニトリル化合物をアミド化合物に変換させる方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ニトリル化合物からアミド化合物
を製造する方法としては硫酸法、銅触媒法などによる化
学法が工業的に行われてきたが、最近では、ニトリル化
合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有する微生
物、たとえば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレ
ビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
（米国特許第４００１０８１号）、シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（米国特許第４５５５４８７
号）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属（特開平６−１４７８６号公報）等を用いる方法
も検討され、これら微生物のうち、一部の微生物はニト
リル化合物からのアミド化合物の工業的生産にも使用さ
れている。このような微生物を用いる方法では、微生物
の菌体をそのまま反応に使用することもできるが、工業
的にはポリアクリルアミドゲル等で固定化した固定化微
生物を反応に用いることによって、上記の水和活性を安
定させている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、アミド
化合物を反応液中に高濃度蓄積させる場合には、上記固
定化微生物が有する水和活性が失活または低下すること
があり、上記方法だけでは、安定してアミド化合物を製
造することが必ずしも容易ではなかった。このために反
応液中における水和活性をより安定させる方法が望まれ
ていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、微生物を固定化した後
に、該固定化微生物をあらかじめ塊状から小粒子に粉砕
し、得られた微粒子を特定な濃度の水溶性ジアルデヒド
で処理することによって、固定化微生物が有する、ニト
リル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性の安定
性を向上させることができることを見い出し、本発明を
完成した。すなわち、本発明は、ニトリル化合物に、ニ
トリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有
する微生物を固定化して得られる固定化微生物を作用さ
せ、該ニトリル化合物をアミド化合物に変換させる方法
において、該固定化微生物をニトリル化合物に作用させ
る前に、該固定化微生物を直径２５０μｍから１０００
μｍに粒子化し、得られる微粒子を終濃度０．２重量％
から１．０重量％の水溶性ジアルデヒドで処理する工程
を含むことを特徴とするアミド化合物の製造方法（以
下、本発明製造方法と記す。）、ニトリル化合物に、ニ
トリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有
する微生物を固定化して得られる固定化微生物を作用さ
せ、該ニトリル化合物をアミド化合物に変換させる方法
において、該固定化微生物をニトリル化合物に作用させ
る前に、該固定化微生物を直径２５０μｍから１０００
μｍに粒子化し、得られる微粒子を終濃度０．２重量％
から１．０重量％の水溶性ジアルデヒドで処理すること
を特徴とする固定化微生物が有する、ニトリル化合物を
アミド化合物に変換させる水和活性の安定性向上方法
（以下、本発明活性向上方法と記す。）、及び該活性向
上方法によってニトリル化合物をアミド化合物に変換さ
せる水和活性の安定性が向上された固定化微生物を提供
するものである。

【０００５】以下、詳細に本発明を説明する。

【０００６】本発明におけるニトリル化合物としては、
例えば、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、イ
ソブチロニトリル、アセトニトリル、ピバロニトリル等
の脂肪族ニトリル化合物、２−クロロプロピオニトリル
等のハロゲン原子を含むニトリル化合物、アクリロニト
リル、クロトノニトリル、メタクリロニトリル等の不飽
和結合を含む脂肪族ニトリル化合物、ラクトニトリル、
マンデロニトリル等のヒドロキシニトリル化合物、２−
フェニルグリシノニトリル等のアミノニトリル化合物、
ベンゾニトリル、シアノピリジン等の芳香族ニトリル化
合物、マロノニトリル、スクシノニトリル、アジポニト
リル等のジニトリル化合物等が挙げられる。好ましく
は、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、イソブ
チロニトリル、アセトニトリル、ピバロニトリル、２−
クロロプロピオニトリル、アクリロニトリル、クロトノ
ニトリル、メタクリロニトリル、ベンゾニトリル、２−
シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリ
ジン、マロノニトリル、スクシノニトリルまたはアジポ
ニトリルを挙げることができる。また上記のニトリル化
合物から生成されるアミド化合物は、上記の各ニトリル
化合物に対応するアミド化合物、すなわちｎ−ブチロニ
トリルからはｎ−ブチルアミドが、ｎ−バレロニトリル
からはｎ−バレルアミドが、イソブチロニトリルからは
イソブチルアミドが、アクリロニトリルからはアクリル
アミドが生成される。

【０００７】本発明において使用される微生物は、ニト
リル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有す
る微生物であり、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属に属する細菌を挙げることができる。その好ま
しい例として、アグロバクテリウムに属する微生物を挙
げることができる。本発明に使用される微生物の培養
は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素
源、窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地
を使用することができる。炭素源としてはグルコース、
グリセリン、デキストリン、シュークロース、動植物
油、糖蜜等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、
ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・
スティープ・リカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕ
ｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素等の
有機または無機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機
塩としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、
鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩類、
酢酸塩類、炭酸塩類およびリン酸塩類、具体的には塩化
カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸
銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸水素一カリウム、リン酸水素二カリウム、リ
ン酸水素一ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等を挙
げることができる。これらの培地のｐＨは、使用される
微生物によって適宜変更できるが、例えば、５〜１０程
度である。培養温度は微生物が生育する範囲で適宜変更
できる。培養時間は、種々の条件によって異なるが、通
常１〜７日間程度が好ましい。培養方法は、一般微生物
における通常の培養方法に準じて行われ、好気的条件
下、液体培地による振とう培養を行うのが好ましい。ま
た、微生物の種類によって異なるが、目的の酵素を誘導
するための誘導剤を添加するのが効果があり、好まし
い。例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）
の場合、誘導剤としてはイソバレロニトリル、クロトノ
ニトリル等のニトリル化合物、クロトンアミド等のアミ
ド化合物をあげることができ、該アミド化合物を培地に
対して約０．０１〜１重量％添加するとよい。

【０００８】上記のように微生物を培養し、例えば、そ
の培養液から菌体を遠心分離等により集め、水、生理食
塩水、リン酸緩衝液等で洗浄した後、得られた微生物を
固定化することによって固定化微生物を得る。微生物を
固定化する方法は、例えば、アクリルアミド系重合物に
よる包括固定化方法等の方法をあげることができる。こ
こで、アクリルアミド系重合物による包括固定化方法と
は、主成分としてアクリルアミド、メタクリルアミドを
用い、必要に応じ他のエチレン性不飽和単量体を共重合
させたアクリルアミド系重合物による包括型の固定化方
法のことである。アクリルアミド系重合物による包括固
定化方法では、例えば、前記微生物またはその懸濁液を
アクリルアミドなどの水溶性不飽和単量体およびＮ，
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどの水溶性多官能
不飽和単量体を含む水溶液に懸濁させ、重合開始剤を添
加して、温度約０〜４０℃、好ましくは約０〜２０℃で
重合させる溶液重合法、あるいは疎水性液体中に懸濁液
を分散させ、重合開始剤を添加して、温度約０〜４０
℃、好ましくは約０〜２０℃で重合させる懸濁重合法等
により固定化することができる。重合ゲル中の微生物の
含有量は微生物の種類、使用方法等によるが、通常、約
０．１〜５０重量％、好ましくは約５〜４０重量％であ
る。重合に用いる水溶性不飽和単量体の量は、懸濁液
中、約５〜３５重量％、好ましくは約１０〜２０重量％
である。水溶性多官能不飽和単量体の量は、水溶性不飽
和単量体の量に対し、約１〜５０重量％、好ましくは約
３〜２０重量％である。重合開始剤としては過硫酸カリ
ウム、過硫酸アンモニウム等を用いることができる。ま
た、重合促進剤として、３−（ジメチルアミノ）プロピ
オニトリル、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレ
ンジアミン等を用いるのが好ましい。懸濁重合を行う際
の疎水性液体としては疎水性の有機溶剤ならばどの有機
溶剤でも使用可能であるが、微生物に対する影響の少な
い有機溶剤、例えばｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−
オクタン等を用いるのが好ましい。また、これらの有機
溶媒は単独でも、二種以上を混合しても用いることがで
きる。さらに、懸濁重合においては適当な分散剤を用い
るのが好ましい。必要に応じて後述する固定化−微粒子
化工程後の水溶性ジアルデヒド処理とは別に、あらかじ
め微生物を固定化する前に培養液から遠心分離・洗浄す
ることによって得られる微生物を水溶性ジアルデヒド処
理しておく方法を併用（水溶性ジアルデヒドによる２段
階処理）することもできる。この場合、固定化前の水溶
性ジアルデヒド処理としては、たとえば、微生物菌体を
ｐＨ約５〜約１０、好ましくは約６〜約８、約０．０１
〜０．５Ｍのリン酸緩衝液等に懸濁させた後、水溶性ジ
アルデヒドを処理液の終濃度約０．１〜５．０重量％、
好ましくは約０．２〜２．０重量％添加し、温度約０〜
４０℃、好ましくは約０〜２０℃で約０．５〜６時間反
応させる方法をあげることができる。このように固定化
する前に水溶性ジアルデヒド処理された微生物を、通
常、遠心分離等によって水、生理食塩水、リン酸緩衝液
等で洗浄した後、前記のように固定化する。

【０００９】このように固定化して得られる固定化微生
物をニトリル化合物に作用させる前に、該固定化微生物
を直径２５０μｍから１０００μｍに粒子化し、得られ
る微粒子を終濃度０．２重量％から１．０重量％の水溶
性ジアルデヒドで処理する工程を行うことが本発明では
必須である。固定化微生物を直径２５０μｍから１００
０μｍに粒子化するには、ブレンダー等の装置による粉
砕方法を用いることができる。つぎに得られる微粒子を
終濃度０．２重量％から１．０重量％の水溶性ジアルデ
ヒドで処理する。具体的には、上記の微粒子を約０．０
１〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ約５〜約１０、好ま
しくは約６〜約８）等に浸漬した後、該溶液に終濃度が
０．２重量％から１．０重量％になるように水溶性ジア
ルデヒドを添加し、これを温度約０〜４０℃、好ましく
は約０〜２０℃で、約０．５〜３０時間、好ましくは約
１〜２４時間インキュベートする。そして水溶性ジアル
デヒド処理を終了した後、得られる固定化微生物を、
水、生理食塩水、リン酸緩衝液等で洗浄する。本発明に
用いる水溶性ジアルデヒドとしては、グルタルアルデヒ
ド、グリオキサール等をあげることができるが、特に好
ましくはグルタルアルデヒドがあげられる。

【００１０】このように調製された水溶性ジアルデヒド
処理済み粒子化固定化微生物（以下、水溶性ジアルデヒ
ド処理した固定化微生物微粒子とも記す。）を作用さ
せ、該ニトリル化合物をアミド化合物に変換させるに
は、たとえば、該固定化微生物をカラム内に充填または
反応釜に入れて、原料であるニトリル化合物の水溶液を
供給し、例えば、約０〜２０℃で反応させる。以下、実
施例により詳細に説明するが、本発明はこれに限定され
るものではない。

【００１１】

【実施例】

【実施例１】グリセロール１．０重量％、ポリペプトン
０．５重量％、酵母エキス０．３重量％、マルトエキス
０．３重量％、イソバレロニトリル０．１重量％および
硫酸第一鉄、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸マンガンを
それぞれ０．００１重量％からなる殺菌済み培地（ｐＨ
７．２）により、３０℃、２日間、好気的に培養して得
たアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−Ｃ１
５−１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３８４３〕の菌体を遠心分
離（12,000xg,20min,4℃）により回収した。回収した菌
体を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）
で洗浄した後、遠心分離（12,000xg,20min,4℃）によっ
て菌体を回収し、洗浄菌体（含水率７７％）を得た。得
られた洗浄菌体２２８ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッ
ファー（ｐＨ７．７）６０ｇで懸濁した後、該微生物懸
濁液に分散剤として２．５％（ｗ／ｗ）アクリルアミド
ポリマー水溶液（ナカライテスク試薬 重合度１０，０
００、１０％水溶液を希釈）１２ｇを加え、十分に混合
した。さらに、該混合物にあらかじめ減圧脱気しておい
たアクリルアミド単量体水溶液（アクリルアミド８１
ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド９ｇ，水１
２６ｇ）と重合促進剤である５％（ｗ／ｗ）の３−（ジ
メチルアミノ）プロピオニトリル水溶液３０ｇを加えた
後、十分に混合することによって微生物懸濁単量体水溶
液を得た。次に２Ｌのセパラブル丸底フラスコに１本の
ファウドラー型撹拌棒と１本の邪魔棒を設置した装置
に、ｎ−ヘプタン６１６ｇ（９００ｍｌ）を仕込み、該
装置をウオーターバスで５℃に保った。セパラブル丸底
フラスコ内を窒素置換し、その後も窒素雰囲気下を保つ
ために必要な窒素ガス量をセパラブル丸底フラスコ内に
吹き込んだ。つぎに、前記の微生物懸濁単量体水溶液
（６００ｍｌ）を４００ｒｐｍで撹拌しながら上記のセ
パラブル丸底フラスコ中に投入した。１５分間撹拌を続
け、温度が５℃になった段階でセパラブル丸底フラスコ
中に重合開始剤である２．５％（ｗ／ｗ）過硫酸カリウ
ム水溶液を６０ｇ加えた。重合は重合開始剤を加えると
数分後に始まったが、この状態で１時間撹拌を続け、重
合を続けた。セパラブル丸底フラスコ系内の温度は重合
熱のため、最高１０℃まで上昇したが、その後冷却され
た。重合終了後、得られた固定化微生物をブレンダーを
用いて粉砕した。粉砕された固定化微生物を５０ｍＭリ
ン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で洗浄し、ふる
い（１６から６０メッシュ）でふるい分けを行い、直径
２５０μｍから１０００μｍの球状粒子（以下、固定化
微生物微粒子と記す。）を回収した。次に回収された固
定化微生物微粒子（含水率８８％）２０ｇと０．６重量
％のグルタルアルデヒド−５０ｍＭリン酸カリウムバッ
ファー（ｐＨ７．７）水溶液２０ｇを混合し、該混合物
を２℃で４時間反応させた（グルタルアルデヒド終濃度
は０．３重量％である）。反応終了後、反応物を５０ｍ
Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に洗
浄した。グルタルアルデヒド処理した固定化微生物微粒
子を用いて下記の酵素安定性試験を行った。まず、固定
化微生物微粒子を３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド−５
０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液
に、２℃、１７時間、浸漬した後、該固定化微生物微粒
子を回収し、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．７）で十分に洗浄した後、アクリロニトリルをアク
リルアミドに変換する活性を測定した。活性の測定は、
固定化微生物微粒子０．２ｇと５０ｍＭリン酸カリウム
バッファー（ｐＨ７．７）０．８ｇを混合し、該混合物
に９ｍｌの２．７８重量％のアクリルニトリルを含む５
０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）を加え
て、反応温度１０℃にて反応を開始した。１０分間後、
１ｍｌの２規定塩酸を加えることにより反応を停止し
た。反応液の一部をガスクロマトグラフィーにて分析
し、アクリルアミドの生成量から水和活性を算出した。 （ガスクロマトグラフィー分析条件） カラム ：パックドカラム 担体：Porapak type Q(mesh 80-100) 長さ：１．１ｍ カラム温度 ：２１０℃ キャリアガス流量：５０ｍｌ／ｍｉｎ サンプル注入量 ：２μｌ その結果、グルタルアルデヒド処理した固定化微生物微
粒子（含水率８８％）における酵素安定性試験後の残存
活性（酵素安定性試験前に対する相対値）は４７．０％
であった。すなわち、本発明には後述する比較例１およ
び２との比較から明らかなように約２．７から約３．７
倍のアクリルアミドに対する安定性向上が認められた。

【００１２】

【実施例２】固定化微生物微粒子を実施例１と同様な方
法で得た。得られた固定化微生物微粒子（含水率８８
％）２０ｇと０．４重量％のグルタルアルデヒド−５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液２
０ｇを混合し、該混合物を２℃で４時間処理させた（グ
ルタルアルデヒド終濃度は０．２重量％である）。反応
終了後、反応物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した。グルタルアルデヒド
処理した固定化微生物微粒子を用いて下記の酵素安定性
試験を行った。まず、固定化微生物微粒子を３０％（ｗ
／ｖ）アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリウムバッフ
ァー（ｐＨ７．７）水溶液に、２℃、１７時間、浸漬し
た後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０ｍＭリン酸
カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した
後、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性
を実施例１と同様な方法で測定した。その結果、グルタ
ルアルデヒド処理した固定化微生物微粒子（含水率８８
％）における酵素安定性試験後の残存活性（酵素安定性
試験前に対する相対値）は３４．７％であった。すなわ
ち、本発明には後述する比較例１および２との比較から
明らかなように約２．０から約２．７倍のアクリルアミ
ドに対する安定性向上が認められた。

【００１３】

【比較例１】固定化微生物微粒子を実施例１と同様な方
法で得た。得られた固定化微生物微粒子（含水率８８
％）２０ｇと０．２重量％のグルタルアルデヒド−５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液２
０ｇを混合し、該混合物を２℃で４時間処理させた（グ
ルタルアルデヒド終濃度は０．１重量％である）。反応
終了後、反応物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した。グルタルアルデヒド
処理した固定化微生物微粒子を用いて下記の酵素安定性
試験を行った。まず、固定化微生物微粒子を３０％（ｗ
／ｖ）アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリウムバッフ
ァー（ｐＨ７．７）水溶液に、２℃、１７時間、浸漬し
た後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０ｍＭリン酸
カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した
後、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性
を実施例１と同様な方法で測定した。その結果、グルタ
ルアルデヒド処理した固定化微生物微粒子（含水率８８
％）における酵素安定性試験後の残存活性（酵素安定性
試験前に対する相対値）は１７．７％であった。

【００１４】

【比較例２】固定化微生物微粒子を実施例１と同様な方
法で得た。得られた固定化微生物微粒子（含水率８８
％）を用いて下記の酵素安定性試験を行った。まず、固
定化微生物微粒子を３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド−
５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶
液に、２℃、１７時間、浸漬した後、該固定化微生物微
粒子を回収し、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐ
Ｈ７．７）で十分に洗浄した後、アクリロニトリルをア
クリルアミドに変換する活性を実施例１と同様な方法で
測定した。その結果、グルタルアルデヒド未処理の固定
化微生物微粒子（含水率８８％）における酵素安定性試
験後の残存活性（酵素安定性試験前に対する相対値）は
１２．７％であった。

【００１５】

【実施例３】グリセロール１．０重量％、ポリペプトン
０．５重量％、酵母エキス０．３重量％、マルトエキス
０．３重量％、イソバレロニトリル０．１重量％および
硫酸第一鉄、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸マンガンを
それぞれ０．００１重量％からなる殺菌済み培地（ｐＨ
７．２）により、３０℃、２日間、好気的に培養して得
たアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−Ｃ１
５−１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３８４３〕の菌体を遠心分
離(12,000xg,20min,４℃) によって回収した。回収した
菌体を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
７）で洗浄した後、遠心分離(12,000xg,20min,４℃) に
よって菌体を回収し、洗浄菌体（含水率７７％）を得
た。得られた洗浄菌体２３０ｇ、２５％（ｗ／ｗ）グル
タルアルデヒド単量体水溶液８．２８ｇ、５０ｍＭリン
酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）５５．５ｇおよび
水５１．２２ｇを十分に混合した後、該混合物を氷冷下
に１時間放置した（グルタルアルデヒド終濃度は０．６
重量％である）。該処理後、５０ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７．７）で洗浄し、遠心分離(12,000xg,
20min,４℃)によって菌体を回収した。回収した菌体を
５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で懸
濁し、該微生物懸濁液の全量を３００ｇに調製した。つ
ぎに、前記の微生物懸濁液２８８ｇに分散剤として２．
５％（ｗ／ｗ）アクリルアミドポリマー水溶液（ナカラ
イテスク試薬 重合度１０，０００、１０％水溶液を希
釈）１２ｇを加え、十分に混合した。さらに、該混合物
にあらかじめ減圧脱気しておいたアクリルアミド単量体
水溶液（アクリルアミド８１ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド９ｇ，水１２６ｇ）と重合促進剤であ
る５％（ｗ／ｗ）の３−（ジメチルアミノ）プロピオニ
トリル水溶液３０ｇを加えた後、十分に混合することに
よって、微生物懸濁単量体水溶液を得た。次に２Ｌのセ
パラブル丸底フラスコに１本のファウドラー型撹拌棒と
１本の邪魔棒を設置した装置に、ｎ−ヘプタン６１６ｇ
（９００ｍｌ）を仕込み、該装置をウオーターバスで５
℃に保った。セパラブル丸底フラスコ内を窒素置換し、
その後も窒素雰囲気下を保つために必要な窒素ガス量を
セパラブル丸底フラスコ内に吹き込んだ。つぎに、前記
の微生物懸濁単量体水溶液（６００ｍｌ）を４００ｒｐ
ｍで撹拌しながら上記のセパラブル丸底フラスコ中に投
入した。１５分間撹拌を続け、温度が５℃になった段階
でセパラブル丸底フラスコ中に重合開始剤である２．５
％（ｗ／ｗ）過硫酸カリウム水溶液を６０ｇ加えた。重
合は重合開始剤を加えると数分後に始まったが、この状
態で１時間撹拌を続け、重合を続けた。セパラブル丸底
フラスコ系内の温度は重合熱のため、最高１０℃まで上
昇したが、その後冷却された。重合終了後、得られた固
定化微生物をブレンダーを用いて粉砕した。粉砕された
固定化微生物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐ
Ｈ７．７）で洗浄し、ふるい（１６から６０メッシュ）
でふるい分けを行い、直径２５０μｍから１０００μｍ
の球状粒子（以下、固定化微生物微粒子と記す。）を回
収した。次に回収された固定化微生物微粒子（含水率８
８％）２０ｇと０．６重量％のグルタルアルデヒド−５
０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液
２０ｇを混合し、該混合物を２℃で４時間反応させた
（グルタルアルデヒド終濃度は０．３重量％である）。
反応終了後、反応物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファ
ー（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した。グルタルアルデヒ
ド処理した固定化微生物微粒子を用いて下記の酵素安定
性試験を行った。まず、固定化微生物微粒子を３０％
（ｗ／ｖ）アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７．７）水溶液に、２℃、１７時間、浸
漬した後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０ｍＭリ
ン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に洗浄し
た後、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活
性を実施例１と同様な方法で測定した。その結果、グル
タルアルデヒド処理した固定化微生物微粒子（含水率８
８％）における酵素安定性試験後の残存活性（酵素安定
性試験前に対する相対値）は４８．１％であった。な
お、酵素安定性試験後の残存活性は、実施例１で得られ
たグルタルアルデヒド処理した固定化微生物微粒子の場
合に比較して本実施例で得られたグルタルアルデヒド処
理した固定化微生物微粒子の場合の方がよりすぐれた値
であった。

【００１６】

【実施例４】グリセロール１．０重量％、ポリペプトン
０．５重量％、酵母エキス０．３重量％、マルトエキス
０．３重量％、イソバレロニトリル０．１重量％および
硫酸第一鉄、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸マンガンを
それぞれ０．００１重量％からなる殺菌済み培地（ｐＨ
７．２）により、３０℃、２日間、好気的に培養して得
たアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−Ｃ１
５−１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３８４３〕の菌体を遠心分
離(12,000xg,20min,４℃) によって回収した。回収した
菌体を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
７）で洗浄した後、遠心分離(12,000xg,20min,４℃) に
よって菌体を回収し、洗浄菌体（含水率７７％）を得
た。得られた洗浄菌体８ｇと５０ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７．７）２ｇを５０ｍｌのビーカーに入
れ、十分に混合した。さらに、該混合物にあらかじめ減
圧脱気したアクリルアミド単量体水溶液（アクリルアミ
ド１．９ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド
０．１ｇ、水５ｇ）を加え、スターラーを用いて、十分
に撹拌混合した後、撹拌しながら重合促進剤である５％
（ｗ／ｗ）の３−（ジメチルアミノ）プロピオニトリル
水溶液１ｇを加えることによって微生物懸濁単量体水溶
液を得た。該微生物懸濁単量体水溶液に重合開始剤であ
る２．５％（ｗ／ｗ）の過硫酸カリウム水溶液２．０ｇ
を加えた。重合は重合開始剤を加えると数分後に始まっ
たが、この状態で１時間静置した。なお、これらの重合
操作はすべて窒素雰囲気下で行った。重合終了後、得ら
れた固定化微生物をブレンダーを用いて破砕した。破砕
された固定化微生物を、５０ｍＭリン酸カリウムバッフ
ァー（ｐＨ７．７）で洗浄し、ふるい（１６から６０メ
ッシュ）でふるい分けを行い、直径２５０μｍから１０
００μｍの球状粒子（以下、固定化微生物微粒子と記
す。）を回収した。回収された固定化微生物微粒子（含
水率８８％）２０ｇと０．６重量％のグルタルアルデヒ
ド−５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）
水溶液２０ｇを混合し、該混合物を２℃で４時間反応さ
せた（グルタルアルデヒド終濃度は０．３重量％であ
る）。反応終了後、反応物を５０ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した。グルタルア
ルデヒド処理した固定化微生物微粒子を用いて下記の酵
素安定性試験を行った。まず、固定化微生物微粒子を３
０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリウ
ムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液に、２℃、１７時
間、浸漬した後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に
洗浄した後、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換
する活性を実施例１と同様な方法で測定した。その結
果、グルタルアルデヒド処理した固定化微生物微粒子
（含水率８８％）における酵素安定性試験後の残存活性
（酵素安定性試験前に対する相対値）は２９．９％であ
った。すなわち、本発明には後述する比較例３との比較
から明らかなように約６．０倍のアクリルアミドに対す
る安定性向上が認められた。

【００１７】

【比較例３】固定化微生物微粒子を実施例４と同様な方
法で得た。得られた固定化微生物微粒子を用いて下記の
酵素安定性試験を行った。まず、固定化微生物微粒子を
３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリ
ウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液に、２℃、１７時
間、浸漬した後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に
洗浄した後、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換
する活性を実施例１と同様な方法で測定した。その結
果、グルタルアルデヒド未処理の固定化微生物微粒子
（含水率８８％）における酵素安定性試験後の残存活性
（酵素安定性試験前に対する相対値）は５．０％であっ
た。

【００１８】

【実施例５】グリセロール１．０重量％、ポリペプトン
０．５重量％、酵母エキス０．３重量％、マルトエキス
０．３重量％、イソバレロニトリル０．１重量％および
硫酸第一鉄、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸マンガンを
それぞれ０．００１重量％からなる殺菌済み培地（ｐＨ
７．２）により、３０℃、２日間、好気的に培養して得
たアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−Ｃ１
５−１株の菌体〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３８４３〕を遠心分
離(12,000xg,20min,４℃) によって回収した。回収した
菌体を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
７）で洗浄した後、遠心分離(12,000xg,20min,４℃) に
よって菌体を回収し、洗浄菌体（含水率７７％）を得
た。得られた洗浄菌体８ｇ、２５％（ｗ／ｗ）グルタル
アルデヒド水溶液０．１２ｇおよび５０ｍＭリン酸カリ
ウムバッファー１．８８ｇを５０ｍｌのビーカーに入
れ、十分に混合した後、該混合物を氷冷下に１時間放置
した（グルタルアルデヒド終濃度は０．３重量％であ
る）。さらに、該混合物にあらかじめ減圧脱気したアク
リルアミド単量体水溶液（アクリルアミド１．９ｇ、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．１ｇ、水５
ｇ）を加え、スターラーを用いて、十分に撹拌混合した
後、撹拌しながら重合促進剤である５％（ｗ／ｗ）の３
−（ジメチルアミノ）プロピオニトリル水溶液１ｇを加
えることによって微生物懸濁単量体水溶液を得た。該微
生物懸濁単量体水溶液に重合開始剤である２．５％（ｗ
／ｗ）の過硫酸カリウム水溶液２．０ｇを加えた。重合
は重合開始剤を加えると数分後に始まったが、この状態
で１時間静置した。なお、これらの重合操作はすべて窒
素雰囲気下で行った。重合終了後、得られた固定化微生
物をブレンダーを用いて破砕した。破砕された固定化微
生物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
７）で洗浄し、ふるい（１６から６０メッシュ）でふる
い分けを行い、直径２５０μｍから１０００μｍの球状
粒子（以下、固定化微生物微粒子と記す。）を回収し
た。回収された固定化微生物微粒子（含水率８８％）２
０ｇと０．６重量％のグルタルアルデヒド−５０ｍＭリ
ン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．７）水溶液２０ｇを
混合し、該混合物を２℃で４時間反応させた（グルタル
アルデヒド終濃度は０．３重量％である）。反応終了
後、反応物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．７）で十分に洗浄した。グルタルアルデヒド処理し
た固定化微生物微粒子を用いて下記の酵素安定性試験を
行った。まず、固定化微生物微粒子を３０％（ｗ／ｖ）
アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．７）水溶液に、２℃、１７時間、浸漬した
後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（ｐＨ７．７）で十分に洗浄した後、
アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を実
施例１と同様な方法で測定した。その結果、グルタルア
ルデヒド処理した固定化微生物微粒子（含水率８８％）
における酵素安定性試験後の残存活性（酵素安定性試験
前に対する相対値）は３２．５％であった。

【００１９】

【実施例６】シュークロース１．０重量％、ポリペプト
ン０．５重量％、酵母エキス０．３重量％、マルトエキ
ス０．３重量％、および硫酸第一鉄、塩化コバルト、硫
酸亜鉛、硫酸マンガンをそれぞれ０．００１重量％から
なる殺菌済み培地（ｐＨ７．２）により、５５℃で１日
間、好気的に培養して得たバチルス・スミシー（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）ＳＣ−Ｊ０５−１〔ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４０３７〕の菌体を遠心分離(12,000xg,20
min,４℃) によって回収した。回収した菌体を５０ｍＭ
リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で洗浄した
後、遠心分離(12,000xg,20min,４℃) によって菌体を回
収し、洗浄菌体（含水率７７％）を得た。得られた洗浄
菌体８ｇと５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．０）２ｇを５０ｍｌのビーカーに入れ、十分に混合
した。さらに、該混合物にあらかじめ減圧脱気したアク
リルアミド単量体水溶液（アクリルアミド１．９ｇ、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．１ｇ、水５
ｇ）を加え、スターラーを用いて、十分に撹拌混合した
後、撹拌しながら重合促進剤である５％（ｗ／ｗ）の３
−（ジメチルアミノ）プロピオニトリル水溶液１ｇを加
えることによって微生物懸濁単量体水溶液を得た。該微
生物懸濁単量体水溶液に重合開始剤である２．５％（ｗ
／ｗ）の過硫酸カリウム水溶液２．０ｇを加えた。重合
は重合開始剤を加えると数分後に始まったが、この状態
で１時間静置した。なお、これらの重合操作はすべて窒
素雰囲気下で行った。重合終了後、得られた固定化微生
物をブレンダーを用いて破砕した。破砕された固定化微
生物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
０）で洗浄し、ふるい（１６から６０メッシュ）でふる
い分けを行って、直径２５０μｍから１０００μｍの球
状粒子（以下、固定化微生物微粒子と記す。）を回収し
た。回収された固定化微生物微粒子（含水率８８％）２
０ｇと０．６重量％のグルタルアルデヒド−５０ｍＭリ
ン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）水溶液２０ｇを
混合し、該混合物を２℃で４時間反応させた（グルタル
アルデヒド終濃度は０．３重量％である）。反応終了
後、反応物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．０）で十分に洗浄した。グルタルアルデヒド処理し
た固定化微生物微粒子を用いて下記の酵素安定性試験を
行った。まず、固定化微生物微粒子を３０％（ｗ／ｖ）
アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．０）水溶液に、２℃、１７時間、浸漬した
後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（ｐＨ７．０）で十分に洗浄した後、
アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を実
施例１と同様な方法で測定した。その結果、グルタルア
ルデヒド処理した固定化微生物微粒子（含水率８８％）
における酵素安定性試験後の残存活性（酵素安定性試験
前に対する相対値）は８３．７％であった。すなわち、
本発明には後述する比較例４との比較から明らかなよう
に約６．７倍のアクリルアミドに対する安定性向上が認
められた。

【００２０】

【比較例４】固定化微生物微粒子を実施例６と同様な方
法で得た。得られた固定化微生物微粒子を用いて下記の
酵素安定性試験を行った。まず、固定化微生物微粒子を
３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド−５０ｍＭリン酸カリ
ウムバッファー（ｐＨ７．０）水溶液に、２℃、１７時
間、浸漬した後、該固定化微生物微粒子を回収し、５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で十分に
洗浄した後、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換
する活性を実施例１と同様な方法で測定した。その結
果、グルタルアルデヒド未処理の固定化微生物微粒子
（含水率８８％）における酵素安定性試験後の残存活性
（酵素安定性試験前に対する相対値）は１２．５％であ
った。

【００２１】

【実施例７】シュークロース１．０重量％、ポリペプト
ン０．５重量％、酵母エキス０．３重量％、マルトエキ
ス０．３重量％、および硫酸第一鉄、塩化コバルト、硫
酸亜鉛、硫酸マンガンをそれぞれ０．００１重量％から
なる殺菌済み培地（ｐＨ７．２）により、５５℃で１日
間、好気的に培養して得たバチルス・スミシー（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）ＳＣ−Ｊ０５−１〔ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４０３７〕の菌体を遠心分離(12,000xg,20
min,４℃) によって回収した。回収した菌体を５０ｍＭ
リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で洗浄した
後、遠心分離(12,000xg,20min,４℃) によって菌体を回
収し、洗浄菌体（含水率７７％）を得た。得られた洗浄
菌体８ｇ、２５％（ｗ／ｗ）グルタルアルデヒド水溶液
０．１２ｇおよび５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．０）１．８８ｇを５０ｍｌのビーカーに入
れ、十分に混合した後、該混合物を氷冷下に１時間放置
した（グルタルアルデヒド終濃度は０．３重量％であ
る）。さらに、該混合物にあらかじめ減圧脱気したアク
リルアミド単量体水溶液（アクリルアミド１．９ｇ、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．１ｇ、水５
ｇ）を加え、スターラーを用いて、十分に撹拌混合した
後、撹拌しながら重合促進剤である５％（ｗ／ｗ）の３
−（ジメチルアミノ）プロピオニトリル水溶液１ｇを加
えることによって微生物懸濁単量体水溶液を得た。該微
生物懸濁単量体水溶液に重合開始剤である２．５％（ｗ
／ｗ）の過硫酸カリウム水溶液２．０ｇを加えた。重合
は重合開始剤を加えると数分後に始まったが、この状態
で１時間静置した。なお、これらの重合操作はすべて窒
素雰囲気下で行った。重合終了後、得られた固定化微生
物をブレンダーにて破砕した。破砕された固定化微生物
を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で
洗浄し、ふるい（１６から６０メッシュ）でふるい分け
を行い、直径２５０μｍから１０００μｍの球状粒子
（以下、固定化微生物微粒子と記す。）を回収した。回
収された固定化微生物微粒子（含水率８８％）２０ｇと
０．６重量％のグルタルアルデヒド−５０ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（ｐＨ７．０）水溶液２０ｇを混合
し、該混合物を２℃で４時間反応させた（グルタルアル
デヒド終濃度は０．３重量％である）。反応終了後、反
応物を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
０）で十分に洗浄した。グルタルアルデヒド処理した固
定化微生物微粒子を用いて下記の酵素安定性試験を行っ
た。まず、固定化微生物微粒子を３０％（ｗ／ｖ）アク
リルアミド−５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．０）水溶液に、２℃、１７時間、浸漬した後、該固
定化微生物微粒子を回収し、５０ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７．０）で十分に洗浄した後、アクリロ
ニトリルをアクリルアミドに変換する活性を実施例１と
同様な方法で測定した。その結果、グルタルアルデヒド
処理した固定化微生物微粒子（含水率８８％）における
酵素安定性試験後の残存活性（酵素安定性試験前に対す
る相対値）は８７．１％であった。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、固定化微生物が有する、
ニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性の
失活または低下を抑制し、該水和活性の安定性を向上さ
せることができた。このため、アミド化合物を反応液中
に高濃度蓄積させる場合にも、より安定したアミド化合
物の製造が可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 光田 賢 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ニトリル化合物に、ニトリル化合物をアミ
   ド化合物に変換させる水和活性を有する微生物を固定化
   して得られる固定化微生物を作用させ、該ニトリル化合
   物をアミド化合物に変換させる方法において、該固定化
   微生物をニトリル化合物に作用させる前に、該固定化微
   生物を直径２５０μｍから１０００μｍに粒子化し、得
   られる微粒子を終濃度０．２重量％から１．０重量％の
   水溶性ジアルデヒドで処理する工程を含むことを特徴と
   するアミド化合物の製造方法。
2. 【請求項２】ニトリル化合物に、ニトリル化合物をアミ
   ド化合物に変換させる水和活性を有する微生物を固定化
   して得られる固定化微生物を作用させ、該ニトリル化合
   物をアミド化合物に変換させる方法において、該固定化
   微生物をニトリル化合物に作用させる前に、該固定化微
   生物を直径２５０μｍから１０００μｍに粒子化し、得
   られる微粒子を終濃度０．２重量％から１．０重量％の
   水溶性ジアルデヒドで処理することを特徴とする固定化
   微生物が有する、ニトリル化合物をアミド化合物に変換
   させる水和活性の安定性向上方法。
3. 【請求項３】請求項２記載の方法によってニトリル化合
   物をアミド化合物に変換させる水和活性の安定性が向上
   された固定化微生物。