JPH08168380A - 酵母の高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 酵母のグリセロアルデヒド−３−ホスフェイ
トデヒドロゲナーゼ構造遺伝子の５’側上流の非翻訳領
域であって、その領域が構造遺伝子の５’側上流約１５
０塩基対よりさらに５’側上流までの塩基対を含む非翻
訳領域と外来遺伝子とから成るＤＮＡ断片。 【効果】 このＤＮＡ断片を酵母内で発現可能な状態で
ベクターに組み込み、このベクタープラスミドで酵母を
形質転換し、形質転換体を培養することにより、従来の
プロモーターを使用したものに比較して、著しく高い効
率でポリペプチド又はタンパクを発現できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酵母サッカロマイセスの
解糖系酵素の１つであるグリセロアルデヒド−３−ホス
フェイトデヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰ−ＤＨと略称す
る）を支配している遺伝子（オペロン）のプロモーター
と有用な目的ペプチド遺伝子とから成るＤＮＡ断片に関
する。更に詳しくは、ＧＡＰ−ＤＨ構造遺伝子の開始コ
ドンより１５０塩基対よりさらに５’側上流の非翻訳領
域と外来の異種遺伝子とから成るＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで遺伝子操作技術を用いて医薬上
有用なペプチド類、例えばソマトスタチン、インスリ
ン、成長ホルモン、各種インターフエロン、インフルエ
ンザウイルス並びに肝炎Ｂウイルス蛋白、サイモシンα
₁、β−エンドルフィン、α−ネオエンドルフィン、セ
クレチン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質
など多くの物質が微生物又は動物細胞で作られるように
なっている。

【０００３】これらの多くは宿主として原核細胞（ｐｒ
ｏｋａｒｙｏｔｅ）である大腸菌を用いているが、近年
有核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）である酵母を宿主とし
て利用することが注目されている。これは、酵母の培養
条件が簡単であり、分裂速度が速いこと、安全性が高い
こと、特にサッカロマイセス酵母では遺伝生化学的解析
がより多くなされていることなどの理由による。しか
し、酵母における外来異種ペプチド産生に関する例は少
なく、α−インターフエロン、ＨＢ肝炎表面抗原蛋白、
α−ネオエンドルフィンにみられる程度である。

【０００４】一方、外来異種遺伝子、例えば化学的に合
成した遺伝子、ｍＲＮＡから逆転写酵素によって得られ
る相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）遺伝子、あるいは染色体か
ら適当な処理によって得られる遺伝子などを発現させよ
うとするには、用いる宿主に適したプロモーター領域の
存在が必須である。プロモーターの良し悪しが目的とす
るペプチド遺伝子発現に大きく影響するため、これまで
種々のプロモーターを用いて発現プラスミドベクターの
開発が行われてきた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、報告さ
れている酵母を宿主とする外来遺伝子の発現ベクターは
大腸菌を宿主とするベクターに比べ、目的とする外来遺
伝子の発現効率は十分とは言えない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵母サッ
カロマイセスの解糖系を支配している酵素であるグリセ
ロアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＡＰ−ＤＨ）が酵母菌体で多量に生産されているのに着
目し、この酵素をコードしているオペロンのプロモータ
ー遺伝子の利用を考え、研究を進めた。この結果、この
プロモーターが酵母での異種または同種のペプチドの生
産に非常に有用であることを見出し、このプロモーター
の下流に異種または同種ペプチド遺伝子とを結合した酵
母菌のベクターを作成し、これを用いて酵母の形質転換
を行い、形質転換の行われた酵母を分離解析することに
より本発明を完成した。

【０００７】本発明のＤＮＡ断片及び当該ＤＮＡ断片を
挿入した酵母ベクターは次のようにして作成される。

【０００８】サッカロマイセス酵母ＸＳ １６−５Ｃ株
［ｃｉｒ⁰］の核ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し
て得た１．９ｋｂから２．２ｋｂに相当するＤＮＡ断片
を適当なプラスミドベクター、例えばプラスミドｐＢＲ
３２２のＨｉｎｄIIIサイトにクローニングして、酵母
の遺伝子ライブラリーを得た。その遺伝子ライブラリー
から２．１ｋｂの長さの酵母ＤＮＡ断片を持ち、かつそ
のＤＮＡ断片が制限酵素ＳａｌＩで１ケ所、制限酵素Ｈ
ｐａＩで１ケ所切断される断片を持つクローンを分離し
た。このプラスミドは、挿入されたＤＮＡ断片について
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（ＰＮＡＳ７４、５６０
−５６４（１９７７））により塩基配列を決定し、この
結果をホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５４，９８３９（１９７９）」の報告と比
較検討することにより、目的とするＧＡＰ−ＤＨ遺伝子
が挿入されていることを確認できる。

【０００９】このようにしてＧＡＰ−ＤＨ遺伝子が挿入
されたプラスミドを特定の制限酵素で切断し、上記遺伝
子を含むＤＮＡ断片を選択マーカーを持つ酵母菌ベクタ
ー、好しくは操作の便宜上大腸菌−酵母シャトルベクタ
ーに挿入する。

【００１０】次に、このベクター中のＧＡＰ−ＤＨ遺伝
子のＣ末端近くにある制限酵素ＳａｌＩ切断部位に、読
みわく（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が合うように、
予じめ得ている目的ペプチド遺伝子を含む断片を挿入す
る。このようにして得たＧＡＰ−ＤＨ遺伝子および目的
ペプチド遺伝子を含むプラスミドにより酵母を形質転換
する。

【００１１】目的ペプチド遺伝子としては外来性異種ペ
プチド遺伝子および酵母内のＧＡＰ−ＤＨ遺伝子以外の
ペプチド遺伝子（同種ペプチド遺伝子）の両方を含むも
のとする。

【００１２】なお、ここで外来性異種ペプチド遺伝子
は、ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の一部と外来遺伝子とが融合さ
れた遺伝子を含むものである。

【００１３】このように形質転換された酵母において、
ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子プロモーターが目的ペプチド遺伝子
の発現に非常に優れていることが認められた。

【００１４】即ち、Ｈｏｌｌａｎｄらにより開示された
ＧＡＰ−ＤＨ構造遺伝子の５’側上流１５０塩基対（Ｊ
ＢＣ ２５４，９８３９−９８４５，１９７９，具体的
には９８４２頁）よりさらに５’側上流の非翻訳領域を
含む領域をプロモーター領域として用いることにより、
極めて高い異種ペプチド、または蛋白の生産性が認めら
れたといえる。

【００１５】又、目的ペプチドの酵母における生産性
は、ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の３’末端非翻訳領域をプラス
ミド中の目的ペプチド遺伝子の下流に付加することによ
って著しく上昇することが認められている。この３’末
端非翻訳領域の付加による効果については特願昭５６−
１６７６１５号に詳細に説明されている。

【００１６】上記のような３’末端非翻訳領域を利用す
る方法およびこの領域も挿入されているプラスミドおよ
びその利用も本発明の範囲に含むものとする。

【００１７】本発明を以下の実施例により更に詳細に説
明する。

【００１８】具体的実施例では、目的ペプチド遺伝子と
してアルファネオエンドルフィン（αＮＥ）遺伝子を用
い、ＧＡＰ−ＤＨプロモーター −ＧＡＰ−ＤＨ構造遺
伝子−αＮＥ遺伝子（ｐＧＡＰ−ＧＡＰ−αＮＥと略）
およびｐＧＡＰ−ＧＡＰ−αＮＥ−３’ＧＡＰ（ＧＡＰ
−ＤＨ遺伝子の３’末端非翻訳領域を付加したもの）の
ような配列から、ＧＡＰ−αＮＥ雑種蛋白質として目的
物質（αＮＥ）を生産する方法を記しているが、ＧＡＰ
−ＤＨプロモーターの位置から適当な塩基配列をおいて
目的遺伝子、例えばインターフエロンのようなペプチド
をコードする遺伝子を付加し目的ペプチドを直接生産さ
せることもできる。このようにＧＡＰ−ＤＨプロモータ
ーは広く外来遺伝子の発現並びにアルファネオエンドル
フィン以外の異種および同種ペプチドの生産に活用され
うるものである。

【００１９】

【実施例】１．ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のクローニング（図１参照） サッカロマイセス酵母ＸＳ１６−５Ｃ［ｃｉｒ⁰］（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ
Ｓ１６−５Ｃ ＭＡＴａ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ｔｒｙｐ
１［ｓｉｒ⁰］）を１ｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキ
ス、２％ポリペプトン、２％グルコース）で３０℃、２
４時間培養し、得られた菌体をクライヤー（Ｃｒｙｅ
ｒ）らの方法（Ｃｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９
７５，ｐｐ３９−４４）に従って総ＤＮＡを分離した。

【００２０】５０μｇの酵母ＤＮＡを１００単位のＨｉ
ｎｄIIIを用いて３７℃で２時間加温することにより切
断した。反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動によ
り分離し、１．９ｋｂ〜２．２ｋｂに相当するＨｉｎｄ
IIIによるＤＮＡ断片を分離精製した。一方、０．５μ
ｇのｐＢＲ３２２をＨｉｎｄIII１単位を用いてＴＡ緩
衝液（３３ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、６６ｍＭ酢酸
カリ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ）中で３７℃で１時間反応させることにより切断し
た。次にこれら両ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ用緩衝
液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂，１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ）に溶
解し、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１５℃で１
８時間反応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌの
ＣａＣｌ₂で処理したＥ．ｃｏｌｉＪＡ２２１に加えて
形質転換し、アンピシリン耐性クローンを得た。このう
ちテトラサイクリンに対して感受性のあるクローンを４
００個選び、そのプラスミドＤＮＡの解析をアルカリ変
性法により行った。

【００２１】既に報告されているホランド等の解析結果
によると、ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を含む２．１ｋｂの断片
にはＨｐａＩおよびＳａｌＩの切断部位がそれぞれ１ケ
所ある。２．１ｋｂのＨｉｎｄIII断片はＳａｌＩによ
り０．１４ｋｂと１．９６ｋｂとの２つの断片に切断さ
れ、またＨｐａＩにより１．３９ｋｂと０．７１ｋｂと
の２つの断片にそれぞれ切断されている。

【００２２】発明者らは上記の４００個のクローンにつ
いて検討した結果、上記ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を含む断片
におけるのと同じ制限酵素切断部位を有するプラスミド
を持つクローンが１つ得られたことが判った。このクロ
ーンのプラスミドをｐＹｇａｐ８７とした。

【００２３】このｐＹｇａｐ８７のＳａｌＩ切断部位に
近い方のＨｉｎｄIII切断によって得られる粘着末端に
γ−［³²Ｐ］−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて標識し、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法に従い
ＤＮＡの塩基配列を決定した。この結果を前記ホランド
らの報告と比較検討し、ｐＹｇａｐ８７はＧＡＰ−ＤＨ
遺伝子を持つことを確認した。このｐＹｇａｐ８７によ
って形質転換された大腸菌Ｋ−１２株はＥ．ｃｏｌｉ
ＳＢＭ１５１と命名し、工業技術院微生物工業研究所
（微工研）に寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−６７６２
（ブタペスト条約に基く国際寄託の受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３８２）を得ている。

【００２４】２．ｐＹＥ２３７のプラスミドベクターの
作製 ｐＹＥ２３７ベクターは特願昭５６−１６７６１５号に
開示されたｐＹＥ２２７ベクターからそのＳａｌＩ切断
点を消失させたプラスミドであり、次のように作製され
た。

【００２５】５μｇのｐＹＥ２２７を１０単位のＳａｌ
Ｉを用いＴＡ緩衝液中で３７℃１．５時間反応させ切断
した。

【００２６】続いて６５℃で加熱することによりＳａｌ
Ｉを失活させた後、４種のｄＮＴＰを０．３ｍＭ；２−
メルカプトエタールを８ｍＭとなる様に加え１単位のＴ
４ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃３０分間反応さ
せ、ＳａｌＩ切断で生じた粘着末端を消失させた。反応
終了後フェノール抽出を１回行った後、２容のエタノー
ルでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿物を２０μｌのＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解後、５単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い１５℃１８時間反応させることにより結
合させた。

【００２７】反応液を供与ＤＮＡとして常法に従いＥ．
ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に形質転換し、アンピシリン耐性
クローンを得た。これらのクローンよりＤＮＡを分離解
析し、ｐＹＥ２２７よりＳａｌＩの切断部位の消失した
ｐＹＥ２３７を得た。

【００２８】３．ｐＹＥ１２０１酵母−大腸菌シャトル
ベターの作製（図２参照） ５μｇのｐＹＥ２３７を２０単位のＨｉｎｄIIIを用
い、ＴＡ緩衝液中で３７℃１時間反応させた。以後制限
酵素の反応はＴＡ緩衝液中で３７℃１時間反応させた。
一方既に得られていたプラスミドｐＹｇａｐ８７ ５μ
ｇを２０単位のＨｉｎｄIIIを用い切断後、寒天電気泳
動法により２．１ｋｂのＤＮＡフラグメント（ＧＡＰ−
ＤＨ遺伝子）を分離し寒天片よりＤＮＡを溶出、精製し
た。この２．１ｋｂ ＤＮＡ断片とｐＹＥ２３７のＨｉ
ｎｄIII切断ＤＮＡを２０μｌ ＤＮＡリガーゼ用緩衝
液に溶解し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃
１６時間反応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌ
のＣａＣｌ₂処理した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に加
え形質転換を行った。

【００２９】アンピシリン耐性トランスホーマントか
ら、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離解析し、ｐＹＥ
１２０１を得たことを確認した。

【００３０】このプラスミドによって形質転換された酵
母（ＸＳ１６−５Ｃ）株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＢＭ３２１と命名し、微工
研に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−６７６６（ブタペスト条約
に基く国際寄託の受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１）と
して寄託した。

【００３１】４．αＮＥ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ
（ｐαＮＥ５’−ＳａｌＩ−ｃ）の作製 Ｎｅｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０
１７４１〜１７５４（１９８２）の方法に従いαＮＥ
遺伝子（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片）を作製
した。

【００３２】この様にして得られた４６塩基対より成る
αＮＥ遺伝子をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ・ＢａｍＨＩ
両制限酵素で切断した大きい方の断片（４ｋｂ）に挿入
しｐＹαＮＥ５’を得た。次にＧＡＰ−ＤＨ遺伝子中に
あるＳａｌＩ部位に読み枠を合せ、挿入する為に、５’
−ＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣ−３’よりなるＳａｌＩリンカ
ーを挿入したプラスミドｐＹαＮＥ５’（ＳａｌＩ）−
ｃを得た。５μｇのｐＹαＮＥ５’を１０単位のＥｃｏ
ＲＩを用いＴＡ緩衝液中で３７℃１時間加温することに
より切断した。６５℃で加熱後、０．３ｍＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ及び８ｍＭの２−メルカプトエタノールと
なる様にそれぞれ加え、３７℃３０ｍｉｎ反応させＥｃ
ｏＲＩの粘着末端を満した。反応終了後フェノール抽出
を１回行ってからエタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。一方、ＳａｌＩリンカー１μｇを５０ｍＭトリス塩
酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中で２５ｎｍｏ
ｌのＡＴＰ，１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを用
いて３７℃，４５分間反応させ、５’末端をリン酸化し
た。これらのＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝
液とし５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃１８時
間反応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌのＣａ
Ｃｌ₂処理したＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に加え形質転
換を行った。アンピシリン耐性形質転換体から常法に従
いプラスミドＤＮＡを分離解析し、ｐＹαＮＥ５’−Ｓ
ａｌＩ−ｃを得た。

【００３３】５．アルファネオエンドルフィン（αＮ
Ｅ）遺伝子の挿入（図２参照） ５μｇのｐＹＥ１２０１を２０単位のＢａｍＨＩ，２０
単位のＳａｌＩで２つの断片に切断し寒天電気泳動にて
分離後、大きい断片を寒天より溶出させ精製した。一方
αＮＥ遺伝子を含む断片はｐαＮＥ５’−ＳａｌＩ−ｃ
５０μｇを１００単位のＢａｍＨＩ，１００単位のＳ
ａｌＩを用いて切断後、５％ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動法により分離し５０塩基対に相当するＤＮ
Ａ断片を溶出・精製して得た。以上の２つのＤＮＡ断片
を２０μｌのＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解し２単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、１５℃１６時間反応させた。
この反応液１０μｌを０．３ｍｌのＣａＣｌ₂処理した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に加え形質転換を行い、アン
ピシリン耐性形質転換体から常法に従いプラスミドＤＮ
Ａを分離解析しｐＹαＮＥ５３を得た。

【００３４】即ち、本プラスミドにおける、α−ネオエ
ンドルフィンをＧＡＰ−ＤＨ酵素の一部との融合蛋白と
して生産させるためのプロモーター領域としては、前記
Ｈｏｌｌａｎｄらにより開示された５’末端（該酵素遺
伝子の開始コドンより１５０塩基対上流）よりさらに
５’側上流の非翻訳領域を含んでいることを示してい
る。このようなプロモーター領域を用いて、異種ペプチ
ドまたは蛋白を酵母中で極めて効率的に発現させた例は
知られていない。

【００３５】６．ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子３’末端領域のｐ
ＹαＮＥ５３への付加（図３参照） ｐＹαＮＥ５３にＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の３’末端領域を
組込まれたαＮＥ遺伝子の下流に付加する具体例を以下
に示す。

【００３６】１０μｇのｐＹαＮＥ５３を３０単位のＢ
ａｍＨＩで切断後、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用い、６７ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール１
６．６ｍＭ硫酸アンモン、６．７μＭ ＥＤＴＡ、０．
３ｍＭの４種のｄＮＴＰを含む緩衝液（Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ緩衝液）中３７℃３０分間反応させ、ＢａｍＨ
Ｉ切断で生じた粘着末端をうめた。一方ＧＡＰ−ＤＨ遺
伝子の３’末端領域をｐＹＥ１２０１より得た１０μｇ
のｐＹＥ１２０１を３０単位のＳａｌＩで切断後、１単
位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い同緩衝液中で３７℃
３０分間反応させ、ＳａｌＩ切断で生じた粘着末端をう
めた。次にそれぞれ３０単位のＰｓｔＩで切断し、ｐＹ
αＮＥ５３からはαＮＥ遺伝子を含む断片、ｐＹＥ１２
０１からはＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の３’末端領域を含む断
片をアガロースゲル電気泳動で分離し精製した。次に両
断片を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中５単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃１７時間反応させ結
合させた。この反応液１０μｌを用い上記の方法で形質
転換体を得、それよりプラスミドＤＮＡを分離・解析し
ｐＹαＮＥ１５５を得たことを確認した。

【００３７】７．酵母の形質転換および培養 上記のようにして得られたプラスミドｐＹＥ１２０１、
ｐＹαＮＥ５３、ｐＹαＮＥ１５５をＢｅｇｇｓ Ｊ．
Ｄ．， Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２７ ５１０４（１９
７８）に記載の方法に従って酵母（サッカロマイセス
セレビジエＸＳ１６−５Ｃ）に形質転換した。得られた
形質転換体をＹＰＤ培地で３０℃、２４時間振とう培養
後、遠心分離により菌体を回収した。１ｍｌの培養液か
ら得られた菌体に０．５ｍｌの冷アセトンを加え、−２
０℃で１〜２４時間放置した後、凍結乾燥した。この乾
燥菌体に５ｍｇ／ｍｌの臭化シアンを含む７０％ギ酸溶
液に懸濁し２４時間暗所で反応させた。この試料を凍結
乾燥後０．１ｍｌの０．１Ｎ酢酸でαＮＥを溶出させ
０．１ｍｌの１．３Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）で中和
後ＲＩＡの試料とした。ＲＩＡはＮ．Ｍｉｎａｍｉｎｏ
ｅｔ ａｌ，ＢＢＲＣ Ｖｏｌ．１０２ ２２６（１
９８１）に記載の方法に準じて行った。その結果を表１
に示した。ＧＡＰ−ＤＨプロモーターを利用しそのＮ末
端（３２３アミノ酸残基）の直後にαＮＥを結合した雑
種蛋白質として、ｐＹαＮＥ５３の場合（ＧＡＰ−ＤＨ
遺伝子の３’末端領域が無い）では１細胞当り２００万
分子発現していた。さらに、本発明者らは、本発明にお
けるプロモーター領域の改変実験においてＧＡＰ−ＤＨ
構造遺伝子の開始コドンの５’側上流約３００塩基対お
よび４８０塩基対をプロモーター領域として用いた場合
のα−ネオエンドルフィンの生産量は、いずれもＧＡＰ
−ＤＨ構造遺伝子の開始コドンの５’側上流約９００塩
基対をプロモーター領域として用いた場合の生産量より
１／１０（１０分の１）に低下している事実を見いだし
た。

【００３８】又、前記のｐＹαＮＥ５３にＧＡＰ−ＤＨ
遺伝子の３’末端領域を付加したもの（ｐＹαＮＥ１５
５）については−ｐＹαＮＥ５３の約１０倍に相当する
１細胞当り２０００万分子発現していた。培養液当りで
は約２μｇ／ｍｌの生産が認められた。プラスミドの安
定性について検討したところ１０世代非選択条件（ＹＰ
Ｄ培地で培養）で培養したところ、完全なＧＡＰ−ＤＨ
を持つプラスミドｐＹＥ１２０１の場合は１０〜２０％
とかなり不安定であった。しかしαＮＥ遺伝子をＣ末端
付近に結合させたプラスミド（ｐＹαＮＥ５３，ｐＹα
ＮＥ１５５）の場合は多少安定性は良くなっていた。

【００３９】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のクローニングを示す。

【図２】ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を含みαＮＥ遺伝子を組込
んだプラスミドの構成法を示す。

【図３】図２で得られたプラスミドｐＹαＮＥ５３上の
αＮＥ遺伝子の下流にＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の３’末端非
翻訳部位が付加されたプラスミドの構成法を示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成６年５月２５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】追加

【補正内容】

【図４】 図１において遺伝子ライブラリーからＨｉｎ
ｄIIIで切り出したＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を示
す図である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】追加

【補正内容】

【図４】

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母のグリセロアルデヒド−３−ホスフ
   ェイトデヒドロゲナーゼ構造遺伝子の５’側上流約１５
   ０塩基対よりさらに５’側上流までの非翻訳領域と外来
   遺伝子とから成るＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 前記非翻訳領域が、前記構造遺伝子の
   ５’側上流約１５０塩基対よりさらに５’側上流約３５
   ０〜７５０塩基対のいずれかの塩基対までの領域である
   ことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 前記非翻訳領域が、前記構造遺伝子の
   ５’側上流約１５０塩基対よりさらに５’側上流約７５
   ０塩基対までの領域であることを特徴とする請求項１記
   載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 酵母のグリセロアルデヒド−３−ホスフ
   ェイトデヒドロゲナーゼ構造遺伝子の５’側上流約１５
   ０塩基対よりさらに５’側上流までの非翻訳領域と外来
   遺伝子とから成るＤＮＡ断片を含むことを特徴とする酵
   母発現用プラスミド。
5. 【請求項５】 前記非翻訳領域が、前記構造遺伝子の
   ５’側上流約１５０塩基対よりさらに５’側上流約３５
   ０〜７５０塩基対のいずれかの塩基対までの領域である
   ことを特徴とする請求項４記載プラスミド。
6. 【請求項６】 前記非翻訳領域が、前記構造遺伝子の
   ５’側上流約１５０塩基対よりさらに５’側上流約７５
   ０塩基対までの領域であることを特徴とする請求項４記
   載のプラスミド。