JPH0576375A - 改良された酵母ベクター - Google Patents
改良された酵母ベクターInfo
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- JPH0576375A JPH0576375A JP4037800A JP3780092A JPH0576375A JP H0576375 A JPH0576375 A JP H0576375A JP 4037800 A JP4037800 A JP 4037800A JP 3780092 A JP3780092 A JP 3780092A JP H0576375 A JPH0576375 A JP H0576375A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 酵母２ミクロン−様プラスミドに由来する対
称的プラスミド及び崩壊性プラスミドを提供する。 【効果】 この新規なハイブリドベクターは細胞増殖中
に細胞に安定に保持され、そして大規模な回分培養及び
特に連続培養における異種性遺伝子の発現のために有用
である。
称的プラスミド及び崩壊性プラスミドを提供する。 【効果】 この新規なハイブリドベクターは細胞増殖中
に細胞に安定に保持され、そして大規模な回分培養及び
特に連続培養における異種性遺伝子の発現のために有用
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野に関
し、そして酵母２ミクロンプラスミドに基く新規なハイ
ブリドベクターを提供する。この新規なハイブリドベク
ターは増殖中の細胞に安定に維持され、そして大規模な
バッチにおいて、そして特に連続培養において酵母中で
異種性遺伝子を発現させるために有用である。
し、そして酵母２ミクロンプラスミドに基く新規なハイ
ブリドベクターを提供する。この新規なハイブリドベク
ターは増殖中の細胞に安定に維持され、そして大規模な
バッチにおいて、そして特に連続培養において酵母中で
異種性遺伝子を発現させるために有用である。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学において、原核性宿主又は真
核性宿主のための多くのポリペプチド発現系がすでに知
られているが、既知の系より有利な新規な系の必要性が
常に存在する。真核性である酵母、例えばサッカロミセ
ス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）が宿主として非常に広く使用されて
おり、そのための種々のタイプのベクターが存在する。
ベクターの１つのタイプは、自律複製配列（ＡＲＳ）を
含有せず、そしてそれ故に細胞中染色体外に維持され得
ない一体化（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ベクターであ
る。
核性宿主のための多くのポリペプチド発現系がすでに知
られているが、既知の系より有利な新規な系の必要性が
常に存在する。真核性である酵母、例えばサッカロミセ
ス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）が宿主として非常に広く使用されて
おり、そのための種々のタイプのベクターが存在する。
ベクターの１つのタイプは、自律複製配列（ＡＲＳ）を
含有せず、そしてそれ故に細胞中染色体外に維持され得
ない一体化（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ベクターであ
る。
【０００３】このタイプのベクターは通常酵母ＤＮＡ成
分及び細菌ＤＮＡ成分から成る。このベクターは相同性
組換えにより、形質転換された酵母細胞のゲノムに組込
まれる。挿入されたＤＮＡの比較的高い安定性にもかか
わらず、これらのベクターは酵母における組換え蛋白質
の生産のためのベクターとして不利な点を有する。第一
の欠点は低い形質転換率であり、これは安定な形質転換
体の生成のために形質転換された細胞中で組換え現象が
起こらなければならないからである。第二は、安定に形
質転換された細胞中でのベクターのコピー数が少ないこ
とである。
分及び細菌ＤＮＡ成分から成る。このベクターは相同性
組換えにより、形質転換された酵母細胞のゲノムに組込
まれる。挿入されたＤＮＡの比較的高い安定性にもかか
わらず、これらのベクターは酵母における組換え蛋白質
の生産のためのベクターとして不利な点を有する。第一
の欠点は低い形質転換率であり、これは安定な形質転換
体の生成のために形質転換された細胞中で組換え現象が
起こらなければならないからである。第二は、安定に形
質転換された細胞中でのベクターのコピー数が少ないこ
とである。
【０００４】ベクターの他のタイプは染色体外複製ベク
ターである。これらのベクターは３種類にグループ分け
することができる。第一グループは自律複製配列（ＡＲ
Ｓ）を含有する。これらのベクターは通常細胞中に高コ
ピー数で存在するが、しかし細胞分裂の間にしばしば失
われる。第二グループはいわゆるＣＥＮベクターであっ
て、このものは細胞分裂の間にセントロマー（ｃｅｎｔ
ｒｏｍｅｒ）として作用するＤＮＡ配列を含有する。こ
れらのベクターは非常に安定であるが、細胞中に少コピ
ー数でのみ存在する。
ターである。これらのベクターは３種類にグループ分け
することができる。第一グループは自律複製配列（ＡＲ
Ｓ）を含有する。これらのベクターは通常細胞中に高コ
ピー数で存在するが、しかし細胞分裂の間にしばしば失
われる。第二グループはいわゆるＣＥＮベクターであっ
て、このものは細胞分裂の間にセントロマー（ｃｅｎｔ
ｒｏｍｅｒ）として作用するＤＮＡ配列を含有する。こ
れらのベクターは非常に安定であるが、細胞中に少コピ
ー数でのみ存在する。
【０００５】第三グループは天然酵母プラスミドである
２ミクロン−様プラスミドに由来する（概観のため、
Ａ．Ｈｉｎｎｅｍ及びＢ．Ｍｅｙｈａｃｋ，Ｃｕｒｅｎ
ｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９６：１０１−１０７，
１９８２；並びにＢ．Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ｙｅａｓｔ４：
２７−４０，１９８８を参照のこと）。
２ミクロン−様プラスミドに由来する（概観のため、
Ａ．Ｈｉｎｎｅｍ及びＢ．Ｍｅｙｈａｃｋ，Ｃｕｒｅｎ
ｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９６：１０１−１０７，
１９８２；並びにＢ．Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ｙｅａｓｔ４：
２７−４０，１９８８を参照のこと）。
【０００６】幾つかの異る２ミクロン−様プラスミドが
記載されている。これらのプラスミドは、Ｓ．セレビシ
エーの２ミクロンプラスミド、チゴサッカロミセス・バ
イリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉ
ｌｉｉ）からのプラスミドｐＳＢ１及びｐＳＢ２、Ｚ．
ルーキシー（Ｚ． ｒｏｕｘｉｉ）からのプラスミドｐ
ＳＲ２、Ｚ．ビスポルス（Ｚ． ｂｉｓｐｏｒｕｓ）か
らのｐＳＢ３、Ｚ．フェルメンタチ（Ｚ． ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉ）からのｐＳＭ１、並びにクルイベロミセス
・ドロソフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）からのｐＫＤ１である。
記載されている。これらのプラスミドは、Ｓ．セレビシ
エーの２ミクロンプラスミド、チゴサッカロミセス・バ
イリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉ
ｌｉｉ）からのプラスミドｐＳＢ１及びｐＳＢ２、Ｚ．
ルーキシー（Ｚ． ｒｏｕｘｉｉ）からのプラスミドｐ
ＳＲ２、Ｚ．ビスポルス（Ｚ． ｂｉｓｐｏｒｕｓ）か
らのｐＳＢ３、Ｚ．フェルメンタチ（Ｚ． ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉ）からのｐＳＭ１、並びにクルイベロミセス
・ドロソフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）からのｐＫＤ１である。
【０００７】これら７種類のプラスミドはすべて高コピ
ー数二本鎖環状ＤＮＡプラスミドであって顕著な類似構
造を有する。すなわち、これらはすべて直径方向に相対
している２個の大きな逆転反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒ
ｅｐｅａｔ）を有し、これらは２種類の等モル異性体形
で存在し、これらすべてはＦＬＰリコンビナーゼ（ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｓｅ）をコードしており、これらは前記
逆転反復の一方に近接して複製起点を有し、これらのプ
ラスミドのすべては少なくとも３個のオープンリーディ
ングフレームを有する。しかしながら、構造的及び幾何
学的類似性にもかかわらず、これらのプラスミドはそれ
らのＤＮＡ配列、及びそれらの遺伝子の蛋白質産物のア
ミノ酸配列に相同性をほとんど共有しない（Ｆｕｔｃｈ
ｅｒ、前掲）。
ー数二本鎖環状ＤＮＡプラスミドであって顕著な類似構
造を有する。すなわち、これらはすべて直径方向に相対
している２個の大きな逆転反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒ
ｅｐｅａｔ）を有し、これらは２種類の等モル異性体形
で存在し、これらすべてはＦＬＰリコンビナーゼ（ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｓｅ）をコードしており、これらは前記
逆転反復の一方に近接して複製起点を有し、これらのプ
ラスミドのすべては少なくとも３個のオープンリーディ
ングフレームを有する。しかしながら、構造的及び幾何
学的類似性にもかかわらず、これらのプラスミドはそれ
らのＤＮＡ配列、及びそれらの遺伝子の蛋白質産物のア
ミノ酸配列に相同性をほとんど共有しない（Ｆｕｔｃｈ
ｅｒ、前掲）。
【０００８】天然の２ミクロンプラスミドは、酵母のた
めのハイブリド発現ベクターの作製において出発ベクタ
ーとして使用するための必要条件である２つの本質的特
徴を合せ持っている。すなわち、これらは高コピー数プ
ラスミドであり、そして細胞中で安定に維持される。
Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプラスミドは、環境から
単離された際、ほとんどすべてのＳ．セレビシエーの株
の核内に見出される。Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプ
ラスミドのコピー数は細胞当り約５０〜６０である。自
然のプラスミド喪失速度は、急速に増殖している一倍体
細胞において約１０-4／細胞／世代である。従って、そ
れは極端な条件下を除き実験室内でＳ．セレビシエー集
団から失われない。
めのハイブリド発現ベクターの作製において出発ベクタ
ーとして使用するための必要条件である２つの本質的特
徴を合せ持っている。すなわち、これらは高コピー数プ
ラスミドであり、そして細胞中で安定に維持される。
Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプラスミドは、環境から
単離された際、ほとんどすべてのＳ．セレビシエーの株
の核内に見出される。Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプ
ラスミドのコピー数は細胞当り約５０〜６０である。自
然のプラスミド喪失速度は、急速に増殖している一倍体
細胞において約１０-4／細胞／世代である。従って、そ
れは極端な条件下を除き実験室内でＳ．セレビシエー集
団から失われない。
【０００９】Ｓ．セレビシエーの完全な２ミクロンプラ
スミドは６３１８塩基対の長さを有する。これは完全に
配列決定されている（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．及びＤ
ｏｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８６：８
６０−８６５，１９８０）。このプラスミドは２個の完
全な５９９塩基対長の逆転反復を含有し、これらは直径
方向にほとんど正確に相対している。このプラスミドは
２つの等モル形（ｅｑｕｉｍｏｌａｒ ｆｏｒｍ）Ａ及
びＢとして存在し、これらは２個のユニーク領域の相対
方向を異にする。このプラスミドは逆転反復間の分子内
組換えのため１つの形から他の方に移行する。このプラ
スミドのＡ形及びＢ形は機能的に同等である。
スミドは６３１８塩基対の長さを有する。これは完全に
配列決定されている（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．及びＤ
ｏｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８６：８
６０−８６５，１９８０）。このプラスミドは２個の完
全な５９９塩基対長の逆転反復を含有し、これらは直径
方向にほとんど正確に相対している。このプラスミドは
２つの等モル形（ｅｑｕｉｍｏｌａｒ ｆｏｒｍ）Ａ及
びＢとして存在し、これらは２個のユニーク領域の相対
方向を異にする。このプラスミドは逆転反復間の分子内
組換えのため１つの形から他の方に移行する。このプラ
スミドのＡ形及びＢ形は機能的に同等である。
【００１０】２ミクロンプラスミドは４個のオープンリ
ーディングフレームＦＬＰ，ＲＥＰ１，ＲＥＰ２及びＤ
を有する。オープンリーディングフレームＦＬＰは、逆
転反復の組換えによるＡ形及びＢ形の移行を生じさせる
特異的リコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）の遺
伝子である。ＲＥＰ１及びＲＥＰ２の両者はプラスミド
の安定性のためのｃｉｓ又はｔｒａｎｓにおいて要求さ
れる。２ミクロンプラスミドはまた、重要なｃｉｓ−作
用部位を含有し、例えばＳ期当り１回のみそこから複製
が開始される複製起点は逆転反復の１つの境界近くに位
置する。ＳＴＢ又はＲＥＰ３と呼ばれる他のｃｉｓ−作
用要素は、有糸分裂の際の娘細胞へのプラスミドの安定
な受継に関与する。これはＲＥＰ１及びＲＥＰ２の作用
部位のようである。第三に、各逆転反復の中心近くに小
さい「ＦＬＰ認識標的」（ＦＲＴ）部位が位置し、ここ
にＦＬＰリコンビナーゼが作用する。
ーディングフレームＦＬＰ，ＲＥＰ１，ＲＥＰ２及びＤ
を有する。オープンリーディングフレームＦＬＰは、逆
転反復の組換えによるＡ形及びＢ形の移行を生じさせる
特異的リコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）の遺
伝子である。ＲＥＰ１及びＲＥＰ２の両者はプラスミド
の安定性のためのｃｉｓ又はｔｒａｎｓにおいて要求さ
れる。２ミクロンプラスミドはまた、重要なｃｉｓ−作
用部位を含有し、例えばＳ期当り１回のみそこから複製
が開始される複製起点は逆転反復の１つの境界近くに位
置する。ＳＴＢ又はＲＥＰ３と呼ばれる他のｃｉｓ−作
用要素は、有糸分裂の際の娘細胞へのプラスミドの安定
な受継に関与する。これはＲＥＰ１及びＲＥＰ２の作用
部位のようである。第三に、各逆転反復の中心近くに小
さい「ＦＬＰ認識標的」（ＦＲＴ）部位が位置し、ここ
にＦＬＰリコンビナーゼが作用する。
【００１１】酵母の天然２ミクロン−様プラスミドの利
点、すなわち安定性及び高コピー数は一般に、ＤＮＡの
挿入の後失われる。Ｓ．セレビシエー２ミクロンプラス
ミドへのＰＧＫ１，ＡＤＨ１又はＣＹＣ１プロモーター
を含有する遺伝子構成物の挿入が、２ミクロンプラスミ
ドとの比較して、細胞内のコピー数の４〜１０倍の減少
をもたらした（Ｂ．Ｅ．Ｊｏｒｄａｎら、１５ｔｈ Ｉ
ｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｂｓ
ｔｒ Ｎｏ．Ｓ４３６）。
点、すなわち安定性及び高コピー数は一般に、ＤＮＡの
挿入の後失われる。Ｓ．セレビシエー２ミクロンプラス
ミドへのＰＧＫ１，ＡＤＨ１又はＣＹＣ１プロモーター
を含有する遺伝子構成物の挿入が、２ミクロンプラスミ
ドとの比較して、細胞内のコピー数の４〜１０倍の減少
をもたらした（Ｂ．Ｅ．Ｊｏｒｄａｎら、１５ｔｈ Ｉ
ｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｂｓ
ｔｒ Ｎｏ．Ｓ４３６）。
【００１２】２ミクロン−様プラスミド由来の既知のも
のより安定なハイブリド発現ベクターを製造するために
多くの試みが行われている。これらの試みは、例えば、
細胞中でのプラスミドの維持及びコピー数の制御のため
に必須でないと思われるＳ．セレビシエー２ミクロンプ
ラスミドの領域に外来遺伝子を挿入することに集中し
た。他の試みは２ミクロンプラスミド由来発現ベクター
中に細菌ＤＮＡの挿入を回避することに向けられた。例
えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／０８０２７に、酵母細
胞中で細菌ＤＮＡ配列を自然に失う２ミクロンプラスミ
ド誘導体が記載されている。
のより安定なハイブリド発現ベクターを製造するために
多くの試みが行われている。これらの試みは、例えば、
細胞中でのプラスミドの維持及びコピー数の制御のため
に必須でないと思われるＳ．セレビシエー２ミクロンプ
ラスミドの領域に外来遺伝子を挿入することに集中し
た。他の試みは２ミクロンプラスミド由来発現ベクター
中に細菌ＤＮＡの挿入を回避することに向けられた。例
えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／０８０２７に、酵母細
胞中で細菌ＤＮＡ配列を自然に失う２ミクロンプラスミ
ド誘導体が記載されている。
【００１３】このＰＣＴ出願で使用された方法におい
て、細菌宿主細胞中での２ミクロン由来発現ベクターの
増加のために要求される細菌ＤＮＡが２個の直接に逆転
したＦＲＴ部位間に挿入される。第三のＦＲＴ部位はプ
ラスミド上に間接方向に位置する。酵母細胞の形質転換
の後、２個のＦＲＴ部位間に直接方向に位置するＤＮＡ
は相同性組換え現象によって除去され、そして細菌性配
列を有しない２ミクロン由来プラスミドが酵母細胞中に
現われる。２個の直接配向ＦＲＴ部位間の相同性組換え
のためにそのＤＮＡの部分を失う２ミクロンプラスミド
由来ベクターは「崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ）ベクター」と呼ばれる。
て、細菌宿主細胞中での２ミクロン由来発現ベクターの
増加のために要求される細菌ＤＮＡが２個の直接に逆転
したＦＲＴ部位間に挿入される。第三のＦＲＴ部位はプ
ラスミド上に間接方向に位置する。酵母細胞の形質転換
の後、２個のＦＲＴ部位間に直接方向に位置するＤＮＡ
は相同性組換え現象によって除去され、そして細菌性配
列を有しない２ミクロン由来プラスミドが酵母細胞中に
現われる。２個の直接配向ＦＲＴ部位間の相同性組換え
のためにそのＤＮＡの部分を失う２ミクロンプラスミド
由来ベクターは「崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ）ベクター」と呼ばれる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】２ミクロンプラスミド
に由来するさらなる安定な酵母発現プラスミドを提供す
るのが本発明の１つの目的である。
に由来するさらなる安定な酵母発現プラスミドを提供す
るのが本発明の１つの目的である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】ハイブリドベクター 本発明は、環形の逆転反復ＦＲＴ部位間の２つの領域が
ほぼ同じ長さを有する酵母２ミクロン−様プラスミド
の、好ましくはＳ．セレビシエー２ミクロンプラスミド
の誘導体に関する。
ほぼ同じ長さを有する酵母２ミクロン−様プラスミド
の、好ましくはＳ．セレビシエー２ミクロンプラスミド
の誘導体に関する。
【００１６】この様なプラスミド誘導体はだいたい２個
の逆転反復ＦＲＴ部位、又は追加の第三のＦＲＴ部位を
含んで成る。前者の種類のプラスミドを、以後、「対称
的２ミクロン−様ハイブリドベクター」と称する。後者
の種類のプラスミドを以後「対称的２ミクロン−様崩壊
ベクター」と呼ぶ。これは真の対称的プラスミドではな
いが、それにより形質転換された酵母細胞中で対称的２
ミクロン−様ハイブリドベクターを生じさせるからであ
る。
の逆転反復ＦＲＴ部位、又は追加の第三のＦＲＴ部位を
含んで成る。前者の種類のプラスミドを、以後、「対称
的２ミクロン−様ハイブリドベクター」と称する。後者
の種類のプラスミドを以後「対称的２ミクロン−様崩壊
ベクター」と呼ぶ。これは真の対称的プラスミドではな
いが、それにより形質転換された酵母細胞中で対称的２
ミクロン−様ハイブリドベクターを生じさせるからであ
る。
【００１７】両種類の２ミクロン−様プラスミド誘導体
は、２ミクロン−様プラスミドの、好ましくはＳ．セレ
ビシエーの２ミクロンプラスミドのＤＮＡ、酵母用選択
マーカー遺伝子、酵母において機能するプロモーターの
制御の下で発現され得る酵母にとって同種の又は好まし
くは異種の遺伝子、及び場合によってはさらにウイル
ス、原核生物又は真核生物由来のＤＮＡ配列から構成さ
れるハイブリドベクターである。これらの更なるＤＮＡ
配列はベクターに必須の構造的又は機能的特徴、例えば
原核性もしくは真核性複製起点、選択マーカー遺伝子又
は制限酵素開裂部位を提供することができ、あるいはま
た単に、対称的２ミクロン−様ハイブリドベクター又は
対称的崩壊ベクターを作製するために非対称的２ミクロ
ン−様プラスミド誘導体又は「非対称的」崩壊ベクター
の２個の逆転反復ＦＲＴ部位間の２つの領域を満たす機
能を有する。
は、２ミクロン−様プラスミドの、好ましくはＳ．セレ
ビシエーの２ミクロンプラスミドのＤＮＡ、酵母用選択
マーカー遺伝子、酵母において機能するプロモーターの
制御の下で発現され得る酵母にとって同種の又は好まし
くは異種の遺伝子、及び場合によってはさらにウイル
ス、原核生物又は真核生物由来のＤＮＡ配列から構成さ
れるハイブリドベクターである。これらの更なるＤＮＡ
配列はベクターに必須の構造的又は機能的特徴、例えば
原核性もしくは真核性複製起点、選択マーカー遺伝子又
は制限酵素開裂部位を提供することができ、あるいはま
た単に、対称的２ミクロン−様ハイブリドベクター又は
対称的崩壊ベクターを作製するために非対称的２ミクロ
ン−様プラスミド誘導体又は「非対称的」崩壊ベクター
の２個の逆転反復ＦＲＴ部位間の２つの領域を満たす機
能を有する。
【００１８】本発明の対称的２ミクロン−様ハイブリド
ベクターは細菌性ＤＮＡ配列、すなわち細菌ゲノム、プ
ラスミド又はウイルス由来のＤＮＡを優先的には含有し
ない。しかしながら、本発明の２ミクロン−様崩壊ベク
ターは形質転換された酵母細胞中でベクターから切除さ
れる２個の直接反復ＦＲＴ部位間に原核生物由来のＤＮ
Ａ配列を含有することができ、前記細胞中では対称な２
ミクロン−様ハイブリドベクターが前記崩壊ベクターか
ら生ずる。これらのＤＮＡ配列は例えば適当な原核宿主
中でベクターの増加を可能にする細菌複製起点及び場合
によっては形質転換された原核細胞の選択を可能にする
細菌選択マーカーを含んで成る。遺伝子工学の分野にお
いて知られている任意の原核宿主中でプラスミドの増加
を可能にする及び場合によっては選択を可能にするＤＮ
Ａ配列を利用することができるが、しかし大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中での増加及び選択を可能にするＤＮＡ配
列が最も一般に用いられる。
ベクターは細菌性ＤＮＡ配列、すなわち細菌ゲノム、プ
ラスミド又はウイルス由来のＤＮＡを優先的には含有し
ない。しかしながら、本発明の２ミクロン−様崩壊ベク
ターは形質転換された酵母細胞中でベクターから切除さ
れる２個の直接反復ＦＲＴ部位間に原核生物由来のＤＮ
Ａ配列を含有することができ、前記細胞中では対称な２
ミクロン−様ハイブリドベクターが前記崩壊ベクターか
ら生ずる。これらのＤＮＡ配列は例えば適当な原核宿主
中でベクターの増加を可能にする細菌複製起点及び場合
によっては形質転換された原核細胞の選択を可能にする
細菌選択マーカーを含んで成る。遺伝子工学の分野にお
いて知られている任意の原核宿主中でプラスミドの増加
を可能にする及び場合によっては選択を可能にするＤＮ
Ａ配列を利用することができるが、しかし大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中での増加及び選択を可能にするＤＮＡ配
列が最も一般に用いられる。
【００１９】天然２ミクロン−様プラスミドは真菌細胞
中で高コピー数を有し、そしてそれらの構造において顕
著な類似性を有する二本鎖環状ＤＮＡから成る。すなわ
ち、それらはすべて直径方向に相対する２個の大きな正
確な逆転反復を有し、それらは等モル（ｅｑｕｉｍｏｌ
ａｒ）異性体形として存在し、それらはすべてＦＬＰリ
コンビナーゼをコードしており、そしてそれらは逆転反
復の１つに近接して複製起点を有する。対称的２ミクロ
ン−様ハイブリド又は崩壊ベクターのために使用され得
る種々の天然２ミクロン−様プラスミドが記載されてい
る。
中で高コピー数を有し、そしてそれらの構造において顕
著な類似性を有する二本鎖環状ＤＮＡから成る。すなわ
ち、それらはすべて直径方向に相対する２個の大きな正
確な逆転反復を有し、それらは等モル（ｅｑｕｉｍｏｌ
ａｒ）異性体形として存在し、それらはすべてＦＬＰリ
コンビナーゼをコードしており、そしてそれらは逆転反
復の１つに近接して複製起点を有する。対称的２ミクロ
ン−様ハイブリド又は崩壊ベクターのために使用され得
る種々の天然２ミクロン−様プラスミドが記載されてい
る。
【００２０】本発明のベクターの調製のために使用され
得る２ミクロン−様プラスミドは主としてチゴサッカロ
ミセス・バイリーからのプラスミドｐＳＢ１及びｐＳＢ
２、Ｚ．ルーキシーからのプラスミドｐＳＲ２、Ｚ．ビ
スポルスからのｐＳＢ３、Ｚ．フェルメンタチからのｐ
ＳＭ１、並びにクルイベロミセス・ドロソフィラルムか
らのｐＫＤ１が優先的に使用され、そしてＳ．セレビシ
エーの２ミクロンプラスミド自体が最も優先的に使用さ
れる。すべてのプラスミドはＢ．Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ｙｅ
ａｓｔ ４：２７−４０，１９８８に記載されている。
さらなる２ミクロン−様プラスミドが存在することが予
想されるので、本発明はさらに、更なる２ミクロン−様
プラスミドに由来する対称的又は崩壊性ベクターにも関
する。
得る２ミクロン−様プラスミドは主としてチゴサッカロ
ミセス・バイリーからのプラスミドｐＳＢ１及びｐＳＢ
２、Ｚ．ルーキシーからのプラスミドｐＳＲ２、Ｚ．ビ
スポルスからのｐＳＢ３、Ｚ．フェルメンタチからのｐ
ＳＭ１、並びにクルイベロミセス・ドロソフィラルムか
らのｐＫＤ１が優先的に使用され、そしてＳ．セレビシ
エーの２ミクロンプラスミド自体が最も優先的に使用さ
れる。すべてのプラスミドはＢ．Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ｙｅ
ａｓｔ ４：２７−４０，１９８８に記載されている。
さらなる２ミクロン−様プラスミドが存在することが予
想されるので、本発明はさらに、更なる２ミクロン−様
プラスミドに由来する対称的又は崩壊性ベクターにも関
する。
【００２１】本発明の意味において対称的である２ミク
ロン−様ハイブリドベクターにおいて、又はその様な２
ミクロン−様ハイブリドベクターを生じさせる崩壊性ベ
クターにおいて、２個の逆転反復ＦＲＴ間に位置する領
域の長さは約１：１〜約５：４の比率を有する。すなわ
ち、長い方の領域は短い方の領域より約２０％以下長
い。長い方の領域が短い方の領域に比べて約１５％以下
長いプラスミドが好ましく、１０％以下長いのがさらに
好ましく、そして５％以下長いのがさらに好ましい。
ロン−様ハイブリドベクターにおいて、又はその様な２
ミクロン−様ハイブリドベクターを生じさせる崩壊性ベ
クターにおいて、２個の逆転反復ＦＲＴ間に位置する領
域の長さは約１：１〜約５：４の比率を有する。すなわ
ち、長い方の領域は短い方の領域より約２０％以下長
い。長い方の領域が短い方の領域に比べて約１５％以下
長いプラスミドが好ましく、１０％以下長いのがさらに
好ましく、そして５％以下長いのがさらに好ましい。
【００２２】本発明の対称的２ミクロン−様ベクター又
は崩壊性ベクターの一部分であることができる異種性構
造遺伝子はウイルス、原核細胞又は真核細胞に由来し、
そしてゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ経路を介して調製され
たｃＤＮＡに由来することができ、あるいは化学的に合
成することができ、そして広範囲の種類の有用なポリペ
プチドをコードしており、このペプチドにはグリコシル
化されたポリペプチド、特に高等真核生物の、特に哺乳
類、例えば動物又は特にヒトのポリペプチドが含まれ
る。有用な蛋白質は例えば、栄養素の製造のため及び化
学において酵素反応を行うために使用することができる
酵素、あるいは栄養素として、又はヒトもしくは動物の
疾患の治療のため又はそれらの予防のために有用であり
且つ価値があるポリペプチド、例えばホルモン、免疫調
節性、抗ウイルス性又抗腫瘍性を有するポリペプチド、
抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、食品等であ
る。
は崩壊性ベクターの一部分であることができる異種性構
造遺伝子はウイルス、原核細胞又は真核細胞に由来し、
そしてゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ経路を介して調製され
たｃＤＮＡに由来することができ、あるいは化学的に合
成することができ、そして広範囲の種類の有用なポリペ
プチドをコードしており、このペプチドにはグリコシル
化されたポリペプチド、特に高等真核生物の、特に哺乳
類、例えば動物又は特にヒトのポリペプチドが含まれ
る。有用な蛋白質は例えば、栄養素の製造のため及び化
学において酵素反応を行うために使用することができる
酵素、あるいは栄養素として、又はヒトもしくは動物の
疾患の治療のため又はそれらの予防のために有用であり
且つ価値があるポリペプチド、例えばホルモン、免疫調
節性、抗ウイルス性又抗腫瘍性を有するポリペプチド、
抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、食品等であ
る。
【００２３】この様な構造遺伝子は例えばホルモン、例
えばセクレチン、チモシン、リラクシン、カルシトニ
ン、黄体ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノマルチ
コトロピン、メラノサイト刺激ホルモン、β−リポトロ
ピン、ウロガストロンもしくはインシュリン、成長因
子、例えば上皮成長因子、インシュリン−様成長因子
（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦＩ及びＩＧＦII、マスト細胞
成長因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞成長因
子、又は形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦα
又はＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ１，β２もしくはβ３、
成長ホルモン、例えばヒト又はウシ成長ホルモン、イン
ターロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは−
２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、
えばセクレチン、チモシン、リラクシン、カルシトニ
ン、黄体ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノマルチ
コトロピン、メラノサイト刺激ホルモン、β−リポトロ
ピン、ウロガストロンもしくはインシュリン、成長因
子、例えば上皮成長因子、インシュリン−様成長因子
（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦＩ及びＩＧＦII、マスト細胞
成長因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞成長因
子、又は形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦα
又はＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ１，β２もしくはβ３、
成長ホルモン、例えばヒト又はウシ成長ホルモン、イン
ターロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは−
２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、
【００２４】インターフェロン、例えばヒトα−インタ
ーフェロン、例えばインターフェロンαＡ，αＢ，αＤ
又はαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロ
ン又はハイブリドインターフェロン、例えばαＡ−αＤ
−又はαＢ−αＤ−ハイブリドインターフェロン、特に
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼ
阻害物質、例えばα１−アンチトリプシン、ＳＬＰＩ
等、肝炎ウイルス抗原、例えば肝炎Ｂウイルス表面抗原
もしくはコアー抗原又は肝炎Ａウイルス抗原、又は肝炎
非−Ａ非−Ｂ抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例え
ば組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼ、
腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドル
フィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＤ，Ｅ
又はＧのライト鎖及び／又はヘビー鎖、又はヒト−マウ
スハイブリド免疫グロブリン、
ーフェロン、例えばインターフェロンαＡ，αＢ，αＤ
又はαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロ
ン又はハイブリドインターフェロン、例えばαＡ−αＤ
−又はαＢ−αＤ−ハイブリドインターフェロン、特に
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼ
阻害物質、例えばα１−アンチトリプシン、ＳＬＰＩ
等、肝炎ウイルス抗原、例えば肝炎Ｂウイルス表面抗原
もしくはコアー抗原又は肝炎Ａウイルス抗原、又は肝炎
非−Ａ非−Ｂ抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例え
ば組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼ、
腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドル
フィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＤ，Ｅ
又はＧのライト鎖及び／又はヘビー鎖、又はヒト−マウ
スハイブリド免疫グロブリン、
【００２５】免疫グロブリン結合因子、例えば免疫グロ
ブリンＥ結合因子、例えばｓＣＤ２３等、カルシトニ
ン、ヒトカルシトニン−関連ペプチド、血液凝固因子、
例えばファクターIX又はVIIIｃ、エリスロポイエチン、
エグリン、例えばエグリンＣ、ヒルジン、デスルファト
ヒルジン、例えばデスルファトヒルジンＨＶ１，ＨＶ２
もしくはＰＡ、ヒトスーパーオキサイドディスムター
ゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グ
ルコースイソメラーゼをコードするものである。好まし
い遺伝子は、ヒトインターフェロン又はハイブリドイン
ターフェロン、特にハイブリドインターフェロンＢＤＢ
Ｂ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ）、肝炎Ｂウイルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、イン
シュリン−様成長因子Ｉ及びII、エグリンＣ、及び最も
好ましくはデスルファトヒルジン、例えば変形体ＨＶ１
をコードする遺伝子である。
ブリンＥ結合因子、例えばｓＣＤ２３等、カルシトニ
ン、ヒトカルシトニン−関連ペプチド、血液凝固因子、
例えばファクターIX又はVIIIｃ、エリスロポイエチン、
エグリン、例えばエグリンＣ、ヒルジン、デスルファト
ヒルジン、例えばデスルファトヒルジンＨＶ１，ＨＶ２
もしくはＰＡ、ヒトスーパーオキサイドディスムター
ゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グ
ルコースイソメラーゼをコードするものである。好まし
い遺伝子は、ヒトインターフェロン又はハイブリドイン
ターフェロン、特にハイブリドインターフェロンＢＤＢ
Ｂ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ）、肝炎Ｂウイルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、イン
シュリン−様成長因子Ｉ及びII、エグリンＣ、及び最も
好ましくはデスルファトヒルジン、例えば変形体ＨＶ１
をコードする遺伝子である。
【００２６】本発明の好ましい対称的プラスミドはｐＦ
ＢＹ１２，ｐＦＢＹ１２Ｒ，ｐＦＢＹ１３，ｐＦＢＹ１
３Ｒ，ｐＦＢＹ１３ｒｅｖ、及びｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲ
である。本発明の好ましい崩壊性ベクターはｐＦＢＹ２
７，ｐＦＢＹ２７Ｒ，ｐＦＢＹ２７ｒｅｖ，ｐＦＢＹ２
７ｒｅｖＲ，ｐＦＢＹ６６，ｐＦＢＹ６６Ｒ，ｐＦＢＹ
９８，ｐＦＢＹ９８Ｒ，ｐＦＢＹ９９、及びｐＦＢＹ９
９Ｒである。
ＢＹ１２，ｐＦＢＹ１２Ｒ，ｐＦＢＹ１３，ｐＦＢＹ１
３Ｒ，ｐＦＢＹ１３ｒｅｖ、及びｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲ
である。本発明の好ましい崩壊性ベクターはｐＦＢＹ２
７，ｐＦＢＹ２７Ｒ，ｐＦＢＹ２７ｒｅｖ，ｐＦＢＹ２
７ｒｅｖＲ，ｐＦＢＹ６６，ｐＦＢＹ６６Ｒ，ｐＦＢＹ
９８，ｐＦＢＹ９８Ｒ，ｐＦＢＹ９９、及びｐＦＢＹ９
９Ｒである。
【００２７】ハイブリドベクターの製造 本発明はまた本発明のハイブリドベクターの製造方法に
関する。本発明の対称的２ミクロン−様ハイブリドベク
ター及び崩壊性ベクターの両者を、常用の化学的又は生
物学的インビトロ合成法を用いて製造することができ、
後者は例えば常用のポリメラーゼ連鎖反応法である。し
かしながら好ましくは、ベクターは組換えＤＮＡ技法を
用いて製造される。
関する。本発明の対称的２ミクロン−様ハイブリドベク
ター及び崩壊性ベクターの両者を、常用の化学的又は生
物学的インビトロ合成法を用いて製造することができ、
後者は例えば常用のポリメラーゼ連鎖反応法である。し
かしながら好ましくは、ベクターは組換えＤＮＡ技法を
用いて製造される。
【００２８】組換えＤＮＡ技法による製造のため、適当
なＤＮＡ断片を常法によりインビトロで連結して本発明
の対称的２ミクロン−様ハイブリドベクター又は崩壊性
ベクターを作製することができる。次に、連結混合物
を、使用される制御要素の性質に依存して適当な原核性
又は真核性宿主に形質転換し、そして目的とするベクタ
ーを含有する形質転換体を常法に従って選択する。ベク
ターを、形質転換された宿主により増幅し、そして常法
に従って単離することができる。宿主の選択はベクター
上に存在する制御配列に依存する。
なＤＮＡ断片を常法によりインビトロで連結して本発明
の対称的２ミクロン−様ハイブリドベクター又は崩壊性
ベクターを作製することができる。次に、連結混合物
を、使用される制御要素の性質に依存して適当な原核性
又は真核性宿主に形質転換し、そして目的とするベクタ
ーを含有する形質転換体を常法に従って選択する。ベク
ターを、形質転換された宿主により増幅し、そして常法
に従って単離することができる。宿主の選択はベクター
上に存在する制御配列に依存する。
【００２９】崩壊性ベクターを作製する場合、対称的ベ
クターの形成が望ましくない場合、宿主は酵母細胞でな
くてもよい。本発明の崩壊性ベクターは好ましくは原核
性生物、例えば大腸菌において機能する制御因子を含ん
で成り、そしてそれ故にベクターの作製及び増幅のため
に原核性宿主、例えば大腸菌が好ましい。対称的２ミク
ロン−様ハイブリドベクタープラスミドの製造は直接に
行うことができる。すなわち、最終ベクターは、適当な
ＤＮＡ断片を連結し、適切な宿主を形質転換しそしてそ
れを形質転換された宿主から単離することにより作製さ
れる。この場合、宿主の選択は、前記のごとく、ベクタ
ー上に位置する制御ＤＮＡ配列に依存する。本発明の対
称的ベクターは細菌性ＤＮＡ配列を優先的に含有しない
ので、好ましい宿主は真核性宿主であり、最も好ましく
は酵母細胞である。本発明の対称的ベクターを製造する
ための他の可能性は崩壊性ベクターから出発して本発明
の対称的ベクターを製造することである。
クターの形成が望ましくない場合、宿主は酵母細胞でな
くてもよい。本発明の崩壊性ベクターは好ましくは原核
性生物、例えば大腸菌において機能する制御因子を含ん
で成り、そしてそれ故にベクターの作製及び増幅のため
に原核性宿主、例えば大腸菌が好ましい。対称的２ミク
ロン−様ハイブリドベクタープラスミドの製造は直接に
行うことができる。すなわち、最終ベクターは、適当な
ＤＮＡ断片を連結し、適切な宿主を形質転換しそしてそ
れを形質転換された宿主から単離することにより作製さ
れる。この場合、宿主の選択は、前記のごとく、ベクタ
ー上に位置する制御ＤＮＡ配列に依存する。本発明の対
称的ベクターは細菌性ＤＮＡ配列を優先的に含有しない
ので、好ましい宿主は真核性宿主であり、最も好ましく
は酵母細胞である。本発明の対称的ベクターを製造する
ための他の可能性は崩壊性ベクターから出発して本発明
の対称的ベクターを製造することである。
【００３０】この製造のため、２対の逆転反復ＦＲＴ部
位及び１対の直接反復ＦＲＴ部位を含有する本発明の崩
壊性ベクターにより酵母細胞を形質転換する。前記１対
の直接配向ＦＲＴ部位により囲まれたＤＮＡが、形質転
換された酵母細胞中で自然に失われる。すなわち、２対
の逆転配向ＦＲＴ部位に囲まれた両ＤＮＡ領域がおよそ
同じ長さを有するすなわちそれらの長さの比が対称的２
ミクロン−様ベクターについて定義したものである崩壊
性ベクターが使用される場合、形質転換された酵母細胞
がインビボで２ミクロン−様ハイブリドベクターを形成
する。
位及び１対の直接反復ＦＲＴ部位を含有する本発明の崩
壊性ベクターにより酵母細胞を形質転換する。前記１対
の直接配向ＦＲＴ部位により囲まれたＤＮＡが、形質転
換された酵母細胞中で自然に失われる。すなわち、２対
の逆転配向ＦＲＴ部位に囲まれた両ＤＮＡ領域がおよそ
同じ長さを有するすなわちそれらの長さの比が対称的２
ミクロン−様ベクターについて定義したものである崩壊
性ベクターが使用される場合、形質転換された酵母細胞
がインビボで２ミクロン−様ハイブリドベクターを形成
する。
【００３１】形質転換された宿主及びその製造 本発明はまた、本発明のハイブリドベクターにより形質
転換された宿主に関する。この様な宿主をプラスミドの
増幅のために使用することができる。崩壊性ベクターの
増幅のために非−酵母真核性宿主及び好ましくは細菌宿
主、例えば大腸菌を使用することができる。崩壊性ベク
ターが２個の直接反復ＦＲＴ部位間に細菌制御ＤＮＡ配
列及び場合によっては細菌性選択マーカーを含んで成る
場合、細菌宿主が使用される。好ましくは細菌性ＤＮＡ
配列を含有しない対称的２ミクロン−様ハイブリドベク
ターの増幅のために、形質転換された酵母細胞を用いる
ことができる。Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプラスミ
ドの誘導体が使用される場合、形質転換された酵母宿主
は好ましくはＳ．セレビシエーの株である。
転換された宿主に関する。この様な宿主をプラスミドの
増幅のために使用することができる。崩壊性ベクターの
増幅のために非−酵母真核性宿主及び好ましくは細菌宿
主、例えば大腸菌を使用することができる。崩壊性ベク
ターが２個の直接反復ＦＲＴ部位間に細菌制御ＤＮＡ配
列及び場合によっては細菌性選択マーカーを含んで成る
場合、細菌宿主が使用される。好ましくは細菌性ＤＮＡ
配列を含有しない対称的２ミクロン−様ハイブリドベク
ターの増幅のために、形質転換された酵母細胞を用いる
ことができる。Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプラスミ
ドの誘導体が使用される場合、形質転換された酵母宿主
は好ましくはＳ．セレビシエーの株である。
【００３２】好ましい形質転換された宿主は前記の好ま
しい崩壊性ベクターのいずれかにより形質転換された大
腸菌の株である。前記の対称的２ミクロン−様ハイブリ
ドベクターのいずれか又は好ましい崩壊性ベクターのい
ずれかにより形質転換されたＳ．セレビシエーも好まし
い。後者の場合、形質転換された酵母細胞は、形質転換
後の組換えにより崩壊性ベクターから生じた対称的プラ
スミドを担持する。
しい崩壊性ベクターのいずれかにより形質転換された大
腸菌の株である。前記の対称的２ミクロン−様ハイブリ
ドベクターのいずれか又は好ましい崩壊性ベクターのい
ずれかにより形質転換されたＳ．セレビシエーも好まし
い。後者の場合、形質転換された酵母細胞は、形質転換
後の組換えにより崩壊性ベクターから生じた対称的プラ
スミドを担持する。
【００３３】本発明はまた、本発明の対称的２ミクロン
−様ハイブリドベクター又は崩壊性ベクターを用いて常
法により形質転換された宿主の製造方法に関する。この
方法は（ａ）適当な宿主を形質転換し、そして（ｂ）形
質転換された宿主を栄養培地中で、場合によっては選択
条件の存在下で培養することを含んで成る。本発明の形
質転換された宿主はまた、その遺伝子が対称的２ミクロ
ン−様ハイブリドベクター上に位置する蛋白質生成物の
製造のために使用することができる。この場合、宿主は
好ましくは酵母、最も好ましくはＳ．セレビシエーの株
であり、そして遺伝子は酵母中で機能する制御配列の制
御のもとにある。
−様ハイブリドベクター又は崩壊性ベクターを用いて常
法により形質転換された宿主の製造方法に関する。この
方法は（ａ）適当な宿主を形質転換し、そして（ｂ）形
質転換された宿主を栄養培地中で、場合によっては選択
条件の存在下で培養することを含んで成る。本発明の形
質転換された宿主はまた、その遺伝子が対称的２ミクロ
ン−様ハイブリドベクター上に位置する蛋白質生成物の
製造のために使用することができる。この場合、宿主は
好ましくは酵母、最も好ましくはＳ．セレビシエーの株
であり、そして遺伝子は酵母中で機能する制御配列の制
御のもとにある。
【００３４】ポリペプチド生成物の製造 本発明は酵母ポリペプチド又は非−酵母ポリペプチドの
製造方法に関し、この方法は、（ａ）酵母で機能するプ
ロモーター、酵母で機能するシグナルペプチドをコード
するシグナル配列、酵母ポリペプチド又は非−酵母ポリ
ペプチドをコードする構造遺伝子、及び場合によっては
酵母で機能するターミネーターから成る発現カセットを
含有する対称的２ミクロン様ハイブリドベクターにより
形質転換された酵母株を培養し、そして（ｂ）前記ポリ
ペプチドを単離する、ことを含んで成る。
製造方法に関し、この方法は、（ａ）酵母で機能するプ
ロモーター、酵母で機能するシグナルペプチドをコード
するシグナル配列、酵母ポリペプチド又は非−酵母ポリ
ペプチドをコードする構造遺伝子、及び場合によっては
酵母で機能するターミネーターから成る発現カセットを
含有する対称的２ミクロン様ハイブリドベクターにより
形質転換された酵母株を培養し、そして（ｂ）前記ポリ
ペプチドを単離する、ことを含んで成る。
【００３５】形質転換された宿主株は、資化性炭素源及
び窒素源並びに無機塩を含有する液体培地中で培養す
る。さらに、栄養培地は増殖促進物質及び／又は、ハイ
ブリドプラスミドを含有する細胞をポジティブに選択す
るための選択圧を生じさせる物質を含有することができ
る。増殖促進物質には例えば微量元素、例えば鉄、亜
鉛、マグネシウム等、又は個々のアミノ酸が含まれる。
び窒素源並びに無機塩を含有する液体培地中で培養す
る。さらに、栄養培地は増殖促進物質及び／又は、ハイ
ブリドプラスミドを含有する細胞をポジティブに選択す
るための選択圧を生じさせる物質を含有することができ
る。増殖促進物質には例えば微量元素、例えば鉄、亜
鉛、マグネシウム等、又は個々のアミノ酸が含まれる。
【００３６】対称的２ミクロンプラスミドが抗生物質耐
性を付与する遺伝子を含有する場合、この様なプラスミ
ドを含有する細胞はこの抗生物質が補充された培地中で
生存するであろうが、該ハイブリドプラスミドを失った
細胞は生存しないであろう。ハイブリドプラスミドが栄
養要求性変異株に原栄養性を提供する遺伝子、例えばＵ
ＲＡ３，ＬＥＵ２又はＨＩＳ３遺伝子を含有する場合、
栄養培地中に対応する遺伝子産物を省略することにより
選択圧が惹起され得るであろう。
性を付与する遺伝子を含有する場合、この様なプラスミ
ドを含有する細胞はこの抗生物質が補充された培地中で
生存するであろうが、該ハイブリドプラスミドを失った
細胞は生存しないであろう。ハイブリドプラスミドが栄
養要求性変異株に原栄養性を提供する遺伝子、例えばＵ
ＲＡ３，ＬＥＵ２又はＨＩＳ３遺伝子を含有する場合、
栄養培地中に対応する遺伝子産物を省略することにより
選択圧が惹起され得るであろう。
【００３７】前記発現カセットの作製のために、酵母に
おける蛋白質の発現のために適当な任意のプロモーター
を使用することができる。制御される酵母プロモータ
ー、例えばＭＥＬ１、ヒートショックプロモーター、ｓ
ｕｃ２，ＧＡＬ１／ＣＹＣ１，ｃｕｐ１，ＧＡＬ１／１
０，ＡＤＨＩ及び好ましくはＰＨＯ５、並びに構成的プ
ロモーター、例えばＧＡＰＤＨ，ＰＧＫ，ＰＹＫ，ＰＤ
Ｃ１及び好ましくはＧＡＰＦＬが本発明の範囲に含まれ
る。
おける蛋白質の発現のために適当な任意のプロモーター
を使用することができる。制御される酵母プロモータ
ー、例えばＭＥＬ１、ヒートショックプロモーター、ｓ
ｕｃ２，ＧＡＬ１／ＣＹＣ１，ｃｕｐ１，ＧＡＬ１／１
０，ＡＤＨＩ及び好ましくはＰＨＯ５、並びに構成的プ
ロモーター、例えばＧＡＰＤＨ，ＰＧＫ，ＰＹＫ，ＰＤ
Ｃ１及び好ましくはＧＡＰＦＬが本発明の範囲に含まれ
る。
【００３８】発現カセット中に使用されるプロモーター
に依存して、組換え遺伝子産物の生産を可能にするため
に誘導的条件又は抑制解除条件が適用されなければなら
ない。例えば、よく知られた制御される酵母ＰＨＯ５プ
ロモーター（例えば、米国特許Ｎｏ．０１００５６１を
参照のこと）が使用される場合、ｍＲＮＡ転写物の最高
レベル、そしてそれ故に蛋白質の最高収量を保証するた
めに、栄養培地中の無機リン酸塩の含量を減少させなけ
ればならない。
に依存して、組換え遺伝子産物の生産を可能にするため
に誘導的条件又は抑制解除条件が適用されなければなら
ない。例えば、よく知られた制御される酵母ＰＨＯ５プ
ロモーター（例えば、米国特許Ｎｏ．０１００５６１を
参照のこと）が使用される場合、ｍＲＮＡ転写物の最高
レベル、そしてそれ故に蛋白質の最高収量を保証するた
めに、栄養培地中の無機リン酸塩の含量を減少させなけ
ればならない。
【００３９】培養は常用技術を用いて、回分培養又は連
続培養において行われる。培養条件、例えば温度、培地
のpH及び発酵時間は、最高レベルのポリペプチドが生産
されるように選択される。選択された酵母核は例えば好
気的条件下、液深培養で、攪拌又は振とうしながら、約
２５℃〜３５℃、好ましくは約３０℃の温度において増
殖する。発現カセットの構成におけるシグナル配列の使
用のためにポリペプチドが生産細胞から分泌される場
合、生成物は培養上清から単離される。ポリペプチドが
生清にではなく細胞のペリプラズム空間に分泌される場
合、細胞は細胞壁を除去する化学薬剤又は酵素により処
理されるべきである。生成物が分泌されない場合は、細
胞が集収され、そして常法に従って細胞内からポリペプ
チドが遊離される。
続培養において行われる。培養条件、例えば温度、培地
のpH及び発酵時間は、最高レベルのポリペプチドが生産
されるように選択される。選択された酵母核は例えば好
気的条件下、液深培養で、攪拌又は振とうしながら、約
２５℃〜３５℃、好ましくは約３０℃の温度において増
殖する。発現カセットの構成におけるシグナル配列の使
用のためにポリペプチドが生産細胞から分泌される場
合、生成物は培養上清から単離される。ポリペプチドが
生清にではなく細胞のペリプラズム空間に分泌される場
合、細胞は細胞壁を除去する化学薬剤又は酵素により処
理されるべきである。生成物が分泌されない場合は、細
胞が集収され、そして常法に従って細胞内からポリペプ
チドが遊離される。
【００４０】本発明及びその好ましい態様に従って得ら
れるポリペプチドは、本発明の発現ハイブリドベクター
の作製のために有用であるとしてすでに定義したそれぞ
れの遺伝子及び好ましい遺伝子である。ＧＡＰＤＨプロ
モーター並びにα−ファクターシグナル配列及びターミ
ネーターに作用可能に連結されたヒルジン又はＩＧＦ−
Ｉ遺伝子を含有する、対称的２ミクロン−様ハイブリド
ベクター、好ましくはＳ．セレビシエー由来のベクター
によるヒルジン又はＩＧＦ−Ｉの生産が最も好ましい。
れるポリペプチドは、本発明の発現ハイブリドベクター
の作製のために有用であるとしてすでに定義したそれぞ
れの遺伝子及び好ましい遺伝子である。ＧＡＰＤＨプロ
モーター並びにα−ファクターシグナル配列及びターミ
ネーターに作用可能に連結されたヒルジン又はＩＧＦ−
Ｉ遺伝子を含有する、対称的２ミクロン−様ハイブリド
ベクター、好ましくはＳ．セレビシエー由来のベクター
によるヒルジン又はＩＧＦ−Ｉの生産が最も好ましい。
【００４１】図面の説明 図１ は崩壊性プラスミドｐＦＢＹ２の物理的地図であ
る。このものは、細菌及びＳ．セレビシエーＤＮＡを分
離する直接反復としてＦＲＴ部位（ＦＲＴ−１及びＦＲ
Ｔ−２）を２倍にするように、ｐＴＺ１８Ｒ（２本線）
に組み込まれたすべての２ミクロンＤＮＡ（１本線）か
ら成る。長い矢印はオープンリーディングフレームを示
し、小さい矢印はＦＲＴ反復の方向を示し、そして“Ｏ
ＲＩ”はＳ．セレビシエーの複製起点を示す。Ｅ＝Ｅｃ
ｏＲＩ，Ｈ＝ＨｉｎｄIII ，Ｈｐ＝ＨｐａＩ，Ｎ＝Ｎｃ
ｏＩ，Ｐ＝ＰｓｔＩ，Ｓ＝ＳｐｈＩ，Ｘ＝ＸｂａＩ。
る。このものは、細菌及びＳ．セレビシエーＤＮＡを分
離する直接反復としてＦＲＴ部位（ＦＲＴ−１及びＦＲ
Ｔ−２）を２倍にするように、ｐＴＺ１８Ｒ（２本線）
に組み込まれたすべての２ミクロンＤＮＡ（１本線）か
ら成る。長い矢印はオープンリーディングフレームを示
し、小さい矢印はＦＲＴ反復の方向を示し、そして“Ｏ
ＲＩ”はＳ．セレビシエーの複製起点を示す。Ｅ＝Ｅｃ
ｏＲＩ，Ｈ＝ＨｉｎｄIII ，Ｈｐ＝ＨｐａＩ，Ｎ＝Ｎｃ
ｏＩ，Ｐ＝ＰｓｔＩ，Ｓ＝ＳｐｈＩ，Ｘ＝ＸｂａＩ。
【００４２】図２は崩壊性プラスミドｐＦＢＹ２のＦＲ
Ｔ部位すなわちＦＲＴ−１及びＦＲＴ−２の間のインビ
トロ又はインビボ組換えから生ずるプラスミドを示す。
Ｓ．セレビシエー中でプラスミドＢは２つの形で存在
し、１つはこの図に示す通りであり、そしてもう１つは
間接反復ＦＲＴ部位間の組換えによる単純な逆転であ
る。標示及び記号は図１と同じである。
Ｔ部位すなわちＦＲＴ−１及びＦＲＴ−２の間のインビ
トロ又はインビボ組換えから生ずるプラスミドを示す。
Ｓ．セレビシエー中でプラスミドＢは２つの形で存在
し、１つはこの図に示す通りであり、そしてもう１つは
間接反復ＦＲＴ部位間の組換えによる単純な逆転であ
る。標示及び記号は図１と同じである。
【００４３】
【実施例】次の実施例は本発明を説明するものであっ
て、制限するものではない。緩衝液及び培地 ＬＧＴ 低ゲル化温度アガロース ＴＡＥ ４０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、２mMエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウ
ム塩）、酢酸によりpH７．６ ＹＰＤ １Ｌの水中２０ｇバクトペプトン、１
０ｇ酵母エキス、２０ｇグルコース ＹＮＢ １Ｌの水中６．７ｇアミノ酸不含有バ
クトイーストニトロゲンベース、２０ｇグルコース ２ＹＴ １Ｌの水中１６ｇトリプトン、１０ｇ
酵母エキス、１０ｇ ＮａＣｌ
て、制限するものではない。緩衝液及び培地 ＬＧＴ 低ゲル化温度アガロース ＴＡＥ ４０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、２mMエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウ
ム塩）、酢酸によりpH７．６ ＹＰＤ １Ｌの水中２０ｇバクトペプトン、１
０ｇ酵母エキス、２０ｇグルコース ＹＮＢ １Ｌの水中６．７ｇアミノ酸不含有バ
クトイーストニトロゲンベース、２０ｇグルコース ２ＹＴ １Ｌの水中１６ｇトリプトン、１０ｇ
酵母エキス、１０ｇ ＮａＣｌ
【００４４】Ｘｇａｌ ０．０５mg／ml ５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクト
ピラノシド ＩＰＴＧ ０．０５mMイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド アンピシリン 培地中最終濃度２５mg／ｌ ＣＡ緩衝液 ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、７mM ＭａＣｌ2 、５mMジチオスレイトー
ル、１００mM ＫＣｌ、ＨＣｌによりpH７．５ Ｈ緩衝液 ５０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１０mM ＭｇＣｌ2 、１mMジチオスレイト
ール、１００mM ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH７．５ リガーゼ緩衝液 ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mMジチオスレイ
トール、ＨＣｌにてpH７．５ ＢＡＰ緩衝液 ５０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、５０mM ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH８．０ Ｓ１緩衝液 １００mM ＮａＣｌ、５０mM ＣＨ3
ＣＯＯＮａ、０．１mMＺｎＣｌ2 、酢酸にてpH４．５
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクト
ピラノシド ＩＰＴＧ ０．０５mMイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド アンピシリン 培地中最終濃度２５mg／ｌ ＣＡ緩衝液 ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、７mM ＭａＣｌ2 、５mMジチオスレイトー
ル、１００mM ＫＣｌ、ＨＣｌによりpH７．５ Ｈ緩衝液 ５０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１０mM ＭｇＣｌ2 、１mMジチオスレイト
ール、１００mM ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH７．５ リガーゼ緩衝液 ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mMジチオスレイ
トール、ＨＣｌにてpH７．５ ＢＡＰ緩衝液 ５０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、５０mM ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH８．０ Ｓ１緩衝液 １００mM ＮａＣｌ、５０mM ＣＨ3
ＣＯＯＮａ、０．１mMＺｎＣｌ2 、酢酸にてpH４．５
【００４５】Ｔ４緩衝液 ６７mMトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、６．７mMＭｇＣｌ2 、１７mM
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、５mMジチオスレイトール、ＨＣ
ｌにてpH８ ＬＳＢ ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１mMエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウ
ム塩）、２００mM ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH７．５ ＨＳＢ ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１mMエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウ
ム塩）、１Ｍ ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH７．５ ＴＥ １０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１mM ＥＤＴＡ、pH８ ＨＩＮ緩衝液 ７mMトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、７mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＮａＣｌ、ＨＣ
ｌにてpH７．５
シメチル）アミノメタン、６．７mMＭｇＣｌ2 、１７mM
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、５mMジチオスレイトール、ＨＣ
ｌにてpH８ ＬＳＢ ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１mMエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウ
ム塩）、２００mM ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH７．５ ＨＳＢ ２０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１mMエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウ
ム塩）、１Ｍ ＮａＣｌ、ＨＣｌにてpH７．５ ＴＥ １０mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１mM ＥＤＴＡ、pH８ ＨＩＮ緩衝液 ７mMトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、７mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＮａＣｌ、ＨＣ
ｌにてpH７．５
【００４６】菌株及びプラスミド 大腸菌ＤＨ５αＦ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ１２Ｆ′ ＥｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒ- ｍ+ ）
ｓｕｐＥ４４ｔｈｉ１ ｒｅｃＡ１ ｐｙｒＡ ｒｅｌ
Ａ１ ＰＨＩ８０ｌａｃＺｄｅｌＭ１５ ｄｅｌ（ｌａ
ｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ＨａｎａｈａｎＤ（１
９８３）プラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉの形質転換についての研究。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１６６：５５７（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
Ｋ１２Ｆ′ ＥｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒ- ｍ+ ）
ｓｕｐＥ４４ｔｈｉ１ ｒｅｃＡ１ ｐｙｒＡ ｒｅｌ
Ａ１ ＰＨＩ８０ｌａｃＺｄｅｌＭ１５ ｄｅｌ（ｌａ
ｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ＨａｎａｈａｎＤ（１
９８３）プラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉの形質転換についての研究。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１６６：５５７（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
【００４７】プラスミドｐＴＺ１８Ｒ：ｐＵＣ１８由来
のプラスミドはＭ１３複製起点を含有し、そのためこれ
は単鎖になることができ、そしてヘルパーＭ１４ファー
ジの助けによりＭ１３ファージヘッドにパッケージされ
得る。Ｍｅａｄ ＤＡ，Ｓｚｃｚｅｓｎａ−Ｓｋｏｒｕ
ｐａ Ｅ，Ｋｅｍｐｅｒ Ｂ（１９８６）、単鎖ＤＮＡ
“ｂｌｕｅ”Ｔ７プロモータープラスミド：クローニン
グ及び蛋白質工学のための多能なタンデムプロモーター
系。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ１：６７
−７４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
のプラスミドはＭ１３複製起点を含有し、そのためこれ
は単鎖になることができ、そしてヘルパーＭ１４ファー
ジの助けによりＭ１３ファージヘッドにパッケージされ
得る。Ｍｅａｄ ＤＡ，Ｓｚｃｚｅｓｎａ−Ｓｋｏｒｕ
ｐａ Ｅ，Ｋｅｍｐｅｒ Ｂ（１９８６）、単鎖ＤＮＡ
“ｂｌｕｅ”Ｔ７プロモータープラスミド：クローニン
グ及び蛋白質工学のための多能なタンデムプロモーター
系。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ１：６７
−７４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００４８】ファージＭ１３Ｋ０７：カナマイシン耐性
を担持するヘルパーＭ１３ファージ。Ｍｅａｄ ＤＡ，
Ｓｚｃｚｅｓｎａ−Ｓｋｏｒｕｐａ Ｅ，Ｋｅｍｐｅｒ
Ｂ（１９８６）、単鎖ＤＮＡ“ｂｌｕｅ”Ｔ７プロモ
ータープラスミド：クローニング及び蛋白質工学のため
の多能なタンデムプロモーター系。ＰｒｏｔｅｉｎＥｎ
ｇｅｎｅｅｒｉｎｇ １：６７−７４（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）。
を担持するヘルパーＭ１３ファージ。Ｍｅａｄ ＤＡ，
Ｓｚｃｚｅｓｎａ−Ｓｋｏｒｕｐａ Ｅ，Ｋｅｍｐｅｒ
Ｂ（１９８６）、単鎖ＤＮＡ“ｂｌｕｅ”Ｔ７プロモ
ータープラスミド：クローニング及び蛋白質工学のため
の多能なタンデムプロモーター系。ＰｒｏｔｅｉｎＥｎ
ｇｅｎｅｅｒｉｎｇ １：６７−７４（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）。
【００４９】Ｓ．セレビシエーＨ４４９：Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＡＴａ；ｕ
ｒａ３ｄｅｌ５；ｌｅｕ２−３；ｌｅｕ２−１１２；ｐ
ｒｂ１；ｃｐｓ１；〔ｃｉｒ〕0 、１９８８年２月１８
日、ＤＳＭ ４４１３。Ｓ．セレビシエーＡＢ１１０；
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ×
Ｓ．カールスペルゲンシス（Ｓ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅ
ｎｓｉｓ）ＭＡＴα；ｕｒａ３−５２；ｈｉｓ４−５８
０；ｌｅｕ２；ｐｅｐ４−３；〔ｃｉｒ0 〕，Ｓｃｈｕ
ｓｔｅｒＪＲ，Ｍｏｙｅｒ ＤＬ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｄｅｎ
ｎｉｓ Ａ，Ｓｍｉｔｈ Ｂ，Ｍｅｒｒｙｗｅａｔｈｅ
ｒ ＪＰ（１９８９）、クローン化されたヒトインシュ
リン−様成長因子Ｉの毒性効果に対する耐性を付与する
酵母株。Ｇｅｎｅ８３：４７−５５。アメリカン・タイ
プ・カルチュアー・コレクションに１９８４年５月９日
にＡＴＣＣ２０７０９として寄託。
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＡＴａ；ｕ
ｒａ３ｄｅｌ５；ｌｅｕ２−３；ｌｅｕ２−１１２；ｐ
ｒｂ１；ｃｐｓ１；〔ｃｉｒ〕0 、１９８８年２月１８
日、ＤＳＭ ４４１３。Ｓ．セレビシエーＡＢ１１０；
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ×
Ｓ．カールスペルゲンシス（Ｓ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅ
ｎｓｉｓ）ＭＡＴα；ｕｒａ３−５２；ｈｉｓ４−５８
０；ｌｅｕ２；ｐｅｐ４−３；〔ｃｉｒ0 〕，Ｓｃｈｕ
ｓｔｅｒＪＲ，Ｍｏｙｅｒ ＤＬ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｄｅｎ
ｎｉｓ Ａ，Ｓｍｉｔｈ Ｂ，Ｍｅｒｒｙｗｅａｔｈｅ
ｒ ＪＰ（１９８９）、クローン化されたヒトインシュ
リン−様成長因子Ｉの毒性効果に対する耐性を付与する
酵母株。Ｇｅｎｅ８３：４７−５５。アメリカン・タイ
プ・カルチュアー・コレクションに１９８４年５月９日
にＡＴＣＣ２０７０９として寄託。
【００５０】プラスミドｐＦＢＹ２：このプラスミド
は、ｐＴＺ１８ＲのＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩ部位間
のＳ．セレビシエー２ミクロンプラスミドからのＦＲＴ
を含有する１６６bp ＡＩｕＩ断片、及びＸｂａＩによ
り切断された２ミクロンプラスミドの全体をｐＴＺ１８
ＲのユニークＸｂａＩ部位に挿入することにより作製さ
れる。従って、以後の実施例において作製されるほとん
どのプラスミドの基礎を構成するプラスミドｐＦＢＹ２
はｐＴＺ１８Ｒの全体、２ミクロンプラスミドの全体及
びＦＲＴ部位の第三のコピーを含有する。２個の直接反
復ＦＲＴ部位間の組換えが２ミクロンＡ−形サークル並
びにｐＴＺ１８Ｒと１個のＦＲＴ部位とから成るプラス
ミドの再生を導くように、ＤＮＡ断片が集成される。後
者は酵母細胞中で失われる。この崩壊性ベクターの物理
的地図を図１に示す。ｐＦＢＹ２はＤＳＭ６２７１とし
て寄託されている。
は、ｐＴＺ１８ＲのＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩ部位間
のＳ．セレビシエー２ミクロンプラスミドからのＦＲＴ
を含有する１６６bp ＡＩｕＩ断片、及びＸｂａＩによ
り切断された２ミクロンプラスミドの全体をｐＴＺ１８
ＲのユニークＸｂａＩ部位に挿入することにより作製さ
れる。従って、以後の実施例において作製されるほとん
どのプラスミドの基礎を構成するプラスミドｐＦＢＹ２
はｐＴＺ１８Ｒの全体、２ミクロンプラスミドの全体及
びＦＲＴ部位の第三のコピーを含有する。２個の直接反
復ＦＲＴ部位間の組換えが２ミクロンＡ−形サークル並
びにｐＴＺ１８Ｒと１個のＦＲＴ部位とから成るプラス
ミドの再生を導くように、ＤＮＡ断片が集成される。後
者は酵母細胞中で失われる。この崩壊性ベクターの物理
的地図を図１に示す。ｐＦＢＹ２はＤＳＭ６２７１とし
て寄託されている。
【００５１】プラスミドｐＦＢＹ４：このプラスミド
は、ｐＴＺ１８ＲのユニークＸｂａＩにクローン化され
たＳ．セレビシエーのＵＲＡ３遺伝子全体を含有する
１．１kbのＸｂａＩ断片から成る。このプラスミドは、
ＸｂａＩ断片を含有する１．１kbのＵＲＡのための便利
な入手源として役立つ。ｐＦＢＹ４はＤＳＭ６２７２と
して寄託されている。
は、ｐＴＺ１８ＲのユニークＸｂａＩにクローン化され
たＳ．セレビシエーのＵＲＡ３遺伝子全体を含有する
１．１kbのＸｂａＩ断片から成る。このプラスミドは、
ＸｂａＩ断片を含有する１．１kbのＵＲＡのための便利
な入手源として役立つ。ｐＦＢＹ４はＤＳＭ６２７２と
して寄託されている。
【００５２】プラスミドｐＦＢＹ５：ｐＦＢＹ５は、細
菌ベクターｐＵＣ１８中にＳ．セレビシエー２ミクロン
プラスミドの全体並びにＳ．セレビシエーのＵＲＡ３及
びＬｅｕ２遺伝子を含有する大きなプラスミドに由来す
る。このベクターのユニークＳａｌＩに、ＰＨＯ５シグ
ナル配列に融合したＳ．セレビシエーＧＡＰＤＨ遺伝子
に由来するプロモーターを含んで成り、該シグナル配列
が合成ヒルジンコードＤＮＡ断片に融合しており、この
断片の後にＰＨＯ５ターミネーターが存在する発現カセ
ットを含有する１．１kbp ＳａｌＩ断片が挿入され
る。ｐＦＢＹ５はＤＳＭ６２７３として寄託されてい
る。
菌ベクターｐＵＣ１８中にＳ．セレビシエー２ミクロン
プラスミドの全体並びにＳ．セレビシエーのＵＲＡ３及
びＬｅｕ２遺伝子を含有する大きなプラスミドに由来す
る。このベクターのユニークＳａｌＩに、ＰＨＯ５シグ
ナル配列に融合したＳ．セレビシエーＧＡＰＤＨ遺伝子
に由来するプロモーターを含んで成り、該シグナル配列
が合成ヒルジンコードＤＮＡ断片に融合しており、この
断片の後にＰＨＯ５ターミネーターが存在する発現カセ
ットを含有する１．１kbp ＳａｌＩ断片が挿入され
る。ｐＦＢＹ５はＤＳＭ６２７３として寄託されてい
る。
【００５３】プラスミドｐＦＢＹ７：ｐＦＢＹ７は、Ｃ
ＤＣ９遺伝子を含有するＳ．セレビシエーＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片に連結された、ＢａｍＨＩ及びＫ
ｐｎＩにより切断されたｐＦＢＹ４から成る。このプラ
スミドは、頭対尾方向にＵＲＡ３及びＣＤＣ９の両者を
含有する３．９kbp ＨｉｎｄIII ／ＫｐｎＩ断片の入
手源として役立つ。これはＤＳＭ６２７４として寄託さ
れている。
ＤＣ９遺伝子を含有するＳ．セレビシエーＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片に連結された、ＢａｍＨＩ及びＫ
ｐｎＩにより切断されたｐＦＢＹ４から成る。このプラ
スミドは、頭対尾方向にＵＲＡ３及びＣＤＣ９の両者を
含有する３．９kbp ＨｉｎｄIII ／ＫｐｎＩ断片の入
手源として役立つ。これはＤＳＭ６２７４として寄託さ
れている。
【００５４】プラスミドｐＦＢＹ２９：このプラスミド
はＬＥＵ２遺伝子を含有する２kbpＢａｍＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片から成る。この断片はｐＴＺ１８ＲのＢａｍＨＩ
部位とＳａｌＩ部位との間に挿入される。ｐＦＢＹ２９
はＬＥＵ２を含有する２．０kbp の入手源として役立
つ。これはＤＳＭ６２７５として寄託されている。プラ
スミドｐＦＢＹ６５：このプラスミドは、α−ファクタ
ーシグナル及びリーダー配列に融合したＧＡＰＤＨプロ
モーターを含有する便利な１．４kbp ＳｍａＩ断片を
有し、前記配列は合成ＩＧＩ−Ｉ遺伝子に融合してお
り、この遺伝子の後にα−ファクターターミネーターが
存在する。これはＤＳＭ６２７６として寄託されてい
る。
はＬＥＵ２遺伝子を含有する２kbpＢａｍＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片から成る。この断片はｐＴＺ１８ＲのＢａｍＨＩ
部位とＳａｌＩ部位との間に挿入される。ｐＦＢＹ２９
はＬＥＵ２を含有する２．０kbp の入手源として役立
つ。これはＤＳＭ６２７５として寄託されている。プラ
スミドｐＦＢＹ６５：このプラスミドは、α−ファクタ
ーシグナル及びリーダー配列に融合したＧＡＰＤＨプロ
モーターを含有する便利な１．４kbp ＳｍａＩ断片を
有し、前記配列は合成ＩＧＩ−Ｉ遺伝子に融合してお
り、この遺伝子の後にα−ファクターターミネーターが
存在する。これはＤＳＭ６２７６として寄託されてい
る。
【００５５】一般的方法 ＥｌｕｔｉｐＤによる制限断片の精製 〔Ｅｌｕｔｉｐ−ｄアフィニティークロマトグラフィー
による低融点アガロースからの制限断片の定量的単離
（Ｓｃｈｍｉｔｔ ＪＪ，Ｃｏｈｅｎ ＢＮ（１９８
３）。Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：４６２
−４６４〕ゲル及び緩衝液中の臭化エチジウム（０．２
mg／Ｌ）と共にＴＡＥ緩衝液を用いてＬＧＴアガロース
ゲルを通して、消化されたＤＮＡを電気泳動する。長波
長ＵＶによりＤＮＡを可視化し、そしてバンドを切り出
す。ここで、必要があれば写真記録を行う。スライスを
１０mlポリプロピレンチューブに入れ、これにアガロー
ス濃度を０．２％未満に下げるのに十分なＬＳＢを加え
る。アガロースを６０℃にて３０分間加熱して溶融し、
十分に混合し、そして次に３７℃にて３０分間平衡化す
る。
による低融点アガロースからの制限断片の定量的単離
（Ｓｃｈｍｉｔｔ ＪＪ，Ｃｏｈｅｎ ＢＮ（１９８
３）。Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：４６２
−４６４〕ゲル及び緩衝液中の臭化エチジウム（０．２
mg／Ｌ）と共にＴＡＥ緩衝液を用いてＬＧＴアガロース
ゲルを通して、消化されたＤＮＡを電気泳動する。長波
長ＵＶによりＤＮＡを可視化し、そしてバンドを切り出
す。ここで、必要があれば写真記録を行う。スライスを
１０mlポリプロピレンチューブに入れ、これにアガロー
ス濃度を０．２％未満に下げるのに十分なＬＳＢを加え
る。アガロースを６０℃にて３０分間加熱して溶融し、
十分に混合し、そして次に３７℃にて３０分間平衡化す
る。
【００５６】秒当り２滴の流速を用いて室温にてクロマ
トグラフィーを行う。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈ
ｕｅｌｌ Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカラムを２．５ml ＨＳＢ
で洗浄し、そして次に２．５mlのＬＳＢで洗浄する。次
に３７℃にてＤＮＡ溶液をカラムに通す。カラムを２．
５mlのＬＳＢですすぎ、そしてＤＮＡを０．４ml ＨＳ
Ｂで溶出する。
トグラフィーを行う。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈ
ｕｅｌｌ Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカラムを２．５ml ＨＳＢ
で洗浄し、そして次に２．５mlのＬＳＢで洗浄する。次
に３７℃にてＤＮＡ溶液をカラムに通す。カラムを２．
５mlのＬＳＢですすぎ、そしてＤＮＡを０．４ml ＨＳ
Ｂで溶出する。
【００５７】１mlのエタノールを添加しそして１５００
０rpm にて３０分間遠心することによりＤＮＡをエタノ
ール沈澱する。注意深くペレットを避けながら無菌ガラ
スピペットにより上清を除去する。５００μｌの７０％
ＥｔＯＨ／水を加え、５分間遠心分離し、そして前記
のようにして上清を除去することによりＤＮＡペレット
を洗浄する。ＤＮＡをＳｐｅｅｄｖａｃ中で２分間乾燥
し、そして水中に再懸濁する。
０rpm にて３０分間遠心することによりＤＮＡをエタノ
ール沈澱する。注意深くペレットを避けながら無菌ガラ
スピペットにより上清を除去する。５００μｌの７０％
ＥｔＯＨ／水を加え、５分間遠心分離し、そして前記
のようにして上清を除去することによりＤＮＡペレット
を洗浄する。ＤＮＡをＳｐｅｅｄｖａｃ中で２分間乾燥
し、そして水中に再懸濁する。
【００５８】Ｔ４ポリメラーゼによるＤＮＡの末端平滑
化 １pMの末端に２μｌのＴ４緩衝液Ｘ１０、２μｌのｄＸ
ＴＰ（０．５mMずつのｄＧ，ｄＴ，ｄＣ）、２μｌの
０．５mM ｄＡＴＰ、１ＵのＴ４ポリメラーゼ、２０μ
ｌまでの水を加える。３７℃にて３０分間インキュベー
トする。（定義：１ＵのＴ４ポリメラーゼは、０．２mM
変性大腸菌ＤＮＡでプライムされた時、３７℃にて３０
分間でＤＮＡに１０mM ｄＸＴＰを導入する。）
化 １pMの末端に２μｌのＴ４緩衝液Ｘ１０、２μｌのｄＸ
ＴＰ（０．５mMずつのｄＧ，ｄＴ，ｄＣ）、２μｌの
０．５mM ｄＡＴＰ、１ＵのＴ４ポリメラーゼ、２０μ
ｌまでの水を加える。３７℃にて３０分間インキュベー
トする。（定義：１ＵのＴ４ポリメラーゼは、０．２mM
変性大腸菌ＤＮＡでプライムされた時、３７℃にて３０
分間でＤＮＡに１０mM ｄＸＴＰを導入する。）
【００５９】ＤＮＡのアルカリホスファターゼ処理 １pMの末端、５μｌの１０Ｘ ＢＡＰ緩衝液、５０μｌ
最終容量への水、細菌アルカリホスファターゼＢＡＰ
（５′の延長のためにはＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの５００Ｕを使
用又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓからの０．５Ｕを使用；平滑末端のため
には２倍多く使用）。６５℃にて３０分間インキュベー
トし、１０μｌの１mg／ml Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ
でＴＥ中で３７℃にて３０分間処理し、次にフェノール
抽出し、エーテル抽出及びエタノール沈澱を行うか、あ
るいはＬＧＴ上にＤＮＡを通すことにより蛋白質からＤ
ＮＡを分離し、次にＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
を行うことによりＢＡＰを除去する。
最終容量への水、細菌アルカリホスファターゼＢＡＰ
（５′の延長のためにはＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの５００Ｕを使
用又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓからの０．５Ｕを使用；平滑末端のため
には２倍多く使用）。６５℃にて３０分間インキュベー
トし、１０μｌの１mg／ml Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ
でＴＥ中で３７℃にて３０分間処理し、次にフェノール
抽出し、エーテル抽出及びエタノール沈澱を行うか、あ
るいはＬＧＴ上にＤＮＡを通すことにより蛋白質からＤ
ＮＡを分離し、次にＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
を行うことによりＢＡＰを除去する。
【００６０】実施例１． ｐＦＢＹ８及びｐＦＢＹ８Ｒ
の作製 ２μｇのｐＦＢＹ７をＣＡ緩衝液中でＨｉｎｄIII 及び
ＫｐｎＩにより完全消化する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。３．９kbp 断片
を切り出し、そしてＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
によりＤＮＡを精製する。ＤＮＡ断片を、０．０５mMず
つのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在
下で３７℃にて３０分間、１ユニットのＴ４ポリメラー
ゼにより平滑末端化する。酵素を６５℃にて１０分間熱
失活させる。
の作製 ２μｇのｐＦＢＹ７をＣＡ緩衝液中でＨｉｎｄIII 及び
ＫｐｎＩにより完全消化する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。３．９kbp 断片
を切り出し、そしてＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
によりＤＮＡを精製する。ＤＮＡ断片を、０．０５mMず
つのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在
下で３７℃にて３０分間、１ユニットのＴ４ポリメラー
ゼにより平滑末端化する。酵素を６５℃にて１０分間熱
失活させる。
【００６１】２μｇのｐＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中Ｓｎａ
ＢＩにより完全開裂せしめる。６５℃にて３０分間ＢＡ
Ｐ中で５００ユニットのＢＡＰを用いて５′−リン酸基
を除去することによりベクターの自己連結を防止する。
これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分
離する。９．３kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡを
ＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。Ｄ
ＮＡ断片を１ユニットのＴ４ポリメラーゼにより上記の
ようにして平滑末端化する。
ＢＩにより完全開裂せしめる。６５℃にて３０分間ＢＡ
Ｐ中で５００ユニットのＢＡＰを用いて５′−リン酸基
を除去することによりベクターの自己連結を防止する。
これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分
離する。９．３kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡを
ＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。Ｄ
ＮＡ断片を１ユニットのＴ４ポリメラーゼにより上記の
ようにして平滑末端化する。
【００６２】約２０ngの挿入部を、１mM ＡＴＰ及び連
結緩衝液の存在下、０．５ユニットのＴ４リガーゼによ
り室温にて３時間、別々の連結反応において、２０ngず
つのベクターに連結する。これらの連結混合物を用いて
４０μｌアリコートのコンピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′
細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ及び
ＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートする。
３７℃にて１６時間のインキュベートの後、白色のコロ
ニーを拾い、そしてＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いてミ
ニスクリーニングして正しい挿入部及び方向の存在を確
認する。
結緩衝液の存在下、０．５ユニットのＴ４リガーゼによ
り室温にて３時間、別々の連結反応において、２０ngず
つのベクターに連結する。これらの連結混合物を用いて
４０μｌアリコートのコンピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′
細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ及び
ＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートする。
３７℃にて１６時間のインキュベートの後、白色のコロ
ニーを拾い、そしてＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いてミ
ニスクリーニングして正しい挿入部及び方向の存在を確
認する。
【００６３】ｐＦＢＹ８及びｐＦＢＹ８ＲはＵＲＡ３
ＣＤＣ９挿入部の方向を異にする。ｐＦＢＹ８において
は、ＵＲＡ３遺伝子の転写の方向がａｍｐＲ遺伝子のそ
れと逆になるように挿入部が挿入されている。これらの
ベクターは、形質転換されたＳ．セレビシエー細胞中で
対称的プラスミドを生じさせる崩壊性ベクターの例であ
る。
ＣＤＣ９挿入部の方向を異にする。ｐＦＢＹ８において
は、ＵＲＡ３遺伝子の転写の方向がａｍｐＲ遺伝子のそ
れと逆になるように挿入部が挿入されている。これらの
ベクターは、形質転換されたＳ．セレビシエー細胞中で
対称的プラスミドを生じさせる崩壊性ベクターの例であ
る。
【００６４】実施例２． ｐＦＢＹ１１及びｐＦＢＹ１
１Ｐの作製 ｐＦＢＹ２の１μｇのアリコート７個を０，０．１，
０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５又は０．
０３１２５ユニットのＸｂａＩによりＣＡ緩衝液中３７
℃にて１時間消化する。１０mM ＥＤＴＡの添加により
酵素反応を停止し、そして断片を０．８％ ＬＧＴゲル
上で分離する。酵素濃度の１つにおいて、線状化された
プラスミドが他の断片から明瞭に分離され、そしてこれ
をＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
ＤＮＡ断片を１００ユニットのＳ１ヌクレアーゼによ
り、Ｓ１緩衝液中室温にて３０分間処理する。これを６
５℃にて１０分間加熱することにより不活性化し、そし
て次に０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの存在下３７℃にて３０分間、１ユニット
のＴ４ポリメラーゼにより適切に平滑末端化する。酵素
を６０℃にて１０分間熱失活させる。
１Ｐの作製 ｐＦＢＹ２の１μｇのアリコート７個を０，０．１，
０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５又は０．
０３１２５ユニットのＸｂａＩによりＣＡ緩衝液中３７
℃にて１時間消化する。１０mM ＥＤＴＡの添加により
酵素反応を停止し、そして断片を０．８％ ＬＧＴゲル
上で分離する。酵素濃度の１つにおいて、線状化された
プラスミドが他の断片から明瞭に分離され、そしてこれ
をＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
ＤＮＡ断片を１００ユニットのＳ１ヌクレアーゼによ
り、Ｓ１緩衝液中室温にて３０分間処理する。これを６
５℃にて１０分間加熱することにより不活性化し、そし
て次に０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの存在下３７℃にて３０分間、１ユニット
のＴ４ポリメラーゼにより適切に平滑末端化する。酵素
を６０℃にて１０分間熱失活させる。
【００６５】約２０ngずつのこの調製された断片を、１
mM ＡＴＰ及び連結緩衝液の存在下０．５ユニットのＴ
４リガーゼにより、室温にて３時間連結する。この連結
混合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＣを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白
色コロニーを拾い、そしてＨｉｎｄIII を用いてミニス
クリーニングを用い、正しいプラスミドの存在を確認
し、そしてＰｓｔＩ−ＸｂａＩ二重消化により正しいＸ
ｂａＩ部位の除去を決定する。
mM ＡＴＰ及び連結緩衝液の存在下０．５ユニットのＴ
４リガーゼにより、室温にて３時間連結する。この連結
混合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＣを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白
色コロニーを拾い、そしてＨｉｎｄIII を用いてミニス
クリーニングを用い、正しいプラスミドの存在を確認
し、そしてＰｓｔＩ−ＸｂａＩ二重消化により正しいＸ
ｂａＩ部位の除去を決定する。
【００６６】これが３種類の可能なプラスミドを生じさ
せる。これらの内の２個を選択し、そしてｐＦＢＹ１１
及びｐＦＢＹ１１Ｐと命名する。これらは２個のＦＲＴ
直接反復のどちらが不活性化されているかにより異る。
ｐＦＢＹ１１においては、ａｍｐＲ遺伝子の上流の第一
ＦＲＴがそしてｐＦＢＹ１１ＰにおいてはａｍｐＲ遺伝
子の下流の第一ＦＲＴが破壊されている。
せる。これらの内の２個を選択し、そしてｐＦＢＹ１１
及びｐＦＢＹ１１Ｐと命名する。これらは２個のＦＲＴ
直接反復のどちらが不活性化されているかにより異る。
ｐＦＢＹ１１においては、ａｍｐＲ遺伝子の上流の第一
ＦＲＴがそしてｐＦＢＹ１１ＰにおいてはａｍｐＲ遺伝
子の下流の第一ＦＲＴが破壊されている。
【００６７】実施例３． ｐＹＢＹ１３ファミリーの作
製 プラスミドのｐＦＢＹ１２及びｐＦＢＹ１３ファミリー
においては、後者は実施例４に記載されており、種々の
遺伝子の挿入がｐＦＢＹ２のＳｎａＢＩ部位に行われ、
そして図１に示す最も右のＦＲＴ結合断片のサイズが増
加している。Ｐシリーズ、例えばｐＦＢＹ１２Ｐ，ｐＦ
ＢＹ１３ｒｅｖ等においては、図１に示すＦＲＴ−１反
復の中間のＸｂａＩ部位が除去されており、従ってこれ
らのプラスミドは、このＸｂａＩ部位の除去により不活
性化されたＦＲＴ−２部位を有する対応するプラスミド
より一層非対称的となっている。後に記載する結果か
ら、Ｐシリーズのプラスミドが、他の点では同じである
が対称的であるプラスミドよりすべて安定性が低いこと
が明らかである。
製 プラスミドのｐＦＢＹ１２及びｐＦＢＹ１３ファミリー
においては、後者は実施例４に記載されており、種々の
遺伝子の挿入がｐＦＢＹ２のＳｎａＢＩ部位に行われ、
そして図１に示す最も右のＦＲＴ結合断片のサイズが増
加している。Ｐシリーズ、例えばｐＦＢＹ１２Ｐ，ｐＦ
ＢＹ１３ｒｅｖ等においては、図１に示すＦＲＴ−１反
復の中間のＸｂａＩ部位が除去されており、従ってこれ
らのプラスミドは、このＸｂａＩ部位の除去により不活
性化されたＦＲＴ−２部位を有する対応するプラスミド
より一層非対称的となっている。後に記載する結果か
ら、Ｐシリーズのプラスミドが、他の点では同じである
が対称的であるプラスミドよりすべて安定性が低いこと
が明らかである。
【００６８】２μｇのｐＦＢＹ７をＣＡ緩衝液中でＨｉ
ｎｄIII 及びＫｐｎＩにより完全開裂せしめる。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離
する。３．９kbp 断片を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌ
ｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。ＤＮＡ
断片を、０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの存在下で３７℃にて３０分間、１ユニ
ットのＴ４ポリメラーゼにより平滑末端化する。酵素を
６５℃にて１０分間熱失活させる。
ｎｄIII 及びＫｐｎＩにより完全開裂せしめる。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離
する。３．９kbp 断片を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌ
ｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。ＤＮＡ
断片を、０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの存在下で３７℃にて３０分間、１ユニ
ットのＴ４ポリメラーゼにより平滑末端化する。酵素を
６５℃にて１０分間熱失活させる。
【００６９】ｐＦＢＹ１１及びｐＦＢＹ１１Ｐから２個
の別個のベクターを調製する。２μｇずつをＣＡ緩衝液
中でＳｎａＢＩにより完全開裂せしめる。５００ユニッ
トのＢＡＰによりＢＡＰ緩衝液中で６５℃にて３０分間
５′−リン酸基を除去することによりベクターの自己連
結を防止する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％
ＬＧＴゲル上で分離する。９．３kbp バンドを切り出
し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
により精製する。１ユニットのＴ４ポリメラーゼを用い
て前記のようにしてＤＮＡ断片を平滑末端化する。
の別個のベクターを調製する。２μｇずつをＣＡ緩衝液
中でＳｎａＢＩにより完全開裂せしめる。５００ユニッ
トのＢＡＰによりＢＡＰ緩衝液中で６５℃にて３０分間
５′−リン酸基を除去することによりベクターの自己連
結を防止する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％
ＬＧＴゲル上で分離する。９．３kbp バンドを切り出
し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
により精製する。１ユニットのＴ４ポリメラーゼを用い
て前記のようにしてＤＮＡ断片を平滑末端化する。
【００７０】約２０ngの挿入部を、２０ngずつベクター
に、１mM ＡＴＰ及び連結緩衝液の存在下０．５ユニッ
トのＴ４リガーゼにより室温にて３時間、別々の連結反
応において連結する。これらの連結混合物を用いて、４
０μｌアリコートのコンピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細
胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ及びＩ
ＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートする。３
７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白色コロ
ニーを拾い、そしてＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いてミ
ニスクリーニングを行い、正しい挿入及び方向の存在を
確認する。
に、１mM ＡＴＰ及び連結緩衝液の存在下０．５ユニッ
トのＴ４リガーゼにより室温にて３時間、別々の連結反
応において連結する。これらの連結混合物を用いて、４
０μｌアリコートのコンピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細
胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ及びＩ
ＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートする。３
７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白色コロ
ニーを拾い、そしてＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いてミ
ニスクリーニングを行い、正しい挿入及び方向の存在を
確認する。
【００７１】こうして４種類のプラスミドが生ずる。ｐ
ＦＢＹ１１からのｐＦＢＹ１２及びｐＦＢＹ１２ＲはＵ
ＲＡ３ ＣＤＣ９挿入部の方向を異にし、そしてｐＦＢ
Ｙ１１Ｐからの２個のｐＦＢＹ１２Ｐ及びｐＦＢＹ１２
ＰＲは前記と同様に異る。ｐＦＢＹ１２Ｒ及びｐＦＢＹ
１２ＰＲにおいては、ＵＲＡ３遺伝子の転写の方向はａ
ｍｐＲ遺伝子のそれと同じである。
ＦＢＹ１１からのｐＦＢＹ１２及びｐＦＢＹ１２ＲはＵ
ＲＡ３ ＣＤＣ９挿入部の方向を異にし、そしてｐＦＢ
Ｙ１１Ｐからの２個のｐＦＢＹ１２Ｐ及びｐＦＢＹ１２
ＰＲは前記と同様に異る。ｐＦＢＹ１２Ｒ及びｐＦＢＹ
１２ＰＲにおいては、ＵＲＡ３遺伝子の転写の方向はａ
ｍｐＲ遺伝子のそれと同じである。
【００７２】ｐＦＢＹ１２及びｐＦＢＹ１２ＰはＦＲＴ
部位の欠失（これらは配列決定され、そして＜３０bpで
あることが示された）を除き、完全に同一の配列を有す
る。この相違は、ｐＦＢＹ１２が対称的プラスミドであ
り、そしてｐＦＢＹ１２Ｐはそうではない。ｐＦＢＹ１
２Ｒ及びｐＦＢＹ１２ＰＲは、ｐＦＢＹ１２及びｐＦＢ
Ｙ１２Ｐと同じ態様で異る。
部位の欠失（これらは配列決定され、そして＜３０bpで
あることが示された）を除き、完全に同一の配列を有す
る。この相違は、ｐＦＢＹ１２が対称的プラスミドであ
り、そしてｐＦＢＹ１２Ｐはそうではない。ｐＦＢＹ１
２Ｒ及びｐＦＢＹ１２ＰＲは、ｐＦＢＹ１２及びｐＦＢ
Ｙ１２Ｐと同じ態様で異る。
【００７３】実施例４． プラスミドのｐＦＢＹ１３フ
ァミリーの作製 下記のスキームに従って、両方向にＧＡＰＦＬｙＨＩＲ
を含有する４つのｐＦＢＹ１２プラスミドから８つのプ
ラスミドを作製することが可能である。ｐＦＢＹ１２フ
ァミリーのプラスミド２μｇずつをＳａｌＩにより完全
消化する。ＢＡＰ緩衝液中６５℃にて３０分間、５００
ユニットのＢＡＰにより５′−リン酸基を除去しベクタ
ーの自己連結を防止する。これらの断片を０．８％ Ｌ
ＧＴゲル上ＴＡＥ緩衝液中で分離する。１３．２kbp バ
ンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマ
トグラフィーにより精製する。
ァミリーの作製 下記のスキームに従って、両方向にＧＡＰＦＬｙＨＩＲ
を含有する４つのｐＦＢＹ１２プラスミドから８つのプ
ラスミドを作製することが可能である。ｐＦＢＹ１２フ
ァミリーのプラスミド２μｇずつをＳａｌＩにより完全
消化する。ＢＡＰ緩衝液中６５℃にて３０分間、５００
ユニットのＢＡＰにより５′−リン酸基を除去しベクタ
ーの自己連結を防止する。これらの断片を０．８％ Ｌ
ＧＴゲル上ＴＡＥ緩衝液中で分離する。１３．２kbp バ
ンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマ
トグラフィーにより精製する。
【００７４】２μｇのｐＦＢＹ５断片をＨ緩衝液中でＳ
ａｌＩにより完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝
液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。ＧＡＰＦＬｙＨＩ
Ｒ遺伝子を担持する１．１kbp 断片を切り出し、そして
ＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーで精製す
る。約２０ngの１．１kbp 挿入部を２０ngずつのｐＦＢ
Ｙ１２ファミリーのベクターに、１mM ＡＴＰ及び連結
緩衝液を含有する反応混合物中で０．５ユニットのＴ４
リガーゼにより室温にて３時間連結した。
ａｌＩにより完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝
液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。ＧＡＰＦＬｙＨＩ
Ｒ遺伝子を担持する１．１kbp 断片を切り出し、そして
ＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーで精製す
る。約２０ngの１．１kbp 挿入部を２０ngずつのｐＦＢ
Ｙ１２ファミリーのベクターに、１mM ＡＴＰ及び連結
緩衝液を含有する反応混合物中で０．５ユニットのＴ４
リガーゼにより室温にて３時間連結した。
【００７５】これらの連結混合物を用いてコンピテント
大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞の４０μｌのアリコートを形質
転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを
含有する２ＹＴプレート上にプレートする。３７℃にて
１６時間のインキュベートの後、白色コロニーを拾い、
そしてＳａｌＩ及びＰｓｔＩを用いてミニスクリーニン
グを行って正しい挿入部の存在及び方向を確認する。
大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞の４０μｌのアリコートを形質
転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを
含有する２ＹＴプレート上にプレートする。３７℃にて
１６時間のインキュベートの後、白色コロニーを拾い、
そしてＳａｌＩ及びＰｓｔＩを用いてミニスクリーニン
グを行って正しい挿入部の存在及び方向を確認する。
【００７６】ｐＦＢＹ１２はｐＦＢＹ１３及びｐＦＢＹ
１３Ｒをもたらす。ｐＦＢＹ１２ＲはｐＦＢＹ１３ｒｅ
ｖ及びｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲをもたらす。ｐＦＢＹ１２
ＰはｐＦＢＹ１３Ｐ及びｐＦＢＹ１３ＰＲをもたらす。
ｐＦＢＹ１２ＰＲはｐＦＢＹ１３Ｐｒｅｖ及びｐＦＢＹ
ＰｒｅｖＲをもたらす。ｐＦＢＹ１３，ｐＦＢＹ１３ｒ
ｅｖ，ｐＦＢＹ１３Ｐ及びｐＦＢＹ１３ＰｒｅｖはＵＲ
Ａ３と同じ転写方向にＧＡＰＦＬｙＨＩＲ遺伝子を担持
し、他方ｐＦＢＹ１３Ｒ，ｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲ，ｐＦ
ＢＹ１３Ｒ及びｐＦＢＹ１３ＰｒｅｖＲでは、これらの
２個の遺伝子が反対方向に向いている。
１３Ｒをもたらす。ｐＦＢＹ１２ＲはｐＦＢＹ１３ｒｅ
ｖ及びｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲをもたらす。ｐＦＢＹ１２
ＰはｐＦＢＹ１３Ｐ及びｐＦＢＹ１３ＰＲをもたらす。
ｐＦＢＹ１２ＰＲはｐＦＢＹ１３Ｐｒｅｖ及びｐＦＢＹ
ＰｒｅｖＲをもたらす。ｐＦＢＹ１３，ｐＦＢＹ１３ｒ
ｅｖ，ｐＦＢＹ１３Ｐ及びｐＦＢＹ１３ＰｒｅｖはＵＲ
Ａ３と同じ転写方向にＧＡＰＦＬｙＨＩＲ遺伝子を担持
し、他方ｐＦＢＹ１３Ｒ，ｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲ，ｐＦ
ＢＹ１３Ｒ及びｐＦＢＹ１３ＰｒｅｖＲでは、これらの
２個の遺伝子が反対方向に向いている。
【００７７】ｐＦＢＹ１２シリーズと同様に、ｐＦＢＹ
１３シリーズのプラスミドはやはり、ＦＲＴ部位が除去
されている点でのみ異るプラスミド対を含む。従って、
ｐＦＢＹ１３ＰはｐＦＢＹ１３の対称性の低いバージョ
ンである。同様に、「Ｐ」で示される他のプラスミドは
それらの対応物に比べて対称性が低いが、他の点では同
一である。
１３シリーズのプラスミドはやはり、ＦＲＴ部位が除去
されている点でのみ異るプラスミド対を含む。従って、
ｐＦＢＹ１３ＰはｐＦＢＹ１３の対称性の低いバージョ
ンである。同様に、「Ｐ」で示される他のプラスミドは
それらの対応物に比べて対称性が低いが、他の点では同
一である。
【００７８】実施例５． ｐＦＢＹ２３の作製 ２μｇのｐＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中でＦｓｐＩにより完
全消化する。６５℃にて１０分間の加熱により制限エン
ドヌクレアーゼを不活性化する。水を添加して体積を２
倍にし、そして０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下で１ユニットのＴ４ポリ
メラーゼにより３７℃にて３０分間平滑末端化する。酵
素を６５℃にて１０分間熱失活させる。エタノール沈澱
の後、ＤＮＡをＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩにより再切
断する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中２％ ＬＧＴ上
で分離する。１７０bp及び５２３bpの断片を切り出し、
そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーによ
り精製する。
全消化する。６５℃にて１０分間の加熱により制限エン
ドヌクレアーゼを不活性化する。水を添加して体積を２
倍にし、そして０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下で１ユニットのＴ４ポリ
メラーゼにより３７℃にて３０分間平滑末端化する。酵
素を６５℃にて１０分間熱失活させる。エタノール沈澱
の後、ＤＮＡをＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩにより再切
断する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中２％ ＬＧＴ上
で分離する。１７０bp及び５２３bpの断片を切り出し、
そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーによ
り精製する。
【００７９】２μｇのｐＴＺ１８ＲをＣＡ緩衝液中でＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII により完全開裂する。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離
する。２．８kbバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌ
ｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。約２０
ngずつの調製された断片を、配列ＧＧＧＡＴＣＣＣの非
リン酸化ＢａｍＨＩリンカー及び１mMＡＴＰ並びに連結
緩衝液と共に、０．５ユニットのＴ４リガーゼにより室
温にて３時間連結する。
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII により完全開裂する。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離
する。２．８kbバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌ
ｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。約２０
ngずつの調製された断片を、配列ＧＧＧＡＴＣＣＣの非
リン酸化ＢａｍＨＩリンカー及び１mMＡＴＰ並びに連結
緩衝液と共に、０．５ユニットのＴ４リガーゼにより室
温にて３時間連結する。
【００８０】この連結混合物を用いてコンピテント大腸
菌ＤＨ５αＦ′細胞４０μｌを形質転換し、そしてアン
ピシリン、Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレ
ート上にプレートする。３７℃にて１６時間のインキュ
ベーションの後、白色コロニーを拾い、そしてＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄIII 二重消化によりミニスクリーニングし
て正しい挿入部の存在を確認し、そしてＨｉｎｄIII−
ＢａｍＨＩ二重消化が前のＦｓｐＩ部位中のＢａｍＨＩ
リンカーの存在を示す。
菌ＤＨ５αＦ′細胞４０μｌを形質転換し、そしてアン
ピシリン、Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレ
ート上にプレートする。３７℃にて１６時間のインキュ
ベーションの後、白色コロニーを拾い、そしてＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄIII 二重消化によりミニスクリーニングし
て正しい挿入部の存在を確認し、そしてＨｉｎｄIII−
ＢａｍＨＩ二重消化が前のＦｓｐＩ部位中のＢａｍＨＩ
リンカーの存在を示す。
【００８１】実施例６． ｐＦＢＹ２４の作製 ２μｇのｐＦＢＹ２３をＣＡ緩衝液中でＨｉｎｄIII 及
びＥｃｏＲＩにより完全消化する。これらの断片をＴＡ
Ｅ緩衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。７０１bpバ
ンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマ
トグラフィーにより精製する。
びＥｃｏＲＩにより完全消化する。これらの断片をＴＡ
Ｅ緩衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。７０１bpバ
ンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマ
トグラフィーにより精製する。
【００８２】２μｇのｐＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中でＰｓ
ｔＩ及びＸｂａＩにより完全消化する。これらの断片を
ＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離する。
１．９５kbp 断片を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。２μｇのｐ
ＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中でＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによ
り完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８
％ ＬＧＴ上で分離する。２．９kbp 断片を切り出し、
そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーによ
り精製する。
ｔＩ及びＸｂａＩにより完全消化する。これらの断片を
ＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離する。
１．９５kbp 断片を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。２μｇのｐ
ＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中でＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによ
り完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８
％ ＬＧＴ上で分離する。２．９kbp 断片を切り出し、
そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーによ
り精製する。
【００８３】約２０ngずつの調製された断片を、１mM
ＡＴＰ及び連結緩衝液の存在下で０．５ユニットのＴ４
リガーゼにより室温にて３時間一緒に連結する。連結混
合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベートの後、白色コ
ロニーを拾い、そしてＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ、及び
ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ二重消化を用いてミニスクリーニン
グを行い、正しい挿入部の存在を確認し、そしてＢａｍ
ＨＩが新たなＢａｍＨＩ部位の存在を確認する。
ＡＴＰ及び連結緩衝液の存在下で０．５ユニットのＴ４
リガーゼにより室温にて３時間一緒に連結する。連結混
合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベートの後、白色コ
ロニーを拾い、そしてＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ、及び
ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ二重消化を用いてミニスクリーニン
グを行い、正しい挿入部の存在を確認し、そしてＢａｍ
ＨＩが新たなＢａｍＨＩ部位の存在を確認する。
【００８４】ｐＦＢＹ２４は、ＦＬＰ遺伝子の３′−末
端のＦｓｐＩ部位にＢａｍＨＩ部位が挿入されている点
を除き、直接反復ＦＲＴ部位により分離されたプラスミ
ドｐＴＺ１８Ｒ及び２μの完全配列を伴うｐＦＢＹ２と
同じである。実施例７． ｐＦＢＹ２５及びｐＦＢＹ２５Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ４をＣＡ緩衝液中でＸｂａＩにより完
全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％
ＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンドを切り出
し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
により精製する。
端のＦｓｐＩ部位にＢａｍＨＩ部位が挿入されている点
を除き、直接反復ＦＲＴ部位により分離されたプラスミ
ドｐＴＺ１８Ｒ及び２μの完全配列を伴うｐＦＢＹ２と
同じである。実施例７． ｐＦＢＹ２５及びｐＦＢＹ２５Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ４をＣＡ緩衝液中でＸｂａＩにより完
全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％
ＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンドを切り出
し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
により精製する。
【００８５】２μｇのｐＦＢＹ２４をＣＡ緩衝液中でＢ
ａｍＨＩにより完全開裂する。ＢＡＰ緩衝液中６５℃に
て３０分間５００ユニットのＢＡＰにより５′−リン酸
基を除去してベクターの自己連結を防止する。これらの
断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。
９．３kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。前記のよう
にして１ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いてＤＮＡ断
片を平滑末端化する。
ａｍＨＩにより完全開裂する。ＢＡＰ緩衝液中６５℃に
て３０分間５００ユニットのＢＡＰにより５′−リン酸
基を除去してベクターの自己連結を防止する。これらの
断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴ上で分離する。
９．３kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。前記のよう
にして１ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いてＤＮＡ断
片を平滑末端化する。
【００８６】約２０ngずつの調製された断片を１mM Ａ
ＴＰ及び連結緩衝液の存在下で０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温にて３時間一緒に連結する。この連結
混合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白
色コロニーを拾い、そしてＢａｍＨＩを用いてミニスク
リーニングを行って正しい挿入部の存在を確認し、そし
てＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ二重消化が方向を決定する。
ＴＰ及び連結緩衝液の存在下で０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温にて３時間一緒に連結する。この連結
混合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白
色コロニーを拾い、そしてＢａｍＨＩを用いてミニスク
リーニングを行って正しい挿入部の存在を確認し、そし
てＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ二重消化が方向を決定する。
【００８７】これにより２つのプラスミドｐＦＢＹ２５
及びｐＦＢＹ２５Ｒが得られる。これら２種類のプラス
ミドの唯一の相違は、前者においてはＵＲＡ３遺伝子が
ａｍｐＲ遺伝子と同じ方向にあり、そして後者において
は反対の方向にあることである。実施例８． ｐＦＢＹ２７及びｐＥＢＹ２７Ｒ、並びに
ｐＦＢＹ２７ｒｅｖ及びｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲの作製 細菌配列を失い且つなお対称性を保持することができる
プラスミドを作製するため、ｐＦＢＹ２中のＦｓｐＩ部
位の１つをＢａｍＨＩリンカーにより置き換えた。この
新たに作られたＢａｍＨＩ部位の位置を図１に「１」と
標示する。ｐＦＢＹ２７及びさらに後記のｐＦＢＹ７９
のごときプラスミドにおいて、挿入部はＳｎａＢＩ部位
及び創成されたＢａｍＨＩの両者に存在し、このためプ
ラスミドが組換わって細菌配列が除去され、対称的プラ
スミドが生ずる。
及びｐＦＢＹ２５Ｒが得られる。これら２種類のプラス
ミドの唯一の相違は、前者においてはＵＲＡ３遺伝子が
ａｍｐＲ遺伝子と同じ方向にあり、そして後者において
は反対の方向にあることである。実施例８． ｐＦＢＹ２７及びｐＥＢＹ２７Ｒ、並びに
ｐＦＢＹ２７ｒｅｖ及びｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲの作製 細菌配列を失い且つなお対称性を保持することができる
プラスミドを作製するため、ｐＦＢＹ２中のＦｓｐＩ部
位の１つをＢａｍＨＩリンカーにより置き換えた。この
新たに作られたＢａｍＨＩ部位の位置を図１に「１」と
標示する。ｐＦＢＹ２７及びさらに後記のｐＦＢＹ７９
のごときプラスミドにおいて、挿入部はＳｎａＢＩ部位
及び創成されたＢａｍＨＩの両者に存在し、このためプ
ラスミドが組換わって細菌配列が除去され、対称的プラ
スミドが生ずる。
【００８８】２μｇのｐＦＢＹ５をＨ緩衝液中で完全開
裂せしめる。断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲ
ル上で分離する。１．１kbp バンドを切り出し、そして
ＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製
する。断片を、０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下、３７℃にて３０分間、
１ユニットのＴ４ポリメラーゼにより平滑末端化する。
酵素を６５℃にて１０分間熱失活させる。
裂せしめる。断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲ
ル上で分離する。１．１kbp バンドを切り出し、そして
ＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製
する。断片を、０．０５mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下、３７℃にて３０分間、
１ユニットのＴ４ポリメラーゼにより平滑末端化する。
酵素を６５℃にて１０分間熱失活させる。
【００８９】２μｇのｐＦＢＹ２５及びｐＦＢＹ２５Ｒ
をＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩにより別々に完全開裂せし
める。ＢＡＰ緩衝液中６５℃にて３０分間５００ユニッ
トのＢＡＰにより５′−リン酸基を除去することにより
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離する。１０．５
kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤ
クロマトグラフィーにより精製する。
をＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩにより別々に完全開裂せし
める。ＢＡＰ緩衝液中６５℃にて３０分間５００ユニッ
トのＢＡＰにより５′−リン酸基を除去することにより
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で分離する。１０．５
kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤ
クロマトグラフィーにより精製する。
【００９０】ｐＦＢＹ５から調製された断片約２０ng
を、１mM ＡＴＰ及び連結混合物の存在下、０．５ユニ
ットのＴ４リガーゼにより室温にて３時間、別々の反応
においてｐＦＢＹ２５又はｐＦＢＹ２５Ｒに連結する。
これらの連結混合物を使って４０μｌのコンピテント大
腸菌ＤＨ５αＦ′を形質転換し、そしてアンピシリン、
Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプ
レートする。３７℃にて１６時間のインキュベーション
の後、白色コロニーを拾い、そしてＰｓｔＩ及びＥｃｏ
ＲＩ消化を用いてミニスクリーニングを行って正しい挿
入部の存在及び方向を確認する。
を、１mM ＡＴＰ及び連結混合物の存在下、０．５ユニ
ットのＴ４リガーゼにより室温にて３時間、別々の反応
においてｐＦＢＹ２５又はｐＦＢＹ２５Ｒに連結する。
これらの連結混合物を使って４０μｌのコンピテント大
腸菌ＤＨ５αＦ′を形質転換し、そしてアンピシリン、
Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプ
レートする。３７℃にて１６時間のインキュベーション
の後、白色コロニーを拾い、そしてＰｓｔＩ及びＥｃｏ
ＲＩ消化を用いてミニスクリーニングを行って正しい挿
入部の存在及び方向を確認する。
【００９１】これにより、ｐＦＢＹ２５から２種類のプ
ラスミドｐＦＢＹ２７及びｐＦＢＹ２７Ｒが生ずる。両
プラスミドにおいて、ＵＲＡ３遺伝子はａｍｐＲと同じ
方向を有する。これらはヒルジン発現カセットＧＡＰＦ
ＬｙＨＩＲの方向においてのみ異り、ｐＦＢＹ２７にお
いてはＵＲＡ３とは反対に向いており、そしてｐＦＢＹ
２７ＲにおいてはＵＲＡ３と同じ方向に向いている。ｐ
ＦＢＹ２５Ｒから２種類のプラスミドｐＦＢＹ２７ｒｅ
ｖ及びｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲが生ずる。これらはヒルジ
ン発現カセットの方向においてのみ異り、ｐＦＢＹ２７
においてはＵＲＡ３と同じ方向にあり、そしてｐＦＢＹ
２７ｒｅｖＲにおいてはＵＲＡ３と反対の方向に向いて
おり、そして両プラスミドにおいてａｍｐＲとは反対の
方向に向いている。
ラスミドｐＦＢＹ２７及びｐＦＢＹ２７Ｒが生ずる。両
プラスミドにおいて、ＵＲＡ３遺伝子はａｍｐＲと同じ
方向を有する。これらはヒルジン発現カセットＧＡＰＦ
ＬｙＨＩＲの方向においてのみ異り、ｐＦＢＹ２７にお
いてはＵＲＡ３とは反対に向いており、そしてｐＦＢＹ
２７ＲにおいてはＵＲＡ３と同じ方向に向いている。ｐ
ＦＢＹ２５Ｒから２種類のプラスミドｐＦＢＹ２７ｒｅ
ｖ及びｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲが生ずる。これらはヒルジ
ン発現カセットの方向においてのみ異り、ｐＦＢＹ２７
においてはＵＲＡ３と同じ方向にあり、そしてｐＦＢＹ
２７ｒｅｖＲにおいてはＵＲＡ３と反対の方向に向いて
おり、そして両プラスミドにおいてａｍｐＲとは反対の
方向に向いている。
【００９２】これら４種類のプラスミドは崩壊性ベクタ
ーであって、Ｓ．セレビシエーに形質転換された場合、
分子内組換え現象を受けて、２μ配列の全体、選択マー
カーとしてのＵＲＡ３及びＧＡＰＤＨ−ＨＩＲ発現カセ
ットを含有する対称的プラスミドをもたらす。実施例９． ｐＦＢＹ６６及びｐＦＢＹ６６Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ６５をＣＡ緩衝液中でＳｍａＩにより
完全開裂せしめる。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．
８％ ＬＧＴゲル上で分離する。１．４kbpバンドを切
り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフ
ィーにより精製する。
ーであって、Ｓ．セレビシエーに形質転換された場合、
分子内組換え現象を受けて、２μ配列の全体、選択マー
カーとしてのＵＲＡ３及びＧＡＰＤＨ−ＨＩＲ発現カセ
ットを含有する対称的プラスミドをもたらす。実施例９． ｐＦＢＹ６６及びｐＦＢＹ６６Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ６５をＣＡ緩衝液中でＳｍａＩにより
完全開裂せしめる。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．
８％ ＬＧＴゲル上で分離する。１．４kbpバンドを切
り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフ
ィーにより精製する。
【００９３】２μｇのｐＦＢＹ２５をＣＡ緩衝液中でＳ
ｎａＢＩにより完全開裂せしめる。ＢＡＰ緩衝液中６５
℃にて３０分間、５００ユニットのＢＡＰにより５′−
リン酸基を除去し、ベクターの自己連結を防止する。こ
れらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で
分離する。１０．５kbp 断片を切り出し、そしてＤＮＡ
をＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
ｎａＢＩにより完全開裂せしめる。ＢＡＰ緩衝液中６５
℃にて３０分間、５００ユニットのＢＡＰにより５′−
リン酸基を除去し、ベクターの自己連結を防止する。こ
れらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％ ＬＧＴゲル上で
分離する。１０．５kbp 断片を切り出し、そしてＤＮＡ
をＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
【００９４】約２０ngの調製された断片を、１mM ＡＴ
Ｐ及び連結緩衝液の存在下、０．５ユニットのＴ４リガ
ーゼにより室温にて３時間一緒に連結する。この連結混
合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白
色コロニーを拾い、そしてＰｓｔＩ及びＸｂａＩ消化を
用いてミニスクリーニングを行い、正しい挿入部の存在
及び方向を確認する。
Ｐ及び連結緩衝液の存在下、０．５ユニットのＴ４リガ
ーゼにより室温にて３時間一緒に連結する。この連結混
合物を用いて４０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘｇａｌ
及びＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上にプレートす
る。３７℃にて１６時間のインキュベーションの後、白
色コロニーを拾い、そしてＰｓｔＩ及びＸｂａＩ消化を
用いてミニスクリーニングを行い、正しい挿入部の存在
及び方向を確認する。
【００９５】こうして２種類のプラスミドｐＦＢＹ６６
及びｐＥＢＹ６６Ｒが得られ、これらはＩＧＩ−Ｉ発現
カセットの方向においてのみ異る。これら２種類のプラ
スミドは崩壊性プラスミドであって、Ｓ．セレビシエー
に形質転換された場合、組換わって、２μ配列の全体、
選択マーカーとしてのＵＲＡ３、及びＧＡＰＰＤＨプロ
モーターの制御のもとにＩＧＩ−Ｉ遺伝子を含有する発
現カセットを含む対称的プラスミドをもたらす。
及びｐＥＢＹ６６Ｒが得られ、これらはＩＧＩ−Ｉ発現
カセットの方向においてのみ異る。これら２種類のプラ
スミドは崩壊性プラスミドであって、Ｓ．セレビシエー
に形質転換された場合、組換わって、２μ配列の全体、
選択マーカーとしてのＵＲＡ３、及びＧＡＰＰＤＨプロ
モーターの制御のもとにＩＧＩ−Ｉ遺伝子を含有する発
現カセットを含む対称的プラスミドをもたらす。
【００９６】実施例１０． ｐＦＢＹ７４の作製 ２μｇのｐＦＢＹ２９をＣＡ緩衝液中でＢａｍＨＩで完
全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中で０．８％
のＬＧＴゲルで分離する。２．０kbp バンドを切り出
し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
により精製する。２μｇのｐＦＢＹ２９をＣＡ緩衝液中
でＢａｍＨＩにより完全に切断する。５′−リン酸基を
ＢＡＰ緩衝液中で５００ユニットのＢＡＰで６５℃にお
いて３０分間除去して、ベクターの自己連結を防止す
る。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中で０．８％のＬＧＴ
ゲルで分離する。９．３kbp のバンドを切り出し、そし
てＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精
製する。
全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中で０．８％
のＬＧＴゲルで分離する。２．０kbp バンドを切り出
し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィー
により精製する。２μｇのｐＦＢＹ２９をＣＡ緩衝液中
でＢａｍＨＩにより完全に切断する。５′−リン酸基を
ＢＡＰ緩衝液中で５００ユニットのＢＡＰで６５℃にお
いて３０分間除去して、ベクターの自己連結を防止す
る。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中で０．８％のＬＧＴ
ゲルで分離する。９．３kbp のバンドを切り出し、そし
てＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精
製する。
【００９７】ほぼ２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴ
Ｐおよび連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４
リガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。こ
の連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌
ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、
ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上で
プレイティングする。３７℃において１６時間インキュ
ベーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＢ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩ−ＸｂａＩ二重消化を使用して
ミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在および方
向を確認する。ＬＥＵ２遺伝子はｐＦＢＹ７４のａｍｐ
Ｒと同一の方向である。
Ｐおよび連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４
リガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。こ
の連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌
ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、
ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上で
プレイティングする。３７℃において１６時間インキュ
ベーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＢ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩ−ＸｂａＩ二重消化を使用して
ミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在および方
向を確認する。ＬＥＵ２遺伝子はｐＦＢＹ７４のａｍｐ
Ｒと同一の方向である。
【００９８】実施例１１． ｐＦＢＹ７８の作製 ２μｇのｐＦＢＹ５をＨ緩衝液中でＳａｕＩで完全開裂
する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴ
ゲル上で分離する。１．１kbp バンドを切り出し、そし
てＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精
製する。ｐＦＢＹ４をＳｐｈＩで完全開裂し、一本鎖の
末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで欠失し、そして再連結
することによって、ｐＦＢＹ４のＳｐｈＩ部位を除去し
た誘導体であるプラスミドｐＦＢＹ７４Ｓｐを調製す
る。
する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴ
ゲル上で分離する。１．１kbp バンドを切り出し、そし
てＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精
製する。ｐＦＢＹ４をＳｐｈＩで完全開裂し、一本鎖の
末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで欠失し、そして再連結
することによって、ｐＦＢＹ４のＳｐｈＩ部位を除去し
た誘導体であるプラスミドｐＦＢＹ７４Ｓｐを調製す
る。
【００９９】２μｇのｐＦＢＹ４ＳｐをＨ緩衝液中でＳ
ａｕＩで完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液
中で５００ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間
除去して、ベクターの自己連結を防止する。この断片を
ＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。
３．９kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
ａｕＩで完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液
中で５００ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間
除去して、ベクターの自己連結を防止する。この断片を
ＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。
３．９kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
【０１００】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＳａ
ｌＩおよびＰｓｔＩ消化を使用してミニスクリーニング
して、正しい挿入部の存在および方向を確証する。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＳａ
ｌＩおよびＰｓｔＩ消化を使用してミニスクリーニング
して、正しい挿入部の存在および方向を確証する。
【０１０１】ＵＲＡ３およびＧＡＰＦＬｙＨＩＲ遺伝子
はｐＦＢＹ７８のａｍｐＲ遺伝子と同一方向で転写され
る。ｐＦＢＹ７８は便利に切除可能な２．３kbのＨｉｎ
ｄIII ／ＳａｃＩ断片上にＵＲＡ３およびＧＡＰＦＬｙ
ＨＩＲを含有する。
はｐＦＢＹ７８のａｍｐＲ遺伝子と同一方向で転写され
る。ｐＦＢＹ７８は便利に切除可能な２．３kbのＨｉｎ
ｄIII ／ＳａｃＩ断片上にＵＲＡ３およびＧＡＰＦＬｙ
ＨＩＲを含有する。
【０１０２】実施例１２． ｐＦＢＹ７９の作製 ２μｇのｐＦＢＹ７８をＣＡ緩衝液中でＨｉｎｄIII お
よびＳａｃＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。２．３kbp
バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロ
マトグラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつ
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在
下に３７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑末端化する。この酵素を６５℃におい
て１０分間加熱して不活性化する。
よびＳａｃＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。２．３kbp
バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロ
マトグラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつ
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在
下に３７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑末端化する。この酵素を６５℃におい
て１０分間加熱して不活性化する。
【０１０３】２μｇのｐＦＢＹ７４をＣＡ緩衝液中でＢ
ａｍＨＩにより完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ
緩衝液中で５００ユニットのＢＡＰで６５℃において３
０分間除去して、ベクターの自己連結を防止する。この
断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離す
る。１１．３kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡを
ＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
ａｍＨＩにより完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ
緩衝液中で５００ユニットのＢＡＰで６５℃において３
０分間除去して、ベクターの自己連結を防止する。この
断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離す
る。１１．３kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡを
ＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
【０１０４】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＢａ
ｍＨＩおよびＰａｔＩ消化を使用してミニスクリーニン
グして、正しい挿入部の存在および方向を確認する。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＢａ
ｍＨＩおよびＰａｔＩ消化を使用してミニスクリーニン
グして、正しい挿入部の存在および方向を確認する。
【０１０５】ｐＦＢＹ７９は崩壊性ベクターであり、こ
れはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）の中に形質転換するとき、組換えにより、選
択マーカーとしてのＬＥＵ２およびＵＲＡ３、並びにＧ
ＡＰＦＬｙＨＩＲ発現カセットを含有する、非対称的プ
ラスミドを生ずる。ｐＦＢＹ７９はａｍｐＲおよびＬＥ
Ｕ２遺伝子に対して反対方向に転写されるＵＲＡ３およ
びＧＡＰＦＬｙＨＩＲの遺伝子を含有する。
れはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）の中に形質転換するとき、組換えにより、選
択マーカーとしてのＬＥＵ２およびＵＲＡ３、並びにＧ
ＡＰＦＬｙＨＩＲ発現カセットを含有する、非対称的プ
ラスミドを生ずる。ｐＦＢＹ７９はａｍｐＲおよびＬＥ
Ｕ２遺伝子に対して反対方向に転写されるＵＲＡ３およ
びＧＡＰＦＬｙＨＩＲの遺伝子を含有する。
【０１０６】実施例１３． ｐＦＢＹ８７の作製 ２μｇのｐＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中でＢａｍＨＩで完全
開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬ
ＧＴゲル上で分離する。２．０kbp バンドを切り出し、
そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーによ
り精製する。２μｇのｐＴＺ１８ＲをＣＡ緩衝液中でＢ
ａｍＨＩにより完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。２．８kbp
のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤク
ロマトグラフィーにより精製する。
開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬ
ＧＴゲル上で分離する。２．０kbp バンドを切り出し、
そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーによ
り精製する。２μｇのｐＴＺ１８ＲをＣＡ緩衝液中でＢ
ａｍＨＩにより完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。２．８kbp
のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤク
ロマトグラフィーにより精製する。
【０１０７】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＨｉ
ｎｄIII およびＰａｔＩ ＸｂａＩ二重消化を使用して
ミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認す
る。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＨｉ
ｎｄIII およびＰａｔＩ ＸｂａＩ二重消化を使用して
ミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認す
る。
【０１０８】実施例１４． ｐＦＢＹ８７Ｂｇの作製 ２μｇのｐＦＢＹ８７をＣＡ緩衝液中でＸｂａＩおよび
ＮｓｉＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液
中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。３．３kbp バン
ドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマト
グラフィーにより精製する。
ＮｓｉＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液
中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。３．３kbp バン
ドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマト
グラフィーにより精製する。
【０１０９】２μｇのｐＦＢＹ８７をＣＡ緩衝液中でＮ
ｓｉＩおよびＨｉｎｄIII により完全開裂する。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離
する。０．３１kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡ
をＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰおよび連結緩
衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リガーゼにより
室温において３時間一緒に連結する。
ｓｉＩおよびＨｉｎｄIII により完全開裂する。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離
する。０．３１kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡ
をＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰおよび連結緩
衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リガーゼにより
室温において３時間一緒に連結する。
【０１１０】この連結混合物を使用して４０μｌのコン
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＨｉｎｄIII およびＸｂａＩ ＮｓｉＩ二
重消化を使用してミニスクリーニングして、正しい挿入
の存在を確認する。
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＨｉｎｄIII およびＸｂａＩ ＮｓｉＩ二
重消化を使用してミニスクリーニングして、正しい挿入
の存在を確認する。
【０１１１】実施例１５． ｐＦＢＹ８８Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ２４をＣＡ緩衝液中でＸｂａＩおよび
ＨｉｎｄIII で完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。０．３１kb
p バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤク
ロマトグラフィーにより精製する。
ＨｉｎｄIII で完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。０．３１kb
p バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤク
ロマトグラフィーにより精製する。
【０１１２】２μｇのｐＴＺ１９ＲをＣＡ緩衝液中でＸ
ｂａＩおよびＨｉｎｄIII により完全開裂する。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離
する。２．８kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡを
ＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。約
２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰおよび連結緩衝
液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リガーゼにより室
温において３時間一緒に連結する。
ｂａＩおよびＨｉｎｄIII により完全開裂する。これら
の断片をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離
する。２．８kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡを
ＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。約
２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰおよび連結緩衝
液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リガーゼにより室
温において３時間一緒に連結する。
【０１１３】この連結混合物を使用して４０μｌのコン
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ二重消化を使用し
てミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認
する。
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ二重消化を使用し
てミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認
する。
【０１１４】実施例１６． ｐＦＢＹ８８ＲＢｇの作製 クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８２（１９８５）４８８−４９２）の試
験管内変異誘発技術の変法により、ＢａｌII部位をプラ
スミドｐＦＢＹ８８Ｒの中に操作する。ｐＦＢＹ８８Ｒ
（１０ng）をＢＷ３１３（ｄｕｔ−ｕｎｇ−）に形質転
換し、そして２×ＹＴプレート＋アンピシリン上でプレ
イティングすることによって、ウラシルを含有する鋳型
を調製する。ウリジン５０ng／mlおよびアンピシリン２
５μｇ／mlを含有する１０mlの２×ＹＴ中に、単一のコ
ロニーを取り上げて入れ、そして３７℃において震盪し
ながら４時間増殖させる。２５ＬのＭ１３Ｋ０７（５×
１０ １０pfu ／ml）を添加し、そして培養物をさらに
１時間インキュベーションする。次いで、０．１mlのカ
ナマイシンを添加し、そして一夜インキュベーションす
る。一本鎖ＤＮＡをＭ１３についての通常の方法で上澄
み液から調製する。
ａｄ．Ｓｃｉ．８２（１９８５）４８８−４９２）の試
験管内変異誘発技術の変法により、ＢａｌII部位をプラ
スミドｐＦＢＹ８８Ｒの中に操作する。ｐＦＢＹ８８Ｒ
（１０ng）をＢＷ３１３（ｄｕｔ−ｕｎｇ−）に形質転
換し、そして２×ＹＴプレート＋アンピシリン上でプレ
イティングすることによって、ウラシルを含有する鋳型
を調製する。ウリジン５０ng／mlおよびアンピシリン２
５μｇ／mlを含有する１０mlの２×ＹＴ中に、単一のコ
ロニーを取り上げて入れ、そして３７℃において震盪し
ながら４時間増殖させる。２５ＬのＭ１３Ｋ０７（５×
１０ １０pfu ／ml）を添加し、そして培養物をさらに
１時間インキュベーションする。次いで、０．１mlのカ
ナマイシンを添加し、そして一夜インキュベーションす
る。一本鎖ＤＮＡをＭ１３についての通常の方法で上澄
み液から調製する。
【０１１５】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す配列の変異
原性プライマーを合成する。５pMのこのプライマーを、
１mMのＡＴＰを含有するリガーゼ緩衝液中で０．５ユニ
ットのＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼにより、３
７℃において３０分間インキュベーションすることによ
ってリン酸化する。この酵素を６５℃で１０分間インキ
ュベーションすることによって不活性化する。
原性プライマーを合成する。５pMのこのプライマーを、
１mMのＡＴＰを含有するリガーゼ緩衝液中で０．５ユニ
ットのＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼにより、３
７℃において３０分間インキュベーションすることによ
ってリン酸化する。この酵素を６５℃で１０分間インキ
ュベーションすることによって不活性化する。
【０１１６】０．５pMのＵ置換鋳型を５pMのリン酸化プ
ライマーとＨｉｎ緩衝液中で、６５℃において２分間イ
ンキュベーションし、そしてそれを室温にゆっくり冷却
することによってハイブリダイズせしめる。このハイブ
リダイズしたＤＮＡを、次の混合物、合計体積５０μｌ
のＤＴＴ＋１ユニットのＫｌｅｎｏｗおよび１ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼの中の６mMＤＴＴ，０．０５mM
ｄＡＴＰ，０．０５mM ｃＣＴＰ，０．０５mM ｄＴＴ
Ｐ，０．０５mM ｄＧＴＰ，１mM ＡＴＰ中で、３７℃
において３０分間インキュベーションし、次いで室温に
おいて３時間インキュベーションする。
ライマーとＨｉｎ緩衝液中で、６５℃において２分間イ
ンキュベーションし、そしてそれを室温にゆっくり冷却
することによってハイブリダイズせしめる。このハイブ
リダイズしたＤＮＡを、次の混合物、合計体積５０μｌ
のＤＴＴ＋１ユニットのＫｌｅｎｏｗおよび１ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼの中の６mMＤＴＴ，０．０５mM
ｄＡＴＰ，０．０５mM ｃＣＴＰ，０．０５mM ｄＴＴ
Ｐ，０．０５mM ｄＧＴＰ，１mM ＡＴＰ中で、３７℃
において３０分間インキュベーションし、次いで室温に
おいて３時間インキュベーションする。
【０１１７】この連結混合物を使用して４０μｌのコン
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＢｇｌII−ＨｉｎｄIII 二重消化を使用し
てミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認
する。ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片の全体の配列を、両
者の鎖から、逆プライマーおよび汎用プライマーを使用
してこの領域における他の突然変異を存在を除外して決
定する。正しい配列をもつプラスミドを取り上げ、そし
てｐＦＢＹ８８ＲＢｇと呼ぶ。
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＢｇｌII−ＨｉｎｄIII 二重消化を使用し
てミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認
する。ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片の全体の配列を、両
者の鎖から、逆プライマーおよび汎用プライマーを使用
してこの領域における他の突然変異を存在を除外して決
定する。正しい配列をもつプラスミドを取り上げ、そし
てｐＦＢＹ８８ＲＢｇと呼ぶ。
【０１１８】実施例１７． ｐＦＢＹ８９の作製 ｐＦＢＹ８９はｐＦＢＹ２に類似するが、ＦＲＴ−１部
位の右端における試験管内変異誘発により、図１（参
照、実施例８）に示す位置「１」に導入したＢａｍＨＩ
を有するｐＦＢＹ２の中に、ＢｇｌIIが導入されてる。
この部位の位置は図１に「２」で示す。この新しくつく
られた部位は、また、図１に示す位置「１」に導入した
前記ＢａｍＨＩ部位と組み合わせて使用して、さらに対
称的２ミクロン崩壊性ベクターをつくることができる。
位の右端における試験管内変異誘発により、図１（参
照、実施例８）に示す位置「１」に導入したＢａｍＨＩ
を有するｐＦＢＹ２の中に、ＢｇｌIIが導入されてる。
この部位の位置は図１に「２」で示す。この新しくつく
られた部位は、また、図１に示す位置「１」に導入した
前記ＢａｍＨＩ部位と組み合わせて使用して、さらに対
称的２ミクロン崩壊性ベクターをつくることができる。
【０１１９】２μｇのｐＦＢＹ２をＣＡ緩衝液中でＸｂ
ａＩおよびＥｃｏＲＩで完全開裂する。これらの断片を
ＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。
２．９kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。２μｇのｐ
ＦＢＹ２４をＣＡ緩衝液中でＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．
８％のＬＧＴゲル上で分離する。０．１８kbp バンドを
切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラ
フィーにより精製する。
ａＩおよびＥｃｏＲＩで完全開裂する。これらの断片を
ＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。
２．９kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。２μｇのｐ
ＦＢＹ２４をＣＡ緩衝液中でＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．
８％のＬＧＴゲル上で分離する。０．１８kbp バンドを
切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラ
フィーにより精製する。
【０１２０】２μｇのｐＦＢＹ２４をＣＡ緩衝液中でＢ
ａｍＨＩおよびＰｓｔＩで完全開裂する。これらの断片
をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。
４．３kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。２μｇのｐ
ＦＢＹ８７ＢｇをＣＡ緩衝液中でＰｓｔＩおよびＸｂａ
Ｉで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．
８％のＬＧＴゲル上で分離する。４．３kbp バンドを切
り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフ
ィーにより精製する。
ａｍＨＩおよびＰｓｔＩで完全開裂する。これらの断片
をＴＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。
４．３kbp バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔ
ｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。２μｇのｐ
ＦＢＹ８７ＢｇをＣＡ緩衝液中でＰｓｔＩおよびＸｂａ
Ｉで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中０．
８％のＬＧＴゲル上で分離する。４．３kbp バンドを切
り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグラフ
ィーにより精製する。
【０１２１】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＢａ
ｌIIおよびＥｃｏＲＩ ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ Ｐ
ｓｔＩの二重消化を使用してミニスクリーニングして、
正しい挿入の存在を確認する。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＢａ
ｌIIおよびＥｃｏＲＩ ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ Ｐ
ｓｔＩの二重消化を使用してミニスクリーニングして、
正しい挿入の存在を確認する。
【０１２２】ｐＦＢＹ８９は、直接反復ＦＲＴにより分
離されているｐＴＺ１８Ｒ及び２μの完全配列を伴うｐ
ＦＢＹ２とほとんど同一であるが、ただしｐＦＢＹ２４
と同様に、ｐＦＢＹ８９はＦＬＰ遺伝子の３′末端のＦ
ｓｐＩ部位に挿入されたＢａｍＨＩ部位を有する（図１
における位置「１」）。ｐＦＢＹ８９は、また、ＲＥＰ
Ｉ遺伝子の３′末端に挿入されたＢａｌII部位を有する
（図１において位置「２」）。
離されているｐＴＺ１８Ｒ及び２μの完全配列を伴うｐ
ＦＢＹ２とほとんど同一であるが、ただしｐＦＢＹ２４
と同様に、ｐＦＢＹ８９はＦＬＰ遺伝子の３′末端のＦ
ｓｐＩ部位に挿入されたＢａｍＨＩ部位を有する（図１
における位置「１」）。ｐＦＢＹ８９は、また、ＲＥＰ
Ｉ遺伝子の３′末端に挿入されたＢａｌII部位を有する
（図１において位置「２」）。
【０１２３】実施例１８． ｐＦＢＹ９４およびｐＦＢ
Ｙ９４Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ８９をＣＡ緩衝液中でＢａｌIIで完全
開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００ユ
ニットのＢＡＰにより６５℃において３０分間除去し
て、ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴ
ＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１
０．５kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
Ｙ９４Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ８９をＣＡ緩衝液中でＢａｌIIで完全
開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００ユ
ニットのＢＡＰにより６５℃において３０分間除去し
て、ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴ
ＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１
０．５kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
【０１２４】ＳａｌＩおよびＨｉｎｃIIの部位の間のポ
リリンカーをこれらの制限酵素で消化して除去し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端化し、そしてＧ
ＧＧＡＴＣＣＣの配列のＢａｍＨＩリンカーで平滑末端
を一緒に連結することによってｐＦＢＹ４Ｂを構成す
る。このプラスミドは、１．１kbp のＵＲＡ３含有Ｂａ
ｍＨＩ断片のための入手源として役立つ。
リリンカーをこれらの制限酵素で消化して除去し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端化し、そしてＧ
ＧＧＡＴＣＣＣの配列のＢａｍＨＩリンカーで平滑末端
を一緒に連結することによってｐＦＢＹ４Ｂを構成す
る。このプラスミドは、１．１kbp のＵＲＡ３含有Ｂａ
ｍＨＩ断片のための入手源として役立つ。
【０１２５】２μｇのｐＦＢＹ４ＢをＣＡ緩衝液中でＢ
ａｍＨＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液
中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バン
ドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマト
グラフィーにより精製する。約２０ngの調製した断片
を、１mMのＡＴＰおよび連結緩衝液の存在下に、０．５
ユニットのＴ４リガーゼにより室温において３時間一緒
に連結する。
ａｍＨＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液
中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バン
ドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマト
グラフィーにより精製する。約２０ngの調製した断片
を、１mMのＡＴＰおよび連結緩衝液の存在下に、０．５
ユニットのＴ４リガーゼにより室温において３時間一緒
に連結する。
【０１２６】この連結混合物を使用して４０μｌのコン
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＰｓｔＩおよびＳｍａＩ ＸｂａＩの二重
消化を使用してミニスクリーニングして、正しい挿入部
の存在を確認する。ＵＲＡ３遺伝子はｐＦＢＹ９４Ｒの
中のａｍｐＲと同一方向に、そしてｐＦＢＹ９４の中の
ａｍｐＲと反対方向に転写される。
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＰｓｔＩおよびＳｍａＩ ＸｂａＩの二重
消化を使用してミニスクリーニングして、正しい挿入部
の存在を確認する。ＵＲＡ３遺伝子はｐＦＢＹ９４Ｒの
中のａｍｐＲと同一方向に、そしてｐＦＢＹ９４の中の
ａｍｐＲと反対方向に転写される。
【０１２７】実施例１９． ｐＦＢＹ９５およびｐＦＢ
Ｙ９５Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ８９をＣＡ緩衝液中でＢａｍＨＩで完
全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００
ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去して、
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１０．５
kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄクロマトグラフィーにより精製する。
Ｙ９５Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ８９をＣＡ緩衝液中でＢａｍＨＩで完
全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００
ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去して、
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１０．５
kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄクロマトグラフィーにより精製する。
【０１２８】２μｇのｐＦＢＹ４ＢＡＭをＣＡ緩衝液中
でＢａｍＨＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp
バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロ
マトグラフィーにより精製する。約２０ngの調製した断
片を、１mMのＡＴＰおよび連結緩衝液の存在下に、０．
５ユニットのＴ４リガーゼにより室温において３時間一
緒に連結する。
でＢａｍＨＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩
衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp
バンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロ
マトグラフィーにより精製する。約２０ngの調製した断
片を、１mMのＡＴＰおよび連結緩衝液の存在下に、０．
５ユニットのＴ４リガーゼにより室温において３時間一
緒に連結する。
【０１２９】この結合混合物を使用して４０μｌのコン
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩの消化を使用し
てミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認
する。ＵＲＡ３遺伝子はｐＦＢＹ９５の中のａｍｐＲと
同一方向に、そしてｐＦＢＹ９５Ｒ中のａｍｐＲと反対
方向に転写される。
ピテント大腸菌ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換し、そして
アンピシリン、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２Ｙ
Ｔプレート上でプレイティングする。３７℃において１
６時間インキュベーションした後、白色コロニーを取り
上げ、そしてＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩの消化を使用し
てミニスクリーニングして、正しい挿入部の存在を確認
する。ＵＲＡ３遺伝子はｐＦＢＹ９５の中のａｍｐＲと
同一方向に、そしてｐＦＢＹ９５Ｒ中のａｍｐＲと反対
方向に転写される。
【０１３０】実施例２０． ｐＦＢＹ９６およびｐＦＢ
Ｙ９６Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４をＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで完
全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００
ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去して、
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１１．６
kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄクロマトグラフィーにより精製する。
Ｙ９６Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４をＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで完
全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００
ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去して、
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１１．６
kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄクロマトグラフィーにより精製する。
【０１３１】２μｇのｐＦＢＹ５をＣＡ緩衝液中でＳａ
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
【０１３２】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９６の中のａｍｐＲと
反対方向に、そしてｐＦＢＹ９６Ｒ中のａｍｐＲと同一
方向に転写される。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９６の中のａｍｐＲと
反対方向に、そしてｐＦＢＹ９６Ｒ中のａｍｐＲと同一
方向に転写される。
【０１３３】実施例２１． ｐＦＢＹ９７およびｐＦＢ
Ｙ９７Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４ＲをＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで
完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５０
０ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去し
て、ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴ
ＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１
１．６kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
Ｙ９７Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４ＲをＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで
完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５０
０ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去し
て、ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴ
ＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１
１．６kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
【０１３４】２μｇのｐＦＢＹ５をＣＡ緩衝液中でＳａ
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
【０１３５】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９７の中のａｍｐＲと
反対方向にそしてｐＦＢＹ９７Ｒ中のａｍｐＲと同一方
向に転写される。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９７の中のａｍｐＲと
反対方向にそしてｐＦＢＹ９７Ｒ中のａｍｐＲと同一方
向に転写される。
【０１３６】実施例２２． ｐＦＢＹ９８およびｐＦＢ
Ｙ９８Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４をＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで完
全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００
ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去して、
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１１．６
kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄクロマトグラフィーにより精製する。
Ｙ９８Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４をＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで完
全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５００
ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去して、
ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴＡＥ
緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１１．６
kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄクロマトグラフィーにより精製する。
【０１３７】２μｇのｐＦＢＹ５をＣＡ緩衝液中でＳａ
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
【０１３８】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９８の中のａｍｐＲと
反対方向に、そしてｐＦＢＹ９８Ｒ中のａｍｐＲと同一
方向に転写される。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９８の中のａｍｐＲと
反対方向に、そしてｐＦＢＹ９８Ｒ中のａｍｐＲと同一
方向に転写される。
【０１３９】実施例２３． ｐＦＢＹ９９およびｐＦＢ
Ｙ９９Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４ＲをＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで
完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５０
０ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去し
て、ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴ
ＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１
１．６kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
Ｙ９９Ｒの作製 ２μｇのｐＦＢＹ９４ＲをＣＡ緩衝液中でＳｎａＢＩで
完全開裂する。５′−リン酸基をＢＡＰ緩衝液中で５０
０ユニットのＢＡＰで６５℃において３０分間除去し
て、ベクターの自己連結を防止する。これらの断片をＴ
ＡＥ緩衝液中０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１
１．６kbp のバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕ
ｔｉｐＤクロマトグラフィーにより精製する。
【０１４０】２μｇのｐＦＢＹ５をＣＡ緩衝液中でＳａ
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
ｌＩで完全開裂する。これらの断片をＴＡＥ緩衝液中
０．８％のＬＧＴゲル上で分離する。１．１kbp バンド
を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐＤクロマトグ
ラフィーにより精製する。断片を０．０５mMずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に３
７℃において３０分間１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端化する。酵素を６５℃に１０分間加熱す
ることによって不活性化する。
【０１４１】約２０ngの調製した断片を、１mMのＡＴＰ
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９９の中のａｍｐＲと
反対方向に、そしてｐＦＢＹ９９Ｒ中のａｍｐＲと同一
方向に転写される。
および連結緩衝液の存在下に、０．５ユニットのＴ４リ
ガーゼにより室温において３時間一緒に連結する。この
連結混合物を使用して４０μｌのコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５αＦ′細胞を形質転換し、そしてアンピシリン、Ｘ
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する２ＹＴプレート上でプ
レイティングする。３７℃において１６時間インキュベ
ーションした後、白色コロニーを取り上げ、そしてＰｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩの消化を使用してミニスクリーニ
ングして、正しい挿入部の存在を確認する。ＧＡＰＦＬ
ｙＨＩＲ発現カセットはｐＦＢＹ９９の中のａｍｐＲと
反対方向に、そしてｐＦＢＹ９９Ｒ中のａｍｐＲと同一
方向に転写される。
【０１４２】ｐＦＢＹ９６，ｐＦＢＹ９６Ｒ，ｐＦＢＹ
９７，ｐＦＢＹ９７Ｒ，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９８
Ｒ，ｐＦＢＹ９９およびｐＦＢＹ９９Ｒは、対にグルー
プ化することができる組換えプラスミドによりサッカロ
ミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
中に形質転換されたとき、１組の崩壊性ベクターを形成
する。各対の両者のメンバーはほとんど正確に同一であ
り、ＦＲＴ部位を含有する１３６bpの配列の相対的位置
が単に異なるだけである。こうして、ｐＦＢＹ９６およ
びｐＦＢＹ９９は１つの対を形成し、ｐＦＢＹ９６は非
対称的でありそしてｐＦＢＹ９９は対称的である。同様
に、対称的ｐＦＢＹ９６Ｒは非対称的ｐＦＢＹ９９Ｒと
対を形成し、対称的ｐＦＢＹ９７は非対称的ｐＦＢＹ９
８と対を形成し、そして対称的ｐＦＢＹ９７Ｒは非対称
的ｐＦＢＹ９８Ｒと対を形成する。
９７，ｐＦＢＹ９７Ｒ，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９８
Ｒ，ｐＦＢＹ９９およびｐＦＢＹ９９Ｒは、対にグルー
プ化することができる組換えプラスミドによりサッカロ
ミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
中に形質転換されたとき、１組の崩壊性ベクターを形成
する。各対の両者のメンバーはほとんど正確に同一であ
り、ＦＲＴ部位を含有する１３６bpの配列の相対的位置
が単に異なるだけである。こうして、ｐＦＢＹ９６およ
びｐＦＢＹ９９は１つの対を形成し、ｐＦＢＹ９６は非
対称的でありそしてｐＦＢＹ９９は対称的である。同様
に、対称的ｐＦＢＹ９６Ｒは非対称的ｐＦＢＹ９９Ｒと
対を形成し、対称的ｐＦＢＹ９７は非対称的ｐＦＢＹ９
８と対を形成し、そして対称的ｐＦＢＹ９７Ｒは非対称
的ｐＦＢＹ９８Ｒと対を形成する。
【０１４３】実施例２４． サッカロミセス・セレビシ
アエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における対称的プラ
スミド対非対称的プラスミドの安定性の試験 すべての４つのｐＦＢＹ１２プラスミド、すべての８つ
のｐＦＢＹ１３プラスミド、およびすべてのｐＦＢＹ９
６，ｐＦＢＹ９７，ｐＦＢＹ９８およびｐＦＢＹ９９
を、補充されたＹＮＢ上でｌｅｕ２またはｕｒａ３の栄
養要求変異の補完について選択することによって、サッ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）株Ｈ４４９に形質転換する。
アエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における対称的プラ
スミド対非対称的プラスミドの安定性の試験 すべての４つのｐＦＢＹ１２プラスミド、すべての８つ
のｐＦＢＹ１３プラスミド、およびすべてのｐＦＢＹ９
６，ｐＦＢＹ９７，ｐＦＢＹ９８およびｐＦＢＹ９９
を、補充されたＹＮＢ上でｌｅｕ２またはｕｒａ３の栄
養要求変異の補完について選択することによって、サッ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）株Ｈ４４９に形質転換する。
【０１４４】少なくとも５つの独立のサッカロミセス・
セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換
体をＹＮＢ＋ロイシン上で単一のコロニーについてスト
リークアウトする。３０℃において２日後、各形質転換
体からの単一のコロニーを１０mlのチューブ中の２．５
mlのＹＤＰ（ＨＥ１６）の中に取り上げて入れ、そして
２００rpm および２０℃において２４時間増殖させる。
セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換
体をＹＮＢ＋ロイシン上で単一のコロニーについてスト
リークアウトする。３０℃において２日後、各形質転換
体からの単一のコロニーを１０mlのチューブ中の２．５
mlのＹＤＰ（ＨＥ１６）の中に取り上げて入れ、そして
２００rpm および２０℃において２４時間増殖させる。
【０１４５】細胞の数を光学密度から、又はヘモサイト
メーターで直接カウントすることによって推定し、そし
て各培養物をほぼ１０００コロニー／mlに希釈する。各
試料のアリコートを３つのＹＰＤプレート上にプレイテ
ィングする。３０℃において２日後、これらを濾紙を使
用して適当な補充したＹＮＢ＋ロイシン上にレプリカ
し、そして３０℃においてさらに２日間インキュベーシ
ョンした後、プラスミドを含有するコロニーの数および
プラスミドをもはや含有しないコロニーの数をカウント
する。
メーターで直接カウントすることによって推定し、そし
て各培養物をほぼ１０００コロニー／mlに希釈する。各
試料のアリコートを３つのＹＰＤプレート上にプレイテ
ィングする。３０℃において２日後、これらを濾紙を使
用して適当な補充したＹＮＢ＋ロイシン上にレプリカ
し、そして３０℃においてさらに２日間インキュベーシ
ョンした後、プラスミドを含有するコロニーの数および
プラスミドをもはや含有しないコロニーの数をカウント
する。
【０１４６】非選択的ＹＰＤ培地中で２４時間後にプラ
スミドを失う細胞の百分率として、プラスミドの安定性
を表す。ヒスチジンをすべてのＹＮＢ培地の中に含める
以外同一の方法で、サッカロミセス・セレビシアエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＢ１１０（ｌｅｕ２
ｕｒａ３ｈｉｓ４）を使用して、これらの実験を反復す
る。データを次の表に記載する。
スミドを失う細胞の百分率として、プラスミドの安定性
を表す。ヒスチジンをすべてのＹＮＢ培地の中に含める
以外同一の方法で、サッカロミセス・セレビシアエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＢ１１０（ｌｅｕ２
ｕｒａ３ｈｉｓ４）を使用して、これらの実験を反復す
る。データを次の表に記載する。
【０１４７】 表 １ 形質転換したサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞 の中の対称的および非対称的２ミクロン−様ハイブリッドベクターの安定性 プラスミド ｒ／ｌ プラスミドを含有する細胞％ Ｈ４４９ ＡＢ１１０ ｐＦＢＹ１２ １．１７ ｎｄ ３０ ｐＦＢＹ１２Ｐ ３．２８ ｎｄ ６３ ｐＦＢＹ１２Ｒ １．１７ ｎｄ ３．５ ｐＦＢＹ１２ＰＲ ３．２８ ｎｄ ６．３ ｐＦＢＹ１３ １．３１ ５．３ １５ ｐＦＢＹ１３Ｐ ３．６５ ５．８ ２８ ｐＦＢＹ１３Ｒ １．３１ ６．８ ２８ ｐＦＢＹ１３ＰＲ ３．６５ ｎｄ ４３ ｐＦＢＹ１３ｒｅｖ １．３１ １．８ ３ ｐＦＢＹ１３Ｐｒｅｖ ３．６５ ５．１ １１ ｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲ １．３１ １．８ ８ ｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲ ３．６５ ４．７ ３０ ｎｄは決定せずを意味する。
【０１４８】ｒ／ｌはプラスミドの２つの逆転反復ＦＲ
Ｔ部位の間の領域の長さの比である。表１におけるプラ
スミドは、ＸｂａＩの欠失の位置およびＦＲＴ部位にお
ける取り囲む領域のみが異なる対で配置される。異なる
プラスミドと異なる株との間の安定性のこの変更はこの
段階において完全には説明されず、そしてわれわれがこ
こにおいて観察するプラスミドの安定性は、自発的に極
めてまれに損失されるサッカロミセス・セレビシアエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然２ミクロンのプラ
スミドの安定性（１０-4／cl／ジェネレイション）と比
較して、非常にはすぐれない。
Ｔ部位の間の領域の長さの比である。表１におけるプラ
スミドは、ＸｂａＩの欠失の位置およびＦＲＴ部位にお
ける取り囲む領域のみが異なる対で配置される。異なる
プラスミドと異なる株との間の安定性のこの変更はこの
段階において完全には説明されず、そしてわれわれがこ
こにおいて観察するプラスミドの安定性は、自発的に極
めてまれに損失されるサッカロミセス・セレビシアエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然２ミクロンのプラ
スミドの安定性（１０-4／cl／ジェネレイション）と比
較して、非常にはすぐれない。
【０１４９】活性ＦＲＴの相対的位置においてのみ異な
りそれ以外は同一の２つのプラスミドを比較するとき、
より対称性の構成体は、広い範囲の絶対的安定性にわた
って、非対称のものより絶えず安定性であることが明ら
かである。ハイブリッドの２ミクロンのプラスミドのこ
の不安定性に影響を及ぼす１つの因子は、酵母プラスミ
ドの中の細菌性配列の存在である。これはＰＣＴ特許出
願ＷＯ８８／０８０２７において発表され、そして表２
に示す結果により確認される。
りそれ以外は同一の２つのプラスミドを比較するとき、
より対称性の構成体は、広い範囲の絶対的安定性にわた
って、非対称のものより絶えず安定性であることが明ら
かである。ハイブリッドの２ミクロンのプラスミドのこ
の不安定性に影響を及ぼす１つの因子は、酵母プラスミ
ドの中の細菌性配列の存在である。これはＰＣＴ特許出
願ＷＯ８８／０８０２７において発表され、そして表２
に示す結果により確認される。
【０１５０】 表２ プラスミド ｒ／ｌ プラスミドを含有するサッカロミセス・ セレビシアエ細胞（ＡＢ１００）％ ｐＦＢＹ８Ｒ ２．３１ ０．６ ｐＦＢＹ１２Ｒ １．１７ ３．５ ｐＦＢＹ１２ＰＲ ３．２８ ６．３ ｐＦＢＹ８Ｒは、すべての３つの活性ＦＲＴ部位を有
し、それゆえサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）の中で増殖するとき、細菌由来のｐ
ＴＺ１８Ｒ配列を欠失する以外、ｐＦＢＹ１２Ｒおよび
１２ＲＰＲと同一である。
し、それゆえサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）の中で増殖するとき、細菌由来のｐ
ＴＺ１８Ｒ配列を欠失する以外、ｐＦＢＹ１２Ｒおよび
１２ＲＰＲと同一である。
【０１５１】ｐＦＢＹ８ＲはｐＦＢＹ１２Ｒほど対称で
はないが、多分ｐＵＣ配列を含有するので、より安定性
である。すべてのこれらのプラスミドの細菌性配列のフ
リッピングおよび欠失は、これらの形質転換体から抽出
されたサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリ
ダイゼーションにより確認される。
はないが、多分ｐＵＣ配列を含有するので、より安定性
である。すべてのこれらのプラスミドの細菌性配列のフ
リッピングおよび欠失は、これらの形質転換体から抽出
されたサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリ
ダイゼーションにより確認される。
【０１５２】対称的でありかつｐＵＣを欠くベクターの
安定性を評価するために、１組のプラスミドｐＦＢＹ９
６，ｐＦＢＹ９７，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９９および
それらのＲ誘導体を作製する。これらをサッカロミセス
・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ４４９
に形質転換し、そしてそれらの安定性を比較する。結果
を表３に示す。
安定性を評価するために、１組のプラスミドｐＦＢＹ９
６，ｐＦＢＹ９７，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９９および
それらのＲ誘導体を作製する。これらをサッカロミセス
・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ４４９
に形質転換し、そしてそれらの安定性を比較する。結果
を表３に示す。
【０１５３】表３におけるプラスミドは、１３６bpのＦ
ＲＴ部位の位置のみが異なる対で配置される。再び、よ
り対称的なプラスミドは対応する非対称的誘導体より安
定性であることが明らかである。 表３ プラスミド ｒ／ｌ プラスミドの喪失％ ｐＦＢＹ９６ １．０２ ３．２ ｐＦＢＹ９９ １．８ １．３ ｐＦＢＹ９６Ｒ １．０２ １０．２ ｐＦＢＹ９９Ｒ １．８ ２．９ ｐＦＢＹ９７ １．０２ ２．９ ｐＦＢＹ９８ １．８ ０．７ ｐＦＢＹ９７Ｒ １．０２ ７．３ ｐＦＢＹ９８Ｒ １．８ １．８
ＲＴ部位の位置のみが異なる対で配置される。再び、よ
り対称的なプラスミドは対応する非対称的誘導体より安
定性であることが明らかである。 表３ プラスミド ｒ／ｌ プラスミドの喪失％ ｐＦＢＹ９６ １．０２ ３．２ ｐＦＢＹ９９ １．８ １．３ ｐＦＢＹ９６Ｒ １．０２ １０．２ ｐＦＢＹ９９Ｒ １．８ ２．９ ｐＦＢＹ９７ １．０２ ２．９ ｐＦＢＹ９８ １．８ ０．７ ｐＦＢＹ９７Ｒ １．０２ ７．３ ｐＦＢＹ９８Ｒ １．８ １．８
【０１５４】実施例２５． ヒルジンの対称プラスミド
からの生産 異種タンパク質の産生のためのベクターとしてこれらの
ベクターの有用性を評価するために、ｐＦＢＹ２７およ
びｐＦＢＹ２７Ｒ、並びにｐＦＢＹ７９およびｐＦＢＹ
７９Ｒを作製する。
からの生産 異種タンパク質の産生のためのベクターとしてこれらの
ベクターの有用性を評価するために、ｐＦＢＹ２７およ
びｐＦＢＹ２７Ｒ、並びにｐＦＢＹ７９およびｐＦＢＹ
７９Ｒを作製する。
【０１５５】ｐＦＢＹ２７およびｐＦＢＹ２７Ｒは、Ｕ
ＲＡ３マーカー、およびＵＲＡ３と同一大きさのヒルジ
ン発現カセットを含有して、１．０２のｒ／ｌ比を与え
る。非選択的培地中で２４時間増殖させることによっ
て、Ｈ４４９中で安定性について評価すると、プラスミ
ド不含細胞の百分率は０．５％より小さい。ｐＦＢＹ７
９及びｐＦＢＹ７９Ｒは、プラスミドの半分に２kbのＬ
ＥＵ２挿入部および他方にヒルジンの発現カセットを含
有して、０．８７のｒ／ｌ比、およびＨ４４９中で０．
２％のプラスミドの損失の２４時間の安定性を与える。
ＲＡ３マーカー、およびＵＲＡ３と同一大きさのヒルジ
ン発現カセットを含有して、１．０２のｒ／ｌ比を与え
る。非選択的培地中で２４時間増殖させることによっ
て、Ｈ４４９中で安定性について評価すると、プラスミ
ド不含細胞の百分率は０．５％より小さい。ｐＦＢＹ７
９及びｐＦＢＹ７９Ｒは、プラスミドの半分に２kbのＬ
ＥＵ２挿入部および他方にヒルジンの発現カセットを含
有して、０．８７のｒ／ｌ比、およびＨ４４９中で０．
２％のプラスミドの損失の２４時間の安定性を与える。
【０１５６】Ｈ４４９に形質転換したこれらのプラスミ
ドを震盪フラスコ中で増殖させ、そしてヒルジンについ
てアッセイする。形質転換体をＹＮＢ＋グルコース＋ロ
イシンの固体培地上で単一のコロニーについてストリー
キングする。単一のコロニーを２５０mlのフラスコの中
の５０mlの最小培地（８．４ｇのＬ Ｄｉｃｏイースト
・ニトロゲン・ベース、アミノ酸不含、１０ｇのＬ−ア
スパラギン、１ｇのＬ−ヒスチジン、４０mg／ｌのＬ−
ロイシン、２％のグルコース）の中に接種し、そして１
８０rpm および３０℃において７０時間増殖させる。試
料をアッセイのために取り出す。次いで、培養物をＹＰ
Ｄ中に１：１０に希釈し、そして１８０rpm および３０
℃においてさらにインキュベーションする。試料を２４
時間毎に取り出す。３０００ｇで５分間遠心することに
よって上澄み液を試料から取り、そしてアッセイに直接
使用する。
ドを震盪フラスコ中で増殖させ、そしてヒルジンについ
てアッセイする。形質転換体をＹＮＢ＋グルコース＋ロ
イシンの固体培地上で単一のコロニーについてストリー
キングする。単一のコロニーを２５０mlのフラスコの中
の５０mlの最小培地（８．４ｇのＬ Ｄｉｃｏイースト
・ニトロゲン・ベース、アミノ酸不含、１０ｇのＬ−ア
スパラギン、１ｇのＬ−ヒスチジン、４０mg／ｌのＬ−
ロイシン、２％のグルコース）の中に接種し、そして１
８０rpm および３０℃において７０時間増殖させる。試
料をアッセイのために取り出す。次いで、培養物をＹＰ
Ｄ中に１：１０に希釈し、そして１８０rpm および３０
℃においてさらにインキュベーションする。試料を２４
時間毎に取り出す。３０００ｇで５分間遠心することに
よって上澄み液を試料から取り、そしてアッセイに直接
使用する。
【０１５７】ヒルジンをトロンビンのその濃度依存性阻
害によりアッセイする。トロンビンの活性を発色性ペプ
チド基質であるトシル−グリシル−ポリル−アルギニン
−４−ニトロアニリドアセテート（Ｃｈｒｏｍｚｙｍ
ＴＨ、ドイツ国ベーリンガーマンハイム）からのｐ−ニ
トロ−アニリンの解放により追跡する。使用した緩衝液
は０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０１％のウシ血清アルブミンである。すべ
てのアッセイはマイクロタイタープレート中で実施す
る。各ウェルは５０μｌのヒトトロンビン（Ｎｏｖａｂ
ｉｏｃｈｅｍ、スイス国レーフェルフィンゲン）を含有
する。反応は１５０μｌの基質（３３３μｇ／ml）の添
加により開始する。
害によりアッセイする。トロンビンの活性を発色性ペプ
チド基質であるトシル−グリシル−ポリル−アルギニン
−４−ニトロアニリドアセテート（Ｃｈｒｏｍｚｙｍ
ＴＨ、ドイツ国ベーリンガーマンハイム）からのｐ−ニ
トロ−アニリンの解放により追跡する。使用した緩衝液
は０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０１％のウシ血清アルブミンである。すべ
てのアッセイはマイクロタイタープレート中で実施す
る。各ウェルは５０μｌのヒトトロンビン（Ｎｏｖａｂ
ｉｏｃｈｅｍ、スイス国レーフェルフィンゲン）を含有
する。反応は１５０μｌの基質（３３３μｇ／ml）の添
加により開始する。
【０１５８】プレートを３７℃において２時間インキュ
ベーションし、そして光学密度をダイナテク（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ）ＭＲ６００マイクロタイタープレートのリー
ダーにより４０５nmにおいて読む。トロンビンは非阻害
対照ウェル中で０．８ＯＤ40 5 に到達する濃度で使用す
る。すべての光学密度は、インキュベーションの開始前
に決定したＯＤ405 について補正する。未知のヒルジン
濃度は、６つのヒルジン濃度で得られた標準曲線から計
算する。すべての測定は少なくとも二重反復試験におい
て実施する。アッセイは試料のアッセイ前に１００倍の
希釈を可能とするために十分に感受性である。
ベーションし、そして光学密度をダイナテク（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ）ＭＲ６００マイクロタイタープレートのリー
ダーにより４０５nmにおいて読む。トロンビンは非阻害
対照ウェル中で０．８ＯＤ40 5 に到達する濃度で使用す
る。すべての光学密度は、インキュベーションの開始前
に決定したＯＤ405 について補正する。未知のヒルジン
濃度は、６つのヒルジン濃度で得られた標準曲線から計
算する。すべての測定は少なくとも二重反復試験におい
て実施する。アッセイは試料のアッセイ前に１００倍の
希釈を可能とするために十分に感受性である。
【０１５９】結果が明瞭に示すように、対称的プラスミ
ドは安定性であるばかりでなく、かつまた対応する非対
称的プラスミドより２５％まで多くのヒルジンを産生す
る。実施例２６． ＩＧＦ−Ｉの対称プラスミドからの生産 これらのより安定な対称的プラスミドを使用するＩＧＦ
−Ｉの発現のために、ｐＦＢＹ６６およびｐＦＢＹ６６
Ｒ、並びにｐＦＢＹ７９ＩＧＦおよびｐＦＢＹ７９ＩＧ
ＦＲを作製する。これらのプラスミドは対称的であり、
そしてサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）中で増殖したとき、細菌由来のｐＵＣ配列
を含有しないように設計される。
ドは安定性であるばかりでなく、かつまた対応する非対
称的プラスミドより２５％まで多くのヒルジンを産生す
る。実施例２６． ＩＧＦ−Ｉの対称プラスミドからの生産 これらのより安定な対称的プラスミドを使用するＩＧＦ
−Ｉの発現のために、ｐＦＢＹ６６およびｐＦＢＹ６６
Ｒ、並びにｐＦＢＹ７９ＩＧＦおよびｐＦＢＹ７９ＩＧ
ＦＲを作製する。これらのプラスミドは対称的であり、
そしてサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）中で増殖したとき、細菌由来のｐＵＣ配列
を含有しないように設計される。
【０１６０】ｐＦＢＹ６６およびｐＦＢＹ６６Ｒは、Ｕ
ＲＡ３マーカー、およびＵＲＡ３と同一の大きさのＩＧ
Ｆ−Ｉ発現カセットを含有して、１．１５のｒ／ｌ比を
与える。非選択的培地中で増殖させることによってＡＢ
１１０の中の安定性をアッセイするとき、プラスミドを
含有しない細胞の百分率は、ｐＦＢＹ６６について３．
６％およびｐＦＢＹ６６Ｒについて０．６％であり、こ
れに対して同一株における非対称的プラスミドｐＤＰ３
４Ａ−ＧＡＰＤＨ−ＡＦＬ−ＩＧＦ１−ＡＦＴについて
は３７％である。
ＲＡ３マーカー、およびＵＲＡ３と同一の大きさのＩＧ
Ｆ−Ｉ発現カセットを含有して、１．１５のｒ／ｌ比を
与える。非選択的培地中で増殖させることによってＡＢ
１１０の中の安定性をアッセイするとき、プラスミドを
含有しない細胞の百分率は、ｐＦＢＹ６６について３．
６％およびｐＦＢＹ６６Ｒについて０．６％であり、こ
れに対して同一株における非対称的プラスミドｐＤＰ３
４Ａ−ＧＡＰＤＨ−ＡＦＬ−ＩＧＦ１−ＡＦＴについて
は３７％である。
【０１６１】ＡＢ１１０に形質転換したこれらのプラス
ミドを震盪フラスコの中で標準条件下に増殖させ、そし
てＩＧＦ−Ｉについてアッセイする。６．５ｇ／ｌの酵
母エキス、４．５ｇ／ｌのカサミノ酸および３０ｇ／ｌ
のグルコースを含有する富化培地を、非選択的前培養培
地として使用する。主培養は、３０ｇ／Ｌのグルコー
ス、８．５ｇ／Ｌのカサミノ酸および要求されるアミノ
酸を補充した１．７ｇ／Ｌのイースト・ニトロゲン・ベ
ースを含有するウラシル選択的培地中で実施する。通
常、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）細胞を、２８℃および１８０rpm において、
前培地および主培地中で５０mlの体積で７２時間までの
間増殖させる。
ミドを震盪フラスコの中で標準条件下に増殖させ、そし
てＩＧＦ−Ｉについてアッセイする。６．５ｇ／ｌの酵
母エキス、４．５ｇ／ｌのカサミノ酸および３０ｇ／ｌ
のグルコースを含有する富化培地を、非選択的前培養培
地として使用する。主培養は、３０ｇ／Ｌのグルコー
ス、８．５ｇ／Ｌのカサミノ酸および要求されるアミノ
酸を補充した１．７ｇ／Ｌのイースト・ニトロゲン・ベ
ースを含有するウラシル選択的培地中で実施する。通
常、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）細胞を、２８℃および１８０rpm において、
前培地および主培地中で５０mlの体積で７２時間までの
間増殖させる。
【０１６２】培地の中のＩＧＦ−Ｉの濃度は、逆相ＨＰ
ＬＣにより決定する。サッカロミセス・セレビシアエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）培養物の１０mlの試料を
３０００ｇにおいて５分間遠心する。上澄み液を取り出
し、そして１５％のＨ2 ＳＯ4 でpH３．０に調節する。
５０μｌのこの調節した培地をＣ18カラム（Ｎｃｕｌｅ
ｏｓｉｌ Ｃ18、４×１２０mm、３０mm、球形５μｍ、
Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ドイツ国デューレン）
のＨＰＬＣにより分離する。溶離は室温において緩衝液
Ａ（０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸）および緩衝液
Ｂ（０．０７５％のトリフルオロ酢酸を含有する８０％
ｖ／ｖアセトニトリルおよび２０％の緩衝液Ａ）の直線
の勾配を使用して実施する。緩衝液Ｂの含量は１分で１
０％から３１％に増加し、１．５ml／分の流速で８分間
平等に保持する。溶離液を紫外線により２１４nmでモニ
ターする。ＩＧＦ−Ｉの含量は、タンパク質のピークを
既知の標準試料のピーク面積と比較することによって計
算する。
ＬＣにより決定する。サッカロミセス・セレビシアエ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）培養物の１０mlの試料を
３０００ｇにおいて５分間遠心する。上澄み液を取り出
し、そして１５％のＨ2 ＳＯ4 でpH３．０に調節する。
５０μｌのこの調節した培地をＣ18カラム（Ｎｃｕｌｅ
ｏｓｉｌ Ｃ18、４×１２０mm、３０mm、球形５μｍ、
Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ドイツ国デューレン）
のＨＰＬＣにより分離する。溶離は室温において緩衝液
Ａ（０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸）および緩衝液
Ｂ（０．０７５％のトリフルオロ酢酸を含有する８０％
ｖ／ｖアセトニトリルおよび２０％の緩衝液Ａ）の直線
の勾配を使用して実施する。緩衝液Ｂの含量は１分で１
０％から３１％に増加し、１．５ml／分の流速で８分間
平等に保持する。溶離液を紫外線により２１４nmでモニ
ターする。ＩＧＦ−Ｉの含量は、タンパク質のピークを
既知の標準試料のピーク面積と比較することによって計
算する。
【０１６３】対称な安定なプラスミドｐＦＢＹ６６およ
び６６Ｒは、対応する非対称プラスミドより２倍多くの
ＩＧＦ−Ｉを産生する。微生物の寄託 次のプラスミドをもつＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ′は、
ブダベスト条約の規定に従い、１９９０年１２月１４日
にドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニスメ
ン・ウント・ゼルクツレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ
ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（Ｍａｓｃｈｅｒ
ｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｉｅｇ）に寄託された：プラスミド 寄託番号 ｐＦＢＹ２ ＤＳＭ６２７１ ｐＦＢＹ４ ＤＳＭ６２７２ ｐＦＢＹ５ ＤＳＭ６２７３ ｐＦＢＹ７ ＤＳＭ６２７４ ｐＦＢＹ２９ ＤＳＭ６２７５ ｐＦＢＹ６５ ＤＳＭ６２７６
び６６Ｒは、対応する非対称プラスミドより２倍多くの
ＩＧＦ−Ｉを産生する。微生物の寄託 次のプラスミドをもつＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ′は、
ブダベスト条約の規定に従い、１９９０年１２月１４日
にドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニスメ
ン・ウント・ゼルクツレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ
ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（Ｍａｓｃｈｅｒ
ｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｉｅｇ）に寄託された：プラスミド 寄託番号 ｐＦＢＹ２ ＤＳＭ６２７１ ｐＦＢＹ４ ＤＳＭ６２７２ ｐＦＢＹ５ ＤＳＭ６２７３ ｐＦＢＹ７ ＤＳＭ６２７４ ｐＦＢＹ２９ ＤＳＭ６２７５ ｐＦＢＹ６５ ＤＳＭ６２７６
【０１６４】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４１ 配列の種類：ＤＮＡ トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 特徴：プラスミドｐＦＢＹ８８ＲにＢｇｌII部位を挿入
するための変異原ＰＣＲプライマー 配列 GGTTTTTTGA AAGTGCGAGA TCTTCTTCAG AGCGCTTTTG G 41
するための変異原ＰＣＲプライマー 配列 GGTTTTTTGA AAGTGCGAGA TCTTCTTCAG AGCGCTTTTG G 41
【図１】図１は崩壊性プラスミドｐＦＢＹ２の物理的地
図を示す。
図を示す。
【図２】図２は崩壊性プラスミドｐＦＢＹ２のＦＲＴ部
位すなわちＦＲＴ−１及びＦＲＴ−２間のインビトロ又
はインビボ組換えから生ずるプラスミドを示す。
位すなわちＦＲＴ−１及びＦＲＴ−２間のインビトロ又
はインビボ組換えから生ずるプラスミドを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (31)
- 【請求項１】 環形の逆方向に反復するＦＲＴ領域間の
２つの領域がおよそ同じ長さを有する、酵母２ミクロン
−様プラスミド誘導体。 - 【請求項２】 Ｓ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）２ミクロンプラスミドに由来する、請求項１に
記載の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項３】 対称的２ミクロン−様ハイブリドベクタ
ーである、請求項１に記載の酵母２ミクロン−様プラス
ミド誘導体。 - 【請求項４】 細菌性ＤＮＡ配列を含有しない、請求項
３に記載の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項５】 それにより形質転換された酵母細胞中で
対称的２ミクロン−様ハイブリドベクターを生じさせる
２ミクロン−様崩壊性ベクターである、請求項１に記載
の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項６】 チゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）からの
プラスミドｐＳＢ１もしくはｐＳＢ２、Ｚ．ルーキシー
（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）からのプラスミドｐＳＲ２、Ｚ．
ビスポルス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）からのプラスミド
ｐＳＢ３、Ｚ．フェルメンタニ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｎｉ）からのプラスミドｐＳＭ１、クルイベロミセス・
ドロソフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）からのプラスミドｐＫＤ１、
又はＳ．セレビシエーからの２ミクロンプラスミドに由
来する、請求項１に記載の酵母２ミクロン−様プラスミ
ド誘導体。 - 【請求項７】 Ｓ．セレビシエーの２ミクロンプラスミ
ドに由来する、請求の範囲第１項に記載の酵母２ミクロ
ン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項８】 ２個の逆方向に反復するＦＲＴ部位間に
位置する領域が約１：１〜約５：４の比率を有する、請
求項１に記載の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項９】 大きい方の領域が小さい方の領域より約
２０％以下大きい、請求項１に記載の酵母２ミクロン−
様プラスミド誘導体。 - 【請求項１０】 大きい方の領域が小さい方の領域より
約１５％以下大きい、請求項９に記載の酵母２ミクロン
−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１１】 大きい方の領域が小さい方の領域より
約１０％以下大きい、請求項１０に記載の酵母２ミクロ
ン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１２】 大きい方の領域が小さい方の領域より
約５％以下大きい、請求項１１に記載の酵母２ミクロン
−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１３】 ウイルス、原核細胞又は真核細胞に由
来する異種性構造遺伝子を含んで成る、請求項１に記載
の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１４】 前記構造遺伝子が、栄養素の生産のた
め又は化学における酵素反応を行うために使用され得る
酵素、あるいは栄養素として、又はヒトもしくは動物の
疾患の治療のため又はその予防のために有用であり且つ
価値があるポリペプチド、例えばホルモン、免疫調節
性、抗−ウイルス性又は抗−腫瘍性を有するポリペプチ
ド、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、食料等
をコードしている、請求項１３に記載の酵母２ミクロン
−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１５】 前記構造遺伝子がヒトα−インターフ
ェロンもしくはハイブリドインターフェロン、ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウイ
ルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュリン−様成長
因子Ｉ及びII、エグリンＣ又はデスルファトヒルジン、
例えば変形体ＨＶ１をコードしている、請求項１４に記
載の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１６】 前記構造遺伝子がハイブリドインター
フェロンＢＤＢＢをコードしている、請求項１５に記載
の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１７】 前記構造遺伝子がデスルファトヒルジ
ンをコードしている、請求項１５に記載の酵母２ミクロ
ン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１８】 ｐＦＢＹ１２，ｐＦＢＹ１２Ｒ，ｐＦ
ＢＹ１３，ｐＦＢＹ１３Ｒ，ｐＦＢＹ１３ｒｅｖ、及び
ｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲから成る群から選択された、請求
項１に記載の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体。 - 【請求項１９】 ｐＦＢＹ２７，ｐＦＢＹ２７Ｒ，ｐＦ
ＢＹ２７ｒｅｖ，ｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲ，ｐＦＢＹ６
６，ｐＦＢＹ６６Ｒ，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９８Ｒ，
ｐＦＢＹ９９及びｐＦＢＹ９９Ｒから成る群から選択さ
れた、請求項１に記載の酵母２ミクロン−様プラスミド
誘導体。 - 【請求項２０】 常用の化学的もしくは生物学的インビ
トロ合成法又は組換えＤＮＡ技法を用いて、請求項１に
記載の酵母２ミクロン−様プラスミド誘導体を製造する
方法。 - 【請求項２１】 常用の組換えＤＮＡ技法を用いる、請
求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 （ａ）常法を用いての適当なＤＮＡ断
片のインビトロ連結、 （ｂ）段階（ａ）で得られた連結混合物による適当な宿
主の形質転換、 （ｃ）常法による陽性形質転換体の選択、 （ｄ）段階（ｃ）において選択された陽性形質転換体の
増加、及び （ｅ）常法によるベクターの単離、 の段階を含んで成る、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 請求項１に記載の酵母２ミクロン−様
プラスミド誘導体により形質転換された宿主。 - 【請求項２４】 ｐＦＢＹ２７，ｐＦＢＹ２７Ｒ，ｐＦ
ＢＹ２７ｒｅｖ，ｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲ，ｐＦＢＹ６
６，ｐＦＢＹ６６Ｒ，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９８Ｒ，
ｐＦＢＹ９９又はｐＦＢＹ９９Ｒにより形質転換された
大腸菌から成る宿主群から選択された、請求項２３に記
載の形質転換された宿主。 - 【請求項２５】 ｐＦＢＹ２７，ｐＦＢＹ２７Ｒ，ｐＦ
ＢＹ２７ｒｅｖ，ｐＦＢＹ２７ｒｅｖＲ，ｐＦＢＹ６
６，ｐＦＢＹ６６Ｒ，ｐＦＢＹ９８，ｐＦＢＹ９８Ｒ，
ｐＦＢＹ９９，ｐＦＢＹ９９Ｒ，ｐＦＢＹ１２，ｐＦＢ
Ｙ１２Ｒ，ｐＦＢＹ１３，ｐＦＢＹ１３Ｒ，ｐＦＢＹ１
３ｒｅｖ又はｐＦＢＹ１３ｒｅｖＲにより形質転換され
たＳ．セレビシエーから成る群から選択された、請求項
２３に記載の形質転換された宿主。 - 【請求項２６】 （ａ）適当な宿主を形質転換し、そし
て （ｂ）場合によっては選択条件の存在下で前記形質転換
された宿主を栄養培地中で培養する、 段階を含んで成る、請求項２３に記載の形質転換された
宿主の製造方法。 - 【請求項２７】 酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプ
チドの製造方法であって、 （ａ）酵母で機能するプロモーター、酵母で機能するシ
グナルペプチドをコードするシグナル配列、酵母ポリペ
プチド又は非酵母ポリペプチドをコードする構造遺伝
子、及び場合によっては酵母で機能するターミネーター
から成る発現カセットを含有する対称的２ミクロン−様
ハイブリドベクターにより形質転換された酵母株を培養
し、そして （ｂ）常法により前記ポリペプチドを単離する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項２８】 前記形質転換された宿主を回分培養に
おいて培養する、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 前記形質転換された宿主を連続培養に
おいて培養する、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項３０】 ＧＡＰＤＨプロモーター、α−ファク
ターシグナル配列及びα−ファクターターミネーターの
制御のもとに、Ｓ．セレビシエーにおいてヒルジンが生
産される、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項３１】 ＧＡＰＤＨプロモーター、α−ファク
ターシグナル配列及びα−ファクターターミネーターの
制御のもとに、Ｓ．セレビシエーによりＩＧＦ−Ｉが生
産される、請求項２７に記載の方法。
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