JPH08173149A - ５−アミノレブリン酸生産微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 低濃度の５−アミノレブリン酸デヒドラター
ゼ阻害剤を添加するのみで、著量の５−アミノレブリン
酸を生産することのできる微生物を提供する。 【構成】 ５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤
に対する阻害物質定数が減少した５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ変異酵素を有する５−アミノレブリン酸
生産微生物、この特徴に加え、５−アミノレブリン酸に
対するミカエリス定数が増加した５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ変異酵素を有する５−アミノレブリン酸
生産微生物。光合成細菌であって、非光照射下で５−ア
ミノレブリン酸を生産することができる５−アミノレブ
リン酸生産微生物。工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ Ｐ−１４６７２として寄託されている上記
の５−アミノレブリン酸生産微生物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、５−アミノレブリン酸
を高濃度で蓄積することのできる微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】５−
アミノレブリン酸は、テトラピロール化合物の前駆体と
して広く生物圏に存在し、生体中で重要な役割を果たし
ている化合物である。

【０００３】５−アミノレブリン酸は、除草剤、殺虫
剤、植物成長調節剤、植物の光合成増強剤として優れた
効果を示し、しかも人畜に対して毒性を示さず、分解性
が高いため環境への残留性もないなど優れた性質を示す
天然化合物である（特開昭６１−５０２８１４号、特開
平２−１３８２０１号公報など参照）。

【０００４】しかし、５−アミノレブリン酸は、生産コ
ストが高く、除草剤、殺虫剤、植物成長調節剤、植物の
光合成増強剤として使用するには実用性に欠ける（Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２９，１９
８４）。

【０００５】このような現状において、多くの化学合成
法が検討されている（例えば、特開平２−７６８４１公
報参照）が、未だ十分な方法は開発されていない。

【０００６】一方、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎ
ａ属などの微生物を用いた５−アミノレブリン酸の製造
方法も検討されている。

【０００７】しかし、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔ
ｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属（特開平５−１８４３７６な
ど参照）などを用いる方法では生産量が非常に低く、満
足できるものではない。

【０００８】また、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎ
ａ属などの微生物により５−アミノレブリン酸を生産さ
せる際に用いられる方法として、（微生物により生産さ
れる５−アミノレブリン酸が生体中において５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼにより代謝されるのを防ぐべ
く、）５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤（例
えば、レブリン酸や４，６−ジオキソヘプタン酸など）
を添加する方法も開発されている（特開平６−２７７０
８１号公報参照）。ただし、この方法では、生産される
５−アミノレブリン酸の３倍、あるいは５００倍以上も
の大量の阻害剤の添加が必要な場合がある。

【０００９】５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害
剤の大量使用は、微生物の生育や機能を著しく阻害する
他に、生産コストの高騰や精製分離の困難などを招来す
ることが懸念される。

【００１０】そこで、５−アミノレブリン酸の生産のた
めに必要な５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤
をできるだけ減少することができる方法の開発が切望さ
れている。

【００１１】また、５−アミノレブリン酸を増産するた
めに、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼによる５−
アミノレブリン酸の代謝をできるだけ抑制することがで
きる条件下であって、しかも微生物の生育や機能をでき
るだけ阻害しないために、エネルギー獲得に必要なテト
ラピロール化合物の使用量を少量とすることができる条
件下において、十分な生育ができ、かつこのような条件
下において十分な５−アミノレブリン酸合成活性を保つ
ことのできる微生物を見出すことが望まれる。

【００１２】特に、上記のような微生物が光合成細菌で
ある場合には、上記のことは、テトラピロール化合物を
原料とするバクテリオクロロフィルなどの集光色素を必
要とする光照射条件下ではなく、光照射を必要としない
（従属栄養）条件下において、十分な生育ができ、かつ
このような条件下で、十分な５−アミノレブリン酸合成
活性を有するということを意味し、工業上有益であるこ
とは言うまでもない。

【００１３】本発明は、以上の諸点を考慮し、低濃度の
５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤を添加する
のみで、著量の５−アミノレブリン酸を生産することの
できる微生物を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために研究を重ねた結果、先ず、（１）阻害
物質に対する阻害物質定数が減少した５−アミノレブリ
ン酸デヒドラターゼ変異酵素を有する微生物、更にはこ
の特徴に加え、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの
５−アミノレブリン酸に対するミカエリス定数が増大し
た５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ変異酵素を有す
る微生物を用いる方法が有効であるとの知見を得、この
ような微生物を変異育種により作出することに成功し
た。

【００１５】次いで、（２）光合成細菌は、バクテリオ
クロロフィルを多量に有しているため、その前駆物質で
ある５−アミノレブリン酸の合成能が強い。したがっ
て、このような微生物を変異処理して、前記したように
テトラピロール化合物が少量でも生育できる微生物とす
れば、５−アミノレブリン酸を代謝してテトラピロール
化合物とする活性が低下し、その結果として５−アミノ
レブリン酸を多量に生産することができるとの知見を得
た。そして、このような微生物を得るための選抜条件と
して、テトラピロール化合物を少量しか必要としない条
件、すなわち光合成能が低下しても生育できる条件での
変異条件として、非光照射条件が有効であるとの知見を
得、このような微生物を作出することに成功した。

【００１６】さらに、（３）上記（１），（２）のよう
な微生物が、非常に低濃度の５−アミノレブリン酸デヒ
ドラターゼ阻害剤の添加のみで、著量の５−アミノレブ
リン酸を蓄積することを確認した。

【００１７】本発明は、上記（１）〜（３）に基付くも
ので、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤に対
する阻害物質定数が減少した５−アミノレブリン酸デヒ
ドラターゼ変異酵素を有することを特徴とする５−アミ
ノレブリン酸生産微生物を要旨とする。

【００１８】この５−アミノレブリン酸生産微生物は、
５−アミノレブリン酸に対するミカエリス定数が増加し
た５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ変異酵素を有す
ることも特徴とする。

【００１９】また、本発明は、光合成細菌であって、非
光照射下で５−アミノレブリン酸を生産することができ
ることを特徴とする５−アミノレブリン酸生産微生物を
も要旨とする。

【００２０】以上の５−アミノレブリン酸生産微生物
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１４６７２として寄託されている。

【００２１】以下、本発明の５−アミノレブリン酸生産
微生物の作出方法、ならびにこの微生物を使用した５−
アミノレブリン酸の製造方法の詳細を説明する。

【００２２】先ず、本発明の５−アミノレブリン酸生産
微生物は、例えば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、
Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｃ
ｃａｒｏｍｙｃｅｓ属、あるいはこれらの変異株を親株
として、これらを変異処理して得られるものであって、
５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤に対する阻
害物質定数が減少した５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼ変異酵素を有するものである。

【００２３】また、この５−アミノレブリン酸生産微生
物は、上記の特徴に加えて、５−アミノレブリン酸に対
するミカエリス定数が増大した５−アミノレブリン酸デ
ヒドラターゼ変異酵素を有するものが好ましい。

【００２４】このような性質を有する本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産微生物の分離方法の詳細を、以下に例
示する。

【００２５】上記の親株が増殖し得る液体培地を試験管
に調製し、滅菌した後、親株を接種し、振とう培養す
る。増殖した菌体を緩衝液で洗浄後、変異操作を行う。

【００２６】この変異操作としては、通常の変異手法を
用いることができる。例えば、紫外線、電離放射線など
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）などのアルキル化剤や、ブロモ
デオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）などの塩基アナログ
などの化学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養す
る方法を用いることができる。

【００２７】上記のような変異手法によって処理した菌
を、さらに緩衝液で洗浄し、寒天培地などに撒き、培養
する。

【００２８】なお、この培養により生育した変異株の中
から、上記の性質を示す菌株を選択するには、以下のよ
うな工程にて行う。

【００２９】ステップ１：これらの変異株を、後述のＣ
Ｒ−５２０の培養条件に用いるような培地に増殖させ、
菌体を集菌後、適当な緩衝液で洗浄して、緩衝液中で細
胞を破砕し、遠心分離して未破砕の細胞を取り除く。

【００３０】ステップ２：ステップ１で得た無細胞抽出
液に対して、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ反応
液（後述の実施例１参照）を用いて酵素反応を行う。

【００３１】ステップ３：ステップ２の酵素反応を、基
質である５−アミノレブリン酸と５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ阻害剤（例えば、レブリン酸）の濃度を
適宜変化させた条件で行い、各条件における反応速度を
求める。

【００３２】この反応速度の測定方法は、反応速度が求
められれば、どのような方法でもよいが、例えば、エイ
リッヒの比色定量法（Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２１
９，４３５，（１９５６）参照）でポルフォビリノーゲ
ン生成量、ＳＡＴＴＯの方法（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．
Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，２７，４３９，（１９８１）参
照）で総ポリフィリン量を求め、数１に示す式により反
応速度を算出すればよい。

【００３３】

【数１】

【００３４】このようにして求められる各条件下での反
応速度と、５−アミノレブリン酸濃度および５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼ阻害剤（例えば、レブリン
酸）濃度とから、ミカエリス定数および阻害物質定数を
求める。

【００３５】これらの定数を求める方法は、幾つも知ら
れているが、ミカエリス定数は、例えば、酵素反応速度
の逆数と５−アミノレブリン酸濃度の逆数とをプロット
するいわゆるリンネバー・バークプロット（「酵素反応
機構」：田伏岩夫訳、東京大学出版会、など参照）によ
り求められる回帰直線と基質濃度軸の交点から求める。

【００３６】この方法は、リンネバー・バークの方法と
して一般的に用いられるミカエリス定数の算出法であ
り、求められるミカエリス定数（Ｋｍ値）は、酵素の基
本的性質のうち、酵素と基質（本発明では、５−アミノ
レブリン酸）との親和性を評価するのに使用される場合
がある。この場合、Ｋｍ値の増加は、親和性の減少とみ
なすことができる。

【００３７】阻害物質定数は、例えば、酵素反応速度の
逆数と阻害物質の濃度とをプロットするいわゆるディク
ソンプロット（「酵素反応機構」：田伏岩夫訳、東京大
学出版会、など参照）により求める方法がある。この方
法で各５−アミノレブリン酸濃度について求められる回
帰直線は一点で交わり、交点のレブリン酸濃度軸の読み
に−１を乗じた値が阻害物質定数（Ｋｉ値）である。

【００３８】Ｋｉ値を用いて酵素と阻害剤の親和性を評
価することができ、一般に、Ｋｉ値の減少は、阻害剤の
酵素に対する親和性の増大を意味する。

【００３９】なお、５−アミノレブリン酸デヒドラター
ゼ阻害剤とは、５−アミノレブリン酸デヒドタターゼが
５−アミノレブリン酸をポルフォビリノーゲンに変換す
る反応を行う際に、それが共存するとき、ポルフォビリ
ノーゲンの生成速度を低下させる作用を持つ化合物を総
称する。該化合物は、５−アミノレブリン酸デヒドタタ
ーゼが本来の基質とする５−アミノレブリン酸中の官能
基の一部が変化したもの、類似の分子の形状、類似のフ
ァンデルワールス半径、またはその他の類似した電子状
態、から選ばれる１つあるいは２つ以上の構造を分子内
に持つことによって、５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼの５−アミノレブリン酸認識部位を遮蔽することに
より、５−アミノレブリン酸と５−アミノレブリン酸デ
ヒドラターゼの会合を阻害する化合物を含む。

【００４０】このような化合物には、レブリン酸、５−
クロロレブリン酸、５−ブロモレブリン酸、５−ケトヘ
キサン酸、２−メチルコハク酸、２−オキソアジピン
酸、酢酸、スクシンアミド酸、３−オキソアジピン酸、
コハク酸モノメチル、４−ケトピメリン酸などのうち少
なくとも１種が挙げられる。

【００４１】上記のように、Ｋｍ値に対して、Ｋｉ値が
小さいほど阻害剤の効果は大きいことになる。

【００４２】変異処理に供した親株についても、上記の
ステップ３により、５−アミノレブリン酸デヒドラター
ゼの阻害物質定数とミカエリス定数とを求め、これらの
値を基準にして、Ｋｉ値が減少し、Ｋｍ値が増加してい
る変異株を選ぶ。

【００４３】このような変異株を得るために用いる親株
は、上記の微生物から適宜選抜する。例えば、光合成細
菌の野性株あるいはその変異株を用いることができ、ロ
ドバクター・セファロイデスＣＲ−３８６株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３１５９）やこれに由来するＣＲ−４５０株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０８５）のように、既に５−アミ
ノレブリン酸に対するＫｍ値が増大した５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼ変異酵素を有する変異株を用いる
ことが好ましい。

【００４４】ただし、このようにして、得られる変異株
の５−アミノレブリン酸デヒドラターゼのＫｍ値が余り
に大きくなっている場合、生育に必要な量のポルフォビ
リノーゲンが生成しないため、該変異株の生育が著しく
悪化することがある。したがって、野性株のＫｍ値の１
００倍以下のＫｍ値を有する変異株を用いることが望ま
しい。

【００４５】なお、ミカエリス定数が大きくなったため
に生育阻害がかかってしまう場合でも、ポルフォビリノ
ーゲンなどの栄養源を培地中に添加することでその阻害
が解除されるような場合は、この限りではない。

【００４６】また、上記のＫｍ、Ｋｉによる選抜に先立
って、例えばエーリッヒ法などによる５−アミノレブリ
ン酸生産性の評価で選抜を行うことによって、より効率
的に選抜を行うこともできる。

【００４７】次に、本発明の、光合成細菌であって、非
光照射下で生育でき、５−アミノレブリン酸を生産する
ことができる５−アミノレブリン酸生産微生物（以下、
「５−アミノレブリン酸生産光合成微生物」と記す）
は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、あるいはその変異性を
親株として、これを変異処理して得られるものである。

【００４８】このような性質を有する本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産光合成微生物の分離方法を以下に例示
する。

【００４９】上記の親株が増殖し得る液体培地を試験管
に調製し、滅菌した後、親株を接種し、振とう培養す
る。増殖した菌体を緩衝液で洗浄後、変異操作を行う。
この変異操作は、通常の変異手法を用い、前述の５−ア
ミノレブリン酸生産微生物を変異する場合と同様の操作
で行う。

【００５０】得られる変異株の中から上記の性質を示す
菌株を選抜するために、これらの菌を非光照射下（暗
所）にて振とう培養する。

【００５１】この後、さらにエーリッヒ法などにより５
−アミノレブリン酸生産性の評価を行うことで効率的に
選抜を行うことができる。

【００５２】また、前述の５−アミノレブリン酸生産微
生物の選抜法と、上述の５−アミノレブリン酸生産光合
成微生物の選抜法とを組み合わせることにより、一層効
率的な選抜を行うことができることは言うまでもない。

【００５３】以上の変異・分離操作によって得られる好
ましい菌株として、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａ
ｅｒｏｉｄｅｓ ＣＲ−５２０株を挙げることができ
る。

【００５４】本菌株は、後述の実施例１のように、Ｒｈ
ｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＣＲ−
４５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０８５）に対するＮＴＧ
変異処理によって誘導されるものであり、光合成能が低
下している；５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの阻
害剤に対するＫｉが低下し、５−アミノレブリン酸に対
するＫｍが上昇している；非光照射下でも５−アミノレ
ブリン酸を著量蓄積する；親株のコロニーが赤であるの
に対し、茶である；など以外は、親株とほぼ同じ菌学的
性質を有する。

【００５５】このＣＲ−５２０株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４６７２として
寄託されている。

【００５６】ＣＲ−５２０を用いた５−アミノレブリン
酸の生産条件については、通常の微生物培養条件が容易
に利用できる。例えば、炭素源として、グルコースなど
の糖類、あるいは酢酸、リンゴ酸、コハク酸などの酸類
を用いることができる。特に、糖類が価格の面で有利で
ある。また、窒素源としては、グリシンを添加すること
が望ましい。グリシンの添加は、５−アミノレブリン酸
の生産を著しく向上させる。通常、５〜１００ｍＭのグ
リシン添加が効果的であり、望ましくは１０〜６０ｍＭ
の添加である。補助成分として、硫安、塩安等のアンモ
ニア態窒素化合物、硝酸ナトリウム等の硝酸態窒素化合
物等の無機窒素源、尿素、ポリペプトン、酵母エキス等
の有機窒素化合物などを使用すればよい。さらに、無機
塩類等の微量成分などを適宜添加することが望ましい。

【００５７】グリシンの添加とほぼ同時に５−アミノレ
ブリン酸デヒドラターゼ阻害剤（例えば、レブリン酸）
を少量添加することができる。本発明の微生物は、５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼの５−アミノレブリン
酸に対するＫｍ値が増大しているため、実施例に示した
ように、レブリン酸の添加無しでも５−アミノレブリン
酸を蓄積し得るが、一般には、レブリン酸を添加するこ
とが５−アミノレブリン酸の生産には効果的である。レ
ブリン酸の添加量は、０．０１〜１０ｍＭ、望ましくは
０．１〜５ｍＭである。

【００５８】培養条件としては、ＣＲ−５２０が生育可
能な条件の全てを用いることができるが、一般には、１
０〜４０℃、望ましくは２０〜３５℃で培養すればよ
く、培地のｐＨは４〜９、望ましくは５〜８が適してい
る。

【００５９】５−アミノレブリン酸の生産は、菌体の増
殖と同時に行うことができるが、菌体の増殖と独立して
も行うことができる。使用する微生物は、増殖期菌体、
休止菌体のいずれでもよく、そのまま５−アミノレブリ
ン酸の生産に使用できるが、遠心分離などにより集菌
し、培地やリン酸緩衝液等の適当な溶液に再懸濁させる
などして、菌濃度を高めて用いることもできる。

【００６０】なお、培養時や５−アミノレブリン酸の生
産時にｐＨが変化する場合には、水酸化ナトリウム、ア
ンモニア、水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液や、塩
酸、硫酸、リン酸などの酸でｐＨを調製することが望ま
しい。

【００６１】生産される５−アミノレブリン酸は、イオ
ン交換法、クロマト法、抽出法などの常法によって必要
に応じて分離・精製される。

【００６２】

【作用】本発明の５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ
阻害剤に対するＫｉ値が減少した５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ変異酵素を有する微生物、またはこの特
徴に加えて、５−アミノレブリン酸に対するＫｍ値が増
大した５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ変異酵素を
有する微生物は、微量の５−アミノレブリン酸デヒドラ
ターゼ阻害剤を添加するだけで、該微生物が生産する５
−アミノレブリン酸２分子を縮合させてポルフォビリノ
ーゲンに転化する活性が著しく特異的に低下する。

【００６３】このため、本発明の微生物を用いる５−ア
ミノレブリン酸の生産は、５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼ阻害剤を、微生物自身の生育、活性を抑制しな
い範囲内で添加する条件で行うことができるため、５−
アミノレブリン酸の生産性は非常に増大する。

【００６４】また、本発明の、光合成細菌であって、非
光照射下で、５−アミノレブリン酸を生産することがで
きる微生物においては、光を照射せずとも著量の５−ア
ミノレブリン酸を蓄積することができる。

【００６５】

【実施例】

実施例１ 表１に示すグルタメート・グルコース培地（培地１）１
０ｍｌ（以下、「ｍＬ」と記し、リットルを「Ｌ」と記
す）を２１ｍｍφの試験管に分注して、１２１℃で１５
分間滅菌し、放冷した。

【００６６】

【表１】

【００６７】これに、ＣＲ−４５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１４０８５）の一白金耳を植菌後、３０℃、暗所にて２
日間振とう培養した。

【００６８】別の２１ｍｍφの試験管に培地１を１０ｍ
Ｌ分注して、上記と同様にして滅菌した。これに、上記
の培養液０．５ｍＬを植え継ぎ、３０℃、暗所にて１８
時間振とう培養した。

【００６９】この培養液を、洗浄のために、１００００
ｒｐｍにて５分間遠心分離し、その上清を捨て、遠心分
離前と同量のトリス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁させた。この洗浄操作を、さらに２度繰り返し
た。

【００７０】この後、再び１００００ｒｐｍにて５分間
遠心分離し、その上清を捨て、１００μｇ／ｍＬのＮＴ
Ｇを含むトリス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸
濁させ、室温にて８０分間静置培養した。

【００７１】このようにして変異処理した菌を、上記と
同様の方法で３回洗浄した後、滅菌した培地１の試験管
に植え継ぎ、３０℃、暗所にて２日間振とう培養した。

【００７２】別に、培地１に寒天１５ｇ／Ｌを添加し、
１２１℃で１５分間滅菌して寒天プレートを調製した。
この寒天プレートに、上記の培養液を希釈して塗布し、
３０℃、暗所で４日間培養した。これにより、約１５０
００株のコロニーを得た。

【００７３】実施例２ 滅菌済みの９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり
０．２ｍＬの滅菌済みの培地１を分注し、上記の約１５
０００株の変異株をそれぞれ植菌した。これを、３０
℃、暗所にてマイクロプレートシェイカーを用いて振と
う培養し、２４時間後、各ウェルにグリシンおよびレブ
リン酸を、それぞれ最終濃度で３０ｍＭおよび１ｍＭと
なるように添加した。

【００７４】さらに、２４時間、上記と同じ条件下で振
とう培養し、各ウェルから培養液を採取し、エイリッヒ
反応により、５５３ｎｍの吸光度が高い変異株７０株を
選抜した。

【００７５】実施例３ 次に、５００ｍＬ容の振とうフラスコに２００ｍＬの培
地１を調製した。これを１２１℃で１５分間滅菌し、放
冷した。

【００７６】実施例２で得られたＣＲ−４５０株由来の
各変異株を、１０ｍＬの培地１を分注して上記と同様に
して滅菌した２１ｍｍφの試験管にて４８時間、３０
℃、暗所にて振とう培養した。

【００７７】この培養液を、上記の振とうフラスコに全
量植菌し、４８時間、３０℃、暗所にて振とう培養した
後、遠心分離により菌体を集めた。

【００７８】集めた菌体をトリス−塩酸緩衝液（４０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．１）で洗浄後、同じ組成の緩衝液５ｍＬに
再懸濁し、定法により超音波破砕装置にて破砕し、１０
０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上清を５
−アミノレブリン酸デヒドラターゼ粗酵素液とした。

【００７９】トリス−塩酸緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ８．
１）１ｍＬ中にＫＣｌを３３ｍＭと、ＭｇＣｌ_２を６．
５ｍＭ含み、さらに上記の粗酵素液を蛋白量換算で１．
０ｍｇ／ｍＬとなるように加えて、酵素反応液を調製し
た。

【００８０】この酵素反応液に、５−アミノレブリン酸
（０．３２、０．６５、１．３、３．２、６．５ｍＭ）
およびレブリン酸（０、０．０１、０．０５、０．２、
１．０、５．０ｍＭ）を各種の濃度で含有するように加
え、３７℃でインキュベートした。

【００８１】６０分後、５ｖｏｌ％トリクロロ酢酸を２
ｍＬ加えて反応を停止させた。これを３５００ｒｐｍで
１０分間遠心分離し、上清を１ｍＬ採り、エイリッヒの
比色定量法により反応液中のポルフォビリノーゲンの生
成量ａを調べた。

【００８２】さらに、別の上清１ｍＬを採り、ＳＡＴＴ
Ｏの方法により、反応液中の総ポルフィリン量ｂを調べ
た。

【００８３】これらの量ａ，ｂから、前述の数１の式に
よってポルフォビリノーゲン生成速度を求め、これを５
−アミノレブリン酸デヒドラターゼ反応速度とした。

【００８４】この反応速度の逆数とレブリン酸濃度とを
プロットし、各５−アミノレブリン酸濃度について回帰
直線を求めた。それぞれの回帰直線は一点で交わり、交
点のレブリン酸濃度軸の値から阻害物質定数（Ｋｉ値）
を求めた。

【００８５】また、反応速度の逆数と５−アミノレブリ
ン酸濃度の逆数とをプロットして回帰直線を求め、この
回帰直線と５−アミノレブリン酸濃度の逆数軸との交点
からミカエリス定数（Ｋｍ値）を求めた。

【００８６】調査した変異株の中で、本発明の５−アミ
ノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤（レブリン酸）に対
するＫｉ値が減少した５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼを有し、５−アミノレブリン酸を生産する菌株ＣＲ
−５１４、５−アミノレブリン酸に対するＫｍ値が増大
し、かつ５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤
（レブリン酸）に対するＫｉ値が減少した５−アミノレ
ブリン酸デヒドラターゼ変異酵素を有し、しかも非光照
射下で生育し、５−アミノレブリン酸を生産する菌株Ｃ
Ｒ−５２０、およびＫｉ、Ｋｍ値に変化はないが、暗所
にても著量の５−アミノレブリン酸を生産する菌株ＣＲ
−５３３を分離することに成功した。ＣＲ−５１４、Ｃ
Ｒ−５２０、ＣＲ−５３３株のＫｉ値およびＫｍ値を表
２に示す。

【００８７】比較例１ 用いる菌株をＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ ＩＦＯ１２２０３とした以外は、実施例３と
同様の処理を行い、Ｋｉ値およびＫｍ値を求めた。これ
らの値を表２に併せて示す。

【００８８】比較例２ 用いる菌株をＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ ＣＲ−４５０株とした以外は、実施例３と同
様の処理を行って、Ｋｉ値およびＫｍ値を求めた。これ
らの値を表２に併せて示す。

【００８９】

【表２】

【００９０】表２から明らかなように、ＣＲ−５２０株
は、明らかに５−アミノレブリン酸に対するＫｍ値が増
大した５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ変異酵素を
有し、しかもこの特徴に加えて、レブリン酸（５−アミ
ノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤）に対するＫｉ値が
減少した５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ変異酵素
を有する菌株であることがわかる。

【００９１】実施例４ ２Ｌ容の振とうフラスコに５００ｍＬの培地１を調製し
た。これを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却した。

【００９２】別に、実施例３で得られたＣＲ−５１４、
ＣＲ−５２０、ＣＲ−５３３株を、それぞれ１０ｍＬの
培地１を分注して上記と同様にして滅菌した２１ｍｍφ
の試験管にて４８時間、３０℃、暗所にて振とう培養し
た。

【００９３】この培養液を上記振とうフラスコに全量植
菌し、４８時間、３０℃、暗所にて振とう培養した後、
遠心分離により菌体を集めた。

【００９４】集めた菌体を予め滅菌しておいた培地１の
１５０ｍＬに湿菌体量約０．３ｇ／１０ｍＬとなるよう
に再懸濁し、これにグリシンを３０ｍＭとなるように加
え、２１ｍｍφ試験管に１０ｍＬずつ分注した。それぞ
れの試験管について、レブリン酸添加濃度条件を変え
て、３０℃、暗所にて振とう培養した。

【００９５】培養１５時間後および３０時間後の培養液
中の５−アミノレブリン酸を岡山らの方法（ＣＬＩＮＩ
ＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．Ｖｏｌ．３６．Ｎｏ．
８．ｐ−１４９４，１９９０）により定量した。結果を
表３に示す。

【００９６】比較例３ 用いる菌株をＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ ＩＦＯ１２２０３とし、加えるレブリン酸を
表３に示したようにした以外は、実施例４と同様の処理
を行い、培養１５時間後および３０時間後の培養液中の
５−アミノレブリン酸を実施例４と同様にして定量し
た。結果を表３に併せて示す。

【００９７】比較例４ 用いる菌株をＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏ
ｉｄｅｓ ＣＲ−４５０株とし、加えるレブリン酸を表
３に示したようにした以外は、実施例４と同様の処理を
行い、培養１５時間後および３０時間後の培養液中の５
−アミノレブリン酸を実施例４と同様にして定量した。
結果を表３に併せて示す。

【００９８】

【表３】

【００９９】表３から明らかなように本発明の微生物の
例であるＣＲ−５２０株は、非光照射下で生育でき、し
かも５−アミノレブリン酸に対するＫｍ値が増大し、か
つレブリン酸に対するＫｉ値が減少した５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼ変異酵素を有するため、非光照射
下において、５−アミノレブリン酸の生産性が向上して
おり、かつ生産のために必要なレブリン酸を減少させる
ことができる。

【０１００】

【発明の効果】本発明の微生物は、生産する５−アミノ
レブリン酸２分子を縮合させてポルフォビリノーゲンに
転化する活性が著しく低いため、５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ阻害剤を、微生物自身の生育、活性を抑
制しない極く微量添加するだけで、５−アミノレブリン
酸の生産を行うことができる。したがって、５−アミノ
レブリン酸の生産性を非常に増大することができる。

【０１０１】また、本発明の、光合成細菌であって、非
光照射下で５−アミノレブリン酸を生産することができ
る微生物によれば、光を照射せずとも著量の５−アミノ
レブリン酸を蓄積することができるため、光照射しない
分だけ５−アミノレブリン酸の生産コストを低減させる
ことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 徹 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻
   害剤に対する阻害物質定数が減少した５−アミノレブリ
   ン酸デヒドラターゼ変異酵素を有することを特徴とする
   ５−アミノレブリン酸生産微生物。
2. 【請求項２】 ５−アミノレブリン酸に対するミカエリ
   ス定数が増加した５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ
   変異酵素を有することを特徴とする請求項１記載の５−
   アミノレブリン酸生産微生物。
3. 【請求項３】 光合成細菌であって、非光照射下で５−
   アミノレブリン酸を生産することができることを特徴と
   する５−アミノレブリン酸生産微生物。
4. 【請求項４】 工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
   ＥＲＭ Ｐ−１４６７２として寄託されていることを特
   徴とする請求項１，２，３記載の５−アミノレブリン酸
   生産微生物。