JPH08176157A - 新規生理活性物質エポスタチン、その製造法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 既知のジペプチジルペプチダーゼII阻害物質
と化学構造中の母核が相違して且つジペプチジルペプチ
ダーゼIIに対する阻害活性を有する新規な化合物を提供
する。 【構成】 ストレプトミセスｓｐ．ＭＪ９９５−ＯＦ５
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６０８）の培養により、次式
（Ｉ）： で表される化合物であるエポスタチンが得られた。この
化合物はジペプチジルペプチダーゼIIを阻害する活性を
有し、該酵素の阻害剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はジペプチジルペプチダー
ゼIIに対する酵素阻害作用を有する新規な生理活性物質
であるエポスタチン(Epostatin）に関し、またエポスタ
チンの製造法およびその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】ジペプチジルペプチダーゼIIの酵素活性
は、全身性エリテマトーデスや慢性関節リュウマチ等の
膠原病において著しく上昇し、その病因と深く関わるこ
とが示唆されている〔Clinical Chemistry、第33巻、14
63〜1465（1987年）〕。したがって、ジペプチジルペプ
チダーゼIIに対する酵素阻害物質は、自己免疫疾患にお
ける免疫の調節作用を有することが期待される。

【０００３】微生物の生産するジペプチジルペプチダー
ゼII阻害物質としては、これまでにピューロマイシン
（Puromycin）〔Proteases in mammalian cells and ti
ssues、311〜391頁、North-Holland Publishing Compan
y、Amsterdam(1977年）〕、ならびにジオクタチン（Dio
ctatin）Ａ及びＢ（特開平3-77857号公報）が報告され
ている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ピューロマイシンなら
びにジオクタチンＡ及びＢ等の既知のジペプチジルペプ
チダーゼII阻害物質と化学構造における母核を異にして
且つジペプチジルペプチダーゼIIに対する阻害活性を有
する新規な物質が望まれている。本発明の目的は、その
ような新規母核を有して且つジペプチジルペプチダーゼ
II阻害活性を有する新規な生理活性物質、その製造法及
びその用途を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的のために研究を行った。その結果、本発明者らが土壌
より新らたに分離した放線菌菌株を培養し、その培養物
中にジペプチジルペプチダーゼIIに対して酵素阻害活性
を有する物質が生産されていることを発見した。さらに
その物質を単離精製することに成功し、またその物質の
化学構造を決定して該物質が新規な化合物であることを
確認し且つジペプチジルペプチダーゼIIに対する酵素阻
害物質として作用することも確認した。そこで、この物
質をエポスタチン（Epostatin）と命名した。

【０００６】従って、第１の本発明においては、下記の
式（Ｉ）： で表される化合物である生理活性物質エポスタチンおよ
びその薬学的に許容し得る塩又はエステルを提供するも
のである。

【０００７】エポスタチンの理化学的性質は下記の通り
である。 （１）色及び性状：薄黄色粉末状の両性物質 （２）分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₃Ｎ₃Ｏ₅ （３）分子量：431 FAB-MS（Positive）m/z 432（M+H)⁺ （４）融点：157〜159℃（分解） （５）比旋光度：［α］_D ²³−174°（c1，メタノール）

【０００８】（６）紫外線吸収スペクトル：添付図面の
図１に示す。 （７）赤外線吸収スペクトル：添付図面の図２に示す。 （８）水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３に
示す。 （９）炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図４に
示す。 （10）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに可
溶であり、酢酸エチル、水に難溶である。

【０００９】（11）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：
0.16 シリカゲル（メルク社製 Art. 5715）薄層を用い、展
開溶媒としてクロロホルム−メタノール−水（65:25:
4）を用いて測定した。

【００１０】本発明によるエポスタチンは、そのカルボ
キシル基における薬学的に許容し得る塩の形態にあって
もよく、このような塩としては、例えばナトリウム、カ
リウム、リチウムなどのアルカリ金属との塩、およびカ
ルシウムなどのアルカリ土類金属等との塩が挙げられ
る。

【００１１】また、本発明によるエポスタチンは、その
カルボキシル基におけるエステルであることもでき、そ
のようなエステルとしては、低級アルカノール、例えば
メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコ
ール等又はその他の適当なアルコール類との薬学的に許
容し得るエステルがあげられる。さらにエポスタチン
は、それの塩基性官能基(−NH−又はNH₂）における酸付
加塩、例えば塩酸、硫酸のような薬学的に許容できる無
機酸、あるいは酢酸、マレイン酸のような薬学的に許容
できる有機酸との酸付加塩の形であることもできる。

【００１２】本発明によるエポスタチンは、下記の試験
例に示すようにジペプチジルペプチダーゼIIに対して酵
素阻害活性を示し、また後記される生物学的活性を有す
る。

【００１３】以下に、エポスタチンがジペプチジルペプ
チダーゼII阻害活性を有することを試験例により示す。

【００１４】試験例１ エポスタチンのジペプチジルペプチダーゼII阻害活性 エポスタチンのジペプチジルペプチダーゼII阻害活性
は、「The Journal ofBiological Chemistry」第243
巻、4134〜4150頁(1968年）に記載の方法の改良法で行
った。即ち、３．２mM リジル−アラニン−β−ナフチ
ルアミド０．０２５ml、０．１Ｍ ３，３−ジメチルグ
ルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH５．５）０．１
ml、検体としてエポスタチンを含む水溶液０．０５mlを
加えた混合溶液を３７℃、５分間加温した。その後、ラ
ット脾臓のホモジェネートより硫酸アンモニウム分画に
より部分精製したジペプチジルペプチダーゼII溶液０．
０２５mlを加え、３７℃、１時間反応させた。反応後、
１０％ポリオキシエチレン（20）ソルビターンモノウレ
ート（和光純薬工業製）および０．２％ファーストガー
ネットＧＢＣ塩（Sigma Chemical Company）を含む０．
５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（pH３．７８）を０．１
ml加えて反応を停止し、５２５nmにおける吸光度（ａ）
を測定した。同時に、検体を含まない緩衝液のみを用い
た盲検の吸光度（ｂ）を測定し、ジペプチジルペプチダ
ーゼII阻害率を計算式の[(b-a)/b]×100により計算し
た。

【００１５】５０％阻害率を示す検体の濃度をＩＣ₅₀の
値とした。この定量法で純粋なエポスタチンは０．９６
μｇ／mlの濃度でジペプチジルペプチダーゼIIを５０％
阻害した。

【００１６】試験例２ エポスタチンの毒性 エポスタチンをマウスに静脈内投与して、常法でエポス
タチンの急性毒性を調べたところ、６２．５mg／kgを投
与しても毒性を示さなかった。

【００１７】第２の本発明においては、ストレプトミセ
ス属に属するエポスタチン生産菌を栄養培地中で培養
し、その培養物から前記の式（Ｉ）で表されるエポスタ
チンを採取することを特徴とする、生理活性物質エポエ
タチンの製造法が提供される。

【００１８】この第２の本発明の方法でエポスタチンを
製造する場合、利用できるストレプトミセス属に属する
エポスタチン生産菌の一例としては、平成５年５月、微
生物化学研究所において千葉県市原市の土壌より分離さ
れた放線菌で、ＭＪ９９５−ＯＦ５の菌体番号が付され
た菌株がある。

【００１９】ＭＪ９９５−ＯＦ５株の菌学的性状を次に
記載する。 １．形 態 ＭＪ９９５−ＯＦ５株は、分枝した基生菌糸より直状あ
るいは曲状の気菌糸を伸長し、らせん形成及び輪生枝は
認められない。気菌糸の先端には胞子の連鎖を認め、成
熟した胞子鎖には、１０個以上の円筒形の胞子が連鎖す
る。胞子の大きさは約０．５〜０．７×１．０〜１．５
ミクロンで、その表面は平滑である。集束糸及び胞子の
うは認められない。なお、イースト・グルコース・ブロ
ス（イーストエキス１．０％、グルコース１．０％、pH
７．０）で２７℃、２日間、振とう培養すると、多数の
submergedsporeが観察される。

【００２０】２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す色の標準は、コンティ
ナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハ
ーモニー・マニュアル(Container Corporationof Ameri
caのColor Harmony Manual）を用いた。

【００２１】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（３
０℃培養） 発育はうす黄［2 gc, Bamboo］〜うす黄茶［2 ie, Lt M
ustard Tan］、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認めら
れない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（３０℃培
養） うす黄茶［3 le, Cinnamon］〜黄茶［3 ng, Yellow Map
le］の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性
色素はかすかに茶色味を帯びる。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、３０℃培養) 発育はうす黄茶［3 le, Cinnamon］〜黄茶［3 pi, Gold
en Brown］、気菌糸は着生せず、溶解性色素は茶色味を
帯びる。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、３
０℃培養） うす黄茶［3 le, Cinnamon］〜黄茶［3 ng, Yellow Map
le］の発育上に、白の気菌糸を部分的に着生し、溶解性
色素はかすかに茶色味を帯びる。

【００２２】（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地
７、３０℃培養） うす黄茶［3 ie, Camel］〜灰味黄茶［3 pl, Clove Bro
wn］の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生する。茶
色の溶解性色素を産生する。 （６）栄養寒天培地（３０℃培養） 発育は黄味灰［2 ca, Lt Ivory］、気菌糸は着生せず、
溶解性色素は認められない。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、３０
℃培養） 発育は黄茶［3 ng, Yellow Maple］〜明るい茶［4 ng,
Lt Brown〜4 lg, Lt Spice Brown］、気菌糸は着生せ
ず、溶解性色素は茶色味を帯びる。 （８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、３０℃
培養） うす黄茶［3 le, Cinnamon］の発育上に、白の気菌糸を
うっすらと着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（３０℃培養） 発育はうす黄茶［2 pg, Mustard Gold］、気菌糸は着生
せず、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。

【００２３】（10）スターチ寒天培地（３０℃培養） 発育はうす黄［2 gc, Bamboo］〜うす黄茶［2 pg, Must
ard Gold］、気菌糸は着生せず、溶解性色素はかすかに
黄色味を帯びる。 （11）マルトース・ベンネット寒天培地（３０℃培養） 黄茶［3 pg, Golden Brown］〜明るい茶［4 pi, Oak Br
own］の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生し、溶解
性色素は茶色味を帯びる。

【００２４】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 マルトース・ベンネット寒天培地（イーストエキス０．
１％、牛肉エキス０．１％、Ｎ−Ｚ−アミン、タイプＡ
０．２％、マルトース１．０％、寒天２．０％、pH
７．３）を用い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３
０℃、３７℃、５０℃の各温度で試験した結果、３７
℃、５０℃を除き、そのいずれの温度でも生育する。生
育至適温度は２４℃〜３０℃付近と思われる。

【００２５】（２）スターチの加水分解（スターチ・無
機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４及びスターチ寒天培地、
いずれも３０℃培養） いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性が認
められ、その作用は中等度〜強い方である。 （３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培
地７；いずれも３０℃培養） トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イースト
・鉄寒天培地では陰性、チロシン寒天培地では陽性であ
る。

【００２６】（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、３０℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコースを
利用して発育し、シュクロースはおそらく利用する。Ｄ
−フラクトース、イノシトール、ラフィノース、ラムノ
ース及びＤ−マンニトールは利用しない。 （５）硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カリウム含有ペ
プトン水、ＩＳＰ−培地８、３０℃培養） 陽性である。

【００２７】以上の性状を要約すると、ＭＪ９９５−Ｏ
Ｆ５株は、その形態上、基生菌糸より直状あるいは曲状
の気菌糸を伸長し、らせん形成および輪生技は認められ
ない。気菌糸の先端に胞子の連鎖を認め、成熟した胞子
鎖には１０個以上の円筒形の胞子を連鎖し、その表面は
平滑である。集束糸及び胞子のうは認められない。液体
培養で、submerged sporeを形成する。種々の培地で、
うす黄茶〜黄茶の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生
し、溶解性色素は茶色味を帯びる。生育至適温度は２４
〜３０℃付近である。メラニン様色素の生成はトリプト
ン・イースト・ブロス及びペプトン・イースト・鉄寒天
培地では陰性であり、チロシン寒天培地では陽性であ
り、スターチの水解性は中等度〜強い方である。なお、
ＭＪ９９５−ＯＦ５株の細胞壁の２，６−ジアミノピメ
リン酸はＬＬ−型とメソ型の両方を含有していた。

【００２８】細胞壁にＬＬ−型とメソ型の２，６−ジア
ミノピメリン酸を含むものとして、１９８２年に大村ら
により提唱されたキタサトスポリア（Kitasatosporia）
属が知られている。しかし、キタサトスポリア属は１９
９２年にウェリントンらにより、ストレプトミセス（St
reptomyces）属とシノニム（synonym）であると提唱さ
れ、基準種（type species）であるキタサトスポリア・
セタエ（Kitasatospor ia setae）を含む４種がストレプ
トミセス属に移行され、ストレプトミセス属の定義も修
正された（Wellington, E. M. H., E. Stackebrandt,
D. Sanders, J.Wolstrup and N. O. G. Jorgensen, 「I
nternational Journal of Systematic Bacteriology」4
2巻、156頁、1992年）。その後、中垣内らはキタサトス
ポリア属よりストレプトミセス属に移行された種のクラ
スターを“セタエ・グループ”（'setae group'）と呼
ぶことを提案し、新規あるいは移行により６種を加えた
（文献１，Nakagaito, Y., A. Yokota and T.Hasegawa,
「The Journal of General and Applied Microbiolog
y」38巻、105頁、1992年、文献２、Nakagaito、Y.,A. S
himazu, A. Yokota and T. Hasegawa, 「The Journal o
f General and Applied Microbiology」38巻、627頁、1
992年）。

【００２９】そこで、ＭＪ９９５−ＯＦ５株は上記の性
状より、ストレプトミセス属の“セタエ・グループ”に
属すると考えられる。このグループ中よりＭＪ９９５−
ＯＦ５株に近縁の既知菌種を検索すると、ストレプトミ
セス・アトロアウランティアクス（Streplomyces atroa
urantiacus）〔文献１、Nakagaito, Y., A. Shimazu,A.
Yokota and T. Hasegawa,「The Journal of General a
nd Applied Microbiology」38巻、627頁、1992年、文献
２、Validation of the publication of newnames and
new combinations previously effectively published
outside theIJSB, List No.46, International Journal
of Systematic Bacteriology, 43巻、624頁、1993
年〕、ストレプトミセス・アザティクス（Streptomyces
azaticus）〔文献１、Nakagaito, Y., A. Yokota and
T.Hasegawa,「The Journal of General and Applied Mi
crobiology」38巻、105頁、1992年、および文献２、Val
idation of the publication of new names and new co
mbinations previously effectively published outsid
e the IJSB, List No.44,「International Journalof S
ystematic Bacteriology」43巻、188頁、1993年〕及び
ストレプトミセス・メディオシディクス（Streptomyces
mediocidicus）〔文献１、Labeda, D. P,「Internatio
nal Journal of Systematic Bacteriology」38巻、287
頁、1988年、および文献２、Wellington, E. M. H., E.
Stackebrandt, D. Sanders, J. Wolstrup and N. O.
G. Jorgensen,「International Journal of Systematic
Bacteriology」42巻、156頁、1992年〕があげられた。
そこで、上記３種の菌株と、ＭＪ９９５−ＯＦ５株とを
実地に比較検討する予定である。現時点ではＭＪ９９５
−ＯＦ５株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyc
es sp.）ＭＪ９９５−ＯＦ５とする。

【００３０】なお、ＭＪ９９５−ＯＦ５株を工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成６年１０月
２８日、ＦＥＲＭ Ｐ−１４６０８として受託された。

【００３１】ＭＪ９９５−ＯＦ５株は他の放線菌の場合
に見られるように、その性状が変化しやすい。たとえ
ば、ＭＪ９９５−ＯＦ５株に由来する突然変異株（自然
発生または誘発性）、形質融合体または遺伝子組み換え
体であっても、エポスタチンの生産能を有するストレプ
トミセス属の菌はすべて本発明の方法に使用することが
できる。

【００３２】第２の本発明の方法では、エポスタチンを
製造するには、エポスタチン生産菌を通常の微生物が利
用しうる栄養物を含有する培地で培養する。炭素源とし
ては、グルコース、水飴、デキストリン、シュクロー
ス、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使用できる。ま
た、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーン
スティープ・リカー、綿実かす、肉エキス，ペプトン、
酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を
利用できる。その他、必要に応じ、ナトリウム、コバル
ト、塩素、硫酸、燐酸、及びその他のイオンを生成する
ことのできる無機塩類を添加することは有効である。ま
た、菌の生育を助け、生理活性物質エポスタチンの生産
を促進するような有機及び無機物を適当に添加すること
ができる。

【００３３】培養法としては、好気的条件での培養法、
特に深部培養法が適している。培養に適当な温度は１５
〜３７℃であるが、多くの場合、２６〜３０℃付近で培
養する。生理活性物質エポスタチンの生産は培地や培養
条件により異なるが、振盪培養、タンク培養とも通常１
〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の生
理活性物質エポスタチンの蓄積量が最高になった時に、
培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製する。

【００３４】第２の本発明の方法によって得られるエポ
スタチンの培養液からの採取にあたっては、その性状を
利用した通常の分離手段を適宜組み合わせて抽出して精
製することができる。エポスタチンは培養濾液及び菌体
の両方に存在する。培養濾液よりは、酢酸エチル等の水
不混和性の有機溶媒で抽出できる。菌体よりは、メタノ
ール、アセトン等の有機溶剤で抽出後、抽出液を減圧濃
縮し、培養濾液と同様の方法で更に溶媒抽出することが
できる。

【００３５】上述の方法に加え、脂溶性物質の採取に用
いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー
よりのかき取り、高速液体クロマトグラフィー等を適宜
組み合わせ、あるいは繰り返すことによってエポスタチ
ンを純粋に単離することができる。

【００３６】なお、第１の本発明によるエポスタチンの
薬学的に許容し得る塩は、公知の方法によって製造する
ことができ、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどを含む溶液
でエポスタチンを処理することによって得ることができ
る。

【００３７】第３の本発明においては、エポスタチンま
たはその薬学的に許容し得る塩又はエステルを有効成分
とする、ジペプチジルペプチダーゼII阻害剤が提供され
る。

【００３８】その有効成分であるエポスタチン又はその
塩又はエステルは、担体と混合されて組成物の形として
酵素阻害剤となり得る。その混和される薬学的に許容で
きる液状又は固体担体は特に制限はなく一般的に使用さ
れるものが使用できる。

【００３９】この阻害剤組成物中の有効成分（エポスタ
チン）の割合はその剤形などにより異なるので一概には
いえないが、０．０５〜９９％（重量）程度まで広範囲
に使用することができる。本阻害剤組成物は常法で経口
投与用又は非経口投与用に適した剤型に製剤できる。通
常、注射剤ではエポスタチンの含有量は０．１〜５０％
程度であり、それ以外の製剤では１〜６０％程度であ
り、残部は薬学的に許容できる担体及び適当な補助剤で
ある。

【００４０】エポスタチンを投与する際の製剤として
は、慣用的に用いられている剤形が挙げられる。経口投
与用の組成物の場合には、例えばデンプンなどの通常の
賦形剤などとともに成型された錠剤、顆粒剤、カプセル
剤などが用いられる。非経口投与用の組成物の場合に
は、例えば生理食塩水に溶解剤などの存在下にエポスタ
チンを溶解又は分散して製剤化された通常の注射剤など
が用いられる。

【００４１】エポスタチンは、通常、経口投与あるいは
静脈、皮内、筋肉内投与などの非経口投与などの投与で
その有効量を投与することにより、生体中のジペプチジ
ルペプチダーゼIIの阻害を行うことができる。従って、
本発明は、別の要旨では、ジペプチジルペプチダーゼII
阻害方法を提供する。エポスタチンの投与量は投与する
対象、投与ルートなどによって変動するが通常０．５〜
１００mg／kg／日、好ましくは１〜５０mg／kg／日であ
る。

【００４２】エポスタチンは前記の試験例に示すよう
に、細胞質に局在する酵素であるジペプチジルペプチダ
ーゼIIを強く阻害し、毒性を示さない。したがって、エ
ポスタチンはジペプチジルペプチダーゼII阻害剤として
極めて有用である。

【００４３】

【発明の効果】以上に詳細に説明したように、本発明で
は新規な生理活性物質エポスタチンが提供される。エポ
スタチンはジペプチジルペプチダーゼIIを強く阻害し、
したがって、ジペプチジルペプチダーゼII阻害剤として
極めて有用である。

【００４４】以下に、本発明を実施例により更に明細に
説明する。

【００４５】

【実施例】次に実施例によって本発明のエポスタチンの
製造例を示す。

【００４６】実施例１ 種培地として、ガラクトース２．０％、バクト−ソイト
ン（ディフコ社製）１．０％、コーン・スティープ・リ
カー（イワキ社製）０．５％、デキストリン２．０％、
グリセリン１．０％、硫酸アンモニウム０．２％、炭酸
カルシウム０．２％、消泡剤〔局方大豆油とシリコン油
ＫＭ−７０（信越化学製）を等量混和したもの〕１滴を
含む培地を用いた。また、生産培地として、ガラクトー
ス２．０％、バクト−ソイトン（ディフコ社製）１．０
％、コーン・スティープ・リカー（イワキ社製）０．５
％、デキストリン２．０％、グリセリン１．０％、硫酸
アンモニウム０．２％、炭酸カルシウム０．２％、前述
の消泡剤１滴を含む培地を用いた。なお、殺菌前の培地
はｐＨ７．４に調整して使用した。

【００４７】５００ml容三角フラスコに１１０mlを分注
した前記の種培地を１２０℃で２０分間滅菌し、これに
ストレプトミセス エスピーＭＪ９９５−ＯＦ５株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４６０８）の斜面培養の１〜２白金耳を
接種し、３０℃、１８０回転／分の回転式振盪機にて６
日間培養して種培養とした。ついで前記の生産培地を５
００ml容三角フラスコに１１０mlずつ分注し、１２０℃
で２０分間滅菌し、前記種培養液３mlずつを移植し、２
７℃で５日間振盪培養した。培養終了後、得られた培養
液を濾過し培養濾液と菌体に分別した。

【００４８】培養濾液１ｌをあらかじめ脱イオン水で充
填したダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）、１０
０mlのカラムにかけ、脱イオン水で洗浄後、有効成分を
５０％アセトン水により溶出し、減圧濃縮によりアセト
ンを除去した。この濃縮液１５０mlに酢酸エチル１５０
mlを加え、よく攪拌して酢酸エチルによって濃縮液を洗
い出し、次に、ｎ−ブタノール１５０mlを加え、よく攪
拌して有効成分を抽出し、これを濃縮して褐色の粗物質
８１．９mgを得た。

【００４９】この粗物質をメタノールに溶解した後、あ
らかじめメタノールで充填したセファデックスＬＨ−２
０（ファルマシア社製）、１００mlのカラムにかけ、同
溶媒で溶出し、濃縮乾固することにより、エポスタチン
を含む黄色の粗物質１９．６mgを得た。

【００５０】更に、この粗物質をクロロホルム−メタノ
ール−水（５：６：４）の下層液に溶解した後、あらか
じめ前記下層液を固定相とした遠心液液分配クロマト
（三鬼エンジニアリング社製、CPC-LLB model SALL、２
５０ml容量、７００回転／分、流速８ml／min）にか
け、前記上層液で洗浄した後、前記下層液によって活性
画分を反転溶出させた。この活性画分を濃縮乾固するこ
とにより純粋なエポスタチンを７．８mgを得た。また、
菌体に２５０mlのメタノールを加え、よく攪拌した後、
有効成分を同溶媒で抽出し、これを減圧濃縮によりメタ
ノールを除去した。この濃縮液５０mlを培養濾液と同様
の方法によって精製し、菌体より純粋なエポスタチンを
１．９mlを得た。

【００５１】上記のようにして得られた純粋なエポスタ
チンを用いて、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペ
クトル、水素核磁気共鳴スペクトル及び炭素核核磁気共
鳴スペクトルを測定した。エポスタチンの各種スペクト
ルは図１、図２、図３及び図４に示した通りである。

【００５２】エポスタチンの培養工程ならびに精製工程
中での追跡は、抗ジペプチジルペプチダーゼII活性の測
定に基づいて行った。その測定方法としては、前述した
試験例１で示すジペプチジルペプチダーゼII阻害活性の
測定法と同様の方法を用いた。

【図面の簡単な説明】

【図１】エポスタチンの１５μｇ／mlメタノール溶液の
紫外線吸収スペクトルを示す。

【図２】エポスタチンの臭化カリウム錠内で測定した赤
外線吸収スペクトルを示す。

【図３】エポスタチンの重ジメチルスルフォキシド中で
測定した５００ＭＨｚでの水素核核磁気共鳴スペクトル
を示す。

【図４】エポスタチンの重ジメチルスルフォキシド中で
測定した１２５ＭＨｚでの炭素核核磁気共鳴スペクトル
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 長縄 博 東京都大田区田園調布本町３番17号 (72)発明者 秋山 哲男 神奈川県横浜市青葉区恩田町1133番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式（Ｉ）： で表される化合物である生理活性物質エポスタチン、又
   はその薬学的に許容し得る塩又はエステル。
2. 【請求項２】 ストレプトミセス属に属するエポスタチ
   ン生産菌を栄養培地中で培養し、その培養物から次式
   （Ｉ）： で表されるエポスタチンを採取することを特徴とする、
   生理活性物質エポスタチンの製造法。
3. 【請求項３】 次式（Ｉ）： で表されるエポスタチンまたはその薬学的に許容し得る
   塩又はエステルを有効成分とする、ジペプチジルペプチ
   ダーゼII阻害剤。