JPH10251262A - プロテアーゼ阻害物質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）由
来のプロテアーゼを阻害する化合物の提供。 【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で示される化合物また
はそれらの医薬として許容される塩。 【化１】 （但し、式中Ｒは、式 【化２】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、スタキボトリス
（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属に属する微生物が生産
し、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）由来のプ
ロテアーゼを阻害する化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】レトロウイルスの一種であるＨＩＶは、
後天性免疫不全症候群（Ａｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ
Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤ
Ｓ）を引き起こすウイルスである。ＨＩＶに関する研究
の進展に伴い、本ウイルスに特異的な酵素群があること
が明らかとなり、それらの酵素活性に対する阻害作用を
ターゲットとした抗ＨＩＶ薬の開発が行われている。こ
れらの酵素群の一つであるＨＩＶプロテアーゼは、ＨＩ
Ｖの成熟感染に必須な酵素で、既にその構造は解明さ
れ、酸性プロテアーゼに属することなどが明らかとなっ
ている。また、その阻害物質が抗ＨＩＶ薬として開発さ
れているが、耐性を獲得するウイルスが出現しており、
新たな抗ＨＩＶ薬の開発が望まれている（Ａ．Ｍｏｌｌ
ａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
２，７６０（１９９６））。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＨＩＶプロ
テアーゼ阻害活性を有する新規な化合物、それらの製造
方法、それらを有効成分とするＨＩＶプロテアーゼ阻害
剤およびそれらの化合物を生産する能力を有する新規な
微生物を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、各地の土壌から微生物を分離し、その
生産する代謝産物について研究を重ねた結果、新たに分
離したスタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属
に属する微生物が、ＨＩＶプロテアーゼ阻害活性を示す
物質を培養液中に生産していることを見出した。その培
養液から有効物質を分離精製し、その物理化学的性質を
調べたところ、得られた有効物質は、いかなる既知物質
とも相違し、かつ優れたＨＩＶプロテアーゼ阻害作用を
有することを見出し、本発明を完成した。

【０００５】本発明により提供されるＨＩＶプロテアー
ゼ阻害活性を示す新規物質は、下記一般式（Ｉ）で示さ
れる化合物である。

【化１０】 （但し、式中Ｒは、式

【化１１】 、式

【化１２】 、式

【化１３】 または式

【化１４】 を表す）

【０００６】本発明者らは、一般式（Ｉ）で示される化
合物のうち、下記式（Ｉ−ａ）、式（Ｉ−ｂ）、式（Ｉ
−ｃ）および式（Ｉ−ｄ）で示される化合物をそれぞれ
Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ａ、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｂ、Ｍ
ｅｒ−ＶＧＦ７２４ＣおよびＭｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｄと
命名した。以後、本明細書においてこれらの化合物は上
記名称を用いて説明する。また、これらの化合物全体を
総称する場合、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群の名称を用
いて説明する。

【０００７】

【化１５】

【０００８】

【化１６】

【０００９】

【化１７】

【００１０】

【化１８】

【００１１】なお、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群は、コ
レステロール合成酵素阻害剤として報告されたＦ１８３
９−Ｅ物質またはＦ１８３９−Ｆ物質と構造上の類似性
を有している（Ｋ．Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４
８，４４７（１９９５））。しかしながらＭｅｒ−ＶＧ
Ｆ７２４物質群は、後述するとおり、その分子式、物理
化学的性質および構造上の特徴によって、既知の化合物
Ｆ１８３９−Ｅ物質またはＦ１８３９−Ｆ物質とは区別
される新規物質である。

【００１２】さらに本発明は、スタキボトリス（Ｓｔａ
ｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属に属し、ＨＩＶプロテアーゼ阻
害活性を示すＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群を生産する能
力を有する微生物を培養し、培養物から該物質群を採取
する該物質群の製造方法、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群
を有効成分とするＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、並びにＭ
ｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群を生産する能力をもつスタキ
ボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属に属する微生
物を提供するものである。

【００１３】本発明に使用される微生物は、スタキボト
リス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属に属し、Ｍｅｒ−
ＶＧＦ７２４物質群を生産する能力を有する菌株であれ
ばよい。例えば、熊本県本渡市の土壌から分離されたス
タキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属に属する
Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４株を挙げることができるが、この
菌株に限らず、スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒ
ｙｓ）属に属し、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群を生産す
る能力を有する菌株であれば、それらの変異株、例え
ば、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理に
より取得できる人工変異株ならびに自然変異株も含めて
すべて本発明に使用することができる。

【００１４】Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４菌株の菌学的性状は
次のとおりである。菌糸は基層の上をはって広がり、隔
壁があり、分岐し、透明またはわずかに色がある。分生
子柄は菌糸の分岐として生じ、直立し、さまざまに分岐
し、隔壁があり、主要な茎の先端に存在する。分生子柄
は分岐して、隔壁のない梗子となる。分生子は単独に梗
子の上に生じ、黒くて粗面である。

【００１５】以上の菌学的性状からＭｅｒ−ＶＧＦ７２
４菌株は不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎ
ａ）に属するカビであり、Ｊ．Ａ．ｖｏｎ Ａｒｘ“Ｔ
ｈｅＧｅｎｅｒａ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ Ｓｐｏｒｕｌａ
ｔｉｎｇ ｉｎ ＰｕｒｅＣｕｌｔｕｒｅ”１９７４お
よびＪ．Ｃ．Ｇｉｌｍａｎ“Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｓｏｉｌ Ｆｕｎｇｉ”１９５７に従い、既知の菌種と
比較したところ、スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔ
ｒｙｓ）属の性状と一致した。そこで、本発明者らは、
本菌株をスタキボトリス・エスピー（Ｓｔａｃｈｙｂｏ
ｔｒｙｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４と命名した。
本菌株は、平成８年９月６日付けで工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８３８として寄託
されている。

【００１６】本発明のＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群は上
記菌株を栄養培地に接種し、好気的に培養することによ
り製造される。上記菌株の培養方法は、原則的には一般
微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振
とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で行うのが
好適である。

【００１７】培養に用いることのできる培地としては、
スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）属に属す
る微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよ
く、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれ
も用いることができる。培地組成としては、例えば、炭
素源として、グルコース、シュークロース、水あめ、糖
みつ、デキストリン、澱粉、グリセロール、動物油、植
物油などを単独または組み合わせて使用することがで
き、また窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーンス
ティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、尿素、硫酸アンモニウムなどを単独または組み合
わせて使用することができる。また必要に応じて、塩化
ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン
酸塩、金属塩などの無機塩を加えることができる。その
他、本菌株の生育あるいはＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群
の生産を促進する有機物、例えば、ビタミン類、アミノ
酸類を加えることができる。さらに必要に応じて、消泡
剤、例えば、アデカノール（商品名：旭電化工業（株）
製）、シリコンなどを添加することができる。

【００１８】培養条件は、上記菌株が良好に生育してＭ
ｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群を生産し得る範囲内で適宜選
択すればよい。例えば、培地のｐＨは、６〜８程度、通
常中性付近とすることが好ましい。培養温度は、微生物
が良好に生育する温度、通常１５〜３０℃、好ましくは
２５〜２８℃に保つのがよい。培養時間は、２〜１０日
間程度でよく、好ましくは３〜５日間である。もちろん
上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、
外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応じて
上記範囲から最適条件を選択、調整できる。その際、培
養液中のＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群の蓄積量が最大に
なったときに培養を停止して得た培養液を以下の精製工
程に使用すればよい。

【００１９】このようにして得た培養液中に蓄積された
Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群は、培養後、濾過、遠心分
離等の一般的固液分離手段によって菌体を分離し、濾液
または上澄液から回収可能である。また分離した菌体か
らも回収可能である。

【００２０】Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群の分離、精製
は、公知の種々の方法を選択、組み合わせて行うことが
できる。例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用い
た溶媒抽出や、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド
・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学
（株）製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカゲル、
アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグ
ラフィーによる方法を用いることができる。これらの担
体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質
によって異なるが、一例として、ポリスチレン系吸着樹
脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水
アセトン等を用いることができる。さらにセファデック
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ファルマシア社
製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等に
よるゲル濾過、シリカゲル、アルミナ等による薄層クロ
マトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取
用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用
いることができ、これらの方法を単独または適宜組み合
せて、場合によっては反復使用することにより、分離、
精製することができる。また、分離した菌体からは、適
当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出
法により菌体から抽出し上記と同様に単離精製すること
ができる。

【００２１】以上のようにして得られるＭｅｒ−ＶＧＦ
７２４物質群は以下に示す物理化学的性質を有する。 （Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ａの物理化学的性質） （１）色および形状：白色粉末。 （２）酸性、塩基性、中性の区別：酸性 （３）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₃₇ＮＯ₉ （４）マススペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ、マトリック
ス：ＮＢＡ） ｍ／ｚ ５３２．２５２５［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（理論値は
分子式をＣ₂₈Ｈ₃₇ＮＯ₉として５３２．２５４７） （５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した
結果は下記のとおりである。 λｍａｘ（ｎｍ）：２１８、２６５、３００ （６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：特徴的な吸
収は、下記のとおりである。 νｍａｘ（ｃｍ^-1）：３２１５、２９４０、１７１７、
１６６５、１６２０、１４７０、１３９５、１３５０、
１２００、１０８６、１０４６ （７）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに溶
け、アセトンにやや溶け、水に溶けない。 （８）呈色反応：リンモリブデン酸試薬、ヨウ素蒸気で
呈色する。ニンヒドリン試薬には呈色しない。 （９）薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ値：シリカゲルプ
レートＦ−２５４（メルク社製）） ０．２４（クロロホルム：メタノール：酢酸＝３：１：
０．１）

【００２２】（１０）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００
ＭＨｚ、重アセトン）：主要なシグナルは、下記のとお
りである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６
Ｈｚ）、０．８９（３Ｈ，ｓ）、１．０３（３Ｈ，
ｓ）、１．０８（３Ｈ，ｓ）、１．３１（１Ｈ，ｂｒ
ｄ）、１．４〜１．７（４Ｈ，ｍ）、１．７７（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、１．８７（１Ｈ，ｍ）、２．
１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）、２．２６（１Ｈ，
ｍ）、２．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、２．４
９（１Ｈ，ｍ）、２．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．９Ｈ
ｚ）、３．３０（１Ｈ，ｄ，１６．９）、３．３１（１
Ｈ，ｂｒｓ）、３．９５（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．
７Ｈｚ）、４．４０（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１６．０Ｈ
ｚ）、５．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，１１．０Ｈ
ｚ）、６．７４（１Ｈ，ｓ）

【００２３】（１１）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００
ＭＨｚ、重アセトン）：主要なシグナルは、下記のとお
りである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１５．９（ｑ）、１７．４
（ｑ）、２１．４（ｔ）、２２．４（ｑ）、２５．５
（ｔ）、２９．２（ｑ）、３０．８（ｔ）、３１．８
（ｔ）、３２．８（ｔ）、３３．８（ｔ）、３７．６
（ｄ）、３８．９（ｓ）、４０．１（ｄ）、４４．１
（ｓ）、４４．８（ｔ）、５４．０（ｄ）、６６．４
（ｄ）、７９．１（ｄ）、９８．９（ｓ）、１０２．１
（ｄ）、１１４．３（ｓ）、１１７．９（ｓ）、１３
４．８（ｓ）、１５４．６（ｓ）、１５７．２（ｓ）、
１６９．５（ｓ）、１７２．５（ｓ）、１７３．７
（ｓ）

【００２４】（Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｂの物理化学的性
質） （１）色および形状：白色粉末。 （２）酸性、塩基性、中性の区別：酸性 （３）分子式：Ｃ₂₇Ｈ₃₇ＮＯ₇ （４）マススペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ，マトリック
ス：ＮＢＡ） ｍ／ｚ ４８８．２６５３［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（理論値は
分子式をＣ₂₇Ｈ₃₇ＮＯ₇として４８８．２６４８） （５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した
結果は下記のとおりである。 λｍａｘ（ｎｍ）：２１８、２６４、３０１ （６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：特徴的な吸
収は、下記のとおりである。 νｍａｘ（ｃｍ^-1）：３４０３、２９４０、１７１１、
１６６３、１４７０、１３９１、１３４８、１２６４、
１０７６、１０４６ （７）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノール、ア
セトンに溶け、水に溶けない。 （８）呈色反応：リンモリブデン酸試薬、ヨウ素蒸気で
呈色する。ニンヒドリン試薬には呈色しない。 （９）薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ値：シリカゲルプ
レートＦ−２５４（メルク社製）） ０．７２（クロロホルム：メタノール：酢酸＝３：１：
０．１）

【００２５】（１０）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００
ＭＨｚ、重アセトン）：主要なシグナルは、下記のとお
りである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６
Ｈｚ）、０．８９（３Ｈ，ｓ）、１．０４（３Ｈ，
ｓ）、１．０８（３Ｈ，ｓ）、１．２９（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝４．４Ｈｚ，１１．７Ｈｚ）、１．４〜１．７（４
Ｈ，ｍ）、１．７５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、
１．８７（１Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、２．１
５（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、２．３６
（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．８８（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１６．９Ｈｚ）、３．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．
９Ｈｚ）、３．２８（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、３．６２（２
Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８，７．３Ｈｚ）、３．９７（１Ｈ，
ｍ）、４．３０（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ）、
６．７３（１Ｈ，ｓ）

【００２６】（１１）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００
ＭＨｚ、重アセトン）：主要なシグナルは、下記のとお
りである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１５．９（ｑ），１７．３
（ｑ），２１．４（ｔ），２２．４（ｑ），２４．６
（ｔ），２９．２（ｑ），３１．６（ｔ），３１．９
（ｔ），３２．７（ｔ），３３．８（ｔ），３７．５
（ｄ），３８．９（ｓ），４０．０（ｄ），４２．４
（ｔ），４４．１（ｓ），４７．７（ｔ），６６．４
（ｄ），７９．２（ｄ），９８．８（ｓ），１０２．０
（ｄ），１１３．７（ｓ），１１７．５（ｓ），１３
５．６（ｓ），１５４．６（ｓ），１５７．１（ｓ），
１６９．１（ｓ），１７４．１（ｓ）

【００２７】（Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｃの物理化学的性
質） （１）色および形状：白色粉末 （２）酸性、塩基性、中性の区別：酸性 （３）分子式：Ｃ₂₅Ｈ₃₃ＮＯ₇ （４）マススペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ，マトリック
ス：ＮＢＡ） ｍ／ｚ ４６０．２３５２［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（理論値は
分子式をＣ₂₅Ｈ₃₃ＮＯ₇として４６０．２３３５） （５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した
結果は下記のとおりである。 λｍａｘ（ｎｍ）：２１８、２６５、２９９ （６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：特徴的な吸
収は、下記のとおりである。 νｍａｘ（ｃｍ^-1）：３４２２、２９３６、１６６７、
１６２０、１４７０、１３８９、１３４８、１２６２、
１０７４、１０４６ （７）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに溶
け、アセトンにやや溶け、水に溶けない。 （８）呈色反応：リンモリブデン酸試薬、ヨウ素蒸気で
呈色する。ニンヒドリン試薬には呈色しない。 （９）薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ値：シリカゲルプ
レートＦ−２５４（メルク社製）） ０．３３（クロロホルム：メタノール：酢酸＝３：１：
０．１）

【００２８】（１０）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００
ＭＨｚ、重メタノール）：主要なシグナルは、下記のと
おりである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．７５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６
Ｈｚ）、０．９１（３Ｈ，ｓ）、１．０３（３Ｈ，
ｓ）、１．０９（３Ｈ，ｓ）、１．３２（１Ｈ，ｂｒ
ｄ）、１．４〜１．７（４Ｈ，ｍ）、１．７７（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ）、１．８７（１Ｈ，ｍ）、２．
０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）、２．９０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ）、３．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
６．８Ｈｚ）、３．３１（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、３．９５
（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ）、４．３１（２
Ｈ，ｓ）、４．４６（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１６．９Ｈ
ｚ）、６．６９（１Ｈ，ｓ）

【００２９】（１１）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００
ＭＨｚ、重メタノール）：主要なシグナルは、下記のと
おりである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１５．９（ｑ）、１７．５
（ｑ）、２１．９（ｔ）、２２．６（ｑ）、２９．３
（ｑ）、３２．２（ｔ）、３３．２（ｔ）、３４．０
（ｔ）、３８．１（ｄ）、３９．５（ｓ）、４０．８
（ｄ）、４４．７（ｔ）、４５．２（ｓ）、４９．０
（ｔ）、６７．３（ｄ）、７９．８（ｄ）、９９．５
（ｓ）、１０２．４（ｄ）、１１４．８（ｓ）、１１
９．０（ｓ）、１３４．６（ｓ）、１５５．３（ｓ）、
１５７．５（ｓ）、１７１．５（ｓ）、１７３．０
（ｓ）

【００３０】（Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｄの物理化学的性
質） （１）色および形状：白色粉末 （２）酸性、塩基性、中性の区別：酸性 （３）分子式：Ｃ₂₆Ｈ₃₅ＮＯ₇ （４）マススペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ，マトリック
ス：グリセリン） ｍ／ｚ ４７４．２４７２ ［（Ｍ＋Ｈ）＋］（理論値
は分子式をＣ₂₈Ｈ₃₇ＮＯ₉として４７４．２４９２） （５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した
結果は下記のとおりである。 λｍａｘ（ｎｍ）：２１８、２６５、３０１ （６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：特徴的な吸
収は、下記のとおりである。 νｍａｘ（ｃｍ^-1）：３４２３、２９３９、１６６３、
１４７０、１４２０、１３９１、１３４８、１２２７、
１１２８、１０８６、１０４５ （７）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに溶
け、アセトンにやや溶け、水に溶けない。 （８）呈色反応：リンモリブデン酸試薬、ヨウ素蒸気で
呈色する。ニンヒドリン試薬には呈色しない。 （９）薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ値：シリカゲルプ
レートＦ−２５４（メルク社製）） ０．３７（クロロホルム：メタノール：酢酸＝３：１：
０．１）

【００３１】（１０）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００
ＭＨｚ、重アセトン）：主要なシグナルは、下記のとお
りである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６
Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｓ），１．０４（３Ｈ，
ｓ），１．０８（３Ｈ，ｓ），１．３１（１Ｈ，ｄｄ，
４．４，１２．１），１．４〜１．７（４Ｈ，ｍ），
１．６１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．７７（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），１．８７（１Ｈ，ｍ），
２．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），２．９０（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．９Ｈｚ），３．３０（１Ｈ，ｄ，１
６．９Ｈｚ），３．３２（１Ｈ，ｂｒ ｓ），３．９７
（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．３９（２
Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，
ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．７５（１Ｈ，ｓ）

【００３２】（１１）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００
ＭＨｚ、重アセトン）：主要なシグナルは、下記のとお
りである。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１５．９（ｑ），１５．９
（ｑ），１７．４（ｑ），２１．５（ｔ），２２．５
（ｑ），２９．２（ｑ），３１．９（ｔ），３２．８
（ｔ），３３．９（ｔ），３７．７（ｄ），３８．９
（ｓ），４０．１（ｄ），４４．１（ｓ），４４．７
（ｔ），５０．１（ｄ），６６．４（ｄ），７９．１
（ｄ），９９．０（ｓ），１０２．１（ｄ），１１４．
２（ｓ），１１７．８（ｓ），１３５．１（ｓ），１５
４．７（ｓ），１５７．３（ｓ），１６９．０（ｓ），
１７３．５（ｓ）

【００３３】本発明のＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群は、
大腸菌で発現させたＨＩＶプロテアーゼ活性を低濃度で
抑制し、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として有用である。 （ＨＩＶプロテアーゼに対する阻害作用）試験試料４μ
ｌに基質溶液（終濃度が各々基質１ｍｇ／ｍｌ、５０ｍ
Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ
６．０）、２Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
ｍＭジチオスレイトール、０．１％トリトンＸ−１とな
るように調製）を加えた。さらに約０．２ＵのＨＩＶプ
ロテアーゼ粗酵素液を添加し合計４０μｌとし、３７
℃、２０分間の反応させた。次いで沸騰水中で３分間加
熱し、酵素を失活させ、さらに０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を８０μｌ加えた。遠心後、高
速液体クロマトグラフィー反応液中の基質濃度を分析
し、その減少量から酵素活性を算出した。このとき基質
は、合成ペプチドＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌを使用した。また、使用
したＨＩＶプロテアーゼは、遺伝子操作により得られた
もの、すなわち、ｐＫＰ１５００のプロモーター下流に
合成ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子を挿入することにより得
られたベクターｐＭＡＫ１０５を宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
Ｐ３９９８に導入して得られる形質転換株により生産さ
れたものである（Ｔ．Ｍｉｋｉｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４，３２７（１９８
７））。なお、ＨＩＶプロテアーゼの酵素単位（Ｕ）
は、１分間当たり１ｎｍｏｌの基質を分解する酵素量で
ある。

【００３４】また高速液体クロマトグラフィーは、逆相
系カラム（ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔ（東ソー
（株）製））を使用し、移動相として２１％アセトニト
リル水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を用い、２
１０ｎｍの吸収でペプチド基質を検出した。本条件下
で、基質は５〜６分付近に、また酵素による分解産物は
それより以前に溶出された。クロマトグラム上の基質の
ピーク面積を測定し、以下の式に従い酵素阻害度（％）
を算出した。

【００３５】［１−（試料添加時の酵素による基質ピー
ク面積減少量／試料無添加時の酵素による基質ピーク面
積減少量）］×１００（％）

【００３６】本発明のＭｅｒ−ＶＧＦ７２４Ａ、Ｍｅｒ
−ＶＧＦ７２４Ｂ、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４ＣおよびＭｅ
ｒ−ＶＧＦ７２４Ｄの１００μｇ／ｍｌにおけるＨＩＶ
プロテアーゼ阻害度は、それぞれ３０％、３５％、４１
％および３９％であった。

【００３７】以上述べたとおり、一般式（Ｉ）で示され
る本発明のＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群は、ＨＩＶプロ
テアーゼによる合成ペプチドの加水分解を低濃度で抑制
するので、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群およびそれらの
医薬として許容される塩を含む医薬製剤は、ＨＩＶが原
因となって引き起される疾患すなわち後天性免疫不全症
候群に対する治療に適用されることが期待される。

【００３８】またその際にＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群
の医薬として許容される塩としては、慣用の無毒性塩
類、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金
属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土
類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、例え
ばトリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタ
ノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘ
キシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミ
ン塩、ジベンジルアミン塩などの有機塩基との塩などを
挙げることができる。

【００３９】Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群およびそれら
の医薬として許容される塩は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害
剤として有用であり、その医薬製剤は、公知の充填剤、
増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、表面活
性剤、滑沢剤等の希釈剤、あるいは賦形剤を用いて調製
することができる。この医薬製剤としては各種の形態が
その治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとし
て錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁シロップ剤、乳剤、顆
粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等
が挙げられる。

【００４０】錠剤の形態に成型するに際しては、担体と
して公知のものを広く使用でき、例えばラクトース、白
糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カ
ルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形
剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グル
コース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセ
ルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウ
ム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アル
ギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビ
タン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステ
アリン酸モノグリセリド、澱粉、ラクトース等の崩壊
剤、白糖、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、
第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の
吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、ラク
トース、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等
の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポ
リエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。

【００４１】さらに錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施
した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコ
ーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。丸
剤の形態に成型するに際しては、担体としてこの分野で
従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、ラ
クトース、澱粉、カカオバター、硬化植物油、カオリ
ン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント
末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン寒天
末などの崩壊剤等が例示できる。

【００４２】坐剤の形態に成型するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、ポリエ
チレングリコール、カカオバター高級アルコール、高級
アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド
等を挙げることができる。

【００４３】注射剤として調製される場合は、液剤及び
懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるものが好まし
く、これらの液剤、懸濁剤の形態に成型するに際して
は、希釈剤としてこの分野において慣用されるもの全て
を使用でき、例えば水、エタノール、プロピレングリコ
ール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキ
シ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソ
ルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。な
お、この場合等張性の溶液を調製するに十分な量の食
塩、グルコースあるいはグリセリンを該製剤中に含有さ
せてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤
等を用いてもよい。また経口投与用には必要に応じて着
色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を
該製剤中に含有させてもよい。

【００４４】本発明のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤に含有
されるべきＭｅｒ−ＶＧＦ７２４物質群およびそれらの
医薬として許容される塩の量は特に限定されず、広範囲
に選択される。その投与方法は、特に制限はなく、各種
製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程
度に応じた方法で投与される。例えば、錠剤、丸剤、液
剤、懸濁シロップ剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の
場合には経口投与される。また注射剤の場合には単独で
またはグルコース、アミノ酸などの通常の補液と混合し
て静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、
皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には
直腸内投与される。またその投与量は、用法、患者の年
齢、性別、その他の条件、疾患の程度等により適宜増減
することができる。

【００４５】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細
に説明する。

【実施例】

実施例１ 種母培地として、ポテト澱粉２．０％、グルコース１．
０％、大豆粉２．０％、リン酸第一カリウム０．１％、
硫酸マグネシウム（７水塩）０．０５％の組成からなる
培地を用い、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌず
つ分注して殺菌した。これにＭｅｒ−ＶＧＦ７２４菌株
の斜面培地（ポテトデキストロース寒天培地）から一白
金耳を接種し、２８℃で３日間回転振とう機上で培養し
て種母培養液を得た。生産培地として、種母培地と同様
の培地を用い、３０Ｌ容ジャーファメンター１基に１５
Ｌ入れて殺菌した。上記種母培養液をジャーファメンタ
ー中に１００ｍｌ接種し、２８℃で９６時間通気攪拌培
養（通気量７．５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌３００ｒｐｍ）を行
って培養液を得た。

【００４６】このようにして得られた培養液の一部３Ｌ
を濾過して上清を集め、ブタノールで抽出し、抽出液を
減圧下で濃縮乾固した。これを少量のメタノールに溶解
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（４００ｍｌ）の上
部に載せ、メタノールで展開し、活性画分を濃縮乾固し
て粗精製物１．３ｇを得た。次に粗精製物を少量のクロ
ロホルム−メタノール混液（クロロホルム：メタノール
＝１０：１）に溶解し、シリカゲル（Ａｒｔ７７３４
（メルク社製））カラム（２．０φ×４０ｃｍ）の上部
に載せクロロホルム−メタノール混液（クロロホルム：
メタノール＝１０：１、５：１、２：１）各５００ｍｌ
で段階的に溶出させた。クロロホルム：メタノール＝
５：１および２：１で溶出される活性画分を集め、濃縮
乾固した。次に少量のクロロホルム−メタノール−水混
液（クロロホルム：メタノール：水＝７：１３：８）に
溶解し、クロロホルム：メタノール：水＝７：１３：８
の下層を固定相とし、上層を移動相とする遠心液々分配
クロマトグラフィーで展開して活性画分を得た。活性画
分は減圧下に濃縮乾固して０．６ｇを得た。

【００４７】得られた濃縮乾固物のうち５０ｍｇをメタ
ノール０．５ｍｌに溶かし、分取用高速液体クロマトグ
ラフィーを下記の条件で行い、５回に分けて分取した。
保持時間２２．２分、３１．５分および２５．８分にピ
ークをもつ三つの活性物質Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ａ、Ｍ
ｅｒ−ＶＧＦ７２４ＢおよびＭｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｃを
分取した。分取した画分は減圧下にアセトニトリルを除
いた後、凍結乾燥してＭｅｒ−ＶＧＦ７２４Ａ、Ｍｅｒ
−ＶＧＦ７２４ＢおよびＭｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｃをそれ
ぞれ３．６ｍｇ、６．３ｍｇおよび２．４ｍｇ得た。

【００４８】（分取用高速液体クロマトグラフィー条
件）カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｐｒｅ
ｐ Ｃ１８（１．９φ×３０ｃｍ）、移動相；アセトニ
トリル：０．１％トリフルオロ酢酸＝３５：６５、流
速；１０．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２２０ｎｍ

【００４９】実施例２ 実施例１で調製したＭｅｒ−ＶＧＦ７２４菌株の培養液
の一部３Ｌを濾過して上清を集め、塩酸を加えてｐＨ
２．５に調整した。これに酢酸エチル３Ｌを加えてよく
攪拌した後、酢酸エチル層を分離した。これに無水硫酸
ナトリウムを加えて脱水した後、減圧濃縮した。得られ
た濃縮物１．１ｇを２０ｍｌのメタノールに溶解した後
シリカゲル１０ｇを添加して濃縮乾固した。乾固物をク
ロロホルム−メタノール−酢酸混液（クロロホルム：メ
タノール：酢酸＝２０：１：０．１）で平衡化したシリ
カゲル（Ａｒｔ７７３４（メルク社製））カラム（３．
０φ×３０ｃｍ）の上部に載せ、クロロホルム−メタノ
ール−酢酸混液（クロロホルム：メタノール：酢酸＝２
０：１：０．１、１０：１：０．１、５：１：０．１）
各６００ｍｌで段階的に溶出させた。クロロホルム：メ
タノール：酢酸＝１０：１：０．１および５：１：０．
１で溶出される活性画分を集め、濃縮乾固した。得られ
た乾固物３６５ｍｇを２ｍｌのアセトニトリル：０．１
％トリフルオロ酢酸＝３０：７０に溶かし、分取用高速
液体クロマトグラフィーを下記の条件で行い、分取し
た。保持時間１３０分にピークをもつ活性物質Ｍｅｒ−
ＶＧＦ７２４Ｄを含む画分を分取した。これを減圧下に
アセトニトリルを除き、凍結乾燥した。得られた乾燥物
１１．０ｍｇを２ｍｌのクロロホルム−メタノール混液
（クロロホルム：メタノール＝１：１）に溶解して同溶
液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム
（１．５φ×７２ｃｍ）に載せ、同溶液で展開し、Ｍｅ
ｒ−ＶＧＦ７２４Ｄを含む画分を分取した。これを濃縮
乾固して、Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２４Ｄを９．０ｍｇ得た。

【００５０】（分取用高速液体クロマトグラフィー条
件）カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｐｒｅ
ｐ Ｃ１８（１．９φ×３０ｃｍ）、移動相；アセトニ
トリル：０．１％トリフルオロ酢酸＝３０：７０、流
速；１０．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２６５ｎｍ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 吉岡 武男 神奈川県綾瀬市吉岡1782−10

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で示される化合物また
   はそれらの医薬として許容される塩。 【化１】 （但し、式中Ｒは、式 【化２】 、式 【化３】 、式 【化４】 または式 【化５】 を表す）
2. 【請求項２】 下記式（Ｉ−ａ）で示される化合物また
   はその医薬として許容される塩。 【化６】
3. 【請求項３】 下記式（Ｉ−ｂ）で示される化合物また
   はその医薬として許容される塩。 【化７】
4. 【請求項４】 下記式（Ｉ−ｃ）で示される化合物また
   はその医薬として許容される塩。 【化８】
5. 【請求項５】 下記式（Ｉ−ｄ）で示される化合物また
   はその医薬として許容される塩。 【化９】
6. 【請求項６】 スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒ
   ｙｓ）属に属し、請求項１〜５のいずれかに記載の化合
   物を生産する能力を有する微生物を培養して、培養物か
   ら請求項１〜５のいずれかに記載の化合物を採取するこ
   とを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化合物
   を製造する方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかに記載の化合物
   またはそれらの医薬として許容される塩からなる群より
   選択された一またはそれ以上の物質を有効成分とするＨ
   ＩＶプロテアーゼ阻害剤。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれかに記載の化合物
   を生産する能力を有するスタキボトリス・エスピー（Ｓ
   ｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−ＶＧＦ７２
   ４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５８３８）。