JPH0817694B2 - アベルメクチンの生産法およびそのための培養法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性およ
び／または分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を
欠くストレプトミセス アベルミチリス株、該S. アベルミ
チリスを生産する方法、および天然および非天然アベル
ミチリス製造へのS.アベルミチリスの使用に関する。

米国特許第4,310,519および4429,042号はアベルメク
チル、強力な駆虫活性を持つ関連薬剤複合体、およびス
トレプトミセスアベルミチリス株いわゆるS. アベルミチ
リスATCC31267、31271および31272、の好気的発酵によ
るそれらの製造について記述している。列挙されたうち
後の２種類の株はS. アベルミチリスATCC31267の紫外線
照射によつて得られる培養物のそれぞれ凍結バイアルお
よび凍結乾燥チユーブを意味する。

1987年３月18日付で発行された欧州特許第214,731号
（1986年７月16日付で出願された米国特許出願番号第88
6,867号の副本である）は天然または既知のアベルメク
チンに関連するが、25位に新規な置換基を持つ（本明細
書では非天然アベルメクチンと帰属される）多数の化合
物およびある種の特別なカルボン酸またはその誘導体や
前駆体の存在下に、アベルメクチン生産生物体を発酵さ
せることによる製造方法を開示している。該新規Ｃ−25
置換アベルメクチンを生産するのに用いたS. アベルミチ
リス生物体はS. アベルミチリスATCC31267、31271、3127
2およびNCIB12121である。欧州特許第214,731号に記述
された後者の生物体はS. アベルミチリスATCC31271から
誘導される。半規定培地で培養すると、新規のＣ−25置
換アベルメクチンの収率が改良される。各ATCC31267、3
1271、31272およびNCIB12121は新規のＣ−25置換誘導体
に加えて、種々の量の既知または天然のアベルメクチン
〔25−置換基はイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチ
ル（１−メチルプロピル）である〕をも生産し得る。

〔以下の式（Ｉ）に記述した〕アベルメクチンの炭素
骨格はアセテートとプロピオテートとから誘導され、天
然のアベルメクチンのＣ−25置換基はＬ−イソロイシン
（Ｒ＝（Ｓ）−sec−ブチル）またはＬ−バリン（Ｒ＝
イソプロピル）から誘導される〔フイツシヤー（Fishe
r）とムロジツク（Mrozik）、「マクロライド抗生物質
（Macrolide Antibiotics）」アカデミツクプレス（Aca
demic Press）（1984）、14章〕。

“既知”または“天然”のアベルメクチンとは、25位
置換基がイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル（１
−メチルプロピル）のいずれかであるS. アベルミチリス
ATCC31267、ATCC31271およびATCC31272によつて生産さ
れるアベルメクチンを意味する。25−位置換基がイソプ
ロピルまたはsec−ブチル（Ｓ−型）以外のものである
アベルメクチンは本明細書では新規または非天然アベル
メクチンと称する。

上述の米国特許に列挙したS.アベルメクチン株は一般
にＣ−076と記述される一群の物質を生産する、その群
はＣ−076A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2aおよびB2
bと記述される８種の異なるが密接に関連した化合物か
らなる。“a"系の化合物は25−置換基が（Ｓ）−sec−
ブチルである天然のアベルメクチンを指し、“b"系の化
合物は25−置換基がイソプロピルである天然のアベルメ
クチンを指す。名称“A"および“B"はそれぞれ５−置換
基がメトキシまたはヒドロキシであるアベルメクチンを
指す。最後に数字の“1"は二重結合が22-23位に存在す
るアベルメクチンを指し、数字の“2"は22位に水素、23
位にヒドロキシを持つアベルメクチンを指す。

本出願では、非天然アベルメクチンの25位に関して、
このような識別名を使用しない。識別名A1、A2、B1およ
びB2は上記のような天然アベルメクチンの構造に相当す
る構造式を持つ非天然アベルメクチンを参照するために
は保持されている。

分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ活性欠乏突然変異
株の発生はバチルス スブチリス（Bacillus subtilis）
〔ウイレツク（Willecke）およびパーディー（Parde
e）、ジヤーナルオブバイオロジカルケミストリー（J.B
iol.Chem.）246 5264-72（1971）〕およびプソイドモナ
ス プチダ（Psendomonas putida）〔マーチン（Martin）
ら、ジヤーナルオブバクテリオロジー（J.Bacteriolog
y）115,198-204（1973）〕では報告されているがストレ
プトミセスでは報告されていない。

実際上アベルメクチンアグリコンA1aおよびA2aのみを
生産する突然変異株、S. アベルミチリスAgly−１はシユ
ルマン（Schulman）らによりジヤーナルオブアンチバイ
オテイツクス（J.Antibiot）38（11）、1494-1498（198
5）に報告されている。その報告ではシンフンギン（Sin
efungin）存在下でS.アベルミチリスAgly−１を発酵す
るとアベルメクチンアグリコンＢ成分の生産が増加し
た。同様にＯ−メチルトランスフエラーゼ阻害剤として
のシンフンギンの存在下でアベルメクチン高生産株S.ア
ベルミチリス08を発酵すると、Ｃ−５のアグリコンおよ
びオレアンドローズ二糖類部分にＯ−メチル基を欠くア
ベルメクチンが生産された。

米国特許第4,378,353号はＣ−076関連化合物およびS.
アベルミチリスATCC31272を紫外線照射して得られる突
然変異株MA-5218の培養によるＣ−076関連化合物の生産
を記述している。その突然変異株はATCC31780とされて
いる。該突然変異株によつて生産されるＣ−076関連化
合物はＣ−076フラン環を欠く。更に報告された化合物
のあるものではオレアンドローズ糖成分の一方または両
方が開裂されており、他のものは５位の基はケト基に酸
化されていた。

Ｏ−メチル基を欠くアベルメクチンを生産するS.アベ
ルミチリスの３群のＯ−メチルトランスフエラーゼ突然
変異株は1985年８月25-30日にハンガリーのデブレセン
で開催された「アクチノミセス菌の生物学（Biology of
Actinomycetes）」についての第６回国際シンポジュウ
ムにおいてラビー（Ruby）らによりおよびシユルマン
（Schulman）らによりアンチミクロバイアルエージエン
ツアンドケミセラピー（Antimicrobial Agents and Che
motherapy）31,744−７（1987）に報告されている。第
１群は大環状ラクトン環のＣ−５水酸基をメチル化でき
ないためアベルメクチンＢを主に生産する。第２群は
３′−O,3″−Ｏ−ビス−デメチルアベルメクチン（両
方のオレアンドローズ−糖類残基の３位にＯ−メチル置
換基を欠くアベルメクチン）を生産し、デメチルアベル
メクチンと呼ばれる。第３群はいかなる位置をもメチル
化できない。

シユルマンらはフエデレーシヨンプロシーデイング
（Fed.Proc.）44,931（1985）に酵素アベルメクチンＢ
−Ｏ−メチルトランスフエラーゼによるアグリコン部分
のＣ−５水酸基のメチル化を阻害するＳ−アデノシルエ
チオニンおよびＳ−アデノシルホモシステインといつた
シンフンギンのような物質の存在下でS.アベルミチリス
を発酵することによつてアベルメクチンＢの生産が増加
することを開示している。Ｏ−メチルトランスフエラー
ゼ活性を欠き、アベルメクチンＢ成分の収量を増加する
ストレプトミセスアベルミチリスもシユルマンらにより
開示されており、アンチミクロバイアルエージエンツア
ンドケモセラピー29,620-624（1986）に引用されてい
る。

S.アベルミチリスの突然変異誘発により分枝鎖２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性または分枝鎖アミノ酸活性
を欠く突然変異体が生産される。このようにして生産さ
れた一方だけブロツクされた突然変異の突然変異誘発に
より分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性および分
枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性の両方を欠く突然
変異体が生産される。この天然変異体はＲがイソプロピ
ルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである化合物RCOOHまたは
発酵工程中にRCOOHに変換できる化合物を添加しない
と、天然アベルメクチンを大量に生産する能力をもはや
持つていない。しかしながら驚くべきことにかつ予想と
は異なり、その突然変異体はＲがイソプロピルまたは
（Ｓ）−sec−ブチル、または本明細書で開示した他の
基を持つ化合物RCOOH、またはそのRCOOHへの前駆体を添
加して発酵すると、天然および非天然アベルメクチンを
生産することが見い出された。分枝鎖２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼ活性のみを欠く本明細書に記述された突然
変異体およびＬ−イソロイシンまたはＬ−バリンを分解
できない本明細書に記述された突然変異体が天然アベル
メクチンの存在しない非天然アベルメクチンを生産する
ことでアベルメクチン生合成経路に広範囲の化合物を同
化できることはより一層驚くべきことである。

本明細書に記述されたＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシ
ンまたはＬ−バリンを分解できず、増殖するためにはこ
れら３種類のアミノ酸を必要とする分枝鎖アミノ酸トラ
ンスアミナーゼ欠乏突然変異体も天然アベルメクチンの
存在しない非天然アベルメクチンを生産するため、他の
化合物を同化できるという発見は少なくとも驚くべきこ
とである。

記述したように、天然アベルメクチンは８種の異なる
が密接に関連した化合物〔式（Ｉ）、Ｒ＝イソプロピル
および（Ｓ）−sec−ブチル〕の複雑な混合物として生
産される。それらは実質上純粋な形で回収される（米国
特許第4,429,042号参照）が、その方法論は、良くても
手間が掛かるものである。欧州特許第214,731号に記述
された方法による非天然アベルメクチンの生産は、その
生産に使用されるS.アベルミチリス微生物の細胞中の分
枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよびアミノ酸（Ｌ
−バリンおよびＬ−イソロイシン）の存在によつて種々
の量の天然アベルメクチンも生産するかも知れない。

生成物の数や複雑さを最小にし、選択したアベルメク
チンの純度を増すように、天然または非天然アベルメク
チンのいずれかを生産するための選択力およびそれによ
る分離操作の簡略化が望ましい目的である。

分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性または分枝
鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性を欠くS.アベルミチ
リス株はS.アベルミチリスのアベルメクチンの産生株の
突然変異、特にS.アベルミチリスATCC31267、ATCC3127
1、ATCC31272またはNCIB12121の突然変異によつて生産
される。それらの欠乏株のいずれかを更に突然変異させ
ると両方の活性の欠乏した株が生ずる。イソプロピルま
たはsec−ブチル（Ｓ−形）の付いた脂肪酸またはその
前駆体が発酵する際の培地に添加される場合を除いて、
その突然変異体は天然アベルメクチンを合成できない。
適当な原料酸または発酵工程中にそれに変換できる化合
物を含む水性栄養培地中、好気的条件下で発酵すると天
然および非天然アベルメクチンが生産できる。

分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損を特
徴とするそれらの突然変異体は¹⁴CO₂定量によつて、そ
の突然変異を起こしたコロニーから単離される。この方
法では、コロニーを透過することによる〔¹⁴Ｃ−１〕−
２−オキソイソカプロン酸や〔¹⁴Ｃ−１〕−２−オキソ
−３−メチル吉草酸または〔¹⁴Ｃ−１〕−２−オキソ−
３−メチル酪酸という基質からの¹⁴CO₂放出の欠除が分
枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性欠損を示す。

アミノ酸トランスアミナーゼ活性の欠損を特徴とする
それらの突然変異体はＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン
およびＬ−バリンを欠く培地における増殖不能を基にし
て突然変異を起こしたコロニーから選択する。実際に
は、カザアミノ酸に見られる個々のアミノ酸全てを添加
したM9塩グルコースを基にした寒天培地で増殖する個々
のコロニーをＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ
−バリンを欠く同様の培地に移す。分枝鎖アミノ酸トラ
ンスアミナーゼ活性のみが欠損した本明細書に記述した
突然変異体はアベルメクチンの生産への前駆体として２
−オキソ酸を使用することができる。

分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび／または
分枝鎖アミノ酸トランスアミアーゼ活性を欠く本明細書
に記述された突然変異体がアベルメクチン、特に非天然
アベルメクチンを生産する能力を保持することは驚くべ
きことであり、予想外のことであつた。通常の培地で増
殖した時、天然脂肪族アシル補酵素Ａ誘導体を生産する
能力のない突然変異体は、もし膜の完全性が該誘導体に
依存したり、前者の誘導体による２−オキソ酸の蓄積が
細胞毒性を引き起こすならば致死的突然変異となり得
る。更に突然変異体が失なつた酵素活性を必要とする場
合、どちらの突然変異体もＬ−イソロイシンおよびＬ−
バリン分解的代謝からアセチルCoAおよびプロピオニルC
oAを合成できるとは予想されなかつた。上述のようにア
ベルメクチン生合成にこれらのアシルCoA誘導体を必要
とすることから、それら突然変異体は非天然アベルメク
チンの産生が厳しく損傷されるのではないかと予想され
たが、驚くべきことにそうではなかつた。

本明細書に記述される突然変異体における分枝鎖２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損はＬ−イソロイシ
ン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリンの分解からの分枝鎖
脂肪族アシルCoA合成の阻害およびそれによる天然アベ
ルメクチンの合成阻害を起こす。同様の方法で、S.アベ
ルミチリスの分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ欠損突
然変異体も分枝鎖脂肪族アシルCoA合成についてこの特
徴ある欠損を持ち、それ故天然アベルメクチンの生産能
を欠く。この脂肪族アシルCoAの欠除は２つの理由によ
る。第１は、このようなトランスアミナーゼ欠損突然変
異体は通常のアミノ基転移経路を経て培地から供給され
るイソロイシン、ロイシンおよびバリンから分枝鎖２−
オキソ酸を合成することができない。第２にこれらのト
ランスアミナーゼ突然変異体では、細胞の分枝鎖アミノ
酸生合成経路による分枝鎖２−オキソ酸生産が発酵増殖
培地中にこれらのアミノ酸を含むことが必須であるので
妨害される。これらのアミノ酸が存在すると、良く知ら
れた酵素抑制やこれらのアミノ酸の経路の最終産物によ
るフイードバツク阻害により、この生合成経路（および
中間体２−オキソ酸の産生）の測定が阻害される。活性
な分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ酵素の基質であ
るこれらの２−オキソ酸が利用できないと分枝鎖脂肪族
アシルCoA合成が硬化的に阻害される。従つて本発明は
このような２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠損やトラン
スアミナーゼ−欠損突然変異体、および、分枝鎖トラン
スアミナーゼ欠損および２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ
欠損突然変異の両方が結合した突然変異体の使用を達成
する。

本発明はその発生や生理的性質にかかわらず、核酸ま
たは本明細書に記述された種からの同等の物質を用いる
形質転換、形質導入、遺伝子組換えまたは他の遺伝子操
作によつて発生し、それによつて本明細書に記述された
突然変異体の特性を獲得した多くの生物体をも含む。

本明細書中に使用される「アベルメクチン」なる用語
は下記の式（Ｉ）の化合物で、25置換基が本発明のS.ア
ベルミチリスによつて25位に同化できる置換基のものを
指す。

本明細書中に記述される突然変異体は本明細書に開示
され例示される方法によつて非天然アベルメクチンの生
産に大きな価値を有する。それらは好適なアベルメクチ
ン（すなわちＣ−25置換基がC₄-C₆シクロアルキルまた
はシクロアルケニルで随意にC₁-C₄アルキルで置換され
たもの;1−メチルチオエチル、または５や６員の酸素や
硫黄を含む複素環基、特に３−チエニルや３−フリルで
ある化合物）の生産に特に有効である。

ストレプトミセスアベルミチリス種のアベルメクチン
産生構成種の突然変異は紫外線照射、Ｘ線照射、Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチル
メタンスルホネート、亜硝酸およびＮ−メチルビス（２
−クロルエチル）アミンなどのようなナイトロジエンマ
スタードを含む多種類の突然変異剤を用いる既知の手順
に従つて実施する。突然変異誘発はS.アベルミチリスAT
CC31272のような天然アベルメクチンを生産できるS.ア
ベルミチリスの胞子や成長培養で行なうことができる。

当事者によく知られた手順に従つて、〔¹⁴Ｃ−１〕−
２−オキソ酸からの¹⁴CO₂生成について多数の不規則に
突然変異を起こした細菌コロニーのスクリーニングを行
なう生化学分析法〔テイバー（Tabor）ら、ジヤーナル
オブバクテリオロジー（J.Bact.）128,485-486,1976〕
によつて分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーナを欠くも
のを探して突然変異を起こしたコロニーを選択する。

その方法論は突然屁に体コロニーを微量定量プレート
のウエル中で適当な栄養培地上で増殖させ、トルエンで
細胞を透過し次いで〔¹⁴Ｃ−１〕−２−オキソ酸（例え
ば２−オキソカプロン酸）を各ウエルに添加し、発酵上
の大気の¹⁴CO₂を検査することからなる。さもなけれ
ば、〔¹⁴Ｃ−１〕−２−オキソ−３−メチル−３−メチ
ル吉草酸や〔¹⁴Ｃ−１〕−２−オキソ−３−メチル酪酸
を〔¹⁴Ｃ−１〕−２−オキソ−イソカプロン酸の代りに
使用することができる。¹⁴CO₂の生成は個々のウエルの
上に湿らせたBa(OH)₂飽和紙を置いて放出された¹⁴CO₂
を捕捉し、Ba¹⁴CO₃をオートラジオグラフイーにより検
出することによつて都合よく検査される。分枝鎖２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く突然変異体はブラン
ク対照のものに近似したオートラジオグラムを生ずる、
すなわちBa¹⁴CO₃は突然変異体により生成しない。

このようにして得られた突然変異体を上述の突然変異
誘発剤のいずれかを用いて更に突然変異を起こさせる。
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン（IL
V）を除いたM9/グルコースミニマルプレート上では増殖
できないことを基にして分枝鎖アミノ酸トランスフエラ
ーゼ活性を欠くものを探して突然変異を起こしたコロニ
ーを選択する。３種類のアミノ酸は全て増殖には存在し
なければならない。更に該トランスアミナーゼ欠損突然
変異体はトランスアミナーゼ反応の基質として役立つ３
種のケト酸全てを添加した培地でも増殖しないことが明
示された。従つて単一のトランスアミナーゼ酵素が３種
のケト酸（２−オキソ−３−メチル吉草酸、２−オキソ
−イソカプロン酸、２−オキソ−イソ吉草酸）の各々の
アミノ基転移を触媒する。

分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび分枝鎖アミ
ノ酸トランスアミナーゼの両方を欠く二重にブロツクさ
れた突然変異体では、天然アベルメクチンを産生する培
養菌へ逆戻りする確率が極めて低いので活性が特に興味
深い。ある条件下では単独にブロツクされた突然変異体
は天然アベルメクチンを産生する培養菌に逆戻りし得
る。

突然変異誘発によつて生ずる微生物の株の望ましい対
立遺伝子の生成に加えて、プロトプラスト融合によつて
一つの株に産生／同定される望ましい対立遺伝子を他の
株の染色体に導入する。例えば、上述の活性を持つS.ア
ベルミチリス株とのプロトプラスト融合によつて、分枝
鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性および分枝鎖アミ
ノ酸トランスアミナーゼ活性欠損S.アベルミチリス株か
ら、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性のみが欠損
したS.アベルミチリス株が作製される。当事者が理解す
るように、プロトプラスト融合技法は異なる選択系から
単一株に好ましい対立遺伝子を結合できる。本明細書に
記述されたS.アベルミチリスJC-923（ATCC 53669）は分
枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ欠損株であり、この技
法を経て産生された。

本発明の突然変異体の形態および培養特性は概して米
国特許第4,429,042号に記述されたようなものである。
本発明の突然変異体を見分ける特徴は、本明細書に記述
されるように特徴を決定する分枝鎖２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性および／または分枝鎖アミノ酸トランス
アミナーゼ活性を欠くことである。該活性の欠損によ
り、Ｒがイソプロピルや（Ｓ）−sec−ブチルである脂
肪酸RCOOHまたは発酵中に該RCOOHに変換できる化合物を
実質上含まない規定培地で増殖させるとその突然変異体
は天然アベルメクチンを生産できない。アメリカンタイ
プカルチヤコレクシヨン（American Type Culture Coll
ection）によつて行なわれた分類学的研究は、上述の¹⁴
CO₂分析によつて選択された２種の突然変異株Ｉ−３お
よびHL-026の特性が米国特許第4,429,042号に記述され
た親株のATCC 31272の特性といくつかの例外はあるが、
密接な関連を持つことを確認した。突然変異株Ｉ−３
（ATCC53567）はATCC 31272よりもかなり少ない胞子鎖
を形成し、突然変異株HL-026（ATCC 53568）は実質上空
気中の菌糸体や胞子を含まないが、産生する極少数の胞
子鎖はATCC 31272のものと同様の特性を示す。また突然
変異体HL-026は唯一の炭素源としてのラフイノースを利
用する能力は疑わしいが、ATCC 31272株および突然変異
Ｉ−３株はラフイノースを使用できる。（出願者による
実験では、これらの株の増殖をラフイノースは維持しな
いらしい）。突然変異株HL-026のもう一つの特性は他の
２株よりもメラニン色素の産生が少なく、チロシン寒天
上では全く生じないことである。結局、米国特許第4,42
9,042号中のATCC 31277についての記述とは対照的に、
我々は唯一の炭素源としてしよ糖を用いると突然変異体
やATCC 31272の増殖を検出できない。突然変異体Ｉ−３
およびHL-026は分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性のみを欠いている。二重に欠損している突然変異体PG
S-119（ATCC 54670）〔突然変異体Ｉ−３（ATCC 5356
7）を更に突然変異誘発して生産する〕およびJC-923（A
TCC 53669）（プロトプラスト融合によつて得られる）
は突然変異株Ｉ−３の時と同様にATCC 31272と同様の形
態的関連を示す。

ストレプトミセス アベルミチリスＩ−３、HL-026、
PGS-119およびJC-923はメリーランド州ロツクビルのア
メリカンタイプカルチヤコレクシヨンにブタペスト条約
の合意のもと供託されており、もし特許が本出願で許可
されると承認された供託所はその供託物を永続的に、社
会がそれらを利用しやすいようにしている。それらはそ
れぞれストレプトミセス アベルミチリスATCC 53567、
ATCC 53568、ATCC53670およびATCC 53669という番号が
与えられている。その寄託物は本出願が係属中米国特許
商標庁長官によつて決められた規則（37CFR1、14および
35USC122との名称を与えられている）および本出願が提
出される国における外国特許法に従つて利用できる。寄
託された微生物の一般への利用の制限は全て特許の許可
により変更されることなく除去されるであろう。S. アベルミチリス ATCC 31267、ATCC 31271、ATCC 31272
およびNCIB12121の各々は天然アベルメクチン、式
（Ｉ）化合物 〔式中22-23位の破線は随意の二重結合を表わし、 R¹は水酸基で、二重結合が存在しない時だけ存在し； R²は式 の４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレ
アンドロシルオキシであり； R³は水素またはメチルであり；そして Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである〕
を産生する。米国特許第4,285,963号は25位が水酸基お
よびエチル基で置換され、R¹が水酸基でR³がメチルであ
る式（Ｉ）のアベルメクチンを記述している。

本明細書で言及される非天然アベルメクチンでは、Ｒ
はイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル以外の置換
基であり、以下に定義されるようなものである。

式（Ｉ）の化合物の生合成への利用に必須の化合物は
S. アベルミチリスの細胞内で生ずる。Ｌ−バリン、Ｌ−
ロイシンおよびＬ−イソロイシンというこれらの化合物
は２−オキソ酸への変換、および補酵素Ａとその生成物
との結合を伴なう分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ
によるその酸の脱炭酸を経てアベルメクチンの生合成に
入ると考えられている。そららの存在によりイソプロピ
ルおよび（Ｓ）−sec−ブチルの付いた式（Ｉ）の化合
物が両方同時に生成することが説明される。もちろんこ
のことが（Ｓ）−sec−ブチル誘導体からイソプロピル
誘導体を分離するという問題を生ずる。

適当な原料化合物を含む栄養培地中で発酵すると、本
発明の突然変異体は式（Ｉ）の化合物、またはより通常
の場合には、Ｒが使用された原料化合物に相当する２種
類以上の式（Ｉ）化合物の混合物、を生ずる。米国特許
第4,429,042号で用いられた名称に従つてＲ−アベルメ
クチンA1、A2、B1およびB2という都合よくそして種に言
及した４種類の名称の生成物が生じ得る。もちろん“R"
−基はＣ−25置換基を表わす。例えばＲがシクロペンチ
ルの場合以下の４種のアベルメクチルが可能である： 非天然アベルメクチンでは、式（Ｉ）のＣ−25置換基
“R"はイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル以外の
ものである。

二重結合が存在し、OHが存在しない式（Ｉ）の化合物
はR¹がOHで、二重結合が存在しない式（Ｉ）の相当化合
物の脱水反応によつても合成することができる。その反
応はまずｔ−ブチルジメチルシリロキシアセチル誘導体
のような化合物で５および４位の水酸基を選択的に保護
し、次に（４−メチルフエノキシ）チオカルボニルクロ
リドのような置換チオカルボニルハライドと反応させ、
次いで脱水を達成するためにトリクロルベンゼンのよう
な高沸点溶媒中で加熱する。その生成物を最終的に脱保
護化すると不飽和化合物が得られる。適当な試薬と伴に
これらの工程および反応条件は米国特許第4,328,335号
に記載されている。

R³がＨである式（Ｉ）の化合物もR³がCH₃である相当
化合物の脱メチル化によつても合成することができる。
この反応は５−メトキシ化合物またはそれが適当に保護
された誘導体を酢酸第II水銀と反応させ、生成した３−
アセトキシエノールエーテルを希釈酸によつて加水分解
して５−ケト化合物を生成する。次にこの化合物を水素
化ほう素ナトリウムのような還元剤で還元すると、５−
ヒドロキシ誘導体が得られる。これらの工程への適当な
試薬や反応条件は米国特許第4,423,209号に記載されて
いる。

R¹がＨで、二重結合が存在しない式（Ｉ）の化合物は
二重結合が存在し、R¹が存在しない相当化合物を適当な
触媒を用いる選択的触媒性水素添加によつて合成するこ
とができる。例えば、還元は欧州特許出願第0001689号
および1980年４月22日に発行されたその副本である米国
特許第4,199,569号に記載されたようなトリス（トリフ
エニルホスフイン）ロジウム（Ｉ）クロリドを用いて実
施できる。

R²がＨである式（Ｉ）の化合物はR²が４′−（α−Ｌ
−オレオンドロシル）−α−Ｌ−オレアンドロシルオキ
シである相当化合物を水性有機溶媒中の酸による緩和な
加水分解によつて、その４′−（α−Ｌ−オレアンドロ
シル）−α−Ｌ−オレアンドローズ基を除去して13位に
水酸基を持つアグリコンを生じ、次にこの化合物をベン
ゼンスルホニルハライドとの反応によつてハロゲン化し
て13−デオキシ−13−ハロ誘導体とし、最終的に例えば
トリブチルすずハライドを用いて選択的に還元すること
により合成される。好ましくない副反応を避けるため、
存在するかも知れない他の水酸基を例えばtert−ブチル
ジメチルシリル基を用いて保護することが好ましい。こ
れはハロゲン化または還元工程の後、微量の酸を含むメ
タノールで処理することによつて容易に除去される。こ
れらの作業のための適当な試薬および反応条件と伴に全
ての工程は欧州特許出願第0002615号に記述されてい
る。

天然および非天然アベルメクチンの生合成に本発明の
S. アベルミチリスによつて利用できる化合物は式（II−
Ａ） Ｒ−COOH （II−Ａ） の化合物および発酵工程中に（II−Ａ）に変換できる化
合物である。該化合物は本明細書では「原料化合物」と
呼称される。式（II−Ａ）では、Ｒはα−分枝鎖基であ
り、−COOH基が付いた炭素原子が少くとも水素以外の原
子または基が２個付いている。もちろんこの定義は非環
状鎖または環状環の構成物として随意に硫黄や酸素を持
つものを含んだ飽和および不飽和非環状および環状基を
包含する。

より特定すると、Ｃ−25置換基となるＲはα−分枝C₃
-C₈アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシア
ルキルまたはアルキルチオアルキル基；アルキル基がα
−分枝C₂-C₅アルキル基であるC₅-C₈シクロアルキルアル
キル基；C₃-C₈シクロアルキルまたはC₅-C₈シクロアルケ
ニル基で、いずれも随意にメチレンや１個以上のC₁-C₄
アルキル基またはハロゲン原子（フルオロ、クロル、ヨ
ードまたはブロム）で置換できるもの；または飽和また
は全体か一部が不飽和であるものおよび随意に１個以上
のC₁-C₄アルキル基またはハロゲン原子で置換し得る３
〜６員の酸素または硫黄を含む複素環である。

発酵工程でRCOOHに変換できる化合物すなわち前駆体
はＲが上で定義したような式（II−Ｂ） Ｒ−(CH₂)_n−Ｚ （II−Ｂ） 〔式中ｎは０、２、４または６であり;Zは-CH₂OH、−CH
O、-CH₂NH₂、-COOR⁵または-CONHR⁶であり、R⁵はＨまた
は（C_1-6）アルキルで、R⁶は水素、（C_1-4）アルキルま
たはアミノ酸残基、特に-CH(COOH)CH₂COOH、-CH(COOH)
(CH₂)₂COOHおよび-CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃のようなアスパ
ラギン酸、グルタミン酸およびメチオニンである〕の化
合物である。

分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼのみが欠損したS.
アベルミチリスの場合、２−オキソ酸も前駆体となり得
る。従つて該系では式（II−Ｃ） Ｒ−CO−Ｚ （II−Ｃ） （式中ＲおよびＺは上で定義したものである）の酸は
アベルメクチンの生合成用として該S. アベルミチリスに
よつて利用され得る。

式（II−Ａ）の化合物の異性形および発酵工程中にそ
れらに変換できる化合物も本発明に含まれ、それらを本
明細書に記述される工程に使用するとＣ−25における異
性アベルメクチンが生ずる。

本発明の方法は窒素、炭素、無機塩の同化源および式
RCOOHの化合物または発酵中に該化合物に変換できる化
合物（すなわち前駆体）からなる水性栄養培地中で分枝
鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性および／または分
枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性を欠くS. アベルミ
チリス株による好気的発酵によつて実施する。酸または
それに変換できる化合物を播種時または発酵中時々のい
ずれかで発酵に添加する。トランスアミナーゼ欠損突然
変異体を用いる時には、その突然変異体の増殖を起こす
ために培地にＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ
−バリンを含まねばならない。アベルメクチン生成物の
産生は発酵物から試料を移し、有機溶媒で抽出して例え
ば高速液体クロマトグラフイーのようなクロマトグラフ
イーによつて生成物の出現を追うことによつて測定する
ことができる。生成物の収率が最大になるまで、一般に
は４から15日間培養を続ける。

原料化合物（カルボン酸またはそれに変化し得る化合
物）の添加の各好適レベルは0.05と3.0g/lの間である。
原料化合物は発酵に継続的、断続的または一度に全部を
添加することができる。酸（RCOOH）は酸として、また
はナトリウム、リチウムまたはアンモニウム塩のような
塩として、あるいは上で定義したような酸に変換できる
化合物として添加される。固体の場合、酸は水または
（C_1-4）アルコールのような適当な溶媒に溶解するのが
好ましい。

発酵に使用される培地は、特にＣ−25置換基がイソプ
ロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである場合には、炭
素、窒素および微量元素の同化源を含む従来の培地を使
うことができる。Ｃ−25置換基が非天然基である時、す
なわちイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルでない
時には、発酵培地は選択された成分を欠くか、またはＲ
種がイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである原
料化合物を最小量だけ含むものである。

24〜33℃の範囲内の好適な温度で数日間発酵した後、
発酵液を遠心分離するか過し、菌糸体ケーキを好適な
アセトンまたはメタノールで抽出する。抽出液を濃縮
し、次に目的の生成物を塩化メチレン、酢酸エチル、ク
ロロホルム、ブタノールまたはメチルイソブチルケトン
のような水と混合しない有機溶媒で抽出する。抽出液を
濃縮し、粗生成物を必要ならば逆相高速液体クロマトグ
ラフイーを用いるようなクロマトグラフイーによつて更
に精製する。

生成物は一般に式（Ｉ）〔式中８R²は４′−（α−Ｌ
−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレアンドロシルオキ
シで、R¹はOHで二重結合がないかまたはR¹がなくて二重
結合が有り、R³はＨまたはCH₃である〕の化合物の混合
物として得られる；しかしその比率は特定の突然変異体
や使用される原料化合物および使用条件によつて変化し
得る。

Ｒ基の源、すなわちＲ−COOHから直接来るのか、上記
前駆体の一つまたはいずれかの前駆体から生ずるのかは
アベルメクチンの生産には些細なことである。その生産
のための本発明の方法の重要な必須条件は目的のＲ基が
発酵工程においてS.アベルミチリス株に利用されること
である。

好適な化合物は以下のものを含む： 2,3−ジメチル酪酸 ２−メチルヘキサン酸 ２−メチルペント−４−エノン酸 ２−シクロプロピルプロピオン酸 4,4−ジフルオロシクロヘキサンカルボン酸リチウム塩 ４−メチレンシクロヘキサンカルボン酸 ３−メチルシクロヘキサンカルボン酸（シス／トラン
ス） １−シクロペンテンカルボン酸 １−シクロヘキセンカルボン酸 テトラヒドロピラン−４−カルボン酸 チオフエン−２−カルボン酸 ３−焦性粘液酸（フラン酸） ２−クロルチオフエン−４−カルボン酸 シクロブタンカルボン酸 シクロペンタンカルボン酸 シクロヘキサンカルボン酸 シクロヘプタンカルボン酸 ２−メチルシクロプロパンカルボン酸 ３−シクロヘキセン−１−カルボン酸 ２−メチルチオプロピオン酸 ２−メチル−４−メトキシ酪酸 チオフエン−３−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン ３−チオフエンカルボキシアルデヒド ３−シクロヘキシルプロピオン酸 ３−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフエン−３−カルボン酸 ３−シクロペンチル−１−プロパノール ３−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩 ３−フルオロシクロブタンカルボン酸 ３−メチレンシクロブタンカルボン酸リチウム塩 ２−メチル−４−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオピラン−４−カルボン酸 シクロブチルメチルアミン シクロブタンカルボン酸エチル ４−ヒドロキシメチルシクロペンテン ２−（３−チオフエンカルボニル）プロピオン酸エチル （Ｓ）−２−メチルペンタン酸 （Ｒ）−２−メチルペンタン酸 Ｏ−メチルトランスフエラーゼ突然変異体は本明細書
記載の分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠損突然変
異体および／または分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ
欠損突然変異体から得ることができる。活性な分枝鎖２
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性および／または分枝鎖
アミノ酸トランスアミナーゼ活性における突然変異でＯ
−メチルトランスフエラーゼ突然変異の一方もしくは両
方と結合した突然変異体はRCOOH化合物または発酵工程
中にRCOOHに変換できる化合物を与えると、主にアベル
メクチンＢ、デメチルアベルメクチンまたはデメチルア
ベルメクチンＢ化合物を生成するS.アベルミチリス株を
生ずる。該突然変異体は紫外線照射および／またはＮ−
メチル−Ｎ−ニトロソウレタン、ニトロソグアニジン、
エチルメタンスルホネートまたは上に列挙したような他
の試薬によつて分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性および／または分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活
性を欠く本明細書記載の突然変異体を突然変異誘発によ
つて生ずる。もう一法としては、Ｏ−メチルトランスフ
エラーゼの一方または両方を欠く分枝鎖２−オキソ酸デ
ヒドロゲナーゼ保持突然変異体および／または分枝鎖ア
ミノ酸トランスアミナーゼ保持突然変異体は分枝鎖２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠損突然変異体および／また
は分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ欠損突然変異体を
生ずるためにUV光または突然変異誘発剤で処理すること
によつて突然変異を起こすことができる。

このような突然変異体によつて産生される非天然アベ
ルメクチンはアグリコン部位のＣ−５位および／または
オレアンドローズ部位のＣ−３′および／またはＣ−
３″位に水酸基があるのが特徴である。

上述の突然変異体はシユルマンらによりアンチミクロ
バイアルエージエンツアンドケミセラピー、29、620-62
4（1986）に記述された方法論に従つて同定される。そ
れらは既知のアベルメクチンと同様の目的および同様の
方法に有用である。

さもなければ、オレアンドローズ二糖類部位にメチル
基を欠くものを含むアベルメクチンＢの増量はＯ−メチ
ルトランスフエラーゼ活性を阻害するシンフンギン（Ｓ
−アデノシルエチオニンまたはＳ−アデンシルホモシス
テイン）のような基質の存在下で活性分枝鎖２−オキソ
酸デヒドロゲナーゼおよび／または分枝鎖アミノ酸トラ
ンスアミナーゼ活性を欠く本発明の突然変異体を発酵す
ることによつて起こる。

本発明の化合物は駆虫薬、外部寄生虫駆除剤、殺虫剤
およびダニ駆除剤として特に有用性を持つ活性の強い駆
虫剤である。

従つてその化合物は線虫として記述される寄生虫群に
よつて頻繁に引き起こされるものや家畜や家禽に影響す
ると共に豚、羊、馬および牛に重大な経済的損失を起こ
し得る特に蠕虫病を含む内部寄生虫によつて生ずる種々
の病気の治療に有効である。その化合物は例えば犬のジ
ロフイラリア（Dirofilaria）およびアンシロストーマ
（Ancyostoma）、ネカター（Nacator）、アスカリス（A
scaris）、ストロンギロイデス（Strongyloides）、ト
リンキネラ（Trinchinella）、カピラリア（Capillari
a）、トリキユリス（Trichrris）、エンテロビウス（En
terobius）およびフイラリア虫やストロンギロイデスや
トリキネラの腸外状態のような血液や他の組織器官中に
見られる寄生虫のような胃腸寄生虫を含むヒトに感染し
得る種々の寄生虫を含む種々の動物種に影響を及ぼす他
の線虫に対しても有効である。

その化合物は牛や馬に作用し得るマダニ、ダニ、シラ
ミ、ノミ、クロバエ、かみつく虫および移動性双翅類の
幼虫のように動物や鳥への特に節足動物の外部寄生虫を
含む外部寄生虫感染の治療にも有効である。

その化合物はハダニ、アリマキ、イモムシのような貯
蔵穀物や農作物への害虫およびバツタのような移動性直
翅目に対して有効であるのと同様にゴキブリ、イガ、カ
ツオブシムシおよびイエバエのような家庭害虫に対して
も活性な殺虫剤である。

式（Ｉ）の化合物は考えられる特定な使用および治療
される宿主動物や伴なう寄生虫または昆虫の特定の種類
に適した処方物として投与される。駆虫剤としての使用
には、その化合物はカプセル、丸薬、錠剤または液状水
薬の形態で経口投与されるか、さもなければ注射または
移植片として投与することもできる。このような処方物
は通常の獣医業務に従つて従来の方法で製造される。従
つてカプセル、丸薬または錠剤は活性成分を適当な細か
く分割された希釈剤または担体（更に澱粉、乳糖、タル
ク、ステアリン酸マグネシウムなどのような崩壊剤およ
び／または結合剤を含む）と混合して製造することがで
きる。水薬処方物は活性成分を分散剤や湿潤剤と一緒に
した水溶液に分散して製造することができ、注射用処方
物は例えば血液と等張液にするために十分な塩やグルコ
ースなどの他物質を含み得る滅菌溶液の形態で製造する
ことができる。これらの処方物は治療される宿主動物
種、感染症の重さや型および宿主の体重によつて活性化
合物の重量に関しては変化するであろう。一般に経口投
与では単一投与または１から５日の期間の分割投与で与
える場合、動物体重kg当り約0.001から10mgの用量で十
分であるが、もちろんより多い投与や少ない投与範囲が
示される例もあり、本発明の範囲もそのようなものであ
る。

代れるものとしては化合物を動物の飼料として投与す
ることができ、この目的のために濃縮した飼料添加物ま
たは前もつて混合したものを通常の動物飼料と混合して
製造することができる。

殺虫剤としての使用および農業上の害虫処理のために
は、普通の農業慣例に従つてスプレー、粉剤、乳濁剤な
どとして適用される。

分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠損S.アベルミチ
リスＩ−３（ATCC 53567）の製造 工程1. S.アベルミチリスATCC 31272をニユーパツチ寒
天培地（New Patch Agar Medium）上で30℃で12日間増
殖させ集約的（コンフルエント）にした。その培地は以
下のものからなる： Ｖ−８ジユーズ^* 200ml CaCO₃ 3g 寒天 15g H₂O 1000mlにする 栄養肉汁 1.0g/l 酢酸ナトリウム・３H₂O 1.4g/l イソ吉草酸 50mg/l イソ酪酸 50mg/l ２−メチル酪酸 50mg/l イソロイシン 250mg/l ロイシン 250mg/l バリン 250mg/l 微量元素溶液^** 1mg/l ＊８種の野菜ジユース（トマト、ニンジン、セロリ、ビ
ート、パセリ、レタス、クレソンおよびホウレンソウ）
に塩、アスコルビン酸、くえん酸および天然香料の混合
物。キヤンベルソープ社（Campbell Sorp Company）、
キヤンデン（Camden）、NJより購入。

＊＊微量元素溶液の組成： FeCl₃・６H₂O 2.7g MnSO₄・H₂O 4.2 CuSO₄・５H₂O 0.5 CaCl₂ 11.0 H₃BO₃ 0.62 CoCl₂・６H₂O 0.24 ZnCl₂ 0.68 Na₂MoO₄ 0.24 上述のものを0.1N HCl（１）に溶解する。

胞子を３枚のプレートからはがし、20mlの0.05Mトリ
ス−マレイン酸緩衝液（pH9.0）に懸濁した。

工程2. 10mlの胞子懸濁液をＮ−メチル−Ｎ″−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG:10mg）を入れたバイア
ルに加えた。そのバイアルを28℃で60分間振盪培養し、
次に胞子を１％NaCl溶液で十分に洗浄した。

工程3. 洗浄した胞子を１％NaClで懸濁し、等量の80％
エチレングリコールと混合した。この懸濁液を−20℃で
保存し、突然変異体の検索するための細胞源として使用
した。発芽させる時には約10⁴コロニー/mlにする。

この胞子貯蔵液をYPDプレートに拡げると約100コロニ
ー／プレートで生ずる（YPD培地は酵母抽出液、バクト
（Bacto）ペプトン^*およびブドウ糖の各10g/lからなり;
15g/lのバクト寒天^*は高圧滅菌する前にpH6.9に調整し
た）。星印を付けた成分はデイフコラボラトリーズ（Di
fco Laboratories）、デトロイト（Detroit）、ミシガ
ン48238から購入する。

工程4. 28℃で２−３週間増殖した後、１個のコロニー
を取り、標準の96ウエル微量定量プレートの個々のウエ
ルに置いた。また突然変異体を同定する時の生育細胞源
として供給するため、少量のコロニーを新鮮な寒天培地
に植え付けた。

工程5. 各ウエルに１％グルコース、0.1％カザアミノ
酸および各0.01％のイソ吉草酸、イソ酪酸および２−メ
チル酪酸を含むM9液体培地を約75μｌ添加した。数日28
℃で培養した後、細胞を分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼの存在について分析した。（M9塩培地はｌ当り6g
NaHPO₄、3g KH₂PO₄、0.5g NaClおよび1g NH₄Clからな
る。培地を高圧滅菌した1M MgSO₄および0.1M CaCl₂各1m
lを無菌的に添加した）。

工程6. M9塩培地にトルエンを５％の割合で懸濁させた
微細懸濁液は、混和しない混合液を短時間超音波処理し
て作製した。この懸濁液（25ml）に〔¹⁴C-1〕−２−オ
キソ−イソカプロン酸（2.5μCi/ml:10.0μCi/μmole）
を含む溶液（1.2ml）を添加した。この全部の混合物50
μｌを分析するコロニーを含む微量定量プレートの各ウ
エルに加えた。

工程7. 各ウエルから生ずる¹⁴CO₂をテイバーらにより
ジヤーナルオブバクテリオロジー、128485-486（1976）
に「多数の試料における¹⁴CO₂検出のための便利な方
法：突然変異体の迅速分析への応用」と記載された手順
によつて捕捉し明視化した。分枝鎖２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性を欠く突然変異体は対照で観察されるも
の以上のBa¹⁴CO₃を生成しない。

オートラジオグラフイーにおいてBa¹⁴CO₃形成による
黒色スポツトで示される¹⁴CO₂の陽性分析とスポツトな
しまたは極めて明るいスポツトにより示される陰性分析
との間のコントラストを改善するより精密な方法は以下
の修正した分析からなる。

（工程４で示した）単一コロニーを（２−３週よりむ
しろ）７−14日間培養した後寒天から取り、直接上記の
工程６および７で分析した。上記手順の工程５は省く。

¹⁴CO₂放出に関して現在するより精密な分析方法は１
％グルコールおよび0.1％“Syncasa-bcaa"（Ｌ−アミノ
酸と市販カザアミノ酸の適当な組成物との混合物ただし
Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−ロイシンは含
まない、以下参照）を含むM9塩培地からなる好適な培地
上で上述の分析によつて検出された突然変異体を増殖す
ることを特徴とする。

高細胞密度に増殖させた後、細胞をM9塩培地で洗浄
し、超音波処理でトルエンの乳白色分散液にした１％ト
ルエンを含む冷却M9塩培地で再懸濁した。その細胞／緩
衝液／トルエン懸濁液を30℃で40分間培養して細胞を透
過させた。次にその透過した細胞をM9塩培地で洗浄し、
最後に当初の1/5の容積のM9培地緩衝液に再懸濁した。
この懸濁液180μｌを分析に使用した。

反応容積300μｌにはトルエン処理細胞0.4mMチアミン
ピロホスフエート（TPP）;0.11mM補酵素（CoA）;0.68mM
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）;2.6mM
ジチオスレイトール（DTT）;4.1mM MgCl₂;60mM Tris-HC
l（pH7.5）；および〔¹⁴C-1〕−α−ケトイソカプロエ
ート（6,000cpm、μCi/μmole）を含有した。計測効率
は73％であつた。バイアルのスクリユーキヤツプ内に押
し付けた２×2cmワツトマン（Whatman）＃４正方形紙を
入れた15mlシンチレーシヨンバイアル中で反応を行なつ
た。その紙には30μｌの1Mハイアミンヒドロキシド〔Hy
amine Hydroxido;メチルベンズエトニウムヒドロキシド
の1Mメタノール溶液；シグマケミカル社（Sigma Chemic
al Co.,）、セントルイス（St.Monis）、MO63178〕を含
み、反応で放出された¹⁴CO₂を捕捉する。２時間培養し
た後、ニユーイングランドヌクリアーリサーチプロダク
ツ（New England Nuclear Research Products）、ボス
トン（Boston）、MA02118から購入されるベツクマンア
クアゾール（Beckman Aquasol）II〔一般的LSC（液体シ
ンチレーシヨンカウンタ）用カクテル〕10mlに浸し、４
時間以上この溶媒中で平衡にした後、液体シンチレーシ
ヨンカウンタで放射性活性を測定した。ブランク対照反
応（すなわち細胞なし）は約50-300cpmであつた。

突然変異体Ｉ−３やその類似物はブランク対照反応よ
り少ないかまたは匹敵する計数を示すのに、その親株は
ブランク対照値よりも数倍高い計算を示した。

S.アベルミチリスＩ−３（ATCC 53567）のHL-026誘導体
（ATCC 53568）の単離 S. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）を栄養寒天プ
レートにすじ状に塗つた。自然変異体が比較的高頻度で
生じ、それらのいくつかは30℃で４日間の培養で空気中
の菌糸体を失なつた。このような変異体のいくつかを単
離し、シクロペンタンカルボン酸を添加したAP−５培地
中で発酵した時の非天然アベルメクチンの生産能力を調
べた。単離物のうち、多くが天然アベルメクチンのない
非天然アベルメクチンを生産し、フラスコ実験で親のS.
アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）よりも高い力価の
アベルメクチンを生ずる株を認定番号HL-026（ATCC 535
68）と帰属した。

分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠損および分枝鎖
アミノ酸トランスアミナーゼ欠損S. アベルミチリスPGS-
119（ATCC 53670）の製造 工程1. 新鮮なSAMM寒天プレートで４日間増殖させたS.
アベルミチリスＩ−３（ATCC 53567）約100mgをSCM培地
（pH7.2;50ml）を入れた300mlフラスコ中に播種した。
次にそのフラスコを200RPM、30℃で24時間振盪した（最
終pH＝8.2）。

工程2. フラスコを振盪器からはずし、全培養液10mlを
滅菌試験管中で５分間2000RPMで遠心分離した。次に細
胞を滅菌300ml三角フラスコ中のSCM培地（50ml）に再懸
濁し、そのフラスコを回転振盪器で30℃で２時間振盪し
た。

工程3. その懸濁液（10ml）を滅菌試験管に入れた。

工程4. エチルメタンスルホネート（250μｌ）を（よ
く換気したフート内で）試験管に入れて、内容物をよく
混合して滅菌した300mlフラスコに注ぎ、回転振盪器内
で３時間30℃で振盪した。

工程5. 新鮮な滅菌SCM培地（40ml）をそのフラスコに
添加し、全部で70時間30℃で振盪を続けた。

工程6. フラスコをはずし、内容物を8000RPMで20分、2
0℃で回転して沈降させた。その細胞をSCM培地に再懸濁
して洗浄し、再び回転して沈降させ、SCM培地（10ml）
に再懸濁した。

工程7. 細胞を取り、約150コロニー／プレートでＬ−
ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンの存在および
不存在下、およびどれか該アミノ酸の組成物とM9/グル
コースミニコルプレート上での増殖能力をレプリカプレ
ーテイングによつて分析した。興味ある突然変異細胞は
Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを添
加した培地中でのみ増殖した。これらの分枝鎖アミノ酸
トランスアミナーゼ活性の欠損したS. アベルミチリスＩ
−３（ATCC 53567）の誘導体はＬ−ロイシン、Ｌ−イソ
ロイシンおよびＬ−バリンへの前駆体として役立つ３種
の２−オキソ酸（２−オキソイソカプロン酸;2−オキソ
−３−メチル吉草酸および２−オキソイソ吉草酸）のう
ち１種または２種類を添加した培地では増殖できなかつ
た。この性質は、このような培地でよく増殖するS. アベ
ルミチリスＩ−３（ATCC53567）の性質とは全く反対で
ある。従つて単一トランスアミナーゼ酵素は該２−オキ
ソ酸のアミノ酸転移を触媒する。

SCM培地 酵母自己分解物 10g/l 牛肉エキス 5g/l カゼイン酵素加水分解物 10g/l 1M MgSO₄ 3g/l 1M K₂HPO₄:pH7.0（HCl） 100g/l SAMM寒天プレート g/l Na₂HPO₄ 6.0 KH₂PO₄3.0 NaCl 0.5 NH₄Cl 1.0 1M MgSO₄ 1.0 0.1M CaCl₂ 1.0 ブドウ糖 8.0 カザアミノ酸 20.0 寒天 20.0 “Syncasa-bcaa"組成物、100倍濃縮液 g/l Ｌ−アラニン ３ Ｌ−アルギニン ４ Ｌ−アスパラギン酸 ６ Ｌ−シスチン １ Ｌ−グルタミン酸 20 グリシン １ Ｌ−ヒスチジン ２ Ｌ−リジン ７ Ｌ−メチオニン ３ Ｌ−フエニルアラニン ６ Ｌ−プロリン 10 Ｌ−セリン ６ Ｌ−スレオニン ４ Ｌ−チロシン ４ Ｌ−トリプトフアン １ その混合物をpH7に調整し、過して滅菌した。濃縮
液１容を培地99容に添加して標準使用濃度にした。S. アベルミチリス ATCC31272およびS. アベルミチリスPGS
119（ATCC53670）のスペクチノマイシン耐性株のプロト
プラスト融合によるS. アベルミチリスJC-933（ATCC 536
69） S. アベルミチリスATCC31272スペクチノマイシン耐性
種はS. アベルミチリスATCC 31272の自然突然変異体であ
る。50μg/mlのスペクチノマイシン含有AS−１寒天プレ
ート上に拡げたATCC31272の生成菌糸体群から単離され
た。富栄養培地上で発芽した突然変異体の胞子は、これ
らの条件下で発芽できない同系の親株の胞子に比べる
と、50μg/mlスペクチノマイシンに耐性を示す。この顕
著な選択的マーカーはATCC31272の分枝鎖アミノ酸トラ
ンスアミナーゼ欠損単離株の単離にうまく使用された。

AS−１寒天 （ストレプトミセス属用の富栄養プレーテイング培地） 酵母エキス 1.g Ｌ−アラニン 0.2g Ｌ−アルギニン 0.2g Ｌ−アスパラギン 0.5g 可溶性澱粉 5g NaCl 25g Na₂SO₄ 10g 寒天 20g 蒸留水 １ pH7.5に調整する。121℃で15分間高圧滅菌にかける。滅
菌プラスチツクペトリ皿（100×15mm）に30から35ml注
ぐ。

ストレプトマイセスアベルミチリス株の生存可能プロト
プラストを製造する手順 A.移植片としての胞子 1.胞子製品は標準的手順によつて製造され、生存可能胞
子数は発芽用寒天上でのプレーテイング希釈法で、計測
し、一部分ずつを40％グリコール中に入れ−70℃で凍結
した。

2.使用前に、胞子貯蔵品を1000gで10分間遠心分離し、
等量の0.85％食塩水に再懸濁した。

3.約10⁷の胞子を300ml気流調整フラスコ３または４個中
の0.5％グリシン含有改良酵母抽出−麦芽抽出液（YEM
E）培地（下記参照）30mlに播種した。

B.移植片としての凍結超音波処理菌糸体 1.PGS-119の菌糸体培養をトリプチカーゼ大豆汁（TSB）
中において600nmで２〜９の濁度に増殖させた。その培
養物をガラス組織粉砕機で10回均質化した。

2.均質化した菌糸体をTSBで２倍に希釈し、20mlを滅菌
ポリプロピレン遠心分離チユーブに入れた。超音波プロ
ーブをその液体に１〜2cmの深さに沈め、試料を10秒間5
0％強度で超音波処理した。超音波処理は菌糸体の塊を
継代培養する時に迅速な指数関数的増殖を起こす単一ま
たは２倍単位に分散した。

3.超音波処理した菌糸体製品を最終濃度の40％グリセロ
ールに希釈し、バイアルにピペツトで移し、−70℃で凍
結した。

4.必要な時に一部を室温で解凍し、上記の工程A.3のよ
うなYEME培地中に播種した。

C.移植片としての寒天上のコロニー 1.TSAまたはYPD−２寒天上で増殖したPGS-119の成熟し
たコロニー６個をミクロフユージチユーフ中の滅菌水
（200μｌ）に輪状に播種した。

2.菌糸体混合物をデイスポーザブル（使い捨て）乳棒で
均質化した。

3.均質化したコロニーを上記の工程A,3のようなYEME培
地に添加した。

D.グリシン中で増殖した菌子体からプロトプラストの製
造 1.培養物を振盪水浴中29.℃で設定８で約65時間培養し
た。

2.菌糸体を40×位相２倍率で顕微鏡観察し、約1475g、2
0℃で10分間ポリプロピレン遠心分離チユーブ内ではが
した。

3.上清を廃棄し、菌糸体ペレツトをプロトプラスト
（Ｐ）緩衝液（以下参照）10mlに再懸濁した。そのペレ
ツトを組織粉砕機で５−10回均質化させ分散した塊にし
た。

4.試料を約1000gで10分間遠心分離した。その上清を廃
棄し、ペレツトをＰ緩衝液（10ml）に静かに再懸濁し
た。

5.上記洗浄工程を繰り返した。

6.その菌糸体を0.22ミクロンフイルターを通して過滅
菌したＰ緩衝液への新鮮なリソチームの1.0g/ml溶液（1
0ml）に再懸濁した。

7.その菌糸体を水浴中37℃で60分間静かに振盪しながら
培養した。その試料を15分ごとにリソチーム溶液中に再
懸濁した。試料をプロトプラスト存在下、40×位相照度
で顕微鏡観察した。

8.菌糸体製品を5mlピペツトで３回粉砕し、その細胞壁
からプロトプラストをなくす。

9.その製品をグラスウールまたは非吸収性綿を通して
過した。

10.プロトプラストを約1000gで７分間遠心分離して沈降
させ、Ｐ緩衝液5mlに静かに再懸濁し、40×位相倍率で
観察した。

11.そのプロトプラストを上記のように沈降させ、Ｐ緩
衝液10mlに再懸濁した。この懸濁液をＰ緩衝液と蒸留水
で希釈し、再生培地で培養した。蒸留水で希釈したプロ
トプラスト製品から生ずるコロニーは不完全または完全
にプロトプラスト化されていない菌糸体ユニツトから誘
導されたと想定された。

12.プロトプラストを−70℃で200-300μｌ部分として氷
上で凍結した。18-24時間後氷を除去した。

ポリエチレングリコール（PEG）1000によるプロトプラ
スト融合 1.ここに記述される実験は全て我々の意図の通り明白な
毒性のほとんどない単一ロツトのPEG1000（シグマケミ
カル社、セントルイス、MO、63178）を使用した。

2.1.0g分のPEGをガラスバイアル中で高圧滅菌し、Ｐ緩
衝液1.0mlを添加し、バイアルを55℃に加熱してPEGを溶
かすか、またはPEGを秤量し、Ｐ緩衝液に溶かし、使用
直前に過滅菌した。PEG溶液は室温で使用した。

3.プロトプラストを新たに作製し、流水中で−70℃貯蔵
温度から迅速に解凍した。各遺伝子型のプロトプラスト
のほぼ等数を静かにポリカーボネート遠心分離チユーブ
にピペツトで移した。新たに作整したプロトプラスト製
品で、濁度を測定し、数播の濃度で融合した。各チユー
ブ中の容積をＰ緩衝液で5.0mlに調整した。

4.その融合混合物を約1000gで７分間遠心分離した。

5.上清を注意深くデカントした。原形質体ペレツトを静
かに再懸濁してＰ緩衝液で最終容積200μｌにした。

6.その融合混合物に50％PEG（800μｌ）を速やかに添加
した。その製品をパスツール（Pasteur）ピペツト中に
吸い上げ、再び排出することによつて混合した。その融
合物を室温で２分間培養し、Ｐ緩衝液9mlを添加してPEG
を希釈した。再度融合を連続的に実施した。そのために
培養間隔は正確にした。

7.その融合混合物を上記の工程４と同様に遠心分離し、
上清を注意深くデカントし、融合して洗浄したプロトプ
ラストをＰ緩衝液1.0mlに再懸濁した。

8.その融合混合物をＰ緩衝液で10^-1から10^-2に連続的に
希釈した。

9.各株だけの融合を実験ごとに実施して対照として培養
した。

10.各プロトプラスト製品の希釈物（生存能力のある計
数）を培養して、その融合手順に使用される各株の生存
能力のある再生物の数を決定した。

プロトプラストの再生 1.プロトプラスト懸濁液、融合混合物または自己融合物
をＰ緩衝液で適当に希釈し、100μｌを再生寒天培地上
でゆるやかな拡張法（ジエントルスプレツド法）を用い
て培養した。軟寒天オーバーレイ中に融合したプロトプ
ラストを拡げてもその再生はあまり改善されなかつた。

2.適当な場合には上記のD.11に記述された手順を使用し
た。

3.その再生プレートを密封プスチツク袋に入れ20-30
℃、約95％湿度で右側を上にして培養した。

4.スペクチノマイシン耐性を主な選択マーカーとして用
いたプロトプラスト融合物では、再生プロトプラストを
高圧滅菌して、45℃未満で添加した軟寒天（下記参照）
中の100μg/mlスペクチノマイシン（35ml）で上を覆つ
た。

5.原形質体を7-10日間培養した。

増殖培地、再生培地およびプロトプラスト緩衝液完全再
生培地 〔ホツプウツド（Hopwood）らによるストレプトミセス
の遺伝子操作：実験質手引（Genetic Manipulation of
Streptomyces:A Laboratory Manual）〕p.235（1985）
の改良法） 基本溶液 シヨ糖 205g K₂SO₄ 0.25g MgCl₂・６H₂O 10.12g グルコース 10g Difcoカザアミノ酸 0.1g Difco酵母エキス 5.0g Difcoオートミール寒天 3.0g Difcoバクト寒天 22.0g 蒸留水 955mlにする 121℃で25分高圧滅菌する。高圧滅菌した後下記の滅
菌貯蔵液を添加した： KH₂PO₄（0.5％） 10ml CaCl₂・２H₂O 5ml Ｌ−プロリン（20％） 15ml MES緩衝液（1.0M） 10ml 微量元素溶液^* 2.0ml NaOH（1N） 3.0ml pH 6.5に調整し；容量を１にする。

＊微量元素溶液（ｌ当り） ZnCl₂ 40mg FeCl₃・６H₂O 200mg CuCl₂・２H₂O 10mg MnCl₂・４H₂O 10mg Na₂B₄O₇・10H₂O 10mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄・４H₂O 10mg スペクチノマイシン軟寒天オーバーレイ 下記以外は上記の完全再生培地 寒天 4.10g 上記のように高圧滅菌し、55℃に冷やす。スペクチノ
マイシン100mgを添加し、ふた付培養試験管に5ml密量ず
つ入れ、冷蔵し、使用直前に再度高圧滅菌する。

改良プロトプラスト（Ｐ）緩衝液 基本溶液： シヨ糖 205g K₂SO₄ 0.25g MgCl₂・６H₂O 2.02g 蒸留水 977mlにする 121℃で25分間高圧滅菌する。

高圧滅菌後、下記の滅菌貯蔵液を順番に添加する： KH₂PO₄（0.5％） 1ml 微量元素溶液^* 2ml CaCl₂・２H₂O（3.68％） 10ml MES緩衝液（1.0M） 10ml pH6.5に調整し、容量を１にする。

＊微量元素溶液の処方は上記の通りである。

改良酵母エキス−麦芽エキス、（YEME）培地 基本溶液 Difco酵母エキス 3g Difcoバクトーペプトン 5g Difcoバクト麦芽エキス 3g グルコース 10g シヨ糖 300g 蒸留水 973mlにする 121℃で25分間高圧滅菌する。高圧滅菌後、下記のも
のを添加する： MgCl₂・６H₂O（2.5M） 2ml グリシン（20％） 25ml 容量を１に調整する。

図面の説明 第１図：脂肪酸不含有培地（WPM SymA40:40）上で増殖
した後のS. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）からの
溶媒抽出からの分画のHPLCクロマトグラフの時間（分）
に対するUV記録（240nm）。13.12分におけるピークはオ
リゴマイシンＡである。

第２図：脂肪酸不含有培地（WPM SynA40:40）上で増殖
した後のS. アベルミチリスMA4848（ATCC31272）の溶媒
抽出からの分画のHPLCクロマトグラフのUV記録（240n
m）。生成物は天然アベルメクチンである。

第３図：シクロペンチルカルボン酸含有培地上で増殖し
た後のS. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）の溶媒抽
出からの分画のHPLCクロマトグラフのUV記録（240nm）
（実施例１参照）。

添付した図は示した化合物のHPLC曲線の正確な記録で
ある。

以下の実施例に使用された培地の組成を以下に示す。
全ての分子量の決定はトリエチレングリコールの固体塩
化ナトリウムとの試料マトリツクスを用いるVGモデル70
70E質量分光計による高速原子衝撃質量分光決定法によ
つて得た。（Ｍ＋Na）⁺が決定される。電子衝撃質量分
光測定法はVEモデル7070F質量分光計を用いて実施しm/e
値が得られ、主要フラグメント値のみが記録される。

AS-7培地 g/l 細片化澱粉^α 20 アルダミン（Ardamine）pH^b ５ フアルマメジア（Pharmamedia）^c 15 CaCo₃ ２ ａ バチリス リケニホルミス〔Bacillus licheniformi
s;ノボエンザイムス（Nevo Enzymes）、ウイルトン（Wi
lton）、CTより購入し、「テルマミル（Termanyl）」と
の商標で販売されている〕からのα−アミラーゼによる
澱粉の加水分解で製造されるもので、ブドウ糖（デキス
トロース）価が40％±５％である。

ｂ イーストプロダクツ（Yeast Products）社、クリフ
トン（Clifton）、NJ07012より購入。

ｃ トレイダーズプロテイン（Traders Protein）、メ
ンフイス（Memphis）、TN38018より購入。NaOHでpH7.2
に調整する。

AP-5培養地 g/l 細片化澱粉 80 アルダミン pH ５ K₂HPO₄ １ MgSO₄・７H₂O １ NaCl １ CaCO₃ ７ FeSO₄・７H₂O 0.01 MnCl₂・７H₂O 0.001 ZnSO₄・７H₂O 0.001 Ｐ−2000（アンチ型） 1ml/l 25％NaOHでpH6.9に調整する。

WPM Syn A 40:40 g/l蒸留水 細片化澱粉 40 ジヤガイモ可溶澱粉 40 グルタミン酸 1.0 アルギニン 0.168 シスチン 0.084 ヒスチジン 0.069 ロイシン 0.798 リジン 0.297 メチオニン 0.108 フエニルアラニン 0.168 スレオニン 0.174 トリプトフアン 0.048 チロシン 0.192 K₂HPO₄1.0 MgSO₄・７H₂O 1.0 NaCl 1.0 CaCO₃ 3.5 FeSO₄・７H₂O 0.01 MnCl₂・４H₂O 0.001 ZnSO₄・７H₂O 0.001 pH6.8-7.0に調整し、121℃で30分間撹拌する。

WPM Syn A 40:40 g/l蒸留水 ジヤガイモ可溶澱粉 40 細片化澱粉 40 グルタミン酸 0.390 アルギニン 0.168 シスチン 0.084 ヒスチジン 0.069 リジン HCl 0.297 メチオニン 0.108 フエニルアラニン 0.168 スレオニン 0.174 トリプトフアン 0.048 チロシン 0.192 K₂HPO₄１ MgSO₄・７H₂O １ NaCl １ CaCO₃ 3.5 FeSO₄・７H₂O 0.01 MnCl₂・４H₂O 0.001 ZnSO₄・７H₂O 0.001 pH6.8-7.0に調整し、121℃で30分間撹拌する。

高速液体クロマトグラフイ（HPLC）の一般的手順 移動相： 水 150ml アセトニトリル 70ml メタノールで１にする カラム： ウルトラスフエアー（Ultrasphere）ODS 25cm〔ベツ
クマンインスツルメンツ（Beckman Instruments）、フ
レルトン（Fullerton）、（A92634-3100） 流速:0.75ml/min 検出:UV 240nm アテニユエイシヨン:6付近 試料希釈度（Ｄ）： 35mlアセトニトリル＋390mlメタノール 標準試料 1.アベルメクチンA2A（0.5mg）を10mlフラスコに秤量
し、メタノールで10mlにする。

2.試験生成物（0.5mg）を10mlフラスコに秤量し、メタ
ノールで10mlにする。

１および２が標準貯蔵溶液である：実験には標準溶液に
ついて： 100μｌ（１）および100μｌ（２）をバイアルに取
り、800μｌの移動相を添加する。

試料： 1.よく振蘯した培養液1mlを取り、遠心する。

2.ペレツトをかき乱さないでできるだけ多くの上清を除
去する。

3.そのペレツオにHPLC水（100μｌ）を添加しボルテツ
クスで混合して分散させる。

4.希釈液（Ｄ）2mlを添加して、よく混合する。

5.その混合液を過してHPLCにかける。

天然アベルメクチンを本HPLCクロマトグラフイー手順
にかけ、存在するオリゴマイシンＡ（行なわれたHPLC決
定法における内部標準として役立つ）で観察される保持
時間で個々のアベルメクチンのピークの保持時間を割つ
た。オリゴマイシンＡはS.アベルミチリス発酵の副産物
としてHPLCでほとんど常に観察され、Ｒが本明細書で定
義されたものである酸RCOOHまたはＲが本明細書で定義
されたものである式RCOOHの酸に変換できる化合物を含
まない培地中で培養した時本明細書に記載された突然変
異体によつて生産されるHPLCで観察できる唯一の生成物
である。典型的には、オリゴマイシスＡ保持時間は12.5
-14分である。保持時間（RT）の比率はアベルメクチン
生成物の同定および収率を比べるために極めて重要な根
拠を提供する。HPLCにおけるアベルメクチン生成物の一
般的な出現順序はB2、A2、B1およびA1である（第２
図）。

天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） B2b 0.70 B2a 0.84 A2b 0.90 A2a 1.09 B1b 1.40 B1a 1.83 A1b 1.83 A1a 2.42 非天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） シクロペンチルB2 0.94 シクロペンチルA2 1.23 シクロペンチルB1 1.99 シクロペンチルA1 2.62 比率は天然アベルメクチンは第２図（B1aとA1bが解離
していないことに注意）、非天然アベルメクチンは第３
図から決定した。保持時間は測定日が異なると１〜２分
変化し、オリゴマイシンＡは概して12.5〜14分付近に出
現する。

以下の実施例では、アベルメクチンは上述のHPLC法に
よつて決定した。

実施例1. シクロペンチルアベルメクチンA2 S. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）をAS−７培地
中28-30℃で24時間振盪培養した。AS−７培地（100ml）
を入れた500mlフラスコに振盪培養液5mlを播種し、同条
件下で24時間培養した。この培養液1mlをAP−５培地（3
00mlフラスコに40ml）に播種し、24時間後にシクロペン
タンカルボン酸（ナトリウム塩;0.4g/l）を添加した。
生成物フラスコを28-30℃で振盪を続けた。240時間まで
に35mg/lのシクロペンチルアベルメクチンA2が生成した
が、相当する天然型A2aの量は０であつた。他のシクロ
ペンチルアベルメクチンも生成した。

実施例2. シクロペンチルアベルメクチンA2 S. アベルミチリスHL-026（ATCC53568）の凍結バイア
ルを500mlフラスコ中のAS−７培地（100ml）に播種に用
いた。28-30℃で24時間振盪培養して増殖させた。その1
mlを２個のAS−７培地（100ml）を含む500mlフラスコに
播種し、18時間培養した後、これらのフラスコ内容物を
10lのAP−５（NaCl除く）培地に播種した。28℃で24時
間播種した後、0.4g/lのスクロペンタンカルボン酸をそ
の培地に添加した。溶存酸素を飽和の20％以上に保持し
て振盪した。120、168、216、264および312時間におけ
るシクロペンチルA2の量はそれぞれ16、40、65、88およ
び110mg/lであつた。対照的に相当する天然アベルメク
チンA2aの量はこれらの試料では０（すなわち検出でき
ない）であつた。

実施例3. シクロペンチルアベルメクチンA2 本実験では、生成培地を富栄養にし、シクロペンタン
カルボン酸を複式添加して、シクロペンチルアベルメク
チンの量を増加させた。移植片の発育および発酵のため
の条件は以下の点を除いて実施例２に記述したものと同
じであつた:5g/lアルダミンpHをAP−５培地に追加（全
体で10g/l）し、0.4g、0.2および0.2g/lのシクロペンタ
ンカルボン酸をそれぞれ30、172および220時間に添加し
た。シクロペンチルアベルメクチンA2の量は、120、16
8、216、246および312時間後、それぞれ12、11、78、13
7および214mg/lであつた。

実施例4. シクロペンチルアベルメクチン S. アベルミチリスHL-026（ATCC53568）の凍結バイア
ルをAS−７培地（100ml）を入れた500ml気流調整フラス
コに播種し、28-30℃で24-28時間培養した。次にこの培
養物1mlをAP−５培地40ml（NaCl含まないが0.6g/lグル
タミン酸を含有）を入れた300mlフラスコに播種した。2
8-30℃で96時間振盪培養した後、シクロペンタンカルボ
ン酸（ナトリウム塩;0.4g/l）を添加した。216時間培養
試料のHPLCクロマトグラフイーはシクロペンチルアベル
メクチンB2、A2、B1およびA1を、それぞれ保持時間12.3
5、15.86、25.28および32.96分に示した。

実施例5. シクロペンチルアベルメクチンA2 本実施例では、S. アベルミチリスＩ−３（ATCC5356
7）およびS. アベルミチリスHL-026（ATCC53568）を同一
条件下で増殖させた。３種類の培地（AP−５、WPM SynA
40:40およびWPM SynB40:40）を使用した。各生物体の
凍結培養物をAS−７培地（100ml）を入れた500ml気流調
整フラスコに播種し、28-30℃で24-26時間培養した。次
にこの培養物1mlを３種類の培地のうち１種（40ml）を
入れた300mlフラスコに播種した。各フラスコに対し２
回の実験を行なつた。28℃で24時間振盪培養した後、各
フラスコに0.4g/lのシクロペンチルカルボン酸（ナトリ
ウム塩）を添加し、全体で192時間培養した後の主要生
成物、シクロペンチルアベルメクチンA2の量を決定した
（表Ｉ）。

実施例6. シクロヘキシルアベルメクチン 本実施例では、0.2g/lのシクロヘキシルカルボン酸を
96時間培養時にシクロペンタンカルボン酸の代りに添加
した。他の条件は全て実施例４に記述されたものと同じ
であつた。４種のシクロヘキシルアベルメクチンが240
時間培養試料のHPLCクロマトグラムで同定された。シク
ロヘキシルアベルメクチンB2、A2、B1およびA1の保持時
間はそれぞれ14.84、19.26、31.46および41.14分であつ
た。

実施例7. ３−シクロヘキセニルアベルメクチン 本実施例では、0.2g/lの３−シクロヘキセンカルボン
酸を96時間培養時にシクロペンタンカルボン酸の代りに
添加した。他の条件は全て実施例４に記述されたものと
同じであつた。312時間培養試料のHPLCクロマトグラム
で数種のシクロヘキセニルアベルメクチンが同定され
た。それらの保持時間はそれぞれ12.88（B2）、16.39
（A2）、27.37/28.36（B1異性体）および35.80/37.13
（A1異性体）分であつた。

実施例8. ３−チエニルアベルメクチン 本実施例では、96時間培養時にシクロペンタンカルボ
ン酸の代りにチオフエン−３−カルボン酸を添加した。
他の条件は全て実施例４に記述されたものと同一であつ
た。312時間培養試料のHPLCクロマトグラムで４種類の
３−チエニルアベルメクチンが同定された。３−チエニ
ルアベルメクチンB2、A2、B1およびA1の保持時間はそれ
ぞれ6.96、8.76、13.8および23.5分であつた。

実施例9. １−メチルチオエチルアベルメクチン 本実施例では、シクロペンタンカルボン酸の代りに0.
4および0.2g/lの２−メチルチオプロピオン酸をそれぞ
れ24および96時間培養時に添加した。他の条件は全て実
施例４に記述されたものと同一であつた。240時間培養
試料のHPLCクロマトグラムで２種の１−メチルチオエチ
ルアベルメクチンが同定された。３−チエニルアベルメ
クチンA2およびB1の保持時間はそれぞれ9.30および13.6
分であつた。7.557分のピークの前面シヨルダーとして
出現する約7.2分の保持時間と評価されたピークはB2化
合物であると思われ、A1化合物は17.22分のピークの下
にあると思われる。

実施例10. ２−ペンチルアベルメクチン 本実施例では、シクロペンタンカルボン酸の代りに0.
2g/lの２−メチル吉草酸を96時間培養時に添加した。他
の条件全ては実施例４に記述されたものと同一である。
312時間培養試料のHPLCクロマトグラムで４種の２−ペ
ンチルアベルメクチンが同定された。２−ペンチルアベ
ルメクチンB2、A2、B1およびA1の保持時間はそれぞれ1
2.88、16.58、31.90および41.92分であつた。

実施例11. １−メチル−３−ブテニルアベルメクチン 本実施例では、シクロペンタンカルボン酸の代りに0.
2g/lの２−メチル−４−ペンテン酸を96時間培養時に添
加した。他の条件全ては実施例４に記述されたものと同
一である。312時間培養試料のHPLCクロマトグラムで４
種の１−メチル−３−ブテニルアベルメクチンが同定さ
れた。１−メチル−３−ブテニルアベルメクチンB2、A
2、B1およびA1の保持時間は、それぞれ11.13、14.78、2
2.10および28.92分であつた。

実施例12. １−メチル−１−ブテニルアベルメクチン 本実施例では、シクロペンタンカルボン酸の代りに0.
2g/lの２−メチル−２−ペンテン酸を添加した。他の条
件は全て実施例４に記述されたものと同一であつた。31
2時間培養試料のHPLCクロマトグラムで４種の１−メチ
ル−１−ブテニルアベルメクチンが同定された。１−メ
チル−１−ブテニルアベルメクチンB2、A2、B1およびA1
の保持時間は、それぞれ11.59、14.93、25.29および33.
18分であつた。

実施例13. 本実施例では、Ｌ−イソロイシンから誘導されるアベ
ルメクチンは生成せず、Ｌ−バリンから誘導される天然
アベルメクチンを生成する突然変異体の使用を例示す
る。S. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）を入れた凍
結バイアルの内容物を500ml気流調整フラスコに入れたA
S−７培地（100ml）に移した。28-30℃でほぼ１日振盪
（約200rpm）培養した後、培養内容物1mlを300mlフラス
コに入れたWPM Syn A40:40培地（40ml）に播種し、続け
て28-30℃で24時間振盪培養する。この時点でイソ酪酸
（NaOHでpH6−７に中和したもの）の滅菌溶液（4mg/ml;
4ml）を添加し、上述のようにして全体で８日間培養し
た。HPLC分析は４個の主要ピーク（オリゴマイシンは除
く）を示した。イソ酪酸の２−メチル酪酸に置換した同
様の実験では、Ｌ−イソロイシンから誘導される相補的
な４ピークが観察された。

実施例14. シクロペンタンカルボン酸を下表の原料化合物に置換
して、実施例１の手順を繰り返した。規定の発酵から同
定されたアベルメクチン（R²がオレアンドローズ＝糖類
部分であり、Ｒ、R¹およびR³が示したものである式Ｉ化
合物）も登録される。

上記化合物のうちあるものの他の物理化学的データを
以下に記述する。

実施例15. シクロペンチルアベルメクチンA2回収 本実施例はシクロペンタンカルボン酸から形成される
A2様アベルメクチンのための回収方法を例示する。（実
施例２の発酵と同様の発酵からの）全培養液を過し、
菌糸体細胞塊をアセトン（３倍容積）で２回抽出した。
そのアセトン抽出液を濃縮して水性油状物にし、塩化メ
チレンで抽出して濃縮すると暗褐色油状物が得られた。
次にその暗褐色油状物をメタノール／水（4:1）に溶解
し、生じた溶液をヘキサンで抽出して脂肪酸／脂質を除
いた。そのメタノール／水を留去すると約10％シクロペ
ンチルアベルメクチンA2W/W含有淡褐色油状物が得られ
た。次に粗製アベルメクチン油状物をクロロホルム（油
状物ｇ当りCHCl₃ 3ml）で希釈し、活性炭（0.35g/g油状
物）およびシリカゲル（1g/g油状物）を添加し、その混
合物を１時間撹拌して過した。液を濃縮して生じた
油状物をイソプロピルエーテル（油状物ｇ当りIPE 1m
l）で希釈した。次に生じた溶液を大量のヘキサン（25m
lヘキサン/g油状物）に徐々に滴下すると、白色の粗製
アベルメクチン粉末が沈殿した。第１生成物を過によ
り単離し、次にその液を約５℃に冷却すると第２生成
物が沈殿した。

その粗製物を分取用高速液体クロマトグラフイーで更
に処理すると精製生成物が得られた。粗製物を25/25/25
/50/0.125 IPE/CH₃CN／酢酸エチル／ヘキサン／酢酸に
（4.1ml溶媒/g粗製粉末）で溶解した。試料を41.4mm×2
5cmのシリカ分取カラムに注入し、30ml/分の流速で上記
溶媒を用いて溶離し、生成物含有ピークを集めた。集め
た分画を濃縮してMeOH/H₂O（86/14）で1mlに約50mgの生
成物を含むように希釈した。次に試料をＣ−18分取カラ
ム（シリカカラムと同寸法）に注入し18-20ml/分の流速
でMeOH/H₂O（275mlのH₂Oをメタノールで2lに調整した混
合液）を用いて溶離した。分画を再び濃縮し、２度目の
Ｃ−18分取カラムを通した。生成物含有分画を乾燥する
まで留去すると純粋な表題生成物が得られた。

相当するシクロペンチルアベルメクチンB2、A1および
B1は上記HPLC手段からの適切な分画を集めて回収され
る。

実施例16. YPD−２寒天培地からのS. アベルミチリスJC923（ATCC
53669）菌糸体を300ml気流調整フラスコ中のAS−７培地
（50ml）に播種し、30℃で24時間振盪（220rpm）培養し
た。次に50mlのAP−５培地を入れた２個のフラスコ（気
流調整なし）の各々にその培養物1mlを播種した。一方
のフラスコは２−メチル酪酸（0.1％）を含み、他方は
２−メチル酪酸を含まない。発酵は30℃で11日間振盪し
て実施した。各フラスコの内容物を同じ方法で処理し
た。全培養液を４倍量のアセトニトリル：メタノール
（810:75）で抽出した。細胞から抗生物質抽出を促進す
るため激しく振盪した後、透明になつた上清をHPLCでア
ベルメクチンを分析した。脂肪酸前駆体を添加しない場
合、アベルメクチン（“AA"型）は検出されなかつた
（感度0.20mg/l）。２−メチル酪酸存在下では、アベ
ルメクチンB2a、A2a、B1a、A1aはそれぞれ0.5、1.3、1.
4および1.1mg/lと測定された。

実施例17. 本実施例では、実施例16におけるようにAS−７増殖移
植片からS. アベルミチリスJC923（ATCC53669）のAP−５
生成発酵物を製造した。原料化合物２−メチル酪酸は0.
05％濃度存在した。本場合、非添加の対照発酵（脂肪酸
前駆体なし）はアベルメクチンB2a、A2a、B1aおよびA1a
がそれぞれ0.2、09、＜0.2および＜0.2mg/l生じたが、
脂肪酸添加発酵からはそれぞれ2.8、5.0、4.5および2.3
mg/l生じた。

実施例18. 本実施例では、実施例17におけるようにS. アベルミチ
リスJC923（ATCC53669）のAP生成発酵物をAS−７移植片
から製造した。本実施例では、AP−５培地に播種して48
時間後、２−メチル酪酸を0.05％濃度に添加し、過し
て細胞を集めて、重量（湿重量）を測り、４倍量の抽出
溶媒で抽出した。本濃縮工程により、全培養液を直接抽
出する以前の場合よりもアベルメクチン定量測定の感度
が良化させる。本実施例では、B2a、A2a、B1aおよびA1a
のレベルは非添加の対照の0.3、0.3、0.3および0.1に比
べて２−メチル酪酸添加発酵では2.5、8.5、4.5および
3.5mg/lと決定された。この対照の低レベルは多分粗製A
P−５生成培地中に低レベルで内在する脂肪酸化合物に
よる。

実施例19. ２−メチル酪酸添加の代りにシクロペンタンカルボン
酸を0.045％濃度で添加することを除いて実施例18にお
けるようにして発酵を実施した。シクロペンチルアベル
メクチンA2は4mg/l濃度存在すると決定された。

実施例20. S. アベルミチリスPGS-119（ATCC53670）の発酵を300m
lフラスコ（気流調整なし）中のAP−５培地（50ml）中
で30℃で培養して実施した。300ml気流調整フラスコ中
のAS−７培地（50ml）で30℃で24時間培養したその株の
培養液1mlをAP−５培地に播種した。AP−５培地中で66
時間増殖した後、イソ酪酸を0.1％濃度で８個のフラス
コに添加した。実施例16の処理手順を用いると、これら
の添加フラスコではB2b、A2b、B1bおよびA1b濃度（２回
の実験の平均）は、それぞれ5.6、4.5、45および68mg/l
生じた。非添加培養ではそれぞれ0.5、4.0、4.5および
8.5mg/l生じた。加えて非添加発酵では相当するB2a、
A2a、B1aおよびA1aのアベルメクチンは1.1、1.1、不確
認およびmg/lで生じた。

実施例21. 本実施例では、S. アベルミチリスPGS-119（ATCC5367
0）のAP−５発酵を４本のプラスチツク試験管（15ml）
中の2ml培養液中で実施した。移植片は実施例20に記述
されたようにAS−７培地中30℃で試験管を30°傾斜させ
た位置に保持しながら振盪して実施した。AP−５に播種
して96時間後、２本の試験管に脂肪酸前駆体シクロヘキ
サンカルボン酸（CHC）を0.045％濃度で添加した。AP−
５播種後400時間で、各試験管にAS−７培養0.05mlに対
して、8mlの抽出溶媒（アセトニトリル：メタノール、8
10:75）を添加し、本文に記述されたようなHPLC分析に
よつてアベルメクチン量を決定した。アベルメクチンCH
C-B2、CHC-A2、CHC-B1、CHC-A1、B2b、B1b、A1b、A2bと
A1aの濃度は（２本の試験管の平均で）それぞれ3.5、6.
2、3.0、1.4、0.2、0.2、0.4、0.2、＜0.2mg/lであつ
た。前駆酸を添加しない２本の発酵チユーブにおける相
当値はそれぞれ＜0.2、＜0.2、＜0.2、＜0.2、4.2、2.
9、9.3、1.2、0.3mg/lであつた。他の天然アベルメクチ
ンは全て実質上検出できなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図：脂肪酸不含有培地（WPM SynA40:40）上で増殖
した後のS. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）からの
溶媒抽出からの分画のHPLCクロマトグラフの時間（分）
に対するUVスペクトル（240nm）である。 第２図：脂肪酸不含有培地（WPM SynA40:40）上で増殖
した後のS. アベルミチリスMA4848（ATCC31272）の溶媒
抽出からの分画のHPLCクロマトグラフのUVスペクトル
（240nm）である。 第３図：シクロペンチルカルボン酸含有培地上で増殖し
た後のS. アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）の溶媒抽
出からの分画のHPLCクロマトグラフのUVスペクトル（24
0nm）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シー−ジェン・エドワード・リー アメリカ合衆国コネチカット州ウォーター フォード，ウォータービュー・ドライブ 12 (56)参考文献 米国特許4310519（ＵＳ，Ａ) 米国特許4429042（ＵＳ，Ａ)

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の活性の一方または両方を欠くが、適
   当なプライマー酸あるいは発酵の過程で該酸に転化し得
   る化合物の存在下にアベルメクチンを産生する能力を有
   するストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces
   avermitilis）： 分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ、 分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ。
2. 【請求項２】透過された細胞が添加された［¹⁴Ｃ−１］
   −２−オキソイソカプロン酸から¹⁴CO₂を生ずる能力の
   ないことを特徴とする、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
   ナーゼを欠くストレプトミセス アベルミチリス。
3. 【請求項３】ストレプトミセス アベルミチリスATCC53
   567である特許請求の範囲第１項のストレプトミセス
   アベルミチリス。
4. 【請求項４】ストレプトミセス アベルミチリスATCC53
   568である特許請求の範囲第１項のストレプトミセス
   アベルミチリス。
5. 【請求項５】Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ
   −バリンを欠く培地では増殖できないことを特徴とす
   る、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼを欠くストレプ
   トミセス アベルミチリス。
6. 【請求項６】ストレプトミセス アベルミチリスATCC53
   669である特許請求の範囲第１項のストレプトミセス
   アベルミチリス。
7. 【請求項７】ストレプトミセス アベルミチリスATCC53
   670である特許請求の範囲第１項のストレプトミセス
   アベルミチリス。
8. 【請求項８】好気的条件下、炭素、窒素および無機塩の
   同化源からなる水性栄養培地であって、上記培地が式RC
   OOH［Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルであ
   る］の酸またはストレプトミセス アベルミチリスによ
   って該酸に変換できる化合物を含むときにのみ、その培
   地中における発酵で下記式（Ｉ）の化合物を合成できる
   ストレプトミセス アベルミチリス。 ［式中、22-23位の破線は随意の二重結合を表わし； R¹は水酸基で、二重結合が存在しない時だけ存在し； R²は式： の４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレ
   アンドロシルオキシであり； R³は水素またはメチルであり；そして Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルであ
   る。］
9. 【請求項９】該ストレプトミセス アベルミチリスがス
   トレプトミセス アベルミチリスATCC53567、ATCC5356
   8、ATCC53669またはATCC53670である特許請求の範囲第
   ８項記載のストレプトミセス アベルミチリス。
10. 【請求項１０】分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
    性および分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性の一方
    または両方を欠くが、適当なプライマー酸あるいは発酵
    の過程で該酸に転化し得る化合物の存在下にアベルメク
    チンを産生する能力を有するストレプトミセス アベル
    ミチリスの一菌株を、窒素、炭素および無機塩の同化源
    およびアベルメクチン生合成に利用できる化合物からな
    る水性栄養培地中で好気的発酵させることからなる下記
    式（Ｉ）のアベルメクチンの製造法。 ［式中、22−23位の破線は随意の二重結合を表わし； R¹は水酸基で、二重結合が存在しない時だけ存在し； R²は式： の４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレ
    アンドロシルオキシであり； R³は水素またはメチルであり；そして Ｒはα−分枝鎖基（−COOH基が付いた炭素原子に水素以
    外の原子または基が少くとも２個付いている）。］
11. 【請求項１１】アベルメクチン生合成に利用できる化合
    物が式 Ｒ−COOH （式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル以
    外のもの）の酸またはストレプトミセス アベルミチリ
    スによって該酸に変換できる化合物である特許請求の範
    囲第10項記載の方法。
12. 【請求項１２】ストレプトミセス アベルミチリスがAT
    CC53567、ATCC53568、ATCC53669またはATCC53670である
    特許請求の範囲第10項記載の方法。
13. 【請求項１３】上記化合物が式 Ｒ−COOH ［式中Ｒはα−分枝鎖基（−COOH基が付いた炭素原子に
    水素以外の原子または基が少なくとも２個付いてい
    る）］または発酵工程中に該化合物に変換できる化合物
    である特許請求の範囲第10項記載の方法。
14. 【請求項１４】Ｒがα−分枝C₃-C₈アルキル、アルケニ
    ル、アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキルチ
    オアルキル基；アルキル基がα−分枝C₂-C₅アルキル基
    であるC₅-C₈シクロアルキルアルキル基；C₃-C₈シクロア
    ルキルまたはC₅-C₈シクロアルケニル基で、それらのい
    ずれかが随意にメチレンや１個またはそれ以上のC₁-C₄
    アルキル基またはハロゲン原子で置換されたもの；また
    は３〜６員の酸素または硫黄を含む複素環（これは飽
    和、または全体あるいは一部が不飽和であり得るし、随
    意に１個またはそれ以上のC₁-C₄アルキル基またはハロ
    ゲン原子で置換し得る）、または発酵工程中に該化合物
    に変換できる化合物である特許請求の範囲第13項記載の
    方法。
15. 【請求項１５】基質RCOOHに変換できる化合物が Ｒ−(CH₂)_n−Ｚ （式中Ｒは既に定義されたものであり;nは0,2,4または
    ６であり;Zは-CH₂OH、−CHO、-COOR⁵、-CH₂NH₂または-C
    ONHR⁶である）［ここでR⁵はＨまたは（C_1-6）アルキル
    で、R⁶は水素、（C_1-4）アルキル、-CH(COOH)CH₂COOH、
    -CH(COOH)(CH₂)₂COOHまたは-CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃であ
    る］か、またはストレプトミセス アベルミチリス株が
    分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性のみを欠く時に
    は、基質RCOOHに変換できる化合物がＲ−CO−Ｚである
    特許請求の範囲第13項記載の方法。
16. 【請求項１６】Ｒがシクロブチル、シクロペンチル、シ
    クロヘキシル、シクロヘプチル、２−メチルシクロプロ
    ピル、３−シクロヘキセニル、１−シクロペンテニル、
    １−シクロヘキセニル、３−メチルシクロヘキシル（シ
    ス／トランス）、４−メチレンシクロヘキシル、３−メ
    チルシクロブチル、３−メチレンシクロブチル、３−シ
    クロペンテニル、１−シクロプロピルエチル、３−フル
    オロシクロブチル、4,4−ジフルオロシクロヘキシル、
    イソプロピル、sec−ブチル、２−ペンチル、2,3−ジメ
    チルプロピル、２−ヘキシル、２−ペント−４−エニ
    ル、２−メチルチオエチル、Ｓ−２−メチルペンチル、
    Ｒ−２−メチルペンチル、２−チエニル、３−チエニ
    ル、４−テトラヒドロピラニル、３−フリル、２−クロ
    ロチエニル、３−テトラヒドロチエニル、４−メチルチ
    オ−２−ブチル、４−テトラヒドロチオピラニル、４−
    メトキシ−２−ブチルまたは４−メチルチオ−２−ブチ
    ルである特許請求の範囲第14項記載の方法。
17. 【請求項１７】Ｒがシクロペンチル、シクロヘキシルま
    たはチエニルである特許請求の範囲第16項記載の方法。
18. 【請求項１８】Ｒがα−分枝C₃-C₈アルキル基である場
    合、Ｒがイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルでな
    い特許請求の範囲第14項記載の方法。
19. 【請求項１９】ストレプトミセス アベルミチリスの菌
    株がストレプトミセス アベルミチリスATCC53567、ATC
    C53568、ATCC53669またはATCC53670である特許請求の範
    囲第14項記載の方法。
20. 【請求項２０】好気条件下に、炭素、窒素および無機塩
    の同化源からなる水性栄養培地であって、該培地が式RC
    OOH（式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル
    である）の酸またはストレプトミセス アベルミチリス
    によって該酸に変換できる化合物を含む場合にのみ該培
    地中における発酵で下記式（Ｉ）の化合物を生産でき
    る、ストレプトミセス アベルミチリスの新規菌株（た
    だし該菌株はストレプトミセス アベルミチリスATCC31
    271またはATCC31272を突然変異させることからなる方法
    で得られる）。 ［式中、22-23位の破線は随意の二重結合を表わし； R¹は水酸基で、二重結合が存在しない時だけ存在し； R²は式： の４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレ
    アンドロシルオキシであり； R³は水素またはメチルであり；そして Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルであ
    る。］
21. 【請求項２１】Ｒがシクロヘキシルである請求項17の方
    法。
22. 【請求項２２】Ｒがシクロヘキシルである請求項15の方
    法。