JPH0817703B2 - 外来遺伝子産物の生産方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラ
スミド［ハイブリッドプラスミド（以後Hi−プラスミド
と称する）］を導入した大腸菌を、該外来遺伝子の発現
を効果的に制御しながら効率良く増殖させ、菌体の増殖
と外来遺伝子の発現の時期を分離したHi−プラスミド導
入大腸菌の培養による外来遺伝子産物の生産方法に関す
る。

〔従来の技術〕

近年、遺伝子組換え技術の発達により、宿主菌での外
来遺伝子の形質発現を可能とする発現ベクターに、動
物、植物、微生物等から得た所望の外来ポリペプチドを
コードする製造遺伝子を組み込んで、Hi−プラスミドを
構築し、そのHi−プラスミドを導入した宿主菌を培養し
て、宿主菌に所望の外来ポリペプチドを生産させる方法
が開発されてきている。

この技術により、例えばヒトインシュリン、ヒト成長
ホルモン等の有用物質の大量生産が可能となりつつあ
る。

このような遺伝子組換え技術を用いた外来遺伝子産物
を生産するために用いる宿主菌としては、その生物学的
特性の解析が十分になされており、また病原性を持た
ず、簡単な組成の培地で容易に培養可能であるという点
から大腸菌が広く用いられている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところが、一般にHi−プラスミドの大腸菌内での安定
性は必ずしも高くなく、それを導入した大腸菌の培養で
は、菌の増殖にともなって、Hi−プラスミドの構造的変
化やHi−プラスミド自体の消滅により外来遺伝子の発現
能を失ったHi−プラスミド脱落菌が出現してくる。

例えば、大量培養を行なう工業的規模での生産では、
一般に種培養を含めた培養期間が長く、上記のようなHi
−プラスミド脱落菌の出現が避けられず、しかも全培養
菌あたりのHi−脱落菌の割合が高くなると、最終的に得
られる培養物中の所望の外来遺伝子産物の濃度の低下を
招き、効率良い外来遺伝子の生産ができない。

また、外来遺伝子の発現をともなった培養では、菌の
良好な増殖状態が得られにくい。

そこで、このようなHi−プラスミドを用いた培養にお
ける問題点を解決する手段の一つとして、菌の増殖と外
来遺伝子の発現期間とを分離させる方法が検討されてい
る。

具体的には、まず導入されたHi−プラスミドの外来遺
伝子の発現を制御しつつ該プラスミド導入菌を培養し、
所望の菌体量が得られたところで、発現の制御を緩和し
て外来遺伝子を発現させて、Hi−プラスミド脱落菌の発
生を極力抑え、より効率良く外来遺伝子産物を生産しよ
うとするものである。

このような方法に用いられる外来遺伝子の発現制御方
法としては、例えば、Hi−プラスミドに、大腸菌ラムダ
ファージのP_Lプロモーター（P_Lラムダプロモーター）・
オペレーターや大腸菌トリプトファンオペロンのプロモ
ーター（trpプロモーター）・オペレーター等のレプレ
ッサーを不活性化する誘導試薬の添加によって任意の時
期に外来遺伝子の発現を誘発できる誘導型発現プロモー
ターを用いる方法や、温度依存性を有する複数開始領域
を持つ（すなわちその複製開始に必要な所定の温度もし
くは温度範囲を有する）温度制御型のベクターを用い、
培養温度を調節し、ヒートショックを与えることによっ
て外来遺伝子の発現を制御する方法が知られている。

しかしながら、誘導型発現プロモーターを用いた方法
では、発現誘導のための誘導試薬が高価であるため生産
コストの上昇を招き、またHi−プラスミド脱落菌の出
現、増加を十分に抑えられないという問題があり、工業
的な規模での培養には適用しにくい。

また、温度制御型のベクターを用いた場合でも、Hi−
プラスミド脱落菌の出現防止効果が十分でなく、更に温
度制御のために培養装置が複雑化してしまうという欠点
もある。

本発明者らは、以上述べたような問題点に鑑み、より
効率良い外来遺伝子産物の生産を実現するために、Hi−
プラスミド導入大腸菌の培養工学的特性について種々検
討を加えたところ、Hi−プラスミド導入大腸菌を、培地
中の炭素源として利用され得るグルコース等の代謝速度
の速い糖濃度を調製して培養することによって該大腸菌
での外来遺伝子の発現を効果的に制御できることを新た
に見い出した。

更に、Hi−プラスミド導入菌を培養して外来遺伝子産
物を生産する際に、このような糖濃度の調整による発現
制御方法を用いて外来遺伝子の発現制御時期を操作し
て、菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離して培養
を行なえば、Hi−プラスミド脱落菌の発生を十分に抑え
た良好な菌体増殖と、効率良い外来遺伝子産物の生産が
可能となるとの結論を得て本発明を完成した。

本発明の目的は、Hi−プラスミドが導入された大腸菌
の培養において、Hi−プラスミドに挿入された外来遺伝
子の発現を簡易な操作によって効果的に制御できる方法
を提供することにある。

本発明の他の目的は、培養物に高濃度で所望の外来遺
伝子産物を効率良く生産することができる工業的規模で
の外来遺伝子産物のHi−プラスミド導入大腸菌を用いた
生産に好適な方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の方法における第１の培養過程での外来遺伝子
の発現制御は、発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿入
した組換え体プラスミドを導入して該外来遺伝子の発現
を可能とした大腸菌の培養に際し、炭素源として利用さ
れ得る糖の該大腸菌の培養培地中での濃度を0.3％以上
に維持することにより、前記外来遺伝子の発現を抑制す
ることを特徴とする。

本発明の方法に用いられるHi−プラスミド（組換え体
プラスミド）とは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能
とする構成を有する発現ベクターに所望の外来遺伝子を
挿入して得られるものである。

Hi−プラスミドを構成する発現ベクターとしては、例
えば大腸菌で複製可能なベクターと、該ベクターに結合
させた、P_Lラムダプロモーター、trpプロモーター、と
大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター（lacプロモ
ーター）の融合プロモーター（tacプロモーター）とP_L
ラムダプロモーターとの連結プロモーターを有する構成
のものを挙げることができる。これらのプロモーター類
は、カタボライトリプレッションを受けることは未だに
知られていない。

なお、ここでいう外来遺伝子とは、例えば真核細胞由
来のポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有す
る非大腸菌由来のポリペプチドなどの野性型大腸菌では
通常生産されないポリペプチドをコードする構造遺伝子
をいう。

本発明の方法における第１の培養過程での外来遺伝子
の発現制御は、Hi−プラスミド導入大腸菌の培地中の炭
素源例えばグルコース、フラクトース、マンノース、マ
ルトース、ソルビトール等の代謝速度の速い糖の濃度を
調整することによりHi−プラスミドに組込まれた外来遺
伝子の発現を抑制するものである。

具体的には、外来遺伝子の発現を抑制したい場合に
は、Hi−プラスミド導入大腸菌が培養されている培地中
の糖の濃度を0.3以上に維持し、外来遺伝子を発現させ
たい場合には、Hi−プラスミド導入大腸菌が培養されて
いる培地中の糖の濃度を0.3％未満に調整する。

このように糖の濃度を0.3％以上に維持してHi−プラ
スミド導入菌の培養を行なうと、外来遺伝子の発現を効
果的に抑制ができ、良好な菌体増殖が得られ、しかも所
望の菌体量が得られるまでの培養期間を通して、Hi−脱
落菌の出現を効果的に抑えることができる。

その上、本発明の方法における第１の培養過程での外
来遺伝子の発現制御は、炭素源の濃度調整という簡易な
操作で、外来遺伝子の発現を制御できるので、先に述べ
たような発現誘導試薬などのような特別高価な試薬を使
用しなくてもすみ、また特別な温度制御用の構造を培養
装置に付加しなくても良いという利点を有する。

このような本発明の方法における外来遺伝子の発現制
御を、Hi−プラスミド導入大腸菌を培養してHi−プラス
ミドに組込んだ外来遺伝子由来の外来遺伝子産物を生産
する方法に適用すれば、効率良く外来遺伝子産物の生産
が可能となる。

すなわち、上述した発現制御を用いたHi−プラスミド
導入大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法は、 ａ） 糖の存在下においてリプレッサーが配合し得るオ
ペレーターを有しないP_Lラムダプロモーター、または該
P_Lラムダプロモーターをtacモーターの直後に繋いだ連
結プロモーターを有する発現ベクターの該プロモーター
によってその発現が支配される位置に、前記外来遺伝子
産物をコードする外来遺伝子を挿入した構成の組換え体
プラスミドを調製する過程と、 ｂ） 該組換え体プラスミドを大腸菌に導入する過程
と、 ｃ） 該組換え体プラスミドが導入された大腸菌を、培
地中での炭素源として利用され得る糖の濃度を0.3％以
上に維持して前記外来遺伝子の発現を抑制しつつ培養す
る第１の培養過程と、 ｄ） 該第１の培養過程で増殖した大腸菌を炭素源とし
て利用され得る糖の濃度が0.3％未満である培地で培養
する第２の培養過程 とを有することを特徴とする。

本発明の方法における第１の培養過程では、培地中の
糖濃度が0.3％以上に維持されて、Hi−プラスミドに組
み込まれて大腸菌内に導入された外来遺伝子の発現が抑
制される。その結果、第１の培養過程では、良好な菌の
増殖が得られ、効率良く所望とする菌体量を得ることが
できる。その上、所望とする菌体量を得るまでに、Hi−
プラスミド脱落菌の出現はほとんど無視できる程度に抑
えられる。また、菌の増殖活性を維持しつつ長期にわた
る植え継ぎ培養を行なう際にも同様にHi−プラスミド脱
落菌の発生を効果的に抑えることができる。

本発明の方法における第２の培養過程では、培養中の
糖濃度が0.3％未満とされ、Hi−プラスミド保持菌で外
来遺伝子の発現の抑制が解除される。すると、Hi−プラ
スミド保持菌で外来遺伝子が発現し、外来遺伝子産物の
生産が行なわれる。その際、第１の培養過程で得られた
全培養菌に占めるHi−プラスミド脱落菌の割合はほとん
ど無視できる程度に小さいので、全培養菌のほとんどで
効率良く外来遺伝子の発現が行なわれ、十分に高い濃度
で外来遺伝子産物を培養物中に得ることができる。

なお、第１の培養過程と第２の培養過程で用いる糖の
濃度の組合せとしては、例えば0.3〜1.0％と0.3％未満
との組合せをなどを挙げることができる。

このような本発明の方法によって、菌体を大量に培養
して培養物を大量に生産すれば、培養物中に外来遺伝子
産物を高濃度で得られるので、外来遺伝子産物の生産量
を相乗的に増加させることができる。

しかも、外来遺伝子の発現をともなう菌体の増殖過程
では、先に述べたように培養期間が長くなるほどHi−プ
ラスミド脱落菌の培養菌に占める割合が増加するので、
培養期間をあまり長くとることができなかったが、本発
明の方法においては、第１の培養過程で、必要に応じ
て、所望とする菌体量を得るのを十分に長い培養期間を
とることができるので、本発明の方法は、種菌培養や前
培養を含めて比較的長い培養期間が必要とされる工業的
規模での大量培養に特に好適である。

なお、第１の培養過程と、第２の培養過程との切換え
時期は、用いるHi−プラスミド導入菌の種類や第１およ
び第２の培養過程に用いる培養方法にもよるが、例え
ば、小容量での種菌を得る前培養と、大容量でのバッチ
式による本培養を行なう際に本発明の方法を適用する場
合、前培養と本培養における対数増殖期の前期までを本
発明の第１の培養過程とし、それ以降を第２の過程とす
れば良いが、所望に応じて適宜選択し得る。また、第１
の培養過程と第２の培養過程は、時間的な開きがあって
も構わない。

また、本発明の方法について、フェニルアラニン・ア
ンモニアリアーゼ（PAL）での例を参考例、実施例およ
び比較例により以下に示す。

〔参考例〕

以下に参考例として、大腸菌でのPAL発現用組換え体
プラスミドの構築例を示す。

参考例１ 1.mRNA（PAL）の単離および精製 ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium t
oruloides IFO 559、この菌はATCC 10788としても収載
されている。）を２％グルコースを含む合成培地（表
１）で、27℃で通気攪拌培養を行い、培養初期に添加し
たグルコースを全て消費した直後に、菌体を遠心分離し
て集菌し、湿菌体を滅菌した0.85％食塩水で洗浄後再度
遠心分離を行い、湿洗浄菌体を得た。

該湿洗浄菌体は直ちにPAL誘導培地［２％Lpheを含む
0.17％Yeast Nitrogen Base（Difco社製、無硫安および
無アミノ酸タイプ）］に菌体濃度0.5〜0.8％になるよう
に懸濁し、27℃にて震盪攪拌を行いPALを誘導した。

２時間誘導処理を行った菌体はPAL誘導培地から遠心
分離で回収し、得られた湿菌体は等量の滅菌水に懸濁
後、該懸濁液を液体窒素中に滴下して凍結菌体とした。

凍結菌体10gを液体窒素中で乳鉢で粉砕を行い、50ml
の５％のSDSを添加した緩衝液Ｃ（0.1MMNa₂HPO₄（pH7.
4）、0.15M食塩、１％デオキシコール酸ナトリウム、１
％Tritonx-100）を加え、緩やかに30分間攪拌した。

30分後、50mlのフェノール・クロロホルム混液（フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合容量
比25:24:1）50mlを加え、15分間攪拌混合した。

該混合液を遠心分離し水層を回収し、この水層に新た
に50mlのフェノール・クロロホルム混液を加え、15分間
攪拌後遠心分離し、更に水層を回収して再びフェノール
・クロロホルム混液抽出操作を２回繰り返した。

最後に得られた水層に食塩の終濃度が0.2Mになるよう
に滅菌した5M食塩水を加え、さらに2.5容の冷エタノー
ルを加え、−20℃以下に保存して核酸成分を沈澱させ
た。

この沈澱物を遠心分離により回収し、冷エタノールで
洗浄しその後、減圧乾燥を行なった。

該乾燥物を10mlの滅菌水に溶解し、65℃、５分間加熱
処理を行い、オリゴｄ（Ｔ）セルロースを用いたmRNAの
公知のマニアティス法［Maniatis.T.et al.,“Molecula
r Cloning"（1982）］に準じてmRNAを単離した。

得られたmRNAをサンプル緩衝液（5M尿素、1mM EDTA、
0.05％Bromophenolblue）に溶解後、65℃、２分間加熱
処理を行いRNAの高次構造を変性させた後、8M尿素−ア
クリルアミドスラブゲル（アクリル濃度３％、8M尿素存
在）を用いて泳動用緩衝液（89mM Tris,89mMホウ酸、2m
M EDTA）中で、100ボルト1.5時間電気泳動に供した。

泳動後、アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイド
処理し、紫外線下でmRNAのバンドを発色させてmRNAの大
きさで2.0〜3.0kbの範囲を長さで三等分に分割し、スラ
ブゲルから各ゲル断片を切り出した。

各ゲル断片を透析チューブに封入し、泳動用緩衝液に
沈め、mRNAをゲルから電気的に溶出した。

透析チューブ内液にフェノール・クロロホルム混液を
加え抽出操作を２回繰り返し、残フェノールをエーテル
抽出後、水層の1/10容の3M酢酸ナトリウム水溶液（pH5.
2）を加え、さらに2.5容の冷エタノールを添加して−20
℃に保存し、mRNAを沈澱させた。

上記で得られたmRNAがPALmRNAを含有するものである
ことを確認するために、各mRNA画分から蛋白質に翻訳さ
せ、生産蛋白質をPAL特異抗体を用いて同定する方法を
行なった。

すなわち、各分画mRNAはウサギの網状赤血球溶解物を
用いた無細胞系の翻訳キットに供した［（Pelham.H.R.e
t al.,European J.Biochem.,67,247-256,（1976）］。

ウサギの網状赤血球in vitro翻訳キットは、Promega
Biotec社のものを用い、標識アミノ酸としては³⁵S−メ
チオニン（Amersham社）を用いた。

ウサギの網状赤血球in vitro翻訳システムで翻訳され
た蛋白質を確認するために、翻訳反応液に緩衝液Ｃを加
えて溶解し、不溶物を遠心分離で除き、上清に自製のウ
サギの抗PAL・IgGを加えて、氷上で30分間反応させ、反
応液に羊の抗ウサギIgG（自製）を加えて、氷上で30分
間反応させ、ウサギ抗体と沈澱させた。

沈澱物を遠心分離して回収し、緩衝液Ｃで２回洗浄を
行い、該沈澱物を２％SDS、10％β−メルカプトエタノ
ール混液と0.1M Tris−リン酸（pH6.8）、１％SDS、50
％グリセリン混液とを3:1の容量で混合した溶液に溶解
し、95℃、２分間処理を行い、蛋白質のジスルフィド結
合を切断し、SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気
泳動（アクリルアミド濃度10％）をレムリの方法［Laem
mli,Nature,227,680-685,（1970）］に準じて行い、泳
動後のゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーによりPA
Lの同定を行った。

2.PALmRNAの二本鎖cDNA（ds-cDNA）への変換 PAL誘導処理２時間後の細胞から得たmRNAを上記の方
法で精製し、得られたmRNAに、Awv逆転写酵素を作用さ
せて、１本鎖cDNA分子を合成した［Gugger,U.,et al.,G
ene,25,263-269,（1983）］。

該一本鎖cDNA-mRNAハイブリットに、RNaseH、DNAポリ
メラーゼＩおよびリガーゼを作用させて、mRNAをとりの
ぞき二本鎖cDNA（ds-cDNA）を構築した。

3.3′末端にオリゴdC尾を有するds-cDNAの構築 上記第２項で得られたds-cDNAに末端デオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（TdT）を作用させてds-cD
NAの３′末端にオリゴdCを付加させた。

即ち、３μg ds-cDNAをTdT緩衝液〔100mMカコジル酸
カリウム（pH7.2）,2mM塩化コバルト、0.2mMジチオスレ
ィトール〕と0.2mM dCTPを含む反応液に溶解し、37℃５
分間前処理を行い、次いで50単位のTdTを加え、37℃15
分間反応を進行させ、その後EDTAが終濃度40mMになるよ
うに加え、氷上に置き、フェノール・クロロホルム混液
を加えて、TdTを変性失活させ、変性不溶化蛋白質を遠
心除去し、上清をフェノール抽出、冷エタノール沈澱操
作後、該沈澱物を70％エタノールで洗浄後減圧乾燥を行
い、３′末端にオリゴdC付加ds-cDNAを得た。

4.ハイブリッドプラスミドの構築 ［pUC9（オリゴdc尾を有する）分子とds-cDNA（オリ
ゴdc尾を有する）分子との結合］ 上記第３項で得られたオリゴdC付加ds-cDNAとプラス
ミドpUC9［オリゴdG尾付加。Pharmacia社（スゥエーデ
ン）より容易に入手可能］分子とをdC-dGホモポリマー
法として公知の方法であるマニアティス法に準ずる方法
で結合させた。

5.形質転換およびクローンの選択 上記4.で得られたハイブリッドプラスミド（オリゴdG
付加pUC9分子とオリゴ付加ds-cDNA分子とからなる）をC
aCl₂処理した大腸菌にコンピデント法で導入した。

約４万個の形質転換体のコロニーを得た後、前記の第
２項においてPALmRNAから一本鎖cDNAを合成するに際し
て、反応液中のdcTPのかわりにα−³²P‐dcTPを用い
て、³²Pで標識した一本鎖cDNAをプローブとして、グル
ンステインらの方法［Grunstein,M.et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA.,72,3961（1971）］に準じたコロニーハイ
ブリダイゼイション法で、細胞の選択を行った。

その結果、陽性のコロニーの中から、プラスミドを抽
出して精製し、更に各種の制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動によってDNA断片の大きさを調べた。

6.完全なPAL構造遺伝子を含有するds-cDNAの構築 上記第５項で得られた形質転換体からプラスミドpSW2
およびpSW11を得た。

つまりPALmRNAの完全なcDNAは、pSW2およびpSW11を組
み合わせることにより構築可能なことが明らかとなった
ので、それぞれを含有する形質転換細胞からプラスミド
を抽出し、精製し、制限酵素BanIIIで切断後、pSW2にお
いては、制限酵素HindIIIで切断し、アガロースゲル電
気泳動による分画を行ない、4.2kbの大きさのDNA断片を
回収し、フェノール・クロロホルム混液処理及び冷エタ
ノール沈澱操作をそれぞれ数回繰返して該DNA断片を精
製した。

一方、pSW11は制限酵素BanIIIおよびHindIIIで切断
後、電気泳動により0.9kbのDNA断片を回収し精製した。

4.2kbおよび0.9kbのおのおのDNA断片をリガーゼによ
り環状にし、該生成物で大腸菌を形質転換した。

マーカーとしたアンピシリン耐性の転換体からプラス
ミドを抽出し、各種の制限酵素を作用させて切断地図を
作成し、第１図に示した制限酵素切断地図の構造を有す
る正しいPAL構造のpSW13を選択した。

7.クローン化DNAの塩基配列の決定 上記のプラスミドpSW13を含むクローンからプラスミ
ドpSW13を単離し、そのクローン化DNA断片を種々の制限
酵素で分解し、適当な制限酵素断片について、それぞれ
DNAのヌクレオチド配列分析をマクサムーギルバート法
（化学分解法）により、またマート法［Maat,J.et al.,
Nucleic Acids Research,5,4537-4545,（1978）］によ
るDideoxy法により生化学的に行った。得られたそれぞ
れのDNA断片の塩基配列の結果を三井情報開発（株）製
のGENASプログラムによりDNA編集を行ない、その塩基配
列は第２図（Ａ）〜（Ｃ）に示すとおりであった。

なお、この塩基配列の2151bpまでが開始コドンをよび
終了コドンを含むPAL構造遺伝子であった。

8.pSW101の構築（第３図参照） プラスミドpUC13（Pharmacia社製）0.9μｇに10単位
の制限酵素Sal Iを14μｌの反応液［7mM Tris-HCl（pH
7.5）、0.7mM EDTA,7mM MgCl₂、175mM NaCl、7mM ２−
メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミン（以
下BSAと略す）］中で、37℃16時間作用させ、フェノー
ル・クロロホルム混液処理、エタノール沈澱操作を行
い、開環線状DNAを得た。

該線状DNAをニック・トランスレーション緩衝液［50m
M Tris-HCl（pH 7.5）、10mM MgCl₂、0.1mMジチオスレ
イトール、２％BSA、80μMdATP、80μM dGTP、80μM dT
TP、80μmM dCTP］の存在下で、DNAポリメラーゼクレノ
フ断片（宝酒造（株）製）を室温で30分間作用させ、粘
着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白を行
い、冷エタノールでDNAを沈澱回収した。このDNA断片に
子牛脾臓由来リン酸ジエステラーゼ（CIP:ベーリンガ社
製）を作用させ、５′末端のリン酸基を除去し、線状pU
C13の自己閉環を防いだ。

一方pSW13を含有する細胞から、このプラスミドを抽
出し精製し、制限酵素Dralを反応液Ａ（4mM Tris-HCl
（pH 7.5）、0.4mM EDTA、50mM NaCl）中37℃で28時間
作用させ、ついで食塩液を加えて食塩濃度を100mMと
し、制限酵素EcoRIおよびHindIIIを37℃で16時間作用さ
せた。

反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供
し、2.3kbの大きさのDNA断片をゲル中から回収し、フェ
ノール抽出、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱をそれぞれ３回繰返した後にPALcDNA断片
を得た。

該cDNA断片に前述のニック・トランスレーション緩衝
液を加え、DNAポリメラーゼクレノフ断片を室温で45分
間作用させ、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱操作をそれぞれ３回繰返し、平滑末端を両
端に有するcDNA断片を得た。

平滑末端を有するpUC13断片と平滑末端を有するcDNA
断片とをリガーゼで結合し、環状プラスミドpSW101を構
築した。

このハイブリッドプラスミドDNAで大腸菌を公知の方
法で形質変換し、アンピシリン耐性コロニーから細胞
（MT-10410,FERM P−8834）を選び出出し、PAL活性を測
定した。

9.pYtrp6の構築及び形質転換 上記第８項に記載した方法で構築したpSW101をPstI及
びBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動後、370bpの
DNA断片を回収し、それを２分割し、それぞれBanIおよ
びBbeIで消化した。

消化後アクリルアミドゲル電気泳動により、BanI消化
のものからは70bpの大きさの断片を回収し、BbeI消化の
ものから280bpの大きさのDNA片を回収した。

70bpの断片はDNAポリメラーゼで平滑末端にして、こ
れらにClaI（BanIII）リンカーをリガーゼで結合させ
た。

こうして得られたClaIリンカーを両端に結合したDNA
断片をBan III及びBbeIで消化し、先に調製したBbeI断
片（280bp）およびpBR322をBan IIIおよびBamHIで消化
して、アガロースゲル電気泳動により4.0kbのDNA断片を
回収したものとをリガーゼで結合し、pSYA1を得、これ
で大腸菌を公知のカルシウム法で形質転換した。

上記第６項で構築したpSW13をXbaIで消化し、粘着末
端をDNAポリメラーゼで埋めて平滑末端とし、HindIIIリ
ンカーをリガーゼで結合して、pSW13Hを構築し、これで
大腸菌を公知の方法で形質転換した。

pSYA1を含む大腸菌から公知の方法でpSYA1を抽出し、
BamHIおよびBan IIIで消化し、350bpの大きさのDNA断片
を回収した。

pSW13Hを含む大腸菌から公知の方法でpSW13Hを抽出
し、抽出したpSW13HをBamHIおよびHindIIIで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により1.0kbの大きさのDNA断片を
回収した。

次に、大腸菌のtrpオペロンの一部を含有するプラス
ミドpVV1［Brian P.Nicols ＆ Charles Yanofsky,Metho
ds in Enzymology,101,155,（1983）］に制限酵素Hinf
Iを作用させて、プラスミドpVV1を消化した。

該消化プラスミドDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で分離した0.9kbの大きさのDNA断片をゲルから先に述べ
た方法で回収した。

0.9kbのDNA断片のHinf Iで生じた粘着末端を先の第８
項に記載した方法で平滑末端とした後、EcorRIリンカー
（GGAATTCC）をリガーゼで平滑末端の５′末端に結合し
た。

EcoRIリンカー結合DNA断片に制限酵素EcoRIを作用さ
せ、EcoRI切断粘着末端付加DMA断片を創製した［Brian
P.Nicols ＆ Charles Yanofsky,Methods in Enzymolog
y,101,155,（1983）］。

該EcoRI粘着末端付加DNA断片とpBR322のEcoRI消化物
を前期第８項に記載の方法でCIP処理を行なったものを
リガーゼにより結合し、該結合生成鵜を制限酵素EcoRI
およびBg1IIで消化し、消化生成物をアガロースゲル電
気泳動で分離して、0.4kbの大きさをもつDNA断片を回収
した。

該DNA断片には制限酵素TaqIの切断箇所が３箇所含ま
れるが、該DNA断片をTaqIで部分的に消化して345bpの大
きさのDNA断片を回収した。

該345bP DNA断片をpBR322をEcoRIおよびClaIで消化し
て得られる4.3kbのDNA断片と結合し、trpプロモーター
を含有するプラスミドpFtpr2を得た。

このようにして構築されたpFtrp2をBan IIIおよびHindI
IIで消化し、アガロースゲル電気泳動により4.7kbの断
片を回収し、この4.7kb断片と先に得た350bPのBamHI＋B
am III断片および1.9kbのBamHI＋HindIII断片をリガー
ゼで閉環し、pSYA2を構築した。

pSYA2をBam IIIで部分消化して生じた粘着末端をDNA
ポリメラーゼを用いて埋めて平滑末端としてリガーゼで
開環し、Nru I切断点を有するpYtrp6を構築した。

このpYtrp6で大腸菌を公知の方法で形質転換し、アン
ピシリン耐性のコロニーから細胞を選び出し、PAL活性
を測定した。pYtrp6の構築のフローシートを第４図に、
またその詳細を第３図〜第５図に示す。ここで られた
PAL活性を示す大腸菌形質転換株をMT-10414（FERM P−8
876）とした。

参考例２ なお、本参考例における各プラスミドの構築工程の概
略図を第８図に示してある。

［プラスミドpSW115の構築］ （１） 第９図に示した工程に従ったプラスミドpTac11
の構築 まず、参考例１に記載の方法に従って得られたロドス
ポリジウム・トルロイデスのPAL構造遺伝子がクローン
化されているプラスミドpYtrp 6を有する大腸菌MT 1041
4（FERMP-8876）株より抽出したプラスミドを制限酵素N
ruIとHindIIIで消化して得たDNA断片混合物から電気泳
動法によって2.4kbpの大きさのDNA断片を分離回収し
た。

これとは別に、tacプロモーターを有するプラスミドp
KK223−３（ファルマシア社製）を制限酵素EcoRIで消化
して、DNA断片を得た後、これらDNA断片の粘着末端をDN
Aポリメラーゼを用いて平滑化した。

次に、このようにして得られた平滑末端を有するDNA
断片と、先に得た2.4kbpのDNA断片とを、リガーゼの存
在下で反応させた後、得られた反応生成物を大腸菌にS.
N.Cohenらの方法によって導入した。

続いて、この反応生成物が導入された大腸菌を、アン
ピシリンプレート｛LB培地［バクトトリプトン（商品
名;Bacto-tryptone 、Difco社製）10g;バクトイースト
エキストラクト（Bacto-yeast extract 、Difco社製）
5g;グルコース1g;蒸留水１（NaOHでpH7.5に調整）］
にアンピシリンを50μg/mlの濃度で添加した培地に寒天
を1.5％の濃度で含有させたもの｝で培養した。培養
後、プレート上に出現したアンピシリン耐性の各コロニ
ーのそれぞれから個々のプラスミドを抽出し、各プラス
ミドの制限酵素地図を作製して、目的とする第９図に示
したような構成のプラスミドpTac11を有するコロニーを
同定し、更に該コロニーからプラスミドpTac11を単離し
た。

（２） 第10図の工程に従ったプラスミドpP_L−PAL-hea
dの構築 プラスミドpP_L−λ（ファルマシア社製）を制限酵素E
coRIとHpaIで消化して、得られたDNA断片混合物から電
気泳動法により470bpのDNA断片を分離回収した。この47
0bpのDNA断片を次に制限酵素HinfIで部分消化し、得ら
れたDNA断片混合物から電気泳動法により370bpのDNA断
片を分離回収した。

更に、この370bpのDNA断片の末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端化してから、それをリガーゼの存在下
でCla Iリンカー（宝酒造社製）と反応させた。反応終
了後、得られた反応生成物を制限酵素Ecor IとCla Iで
消化してEcoRI-Cla I DNA断片を含む混合物を得た。

これとは別に、先に示した参考例１におけるロドスポ
リジウム トルロイデスの構造遺伝子のクローニング過
程で構築したプラスミドpSYA 2を、制限酵素EcoRIで消
化した後、得られたDNA断片を、更に制限酵素Cla Iで部
分消化し、得られた大小２種のDNA断片の混合物から電
気泳動法によって大DNA断片を抽出分離した。

次に、このようにして得られたプラスミドpSYA 2由来
の大DNA断片と、先に得たEcoRI-Cla I断片を含む混合物
とをT₄リガーゼの存在下で反応させ、得られた反応生成
物を大腸菌に導入し、これをアンピシリンプレートで培
養した。アンピシリンプレート上に出現した各コロニー
からプラスミドを調製し、その制限酵素地図を作製し
て、目的とする第10図に示す構成のプラスミドpSYP_L−
３を有するコロニーを同定し、該コロニーからプラスミ
ドpSYP_L−３を単離した。

更に、このようにして得られたプラスミドpSYP_L−３
をEcoRIとBamHIとで消化し、得られた大小２種のDNA断
片から電気泳動法によって小DNA断片を分離回収した。

次に、プラスミドpBR322（ファルマシア社製）を制限
酵素EcoRIとBamHIとで消化し、得られた大小２種のDNA
断片から電気泳動法によって大DNA断片を分離回収した
後、この大DNA断片と先に得たプラスミドpSYPL−３由来
の小断片とを、リガーゼの存在下で反応させ、第９図の
構成のプラスミドpP_L‐PAL-headを得た。なお、ここで
目的のプラスミドが得られたかどうかは、リガーゼを用
いた反応で生成された反応生成物を大腸菌に導入し、こ
れをアンピシリンプレートで培養し、アンピシリンプレ
ート上に出現した各コロニーからプラスミドを調製し、
その制限酵素地図を作成することで確認した。

（３） 第11図に示した工程に従ったプラスミドpSW115
の構築 まず、前記（１）項で得たプラスミドpTac11を制限酵
素EcoRIとAatIで消化し、得られた大小２種のDNA断片の
混合物から電気泳動法により大DNA断片を分離回収し
た。

次に、前記（２）項で得たプラスミドpP_L‐PAL-head
を制限酵素EcoRIとAatIで消化し、得られた大小２種のD
NA断片混合物から電気泳動法により小DNA断片を分離回
収した。

最後に、このようにして得たプラスミドpTac11由来の
大DNA断片とプラスミドpP_L‐PAL-head由来の小DNA断片
とをT₄リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラス
ミドpSW115を得た。

なお、目的とするプラスミドが得られたかどうかは、
得られたプラスミドを大腸菌に導入して、形質転換株を
アンピシリンプレートで選択し、アンピシリン耐性を有
する各形質転換株からプラスミドを調製して、それらの
制限酵素地図を作製するとともに、形質転換株のPAL活
性を後述する方法によって測定して確認した。ここで得
られたPAL活性を有する形質転換大腸菌株をMT-10423株
（FERM P−9023）とした。

（４） プラスミドpSW115によるPALの発現 上記（３）項で得たプラスミドpSW115が導入された形
質転換大腸菌を先にアンピシリンプレートの組成に用い
たLB培地（pH7.5）にアンピシリンを50μg/mlの濃度で
天下した培地に接種し、これを30℃で振とう培養した。

20時間の培養により660nmでのODが5.40を示す培養菌
体濃度が得られたので、培養液から菌体を遠心分離によ
って集め、得られた菌体のPAL活性を後述の方法に従っ
て測定し、乾燥菌体重量あたりの比活性を算出したとこ
ろ、630 U/乾燥菌体重量（ｇ）であった。

なお、上記の乾燥菌体重量は、洗浄菌体を乾燥して測
定した。

なお、以上の参考例２における組換え体プラスミドの
大腸菌への導入は、S.N.Cohenらの方法［S.N.Cohenら;P
roc.Natl.Acad.Sci.USA、69、2110（1972）］を用いて
行なった。また、制限酵素、リガーゼ、T₄リガーゼ、DN
Aポリメラーゼを用いたプラスミドやDNA断片の処理およ
び菌体からのプラスミドの調製は、特に指定されている
場合以外は通常用いられている方法によって行なった。
更に、宿主大腸菌としては、MC1061株［Δ（lacIPOZY
A）F^-、araD139、Δ（ara leu）7697×74gal U gal K s
trA］［M.J.Casadaban,J.Mol.Biol.,138,179,（198
0）］を用いた。なお、制限酵素類、リガーゼ、T₄リガ
ーゼ、DNAポリメラーゼは特に指定しない限り宝酒造社
製を用いた。

〔実施例〕

以下本発明の実施例及び比較例を示す。

なお、以下の実施例及び比較例で用いられる培地は次
のようにして調製した。

LB培地； トリプトン 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g 水 １ （KOHによりpH7.5に調整） LB-AP寒天培地； 上記組成のLB培地１あたり、グルコース1gおよび寒
天15gを加え、オートクレーブで殺菌処理したのち、ア
ンピシリン（AP）を100μg/mlの濃度で無菌的に加え、
シャーレ中に流し込んでプレートとしたもの。

合成培地； リン酸一カリウム 3g リン酸二カリウム 7g 硫酸マグネシウム・７水和物 0.5g 硫酸アンモニウム 1.5g 塩化カルシウム・２水和物 0.02g 硫酸第一鉄・７水和物 0.02g クエン酸ナトリウム 1g カザミノ酸 12g Ｌ−トリプトファン 0.1g 蒸留水 １ 実施例１ 参考例２で得たAP耐性をコードする遺伝子を含むベク
ターに、P_Lラムダプロモーター・オペレーターが結合し
た発現ベクターの該プロモーター・オペレーター下流に
PAL構造遺伝子が挿入された構成のHi−プラスミドpSYP_L
−３を保持する大腸菌MT-10424株（FERM P−9024）を、
LB-AP寒天培地プレート上に塗布して、これを37℃で培
養した。

一方、APを50μg/mlの濃度で含むLB培地に、第２表に
示すような各種濃度でグルコースをLB培地に含有させた
培地を別々に綿栓付き坂口フラスコ中に100mlずつ用意
し、オートクレーブによる殺菌処理後に、各フラスコに
APを50μg/mlの濃度となるように無菌的に加え、５種の
グルコース濃度の異なる培地を調製した。

次に、LB-AP寒天培地プレート上に現われたコロニー
から、各坂口フラスコ中の培地に菌体を同量接種し、こ
れを30℃、110回／分の条件で25時間振とう培養した。

培養終了後、各培養液のそれぞれから個々に、以下の
ようにして、菌体抽出液を、調製し、各抽出液のPAL比
活性を求めた。

振とう培養終了時の培養菌体濃度（OD₆₀₀）及び得ら
れたPAL比活性の値を第２表に示す。

菌体抽出液の調製； 培養菌体を遠心分離によって培養液から集菌し、集菌
した菌体を0.85％食塩水に懸濁して洗浄してから再度遠
心分離で菌体を回収し、得られた洗浄菌体を、湿菌体濃
度１％の菌体濃度で0.05mM Tris-HCl緩衝液（pH8.8）に
懸濁させ、超音波処理して菌体を破砕し、さらに該溶液
から遠心分離によって細胞残渣等を取り除いて菌体抽出
液を調製した。

PAL活性の測定； 各抽出液のPAL活性は、Ｌ−フェニルアラニンから桂
皮酸を生成する酵素反応を利用して以下の操作に従って
求めた。

まず、菌体抽出液を25mM Tris-HCl緩衝液（pH8.8）で
湿菌体濃度1.0％程度に希釈し、その1.0mlを、31.25mM
のＬ−フェニルアラニンを含む4.0mlの31.25mMTris-HCl
緩衝液に加え、30℃、20分間反応させた。1mlのlN-HCl
の添加によって反応を終了させ、反応液中に生成した桂
皮酸量を、以下の条件での液体クロマトグラフィーによ
り分析してその活性を測定した。

なお、ここでの1U（ユニット）は１分間当りに１マイ
クロモルの桂皮酸を生成する酵素量に相当する。

液体クロマトグラフィー操作条件； 分離カラムYMCバックＡ−312（山村化学研製）を用
い、移動相にメタノール：水：リン酸＝50:41:0.08v/v
を使用し、桂皮酸の検出を紫外分光光度計（検出波長26
0nm）で行なった。

また、PAL比活性の算出に用いた菌体量は洗浄菌体を
乾燥して求めた。

第２表に示したように培養液中のグルコース濃度が0.
3％以上の場合、グルコース濃度が0.3％未満の場合より
も大腸菌の増殖が良好である上に、PAL比活性は低く、P
ALが僅かしか発現していないことが示されており、グリ
コール濃度を0.3％以上にすることにより発現の効果的
な制御が可能であることが確認された。

実施例２ 参考例１で得たAP耐性をコードする遺伝子を含むベク
ターにtrpプロモーターを連結した発現ベクターのtrpプ
ロモーター下流にPAL構造遺伝子を挿入した構成のHi−
プラスミドpYtrp6を保持する大腸菌MT10414株（FERM P
−8876）をLB-AP寒天培地に塗布して、37℃で培養し、
生じたコロニーの一部をAPを50μg/mlの濃度で、更に第
２表に示すような各種濃度でグルコースを含有するLB培
地5mlを入れた綿栓付き試験管のそれぞれに同量接種
し、これを30℃、100回／分の条件で25時間振とう培養
した。

以下、実施例１と同時にして各培養液から個々に僅体
抽出液を調整し、それぞれのPAL活性を測定した。

振とう培養終了時の培養菌体濃度（OD₆₀₀）及び得ら
れたPAL比活性の値を第３表に示す。

第３表の結果からも明らかなように本実施例において
も、培養液のグルコース濃度が0.3％以上では、菌の生
育は良好であり、しかもPALの発現は十分に制御され
た。

実施例３ 参考例２で得たAP耐性をコードする遺伝子を含むベク
ターにtacプロモーターとその下流に連結されたP_Lラム
ダプロモーターとの連結プロモーターを結合させた発現
ベクターの該連結プロモーター下流にPAL構造遺伝子が
挿入された構成のHi−プラスミドpSW115を保持する大腸
菌MT10423株（FERM P−9023）をLB-AP寒天培地に塗布し
て、37℃で培養した。

次に、50μg/mlの濃度でAPを含むLB培地に、グルコー
ス、マンノース、マルトース、ソルビトールを個々にそ
れぞれの濃度が0.1、0.3および1.0％となるように添加
して合計12種の糖の種類とその濃度の異なる培養液を調
製した。

このようにして調製した各培養液（5ml）に先の培養
でLB-AP寒天培地プレート上にあらわれたコロニーから
大腸菌を同量接種し、30℃、110回／分で24時間振とう
培養を行なった。培養終了後、実施例１と同様の操作を
行ないPAL活性を求めた。

振とう培養終了時の培養菌体濃度（OD₆₀₀）及び得ら
れたPAL比活性の値を第４表に示す。

第４表に示したように、いずれの培養においても、0.
3％以上の糖濃度ではPALの発現が効果的に制御された。

実施例４ 合成培地1.5lを培養液中のグルコース濃度が測定可能
な装置を設置した2lのミニジャーファーメンターに入れ
て、殺菌後、更にAPを0.5g無菌的に添加した。

これとは別に、合成培地にグルコースをその濃度が１
％となるように添加した培地100mlを坂口フラスコに調
製し、オートクレーブで殺菌処理してから、更にこの培
地にAPを50μg/mlの濃度となるように無菌的に添加し
た。次に、これに実施例３で用いた大腸菌MT10423株を
接種し、30℃110ストローク／分で22時間振とう培養を
行ない種培養液とした。得られた種培養液75mlを先に用
意したミニジャー内の培養液に接種し、初期グルコース
濃度が１％になるようにグルコースを添加した後、培養
液のpHをアンモニア水の添加により7.0に調節し、通気
攪拌を行ないながら30℃で培養を開始した。培養液中の
グルコース濃度は所望の菌体量が得られるまでは１％に
保った。目的菌体濃度に達した時点でグルコースの供給
を停止し、菌によるグルコースの消費を利用して、培養
液中のグルコース濃度を0.3％未満に低下させ、PALを発
現した。

培養開始から経時的に培養液を採取し、任意の培養時
間におけるグルコース濃度、菌体濃度および実施例１と
同様の方法によるPAL比活性を求めた。その結果を第12
図に示す。

第12図から明らかなようにグルコース濃度0.3％未満
でPALの発現がなされ、最終的に十分に高いPAL比活性が
得られた。

実施例５ なお、本実施例５及び後述の比較例１において使用さ
れる培地は以下のようにして調製した。

LB培地； 先に示したグルコースを含有しないLB培地１あたり
にグルコース1gを加え、オートクレーブで殺菌処理（12
0℃、15分間）した後、APを50μg/mlの濃度で無菌的に
加えた。

Ａ培地； 先に示したグリコールを含有しないLB培地１あたり
グリコール10gを加え、オートクレーブで殺菌処理（120
℃,15分間）した後、APを50μg/mlの濃度で無菌的に加
えた。

まず、LB-AP寒天培地に実施例３で用いたHi−プラス
ミドpSW115を保持する大腸菌MT10423株を塗布して、こ
れを37℃で16時間培養した。

出現したコロニーから菌体をＡ培地（5ml）入り綿栓
付き試験管およびLB培地（5ml）入り綿栓付き試験管に
分割して接種し、そのおのおのの試験管を30℃、24時
間、110ストローク／分で振とう培養し、培養液No.1−
１（Ａ培地培養）、培養液No.1−２（LB培地培養）を得
た。

次に、培養液No.1−１から培養液（菌体を含む）の15
μｌを種培養液として、Ａ培地（5ml）入り綿栓付き試
験管およびLB培地（5ml）入り綿栓付き試験管内に接種
し、上記と同様の条件でそれぞれ振とう培養して、培養
液No.1−３（Ａ培地培養）、培養液No.1−４（LB培地培
養）を得た。

更に、第13図に示したような順で上記と同様の培養操
作を繰り返し、培養液No.1−５、No.1−６、No.1−７を
得た。

なお、培養液No.1−２、No.1−４、No.1−６、No.1−
７においては培養終了後ただちに遠心分離によって集菌
し、得られた菌体はいずれも0.85％のNaCl水溶液に懸濁
して洗浄後、再度遠心分離で回収した菌体を凍結保存し
ておいた。

次に、各凍結保存菌体を解凍し、菌体懸濁液とし、以
後実施例１と同様にして菌体抽出液を調製し、そのPAL
比活性を測定した。その結果を表５に示す。

比較例１ 実施例５におけるＡ培地での培養を第14図に示すよう
に全てLB培地に変更する以外は実施例５と同様にして培
養操作を繰り返し、培養液No.2−１〜No.2−７を得た。

更に、培養液No.1−２、No.1−４、No.1−６、No.1−
７から実施例５と同様にして凍結保存菌体をそれぞれ調
製し、それらのPAL比活性を求めた。その結果を表５に
示す。

実施例５及び比較例１の結果から、長期にわたる植え
継ぎ培養を行う際にも、Hi−プラスミド脱落菌の発生を
効果的に抑えることができることがわかった。

（発明の効果） 本発明によれば、培地中の炭素源として利用され得る
糖の濃度を調整するという簡易な操作で、Hi−プラスミ
ド導入大腸菌における外来遺伝子の発現を所望に応じて
効果的に制御可能である。

また、本発明の発現制御方法を用いて、Hi−プラスミ
ド導入大腸菌を培養して外来遺伝子産物を生産する方法
における菌の増殖と、外来遺伝子の発現時期とを分離
し、これらを効率良く行なうことによって、Hi−プラス
ミド脱落菌の発生を十分に抑えた良好な菌体増殖が達成
でき、しかも培養物中に高濃度で所望の外来遺伝子産物
が得られ、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能となっ
た。

特に、本発明の方法では、発現制御を培地成分である
グリコール等の濃度調整という簡易な操作によって行な
うので、誘導型プラスミドを用いる場合のように高価な
誘導試薬を用いる必要がなく、また、温度制御型を用い
る場合のように温度制御のための特別な装置を用いなく
てもよい。

更に、Hi−プラスミド脱落菌の出現をより効果的に抑
えられることができるので、本発明の方法によれば、工
業的規模での大量培養による外来遺伝子の生産性の向上
が容易に図れる。

【図面の簡単な説明】

第１図はpSW11、pSW2およびpSW13のPAL構造遺伝子に関
わる部分の制限酵素切断地図を示す。 第２図は、参考例でクローン化したフェニルアラニン・
アンモニアリアーゼをコードする領域を含むDNA配列の
一方の鎖の有する塩基配列を示したものである。 第３図はpSW101を構築する手順のフローチャート、第４
図はpYtrp6を構築する手順のフローチャートのであり、
第５図〜第７図はそれぞれ第４図に示したフローチャー
トの内の一部を詳しく示したものである。 第８図は参考例２で構築された各組換え体プラスミドの
構築工程の概略図であり、第９図はプラスミドpTac11
の、第10図はプラスミドpP_L‐PAL-headの、第11図はプ
ラスミドpSW115の構築工程を具体的に示した図である。 第12図は実施例４における培養での培地中のグルコース
濃度および菌体濃度、並びに培養菌のPAL比活性の経時
的変化を示すグラフである。また第13図および第14図は
実施例５および比較例１での培養操作の流れを示した図
である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法にお
   いて、 ａ） 糖の存在下においてリプレッサーが結合し得るオ
   ペレーターを有しないP_Lラムダプロモーター、または該
   P_Lラムダプロモーターをtacプロモーターの直後に繋い
   だ連結プロモーターを有する発現ベクターの該プロモー
   ターによってその発現が支配される位置に、前記外来遺
   伝子産物をコードする外来遺伝子を挿入した構成の組換
   え体プラスミドを調製する過程と、 ｂ） 該組換え体プラスミドを大腸菌に導入する過程
   と、 ｃ） 該組換え体プラスミドが導入された大腸菌を、培
   地中での炭素源として利用され得る糖の濃度を0.3％以
   上に維持して前記外来遺伝子の発現を抑制しつつ培養す
   る第１の培養過程と、 ｄ） 該第１の培養過程で増殖した大腸菌を炭素源とし
   て利用され得る糖の濃度が0.3％未満である培地で培養
   する第２の培養過程 とを有することを特徴とする大腸菌での外来遺伝子産物
   の生産方法。
2. 【請求項２】前記外来遺伝子産物がＬ−フェニルアラニ
   ン・アンモニアリアーゼである特許請求の範囲第１項に
   記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。
3. 【請求項３】前記Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリ
   アーゼが以下に示すアミノ酸配列を有するものである特
   許請求の範囲第２項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物
   の生産方法。
4. 【請求項４】前記大腸菌が組換え体プラスミドpSYP_L−
   ３を保持する大腸菌MT 10424株である特許請求の範囲第
   １項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。
5. 【請求項５】前記大腸菌が組換え体プラスミドpSW 115
   を保持する大腸菌MT 10423株である特許請求の範囲第１
   項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。