JPH08187084A - 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置 - Google Patents

生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置

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JPH08187084A
JPH08187084A JP7263371A JP26337195A JPH08187084A JP H08187084 A JPH08187084 A JP H08187084A JP 7263371 A JP7263371 A JP 7263371A JP 26337195 A JP26337195 A JP 26337195A JP H08187084 A JPH08187084 A JP H08187084A
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オッパーマン ハーマン
Thangavel Kuberasampath
クベラサンパス サンガベル
David C Rueger
ルエガー デーヴィッド・シー
Engin Ozkaynak
オズカイナク エンジン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 哺乳類の体内で軟骨内骨形成を誘導するため
の材料および手段を提供する。 【解決手段】 ２００より少ないアミノ酸からなるポリ
ペプチド鎖の一対が正しく折り畳まれた組換えダイマー
骨形成蛋白質およびその製造方法、ならびに、該ダイマ
ー骨形成蛋白質を含有する生体適合性であって生体分解
性のマトリックスを含む骨形成装置およびその製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は骨形成装置、哺乳類
中で骨形成を誘発することのできる蛋白質をコードする
合成遺伝子および組換えＤＮＡ技術による該蛋白質の製
造方法、骨形成蛋白質の合成形、および該合成蛋白質を
含む骨形成装置を用いた骨および軟骨の修復に関する。
【０００２】
【従来の技術】哺乳類の骨組織は一種もしくはそれ以上
の蛋白性物質を含むことが知られていて、このものはお
そらく成長および骨の自然治癒の間に活性であり、軟骨
内の骨形成を結果としてもたらす細胞内現象の連続過程
（カスケード）の発生を誘発することが出来る。この活
性因子（若しくは複数の活性因子）は、文献において骨
形態発生蛋白質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉ
ｃまたはｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
骨誘発蛋白質（ｂｏｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｐｒｏｔ
ｅｉｎ）、骨形成蛋白質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）、オステオゲニン（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉ
ｎ）、またはオステオインダクティブ蛋白質（ｏｓｔｅ
ｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）という種々の
名称で呼ばれている。
【０００３】骨分化の発達カスケードは、間葉細胞の補
充、軟骨のカルシウム化、血管の侵入、骨形成、修復、
および最後に骨髄分化から成る（レディ（Ｒｅｄｄｉ
（１９８１）），Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅ
ｓ．，１：２０９−２２６）。
【０００４】これらの形態変化の基礎となる詳細な機構
は明確にされていないが、骨マトリックスの自然の軟骨
内骨分化活性は、不活性な残存コラーゲンマトリックス
を用いて、完全な骨誘発活性を回復するように、分離抽
出及び再構成できる（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄ
ｉ，（１９８１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ．７８：７５９９−７６０３）。この事実
は、蛋白質抽出物のｉｎｖｉｖｏでの軟骨内細胞誘発能
力をアッセイする実験方法を提供する。
【０００５】骨形成蛋白質であると推定される蛋白質
は、５０kdより小さい分子量を有することが示されてい
る。数種の哺乳類は密接に関連する蛋白質を生産し、こ
のことは種間移植実験で証明されている（Ｓａｍｐａｔ
ｈおよびＲｅｄｄｉ（１９８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：６５９１−６５
９５）。
【０００６】これらの蛋白質の可能な用途は広く認識さ
れている。純粋蛋白質として入手出来れば、整形外科の
医療、ある種の形成手術および種々の歯周再構成および
頭蓋顔面再構成の手法に、革命をもたらすと考えられ
る。
【０００７】これらの蛋白質分画について観察された性
質は、多くの研究施設で骨形成活性に関与する純粋因子
（もしくは複数因子）を単離同定するための、精力的研
究努力を刺激した。哺乳類の骨からの骨形成蛋白質の精
製に関する現状技術は、Ｓａｍｐａｔｈら（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９８７）８
０）に開示されている。Ｕｒｉｓｔら（Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９８４）１７３、
１９４−１９９）は、ヒト骨形成蛋白質フラクションを
開示しており、このフラクションは、脱ミネラルした皮
質（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ）から、塩化カルシウ
ム−尿素無機−有機溶媒混合物によって抽出され、そし
てグアニジン−塩酸での分別沈澱および調製用ゲル電気
泳動によって回収されたものである。この著者らによれ
ば、このフラクションは酸性ポリペプチドのアミノ酸組
成を有し、分子量が１７−１８kdの範囲である。
【０００８】Ｕｒｉｓｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８４）８１：３７１−３
７５）は、酸性ポリペプチドの特性および約１８kdの分
子量を持つウシ骨形成蛋白質抽出物を開示している。こ
の著者らはこの蛋白質がヒドロキシアパタイトクロマト
グラフィーにより分離されたフラクション中に存在し、
そしてこの蛋白質はマウスの後躯筋肉における骨形成を
誘発し、そしてラットとイヌの頭蓋骨の穿頭器による欠
損部の骨再生を誘発したと報告している。この著者らが
骨から該抽出物を得るために用いた方法は、不特定の不
純な調製物しか与えなかった。
【０００９】１９８５年１０月７日に公開されたヨーロ
ッパ特許出願第１４８，１５５号は、ウシ、ブタおよび
ヒト由来の骨形成蛋白質の開示を目的としている。この
ヨーロッパ出願の蛋白質の一つは分子量２２−２４kdの
蛋白質で、発明者らによってＰ３蛋白質と命名され、実
質的に純粋な状態に精製されたと記載されている。この
物質は動物に移植した時、骨の形成を誘発したと報告さ
れている。
【００１０】１９８８年１月１４日に国際公開されたＰ
ＣＴ／０８７／０１５３７号は、ウシの骨から得られた
骨誘発の能力を有する純粋でないフラクションを開示し
ている。このＰＣＴの出願人はまた、組換えＤＮＡ技術
で製造された骨誘発性の、推定骨誘発因子を開示してい
る。ヒトまたはウシゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリ
ーから４つのＤＮＡ配列が回収され、組換え宿主細胞で
発現されたように記載されている。この出願人は発現さ
れた蛋白質が骨形成蛋白質であろうと記載しているが、
その骨誘発能は証明されていない。ＵｒｉｓｔらのＥＰ
Ｏ，２１２，４７４号（発明の名称「骨形成剤」）も参
照。
【００１１】Ｗａｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：９４８４−９４
８８）は、脱ミネラル骨のグアニジン描出物からの、軟
骨および骨形成活性を有する、ゲル濾過で決定された分
子量３０kdの塩基性蛋白質としてのウシ骨形成蛋白質の
精製を開示している。この蛋白質の精製は３０、１８お
よび１６kdの蛋白質を生じ、これらは分離すると不活性
であった。この結果から考えて、この著者らは活性物質
の正確な同定は出来ていないと認めている。
【００１２】Ｗｏｚｎｅｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
８）２４２：１５２８−１５３４）は、最初ウシの骨か
ら精製された三つのポリペプチドに相当するヒトポリペ
プチドをコードする、完全長のｃＤＮＡの単離を開示し
ている。この著者らは、組み換え法で発現された三つの
ヒト蛋白質の各々は、独立してもしくは共同で、軟骨形
成を誘発する能力を持つと報告している。骨形成の証拠
は記載されていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、同種異系の
移植および異種移植において、骨誘発能を持つ骨形成蛋
白質を分散して有するマトリックスからなる骨形成装置
を提供することを目的とする。他の目的は、ヒトを含む
哺乳類において軟骨内骨形成の誘発能を有する合成骨形
成蛋白質を提供することである。さらに別の目的は、非
−天然骨形成蛋白質をコードする遺伝子および組換えＤ
ＮＡ技術を用いてそのような蛋白質を製造する方法を提
供することである。さらに別の目的は、新規生合成型の
骨形成蛋白質を提供し、そして新規機能性骨形成蛋白質
の構造デザインを提供することである。さらに別の目的
は軟骨形成の方法を提供することである。
【００１４】上記目的および他の目的は明細書、図面お
よび請求の範囲の記載から明らかであろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳類の体内
に移植した時、移植部位で軟骨形成および骨髄分化の完
全な発達カスケードを誘発できる骨形成装置に関する。
本明細書の開示から適当な改変を加えた装置は、軟骨形
成にも使用できる。本発明の装置は、本明細書中でマト
リックスと呼ばれ、以下に説明する性質を有し、骨形成
蛋白質を生合成物として分散して含む担体材料を有す
る。
【００１６】本発明の成功の鍵は、骨から精製された実
質的に純粋な骨形成蛋白質の調製に成功し、この天然骨
形成蛋白質のアミノ酸配列および構造データを解析しお
よび、この天然源生成物のＤＮＡおよびアミノ酸配列の
研究を含む考察に成功したことであった。本出願人は一
つの手順を開発し、その手順にそって活性な実質的に純
粋な哺乳類骨由来の骨形成蛋白質の回収に成功した。次
いで天然型の骨形成蛋白質の性質および構造の調査の結
果、本発明者らは、非天然型（即ち天然には従来知られ
ていなかった型）の骨形成誘発能を持つ、合理的デザイ
ンを完成することができた。本出願人が知る限り、本出
願によって開示された構造は、天然型ヌクレオチドまた
はアミノ酸配列の活性領域の予備知識無しに、機能的な
活性蛋白質をデザインした最初の例である。活性な骨形
成蛋白質を製造する目的で、一連のコンセンサスＤＮＡ
配列がデザインされた。これらの配列は、天然源生成物
から得られた部分アミノ酸配列データおよび文献に報告
されている無関係な遺伝子間で観察されるホモロジーに
基づき、あるいはそれらがコードし推測もしくは証明さ
れた発生学上の機能を持つ配列に基づくものである。こ
うして生合成されたコンセンサス配列のいくつかはプロ
カリオート細胞で融合蛋白質として発現され、精製さ
れ、開裂され、再折り畳まれ、マトリックスと混合さ
れ、確立された動物モデルに移植され、そして軟骨内骨
誘発活性を有することが証明された。現時点で好ましい
活性蛋白質はＣＯＰ５，ＣＯＰ７，ＣＯＰ１６およびＯ
Ｐ１と命名された配列からなる。これらの蛋白質のアミ
ノ酸配列を下に示す。
【００１７】
【化５９】
【００１８】
【化６０】
【００１９】
【化６１】
【００２０】
【化６２】
【００２１】
【化６３】
【００２２】これらの配列においておよび本明細書に開
示される他の全てのアミノ酸配列において、ダッシュ記
号（−）は関連する複数蛋白質の対比すべき配列を整列
させるために挿入したもので、それ以上の意味はもって
いない。即ち、例えばＣＯＰ７のアミノ酸４６−５０は
ＮＨＡＶＶである。また、アミノ酸番号は、複数配列間
の対比を容易にする目的のみのために付されている。従
って、例えばＣＯＰ５およびＣ０Ｐ７の番号９および１
０のＤＦ残基は、本発明の骨形成蛋白質の一態様の、例
えば３５および３６番目の残基を示しうる。蛋白質の骨
形成または軟骨形成活性が損なわれない限り、機能的に
活性な領域にリーダー配列またはトレーラー配列が結合
してもよい。
【００２３】従って、一観点において、本発明は適当に
折り畳まれてマトリックスと一緒に哺乳類に移植された
ときに軟骨内骨形成誘発能力を有するのに十分な程度
に、ＣＯＰ５，ＣＯＰ７，ＣＯＰ１６およびＯＰ１の配
列に近似したアミノ酸配列を持った蛋白質よりなる。こ
れらの配列のあるものは軟骨を誘発し骨は誘発しない。
また、これらの骨形成物質は、無血管部位に移植される
ときまたは完全骨の発達の阻害剤とともに移植されると
きは、軟骨を形成するために使用してもよい。従って、
他の観点において、本発明は、ＣＯＰ５、ＣＯＰ７、Ｃ
ＯＰ１６またはＯＰ１の配列を十分に複製し、従って正
しく折り畳まれてマトリックスとともに哺乳類に移植さ
れた場合に少なくとも軟骨形成能力を持つ配列を含ん
だ、（各鎖について）２００アミノ酸よりも少ない蛋白
質よりなる。「十分に複製した」という用語は、本明細
書に開示された特定の配列とホモロジーを持つ程度の蛋
白質、あるいは他の異なるアミノ酸をもつが然し骨形成
もしくは軟骨形成活性をもつ蛋白質を示すために用いら
れる。
【００２４】好ましい一態様において、そのような蛋白
質は、次の一般アミノ酸配列：
【００２５】
【化６４】
【００２６】または
【００２７】
【化６５】
【００２８】（式中、各アルファベットは標準的１文字
記号によるアミノ酸残基を表し、各Ｘは２２種の天然ア
ミノ酸残基の任意のものを表す。）で表される群のもの
である。上記一般アミノ酸配列において好ましいアミノ
酸配列は次のものである：
【００２９】
【化６６】
【００３０】および
【００３１】
【化６７】
【００３２】（式中、配列中で縦の各位置に示されてい
る各アミノ酸は、種々の組合わせで交互に用いられても
良い）。これらの一般配列は、分子間または分子内ジス
ルフィド結合を生じ得る６個そして好ましくは７個のシ
ステイン残基を有しており、また蛋白質の三次元構造に
影響する他の重要アミノ酸も有している点に注目された
い。これらの一般構造は以前に発表された配列に見られ
るものであるが、その何れも骨形成活性を有するとは報
告されておらず、またそれらの殆どはそのような活性と
結びつけて考えられていない。
【００３３】特に有用な配列には次のものが含まれる：
【００３４】
【化６８】
【００３５】
【化６９】
【００３６】
【化７０】
【００３７】
【化７１】
【００３８】
【化７２】
【００３９】
【化７３】
【００４０】
【化７４】
【００４１】
【化７５】
【００４２】Ｖｇ１は従来骨形成に関連づけられなかっ
た公知のアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の配列
である。ＤＰＰは背腹模様の発達に関連するショウジョ
ウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子によりコードさ
れるアミノ酸配列である。ＯＰ１は本出願人らにより得
られたゲノムＤＮＡ配列のエクソンによりコードされる
天然配列の一領域である。各ＣＢＭＰは、本出願人らに
より得られたゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡによりコード
される哺乳類蛋白質の一部（サブパーツ）を構成するア
ミノ酸配列である。ＣＯＰはどれも、本明細書に記載し
た基準を用いてデザインされ、今までに天然に見つかっ
ていない新規コンセンサス遺伝子構造物から発現され
た、完全生合成蛋白質配列である。
【００４３】これらの蛋白質はダイマーであると信じら
れている。還元されると活性を失うように思われる。こ
れら蛋白質各々の種々の組合わせは、ヘテロダイマーま
たはホモダイマーとして存在しうる。出願人が知るかぎ
りＣＯＰ５、ＣＯＰ７、ＣＯＰ１６およびＯＰ１構造
は、天然型ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の活性
領域の予備知識なしに、生物活性蛋白質がデザインされ
た最初の例である。
【００４４】従って、本発明は組換えＤＮＡ技術を用い
て生産された合成骨形成蛋白質を提供する。本発明の蛋
白質は種々のグリコシル化パターン、種々のＮ末端、ア
ミノ酸配列ホモロジー領域を有する関連蛋白質の一群
（ファミリー）、および天然蛋白質の活性な短縮もしく
は変異された型を包含し、これらがいかにして誘導され
たかは問題でない。本発明の開示により、習熟した遺伝
子工学技術者は、適当なアミノ酸配列をコードする遺伝
子をデザインおよび合成することができ、次いでそのよ
うな遺伝子を原核細胞および真核細胞を含む種々の型の
宿主細胞内で発現させて、短縮類縁体、ミューテイン、
融合蛋白質、および天然型の生物活性をまねたヒトを含
む哺乳類中で骨形成を誘発することのできる他の構造物
から選ばれる、活性な合成蛋白質を大量生産することが
できる。
【００４５】本発明の合成蛋白質は、適当な配給もしく
は担体システム（マトリックス）とともに臨床使用する
ために有用である。そのマトリックスは、粒状または多
孔性材料から成る。孔の寸法は、先祖細胞の遊走および
引き続く分化ならびに増殖を可能ならしめるものでなけ
ればならない。粒径は７０−８５０μｍ、好ましくは７
０−４２０μｍである。マトリックスは粒状材料を骨の
欠損部を網羅する形に密に圧縮して製造されるか、また
は生体適合性（非炎症性）でｉｎ ｖｉｖｏで生体分解
性の、遊走先祖細胞を集合させるための「一時的足場」
および基盤としておよび引き続く細胞の接着および増殖
のべースとして作用する材料を所望の形に構成すること
により製造される。現在のところ好ましい担体には、粒
状の、脱ミネラルされ、グアニジンで抽出された、種特
異的（アロジェニック）な骨、および粒状の、脱グリコ
シル化（またはＨＦ処理）され、蛋白質抽出され、脱ミ
ネラル化された、異種の骨が含まれる。場合により、そ
のような異種の骨粉マトリックスはトリプシンのような
蛋白質分解酵素で処理されていてもよい。他の有用なマ
トリックス材料には、コラーゲン、グリコール酸のホモ
ポリマーおよびコポリマーならびに乳酸、ヒドロキシア
パタイト、リン酸三カルシウムおよび他のリン酸カルシ
ウムが含まれる。
【００４６】ここに開示された骨形成蛋白質および移植
可能骨形成器具は、医者が例えば後天的もしくは先天的
な頭蓋顔面異常および他の骨格もしくは歯の異常を矯正
するために、期待できる最適の骨形成手段の入手を可能
にするであろう（Ｇｌｏｗａｃｋｉら，（１９８１），
Ｌａｎｃｅｔ，１：９５９−９６３）。本発明の器具
は、正常に冶癒していない骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ
ｆｒａｃｔｕｒｅ）の局所的軟骨内骨形成の誘発に使用
することができ、また、歯周への適用等の骨形成が要求
される他の臨床応用に使用することができる。他の臨床
応用可能分野は、軟骨の修復、例えば変形性関節炎の治
療である。
【００４７】
【発明の実施の形態】本発明の前記目的およびその他の
目的、本発明の種々の態様および、本発明の本質は、以
下の説明を図面とともに参照することにより、より一層
十分に理解される。
【００４８】図１および図２は、種々の骨形成蛋白質の
アミノ酸配列をＴＧＦ−べータ群の配列と比較した図で
ある。ＣＯＰ１、ＣＯＰ３、ＣＯＰ４、ＣＯＰ５および
ＣＯＰ７は合成骨形成蛋白質の類縁体群（ファミリー）
であって、Ｄ−Ｐ部位（酸により）またはＮ−Ｇ（ヒド
ロキシルアミンにより）での化学開裂により該類縁体蛋
白質の遊離をもたらすＤ−Ｐ−Ｎ−Ｇの配列を有するヒ
ンジ領域を介してリーダー蛋白質に結合されたコンセン
サス遺伝子から得られたものであり；ＶＧ１はアフリカ
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の蛋白質であり、ＤＰＰ
はショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の蛋白質
であり；ＯＰ１は天然骨形成蛋白質であり；ＣＢＭＰ２
ａおよびＣＢＭＰ２ｂおよびＣＢＭＰ３は夫々、ＰＣＴ
出願第０８７／０１５３７に開示された蛋白質の一部
（サブパート）であり；ＭＩＳはＭｕｌｌｅｒｉａｎ生
物の阻害物質であり；そして、「コンセンサスの選択
枝」は、骨形成蛋白質内の種々の位置で取り得る種々の
アミノ酸置換を示す。
【００４９】図３は、リーダー蛋白質に融合した骨形成
蛋白質の遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターであ
り、図４は、修飾ｔｒｐ−ＬＥリーダー、プロテインＡ
の二つのＦｂドメイン、Ａｓｐ−Ｐｒｏ開裂部位および
ＣＯＰ５配列を含むＤＮＡ配列である。
【００５０】図５は、ＣＯＰ５活性組換え蛋白質の組織
所見（１２日）を示す移植物の拡大写真である。Ａはコ
ントロール区（ラットのマトリックスのみ、２５mg）で
ある。ＢはラットのマトリックスおよびＣＯＰ５添加区
であり、軟骨形成（＋＋＋）および骨形成（＋＋）を示
す（後述の採点基準を参照）。
【００５１】図６は、骨形成蛋白質（ＣＯＰＯ）のコン
センサス遺伝子のＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配
列の図である。
【００５２】本出願人は哺乳類の骨から得られた粗蛋白
抽出物の中に存在する骨形成蛋白質の単離を可能にする
精製手段を開発した。この単離方法は、相当量の実質的
に純粋な骨形成蛋白質を、十分量の新鮮骨が得られる任
意の哺乳類から、製造することを可能にする。経験の積
み重ねによる方法の開発および新鮮仔牛骨の入手可能性
があいまって、実質的に純粋なウシ骨形成蛋白質（ＢＯ
Ｐ）の単離が可能になった。ＢＯＰの特性がネコ、ウサ
ギ、およびラットにおける軟骨誘発そして究極的な軟骨
内骨成長誘発能力によって深く研究された；ＢＯＰは、
従来異種の骨の抽出物中の単数もしくは複数の未知蛋白
質によるとされていた、骨形成のカスケードの十分な分
化を誘発することが出来ることが示され：したがって、
正常に治癒していない骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ ｆｒ
ａｃｔｕｒｅ）を含む整形外科的欠損における軟骨内の
骨の形成誘発に使用することができる。ＢＯＰは天然状
態ではグリコシル化された二量体蛋白質である。しかし
ながら、脱グリコシル化された形でも活性を有する。そ
の部分的配列決定もなされた。
【００５３】ＢＯＰのアミノ酸配列の解明は、本明細書
に開示されたように、配列データ、該配列に推定される
コドン、および既知遺伝子との部分的ホモロジーの観察
に基づいてデザインされたコンセンサスヌクレオチド配
列の造成を可能にした。
【００５４】これらのコンセンサス配列は、ショウジョ
ウバエ、アフリカツメガエルおよびヒトからのある種の
調節遺伝子内に存在する配列との比較に引き続き、ポイ
ントミューテーション、発現および活性のアッセイによ
って改良された。この手法により、天然には見出されな
い活性ないくつかの完全合成構造の製造に成功した。上
記の発見は、単独もしくは共同で実際に軟骨内骨を製造
する能力のある、全く新規な非天然蛋白質構造をコード
するＤＮＡの造成が可能とする。これらのＤＮＡは、十
分に確立された組換えＤＮＡ技術を用いて真核もしくは
原核宿主細胞で発現させることができ、発現した蛋白質
は必要であれば酸化してｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性
を与えるために折り畳むことができる。
【００５５】そのような生合成蛋白質のデザインおよび
製造、マトリックスの性質およびその他本出願で請求さ
れている主題の性質、用途、達成法、および使用法に関
する物質的観点は、本発明の種々の観点を実施するため
に現在知られている最良の態様を成す、以下に示す記載
から理解されよう。
【００５６】（コンセンサス配列デザイン）図６に示す
合成コンセンサス遺伝子は、ＴＧＦ−ベータ遺伝子群と
のホモロジーから予測されたアミノ酸に基づくコンセン
サス蛋白質をコードするようにデザインされた。デザイ
ンされたこのコンセンサス配列は、次いで、ＤＮＡ合成
装置内で製造されたオリゴヌクレオチドの組み立て操作
を含む、公知の技術を用いて造成された。
【００５７】本出願人により単離されてエドマン分解に
よって配列決定されたウシ骨形成蛋白質から誘導された
トリプシン消化ペプチドは、次の表１に示すとおり、シ
ョウジョウバエＤＰＰ蛋白質配列（遺伝子から推測され
た）およびアフリカツメガエルＶｇ１蛋白質と高度なホ
モロジーを示し、インヒビン（ｉｎｈｉｂｉｎ）および
ＴＧＦ−べータとのホモロジーはそれより若干低いアミ
ノ酸配列を与えた。
【００５８】
【表１】
【００５９】骨形成蛋白質の適当なアミノ酸配列（これ
からヌクレオチド配列が決定される）の決定において
は、次の点が考慮された：（１）天然源の骨形成蛋白質
のトリプシンフラグメントのエドマン分解で決定された
アミノ酸配列は、遺伝子群の他のメンバーと整列させた
ときホモロジーまたは保存的変化を強く示唆しそして示
す限り、最高位置にランクする；（２）配列が４種全て
の蛋白質にマッチする限りその配列は合成遺伝子配列の
中に利用する；（３）ＤＰＰおよびＶｇ１の中で一致す
るアミノ酸は使用する；（４）もしＶｇ１またはＤＰＰ
が相違するが然しいずれか一方がインヒビンまたはＴＧ
Ｆ−べータと一致するときは、この一致アミノ酸は選択
する；（５）全ての配列が相違する時はＤＰＰ配列を先
ず選択するが、ミュータジェネシスによりＶｇ１配列を
造成するその後の計画の可能性を残しておく。さらに、
コンセンサス配列はジスルフィドの架橋を保存し、そし
て関連蛋白質の間の明らかな構造ホモロジーを保存する
ように、デザインされる。
【００６０】（組換え骨形成蛋白質の造成物）上記のア
プローチにより、軟骨形成誘発および軟骨内骨形成誘発
の能力を有する、新規組換え蛋白質の製造が達成され、
その蛋白質構造は天然源物質の機能的領域（ドメイン）
に類縁であるかまたは複製的である。コンセンサスＤＮ
Ａ配列によりコードされるアミノ酸配列は、組織の発達
に関連する天然蛋白質の群から誘導された。これらの遺
伝子産物／蛋白質は二量体として活性型に存在すること
が知られており、そして一般に前駆体蛋白質から該前駆
体の活性Ｃ末端領域へと加工（プロセシング）されて生
じるものである。
【００６１】本発明の組換え骨形成性／軟骨形成性蛋白
質は、出願人が知る限り天然に存在せず、またもし存在
するとしても従来骨もしくは軟骨の形成と関連があると
は考えられていなかったという意味で新規である。これ
らの蛋白質をデザインする方針は、天然ＯＰ単離物中に
見られるアミノ酸配列やポリペプチド構造物中のアミノ
酸配列を採用し、文献中で報告されているある種の蛋白
質になぞらえてポリペプチドの構造をパターン化し、あ
るいは文献に報告されているＤＮＡからアミノ酸配列を
推定することである。従って、前記のデザイン基準を用
いて、そして更なる蛋白質配列情報が入手されるにつれ
てアミノ酸配列を改良することにより、下記のバイオア
ッセイ系で試験した時骨形成または軟骨形成活性を有す
るであろうという期待および目的の下に、一連の合成蛋
白質がテザインされた。
【００６２】例えば、ショウジョウバエからのＤＰＰ、
アフリカツメガエルからのＶｇ１、ＴＧＦべータ群の蛋
白質、および程度はやや低いがアルファインヒビンおよ
びべータインヒビンは、天然源のＯＰ産物から誘導され
た配列の或るものと有意のホモロジーを示した（図１お
よび図２）。これらの蛋白質の研究により、各々の配列
はその一部に、蛋白質の三次元構造に重要な影響を持つ
システインおよび他のアミノ酸の位置関係の解析から観
察できる、構造上の類似性を有することが認識された。
これらの配列の一領域は非常に近似する同じ相対位置に
一連の７個のシステインおよびある種の他のアミノ酸
を、次に示す配列中に有することが認められた：
【００６３】
【化７６】
【００６４】（式中、各Ｘは独立にアミノ酸を表す）。
【００６５】これらの構造の二つについて発現実験を行
ったところ活性が証明された。この鋳型アミノ酸配列に
なぞって、６個のシステインのみを有するより短い配列
を持つ下記の構造を作って実験した場合も活性が認めら
れた：
【００６６】
【化７７】
【００６７】（式中、各Ｘは独立にアミノ酸を表す）。
【００６８】これらの一般配列式中で、骨形成活性また
は軟骨形成活性を有する多数の具体的配列が存在する。
好ましい構造は次のアミノ酸配列を有する：
【００６９】
【化７８】
【００７０】（式中、各位置において一つ以上のアミノ
酸が示されている場合は、その位置には示された任意の
アミノ酸が存在してよいことを意味する。） 新規活性蛋白質はまた、この配列の６番目の残基から開
始する（即ちＮ末端のＣＸＸＸＸを除去し、またはＣＫ
ＲＨＰ、ＣＲＲＫＱ、ＣＫＲＨＥ等の好ましい特定Ｎ末
端を除去した、６個のみのシステイン残基を有する構造
の）活性領域を含むアミノ酸配列としても特定される。
本発明の後に国際公開されたＰＣＴ８７／０１５３７号
において、ＢＭＰIIａおよびｂおよびＢＭＰIIIとして
同定された蛋白質は、この一般配列式の態様に包含され
る領域を含むことがみとめられた。この国際公開におい
て、これらの蛋白質は骨形成であると述べられていな
い。しかしながら、本発明者らはこれらの蛋白質のアミ
ノ酸配列の一部（サブパート）を正しく折り畳んで、本
明細書に記載したように移植すると活性であることを発
見した。そのようなサブパートはここにＣＢＭＰIIａ、
ＣＢＭＰIIｂ、およびＣＢＭＰIIIとして開示する。ま
た、本出願人はヒトゲノムＤＮＡライブラリーをＣＯＰ
Ｏで探索（プロービング）することにより、従来は報告
されていなかった遺伝子を回収した。この蛋白質はＯＰ
１と命名された。この蛋白質は同じ遺伝子構造を有する
領域を含む。
【００７１】従って、好ましい骨形成蛋白質は組換えＤ
ＮＡから発現され、そして次の任意の配列を含むアミノ
酸配列を含む：
【００７２】
【化７９】
【００７３】
【化８０】
【００７４】
【化８１】
【００７５】
【化８２】
【００７６】
【化８３】
【００７７】
【化８４】
【００７８】
【化８５】
【００７９】
【化８６】
【００８０】
【化８７】
【００８１】
【化８８】
【００８２】
【化８９】
【００８３】
【化９０】
【００８４】
【化９１】
【００８５】図１および図２に示すように、これらの配
列はアルファおよびべータインヒビン、ＴＧＦべータの
３つの型およびＭＩＳにかなりのホモロジーを有する。
【００８６】（マトリックスの特性に関する一般的考
慮）下記のバイオアッセイの項において記載する担体
は、生物分解性−合成マトリックスまたは合成−無機マ
トリックス（例えば、ＨＡＰ、コラーゲン、リン酸三カ
ルシウム、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそ
れらの種々のコポリマー）と置き換えることが可能であ
る。また、下記のようこ予備処理した異種の骨も用いる
ことができる。
【００８７】研究によると、表面電荷、粒径、ミネラル
の存在およびマトリックスと骨形成蛋白質との混合方法
の全てが、骨誘発の成功の可否に影響する。化学的修飾
によって電荷の乱れをおこすと誘発応答が失われる。粒
径は新生骨の定量的応答に影響し、７５ないし４２０μ
mの間の粒子が最大の応答を引き起こす。マトリックス
が骨のミネラルで汚れると、骨の生成が阻害される。最
も重要な点は、骨形成蛋白質をマトリックス上に配置す
る為に使用する方法は、骨形成蛋白質およびマトリック
スの両者の物理的および化学的状態に対して極度に感受
性であることである。
【００８８】骨のマトリックスとＯＰ移植物との境界で
の細胞の連続的反応は複雑である。この多段階カスケー
ドは、移植されたマトリックスへのフィブリンおよびフ
ィブロネクチンの結合、細胞の移動、繊維芽細胞の増
殖、軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、血管の侵入、骨形
成、修復、および骨髄分化、を含む。
【００８９】骨形成蛋白質の効果的担体は、いくつかの
重要な機能を奏するべきである。この担体は、骨形成蛋
白質を結合して徐放性の系として作用し、骨の発達の間
の細胞応答の各ステップに適合し、そして非特異的蛋白
質分解から骨形成蛋白質を保護するものでなければなら
ない。更に、選択された材料はｉｎ ｖｉｖｏで生体適
合性でかつ生体分解性でなければならず；この担体は、
新しい骨に完全に置換されるまでの仮の骨組みとして作
用する必要がある。生体適合性は、マトリックスが移植
された時有意な炎症を誘発せずそして宿主動物に拒絶反
応をひきおこさないことを要求する。生体分解性は、新
生骨または軟骨の発達の間に、マトリックスが宿主の体
に徐々に吸収されることを要求する。ポリ乳酸（ＰＬ
Ａ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）および種々の組み合
わせはｉｎ ｖｉｖｏにおける異なる分解速度を有す
る。骨中においては、分解速度は移植物が皮質（ｃｏｒ
ｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ）中に置かれるかまたは海綿質
（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）中に置かれるかに
よって変化しうる。
【００９０】マトリックスの幾何形状、粒径、表面電荷
の存在、および該粒子中の細胞の侵入を許すために十分
な寸法の多孔もしくは隙間の存在、は全て効果的マトリ
ックスの性質にとって重要である。マトリックスを新生
骨の所望形状に加工することおよび偽関節欠陥部を覆う
寸法に加工することが好ましい。ラットでの研究で、新
生骨は実質的に移植器具の寸法に形成されることが示さ
れた。
【００９１】マトリックスは、例えばコラーゲンのよう
な粒状材料を軽く接着してできた形状保持固体からなっ
ても良い。あるいはマトリックスは型成形された多孔質
の固体からなっても良く、あるいは単に周囲の組織によ
ってその場に保持された密に圧縮された粒子の凝集物で
あってもよい。砕いた筋肉または他の組織も使用できる
であろう。同種異系の大きな骨からなる移植物は、その
骨髄腔を洗浄して粒状物と分散された骨形成蛋白質を充
填すれば、マトリックスの担体として作用することが可
能である。
【００９２】骨形成蛋白質を他の種のコラーゲン性骨マ
トリックスとともに再構成し、ラットに移植しても骨は
全く形成されない。この事実は骨形成蛋白質は異種性で
ある（種特異性でない）が、マトリックスは種特異性で
ありそして恐らく固有の免疫成分もしくは阻害成分のた
めに他種に移植できないことを示唆している。従って従
来、骨を主体とするマトリックスが、骨形成蛋白質の骨
誘発能を完全に発揮させるためには、種特異的コラーゲ
ン性骨マトリックスが要求されていた。
【００９３】全ての骨マトリックスの主要成分は、タイ
プＩコラーゲンである。コラーゲンに加えて、抽出骨は
非−コラーゲン性蛋白質をその質量の５％程度含む。骨
マトリックスの多くの非−コラーゲン性成分はグリコプ
ロテインである。骨形成におけるグリコプロテインの生
物学的意義は知られていないが、その含有する炭水化物
が強力な抗原となり、異種マトリックス中に存在する免
疫源成分および／または阻害成分を構成するのであろ
う。
【００９４】本発明者らは、コラーゲン骨マトリックス
が、マトリックスから免疫源性かつ阻害性成分を最初に
除去すれば、異種移植物の骨誘発能力をおこさせる担体
として使用できることを見出した。この目的を達成する
ために、マトリックスは例えば弗化水素を用いて化学的
に脱グリコシル化される。
【００９５】本発明はその精神もしくは本質的特徴を逸
脱することなく、他の特定の態様によっても実施でき
る。従って、本明細書中の態様は例示的なものであっ
て、決して限定的なものではなく、本発明の範囲は請求
の範囲により定められ、請求の範囲と均等の意味および
範囲内での変更は、本発明の範囲に含まれる。
【００９６】
【実施例】１．遺伝子の調製 上記蛋白質を発現するようにデザインされた合成遺伝子
は、好ましくは化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
の組立により製造される。１５−１００ｍｅｒのオリゴ
ヌクレオチドは、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）
ＤＮＡ Ｍｏｄｅｌ ８６００合成装置で合成し、そし
てトリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）を用いたポリ
アクリルアミトゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製するこ
とができる。このＤＮＡを次にゲルから電気的に溶離す
る。オーバーラップするオリゴマーをＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼでリン酸化しそして連結してより大きいブ
ロックにし、これを同様にＰＡＧＥで精製することがで
きる。天然遺伝子配列およびｃＤＮＡもまた発現に使用
できる。
【００９７】２．発現 上記遺伝子は適当な原核細胞、例えば種々のＥ．ｃｏｌ
ｉストレインおよびバチルス、イーストおよび種々の動
物細胞例えばＣＨＯ、ミエローマ等で発現することがで
きる。一般に、発現は当業者に良く知られている多くの
細胞種および発現系で達成できる。遺伝子をＥ．ｃｏｌ
ｉ中で発現させる場合は、最初に発現ベクター中にクロ
ーン化しなければならない。このような発現ベクターを
通常の遺伝子工学的手法を用いることにより構築し得る
ことは、当業者には周知である。好ましい実施態様は、
図３に示すような融合蛋白質発現ベクターの使用であ
る。上記ベクターの構築、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主細
胞の形質転換、形質転換された宿主細胞の培養、および
発現した組換え蛋白質の精製は、当該分野で周知の方法
に基づいて、当業者により容易に実施され得る。ｐＢＲ
３２２を基本として合成ｔｒｐプロモーターオペレータ
ーおよび修飾ｔｒｐＬＥリーダーを含む発現ベクター
（図３）をＥｃｏＲＩ制限部位およびＰｓｔＩ制限部位
で開裂し、ＦＢ−ＦＢ、ＣＯＰ１、ＣＯＰ３、ＣＯＰ５
およびＣＯＰ７遺伝子フラグメント（図４）をこれらの
制限部位の間に挿入することが可能である（ここで、Ｆ
ＢはスタフィロコッカスのプロテインＡのフラグメント
Ｂである）。図４に示すように、Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｇの配列
をコードするヒンジ領域が、ＦＢをコードするフラグメ
ントとＣＯＰ５をコードするフラグメントとの間に存在
する。融合蛋白質発現システムの構築において周知の処
理法である、上記のようなヒンジ領域の導入は、Ｄ−Ｐ
部位（酸により）またはＮ−Ｇ部位（ヒドロキシルアミ
ンにより）での化学開裂による、発現されたＣＯＰ類縁
体の遊離を可能にする。発現されたＣＯＰ類縁体の折り
畳みには、トリス、酸化型グルタチオン、および低濃度
のＧｕ−ＨＣｌおよびジチオスレイトールをpH８．０で
用いた。別法として、ＣＯＰまたはＯＰ１蛋白質を５０
mM ＨＣｌ，６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、pH８．０中に４
℃で１８時間懸濁させる。この蛋白質を動物細胞中で発
現させる時は、折り畳みは不要であろう。
【００９８】３．抗体の製造 ＣＯＰ７およびＣＯＰ５に対する抗体はニュージーラン
ド白色家兎で製造した。これらの抗体はウェスタンブロ
ット分析でＣＯＰ７およびＣＯＰ５調製物と反応した。
ＣＯＰ７に対する抗体について、天然源ウシ骨形成蛋白
質サンプルとの反応性が試験された。ウェスタンブロッ
ト分析は、この３０kd蛋白質（そして還元した時１６kd
の蛋白質）との明確な反応を示した。この免疫反応性の
部分はＣｏｎＡブロットの１６kd二量体（ダブレット）
に見られるのと同様に、１６kdサブユニット領域中の狭
い間隔をもった二量体部分であるように思われる。
【００９９】４．マトリックスの調製 （生物学的に活性な同種異形マトリックスの調整）脱ミ
ネラル化骨マトリックスは、ラットの大腿および脛骨の
脱水した骨幹のシャフトから、本明細書に記載のように
して調製し、４２０μmの篩を通過する骨粉に調製し
た。この骨粉を４Ｍグアニジン−ＨＣｌによる解離的抽
出に付した。この処理で、この骨形成マトリックスは本
来有した軟骨内骨分化の能力を完全に消失した。残存す
る不溶性物質をマトリックスの製造に使用した。この物
質はその性質がほぼコラーゲン性であり、移植によって
軟骨および骨を誘発しない。全ての新規調製物は、使用
前にミネラル含有量および疑陽性が試験された。この生
物学的に不活性な不溶性のコラーゲン性マトリックス
を、骨形成誘発蛋白質の活性フラクション（または純粋
蛋白質）とともに再構成すると、消失した骨マトリック
スの全活性が回復する。骨形成誘発蛋白質は任意の脊椎
動物、例えばウシ、ブタ、サル、またはヒトから得るこ
とが出来、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて製造でき
る。
【０１００】（異種移植に使用する脱グリコシル化骨マ
トリックスの調整）上記のようにして調製されたウシ骨
残渣を篩い分けし、７４−４２０μｍの粒子を回収す
る。このサンプルを真空中でＰ2Ｏ5により乾燥し、反応
容器に移し、次いで無水弗化水素（ＨＦ）（１０−２０
ml／ｇマトリックス）を−７０℃でサンプル上に留出さ
せる。容器を０℃に温め、そして反応混合物をこの温度
で室温で１２０分間攪拌する。ＨＦを真空で蒸発させた
のち、残渣をＫＯＨペレット上で真空にて完全に乾燥し
て残存する痕跡量の酸も除去する。
【０１０１】脱グリコシル化の程度は、ＨＦ処理の前後
のマトリックスサンプルを、非−共有結合的に含まれる
炭水化物を除去するために適当な洗浄処理に付した後、
炭水化物を分析して知ることができる。
【０１０２】脱グリコシル化骨マトリックスを次に下記
の如く処理する： １）ＴＢＳ（トリス緩衝サリーン）に１ｇ／２００mlに
懸濁し、４℃で２時間攪拌する；または６Ｍ尿素、５０
mMトリス塩酸、５００mMＮａＣｌ、pH７．０（ＵＴＢ
Ｓ）に懸濁しそして室温で３０分間攪拌する； ２）遠心分離しそして工程１のＴＢＳまたはＵＴＢＳで
洗浄する；そして ３）遠心分離し、上清を捨て、残渣を水で洗浄し、次に
凍結乾燥する。
【０１０３】５．骨形成器具の作製 上記の任意の骨形成蛋白質とともに上記任意のマトリッ
クスを用いて骨形成器具の作製を次のように実施する。
【０１０４】Ａ．エタノール沈殿 この操作において、マトリックスはグアニジン−ＨＣｌ
中の骨形成蛋白質に添加される。サンプルを渦巻攪拌
し、低温でインキュベートする。次にサンプルをさらに
渦巻攪拌する。冷無水エタノールをこの混合物に添加
し、これを次に攪拌しインキュベートする。遠心分離
（小型高速遠心機）の後上清を棄てる。再構成マトリッ
クスを冷水中の高濃度のエタノールで洗浄しそして凍結
乾燥する。
【０１０５】Ｂ．アセトニトリル トリフルオロ酢酸凍
結乾燥 この操作において、アセトニトリル トリフルオロ酢酸
（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液中の骨形成蛋白質を担体に添加
する。サンプルを何回も激しく渦巻攪拌し、その後凍結
乾燥する。
【０１０６】Ｃ．尿素凍結乾燥 尿素緩衝液中に調製された蛋白質については、蛋白質を
マトリックスと混合し、何回も渦巻攪拌し、そして凍結
乾燥する。凍結乾燥された材料は、そのまま移植物とし
て使用できる。
【０１０７】６．ラットでのｉｎ ｖｉｖｏバイオアッ
セイ 合成骨形成蛋白質のいくつかを、マトリックスに混入さ
せて骨形成器具とし、ラットにおいて軟骨内骨形成のア
ッセイを行った。ラットでの研究は、骨形成効果が骨形
成器具内に分散した骨形成蛋白質の量に依存することを
示した。マトリックスを単独で移植した場合は、活性は
全く認められなかった（図５）。次に、蛋白質構造物お
よびマトリックスの生物学的活性を評価し、本発明の骨
形成器具をいかにして使用するかの指針を示す。
【０１０８】Ａ．皮下移植 ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：６５
９１−６５９５：参照によりここに含まれる）により記
載された骨誘発のバイオアッセイを用いて軟骨内骨分化
活性を評価した。このアッセイはエーテル麻酔下の同種
異系被受容ラットの皮下部位に試験サンプルを移植する
ことからなる。２８−３２日令の雄のＬｏｎｇ−Ｅｖａ
ｎｓラットを用いた。無菌条件で胸部領域の皮膚に縦の
切込み（１cm）を作製し、鈍い刃で切開してポケットを
作製した。約２５mgの試験サンプルをこのポケットに深
く移植し、皮膚用金属性クリップで切込み部分を閉じ
た。移植の当日を実験１日目とした。移植物は１２日目
に除去した。この異所性部位を用いた試験は、正常部位
を用いて得られた結果に付随する不明瞭さを排除した骨
誘発試験を可能にする。 Ｂ．細胞の挙動 ラットでの移植モデルは、マトリックスにより誘発され
る軟骨内骨の発達の段階を通じて、（１）第１日目にお
ける多形核白血球による一過性の侵入；（２）第２およ
び３日目の間葉細胞の遊走および増殖；（３）第５およ
び６日目における軟骨細胞の出現；（４）第７日目にお
ける軟骨マトリックスの形成；（５）第８日目における
軟骨のカルシウム化；（６）第９および１０日目におけ
る血管の侵入、骨芽細胞の出現および新生骨の形成；
（７）第１２ないし１８日目における骨芽細胞および骨
の修復の出現および移植マトリックスの分解；および
（８）第２１日目における小骨内での造血性骨髄分化；
を含む制御された発達を示す。この結果は新たに生じる
骨の形状は移植されたマトリックスの形に一致すること
を示す。
【０１０９】Ｃ．組織学的評価 移植物内での骨形成の程度を評価するためには、組織切
片作製およびその染色が好ましい。移植物をブアン液で
固定しパラフィンに包埋し、６−８mmの切片に切り出
す。トルイジンブルーまたはへマトキシリン／エオシン
での染色は、軟骨内骨の最終的発達を明確に証明する。
通常、この移植物が骨誘発活性を示すかどうかを判断す
るために１２日目の移植物で十分である。
【０１１０】Ｄ．生物学的マーカー 骨形成のマーカーとしては、アルカリホスファターゼ活
性を用いることができる。この酵素活性は移植物をホモ
ジナイズした後、分光分析で測定できる。ｉｎｖｉｖｏ
での活性は９−１０日目にピークに達し、その後徐々に
低下する。組織学的試験で骨の発達を示さない移植物
は、これらのアッセイ条件でアルカリホスファターゼ活
性を殆どまたは全く示さないであろう。このアッセイは
移植物をラットから取り出して骨形成を非常に迅速に定
量または評価するために有用である。別法として、骨形
成の量は移植物のカルシウム含量の測定によっても知る
ことができる。
【０１１１】骨形成蛋白質による骨形成活性は、「骨形
成単位」で表示される。１骨形成単位は、ラットの脱ミ
ネラル骨マトリックスをコントロールとして１２日目の
移植物のカルシウム含量を決定したとき、最大骨形成活
性の半分に必要な蛋白質量を示す。
【０１１２】ラットの担体のみを含む器具は新生骨形成
を全く示さない。その場合の移植物は、担体であるラッ
トのマトリックスおよびその周囲の間葉細胞のみを含ん
でいる。ラットの担体および正しく折り畳まれていない
（もしくは生物学的に不活性な）組換え蛋白質を含む器
具もまた、骨形成を全く示さなかった。これらの移植物
は軟骨形成（−）および骨形成（−）と採点される。そ
の軟骨内骨形成活性はゼロパーセント（０％）と採点さ
れる（図５中のＡ）。
【０１１３】これに対して、生物学的に活性な組換え蛋
白質を含む移植物は、軟骨内骨形成の証拠を示した。組
織学的に、移植物は新たな軟骨および骨形成を示した。
【０１１４】軟骨形成は移植物の中心での異染性に染色
された軟骨細胞の存在により（＋）と採点され、移植物
の多くの領域での多数の軟骨細胞の存在により（＋＋）
と採点され、そして軟骨細胞を形成する軟骨マトリック
スの大量の存在および軟骨のカルシウム化を伴う肥大軟
骨細胞の出現によって（＋＋＋）と採点される（図５中
のＢ）。
【０１１５】骨形成は、新たなマトリックスを形成する
血管内皮を囲む骨芽細胞の存在により（＋）と採点さ
れ、骨芽細胞によって骨が形成され（図５中のＢにおい
て矢印で示されている）、さらに、新たに形成された骨
マトリックスに向かいあって破骨細胞が出現して骨の修
復がなされることによって（＋＋）と採点される。これ
らの移植物での血管侵入は明らかである（図５中の
Ｂ）。小骨の形成をもたらす十分に修復された骨の存在
により、骨形成は（＋＋＋）と採点される。
【０１１６】組換え蛋白質による総合的骨形成誘発活性
を、軟骨内骨形成応答の百分率で示す（下記の表２を参
照）。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【発明の効果】本発明の骨形成蛋白質および骨形成器具
は、例えば後天的もしくは先天的な頭蓋顔面異常および
他の骨格もしくは歯の異常を矯正するために、期待でき
る最適の骨形成手段の入手を可能にする。本発明の骨形
成器具は、正常に冶癒していない骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉ
ｏｎ ｆｒａｃｔｕｒｅ）の局所的軟骨内骨形成の誘
発、または歯周への適用等、骨形成が要求される他の臨
床応用に使用することができる。他の臨床応用可能分野
として、軟骨の修復、例えば変形性関節炎の治療に有用
である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々の骨形成蛋白質のアミノ酸配列とＴＧＦ
−べータ群の配列との比較図（前半）である。
【図２】 種々の骨形成蛋白質のアミノ酸配列とＴＧＦ
−べータ群の配列との比較図（後半）である。
【図３】 リーダー蛋白質に融合した骨形成蛋白質の遺
伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを示す。
【図４】 修飾ｔｒｐ−ＬＥリーダー、プロテインＡの
二つのＦｂドメイン、Ａｓｐ−Ｐｒｏ開裂部位およびＣ
ＯＰ５配列を含むＤＮＡ配列を示す。
【図５】 ＣＯＰ５活性組換え蛋白質の組織所見（移植
後１２日目）を示す移植物の拡大写真である。Ａはコン
トロール（ラットのマトリックスのみ、２５mg）区、Ｂ
はラットのマトリックスおよびＣＯＰ５添加区である。
【図６】 骨形成蛋白質（ＣＯＰＯ）のコンセンサス遺
伝子のＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配列を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 を含む一般アミノ酸配列を提供する工程、ここで配列中
に存在するＸは、各々天然に存在する任意のアミノ酸で
あり得； （ｂ）該一般アミノ酸配列中に存在する各Ｘについて
は、それぞれ独立して一つのアミノ酸を選択し、かつ、
該一般アミノ酸配列中のＸでないすべてのアミノ酸残基
を保持することにより、以下の配列：
【化２】
【化３】 または
【化４】 の合成変異体の一つのアミノ酸配列を創出する工程； （ｃ）工程（ｂ）で創出したアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含む合成核酸分子を構築する工程； （ｄ）該合成核酸分子を宿主細胞に導入する工程；およ
び （ｅ）該合成ポリペプチド鎖の生産に充分な条件下で該
ヌクレオチド配列を発現させる工程、を包含する、方
法。
【化５】
【化６】
【化７】 および、
【化８】 のいずれかの相当する位置に存在するアミノ酸である、
請求項１ないし３のいずれかの項に記載の方法。
【化９】
【化１０】 および、
【化１１】 のいずれかと同じ相対位置に同じ数のシステインを有
し、ここで該合成ポリペプチド鎖は、もう一つのポリペ
プチド鎖とのジスルフィド結合によって正しく折り畳ま
れたダイマーを形成してほ乳類に移植されたとき軟骨お
よび軟骨内骨形成を誘導し得る； （ｂ）該核酸分子を宿主細胞に導入する工程； （ｃ）該合成ポリペプチド鎖の生産に十分な条件下で該
ヌクレオチド配列を発現させる工程； （ｄ）工程（ｃ）において生産された該合成ポリペプチ
ド鎖を有する正しく折り畳まれたダイマー蛋白質を生産
する工程、を包含する、方法。
【化１２】 を有するポリペプチド鎖を生産する方法であって、該ポ
リペプチド鎖は、２００より少ないアミノ酸を有し、該
ポリペプチド鎖ともう一つのポリペプチド鎖とのジスル
フィド結合によって正しく折り畳まれたダイマーを形成
したときほ乳類の体内で軟骨および軟骨内骨形成を誘導
し得、以下の工程： （ａ）上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を提供
する工程； （ｂ）該ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入する工程；およ
び、 （ｃ）該ポリペプチド鎖の生産に充分な条件下で該ヌク
レオチド配列を発現させる工程、を包含する、方法。
【化１３】
【化１４】 および、
【化１５】 のいずれかと同じ相対位置に同じ数のシステインを有す
る。
【化１６】 ここで、複数のアミノ酸が示される配列位置において
は、該位置はそれらのうちの任意のアミノ酸であり得
る；または
【化１７】 ここで、複数のアミノ酸が示される配列位置において
は、該位置はそれらのうちの任意のアミノ酸であり得
る、のいずれかを含む、請求項１２に記載の蛋白質。
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】 または
【化２２】 ここで、複数のアミノ酸が示される配列位置において
は、該位置はそれらのうちの任意のアミノ酸であり得
る。
【化２３】
【化２４】
【化２５】 または、
【化２６】 の合成変異体のアミノ酸配列、または、
【化２７】
【化２８】 あるいは
【化２９】 のアミノ酸配列を有する、蛋白質。
【化３０】 を含む２００より少ないアミノ酸を有し、ここで配列中
に存在するＸは、各々天然に存在する任意のアミノ酸で
あり得、該一般アミノ酸配列中に存在する各Ｘについて
は、それぞれ独立して一つのアミノ酸を選択し、かつ、
該一般アミノ酸配列中のＸでないすべてのアミノ酸残基
を保持することにより、以下の配列：
【化３１】
【化３２】 または
【化３３】 の合成変異体のアミノ酸配列を含んでいる。
【化３４】 を有する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/78 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (71)出願人 595148888 2725 Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ Ｒｏａｄ，Ｋ ａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 デーヴィッド・シー ルエガー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02132, ウエスト・ロックスバリー，エッジミア・ ロード 150，アパートメント ４ (72)発明者 エンジン オズカイナク アメリカ合衆国マサチューセッツ州01757, ミルフォード，パーデュー・ドライブ 44

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 合成ポリペプチド鎖を生産する方法であ
    って、該合成ポリペプチド鎖は、２００より少ないアミ
    ノ酸を有し、該ポリペプチド鎖ともう一つのポリペプチ
    ド鎖とのジスルフィド結合によって正しく折り畳まれた
    ダイマーを形成したときほ乳類の体内で軟骨および軟骨
    内骨形成を誘導し得、以下の工程： （ａ）以下の配列： 【化１】 または 【化２】 を含む一般アミノ酸配列を提供する工程、ここで配列中
    に存在するＸは、各々天然に存在する任意のアミノ酸で
    あり得る； （ｂ）該一般アミノ酸配列中に存在する各Ｘについて
    は、それぞれ独立して一つのアミノ酸を選択し、かつ、
    該一般アミノ酸配列中のＸでないすべてのアミノ酸残基
    を保持することにより、一つのアミノ酸を創出する工
    程； （ｃ）工程（ｂ）で創出したアミノ酸配列をコードする
    ヌクレオチド配列を含む合成核酸分子を構築する工程； （ｄ）該合成核酸分子を宿主細胞に導入する工程；およ
    び （ｅ）該合成ポリペプチド鎖の生産に充分な条件下で該
    ヌクレオチド配列を発現させる工程、を包含する、方
    法。
  2. 【請求項２】 さらに以下の工程： （ｆ）前記工程（ｅ）において生産された前記ポリペプ
    チド鎖を有する正しく折り畳まれたダイマー蛋白質を生
    産する工程、を包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記工程（ｂ）において創出された配列
    中の独立して選択された一つまたは複数のアミノ酸を異
    なる一つのアミノ酸で置換する工程、をさらに包含す
    る、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記工程（ｂ）において独立して選択さ
    れるアミノ酸の一つまたは複数が、以下の配列： 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 または 【化１５】 のいずれかの相当する位置に存在するアミノ酸である、
    請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 一対のポリペプチド鎖の正しく折り畳ま
    れたダイマーを有する、活性な合成骨形成蛋白質を生産
    する方法であって、以下の工程： （ａ）合成ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配
    列を含む合成核酸分子を構築する工程であって、該合成
    ポリペプチド鎖は、２００より少ないアミノ酸を有し、
    かつ、以下の配列： 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】 または 【化２０】 のいずれかと同じ相対位置に同じ数のシステインを有
    し、ここで該合成ポリペプチド鎖は、もう一つのポリペ
    プチド鎖とのジスルフィド結合によって正しく折り畳ま
    れたダイマーを形成してほ乳類に移植されたとき軟骨お
    よび軟骨内骨形成を誘導し得る； （ｂ）該核酸分子を宿主細胞に導入する工程； （ｃ）該合成ポリペプチド鎖の生産に充分な条件下で該
    ヌクレオチド配列を発現させる工程；および （ｄ）工程（ｃ）において生産された合成ポリペプチド
    鎖を有する正しく折り畳まれたダイマー蛋白質を生産す
    る工程、を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 前記宿主細胞が原核生物の宿主細胞であ
    る、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項２から６のいずれかに記載の方法
    によって生産される、合成骨形成蛋白質。
  8. 【請求項８】 以下のアミノ酸配列： 【化２１】 ここで、複数のアミノ酸が示される配列位置において
    は、該位置はそれらのうちの任意のアミノ酸であり得
    る；または 【化２２】 ここで、複数のアミノ酸が示される配列位置において
    は、該位置はそれらのうちの任意のアミノ酸であり得
    る、のいずれかを含む、請求項７に記載の蛋白質。
  9. 【請求項９】 以下の配列： 【化２３】 【化２４】 【化２５】 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【化３０】 【化３１】 【化３２】 【化３３】 【化３４】 【化３５】 または 【化３６】 ここで、複数のアミノ酸が示される配列位置において
    は、該位置はそれらのうちの任意のアミノ酸であり得
    る、のいずれかの配列から誘導された配列を含む、請求
    項７に記載の蛋白質。
  10. 【請求項１０】 宿主細胞中での組換え遺伝子の発現に
    よって生産され、軟骨内骨形成を誘導し得るようにジス
    ルフィド結合によって正確に折り畳まれたダイマーを形
    成した一対のポリペプチド鎖を含む、合成骨形成蛋白
    質：ここで、該一対のポリペプチド鎖の各々は、２００
    より少ないアミノ酸を有し、以下の配列： 【化３７】 【化３８】 【化３９】 【化４０】 【化４１】 【化４２】 【化４３】 【化４４】 【化４５】 【化４６】 および 【化４７】 からなる群から独立して選択される配列を含む。
  11. 【請求項１１】 グリコシル化されていないことを特徴
    とする、請求項７から１０のいずれかに記載の蛋白質。
  12. 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の蛋白質
    に免疫反応性を有する抗体であって、以下の配列： 【化４８】 【化４９】 【化５０】 【化５１】 【化５２】 【化５３】 【化５４】 【化５５】 【化５６】 【化５７】 および 【化５８】 からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部分をエピ
    トープとして認識する抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項７から１１のいずれかに記載の
    蛋白質を内部に配置したマトリックスを含む、骨形成器
    具。
  14. 【請求項１４】 ほ乳類への移植のための骨形成器具で
    あって： （ａ）該ほ乳類の体からの遊走性先祖細胞の侵入、増殖
    および分化を可能にするのに充分な寸法の複数孔を規定
    する、生体適合性でかつｉｎ ｖｉｖｏで生体分解性の
    マトリックス；および （ｂ）該マトリックス内に配置され該細胞と接触し得
    る、請求項７から１１のいずれかに記載の蛋白質、を含
    む、骨形成器具。
  15. 【請求項１５】 前記マトリックスが、７０から４５０
    μmまでの範囲の粒径を有する密に圧縮された粒状材料
    を含む、請求項１３または１４に記載の骨形成器具。
  16. 【請求項１６】 前記マトリックスが、（ａ）脱ミネラ
    ル化され、蛋白質抽出された同種異形の骨、（ｂ）脱ミ
    ネラル化され、蛋白質抽出され、脱グリコシル化された
    異種の骨、（ｃ）脱ミネラル化され、蛋白質抽出され、
    ＨＦで処理された異種の骨、（ｄ）コラーゲン、ヒドロ
    キシアパタイト、リン酸カルシウム、およびグリコール
    酸または乳酸モノマーを含むポリマーからなる群から選
    択される材料、（ｅ）粒径材料を軽く接着させてなる形
    状保持固体、（ｆ９多孔質の固体、（ｇ）砕いた筋肉、
    （ｈ）砕いた組織、または（ａ）から（ｈ）のいずれか
    の組み合わせを含む、請求項１３から１５のいずれかに
    記載の骨形成器具。
  17. 【請求項１７】 ほ乳類で局所的な軟骨形成および軟骨
    内骨形成、歯周の治療、軟骨の修復、変形性関節炎の治
    療、正常に治癒していない骨折の矯正、および、後天的
    または先天的な頭蓋顔面、他の骨格または歯の異常の治
    療からなる群から選択される治療に用いるための請求項
    １３から１６のいずれかに記載の骨形成器具。
  18. 【請求項１８】 同種異系骨の骨髄腔内に配置された、
    請求項１３から１６のいずれかに記載の骨形成器具。
  19. 【請求項１９】 ほ乳類で軟骨および／または軟骨内骨
    形成を誘導するための組成物であって、請求項７から１
    １のいずれかに記載の蛋白質を含む、組成物。
  20. 【請求項２０】 請求項７から１１のいずれかに記載の
    蛋白質をコードする、合成遺伝子。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の合成遺伝子を含有
    し、合成骨形成蛋白質を生産するように設計された細胞
    系。
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