JPH03500655A - 骨形成デバイス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、該マトリックスが無機塩を除き、タンパク質を抽出し、ＨＦで処理した微 粒子状の異種骨からなるところの請求の範囲第１項記載の装置。

２１、該哺乳動物中の、該哺乳動物の移動性祖先細胞が接近できる部位に請求の 範囲第１項記載の装置を移植する段階を含む、哺乳動物中で局所的な軟骨あるい は骨形成を誘導する方法。

２２、該哺乳動物中の、該哺乳動物の移動性祖先細胞が接近できる部位に請求の 範囲第１項記載の装置を移植する段階を含む、哺乳動物中で局所的な軟骨形成を 誘導する方法。

汁書（内容に変更なし） 明　細　書 阻二 本発明は、骨形成デバイス、哺乳動物中で骨形成を誘導可能なタンパク質をコー ドする遺伝子とその産物を組み換えＤＮＡいた骨および軟骨修復法に関するもの である。

哺乳動物骨組織は、おそらく成長時および通常の骨治癒の際に活性を持つ、一種 以上のタンパク性物質を含んでいることが知られており、その物質は軟骨内の骨 形成を引き起こす細胞性は文献中で、骨形態発生タンパク質、骨誘導タンパク質 、骨形成タンパク質、オステオゲニンとして様々に呼ばれてきた。

骨分化の発生カスケードは、間葉紺胞の補充、前駆細胞の増殖、軟骨のカルシウ ム沈着、血管の侵入、骨形成、再構成、および最後の骨髄分化からなる（レディ （Ｒｅｄｄｉ）　（１９８１）　Ｃｏ］ｌａｇｅｎＲｅ１．　Ｒｅｓ、上：　２ ０９−２２６）。

これらの表現型の形態転換を引き起こす詳細な機構はいまだ明らかになっていな いが、通常の骨基質の軟骨内骨分化活性を分離抽出し、不活性な残存するコラー ゲン性基質と再構成させて完全な骨誘導活性を回復させられることが示されてい る（サンバス（Ｓａｍｐａｔｈ）　とレディ（Ｒｅｄｄｉ）　、（１９８１）　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８　：　７５９９−７６０３）。このことにより、タンパ ク質抽出液が軟骨内の骨をｉｎ　ｖｉｖｏで誘導する活性をアンセイするため− の実験法が与えられる。

骨誘導タンパク質であると予想されるこのタンパク質は、５０キロダルトン（ｋ Ｄ）以下の分子量を持つことが示された。種間移植実験から示されたように、数 種の哺乳動物が密接に関連したタンパク質を産生ずる（サンバス（Ｓａｎｐａｔ ｈ）とレディ（Ｒｅｄｄｉ）（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：　６５９１−６５９５）。

このタンパク質の潜在的な有用性は広く認識されている。このタンパク質が容易 に入手可能となることにより、整形外科医学、ある種の形成外科、および多様な 歯周および脳顔面頭蓋復元法を根本的に変えるであろうと予測されている。

これらのタンパク質両分に関して観察された性質から、骨形成活性を担う純粋な 因子（群）の分離および同定を目的として多数の研究室で熱心な研究が行われて きた。

哺乳動物の骨から骨形成タンパク質を生成する技術の現在の状態は、サンバスら によって開示されている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　（１９８７）　朋）　、ウリスト（Ｕｒｉｓ ｔ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ。

Ｅｘｐ−Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　（１９８４）　、ｌｐ：１９４−１９９）は、 塩化カルシウム−尿素、無機−有機溶媒混合物を用いて鉱物質除去された皮質性 骨から抽出し、グアニジン−塩酸中で分離沈殿させ調製用ゲル電気泳動で回収し たヒト骨形成タンパク質を開示している。

著者らは該タンパク質画分は酸性ポリペプチドのアミノ酸構成を有し、分子量は １７〜１８ｋＤの範囲であることを報告している。

ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）　ら（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　（１９８４）８１：３７１−３７５）は、酸性ポリペプチドであって 分子量約１８ｋＤのウシ骨形態形成タンパク質抽出物を開示している。該タンパ ク質とヒ存在し、マウス後回半部筋肉中での骨形成およびラットおよびイヌ頭蓋 のトレフィン欠陥の骨再生を誘導することを著者らは報告している。骨から該抽 出物を得る彼らの方法では、定義の曖昧な不純な調製物が得られる。

１９８５年１０月７日に出版されたヨーロッパ特許出願連続番号第１４８、１５ ５号は、ウシ、ブタ、およびヒト由来の骨形成タンパク質を開示することを意図 している。該タンパク質の一つ、発明者がＰ３タンパク質と呼んでいるものは分 子量が２２〜２４ｋＤであり、実質的に均質な状態にまで精製されたと言われて いる。この物質は、動物に移植すると骨形成を誘導することが報告されている。

１９８８年１月１４日に出版された、国際出願番号ＰＣＴ１０８７１０１５３７ 号は骨誘導活性を有するウシ骨由来の不純な両分を開示している。上述の出願ら は、組み換えＤＮＡ技術によって産生されたウシ骨誘導因子であると予想される 因子も開示している。ヒトあるいはウシのゲノムあるいはｃＤＮＡライブラリー から４つのＤＮＡ配列が回収され、組み換え宿主細胞中で明らかに発現された。

発現されたタンパク質は骨形層形成タンパク質であろうと出願人らは述べている が、骨誘導は示されなかった。骨形態形成剤と題されたウリスト（Ｕｒｉｓｔ） 　ら、ＥＰ　Ｏ，２１２，４７４も参照のこと。

ワン（Ｗａｎｇ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ］、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌ１Ｓ Ａ　（１９８Ｂ）　８５　：　９４８４−９４８８）は、ウシの鉱物質除去した 骨のグアニジン抽出物から、ゲル溶出から分子量３０ｋＤと決定された塩基性タ ンパク質として軟骨・骨形成活性を有するウシ骨形態形成タンパク質の精製を開 示している。該タンパク質の精製により、３０、】８、および１６ｋＤのタンパ ク質が得られ、これらは分離されると不活性であった。この結果から見て、活性 を持つ物質の正確な性質は決定されなかったと著者らは認めている。

ウオズニ−（Ｗｏｚｎｅｙ）ら（５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｂ）　２４２　：　 １５２Ｂ−１５３４）は、ウシ骨からまず精製された３つのポリペプチドに対応 するヒトのポリペプチドをコードする完全長のｃＤＮＡＯＤＮＡ間示している。

組み換え技術で発現された３つのヒトタンパク質はそれぞれ単独で、あるいは組 み合わせて軟骨形成を誘導できると著者らは報告している。骨形成の証拠は報告 されていない。

本発明の一つの目的は、同種移植および異種移植で骨講導可能な骨形成タンパク 質が分散して含まれている基質から居る骨形成装置を与えることである。別の目 的は、哺乳動物骨組織から骨形成タンパク質を単離する再現性のある方法を与え ることである。また別の目的は、骨形成を担うタンパク質の解析を行うことであ る。さらに別の目的は、ヒトを含む哺乳動物中で軟骨内の骨形成を跣導可能な天 然あるいは組み換え骨形成タンパク質を与えることである。さらに別の目的は、 ・骨形成タンパク質をコードする遺伝子および組み換えＤＮＡ技術を用いてそれ らを産生させる方法を与えることである。また別の目的は、軟骨形成を誘導する 方法を与えることである。

本発明の上述の、またそれ以外の目的および特徴は、以下の説明、図、および請 求の範囲から明らかとなるであろう。

主肌■翌り 本発明は、哺乳動物体に移植されるとその部位で軟骨内骨形。

成および骨髄分化の完全な分化カスケードが誘導される骨形成デバイスに関する ものである。ここで開示するように適切に修飾すると、該デバイスは軟骨形成の 誘導にも使用することができる。このデバイスはここでは基質と呼ぶ担体基質か らなり、該基質は以下に述べるような性質を有しており、該基質には天然材料か ら精製された元来の形態の骨形成タンパク質、あるいは組み換えＤＮＡ技術で産 生じたもののどちらかが分散して含まｎている。

これらの開発の鍵は、哺乳動物の骨から活性のある、実質的に純粋な骨形成タン パク質を回収する方法、およびそれに続く天然の骨形成タンパク質のアミノ酸配 列および構造データの解析の発展が成功することである。該タンパク質は１ｍｇ の移植あたり約０．８〜１．０ｎｇの２分の１最大値骨形成活性を有する。該タ ンパク質は二量体であると考えられている。それは解離すると活性がなくなるよ うである。該タンパク質の複数の種の多様な組み合わせがヘテロニ量体あるいは ホモニ量体として存在しているらしい。

本発明は、骨から抽出された、または組み換えＤＮＡ技術で産生された天然の型 の骨形成タンパク質を与える。実質的に純粋な骨形成タンパク質としては、どの ような由来かには関わらず、多様なグリコジル化パターン、多様なＮ末端を有す る型、アミノ酸配列の相同性がある領域を持つ関連したタンパク質のファミリー 、および天然のタンパク質の活性を持つ短縮型あるいは変異型タンパク質が含ま れる。天然の材料から得た骨形成タンパク質はその元来の型では、グリコジル化 されており、５Ｏ５−ＰＡＧＥで決定されたところでは約３０ｋＤの見かけの分 子量を持つ。

還元されると、その３０ｋＤのタンパク質は約１６ｋＤおよび１８ｋＤの見かけ の分子量を持つ二つのグリコジル化されたポリペプチド鎖が生じる。還元された 状態では、３０ｋＤタンパク質は検出可能な骨形成活性を示さない。脱グリコジ ル化されたタンパク質は骨形成活性を持っており、約２７ｋＤの見かけの分子量 を持っている。

還元されると、２７ｋＤタンパク質は約１４ｋＤと１６ｋＤの見かけの分子量を 持つ二つの脱グリコジル化されたポリペプチドを生じる。

完全な分子および消化断片の解析から、天然の３０ｋＤ骨形成タンパク質は以下 のアミノ酸配列を含むことが示唆された（疑問符は決定されていない残基を示す ）： （１）　５−Ｆ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｙ、Ｃ−３−Ｇ−Ａ−Ｃ−ローＦ−Ｐ−トＰ−Ｋ 。

（２）　５−Ｌ−に−Ｐ−３−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｉ−１１ｉ−５−Ｉ−Ｖ。

（３）　Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｖ−Ｐ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−５−Ａ−Ｉ−３−Ｍ−Ｌ−Ｙ−Ｌ− Ｄ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−Ｋ。

（４）　Ｍ−３−３−Ｌ−３−Ｉ−Ｌ−Ｆ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｎ−Ｋ。

（５）　５−Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ｑ−Ｒ；（６）　Ｆ−Ｌ−）１−Ｃ −Ｑ−Ｆ−Ｓ−Ｅ−Ｒ−Ｎ−Ｓ。

（７）Ｔ−シーＧ−Ｑ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−［ｌ−５−５−Ｅ−Ｐ−Ｎ−１−Ｙ。

（８）　Ｌ−Ｙ−Ｄ−Ｐ、Ｍ−Ｖ−Ｖ。

（９）　Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｉ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ｃ−Ｃ−シーＰ−Ｅ。

（１０）　Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｄ−Ｔ−Ｇ。

（１１）　Ｖ−Ｐ、に−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｔ。

（１２）　ｌ−Ｎ４−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｌ；（１３）　Ｄ−）１−Ｈ−シーＬ−ＴＪ Ｉ−Ｆ−Ｐ−１−バーＴ−Ｎフ（１４）　Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−に−１（−Ａ− Ｒ’−Ｒ−に−Ｑ−Ｗ−１−？−Ｐ。

（１５）　Ｄ−１−Ｇ−？−５−Ｅ−Ｗ−１−１−？−Ｐ；（１６）　Ｓ−１− Ｖ−Ｒ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−１−Ｐ−Ｅ−Ｐ−？−？−Ｖ：（１７）　Ｄ −？−Ｅ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−）１−Ａ−Ｆ−Ｙ。

（１８）　Ｄ−Ｅ−Ｎ−に−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−に−Ｖ−Ｙ−Ｐ−Ｎ−トＴ−Ｖ− Ｅ。

（１９）　５−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｑ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ω−Ｔ−Ｌ４−？−Ａ−Ｒ−？− に−Ｑ；（２０）　Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ４−に−Ａ−Ｒ−Ｒ−に−Ｑ−Ｗ４−Ｅ −Ｐ−Ｒ−Ｎ−？−＾−Ｒ−Ｒ−Ｙ−Ｌ；（２１）　八−Ｒ−Ｒ４−Ｑ−ｈ’− Ｔ−Ｅ−Ｐ−Ｒ−Ｎ−？−Ａ−？４−Ｙ−？−？−シーＤ：（２２）　Ｒ−？− Ｑ−一へＩ−Ｅ−Ｐ−？−Ｎ−？−Ａ−？−？−Ｙ−Ｌ−に一シーＤ−？−Ａ〜 ？−？−Ｇ。

実質的に純粋な形で該タンパク質を入手できること、そのアミノ酸配列などの構 造的な特徴を知ることにより、骨形成タンパク質をコードする元の遺伝子の同定 、クローニング、および発現が可能となる。翻訳後に適切に修飾し、適当な基質 に混合し、ここで述べるように移植すると、これらのタンパク質は軟骨および軟 骨内骨の形成を誘導することができる。

部分的な配列データを基にしてここでデザインしたコンセンサスＤＮＡ配列、お よび文献で開示されている調節タンパク質との間に見いだされた相同性は、ゲノ ムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから骨形成タンパク質をコードする 遺伝子を抽出するためのプローブとして有用である：コンセンサス配列の一つは これまで同定されていなかったゲノムＤＮＡ配列の単離に使用され、それらの一 部は連結されると軟骨内骨形成を誘導できる領域を持タンパク質をコードしてい るものであった。ＯＰＩと呼ぶこのタンパク質は以下に示す配列を持つ活性領域 を有する。

より長い活性配列は以下のものである。

第１Ａ図はＯＰＩのゲノムＤＮＡ配列を示している。

このプローブは、上で参照したＰＣＴ１０８７１０１５３７で同定され、その中 でＢＭＰＩＩ　（ｂ）およびＢＭＰＩＩＩと呼ばれているＤＮＡ配列も回収した 。この中で発明者らは、同一の出版物由来のこれらのゲノムＤＮＡのある一部分 とＢＭｌ’ｌＩａを適当に連結すると、真の骨形成活性を有する、すなわち適当 に哺乳動物に移植すると軟骨内骨形成に至る完全なカスケードを誘導するタンパ ク質群（ＣＢＭＰＩＩａ、ＣＢｌＩＰＴＩｂ　、　ＣＢＭＰＩＩＩ）をコードす ることを開示した。これらの配列を以下に示す： 以上のように、本開示の観点から、熟練した遺伝学技術者はｃＤＮＡライブラリ ーあるいはゲノムライブラリーノ酸配列をコードする遺伝子を単離し、それらを 原核生物および真核生物を含む様りな型の宿主細胞中で発現させ、ヒトを含む哺 乳動物中で骨形成を誘導可能な活性タンパク質を大量に産生させることができる 。

実質的に純粋な骨形成タンパク質（すなわち、骨誘導活性を持たないタンパク質 の混入がない、天然出来のタンパク質あるいは組み換えタンパク質）は、適当な 輸送系あるいは補助系（基質）と組み合わせて臨床での応用に有用である。基剤 は粒子状物質あるいは多孔性物質から作られる。孔は前駆体細胞の移動およびそ れに続く分化と増殖が可能な大きさでなければならない。粒子のサイズは７０− ８５０ｍ、望ましくは７０−４２０−の範囲内でなければならない、該基剤は粒 子性物質を密にバッキングして骨の欠損をつなぐような形にすること、あるいは 生体適合性（炎症を起こさない）であってｉｎ　ｖｉｖｏで生物分解可能な物質 を望みの形に構築して“一時的補助材”および移動性前駆体細胞の補充のための 基質として、およびそそれに続く固定化と増殖のための基盤として働くように、 作成される。目下のところ推奨される担体としては、顆粒状、鉱物質除去され、 グア；ジン抽出された、種特異的（同種）骨組織、および顆粒状で脱グリコジル 化され（あるいは肝処理した）、タンパク抽出され、鉱物質除去された異種骨組 織が含まれる。任意に、このような異種骨Ｍｉ繊織顆粒基剤はトリプシンなどの プロテアーゼで処理してもよい。そのほかの有用な基剤物質としては、コラーゲ ン、グリコリン酸と酪酸のホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシアパタイ ト、リン酸３カルシウム、およびそのほかのカルシウムリン酸塩が含まれる。

ここで可能となり開示された骨形成タンパク質および移植可能な骨形成デバイス により、例えば後天的および先天的脳頭面頭蓋およびその他の骨あるいは歯の異 常を矯正するための、予想可能な最適の骨形成を外科医が得られるようになる（ ブロワツキ（Ｇｌｏｗａｃｋｉ）ほか、（１９８１）　Ｌａｎｃｅｔ上：　９５ ９−９６３）、動物実験で示されたように、該デバイスは不連続骨折において、 および骨形成が必要とされる歯周での応用を含むそのほかの臨床的応用において の局所的な軟骨内骨形成を誘導するために使用される。もう一つの潜在的な臨床 的応用は、例えば骨関節炎の治療での、軟骨修復である。

■皿坐呈単星脱ユ 本発明の上述およびその他の目的、その多様な特徴、および本発明そのものは、 添付した図と共に以下の説明を読むことにより、より完全に理解されるであろう 。

第１Ａ図は、骨形成タンパク質“ＯＰＩｏのゲノムコピーのヌクレオチド配列を 示したものである。１８８０および１９２９の間の満ち領域は実際には約１００ ０ヌクレオチドを表している：第１Ｂ図は骨形成タンパク質″ＯＰＩ”遺伝子へ のコンセンサス遺転子／フローブのハイブリダイゼーションの模式図である；第 ２図は、ヘパリン−セファロース−１、）ＩＡＰ−ウシトロゲル：シービングー ゲル（セファクリル３００）　；およびヘパリン−セファロース−ＩＩ上での精 製の際のウシ骨形成タンパク質（ＢＯＰ）分画の結果を示す、溶出体積に対する タンパク質濃度（吸光度で示される）のプロットの集合である； 第３図は、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ）での骨形成タンパク質の クマジーブルーで染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを写真で再現したもの である；第４図は、酸化した（Ａ）、および還元した（　Ｂ）　３０ｋｖタンパ ク質の炭水化物成分を示すＳＤＳポリアクリルアミドゲルのＣｏｎＡプロットを 写真で再現したものであるｉ 第５図は、＋　ｚｓＩ槓識グソコシル化された（Ａ）、および脱グリコジル化さ れた非還元条件下（１）および還元条件下（２）での骨形成タンパク質のＳＯＳ ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを写真で再現したものである； 第６図は、Ｖ−８プロテアーゼ（Ｂ）、エンドＬｙｓ　Ｃプロテアーゼ（Ｃ）、 ペプシン（Ｄ）、およびトリプシン（Ｅ）で３０ｋＤ骨形成タンパク質を消化し て得られたペプチドのＳＤＳポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを写 真で再現したものである。（Ａ）はコントロールである。

第７図は、３０ｋＤ　ＲＯＰ　（Ａ）、１６ｋＤサブユニット（Ｂ）、および１ ８ｋＤサブユニツト（Ｃ）のトリプシンペプチド消化産物の）ＩＰＬＣクロマト グラムを集めたものである； 第８図は、２回目のヘパリン−セファロースクロマトグラフィー過程（第２Ｄ図 参照）から回収された試料の逆相Ｃ−１８）ＩＰＬｃでの溶出プロファイルの肝 ＬＣクロマトグラムである。重ね書きされているものは、各画分中の骨形成率パ ーセントである；第９図は、Ｃ−１８で精製した骨形成ピーク画分のＴＳＸ３０ ００／２０００ゲルでの溶出プロファイルのゲル浸透クロマトグラムである。

重ね書きしであるのは各両分中の骨形成率パーセントである；第１０図は、ヘパ リン−セファ０−スＩ　（Ａ）、）ＩＡＰ−ウシトロゲル（Ｂ）、ＴＳＫ３００ ０／２０００　（Ｃ）、およびヘパリン−セファ０−スＩＩ（Ｄ）でのヒトタン パク質分画化の結果を示す、溶出体積に対するタンパク質濃度（吸光度で示され ている）のグラフを集めたものである。矢印は緩衝液の変化を示している；第１ １図は、Ｃ−１８での逆相）ＩＰＬｃ　（Ａ）、ヘパリン−セファ０−スＩＩ　 （Ｂ）、ＴＳＫ３０００　（Ｃ）、ＨＡＰ−ウシトロゲル（Ｄ）、およびヘパリ ン−セファロースＩ（Ｅ）を含む多様な精製過程由来の試料の骨誘導活性に関す る典型的な投与量反応を示すグラフである。

第１２図は、骨形成デバイス（Ａ）、担体コントロール（Ｂ）、および鉱物質除 去した骨（Ｃ）で処理した後のネコ骨欠損修復の放射線形態学的解析の棒グラフ である； 第１３図は、骨形成タンパク質（ＣＯＰＯ）に関するコンセンサス遺伝子／プロ ーブのＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を模式的に表したものである； 第１４図は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲルの３０ｋＤ領域中のピーク骨形成活 性を示す、増加する分子量に対する骨形成活性のグラフである； 第１５図は、３０ｋＤタンパク質のゲルで精製されたサブユニットを示すクマジ ーブルーで染色したＳＤＳゲルを写真で示したものである； 第１６図は、１８ｋＤサブユニツト（Ｕ＃よび１６ｋＤサブユニツト（Ｂ）のエ ンドＡｓｐ　Ｎプロテイナーゼ消化産物の二つのＨＰＬＣクロマトグラムである ； 第１７図は、ラットモデルでの骨移植の組織学的検査を写真で示したものである ：担体のみ（Ａ）；担体とグリコジル化した骨形成タンパク質（Ｂ）：および担 体と脱グリコジル化した骨形成タンパク質（Ｃ）。矢印は遺骨細胞を示す：第１ ８図は異種基質（脱グリコジル化されたウシ基質）の活性を示すグラフである； および、 第１９Ａ図および第１９Ｂ図は、増加するタンパク質濃度（投与量曲線、ｎｇ） に対して、カルシウム含量で測定されるゲル溶出前後の天然材料から得られたＯ ＰＯ比活性を示す棒グラフである。

見肌立投ユ 哺乳動物の骨由来の粗抽出液中に存在する骨形成タンパク質の単離を可能にする 精製法が開発された。各分離過程は既知の分離技術から構成されているが、尿素 などの変性剤の存在下でヘパリンおよびヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）に対す るタンパク質の親和性を利用した一連の分離の組み合わせが粗抽出液から純粋な タンパク質を単離するための鍵であることが発見された。

これらの重要な分離過程は疎水性溶媒、ゲル除外クロマトグラフィー、および５ Ｏ５−ＰＡＧＥからの溶出と組合わされる。

この単離法により、あらゆる哺乳動物種から、十分量の新鮮な骨が入手可能であ れば、実質的に純粋な骨形成タンパク質の大量産生が可能となる。新鮮なウシの 骨が入手可能であることと合わせて、この方法の実験に基づいた発展により、実 質的に純粋なウシ骨形成タンパク質（ＢＯＰ）の単離が可能となった。ＢＯＰは 、以下に述べるように重要なものとして解析されて来た：ネコ、ウサギ、ラット 中で軟骨および最終的には軟骨内骨の成長を誘導する能力が研究されて来た；不 均質な前抽出物中に存在する未知のタンパク質（群）によるものだとそれまで考 えられてきた骨形成の完全な分化カスケードをＢＯＰが誘導できることが示され た；また、ＢＯＰは、不連続骨折を含む整形外科系欠陥における軟骨内骨の形成 を誘導するために用いられる。天然の形では、ＢＯＰはグリコジル化されている 二量体タンパク質である。しかし、ＢＯＰは、脱グリコジル化された形で活性を 持つ。

部分的に塩基配列決定が行われていた。その−次構造はここで示すアミノ酸配列 を含んでいる。

ＢＯＰのアミノ酸配列の解明により、ペプチド断片をコードする核酸プローブの プールの構築が可能となる。また、アミノ酸配列データ、配列に関して推定した コドン、および既知の遺伝子との部分的相同性の観察を基にしてここで述べるよ うにデザインしたコンセンサス核酸配列もプローブとして使用された。

プローブは、以下で述べるように標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて 活性のある哺乳動物骨形成タンパク質（ＯＰ）をコードしている、通常化上るｃ ＤＮＡの単離に使用することもできる。そのｎ＋ＲＮＡは骨形成タンパク質を合 成することが知られている多様な種の細胞の紛胞質中に存在している。核ｍＲＮ Ａををする有用な細胞としては、例えば、骨あるいは骨肉腫由来の骨芽細胞、肥 大性軟骨細胞、および幹細胞がある。該ｍＲＮＡはｃＲＮＡライブラリーの産生 に使用可能である。あるいは、骨形成タンパク質をコードする適切なりＮＡは、 多様な哺乳動物種由来のクロー′化されたゲノム［ｌＮＡライブラリーから回収 することができる。

コレラノ発見により、単独あるいは組み合わせることによって真の軟骨内骨を産 生可能な完全に新しく、非天然のタンパク質構造物をコードするＤＮＡの構築が 可能となる。また、それらにより、天然の材料から回収したｃＤＮＡ、あるいは 市販の自動化された装置を用いてここで開示する技術によって合成したｃＤＮＡ から、元来の物質、短縮化された型、変異タンパク質、類似体、融合タンパク質 、および多様なそのほかの改変体および構造物を発現させることができる。これ らのＤＮＡは、確立されている組み換えＤＮＡ技術を用いて原核生物あるいは真 核生物宿主細胞中で発現させることが可能であり、生物活性が必要ならば、ｎｖ ｉｔｒｏで酸化して再度形作らせることができる。

骨からタンパク質を得るための単離方法、骨形成タンパク質遺伝子の回収、組み 換えタンパク質のデザインおよび産生、基剤の性質、およびここで請求する目的 物質の性質、用途、作成法および使用法に関するそのほかの重要な局面は、本発 明の多様な局面を実施するために現在知られている最適の方法を示している以下 の記述からさらに理解されるであろう。

八−■巴Δ様製 Ａ１．　ム　した尾のｆ、剥 脱鉱物化したウシ骨基質は、すでに出版されている方法にょって調製した（サン バス（Ｓａｍｐａｔｈ）とレディ（Ｒｅｄｄｉ）　（１９８３）Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：６５９１−６５９５）。ウシ骨 幹性骨（１〜１０日令）を地域の屠殺場から入手し、新鮮なうちに使用する。骨 から筋肉および脂肪を剥がし、骨膜を取り除き、冷水圧によって髄を除き、冷た い純粋エタノールに短時間さらし、−２０″Ｃで保存する。次にそれらを乾燥さ せ、大きな挽き器の中で砕き、粉砕することによって顆粒化した。液体窒素を用 いることにより、過熱しないように注意する。粉砕した骨を７０〜４２０′虜の 間の粒子サイズまで粉砕し、３倍体積のクロロホルム／エタノール（３：１）を 用いて約２時間の洗浄を２回行うことにより、脂肪を除く。顆粒状の骨を次に１ 倍体積の純粋エタノールで洗浄し、１倍体積の無水エーテル上で乾燥させた。脱 脂肪化骨パウダー（別の方法としては、アメリカン・バイオマテリアルズ社から ウシ皮質骨パウダー（７５〜４２ｈｍ）を入手する）を次に、１００倍体積０． ５Ｎ　ＨＣＩを用いて４℃で４０分間、４回鉱物質除去する。最後に、多量の水 で鉱物質除去した骨パウダーを洗浄して中和させる。

Ａ２．　＼−とエ　ノール２′ 上述のように調製した、脱鉱物化骨基質を、５倍体積のプロテアーゼ阻害剤（５ ｍＭ　ベンザミジン、４４＋＋＋Ｍ　６−アミノヘキサノン酸、４．３ｍＭ　Ｎ −エチルマレイミド、０．４４ｄフエニルメチルスルホニルフルオライド）を含 む４Ｍグアニジン−ＨＣｌ　（Ｇｕ−）１ｃＩ）、５０ｔ＋Ｍ）　’）　ス−Ｈ ＣＪ、　ｐＨ７，０を用いて、４　’Ｃで１６時間、分離用の抽出を行う。その 懸濁液を濾過する。上滑を集め、限外濾過ハローファイバーメンブレン（アミコ ン社、ＹＭ−１０＞を用いて１体積まで濃縮する。濃縮液を遠心しく８，０ＯＯ ｘ　ｇで１０分間、４℃）、上滑のエタノール沈澱を行う。１体積の濃縮液に５ 倍体積の冷（−７０℃）純粋エタノール（１００χ）を加え、−７０℃で１６時 間保持する。沈澱物を１０，０００χｇで１０分間４℃で遠心して回収する。得 られたベレットを４１の８５ｚ冷エタノールに再懸濁し、−７０℃で６０分間イ ンキュベートし、再度遠心する。沈澱物をもう一度８Ｓχ冷エタノールに懸濁し く２１）、−７０°Ｃで６０分間インキュベートし、遠心する。次に、沈澱物を 凍結乾燥する。

Ａ３．ヘパ１ンーセフ　ロース　りロマトグーフィーＩエタノール沈澱し、凍結 乾燥して抽出した粗タンパク質を２５体積の０．１５Ｍ　ＮａＣ］を含む６Ｍ尿 素、５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐ）ｌ’７−０（緩衝液Ａ）に溶解し、８， ０００χｇで１０分間遠心して清浄にした。

ヘパリン−セファロースは緩衝液Ａを用いてカラム平衡化を行う。

タンパク質をカラムの上に載せ、３力ラム体積の開始緩衝液（０，１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１を含む緩衝液Ａ）で洗浄した後に、タンパク質を０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む 緩衝液Ａで溶出する。溶出液の吸光度を連続的に２８０ｎｍで追跡する。０．５ Ｍ　ＮａＣ１で溶出されたタンパク質のプール。

（約１カラム体積）を集め、４℃で保存する。

第２Ａ図で示すように、はとんどのタ゛ンバク質（約９５ｚ）は結合せずに残る 。約５χのタンパク質がカラムに結合する。結合しなかった画分は、全体として パイオアンセイを行っても、あるいはセファロースＣＬ−６Ｂで部分精製した後 も骨誘導活性を示さない。

Ａ４．ヒドロキシアバ　イト−ル　ロール　ロマ　グーフィー°ヘパリンーセフ ァ０−スから０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで溶出したタンパク質の全体積 を、０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで平衡化したヒドロキシアバタイトウシ トロゲル（ＨＡＰ−ウシトロゲル）（ＬＫＢインスッルメント社）のカラムに直 接アプライする。ＩＩＡＰ−ウシトロゲルは平衡化に先立ち、５００＋ｉＭリン 酸ナトリウムを含む緩衝液Ａで処理する。吸着されないタンパク質を未結合画分 として集め、カラムを３体積の０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで洗浄する。

続いてカラムを１００ｍＭ　リン酸ナトリウムを含む覆衝液潟で溶出させた（第 ２Ｂ図）。

溶出する化合物は、アルカリホスファターゼ活性および組織学的に調べると、軟 骨内骨誘導を行える。生物学的に活性のあるタンパク質は６Ｍ尿素および０．５ Ｍ　ＮａＣ１の存在下でＨＡＰに結合するので、該タンパク質は骨組物質に親和 性を有し、リン酸イオンによってのみ置き換えられる。

Ａ５．セフ　りｉルＳ−３００−ルン゛　ロマトグーフィーセフアクリルＳ−３ ００）ＩＲ（光解像度、５ｃｍ　Ｘ　１００ｃ１１＋カラム）はファルマシア社 から入手し、４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐ）ｌ　 ７．０で平衡化する。ＨＡ−ウシトロゲルから結合したタンパク質両分を濃縮し 、尿素から４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｎ＋ＭトリスーＨＣｌ、　ｐ）１７． ０へ、アミコン限外濾過Ｙト１０メンブレンを介して交換する。次に、この溶液 をシュライヒャー・アンド・シュニル社ＣＥＮＴｌ？ＥＸ使い捨てマイクロフィ ルターで濾過する。

約４００Ｐａｇのタンパク質を含む約１５鵬１の試料アリコートをカラムニ載せ 、４片グアニジン−）ＩＣ】、５０５Ｍ　）リス−）１ｃＩ、ｐＨ７，０で、流 速３ｍｌ／＋ｗｉｎで溶出する；　１２ａ＋１の両分を８時間以上集め、タンパ ヲ骨形成に関してバイオアッセイを行う。骨形成を示し、見かけ分子量が３５ｋ Ｄ以下として泳動されるこれらの両分をプールし、ＹＭ−１０メンブレンを持つ アミコン限外濾過システムで濃縮する。

Ａ６．ヘパ１ンーセ　ロースクロマト　−フィーーＩＩゲル濾過クロマトグラフ ィーから得られた、プールした骨誘導画分を蒸留水（ｄＨ，Ｏ）に対して、次に ０．ＩＭ　ＮａＣ１を含む６Ｍ　尿素、５０ａ＋Ｍ　）リス−１１ＣＩ、　ｐＨ ７，０（緩衝液Ａ）に対して十分に透析する。透析後の溶液を遠心で清浄にする 。試料をヘパリン−セファロースカラム（試料緩衝液で平衡化したもの）にアプ ライする。３力ラム体積の開始緩衝液で洗浄した後、カラムを０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃｌ、および０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝′４Ｂで連続的に展開する（第２Ｄ 図）。０．５Ｍ　ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を集め、蒸留水に対して十分 に透析した。次に、３０χアセトニトリル、０．１χＴＦＡに対して４℃で透析 を行った。

Ａ７．逆祖此匡 タンパク質をＣ−１８バイダツク（Ｖｙｄａｃ）シリカをベースとしたＨＰＬＣ カラムクロマトグラフィー（粒子サイズ５β；孔サイズ３００Ａ）によってさら に精製した。ヘパリン−セファロース−ＩＩ　クロマトグラフで得られた骨誘導 画分をカラムに載せ、０．１Ｘ　ＴＦＡ、１０χアセトニトリルで５分間洗浄す る。第８図に示すように、結合したタンパク質を１０−３０％アセトニトリルの 直線勾配で１５分以上、３０−５０％アセトニトリルで６０分以上、および５０ −７０χアセトニトリルで１０分以上、２２°Ｃで流速１．５＋＋＋１／＋ｓｉ ｎで溶出し、１．４ｍｌ試料をポリカーボネートチューブに集める。タンパク質 をＡ２１ａｎｍでの吸光度で追跡する。カラム画分を骨誘導活性の存在、および コンカナバリンＡでプロット可能なタンパク質の存在に関して試験する。これら の画分をプールし、オートラジオグラフィー、コンカナバリンＡブロッティング 、およびクマジーブルー染色によって３０ｋＤタンパク質の存在を生化学的に解 析する。

次にそれらを江　■脛骨形成活性に関してアッセイを行う。３０ｋｎタンパク質 が存在しないと生物学的活性は見いだされない。

Ａ８．Ｌ水痘上 グリコジル化された、あるいは脱グリコジル化されたタンパク質をさらに解析す るためにＳＯＳゲル（厚さ０．５＋＋ｍ）から溶出する。＋　ｚｓｌで標識した ３０ｋＤタンパク質を、収量を追跡するために各調製液に定常的に添加する。表 １は、試した多様な溶出緩衝液と＋２５１で標識したタンパク質の収量を示して いる。

（１）　ｄ）１２０　２２ （２）４月グアニジン−ＨＣｌ、ｌ−リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０２（３）４門 グアニジン−）１ｃ１．　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０，９３０，５Ｚ　）リ ドンＸ−１００ （４）　０．１χ、ＳＤＳ、　）リス−）１ｃＩ、　ｐＨ７，０９８表２は３０ ｋＤあるいは脱グリコジル化された２７ｋＤゲル結合タンパク質の単離に使用さ れる過程を列挙したものである。標準的な方法では、トリス−ＨＣｌ緩衝液中に ０．５χトリトンｘ　１００を含む４１１グアニジン・ＨＣＩ、あるいは０．１ Ｘ　ＳＯＳを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液・を用いた拡散溶出を用い、以下の部分 で述べるようにｎ　■胆骨形成活性を示すためにゲルの２７あるいは３０ｋＤｔ Ｊｉ域からのタンパク質の９５％以上の溶出を行った。

Ｌ２−ル）”シロ　した　ンバク　のＷＬｊＡ（Ｃ−１８プールあるいは脱グリ コジル化タンパク質と、１２５Ｉ標識した３０ｋＤタンパク質） １、真空遠心で乾燥させる； ２、ペレットをＨ２Ｏで洗浄する； ３、ペレットを試料緩衝液に溶解する（還元剤は含まない）：４、前電気泳動し た０、５ｍｍミニゲルで電気泳動する；５．２７あるいは３０ｋＤタンパク質を 切り出す：６．０．１χＳＤＳ、　５０＋ａＭ　）リス−〇ＣＩ、　ｐ＋（７， ０でゲルから溶出する；７、　ＣＥＮＴＲＥＸメンブレンで濾過する；８、セン トリコンチューブ（１０ｋＤメンブレン）中で濃縮し、水で洗浄する。

ゲル溶出法による標識した３０ｋＤタンパク質の総収量は載せた試料の５０〜６ ０χである。損失の殆どは、タンパク質の重合および／またはスメアによる電気 泳動過程で起きている。

収量は、骨１ｋｇあたり０．５から１　、　ＯＩｇの実質的に純粋な骨形成タン パク質が得られるものである。

Ａ　９．６ｋＤ　び１８ｋＤ　の 表３は、サブユニットの調製に関する方法を要約したものである。約１０ｐｇの ゲルから溶出した３０ｋＤタンパク質（第３図）をカルボキシメチル化し、ＳＯ Ｓゲル上で電気泳動する。試料は〔゛収量の追跡と、ゲルから１６ｋＤおよび１ ８ｋＤ領域を切り出すためのインディケータ−として用いるために、Ｉ　２５１ 　ｉ　議を含んでいる。

第１５図はゲルから精製した１６ｋＤおよび１８ｋＤタンパク質のクマジーブル ー染色したゲルを示している。

表３　ｋＤ　ンバク　のサブユニ・トの（Ｃ４８７”−ルト”＃識シｔ：３０ｋ Ｄ９　ンハク質）１、ＳＯＳゲル上で電気泳動する。

２．３０ｋＤタンパク質を切り出す。

３、　Ｏ，ｌＸ　ＳＤＳ、５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０で溶出する 。

４、セントリコンチューブ（１０ｋＤメンブレン）中で濃縮し、Ｈ２Ｏで洗浄す る。

５、還元した試料をＳＤＳゲル上で電気泳動する。

６．１６ｋＤおよび１８ｋＤサブユニツトを切り出す。

７、０．１！　ＳＯ５，５ＱｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐ）１７．０で溶出する 。

８、セントリコンチューブ中で濃縮し、Ｈ，Ｏで洗浄する。

９．１χＳＤＳ、　０．４Ｍ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，５中で還元し、カルボ キシメチル化する。

１０、セントリコンチューブ中でｆｉ！し、ＨｚＯで洗浄する。

ＢＢＯＰｏ）”’、” Ｂ１．　！Ｌ土λ土工丞 ゲルスライス実験により、単離された３０ｋＤタンパク質が骨形成活性を担うタ ンパク質であることが確認される。

精製の最後の過程由来のゲルをスライスする。各画分のタン４００）　、５０＋ ｍＭ　）リス−ＨＣｌを含む緩衝液中で抽出する。抽出したタンパク質を脱塩し 、濃縮し、軟骨内骨形成活性に関してアッセイを行う。結果を第１４図に示す。

この図から、骨形成活性の大部分がケルの３０ｋＤ領域のタンパク質によるもの だということが明らかである。高分子量領域中の活性は明らかにタンパク質の重 合によるものである。これらのタンパクｆ重合体は、還元されると上述の１６ｋ Ｄおよび１８ｋＤ種を与える。

Ｂ２．Ｃｏｎ−Ａ−セフ　ロースクロマトグーフィー３０ｋＤタンパク質を含む 試料を０．１＄　ＳＤＳ、５０ＩＩＭトリスーＨＣｌを用いて可溶化し、同し緩 衝液で平衡化したコンカナバリンＡ（Ｃａｎ−Ａ）のカラムにアプライする。結 合した物質を、０．５ｍＭアルファーメチルマンノシドを含むＳＤＳ　）リス− ＨＣｌ緩衝液で溶出する。結合画分および非結合画分の双方の逆相クロマトグラ フィーを行った後に、Ｃｏｎ−Ａ結合性物質は移植すると顕著な骨形成を引き起 こす。結合性物質のさらなる解析から、Ｃｏｎ−Ａでプロット可能な３０ｋＤタ ンパク質が示された。さらに、グリコジル化された３０ｋＤタンパク質は骨形成 活性を担っている。

Ｂ３．゛ル゛秀クロマトグーフィー グアニジン−ＨＣｌ中のＴＳＫ−３０００／２０００のどちらかを用いてゲル浸 透クロマトグラフィーによって、Ｃ−１８クロマトグラフイーで得られた高比活 性画分の分離を行った（第９図）。その結果、骨誘導活性のピークはクマジーブ ルー染色で実質的に純粋な３゜ｋＤタンパク質を含む画分に溶出することが示さ れている。この両分をヨウ素化し、オートラジオグラフィーにかけると３０ｋＤ の強いバンドがヨウ素化されているタンパク質の９ｏχを占めている。該画分は 江　血で、移植あたり５０から１１００ｎの投与量で骨形成を誘導する。

８４″″′・ｊ　のための　告・な７゛・Ｂ４−１　遣上盪至盈性 ３０ｋＤ骨形成タンパク質の骨誘導における役割は明確に確立されたが、タンパ ク質分解産物の解析から我々は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの活性に必要な最小構造を探 し始めた。切断実験の結果から、ペプシン処理では骨誘導活性を破壊することは できないが、トリプシンあるいはＣＮＢｒでは活性が完全にすくナル。

生物学的活性に必要なペプシン消化産物を単離し、同定するための実験が行われ る。ペプシン消化に用いられる試料は２０Ｘ〜３０χの純度であった。用いた緩 衝液は、０．１！　ＴＦＡ水溶液である。酵素の基質に対する割合は、１：１０ である。コントロール試料は酵素を加えないで作製した。分解混合液は室温で１ ６時間インキュベートする。次に、分解産物をゲル浸透クロマトグラフィーを用 いて４門グアニジン−ＨＣｌ中で分離され、その両分を憇血アッセイのために調 製する。その結果、ペプシン消化産物のゲル浸透クロマトグラフィー由来の活性 画分は８ｋＤ〜１０ｋＤの範囲の見かけの分子！を有するペプチドに対応するこ とが示さ骨形成活性に関しての炭水化物部分の重要性を理解するために、３０ｋ Ｄタンパク質をＨＦを用いて科学的に脱グリコリル化させた（以下参照）。炭水 化物がないことを確実にするためにＣｏｎＡプロットによる反応産物のアリコー トを解析した後、その物質のｉｎ　ｖｉｖｏでの活性をアッセイした。そのバイ オアッセイは陽性であり（すなわち、第１７Ｃ図で示されているように、組織学 的な試験によって決定されたように、脱グリコジル化されているタンパク質は骨 形成反応を引き起こす）、肝にさらすことによりタンパク質の生物学的機能は破 壊されず、したがってＯＰ投与量は生物学的活性に炭水化物を必要としないこと が示された。

さらに、脱グリコジル化されたタンパク質の比活性は、グリコジル化されている 天然のタンパク質とほぼ同じである。

Ｂ５．観ハ延り１性 １）移植物のカルシウム含量を基にした２分の１最大骨誘導活性を決定するため ；２）ゲルスキャニング法を用いナノグラムレベルでタンパク質を見積もるため ；および３）ゲルから溶出した３０ｋＤ　ＲＯＰの２分の１最大値骨誘導活性に あたる投与量を確立するために、実験が行われた。その結果、ゲルから溶出した 実験的に純粋な３０ｋＤ骨形成タンパク質は移植当たり５ｎｇ以下で骨を誘導し 、移植あたり２０ｎｇ　（約２５ｍｇ）で２分の１最大値骨分化活性を示すこと が明らかになった。精製データから、骨形成タンパク質は、ウシ骨からタンパク 質１ｍｇあたり４７．７５０骨形成ユニツトであった最後のゲル溶出過程後に、 ３６７、３０７倍まで精製されたことが示唆されている。

ＢＳ（Ａ）　２分の１最大骨分化活性 骨誘導活性は、アルカリホスファターゼの比活性、および１２日目の移植物中の カルシウム含量によって生化学的に決定した。

アルカリホスファターゼの比活性の増加は、骨形成の開始を氷′唆する。一方、 カルシウム含量は、移植物中で形成された骨の量に比例する。したがって、骨形 成は、ラットの１２日目の移植物のカルシウム含量を決定することによって計算 され、骨形成ユニットとして表され、これはラットの鉱物質除去した骨基質と比 較して２分１の最大骨分化活性を示す量を表す。元来の鉱物質除去したラット骨 基質によって示される骨誘導は、比較する際の最大骨分化活性であると考えられ る。

Ｂ５　（ｂ）ゲルスキャニング法を用いるタンパク質の見積もり標準曲線は、既 知の量の標準タンパク質、ウシ血清アルブミンを用いた。該タンパク質の濃度を さまざまに変えて（５０〜３００ｎｇ）　１５χＳＤＳゲルに載せ、電気泳動し 、クマジーで染色し、脱染する。ゲルは５８０ｎｍのゲルスキャナーを用いて、 あらかじめ決定された装置のところでスキャンされた。タンパク質のバンドによ って覆われた領域は計算され、タンパク質の濃度に対して標準曲線が構築される 。未知のタンパク質濃度の試料を、ＢＳＡを標準として電気泳動する。未知の試 料を含むレーンがスキャンされ、タンパク質の濃度が曲線の下の領域から決定さ れる。

Ｂ５　（ｃ）ゲル溶出および比活性 高度に精製され活性のあるＣ−１８画分のアリコートをＳＤＳゲルに流し、第１ ４図に示されているように分子量によってスライスする。タンパク質をスライス から０．５χトリトンｘ−１００を含む４Ｍグアニジン−ＨＣｌ中に溶出し、脱 塩し、濃縮し、カルシウム含量によって決定されるように軟骨内骨形成活性に関 してアッセイする。

含量によって決定された。第１９Ａ図および第１９Ｂ図は、ゲル溶出の前後にカ ルシウム含量で見積もって、３０ｋＤタンパク質の多様な濃度に対する骨形成活 性を示している。ゲル溶出前は３０ｋＤタンパク質の２分の１最大値活性が６９ ｎｇ毎２５ｎ＋ｇ移植で、溶出後は２１ｇｇ毎２５ｎ＋ｇ移植あ、ることを示唆 している０表４は、精製の各過程における骨形成タンパク質の収量、総圧活性、 および精製倍率を示している。約５００ｎのヘパリン−セファ０一スＩ画分、１ ３０−１５０〃ｇのＨＡ−ウシトロゲル画分、１０−１２ｇのゲル濾過画分、４ −５　ｐｇのヘパリン−セファロースＴＩ画分、０．４−０．５ｕｇのＣ−１８ 高度精製画分、および、２２０−２５ｎのゲル溶出された実質的な精製画分が２ ５ｆｆ１ｇの移植光たりの、２分の１最大値活性を示す明確な骨形成に必要とさ れる。以上のように、ｍｇ移植当たり０．８−１．Ｏｎｇの精製骨形成タンパク 質がｉｎ　ｖｉｖｏで２分の１最大値骨分化活性を示すのに必要である。

表４　胆醗１盟 ゲル濾過　２０＄　１，６００　８（１００６１５Ｃ−１８）ＩＰＬＣＯ，０７ ０ａ　１５０　２，０４３．００　１５．７１５ゲル溶出　０．００４ｉｉ　１ ９１　４７，７５０．００　３６７．３０７値は４ｋｇのウシ骨基質（８００ｇ の！物質除去した基質）から計算している。

傘１ユニットの骨形成活性は、ラットへの移植１２日口のカルシウム含量によっ て決定される、ラット鉱物質除去費基質に比較した場合の２分の１最大値骨分化 活性を表している。

＃タンパク質は２８０ｒ＋＋ｓでの吸光度によって測定された。

ａタンパク質は既知の標準タンパク質、ウシ血清アルブミンと比較するゲルスキ ャニング法によって測定された。

本本ウシ骨のエタノール沈澱したグアニジン抽出は、おそらく内在性の阻害因子 の存在のため、ラットの中では弱い誘導因子である。この沈澱をゲル濾過にかけ 、５０ｋＤ以下のタンパク質を分離し、バイオアッセイに用いた。

Ｃ０ＢＯＰの化学的解析 Ｃ１，立子ｌ上１遣 最後の精製過程後のタンパク質を非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳 動を行うことにより、クマジーブルー染色（第３Ａ図）およびオートラジオグラ フィーの双方で検出されたように約３０ｋＤの位置に拡散したバンドが見られた 。

ＢＯＰの解析をさらに広げるために、該タンパク質を還元条件下で調べた。還元 により、３０ｋＤ　ＲＯＰはクマジーブルーで染色される二つの種：　１６ｋＤ 種および１８ｋＤ種を産生ずる。還元により、生物学的活性は失われる。二つの 還元されたＢＯＰ種を解析して構造的に関連があるかどうかを決定した。二つの 種のアミノ酸構造およびペプチドマツピングの比較（以下に示す）では、殆ど差 異が認められず、天然のタンパク質は顕著な相同性を有する二つの鎖からなって いることが示唆された。

Ｃ２，炭水化隻坐立立 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロース紙への転移の後、Ｃ０Ｎ−Ａブロッテ ィングによって炭水化物の存在を調べた。結果から、３０ｋＤタンパク質はＣｏ ｎ−Ａによって対して高い親和性を持っており、タンパク質がグタコシル化され ていることが示唆された（第４Ａ図）。さらに、Ｃｏｎ−Ａプロットの結果から 、ゲルの３０ｋＤ領域中にサブ構造がある証拠が示され、グリコジル化の程度が 多様であるための不均質性が示された。還元後（第４Ｂ図）　、Ｃａｎ−Ａプロ ットにより二つの主要な構成物質が１６ｋＤと１８ｋＤにある証拠が示された。

さらに、還元後は３０ｋＤＧＷ域にはグリコジル化されている物質はなかった。

炭水化物の存在を確実にし、結合している炭水化物の量を見積もるために、３０ ｋＤタンパク質をＮ−グリカナーゼ、広い特異性を持つ脱グリコジル化酵素で処 理した　Ｉ　ｔ　Ｓ　１　標識した３０ｋＤタンパク質を該酵素と共にＳＯ３の 存在下で３７°Ｃで２４時間インキユベートシた。５ＤＳ−ＰＡＧＥから観察さ れたように、処理した試料はは＜　２７ｋＤの位置に主要な種として見られる（ 第５Ａ図）、還元により、２７ｋＤ種は分子量が約１４ｋＤ−１６ｋＤである種 に還元される（第５Ｂ図）。

３０ｋＤタンパク質の完全な脱グリコジル化を確実にするために、フッ化水素（ ）ＩＦ）を用いた炭水化物の化学的切断法を行った。Ｃ−１８クロマトグラフイ ー過程からプールした活性のある骨形成２ンパク質をｐ、ｏ、上で真空下で乾燥 させ、新しく蒸留した無水）ＩＦ５０ｐ１を−７０“Ｃで加える。チューブの蓋 を堅く閉めた後、混合液をアイスバス中でときどき攪拌しながら１時間０°Ｃに おいた。

乾燥した窒素ガスを連続的に吹き付けて、）ＩＦを蒸発させる。チューブをアイ スパスから取り出し、残滓をＰｔＯｓとＫＯＨペレット上で真空下で乾燥させる 。

乾燥した後、試料を１００〃のＳＯＷアセトニトリル１０．１Ｚ　ＴＦＡに溶解 し、ＳＤＳゲル分析、Ｃａｎ　Ａ結合および生物学的アッセイのために分注する 。分取した試料は、乾燥させ、ＳＯＳゲル分析およびＣｏｎ　Ａブロッティング のための調製では、ＳＯＳゲルサンプルパンファーに溶解するか、生物学的アッ セイのためには、４ｈグアニジン−ＨＣｌ、　５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ 、　ｐＨ７−０に溶解する。

この結果は、）ＩＰ処理により試料から完全に糖鎖が除去されることを示してい る二ＳＤＳゲル電気泳動を行いイモピロン膜に転写した後Ｃａｎ　Ａプロッティ ングを行なうと、この処理をした試料にはＣｏｎ　Ａが結合しないが、一方、未 処理の対照は、３０ｋＤの位置で強く陽性を示す。処理した試料のクマシーゲル は、未処理の対照に存在する３０ｋＤのバンドの代わりに２７ｋＤのバンドが存 在することを示している。

Ｃ３，′・な゛びに−・ ＣＮＢｒによる切断反応物は、炭水化物と結合した断片を検出するためにＣｏｎ 　Ａの結合を用いて分析する。切断反応は、ＣＮＢｒ存在、非存在下でトリフル オシ酢酸（ＴＦＡ）を用いて行なう。反応は、３７℃で１８時間行い、試料は真 空乾燥する。この試料を水で洗い、還元試薬を含むＳＤＳゲルサンプルバッファ ーに溶解し、煮て、これをＳＤＳゲルにアプライする。電気泳動後、タンパクを イモピロン膜に転写し、Ｃｏｎ　Ａの結合によって視覚化する。

低濃度の酸（１χ）の中では、ＣＮＢｒは１６ｋＤと１８ｋＤの分子種の大半を １つの産物、つまり約１４ｋＤの分子種に分解してしまう。１０２７ＦＡを用い た反応では、１４ｋＤの分子種は、ＣＮＢｒ存在下、非存在下の両者において観 察される。

これらの実験において、３０ｋＤタンパク質の分解産物を検定するために、４種 のタンパク質分解酵素：１）シー８プロテアーゼ；２）エンドＬｙｓ　Ｃプロテ アーゼ：３）ペプシン：および４）トリプシンが用いられる。ペプシンを除いて 、酵素のための分解バッファーは０．１Ｍ　炭酸アンモニウム、ｐｏｓ、ｓであ る。ペプシンの反応は、０．１ｘＴＦＡ中で行なう。分解容量は１００μ！で、 酵素と基質の比は、１：１０である。１２５Ｉ−標識３０ｋＤ骨形成タンパク質 を検出のために添加する。３７°Ｃで１６時間インキュベートした後、分解混合 液を乾燥し、５ＯＳ−ＰＡＧＥを行なうためにジチオスレイトールを含むゲルサ ンプルバッファーに懸濁する。第６図は、分解産物のＳＤＳゲルのオートラジオ グラフを示している。この結果は、これらの条件では、トリプシンによる切断の みが１６ＫＤ／１８ｋＤの分子種を完全に分解し、１２ｋＤ周辺に主な分子種を 生ずることを示している。ペプシンによる分解により、より明確な、低分子量の 分子種が得られる。しかし、１６ｋＤ／１８ｋＤＳ断片は、完全には切断されな かった。シー８による切断は、１つの優性な分子種を１６ｋＤに持つ限定分解を 示す。

Ｃ４，ンバク　の　万１ アミノ酸配列データを得るために、タンパク質をトリプシンあるいはエンドプロ ティナーゼＡｓｐ−Ｎ　（ＥｎｄｏＡｓｐ−Ｎ）で切断する。

還元した３０ｋＤのタンパク質およびカルボキシメチル化したタンパク質（約１ ０μｇ）のトリプシンによる分解物は、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配により、１ ５０μｌ／分の流速で、Ｃ−８ナロウボアカラム（１３ｃｍＸ２．１ｍｓ＋　Ｉ Ｄ）を用いた逆相）ＩＰＬＣによって分画した。勾配は、（Ａ）　０．０６Ｘ　 ＴＦＡ水溶液ならびに（Ｂ）水およびアセトニトリル（１工４□工、）に溶解し た０、０４χＴＦＡを用いた。方法は、１０χＢを５分間、それに続＝ｓｏｘＢ までの直線勾配を７０分間、次に１００２Ｂまでの直線勾配を１０分間である。

ＨＰＬＣプロフィール（第７Ａ図）中のピークから決定される断片を含む両分は 、配列分析を行なうのに足るだけの単一の成分を単離するために、同じ条件で少 なくとも１回は再クロマトグラフィーを行なう。

同様に切断された１６ｋＤおよび１８ｋＤサブユニツトのＨＰＬＣプロフィール は、第７Ｂ図と第７Ｃ図にそれぞれ示されている。これらのペプチドマツプが似 ているということは、このサブユニットが同一であるかまたはぎ接に関連してい ることを示唆している。

１６ｋＤおよび１８ｋＤのサブユニットは、ｇｌｄｏＡ−ｓｐ−Ｎプロテイナー ゼによって切断される。このタンパク質を、５０ａ＋Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝 液、ｐＨ７，８中で、０　、５　ｐｇのＥｎｄｏＡｓｐ−Ｎにより３６°Ｃｌ２ Ｏ時間処理する。分画の条件は３０ｋＤ、　１６ｋＤおよび１８ｋＤ分解物につ いて既に述べた条件と同じである。このプロフィールは第１６Ａ図および第１６ Ｂ図に示されている。

前述の方法を用いて作られた種々のペプチド断片は、自動アミノ酸配列分析機（ １２ＯＡオンラインＰＴＨ分析機を付属したアプライド・バイオシステム４７０ Ａ）で分析された。以下の配列データが得られた： （１）　５−Ｆ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−３−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ω−Ｆ−Ｐ−Ｍ−Ｐ− に；（２）　５−Ｌ４−Ｐ−５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｔ４−Ｑ−５−１−Ｖ。

（３）　Ａ−Ｃ−Ｃ−シーＰ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−３−Ａ−４−５−トＬ−Ｙ−Ｌ−Ｄ −Ｅ−Ｎ−Ｅ−に；（４）　Ｍ−３−Ｓ−Ｌ−５４−Ｌ−Ｆ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｎ− Ｋ。

（５）　Ｓ−［１−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ω−Ｒ；（６）　Ｆ−Ｌ−Ｈ−Ｃ −Ｑ−Ｆ−Ｓ−Ｅ−Ｒ−Ｎ−３；（７）　Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｇｌ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−Ｑ− ３−３−Ｅ−Ｐ−Ｎ−１−Ｙ。

（８）　Ｌ−Ｙ−Ｄ−Ｐ−Ｍ−Ｖ−Ｖ。

（９）　Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｉ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ｖ−Ｐ−Ｅ；（１ ０）　Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｄ−１−Ｇ。

（１１）　Ｖ−Ｐ−に−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｔ；（１２）　ｒ−Ｎ４−Ａ−Ｎ −Ｙ−Ｌ；（１３）　Ｄ−Ｎ４−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−１−Ａ４−Ｎ。

（１４）　Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ４−に−Ａ−Ｒ−Ｒ−に−Ｑ−讐−１−？−Ｐ。

（１５）　Ｄ−Ｔ−Ｇ−？−５−Ｅ−Ｗ−Ｉ−１−？−Ｐ。

（１６）　Ｓ−１−Ｖ−Ｒ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−１−Ｐ−Ｅ−Ｐ−７−？ −Ｖ。

（１７）　Ｄ−？−Ｉ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−）１−Ａ−Ｆ−Ｙ：（１Ｂ） 　Ｄ−Ｅ−Ｎ−に−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−に−Ｖ−Ｙ−Ｐ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｖ−Ｅ；（ １９）　５−Ｑ−ＴｍＬ−Ω−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ４−？−Ａ−Ｒ−？−に −１１１；（２０）　Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ４４−Ａ−Ｒ−Ｒ−に−ローＷ４−Ｅ −Ｐ−！？−Ｎ−？−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｙ−Ｌ。

（２１）　Ａ−Ｒ−Ｒ−に−［］−］Ｗ−Ｔ−Ｅ−Ｐ−Ｒ−Ｎ−？−Ａ？−Ｒ− Ｙ−？−？−Ｖ−Ｄ、　、ｉヨヒ（２２）　Ｒ−？−Ｑ−Ｗ−１−Ｅ−Ｐ−？− Ｎ−？−Ａ−？−？−Ｙ−Ｌ−に一シーＤ−？−Ａ−？−？−ＧＣ５，ヱユｌ」 辷た捉 酸化型（３０ｋＤ）および還元型（１６ｋＤト１８ｋＤ）　ＢＯＰ（ＤＫｆ４Ｌ ；！ケル電気泳動し、加水分解および試料を誘導化するための従来の、市販され ている試薬を用いたアミノ酸分析、ならびムこＰｉｃｏ　Ｔａｇ（ミリボア社） システムを用いたＨＰＬＣを行なうためにイモピロンに転写した。いくつかのア ミノ酸、特にシスティンおよびイソロイシンの残基数にいくらが変動があるもの の、再現性がみられる。

得られた組成データは第５表に示されている。

牢この結果は、ヒスチジンが低濃度で存在するため取り入れられていない。

＊＊　システィンは、標準タンパク質の過ギ酸加水分解から通常得られる割合に よって補正した。

１６ｋＤおよ１８ｋＤサブユニツトから得られた結果は、これらを合わせると無 傷の３０ｋＤタンパク譬から得られた数に良く似ている。

グリシンおよびセリンに対して得られた高い数値は、ゲルから溶出した結果によ くあっている。

１−表 一四凡てＡノＪｌｌｋ−近 セリン　２４　１６　２３ グリシン　２９　１８　２６ スレオニン　１１６７ アラニン　１８　１１　１２ システイン　１６　１４　１２ イソロイシン　１５　１４　１０ トリプトフアン　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ Ｄ、　ヒト骨形成タンパク質の精製 ヒト骨は、ボーン・バンク、（マサチューセッツ・ゼネラル・ホスピタル、ボス トン、マサチューセッツ州）から入手し、上で開示された方法により５ＩＩＩ粉 化、脂肪、骨髄の除去および脱塩を行なった。３２０ｇの含塩前基質から７０か ら８０ｇの脱塩された骨基質が得られる。基質からの拡散による抽出とエタノー ル沈澱により、１２．５　ｇのグアニジン＝ＨＣ１抽出物が得られる。

エタノール沈澱物の３分の１　（０，５ｇ）が、ＡＰＩグアニジン−ＨＣｌ中で のゲルｆ過に用いられる。（第１０Ａ図）、１回のｆ過当り、約７０−８０ｇの エリノール沈澱物を用いる。ｉｎ　ｖｉｖｏ骨誘導活性は３０ｋＤの領域にある タンパク質を含む画分に局在する。これを保存し、６Ｍ尿素、　０．５Ｍ　Ｎａ Ｃ１緩衝液で平衡化し、直接ＨＡＰカラムにかける；　これに結合したタンパク 質は、１００ｍＭおよび５００１１Ｍのリン酸を含む同緩衝液を用いて段階的に 溶出する（第１０８図）。

ｎＡｐ結合、非結合画分をバイオアッセイしたところ、１００ｍＭリン酸で溶出 された両分のみがｉｎ　亘皿での骨誘導活性を臂することが示された。ＨＡＰク ロマトグラフィーで得られた生物学的に活性な両分は、低濃度の塩を含む緩衝液 を用いたヘパリン−セファ０−ス・アフィニティー・クロマトグラフィーにかけ る：結合したタンパク質は０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出する（第１０Ｃ図）。ヘパ リンセファロース画分をアッセイしたところ、０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出された 両分が骨−誘導活性を有することが示された０次に、この活性画分をＣ−１８逆 相クロマトグラフイーにかけた（第１００図）。

その後、この活性画分は上述したように５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、実質的に純粋 なヒト骨形成タンパク質からなる約３０ｋＤのバンドを与える。

Ｅ、無傷の骨形成タンパク質をコードする遺伝子単離のための生合成されたプロ ーブ Ｅ−１プローブのデザイン 第１３図に示されている合成されたコンセン、サス遺伝子は、ＴＧＦ−β遺伝子 族との相同性から予想されるアミノ酸に基づき、また、ヒトＴＧＦ−βで見つか っているヒトコドン利用における偏りを用いて、ハイブリダイゼーション・プロ ーブとしてデザインされた。そして、このデザインされたコンセンサス配列は、 ＤＮＡ合成機でつくられたオリゴヌクレオチドを集合させることからなる、既存 の技術を用いて構築された。

ＢＯＰから由来し、エドマン分解により配列決定されたトリプシン分解ペプチド は、以下の第６表に示されるように、ショウジョウバよりＰＰタンパク質の（遺 伝子から推定された）配列、アフリカッメガエルのＶＧＩタンパク質と高い相同 性を示し、またインヒビンおよびＴＧＦ−βとやや低い相同性を示すアミノ酸配 列を与えた。

マ　一致したアミノ酸 骨形成タンパク質のアミノ酸配列を決定する際に（これから核酸配列を決定する ことが出来る）、以下の点を考慮した：（１）骨形成タンパク質のトリプシン分 解断片のエドマン分解によって決められたアミノ酸配列は、それが強いシグナル を持ち：この遺伝子族のその他のものと整列させたときに相同性あるいは保存的 ｆ換を示す限りにおいて最も上位に置かれる；（２）配列が４種全てのタンパク 質と一致する場合、これは合成遺伝子配列に用いられる； （３）　ＤＰＰおよびνｇ１で一致するアミノ酸配列を用いる：（４）νｇ１あ るいはＤＰＰが相違しても、いずれか一方がインヒビンあるいはＴＧＦ−βと一 致する場合、この一致したアミノ酸を°選択する； （５）全ての配列が相違する場合は、ＤＰＰの配列を第一に選択するが、その場 合、可能性ともては変異を起こすことによりＶｇｌ配列を作製することも後の計 画に含まれている。

び見かけ上の構造的相同性を保つようにデザインされている。

。。、。という、はじめにデザインされた合成コンセンサス遺伝子配列のひとつ の目的は（第１３図）、天然の遺伝子を単離するプローブとして用いるためのも のだった。このため、このＤＮＡは、ヒトコドン利用の偏りを用いてデザインさ れた。これに代わるものとして、従来の技術を用いて、前述の単離法にしたがっ て産生された骨形成タンパク質の、アミノ酸配列のある部分をコードするような 、一群のヌクレオチド配列からなるプローブが構築されるかも知れない。こうし たプローブの集まりを用いることにより、無傷のタンパク質をコードするＤＮＡ を単離することも可能であろう。

Ｅ−２ゲノム・−イブ石１−か゛の、乏　ンバク　ツー上１五逍倣玉夙檎皇 ラムダ、ファージ（Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ）に組み込まれたヒト−ゲノム・ライブ ラリー（マニアテイスーライブラリー）を、ｃｏｐｏコンセンサス遺伝子をプロ ーブとして用い、検索した。はじめの検索は、５００，０００プラークについて 行なった（それぞれｓｏ、ｏｏｏプラークを１０プレート）。ハイブリダイゼー ションシグナルを与える領域をプレートから抜き出し、ファージ粒子を溶出し、 これを再びプレート当り２０００−３０００プラークの濃度で塗布した。２回目 のハイブリダイゼーションによりプラークを得、これをもう一度、今度は純粋な りローンが単離できるように、プレート当り約１００プラークの濃度で塗布した 。プローブ（ＣＯＰＯ）は、増幅プラスミドからＢａＩＩｅｒ−ＰｓｔＩ切断し て得た３００塩基対の断片であり、これは、ファインバーブ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ）とフオーゲルシュタダム・ブライミング法にしたがって、α３２　ｄＣＴＰを 用し）で標識シタ。プレハイブリダイゼーシヲンは５　Ｘ５ＳＰＥ、　１０ｘデ ンノ＼ルト混合液、０．５ｚＳＤＳ中で５０°Ｃ１１時間行なった。ハイブリダ イゼーションは上と同じ溶液にプローブを加えて一夜行なった。

ニトロセルロース膜の洗いは、］、　Ｘ５ＳｐＦ、、　０．１ｘＳＤＳ中、低温 で５分を１回行い、次に同溶液中で５０’Ｃ２２×３０分間を２回行なった。こ の方法を用いて、２４個の陽性クローンカく見し）だされた。

これまでに全く報告のない遺伝子を含む２つはＯＰＩ、すなわち以下に述べる骨 形成タンパク質−１と称された。そのＩｚ力１０２つ。

はＢＭＰ−２ｂに当たる遺伝子を、１つはＢＭＰ−３Ｄこ当たるものを与えた（ 米国特許明細書　第ＰＣＴ　ＬＩＳ　８７１０１５３７号参照）。

ラムダ＃１３ＤＮＡのサザン・プロット分析により、約３ｋｂのＢａｍＨＩ断片 がプローブにハイブリダイゼーションすること力ζ示された（第１Ｂ図参照）。

この断片は、分離され、ブル−スクリプト・ベクター（のＢａｌ１）ＩＩ　サイ ト）にサブクローニング゛された。このクローンは、サザンプロットおよびｃｏ ｐｏプローブへのノ１イフ゛１ノダイゼーションによってさらに分析された。二 氾こより、（約）ｌｋｂのＥｃｏＲ］断片がこのプローブに強くハイブリダイゼ ーションすることが示された。この断片は、ブルースクリプト・ベクターのＥｃ ｏＲ１サイトにサブクローニングされ、配列が決定さｎた。

この配列の分析により、この断片があるタンノイク質、すなわち骨形成タンパク 質−１（ＯＰＩ）のカルボキシル末端をコードする事が示された。このタンパク 質は、ＴＧＦ−β族とのアミノ酸の相同性によって同定された。この比較のため に、システインノくターンが用いられ、次に隣接アミノ酸が比較された。コンセ ンサス・スプライスシグナルはアミノ酸の相同性が終わったところに見つかり、 エクソンイントロン境界と名付けられた。３つのエクソンが組み合わされて、７ 個のシスティンを含む機能を有するＴＧＦ−β一様トドメイン与えている。２つ のイントロン番よ、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の−末鎖変異法を用いることによ り、エク゛ノンをまたいで、プライマーを介してループ・アウトすることにより 除去された。また、最初のシスティンの上流に、酸切断のためのＥｃｏＲＩサイ トとＡｓｐ−Ｐｒｏ連結部位を導入し、３′末端に器よ、同じ方法でＰｓｔＩサ イトが加えられた。より進んだ配列に関する情報（後ろから２番目のエクソン） は、挿入断片の全長のム己ダ１を決定することによって得られた。塩基配列決定 しよ、−揃えの片方向からの欠失クローンを作製して行なった（オズカイナノク （Ｏｚｋａｙｎａｋ）、　Ｅ、＋　ブトニイ（Ｐｕｔｎｅｙ）、Ｓ、　（１９８ ７）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

ｉニア７Ｏ−７７３）　−この得られた配列は、ＯＰＩのＴＧＦ−β様領域の約 ８０２を含んでおり、第１Ａ図に示されている。ＴＧＦ−β様領域の完全な配列 は、はじめに、ラムダクローン＃１３　ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断Ｃ：切断性ずる 断片をサブクローニングし、以前に明かとされてし）た配列と同様にして、丁Ｇ Ｆ−β捧領域のはじめの部分（後ろ力１ら数えて３番目のエクソン）を含む４ｋ Ｂの断片を配列決定することにより得られた。ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片上の遺 伝子は、酸切断部位を持つ修飾型ｔｒｐ　ＬＥ融合タンパク質を産生ずるために 、ｔｒｐプロモーター−オペレーターによって調節される大腸菌の発現ベクター に挿入された。ＯＰＩ遺伝子は、天然材料の配列中ムこ見し）だされるペプチド に実質的に一致するアミノ酸をコードしてし）る。その活性領域と信じられる部 分の配列は、以下に示されている。

更に長い活性を有する配列しま： コンセンサスプローブを用し１て検索されてきた、その他の３種の無傷の遺伝子 がコードする、活性領域と信じられる部分のＥ−３ｃＤＮＡ−イブ−１−の′ 無傷のタンパク質をコードするＤＮＡの単離が可能なプローブ群を利用するもう １つの例は、以下に示されている。タンパク質を発現することが知られている細 胞（例えば、骨芽細胞あるいは骨肉腫〕は、全細胞質ＲＮＡを単離するために抽 出された。

ｍＲＮＡを単離するために、オリゴ−ｄＴカラムを用いることが出来る。このｍ ＲＮＡは例えばゲル電気泳動によってサイズ分画する０とが出来る。目的のゆＲ ＮＡを含む両分は、適当な宿主細胞中で一時的に発現を誘導し、例えばイムノア ッセイにおいては、骨形成タンパク質のトリプシン分解断片由来のペプチドζ二 対する抗体を用いて、骨形成タンパク質の存在を検定することによって決定でき るだろう。次に、ｍＲＮＡ画分は、逆転写酵素を用いて、単鎖ｃＤＮＡへと逆転 写される；そして、もう一方の相補的ＤＮＡ鎖は、ｃＤＮＡを鋳型として合成す ることが出来る。その後、２本鎖ＤＮＡは、細菌を形質転換してｃＤＮＡライブ ラリーを生産するために用いるベクターにライゲージテンされる。

骨形成タンパク質の既知のアミノ酸配列に対するコドンに相補的な、放射性標識 をしたコンセンサス配列、その一部、あるいは合成デオキシオリゴヌクレオチド は、標準的なりＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いて、ｃＤＮＡライ ブラリーのどのＤＮＡが全長の骨形成タンパク質をコードしているかを固定する ために用いられるだろう。

このｃＤＮＡは、次に、発現ベクターに組み込まれ、タンパク質発現のために適 当な宿主細胞に導入されるだろう。原核細胞が骨形成タンパク質に糖鎖を修飾す ることが出来ないことムこより、このタンパク質の酵素活性が影響を受けないた め、宿主は、原核細胞でも真核細胞でも可能である。有用な宿主細胞には、サツ カロミセス、大腸菌、および種々の哺乳動物培養細胞が含まれる。ベクターは、 そのうえにタンパク質の分泌のための種々のシグナル配列をコードしたり、また 、骨形成タンパク質を融合タンパク質としてコードする事もできる。翻訳後、タ ンパク質は細胞から精製あるいは培養液から回収することが出来る。

Ｒ４，１伝三Ω璽製 上述のようにして回収された天然の遺伝子の配列およびｃＤＮＡは、発現に用い ることができる。上述の遺伝子は、また、化学的に合成されたオリゴヌクレオチ ドを集合させることにより生産され得る。１５−１００翔ｅｒのオリゴヌクレオ チドは、バイオサーチＤＮＡモデル８６００合成機で合成され、トリス−はう酸 −ＥＤＴＡｉ衝ｆｉ　（ＴＯＥ）中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ ＧＥ）により精製できる。つぎに、このＤＮＡは、ゲルから電気溶出する。

重複するオリゴマーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、ＰＡ ＧＥにより精製可能なより大きな断片にライゲーションされることが出来る。

Ｒ５−Ｒ１ この遺伝子は、大腸菌の種々の株といった適当な原核細胞宿主あるいは、枯草菌 、酵母、およびＣ）１０−９）骨髄種などの様々な動物細胞において発現可能で ある。一般に、発現は多くの細胞型および当業者によく知られた発現系を用いて 行なわれる。例えば、この遺伝子が大腸菌中で発現される場合、ｐＢＲ３２２に 基づき、合成のｔｒｐプロモーター−オペレーター、および修飾型ｔｒｐＬＥリ ーダーを含む発現ベクターを用いることができる。このベクターは、ＥｃｏＲＩ およびＰｓｔｌ制限酵素切断部位で開裂する事ができ、また、例えばＯＰ遺伝子 断片をこの２つの部位の間に挿入することが出来る。この〇Ｐタンパク質は、Ａ ｓｐ−Ｐｒｏという配列を持つヒンジ部位を介してリーダータンパク質に連結さ れる。

このヒンジにより、融合タンパク質をＡｓｐ−Ｐｒｏ部位で希酸により化学的に 開裂する事が可能となる。

Ｒ６，ラ　ンバク　の 以下の方法は、活性型の組換え体タンパク質を生産するために用いられるだろう 。融合タンパク質を含む大腸菌細胞を溶菌する。融合タンパク質は、分画溶解法 によって精製される。切断は希酸によって行い、その結果性じた切断産物は、切 断されたタンパク質を分離するために、セファクリル−２００ＨＲあるいはＳＰ トリスアシルカラムに通す、還元された０２画分を次にセミ−ブレツブＣ−１８ カラムを用いて）ＩＰＬＣにかける。

ＯＰに再び折りたたみ構造をとらせる条件は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩおよ び６Ｍ　Ｇｕ−）１ｃＩを用いた、ｐＨ８，０におけるものである。試料せた。

これらの方法は、前述したアミノ酸配列（長い方の分子種）を持つＯＰＩと呼ば れる活性型タンパク質を大腸菌中で発現するために用いられてきた。

もし、タンパク質が動物細胞中で発現される場合、再折りたたみ化は必要とされ ないだろう。

マトリックスの調製 Ａ、マド丁・・クスの　′に　るー　・な１、後にパイオア・７セイの節でのべ られるキャリアーは、生物学的に分解可能な合成のマトリックスあるいは、合成 した無機のマトリックス（例えば、Ｉ（ＡＰ、コラーゲン、リン酸三カルシウム あるいはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびに種々の共重合物）いずれかに置 き換えることができる。もし、以下に述べられるように前処理を行なえば、異種 移植骨も用いることができる。

表面の電荷、粒子サイズ、無機塩の存在およびマトリックスと骨形成タンパク質 を組み合わせるための方法論など全てが、骨誘導をうまく行なうために、ある役 割を果たしていることが、研究により示されている。化学的修飾により電荷を乱 してやると、誘導応答が失われる。粒子のサイズは、新しい骨の定量的応答に影 響を与える；７５から４２０−の間の粒子は、最大の応答を引き出す。マトリッ クスが骨の無機塩で汚染されると、骨形成が阻害されるだろう。最も大事なこと は、マトリックス上に骨形成タンパク質を配列するために用いられる方法が、骨 形成タンパク質およびマトリックス両者の物理的、化学的状態に極めて怒受性で あることである。

骨マトリックス１０Ｐ移植の接触面における逐次的な細胞反応は複雑である。多 段階カスケードは、以下のものを含む：移植されたマトリックスへのフープリン およびフィブロネクチンの結合、細胞の化学走性、繊維芽細胞の増殖、軟骨芽細 胞への分化、軟骨形成、血管の侵゛入、骨形成、再逼成および骨髄の分化。

骨形成タンパク質に対しうまく作用するキャリアーは、いくつかのｘｙな機能を 果たさなければならない。キャリアーは、骨形成タンパク質に結合し、スロー・ リリース・デリバリ−・システム（ｓｌｏｗ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｄｅｌｉｖｅｒ ｙ　５ｙｓｔｅｙａ）として働き、骨ノ発達途上での各段階の細胞応答を調節し 、骨形成タンパク質を非特異的分解から保護しなくてはならない。それに加え、 選択された材料は、ｉｌ　ｖｉヨで生物学的に適合可能でがっ生物学的に分解さ れることができなければならない：キャリアーは、新しい骨によって完全に置換 されるまで、一時的な骨格として機能しなければならない。生物学的な適合性は 、マトリックスが移植された際に顕著な炎症を誘起せず、宿主動物に拒絶されな いことがめられる。生物学的に分解されるためには、マトリックスが新しい骨ま たは軟骨の発達途上で、宿主の体によって糧やかに吸収されることが必要である 。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）および種々の組合せは、ｎ 　■些で様ルな溶解速度を有している。骨の場合、溶解速度は移植が、皮膚骨あ るいは結締組織繊維骨で行なわれたかに大きく依存している。

マトリックスの結合構造、粒子のサイズ、表面電荷の存在、細胞の侵入を許すの に充分なサイズの粒子間の孔および隙間の存在などは、全て有効なマトリックス として機能するために重要でする。マトリックスを新たｔ骨に望まれる形に整形 し、癒合不能を補う容積を持つことが好ましい。ラットにおける研究により、新 しい骨は、本質的には移植された装置の容積を有したまま形成されることが示さ れている。

マトリックスは、ゆるく付着する微粒子状の材料、例えばコラーゲンから作られ た、形状の維持する固体からなるだろう。

マトリックスはまた、鋳造された多孔性の固体、あるいは単に、周囲の組織によ って適切に保持された密に詰められた粒子の凝固物から成るかもしれない。粉砕 した筋肉あるいはその他の組織も用いられるだろう。大きな同種骨の移植は、そ の骨髄腔が浄化され、粒子が充填され、骨形成タンパク質を散布しておけば、マ トリックスの担体として働き得る。

Ｂ、Ｖ′・に２　の　ヨ　マトト・　スのｉ′１無機塩を除いた骨マトリックス は、ここで述べるように４２μのｆ過膜を通る骨粒子を生産するために、ラット 大腿骨あるいは頭骨の脱水した骨幹から調製された。この骨粒子を４Ｍのグアニ ジン−ＭＣＩを用いた分離抽出にかける。こうした処理により、骨マトリックス が軟骨分化を誘導するもともとの能力が完全に失われる。残った不溶性の物質が マトリックスを作り上げるために用いられる。この物質は、はとんどがコラーゲ ンそのものであり、移植した際に、軟骨および骨を誘導することはない。

全ての新しい標品は、使用前にその無機塩の含量と偽陽性について検定される。

骨マトリックスの生物活性の全体的損失は、活性のある前形成タンパク質両分あ るいは純粋なタンパク質を生物学的に不活性な不溶性のコラーゲンマトリックス とともに再構成した際に回復する。骨形成タンパク質はいかなるを推動物、例え ば、ウシ、ブタ、サルあるいはヒトから得ることができ、またあるいは、組換え 体ＤＮＡ技術を用いて生産することも上製 骨形成タンパク質が他の種由来のコラーゲン性骨マトックスと再構成され、ラッ トに移植されると、骨は全く形成されない。

このことは、骨形成タンパク質が異種性である（種特異的でない）が、一方マト リックスは種特異的であり、おそらく本来の免疫原あるいは阻害成分のために、 種間の移植はできないことを示唆している。したがって、これまで、骨に起因す るマトリックスに対しては、骨形成タンパク質がその骨誘導活性を完全に発揮す るために種特異的なコラーゲン性骨マトリックスが必要とされた。

全ての骨マトリックスの主成分は、Ｉ型コラーゲンである。

コラーゲンに加え、抽出された骨は、その容積の５χをしめる非コラーゲンタン パク質を含んでいる。骨マトリックスの多くの非コラーゲン成分は塘タンパク質 である。骨形成における糖タンパク質の生物学的な特徴は知られていないが、そ の炭水化物含量のためムこぞれ自身が強力な抗原性を示し、異ｌマトリックス中 に存在する免疫原あるいは阻害成分を構成するだろう。

現在、もしはじめにマトリックスから免疫原および阻害成分を除いてやれば、コ ラーゲン性骨マトリックスは、異種移植において骨誘導活性に効果を及ぼすため のキャリアーとして用い得ることが見つかっている。このマトリックスは、この 目的を果たすために、例えばフン化水素を用いて化学的に糖鎖を除いである。

上述のようにして調製されたウシ骨の残さを１過し、７４−４２０廊の粒子を回 収する。この試料をＰ２Ｏ，にのゼ真空中で乾燥しご反応容器に移し、次に無水 フッ化水素（）ＩＦ）　（マトリックス１ｇ当り１Ｏ−２０ｄ）を−７０℃でこ の試料上ムこしたたらせる。反応容器の温度を０℃まで１昇させ、反応混合液を この温度で１２０分間撹拌する。真空でｌ（Ｆを蒸発させた後、残留した酸を除 くために、残さをＫＯＨのベレット上において真空で完全に乾燥させる。

どの程度糖鎖が除けたかは、共有結合していない炭水化物を除去するためムこ、 試料を適当に洗った後、）ＩＰ処理の前と後で分取したマトリックス試料の炭水 化物を分析することから決定できる。

次に、糖鎖を除去した骨マトリックスについて、以下に示した処理を行なう。

１　）　Ｉｇ／２００ｍとなるようにＴＢＳ　（Ｔｒｉｓ＠衝生理食塩水）中に 懸濁し、４°Ｃで２時間攪拌する、あるいは６ｉ尿素、５０ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　５００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，０（ＵＴＢＳ）に懸濁し、室温で３ ０分間攪拌する； ２）遠心し、段階１）と同欅に、ＴＢＳあるいはＵＴＢＳで洗う：そして、 ３）遠心；上清を棄却；残さを水で洗い；凍結乾燥する。

骨形成装置の組み立て 前に示したマトリックスと上述の骨形成タンパク質のいずれかを用いた骨形成装 置の組み立ては、以下のように行なうこと本方法において、マトリックス、グア ニジン−ＨＣｌ中の骨形成タンパク質に添加された；試料は低温でポルテックス にかけイ冷エタノールをこの混合液に加え、これを攪拌してインキュベートした 。遠心後（高速遠心）、上清を棄却した。再構成されたマトリックスは、水を加 えた冷した濃エタノールで洗い、凍結乾燥した。

Ｂ、　アセトニドアル・トｉフルオロ　−゛本法おいて、アセトニトリル・トリ フルオロ酢ｍ　（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液中の骨形成タンパク質は、キャリアーに 添加された。試料は、数回激しくポルテックスにかげ、凍結乾燥した。

Ｃ−求索遠拮乾員 尿素緩衝液で調製されたこれらのタンパク質については、タンパク質をマトリッ クスと混合し、数回ボルテックスし、次に凍結乾燥した。この凍結乾燥した材料 は、移植に「そのままで」用いることができる。

ＴＮ　ＶＴＶＯラット・バイオアッセイ実質的に純粋なりＯＰ　、前出の性質を 有するタンパク質を含むＢＯＰの豊富な抽出物および、組換え体タンパク質のい くつかは、骨形成装置を生産するためにマトリックスに取り込まれ、ラット内で 軟骨についてアッセイされた。ラットにおける研究は、骨形成効果は、骨形成装 置中に散布された骨形成タンパク質の投与量に依存していることを示している。

マトリックスのみが移植されると、活性は全く観察されない。以下は、ここで開 示される骨形成装置が本発明の単離法に用いられたとき、骨形成タンパク質の活 性画分を決定するためにアッセイする方法、またタンパク質の構成および、生物 学的活性についてマトリック。

スを評価する方法について指針を示している。

Ａ、　反］」支埴 サンバス（Ｓａｍｐａ　ｔｈ）　とレディ（Ｒａｄｄｉ）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　（１９８３）　８０　：　６５９１−６５９５）によって 述べられている骨誘導のバイオアッセイは、参考文献に加えられているが、軟骨 の分化活性の精製プロトコルを監視するために用いる。このア。

セイは、エーテル麻酔をした同種の受容体ランドの皮下部位に検定試料を移植す ることから成っている。　２８−３２日齢の雄のロング−エバンスラットが用い られた。胸郭環上の皮膚に無菌状態で縦方向の切開（１ｃｍ）を行ない、切開腔 をプラントな切開によって作製した。約２５ｎ＋ｇの検定試料をこの切開腔深く に移植し、切開腔を金属のスキンクリップで閉じた。移植を行なった日を実験日 とした。移植片は１２日百日除去した。異型部位は、同型部位を用いて得られる 結果で予想される不明瞭さなしに骨誘導の研究を可能とする。

Ｂ、■２校並ザエ！泉 ラットにおける移植のモデルは、以下の点を含むマトリックスによって誘導され る軟骨発達段階を通して、調節された進行の様子を示している：（１）第１日日 では、多形核白血球による一次的な侵入が起き；（２）第２、第３百日では、間 葉細胞の移植と増殖が起き；（３）第５、第６百日は、軟骨細胞が出現し；（４ ）第７日日には軟骨組織マトリックス形成が起き；（５）第８日には、カルシウ ムの沈着が起き１（６）第９、ｌＯ日百日は、血管の侵入、骨芽細胞が出現し、 新前が形成され；（７）第１２日がら第１８日では、骨芽細胞と骨の再構成と、 移植されたマトリックスの溶解が起き；（８）第２１日には、小骨において造血 性骨髄の分化が起きる。この結果は、新たな骨の形は、移植したマトリックスの 形に準することを示している。

Ｃ２■檄ヱ立狂血 組織切片および染色は、移植片において骨形成の程度を決めるために好ましいも のである。移植片はボインス（Ｂｏｕｉｎｓ）液で固定し、バラフィルムに包埋 し、６−８１の切片に切る。トルイジン・ブルーあるいはヘモトキシリン／エオ シンを用いた染色により、軟骨の最終的な発達が明確に示される。通常、２０日 経た移植片であれば、移植片が骨誘導活性を示すか否かを決めるには充分である 。

Ｄ、生立ヱカヱニ互二 骨形成のマーカーとしては、アルカリ性ホスファターゼ活性を用いることができ る。この酵素の活性は、移植片をホモジナイズした後、分光学的に決定すること ができる。活性は、江血で、第９−１０日においてピークを示し、その後援やか に減少する。組織学的に全く骨の発達を示さない移植片は、これらのアッセイ条 件下で殆どあるいは全くアルカリ性ホスファターゼ活性を持たない。このアッセ イは定量化ならびに、ラットから移植片を除去した後、非常に速やかに骨形成の 推定値を得るために有用である。もう１つの方法として、骨形成の量は、移植片 のカルシウム含量を測定することによって決めることができる。

商業規模で生産することができる系統化をめて、最も有効な投与量／純度レベル を決定するために、いくつかの程度の踵。

度を持った骨形成タンパク質を含む移植片を用いて試験を行なった。結果は、ア ルカリ性ホスファターゼの比活性、カルシウム含量および組織学的検定によりて 測定する。前述したように、アルカリ性ホスファターゼの比活性は骨形成のはじ めに上昇し、次いで減少する。一方、カルシウム含量は、形成された骨の総量に 直接比例している。骨形成タンパク質による骨形成活性は、「骨形成単位」によ って表わされる。例えば、１骨形成単位は、ラットの無機塩を除いた骨マトリッ クスを対照とし、第１２日の移植片のカルシウム含量によって決定される値と比 較したとき、その最大値の半分の骨形成活性に必要とされるタンパク質量を表わ している。

Ｅ、廠果 投与量曲線は、種々のタンパク質の濃度をアッセイすることにより、精製系の多 段階における江■跋での骨誘導活性について構築されている。第１１図は、アル カリ性ホスファターゼによって決められた場合の、ラットにおける代表的な投与 量曲線を示している。同様な結果は、骨形成単位として表わした場合にも得られ る。約１Ｏ−１２ｎのＴＳＫ−画分、３３−４ｉｔのヘパリン−セファロース− ■画分、０．４−０．５Ｊ！ｇのＣ−１８力ラム精製画分および２２０−２５ｎ のゲルから溶出された高度に精製された３０ｋＤタンパク質が、明確な骨形成（ 最大活性の半分）のために必要とされる。通常、移植片２５−ｇ当り２２０−２ ５ｎの実質的に純粋なタンパク質があれば、軟骨を生産するためには充→である 。したがって、さらに多くの投与量を用いることもあるが、移植片１ｍｇあたり ｌ　−２ｎｇの骨形成タンパク質を用いる°のが妥当な投与量である。（骨形成 タンパク質量ク質性に関するＴＢ５の節を参照のこと。）上に示したようにして 発現されたＯＰＩ　（長い方のもの）は、ｕｉ織学的に活性をアッセイした場合 、移植片の多くのＭ３ＩＸにおいて無数の軟骨細胞が存在すること、ならびに・ 新たなマトリックスを形成している血管上皮を囲んで骨芽細胞が存在することに よって示されるように、軟骨および骨形成を誘導した。

糖鎖を除去した異種コラーゲン性骨マトリックス（例：ウシ）は・骨形成装置を 調製するために同種異型コラーゲン性骨マトリックスの代わりに用いられ、ｎ旦 脛における骨誘導活性について、ラット内でバイオアッセイされている。この結 果は、化学的に糖鎖を除いた異種のコラーゲン性骨マトリフクスが、軟骨形成を よく誘導することを示している（第１９図）。アルカリ性ホスファターゼの比活 性によって示されるように、糖鎖を除去した異種マトリックスは骨を誘導するが 、一方、未処理のウシ・マトリックスは誘導しないことは明かである。

移植片の組織学的評価は、［１を除いたウシ・マトリックスは、ラットの残さマ トリックスと一致した方法で骨を誘導するだけでなく、軟骨の分化に関わる発達 段階を推進することも示唆している。ラットの残さを対照として比較すると、Ｈ Ｆ処理したウシ・マトリックスは、広範囲に再構成した骨を含んでいる。

骨髄成分で既に満たされた小骨は、第１２日までに形成される。

この、支持骨誘導において、糖鎖を除いたウシ・マトリックスによって刺激され るような深部の働きは、再現性があり、また骨形成タンパク質の様々な濃度につ いて投与量依存性がある。

動物に対する効能に関する研究 ウシ骨（ＢＯＰ）由来の、実質的に純粋な骨形成タンパク質や、上述の性質を持 つＢＯＰが多く含まれる骨形成画分、ならびにいくつかの組換え体タンパク質は 、マトリックスに取り込まれ、骨形成装置を産している。これらの装置の骨ｇ１ 能の効果は、ネコおよびウサギ標本で試験され、強力な骨形成誘導物であり、最 終的に無機塩を含んだ骨を形成する事がわがっている。以下は、ここで開示され た骨形成装置が臨床的な装置においてどの様に用いられるかに関する指針を示し ている。

Ａ、ネコ　いｔ°モール この研究の目的は、本発明の骨形成装置を試験するために、大動物への効果を見 るモデルを確立し、大きな骨の欠損の修復を明らかにし、整形外科手術愚者でし ばしば遭遇する骨折の非癒合を模擬実験するためのものである。この研究は、大 哺乳動物モデルを用いることにより、キャリアーを持つ骨形成タンパク質の移植 が、損傷あるいは再構成を行なう手術に続く骨の再生を、促進できるか否かを評 価するためにデザインされている。

この研究デザインの第一段階は、それ以上の介在物なしに、刺激された骨折の非 癒合に着実に進んでいくであろう大腿骨の骨切術による欠損を外科的に準備する ことからなる。創生された骨への骨形成装置の移植の効果は、以下の研究プロト コルによって評価された。

Ａ−１，方法 ｌｂｓ以下の１６匹の成長したネコに対し、側部の外科的アプローチを通して、 右の大腿骨において１ｃｏ＋の骨を片側だけ欠損させた。他の実験では、２ｃｍ の骨欠損が作製された。大腿は、欠損の正確な広がりを維持するために、８−大 のプレートを側面におくことにより、即座にその内部が満たされた。外科的に作 られたネコの大腿骨の欠損部に移植された物質には３つの種類がありニゲループ Ｉ　（ｎ−３）は、４Ｍグアニジン−ＨＣｒ処理した（不活性型の）ネコ脱無機 塩型骨マトリックス粉ＣＧｕ−ＨＣＩ−ＤＢＭ）の移植と同じプレート固定を受 ける対照グループでニゲループ■（ｎ＝３）は、生物学的に活性のあるネコ脱無 機塩型骨マトリックス粉（ＤＢＭ）　（３６０＋ｏｇ）を移植した陽性対照グル ープでありニゲループｍ　（ｎ＝１０）は、Ｇｕ−ＨＣＩ−ＤＢＭキャリアー試 料の各々ニ骨＃Ｕ？７バク質を添加して、グループｌ−１１と同様な方法を行な ったものである。要約すると、グループ■の骨形成タンパク質で処理した動物は 、グループ■の動物と厳密に同じだが、骨形成タンパク質のみをただ１つよけい に加えた物質を移植された。

全ての動物は、術後カゴの中を任意に移動することが許されている。いずれのネ コも骨を標識するために、テトラサイタリンを注射されている（各週２５＋ｍｇ ／ｋｇ　ＳＱずつ４週間）、グループ■の４匹以外、全ての動物は大腿骨の骨切 除後４ケ月後に屠殺された。

Ａ−２，散財主型差足 ｉｎ　ｖｉｖ（＋の放射体型測定は、大腿および骨切除部位の正しい前部−後部 像を一定に生ずるようにデザインされた軟Ｘ線ジグに置かれた、軽く麻酔をかけ た動物の標準化したＸｖＡ像を手術直後、４．８．１２および１６週目にとるこ とにより行なわれる。

全てのＸｖＡ像は、厳密に同じ様式で、また厳密に各々の動物の同じ位置につい てとられている。骨修復は、任意の点におけｉ分析により、無機塩の蓄積量の関 数として計算される。切り出された骨に関する最終標本のラジオグラフィー分析 は、屠殺後、２断面にりいて行なわれる。Ｘ線分析の結果は第１２図に示されて おり、骨損失の修復率として置換されている。要約すると、第１６週では、グル ープ■の大腿骨の６０ｚが平均８６％の骨欠損再生率で癒合している。これとは 対照的に、グループＩのＧｔｌ−ＨＣＩ−ＤＭＢを用いた陰性一対照移植は、第 ４週で全く骨の成育がみられず、第８週および第１２週でも１０％以下で、第１ ６週でも１６ｚ（±１０χ）で、５匹のうち１匹が少量の架橋された骨を示して いるだけであった。グループ■のＤＭＢ陽性一対照移植は、第４週で１８χ（± ３χ）の修復を示し、第８週では３５％、第８週では３５χ、第２０週では５０ χ（±１ｏｚ）、第１６週では７ｏｚ（±１２ｚ）を示し、全ての月における骨 形成タンパク質に対しｐ　（０，０１の統計的差異を示した。３匹のうち１匹（ ３３ｚ）は第１６週で癒合している。

Ａ−３，生生力！ 切り出された検定試料および正常型の大腿骨は、直ちに骨密度計による研究を行 ない、整理食塩水で湿らせた２枚のタオルに包み、２枚の密封したプラスチック ・バッグに入れ、後に研究するまで一２０℃で保存した。骨修復強度および破断 実験は、骨強度、硬度および破断するためのエネルギー吸収および変形を定量化 するためのインストロン（Ｉｎｓｔｒｏｎ）試験機に連結した、特別にデザイン した金属性の４−ポイントの屈折ジグ上で破断させることによって行なった？検 定試料の大腿骨および正常型の大腿骨に間する研究では、骨強度（ロード）はポ ンドで、破断力はジュールで得られる二正常型の大腿骨は９６（±１２χ）ポン ドの強度を示す。骨形成タンパク質−移植を行なった大腿骨は３５（±４）ボン ドだが、骨折部位の表面域（骨欠損修復でみられる「砂時計ｊ型による）に対す る補正を行なうと、この値は正常骨の強度とヨ接に相関した。−次元的な骨標本 のみが２５ポンドの強度検定に使用できたが、この場合も、骨折表面域について 補正をすると正常型骨と密接な相関を示した・Ａ−４，組織体型測定／組織学 生体力学的検定に続いて、骨は、直ちに骨折部位において縮方向に２枚の切片を 切り、重を測定および体積測定を行なった。

半分を蛍光染料の取り込み評価による、標準的なカルシウム沈着骨の組織体型測 定のために固定し、もう半分を脱カルシウム化したヘモトキシリン／エオシン染 料を用いた組織学的調製のために固定した。

Ａ−５，生化学 骨修復部位（ｎ・６）から選ばれた標本を、冷却した０、１５Ｍ　ＮａＣ１゜３ ＋ｎＭ　ＮａＨＣＯ＝、　ｐＨ９，０中で、スペソクス・フリーザー・ミル（Ｓ ｐｅｘｆｒｅｚｅｅｒ　ｍ１ｌｌ）を用いてホモジナイズした。つぎに、上清の アルカリ性ホスファターゼ活性および、沈澱物の酸可溶性画分の全カルシウム含 量を測定した。

Ａ−６９組織病理学 的な検死報告は、何ら異常あるいは病理学的な発見も明らかにしていない。全て の主要な臓器の一部は、今後の研究のために保存されている。組織病理学的評価 は、以下の臓器の試料について行なった：心臓、肺、肝臓、両方の腎臓、すい臓 、両方の。

副腎、リンパ節、（実験で用いた大腿骨の欠損部位に隣接した）左右の大腿骨中 部の大腿四頭筋。異常な病変あるいは病理学的な病変はいずれの組織においても 見られなかった。大腿四頭筋で見られた軽い病変は、欠損部位における外科的操 作に対する治癒反応にあたる。肺浮腫は、安楽死に起因するものである。

なんらかの一般的な全身性の効果あるいは、検定した特定の臓器についてなんら かの影響を与えているという証拠は一切なり）。

Ａ−７，ネコにおける研究の要約 １（ｍおよび２ｃｍの大腿骨を欠損したネコについての研究から、配置された骨 形成タンパク質を含むマトリックスからなる装置が： （１）大動物において体重を支える骨の欠損を修復できる；（２）移植後短時間 で（２週間以内）−貫して骨形成を誘導できる； （３）軟骨の骨化により、体積当り正常骨に等しい強度を持つ骨を誘導できるこ とを示している。

さらに、全ての動物は、実験期間中健康であり、移植された装なかった。この骨 欠損モデルにおいて、対照骨を移植した部位においては殆ど治癒がみられなかっ たかあるいは全く治癒がみられなかった。この結果は、骨形成デバイスを大きな 、非癒合骨欠損の修復にうまく利用することができるという証拠を与えＢ１．方 法と結果 本研究の目的は、対照動物において僅かなあるいは全く骨の成長がなく、その結 果、骨誘導が検定される場合、強カムこ誘導できる物質しか陽性の結果を得るこ とができないというモデルを確立するためである。骨形成デバイスを移植したあ るいは移植しない、１　、５ｃｍの欠損をウサギの尺骨に作製する。

Ｘ線分析により報告されている管端閉鎖を有する、８羽（１０Ｉｂｓ以上）のニ ュージランド白ウサギが研究された。これら８羽の動物（１週および２週で１羽 ずつ層殺された）のうち、１１の尺骨欠損体について８週間の研究全工程を行な った。いずれの場合（ｎ＝７）も、骨膜の切除に続いて移植を受けない動物は、 ８通間の間はＸ線写真上で癒合は形成されない。移植を受けない動物はいずれも 、第４週にみられる周辺の骨から成育してくる骨の薄い「殻」を発達させ、第８ 週までには、僅かながらさらに発達する。全ての場合（ｎ−４）において、第８ 週までには、骨形成タンパク質を移植した動物において顕著な骨誘導をともなう ＸｗＡ写真写真層合が確立されている。移植していない場合の修復とは反対に、 この骨修復は、除去された骨の部位で起きている。

放射体型測定分析により、第８週で層殺した、９０χの骨形成タンパク質移植骨 が修復され、１８２の非移植骨が修復されたことを明らかにしている。検死では 、骨形成タンパク質骨は正常に見えるが、一方「移植していない」骨部位には軟 骨の繊維状組織がみられ、欠損部位における軟骨あるいは骨修復の証拠はない。

Ｂ−２，同種異型移植デバイス もう１つの実験において、１　、５ｃｏ＋の尺骨欠損の骨髄孔は、活性化された 骨形成タンパク質ウサギ骨粉で埋められており、この骨は、挿入の様式をとって 同種異型移植される。２つの対照尺骨は、第８週までは治癒されず、古典的な「 ぞうげ質」が出現する。これとは対照的に、骨形成タンパク質処理した移植片は 第４週までにはＸ線写真上で「消失」し、第６週から第８週までの再度の無機塩 の蓄積が開始する。この同種異型移植片は、第８Ａまでにその各々の末端に弱い 増殖性の骨形成をともなう治癒を受ける。

このタイプのデバイスは、同種異型移植片の修復を促進するために役立つ。

Ｂ−３，要約 これらの、成熟したウサギの尺骨における、１　、５ｃｍの骨膜欠損に関する研 究は： （１）これが、骨の成長の研究に適当なモデルであり盲（２）「移植を受けてい ない」あるいはＧｕ−ＨＣＩ陰性対照である移植片は、少量の骨膜型骨を生ずる が、髄質あるいは皮質骨の生育は起こさす； （３）骨形成タンパク質移植ウサギは対照グループとは非常に異なる様式の増殖 性骨増殖を示し； （４）はじめの研究から、外科的に欠損を作った後わずか８週間で、この骨は正 常骨の５ｏｚの強度を示しく体積比では、正常の１００χ）； （５）骨形成タンパク質−同種異型移植片の研究により、同種異型移植及び骨治 癒両者に顕著な効果を示すことを明らかにした。

本発明は、その性質あるいは基本的な特徴から離れることなく、その他の特異的 な態様をとることができる。したがって、この態様は、全てにおいて前述の説明 によるよりもむしろ、添付の請求の範囲によって示されている本発明の詳細な説 明を行なうものであって、制限を加えるものとして考えられるべきではなく・そ のため、請求の範囲と同等の意味あるいは範囲に含まれる全ての変更は、ここに 包含されることを意図している。

請求の範囲は： ＵＱ　Ｏ←ＵＯト（ＪＣ）　Ｕ　（ ＰＩ　ＰＮ　／　ｆ、＋　ＩＩ　ＰＩｔ　ｒＭ　ｊ　ｌ＋ｌ　／　ｒｌ浄書（内 容に変更なし） ＦＩＧ、　３Ａ　ＦＩＧ、　３８　ＦＩＧ、４Ａ　ＦＩＧ、　４Ｂ浄τ（内容ｊ ：変更なし） ＦＩＧ、６Ａ　ＦＩＧ、６Ｂ　ＦｆＧ、６ＣＦＩＧ、６０　ＦＩＧ、６Ｅ・ ＦＩＧ、１５ 浄書（内容に変更なし） ？９１Ｆ（内容に変更なしン ２名骨形桟□吠犬炭 り介番号 形コ　ｔ＠成　□吸犬ち度 汁二セ！＝：：〕こユなし） 浄Ｃ（内１に″：ニニＣＬ） クンハ０７で一電′（マイクログフムンーΔ−ヘパリンｔ７７ｖ−Ｊｌ　−０− ＨＡ　クル１０デル　”４−７５に−３０００−〇−ヘパリンぞ？ｒｐ−ズ］　 −・−Ｃ−４ＧＡＴＣＣＴＡＡＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＧＴＧＧ入ＣＴＴＣＣＡＧ ＣにＣＧＡＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＣＧ入ＤＰＮＧＬＹＶＤＦＱＲＤＶＧＷＤ Ｄ ６０　７０　８０　９０　１ｏ。

ＣＴＧＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣに’ｒｃＧＡＣＴＴＣＧＡＣにＣＣＴＡＣＴ ＡＣＴＧＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＴＷＩＩＡＰＶＤＦＤＡＹＹＣ５Ｇ入 ＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣににＡＴＣＡＣＴＴＣＡ＾ＣＡＧＣＡＣＣ入 入ＣＣ入ＣＧＣＣＧＴＧＧτＧＣＱＦＰＳＡＤＨＦＮＳＴＮＨＡＶＶ ＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣ入ＡＣＡＴＧ入ＡＣＣＣＣＧＧＣ入ＡＧにＴＡ ＣＣＣ入λＧＣＣＣτＧＣＴＧＱＴＬＶＮＮＭＮＰＧＫＶＰＫＰＣＣ ２１０２２０２コ０　２４０　２５０ ＣＧＴにＣＣＣＡＣＣＧＡにＣＴにＴＣＣにＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴにＣＴに’ｒ ＡｃｃＴＧＧ入ＣＧＡにＡＡＴＩ’ＶＰ置５人工ＳＭＬＹＬＤＥＮ ＣＣＡＣＣにＴＧＧＴＧＣＴにＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＡＧにへＧ入ＴにＡＣＣに ＴＧＧＴＧにＧＣＴＧＣＧＧＣ５ＴＶＶＬＩＣＮＹＱＥＭＴＶＶＧＣＧコｌＯ 浄Ｃ（Ｆｔ？容に変更なし） ＢＯＰ　Ｐｗｕ７　＊　４１（Ｌｌｙ　）浄書（内容に変＝１１＞ ＦＩＧ、　１６Ａ ＦＩＧ、　１６Ｂ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１９Ａ ＦｉＧ、　１９８ 手続補正書（方力 １．事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１４５Ｂ ２、発明の名称 骨形成デバイス ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名称　クリエイティブ・バイオモリキュールズ・住　所　東京都千代田区大手町 二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　２年１０月　９日　（発送日）６、補正の対象 （１）出願人の住所、名称、代表者名及び国籍を正確に記載した国内書面 （２）委任状及び翻訳文 （３）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際ｖＩｊＡ査 報告 Ｉ＾ｌＴ＋＋＆ｌｌｅＭｌ＾−＠噂堕−ＰＣＴ／ＬＩＳ　８９１０ｍ４５３

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物における移植のための骨形成デバイスで、該デバイスは： 該哺乳動物体からの移動性祖先細胞の流入、増殖および分化が許されるのに足る 広さの孔を規定する、生物学的に適合可能で、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて生物学的 に分解可能なマトリックス；および 該マトリックス中に配置した哺乳動物において、軟骨形成が誘導可能でまた該細 胞にも利用可能な、実質的に純粋な骨形成タンパク質。
2. ２．該哺乳動物に移植されたマトリックス中に配置された際、哺乳動物中で軟骨 形成を誘導できる実質的に純粋な骨形成タンパク質。
3. ３．該マトリックスが７０−４２０μｍの範囲の粒子サイズを持つ、密に充填さ れた微粒子からなるところの請求の範囲第１項記載のデバイス。
4. ４．該マトリックスが無機塩を除き、タンパク質を抽出した微粒子状の同種異型 骨からなるところの請求の範囲第１項記載のデバイス。
5. ５．該マトリックスが無機塩を除き、タンパク質を抽出した微粒子状の異種骨か らなるところの請求の範囲第１項記載のデバイス。
6. ６．該マトリックスがプロテアーゼにより処理されるところの請求の範囲第５項 記載のデバイス。
7. ７．該骨形成タンパク質が糖鎖を除去されたところの請求の範囲第１項記載ある いは請求の範囲第２項記載の発明。
8. ８．該骨形成タンパク質が 【配列があります】 というアミノ酸配列からなる請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２項記 載の発明。
9. ９．該タンパク質の最大の骨誘導活性の半分が、該マトリックス１ｍｇ当り０． ８から１．０ｎｇであるところの請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２ 項記載の発明。
10. １０．タンパク質が配列： ＯＰ１【配列があります】 から成るところの請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２項記載の発明。
11. １１．タンパク質が配列； ＯＰ１【配列があります】 から成るところの請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２項記載の発明。
12. １２．タンパク質が配列： 【配列があります】 から成るところの請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２項記載の発明。
13. １３．タンパク質が配列： ＣＢＭＰ−２ｂ【配列があります】 から成るところの請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２項記載の発明。
14. １４．タンパク質が配列： ＣＢＭＰ−３【配列があります】 から成るところの請求の範囲第１項記載あるいは請求の範囲第２項記載の発明。
15. １５．第ＩＡ図の遺伝子によってコードされる配列のＤＮＡ配列を充分に複製し 、そのため、該コード配列がマトリックスと組み合わせて哺乳動物中に移植され ると骨あるいは軟骨形成を誘導するところのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配 列。
16. １６．第ＩＡ図に示した遺伝子と同じアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１ ５項記載のＤＮＡ。
17. １７． ＯＰ１【配列があります】 をコードするところの請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。
18. １８． ＯＰ１【配列があります】 をコードするところの請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。
19. １９．請求の範囲第２項記載のタンパク質を発現するよう操作された細胞系列。
20. ２０．該マトリックスが無機塩を除き、タンパク質を抽出し、ＨＦで処理した微 粒子状の異種骨からなるところの請求の範囲第１項記載の装置。
21. ２１．該哺乳動物中の、該哺乳動物の移動性祖先細胞が接近できる部位に請求の 範囲第１項記載の装置を移植する段階を含む、哺乳動物中で局所的な軟骨あるい は骨形成を誘導する方法。
22. ２２．該哺乳動物中の、該哺乳動物の移動性祖先細胞が接近できる部位に請求の 範囲第１項記載の装置を移植する段階を含む、哺乳動物中で局所的な軟骨形成を 誘導する方法。