JPH08187098A

JPH08187098A - 遺伝子解析方法および装置

Info

Publication number: JPH08187098A
Application number: JP26736295A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Fujita; 毅藤田; Shinichiro Umemura; 晋一郎梅村; Masaharu Kiyama; 政晴木山
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 1996-07-23
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: JP3387707B2

Abstract

(57)【要約】【課題】目的遺伝子配列の存在の有無、存在量や配列
特徴を高感度に得ることが可能で、かつ前処理から遺伝
子情報の獲得、解析に至るまでの全過程が、簡便な装置
構成および操作により高速に実現可能な方法および装置
を提供すること。【解決手段】目標とする遺伝子領域の一本鎖ＤＮＡを
調製し、変性条件制御手段によって該一本鎖ＤＮＡ断片
の高次構造の変性条件を変化させながら、該一本鎖ＤＮ
Ａ断片試料の吸光度変化を計測し、該変性条件変化に対
する該吸光度変化の曲線を解析することによって、該一
本鎖ＤＮＡの配列情報すなわち目標とする遺伝子配列情
報を、迅速かつ簡便に得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医療診断や生命科学
の分野における遺伝子情報解析のための方法および装置
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子解析の技術の進歩に伴い、
医療診断や生命科学の分野で遺伝子情報の解析が重要視
されるようになってきた。例えば生命科学の分野では、
ヒトゲノム計画に代表されるように、様々な動植物遺伝
子の全塩基配列を決定するプロジェクトが進展してお
り、新規蛋白質のコード領域、発現の調節領域、またそ
れらに関連して癌遺伝子等の病因遺伝子が次第に明らか
にされつつある。

【０００３】一方医療診断の分野では、これらの研究成
果を受けて、各種の病因診断や検査に遺伝子解析技術を
導入する動きが始まっている。Ｃ型肝炎やＨＩＶ(Human
Immunodeficiency Virus)の感染によるＡＩＤＳ（後天
性免疫不全症候群）に代表される感染症の診断は、検出
の高感度化やそれらウイルス（レトロウイルス）の感染
特性と多型性との関係などの理由から、遺伝子診断の導
入が強く望まれる分野の一例である。また現在経験的な
病理診断に頼っている腫瘍細胞の検査や、骨髄バンク登
録の需要から検体数が急増しつつあるＨＬＡ（ヒト白血
球抗原）型検査などでも、正確かつ詳細な情報を与える
遺伝子解析の技術導入が望まれている。

【０００４】このような分野で望まれている遺伝子解析
の技術の最近の進歩は著しく、従来の代表的な塩基配列
決定法やプローブ法に加えて、遺伝子におけるわずかな
配列差異を、電気泳動中に一本鎖ＤＮＡがとる高次構造
の差異を利用して分離する方法が開発された。この方法
はＳＳＣＰ(Single Strand Conformation Polymorphism
s）と呼ばれ、例えば、ジェノミクス５巻，第８７４
頁〜８７９頁，１９８９（Genomics Vol.5,pp874〜pp87
9,1989）に紹介されているように、一塩基置換をも感度
良く検出できる手法として注目を浴びている。この分離
方法は、相補的な一組の二本鎖からなるＤＮＡを一本鎖
状態に置くと、この一本鎖ＤＮＡは、通常、適当な条件
（イオン強度、温度など）下では分子内で自己会合し配
列特異的な高次構造を形成するが、配列が異なればこの
高次構造も異なることに着目し、この高次構造の違いを
ゲル電気泳動によって移動度の違いとして検出すること
によって配列の差異を検出するものである。

【０００５】この方法は、配列差異の分離感度は高い
が、分離法として電気泳動を用いるため、分離に長時間
を必要とし、高スループット化が困難であるとともに、
配列の違いが効率良く電気泳動移動度の違いに反映され
るための条件の選択が難しい。さらに、自動化が困難で
あるのみならず、場合によっては全多型を完全に分離す
るために、複数の条件下での分離を必要とするなどの欠
点もある。

【０００６】また、同じく、遺伝子におけるわずかな配
列差異を検出する方法として変性勾配ゲル電気泳動法と
称される方法が提案されているが(例えば、S.G.Fischer
andL.S.Lerman:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.80, 1579
-1583,1983)、これも分離法に電気泳動を用いているた
め、上述の問題点と同様な欠点がある。

【０００７】一方、完全に相補的な配列を持つ二本鎖Ｄ
ＮＡと、完全ではないがほぼ相補的な配列を持つ二本鎖
ＤＮＡとの変性条件の違いを、二本鎖ＤＮＡが一本鎖Ｄ
ＮＡに変性するときの吸光度の変化の違い(変性曲線(me
lting curve))として検出出来ることが知られている(例
えば、I. V. Razlutuskii, L. S. Shlyakhtenko andYu.
L. Lyubchenko:Nucleic Acids Research, Vol.15, No.
16, p6665-6676（1987))。さらには、高次構造（ヘアピ
ン、ステム、ループ構造など）をとる一本鎖ＲＮＡの型
の識別が、一本鎖ＲＮＡの塩基対号が分離するときの吸
光度の変化(変性曲線)として検出出来ることも知られて
きた（例えば、L. G. Laing and D.E. Draper: J. Mol.
Biol.(1994)237, 560-576)。

【０００８】これらの手法によれば、試料が得られた後
は電気泳動の操作が必要でないため操作が簡便であるの
みならず、計測自体は光学的な計測法として取り扱いが
容易であるとともに信頼性も高いものであるメリットが
ある。

【０００９】また、完全に相補的な配列を持つ二本鎖Ｄ
ＮＡと、完全ではないがほぼ相補的な配列を持つ二本鎖
ＤＮＡが、各相補鎖に各々修飾した二種類の蛍光体によ
って起こる蛍光エネルギ移動が変性時に解消する現象を
光学的に計測することによって検出し、それによって完
全には相補的でない二種類のＤＮＡの配列差異を検出す
る技術が提案された（特開平７−３１５００）。この場
合も、試料が得られた後は電気泳動の操作が必要でない
ため上述の例と同様のメリットがある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】これらの方法によって
検出出来るのは、しかしながら、配列組成（ＧＣ含有量
など）や塩基の欠失／挿入などであって、詳細な配列差
異、特に一塩基置換を含む遺伝子型決定は、実質上困難
であった。また変性条件の制御も極めて低速で行なう必
要があるため高スループットな検出、決定には適応困難
であった。

【００１１】さらには、一本鎖ＤＮＡから、直接、一塩
基置換含む遺伝子型を光学的に解析することは考慮され
ていなかった。

【００１２】この課題を解決するため、本願の発明は一
本鎖ＤＮＡの高次構造の変性曲線（melting curve）を
直接検出し、これにより装置構成の簡易化、より精度の
良い現実的な信号処理方法および装置を提供するもので
ある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明では、目標とする
遺伝子領域の一本鎖ＤＮＡに関し、二種類以上の遺伝子
型を同時に有するヘテロ接合型の場合にも、分離分析を
可能にするため、既知の全多型に対応する変性曲線を記
憶しておき（鋳型曲線）、一つまたは複数の鋳型曲線の
線形結合によって作られる曲線の全ての組み合わせと、
試料から得られた信号曲線とを比較し、その平均二乗誤
差が所定の値以下でかつ最も小さい場合に、その鋳型曲
線の組み合わせを計測された一本鎖ＤＮＡ断片（試料）
の遺伝子の型、即ち配列特徴、として認識するよう構成
した。

【００１４】また、ＰＣＲ法を応用した医療診断などに
おける遺伝子解析を考えた場合、遺伝子情報として獲得
すべきものは、目標遺伝子断片の増幅の有無、増幅され
た場合には目標遺伝子断片の配列情報および産物量であ
るが、本発明では、上記３つの情報を、melting curve
を定量的に計測することにより同時に得る面でも有利と
なるよう工夫された。

【００１５】また、試料を保持し温度制御を行なう試料
保持手段を表面積／体積比の大きいものに工夫すること
により、変性速度の高速化を可能として計測した結果、
一本鎖ＤＮＡの変性曲線は、温度が上がり高次構造が解
けるときと、温度が下がり高次構造を形成していくとき
とで異なる曲線を描き、ヒステリシスを示することを発
見した。そして、このヒステリシス曲線自体に再現性が
あるとともに、このデータを前記と同様な信号処理手段
によって処理することにより一塩基置換の遺伝子型を分
析出来た。

【００１６】さらに、一本鎖ＤＮＡ試料を調整する際、
ＤＮＡの相補配列が形成する塩基対合にインターカレー
トして蛍光波長を移動させるエチジウムブロミドなどの
インターカレータを組み込み、試料溶液に所定波長の励
起光を照射する励起光を照射することによって、励起光
の照射によって発生する蛍光が一本鎖ＤＮＡの変性時
に、一本鎖ＤＮＡ断片試料とインターカレータとの相互
作用によって発生する蛍光強度に変化をもたらすことを
発見した。従って、これを計測し、このデータを前記と
同様な信号処理手段によって処理することにより、一本
鎖ＤＮＡ断片の配列情報を得ることができる。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施例の一つを示
す。

【００１８】図１は本発明の遺伝子解析装置の基本的な
構成を示すブロック図である。光源１で発せられた紫外
光（波長２６０ｎｍ）は光学系２で２本に分けられ、試
料室６に設置される試料部４および対照部５に入射す
る。その後光学系（図示せず）で集光されたそれぞれの
光線は光電変換器７により検出され、増幅器９を通して
解析および信号処理装置１０で処理される。試料室６は
温度調節器８によって任意にプログラムされた温度プロ
ファイルに沿って試料部４および対照部５の温度を制御
することができる。温度制御は、任意の昇降温速度で行
なうことが出来る。また試料室６中の試料温度は温度セ
ンサ（図示しない）によって計測され、温度調節器８に
フィードバックされるとともに信号処理装置１０に入力
される。試料温度は試料によっては−２０℃〜１００℃
まで制御することが必要となるので、試料部４が室温以
下の温度に制御されるときには、試料室６や試料を保持
するセル（試料セル）の表面に結露が起こらないよう、
乾燥空気を試料室６の下部から上方に向けて流す構造と
される。

【００１９】対照部５は、試料部４の試料を溶解した緩
衝液や試料セルによる吸収を補正し、正味のＤＮＡによ
る吸収を求めるために設けられるものである。これは、
分光計測技術における常套手法であり、以下に説明する
実施例のデータは全てこの補正がなされたものである。

【００２０】次に上記の装置を用いて遺伝子多型解析を
行なった例について述べる。

【００２１】本実施例ではヒト血球細胞より抽出したゲ
ノムＤＮＡから、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）遺伝子のク
ラス２：ＤＱＡ１領域を非対称ＰＣＲ増幅し、該領域に
関して遺伝子多型解析（タイピング）を行なった。

【００２２】常法によりゲノムＤＮＡを抽出したＤＮＡ
試料溶液、終濃度10mM Tris-Hcl(pH8.3)、50mM Kcl、1.
5mM MgC12、0.02% ゲラチン、各200μM デオキシリボヌ
クレオチド三りん酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を含む
PCRバッファ液、2.5U Taqポリメラーゼ、解析を行なう
ＨＬＡのＤＱＡ１領域に対応する２種類のプライマＧＨ
２６およびＧＨ２７(;Ulf B.Gyllensten and Henry A.E
rlich プロシーディングナショナルアカデミーオ
ブサイエンスユー．エス．エー(Proceeding Nation
al Academy of Science of U.S.A.)Vol.85,pp.7652-765
6,October 1988) 20pmolずつをチューブに混合し、ミネ
ラルオイルを上層に充填した後、ＰＣＲを行なった。Ｐ
ＣＲサイクルのパラメータは９４℃（１分）→５７℃
（１．２分）→７２℃（１分）で２７サイクルである。

【００２３】この反応産物１／１００を用いて非対称Ｐ
ＣＲを行なう。非対称ＰＣＲ反応液は上記のＰＣＲとほ
ぼ同様で、プライマのみＧＨ２６を10pmol、ＧＨ２７を
1pmolと量を変更して行なう。ＰＣＲサイクルのパラメ
ータは９４℃（１分）→５７℃（１．２分）→７２℃
（１分）で１５サイクルである。

【００２４】この反応産物をマイクロフィルタ：microc
on(TM)30（グレースジャパン（株））で脱塩濃縮しTNE
バッファl（１０mM Tris-Hcl,1mM EDTA(pH8.0),30mM Na
cl）に溶解し試料溶液とした。

【００２５】ちなみに本実施例では一本鎖ＤＮＡの調製
に非対称ＰＣＲを用いたが、他の方法として二本鎖ＤＮ
ＡをＰＣＲ増幅した後、片側一本鎖をλエキソヌクレア
ーゼにより消化する方法（λエキソヌクレアーゼ法）
や、ＰＣＲに用いるプライマのうち片側一方を膜上に固
定した状態でＰＣＲ増幅を行ない、その後変性温度まで
温度を上昇させた状態で膜上に固定されてない一本鎖Ｄ
ＮＡを洗い流す方法（メンブレン法）などが採用出来
る。メンブレン法は膜上に所定のプライマを固定する作
業が必要であるが、一本鎖を非常に簡便に、高純度に調
製することが可能で、かつ自動化に適している。

【００２６】上記の試料溶液を試料部４に、対照溶液と
してTNEバッファ1を対照部５に設置し、一旦、試料温度
を０℃まで下降した後、1℃/minの昇温速度で６０℃ま
で昇温した。

【００２７】図２〜図７の（ａ）、（ｂ）は上記の方法
によって、ＨＬＡーＤＱＡ１領域遺伝子(242塩基 or 23
9塩基)の中から既知の６タイプ（0101、0102、0103、0301、
0401、0601:The WHO nomenclature committee for facto
rs of the HLA system,1989.Immunogenetics,31:131-14
0,1990)の一本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting
curve）を吸光度データおよびこれを温度で微分した微
分吸光度データとして示したものである（他の0201、050
1の２タイプについては、発明者がホモ接合型の試料を
入手できなかったのでここでは割愛した）。また（ｂ）
では微分吸光度データのみを示した。ここで0101と0102
は１塩基相異、0101と0103は３塩基、0102と0103は２塩
基相異である。0101と0301は２７塩基相異、0401と0601
は他の型よりも３塩基短く配列も0101と比べると２０塩
基以上相異しているが、0401と0601とでは１塩基しか相
異していない。

【００２８】また、（ａ）、（ｂ）は同一の試料につい
ての解析結果を示すものであるが、（ａ）は本願の優先
権に係る出願時に得られた解析結果であり、（ｂ）は比
較的最近得られた解析結果である。両者が、同じ試料に
ついての解析結果を示すものであるにもかかわらず、完
全に一致していないのは、解析技法の熟度の差異と、解
析技法の未熟を補うために採用したデータの補正による
ものであり、解析に再現性が無いということではない。

【００２９】図より、まず、大きく配列のことなるグル
ープ、例えば0101〜0103（１型）と0301（３型）と0401
および0601（短型）とは明らかにmelting curveの特徴
が異なっていることがわかる。また１塩基相異や２塩基
相異であるタイプの違いも（例えば0101〜0103や0401、
0601）メインのピークではないが、明らかな違いとして
検出できることがわかる。

【００３０】また図８は0301型のmelting curveおよび
その微分関数をガウス分布関数の重ね合わせで近似した
ものである。図８から明らかなように、0301型のmeltin
g curveは２種類のガウス曲線の重ね合わせにより良く
近似される。

【００３１】このことは、すなわち、これら既知の多型
ＤＮＡについて変性曲線（meltingcurve）を調べてお
き、検体ＤＮＡをこれらの既知の多型ＤＮＡについての
変性曲線（melting curve）を鋳型として引き較べれ
ば、検体ＤＮＡを特定出来ることを意味する。さらにヘ
テロ接合型ＤＮＡについてはガウス曲線に分析した上で
重ね合わせを特定することで検体ＤＮＡを特定出来る。

【００３２】表１は図２〜図７に示した既知の６種類の
変性曲線（melting curve）の微分関数を同様に複数種
類のガウス曲線で表現した場合の、ａ：大きさ、μ：ピ
ーク位置（平均値）、σ：広がり度合い（標準偏差）と
をまとめたものである。

【００３３】

【表１】

【００３４】近似に用いたガウス関数の項数は、近似誤
差が最小値に飽和した点とした。この表に示すとおり各
型に対応する変性曲線（melting curve）の微分関数は
特徴的なパラメータ（ａ、μ、σ）で表されることがわ
かる。すなわち、これらの既知の多型ＤＮＡについての
変性曲線（melting curve）を鋳型として未知の遺伝子
（型）と引き較べる際、表１に示すパラメータとの対比
という形で行なえば、自動的な演算処理として行なえる
のみならず、数学的な処理により厳密な比較が出来るこ
とになる。

【００３５】数学的な処理としては、予め準備された既
知の変性曲線データの一つまたは複数の鋳型曲線データ
の線形結合によって作られる曲線データの全ての組み合
わせと、新たに計測し入力された信号曲線データとを比
較し、最も統計的誤差の少ない該鋳型曲線データもしく
はその線形結合によって作られた曲線データの基となる
該鋳型曲線データの組み合わせを、検体二本鎖ＤＮＡ断
片から準備された一本鎖ＤＮＡ断片の配列特徴とすれば
良い。

【００３６】図９は、0102および0301のヘテロ接合型の
試料の場合の変性曲線（meltingcurve）の微分関数およ
び該曲線データの特徴パラメータである。ヘテロ接合型
の場合もそれぞれの遺伝子タイプの重ね合わせで表現さ
れており、スペクトル解析の容量でタイピングができる
ことがわかる。

【００３７】表２は、図９の結果から遺伝子型別のパラ
メータを整理したものである。すなわち、ヘテロ接合型
の遺伝子がガウス曲線データで表現した場合パラメータ
μ：ピーク位置（平均値）、およびσ：広がり度合い
（標準偏差）について表２の回帰値とほぼ同じ値を示せ
ば、それらから推測される二つの遺伝子型のヘテロ接合
型であると特定出来る。

【００３８】

【表２】

【００３９】本実施例においては、最大、５℃／ｍｉｎ
の昇温速度で実用的な意味での十分正確な変性曲線デー
タ(melting curve data)が得られた。この場合一検体の
解析に対して約１０分の解析時間であり、従来の配列決
定やＳＳＣＰ法（４時間以上）に対して、２０倍以上の
高速化を達成したこととなる。

【００４０】図１０はヘテロ結合型ＤＮＡについての図
２（ｂ）−図７（ｂ）を元にした他の解析例を示す。本
例においても、ＨＬＡ−ＤＱＡ１のｅｘｏｎ２領域（24
2塩基 or 239塩基（３塩基欠失））にある８種類の遺伝
子多型に対して、センス鎖それぞれについて鋳型となる
変性曲線データ（melting curve data）を予め計測して
おく。試料から得られたヘテロ結合型実測曲線データが
ＤＱＡ１＊０１０１を示す鋳型0101とＤＱＡ１＊０１０
２を示す鋳型0102の合成曲線として良く一致する（平均
二乗誤差RMS=0.00008）ことを示しており、この結果、
試料が両者のヘテロ接合型ＤＮＡと判定出来ることを示
す。

【００４１】多型解析においては、分析する試料の遺伝
子型が既知の遺伝子型の中のどの型に帰属されるか、ま
たは新規なものであるのかを判断することが必要であ
る。また複数種類の遺伝子型を同時に有するヘテロ接合
型の分離分析が可能であることが必要課題であるが、本
解析例では、複数種類の遺伝子型を同時に有するヘテロ
接合型の分離分析を容易にする信号処理として、既知の
全多型に対応する変性曲線データを記憶しておき（鋳型
曲線データ）、一つまたは複数の鋳型曲線データの線形
結合によって作られる曲線データの全ての組み合わせ
と、新たに計測し入力された信号曲線データとを比較
し、その平均二乗誤差が所定の値以下で、かつ最も小さ
い場合に、その鋳型曲線データの組み合わせを計測され
た一本鎖ＤＮＡ断片の遺伝子の型（即ち配列特徴）とし
て認識することにより、容易かつより確実に遺伝子型の
決定が可能となった。また上記平均二乗誤差が小さい順
番に、確からしい組み合わせとして出力することも可能
である。

【００４２】図１０に示す結果について、結果最少の誤
差を与える組み合わせの有効性を表３によって説明す
る。

【００４３】結果最少の誤差を与える組み合わせは、正
しいヘテロ接合型の組み合わせを示し、その誤差量は、
変性曲線データ（melting curve data）を５回計測して
とった再現誤差と同程度（より小さいが）であった。表
３に再現誤差および正しい組合せの場合（表に二重丸を
付して示す組み合わせ）の平均二乗誤差と、それ以外の
組み合わせのうち誤差の小さい組み合わせの内の幾つか
についての平均二乗誤差を示す。一塩基差異の配列の組
み合わせによるヘテロ接合の場合に、最も判断を誤りや
すい遺伝子型は、該ヘテロ接合を構成する基の各遺伝子
型によるホモ接合型であるが、表３から明らかなよう
に、正解と不正解の場合との間に有意な差異の存在する
ことが分かる。

【００４４】

【表３】

【００４５】また、試料の温度を高速かつ実質的に均一
に制御することにより、幾つかの検体では、１０℃／分
を越えた昇温および降温速度で域で制御すると、一本鎖
ＤＮＡ高次構造の動的温度特性が計測できた。すなわ
ち、高次構造融解時（昇温）と高次構造形成時（降温）
とで、変性曲線（Melting Curve）が図１１に示すよう
なヒステリシスカーブ（１→２→３→４→５→６→２→
３→４→５→…）を描くことが計測された。これらのこ
のヒステリシスカーブは、しかも、検体試料によって異
なり、塩基の置換、欠失または挿入による配列の違いに
よって特異的なものであることが分かった。このこと
は、前述した吸光度変化に限らず、吸光度のヒステリシ
スカーブについて前記信号処理方法と同様な方法によ
り、鋳型となるヒステリシスカーブと計測したヒステリ
シスカーブとの一致を評価することにより、より高速に
正確な型決定を行なうことが可能であることを意味す
る。

【００４６】このやり方の場合、最高で一検体当たり一
分以内（５０秒）で昇降温２サイクルのヒステリシスカ
ーブを得て計測を完了することが可能であった。ヒステ
リシスカーブは昇温速度に応じてカーブが変化する。従
って、昇温速度を多型に応じて適切な値にすれば遺伝子
型に対応したヒステリシスカーブを効果的に得られるの
で、このヒステリシスカーブの昇温速度依存性による遺
伝子解析も出来る。

【００４７】次に、ＰＣＲを前処理として、フロー（流
れ）系として前処理からmelting curveの計測までを連
続処理する遺伝子解析装置の実施例について図１２、図
１３によって説明する。

【００４８】図１２にプロセスの概略流れ図、図１３に
装置構成の概略図、図１４に分光用セルの詳細構成図
を、それぞれ示す。

【００４９】反応プロセスは、図１２に示す（ａ）から
（ｇ）の過程を経過して進行する。（ａ）に示すよう
に、ＰＣＲは、ＰＣＲ反応セル内の底面に多孔質のフイ
ルター膜６０１にＰＣＲのプライマとなるオリゴヌクレ
オチドＡ６０２を固定したＰＣＲ反応セル６００中で行
なわれる。このＰＣＲ反応セル６００中に検体としての
抽出精製したゲノムＤＮＡを供したものを後述する図１
３の装置に組み付ける。ＰＣＲ反応が進むと（ｂ）に示
すように、検体ＤＮＡに対応し、固相の１本鎖がフイル
ター膜６０１に一端が固着された形で２本鎖ＤＮＡ（Ｐ
ＣＲ生成物）が生成される。この２本鎖ＤＮＡを変性さ
せると、（ｃ）に示すように、フイルター膜６０１に一
端が固着された形で１本鎖ＤＮＡ（固相）と、（ｄ）に
示すように、フリーの１本鎖ＤＮＡ（液相）とに分離さ
れる。この液相の１本鎖ＤＮＡを計測用バッファ液に溶
解し、分光セルに送りこみ、分光セルの温度制御をし
て、（ｅ）に示す（融解した）液相の１本鎖ＤＮＡ、
（ｆ）に示す高次構造の形成との制御を行なう。この分
光セルによって、（ｇ）に示すように、吸光度を計測し
変性曲線（melting curve)を得ることが出来る。

【００５０】図１３に装置構成の概略図を示す。試料前
処理セル７００の出入り口７０５、７０６を介して、Ｐ
ＣＲ反応セル６００に、後述するように、ＰＣＲ反応
液、洗浄用バッファ液および分光用バッファ液が送りこ
まれるとともに、ＰＣＲ反応セル６００を所定の熱サイ
クルで制御する。ＰＣＲ反応セル６００にはプライマＡ
を固定した多孔質フィルタ６０１が備えられる。試料前
処理セル７００では、図１２で説明した（ａ）−（ｄ）
の処理が行なわれることになる。

【００５１】ＰＣＲ反応セル６００内の多孔質フイルタ
６０１にＰＣＲのプライマとなるオリゴヌクレオチドＡ
を10 pmol固定し、このＰＣＲ反応セル６００中に検体
である抽出精製したゲノムＤＮＡを１００ng供する。Ｐ
ＣＲ反応液槽７０１にガス源７０７、バルブ７２３、７
２２、７２１を介してガスが送りこまれ、ＰＣＲ反応液
５０μｌがバルブ７２５、７２４を介してＰＣＲ反応セ
ル６００に送りこまれる。ＰＣＲ反応液としては５０mM
Kcl,１０mM Tris-HCl（pH８．３），１．５mMMgC12，
０．００１％ゼラチン（終濃度）のバッファ溶液中に、
プライマ（オリゴヌクレオチド）Ｂを１０pmolと各１０
nmolのデオキシリボヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰ：ｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）および耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を１unitが
混合されているものを用いた。

【００５２】この状態で、前記ＰＣＲ反応セル６００を
熱風もしくは冷風によって温度制御しＰＣＲを行う。サ
イクル数は２５サイクルで、温度条件は９４℃ ３０
秒、５５℃ １分、７２℃ ３０秒で、総反応時間は５
０分であった。このサイクルに要する時間は、セルの形
状をより細長くし、面積／体積比をより大きくすること
により、２０分程度に短くすることが可能であると考え
られる。高温時の反応液の蒸発は、バルブ７２４、７２
８を閉じておくことで、実質的に零に出来た。

【００５３】反応後に、洗浄または分光用バッファ液槽
にバルブ７２２、７２３を介して、ガス源７０７からガ
スを供給し、バルブ７２６、７２５、７２４を介して洗
浄用バッファ液をフィルタ６０１に流して、フィルタ６
０１を数回洗うことにより残存プライマや残存ｄＮＴＰ
を除去する。廃液はバルブ７２８を通して廃液タンク７
０３に廃棄される。フィルタ６０１上にはＰＣＲ反応産
物が残る。フィルタ６０１を通過しない不要物が残る可
能性があるときは、ガス源７０８からバルブ７２８を介
してガスを送りこみ、バルブ７２４を介して廃液タンク
７０９に廃液を廃棄するようにしても良い。これらの動
作は、全て、図１２に示す（ｂ）のように、二本鎖が多
孔質フィルタ６０１に固相状態にある条件で行なわれ
る。

【００５４】この後、最後の洗浄液（分光用バッファ液
となる）をＰＣＲセル６００中に導入し、次にＰＣＲ反
応セル６００中の温度を上げるなど変性状態にして、液
をガス源７０８を使用してＰＣＲ反応セル６００から出
入り口７０５の方向へ流す。すなわち図１２（ｄ）のよ
うに液相の１本鎖ＤＮＡを取り出して、分光セル３００
に送りこむのである。本実施例においては、洗浄用バッ
ファとして２０μlのＴＮＥバッファ（１０mM Tris-HC
l，１mM ＥＤＴＡ（pH８．０），３０mM ＮａＣｌ）を
用いた。分光セル３００へ導入された試料は、計測後、
バルブ７２６、７２７を介して洗浄用バッファを流すこ
とにより廃液タンク７０４に廃棄される。この結果、用
済み後の試料が除去されるとともに、分光セル３００内
が洗浄される。このとき、廃液タンク７０４の代わり
に、フラクションコレクタを設置し、計測後の試料を採
取することも可能である。

【００５５】以上の装置構成については、ＰＣＲ反応セ
ル６００と分光セル３００の数は１対１であったが、複
数のＰＣＲ反応セルがバルブを通して一つの分光セルに
結合され、反応産物が順次分光セルに導入され計測が行
なわれてもよい。

【００５６】また、システムの全体構成はやや複雑なも
のになりうるが、ＰＣＲ反応セル６００に、直接、検体
の元となる血液等の生細胞試料を供給し、これから既知
の方法により、検体としての遺伝子を抽出する処理を行
ない、その後、上述した遺伝子型の解析処理を行なうよ
うにして、抽出から解析までのシステムを一貫したもの
とすることもできる。

【００５７】図１４は、図１３で採用した分光セル３０
０の構成例を示す図であり、左側に側面図を、右側に、
側面図をＡ−Ａの位置で、矢印方向に見た断面図を示
す。

【００５８】本実施例の分光用マイクロセル３００は、
石英ガラスおよび黒石英ガラスで、光路窓が石英（透
明）がラスで直方体の上部が開放された形の黒石英ガラ
スの箱を形成し、この上部内側に、両側に試料の流出入
口３０３を残して黒石英ガラスからなるスペーサーをの
設けたものである。従ってスペーサー下側に、光路長は
１０mmで光路断面は１．４mm×１．４mmの正方形の試料
液保持部が形成される。スペーサーの中央部には試料液
保持部に向かって温度センサ３０１をわずかに突出させ
る。分光用マイクロセル３００は、試料液の温度を制御
するための温度制御器３０２内に、図に太い矢印で（挿
入）としたように、内蔵する形で配置する。

【００５９】セル壁は反射迷光の極めて少なく熱伝導
率、強度も比較的高いという意味で黒石英ガラスを用
い、厚みは１ｍｍ程度としたが、セルの材質に関して
は、反射迷光が少なく熱伝導率の優れた材質が適してお
り、他の例としてはアルミ合金に白金黒やＴｉＮ（窒化
チタン）などをコーティングしたものも良い。本実施例
のセルでは、光路の中心位置で試料の温度が温度センサ
３０１で計測され、かつ温度制御器３０２中に埋め込ん
だ形とされているので、高効率に試料の温度を制御し、
且つ試料の温度を精密に測定することが可能である。さ
らに、本実施例のセルは、市販の一般的な分光セルと比
較し、表面積／体積比率は２８００と大きく、本セルに
よって０．１℃／ｍｉｎの速度から５℃／ｓｅｃでの昇
降温が可能となった。

【００６０】最後に、エチジウムブロミドを用いて、試
料ＤＮＡとインタカレータとの蛍光を検出することによ
り変性曲線（Melting Curve）を得た実施例について述
べる。

【００６１】図１５はＤＮＡとインタカレータとの蛍光
を検出するための検出装置構成の実施例を示すブロック
図である。光源８０１で発せられた紫外光（波長２６０
ｎｍ）はフィルタ、レンズ等の光学系８０２を通って試
料室８０５に設置される試料８０４に入射する。試料Ｄ
ＮＡ中にインタカレートしたエチジウムブロミドの存在
によって５９０ｎｍの蛍光が発し、その後光学系８０７
で収光された蛍光は光電変換器８０８により検出され、
増幅器８０９を通して解析および信号処理手段８１０で
処理される。試料室８０５は温度制御部８０６によって
任意にプログラムされた温度プロファイルに沿って試料
温度を制御することができる。温度制御は、昇降温速度
０．１℃／ｍｉｎの速度から２℃／ｓｅｃの速度まで任
意に設定可能で、ペルチェ式電子加熱冷却要素により−
２０℃〜１００℃まで制御可能である。本実施例で
も、図１４に示した分光セルが使用可能であり、信号の
扱い、セルの表面に結露が起こらないように必要な工夫
がされることは先の実施例と同様である。

【００６２】インタカレータの蛍光による変性曲線（Me
lting Curve）計測の場合、一本鎖ＤＮＡ高次構造の融
解と共に蛍光強度は減少する。これは高次構造を形成す
る塩基対に、エチジウムブロミドがインタカレートする
ことにより発せられていた蛍光が、高次構造の融解に伴
ってインタカレートが解消し、発せられなくなるからで
ある。当初、エチジウムブロミドの濃度によって蛍光強
度が変化するなど再現性の問題が在ったが、最低温度で
の蛍光強度を基準に規格化した変性曲線(Melting Curv
e)を用いることにより、同試料間での再現性を保証する
ことが可能となった。

【００６３】図１６は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１０１と
ＤＱＡ１＊０１０２の蛍光による変性曲線(Melting Cur
ve)を示したものである。前記吸光度を用いた場合と同
様に、一塩基置換を分離することが可能であった。また
図１６のデータは吸光度を用いた場合の１／５０の濃度
で計測したものである。蛍光を用いることで、１桁から
２桁の感度向上（変性曲線(Melting Curve)の計測精度
＝Ｓ／Ｎ比の向上）が実現された。

【００６４】信号処理は、前記吸光度の場合と同様に、
鋳型曲線との比較で行なった結果、行なった全ての試料
に対して正確な分析が可能であった。

【００６５】以上、本発明に関する幾つかの実施例を説
明したが、本発明の適用範囲はこれら実施例によって制
限されるものではなく、一本鎖ＤＮＡの変性曲線(Melti
ng Curve)を解析することにより当該配列の情報を得る
ことを特徴とする方法および装置を与えるものは本発明
の範疇に属するものである。

【００６６】

【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、本発明の装
置および方法を用いることによって、医療診断や遺伝子
検査に必要な少なくとも最小限の遺伝子情報、即ち目的
配列の存在の有無、存在量や配列特徴を得ることが可能
で、かつ前処理から遺伝子情報の獲得、解析に至るまで
の全過程が、簡便な装置構成および操作により短時間で
実現可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第一の実施例の検出装置構成を示すブ
ロック図。

【図２】（ａ）、（ｂ）はＨＬＡ−ＤＱＡ１領域遺伝子
(242塩基 or 239塩基)の中から既知の0101のタイプの一
本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting curve）を
吸光度データおよびこれを温度で微分した微分吸光度デ
ータとして示した図。

【図３】（ａ）、（ｂ）はＨＬＡ−ＤＱＡ１領域遺伝子
(242塩基 or 239塩基)の中から既知の0102のタイプの一
本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting curve）を
吸光度データおよびこれを温度で微分した微分吸光度デ
ータとして示した図。

【図４】（ａ）、（ｂ）はＨＬＡ−ＤＱＡ１領域遺伝子
(242塩基 or 239塩基)の中から既知の0103のタイプの一
本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting curve）を
吸光度データおよびこれを温度で微分した微分吸光度デ
ータとして示した図。

【図５】（ａ）、（ｂ）はＨＬＡ−ＤＱＡ１領域遺伝子
(242塩基 or 239塩基)の中から既知の0301のタイプの一
本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting curve）を
吸光度データおよびこれを温度で微分した微分吸光度デ
ータとして示した図。

【図６】（ａ）、（ｂ）はＨＬＡ−ＤＱＡ１領域遺伝子
(242塩基 or 239塩基)の中から既知の0401のタイプの一
本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting curve）を
吸光度データおよびこれを温度で微分した微分吸光度デ
ータとして示した図。

【図７】（ａ）、（ｂ）はＨＬＡ−ＤＱＡ１領域遺伝子
(242塩基 or 239塩基)の中から既知の0601のタイプの一
本鎖ＤＮＡについて得た変性曲線（melting curve）を
吸光度データおよびこれを温度で微分した微分吸光度デ
ータとして示した図。

【図８】0301型の変性曲線（melting curve）の微分関
数をガウス分布関数の重ね合わせで近似した図。

【図９】0102型および0301型のヘテロ接合型の試料の場
合の変性曲線（melting curve）の微分関数および該曲
線の特徴パラメータを示す図。

【図１０】ヘテロ結合型ＤＮＡについての他の解析例を
示す図。

【図１１】変性曲線（Melting Curve）がヒステリシス
カーブを描く場合の計測例を示す図。

【図１２】本発明の実施例のプロセスの概略流れを示す
図。

【図１３】本発明の第１の実施例の装置構成の概略を示
す図。

【図１４】本発明の実施例の分光用セルの詳細構成を示
す図。

【図１５】ＤＮＡとインタカレータとの蛍光を検出する
ための検出装置構成の実施例を示すブロック図。

【図１６】ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１０１とＤＱＡ１＊０
１０２の蛍光による変性曲線(Melting Curve)の結果を
示す図。

【符号の説明】

１…光源、２…光学系、３…紫外光、４…試料、５…対
照、６…試料室、７…光電変換器、８…温度制御器、９
…増幅器、１０…信号処理装置、２０１…セル、２０２
…シース熱電対、３００…分光用マイクロセル、３０１
…温度センサ（シース熱電対）、３０２…温度制御器、
３０３…試料流出入口、６００…ＰＣＲ反応セル、６０
１…多孔質フィルタ、６０２…プライマＡ（固相）、７
０１…ＰＣＲ反応液供給用バルブ、７０２…洗浄／分光
用バッファ液供給用バルブ、７０３…廃液タンク、７０
４…廃液タンク、７０５…出入り口、７０６…出入り
口、８０１…光源、８０２…光学系、８０３…紫外光、
８０４…試料、８０５…試料室、８０６…温度制御器、
８０７…光学系、８０８…光電変換器、８０９…増幅
器、８１０…信号処理装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＰＧ０６Ｆ 17/60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体二本鎖ＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ断
片を準備すること、該一本鎖ＤＮＡ断片の高次構造を所
定の変性条件によって変性させること、該変性条件と変
性の結果との関係を示す変性曲線データを得ること、該
変性曲線データと前記検体二本鎖ＤＮＡ断片に対応する
既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片から得られた一本鎖ＤＮＡ
断片による高次構造が変性するときの変性条件による変
性曲線データを比較することとよりなり、該比較結果か
ら前記検体二本鎖ＤＮＡ断片を前記既知の多型二本鎖Ｄ
ＮＡ断片との対応関係に応じて表示することを特徴とす
る遺伝子解析方法。
【請求項２】検体二本鎖ＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ断
片を準備すること、該一本鎖ＤＮＡ断片が高次構造を形
成するとき相補配列が形成する塩基対合に所定波長の励
起光を受けて所定波長の蛍光を発するインターカレータ
をインターカレートすること、該インターカレータをイ
ンターカレートした一本鎖ＤＮＡ断片に該所定波長の励
起光を照射すること、該励起光の照射の下に該一本鎖Ｄ
ＮＡ断片の高次構造を所定の変性条件によって変性させ
ること、該変性によって発生する該所定波長の蛍光の強
度の変化を変性結果として検出すること、該変性条件と
変性の結果との関係を示す変性曲線データを得ること、
該変性曲線データと前記検体二本鎖ＤＮＡ断片に対応す
る既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片から得られた一本鎖ＤＮ
Ａ断片による高次構造が変性するときの変性条件による
変性曲線データを比較することとよりなり、該比較結果
から前記検体二本鎖ＤＮＡ断片を前記既知の多型二本鎖
ＤＮＡ断片との対応関係に応じて表示することを特徴と
する遺伝子解析方法。
【請求項３】前記検体二本鎖ＤＮＡ断片の変性曲線デー
タと既知の変性曲線データとの比較が予め準備された既
知の変性曲線データの一つまたは複数の鋳型曲線の線形
結合によって作られる曲線の全ての組み合わせと、新た
に計測し入力された信号曲線とを比較し、最も統計的誤
差の少ない該鋳型曲線もしくはその線形結合によって作
られた曲線の基となる該鋳型曲線の組み合わせを、検体
二本鎖ＤＮＡ断片の計測された一本鎖ＤＮＡ断片の配列
特徴とする請求項１または２記載の遺伝子解析方法。
【請求項４】前記検体二本鎖ＤＮＡ断片の変性曲線デー
タと既知の変性曲線データとの比較が予め準備された既
知の変性曲線データの一つまたは複数の鋳型曲線の線形
結合によって作られる曲線の全ての組み合わせと、新た
に計測し入力された信号曲線とを比較し、最も統計的誤
差の少ない該鋳型曲線もしくはその線形結合によって作
られた曲線の基となる該鋳型曲線の組み合わせを、検体
二本鎖ＤＮＡ断片の計測された一本鎖ＤＮＡ断片の配列
特徴として、統計誤差の小さい順に所定数表示する請求
項１または２記載の遺伝子解析方法。
【請求項５】前記変性条件が温度であり、変性曲線デー
タが温度に対する試料の吸光度または蛍光強度の変化で
得られるものである請求項１、２、３または４記載の遺
伝子解析方法。
【請求項６】前記変性条件が水素イオン濃度であり、変
性曲線データが水素イオン濃度に対する試料の吸光度ま
たは蛍光強度の変化で得られるものである請求項１、
２、３または４記載の遺伝子解析方法。
【請求項７】前記変性条件が変性剤ホルムアミド濃度で
あり、変性曲線データが変性剤ホルムアミド濃度に対す
る試料の吸光度または蛍光強度の変化で得られるもので
ある請求項１、２、３または４記載の遺伝子解析方法。
【請求項８】前記変性条件変化に対する吸光度変化の曲
線を、変性条件を変性が進行する向きと、逆に高次構造
が形成される向きに交互に連続的に変化させ、該変化に
応じて起こる該吸光度または蛍光強度の変化のヒステリ
シス特性を計測し解析することによって一本鎖ＤＮＡ断
片の配列情報を得る請求項１ないし７のいずれかに記載
の遺伝子解析方法。
【請求項９】前記インタカレータがエチジウムブロミド
である請求項２ないし８のいずれかに記載の遺伝子解析
方法。
【請求項１０】一つまたは複数の種類の一本鎖ＤＮＡ断
片を有する試料溶液を保持する手段、該一本鎖ＤＮＡ断
片を有する試料溶液の紫外領域の吸光度を計測する分光
手段と、該一本鎖断片が所定の条件のもとで形成する高
次構造を変性させるために前記試料溶液に所定の変性の
条件に応じた作用をおよぼす変性手段および該変性の条
件を制御する変性条件制御手段と、該変性条件制御の信
号と該分光計測の信号とを入力し蓄積し処理する信号処
理手段とを具備し、該変性条件制御手段によって該一本
鎖ＤＮＡ断片の高次構造の変性条件を変化させながら、
該一本鎖ＤＮＡ断片試料の該変性条件変化に対する変性
曲線データを得て、該変性曲線データと前記検体二本鎖
ＤＮＡ断片に対応する既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片から
得られた一本鎖ＤＮＡ断片による高次構造が変性すると
きの変性条件による変性曲線データを比較するし、該比
較結果から前記検体二本鎖ＤＮＡ断片を前記既知の多型
二本鎖ＤＮＡ断片との対応関係に応じて表示することを
特徴とする遺伝子解析装置。
【請求項１１】一つまたは複数の種類の一本鎖ＤＮＡ断
片を有する試料溶液を保持する手段、該試料溶液内の一
本鎖ＤＮＡ断片が高次構造を形成するとき相補配列が形
成する塩基対合に所定波長の励起光を受けて所定波長の
蛍光を発するインターカレータをインターカレートする
手段、該インターカレータをインターカレートした一本
鎖ＤＮＡ断片に該所定波長の励起光を照射する手段、該
励起光の照射の下に該一本鎖ＤＮＡ断片の高次構造の変
性条件を変化させながら、該一本鎖ＤＮＡ断片試料の該
変性条件変化に対する変性曲線データを得て、該変性曲
線データと前記検体二本鎖ＤＮＡ断片に対応する既知の
多型二本鎖ＤＮＡ断片から得られた一本鎖ＤＮＡ断片に
よる高次構造が変性するときの変性条件による変性曲線
データを比較するし、該比較結果から前記検体二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を前記既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片との対応関
係に応じて表示することを特徴とする遺伝子解析装置。
【請求項１２】前記検体二本鎖ＤＮＡ断片の変性曲線デ
ータと既知の変性曲線データとの比較が予め準備された
既知の変性曲線データの一つまたは複数の鋳型曲線の線
形結合によって作られる曲線の全ての組み合わせと、新
たに計測し入力された信号曲線とを比較し、最も統計的
誤差の少ない該鋳型曲線もしくはその線形結合によって
作られた曲線の基となる該鋳型曲線の組み合わせを、検
体二本鎖ＤＮＡ断片の計測された一本鎖ＤＮＡ断片の配
列特徴とする請求項１０または１１記載の遺伝子解析装
置。
【請求項１３】前記検体二本鎖ＤＮＡ断片の変性曲線デ
ータと既知の変性曲線データとの比較が予め準備された
既知の変性曲線データの一つまたは複数の鋳型曲線の線
形結合によって作られる曲線の全ての組み合わせと、新
たに計測し入力された信号曲線とを比較し、最も統計的
誤差の少ない該鋳型曲線もしくはその線形結合によって
作られた曲線の基となる該鋳型曲線の組み合わせを、、
検体二本鎖ＤＮＡ断片の計測された一本鎖ＤＮＡ断片の
配列特徴として、統計誤差の小さい順に所定数表示する
請求項１０または１１記載の遺伝子解析装置。
【請求項１４】前記変性条件が温度であり、変性曲線デ
ータが温度に対する試料の吸光度または蛍光強度の変化
で得られるものである請求項１０、１１、１２または１
３記載の遺伝子解析装置。
【請求項１５】前記変性条件が水素イオン濃度であり、
変性曲線データが水素イオン濃度に対する試料の吸光度
または蛍光強度の変化で得られるものである請求項１
０、１１、１２または１３記載の遺伝子解析装置。
【請求項１６】前記変性条件が変性剤ホルムアミド濃度
であり、変性曲線データが変性剤ホルムアミド濃度に対
する試料の吸光度または蛍光強度の変化で得られるもの
である請求項１０、１１、１２または１３記載の遺伝子
解析装置。
【請求項１７】前記変性条件変化に対する吸光度変化の
曲線を、変性条件を変性が進行する向きと、逆に高次構
造が形成される向きに交互に連続的に変化させ、該変化
に応じて起こる該吸光度または蛍光強度の変化のヒステ
リシス特性を計測し解析することによって一本鎖ＤＮＡ
断片の配列情報を得る請求項１０ないし１６のいずれか
に記載の遺伝子解析装置。
【請求項１８】前記インタカレータがエチジウムブロミ
ドである請求項１１ないし１７のいずれかに記載の遺伝
子解析装置。
【請求項１９】特定遺伝子領域を選択的に増幅する反応
を行なわせるとともに、解析対象の１本鎖ＤＮＡ断片を
得る酵素反応手段と、該一本鎖ＤＮＡ断片を有する試料
溶液を保持する手段、該一本鎖ＤＮＡ断片を有する試料
溶液の紫外領域の吸光度を計測する分光手段と、該一本
鎖断片が所定の条件のもとで形成する高次構造を変性さ
せるために前記試料溶液に所定の変性の条件に応じた作
用をおよぼす変性手段および該変性の条件を制御する変
性条件制御手段と、該変性条件制御の信号と該分光計測
の信号とを入力し蓄積し処理する信号処理手段とを具備
し、該変性条件制御手段によって該一本鎖ＤＮＡ断片の
高次構造の変性条件を変化させながら、該一本鎖ＤＮＡ
断片試料の該変性条件変化に対する変性曲線データを得
て、該変性曲線データと前記検体二本鎖ＤＮＡ断片に対
応する既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片から得られた一本鎖
ＤＮＡ断片による高次構造が変性するときの変性条件に
よる変性曲線データを比較するし、該比較結果から前記
検体二本鎖ＤＮＡ断片を前記既知の多型二本鎖ＤＮＡ断
片の一つと特定することを特徴とする遺伝子解析装置。
【請求項２０】前記一本鎖ＤＮＡが、ＰＣＲ等によって
予め領域選択的に増幅もしくは濃縮された特定領域ＤＮ
Ａ断片をもとに調製された特定領域一本鎖ＤＮＡ断片で
ある、請求項第１９項記載の遺伝子解析装置。
【請求項２１】該一本鎖ＤＮＡが、ＰＣＲ時に用いる一
組のプライマの量比を非等量に設定し目的の一本鎖ＤＮ
Ａのみを過剰に複製せしむる非対称ＰＣＲによって予め
領域選択的に増幅された特定領域一本鎖ＤＮＡ断片であ
る請求項第２０項記載の遺伝子解析装置。
【請求項２２】該一本鎖ＤＮＡが、予め担体に固定され
た一種類のプライマと、固定されていない他のプライマ
により増幅されたＰＣＲ増幅産物から、該担体に固定さ
れていない一本鎖ＤＮＡか、もしくは該担体に固定され
ている一本鎖ＤＮＡのどちらか一方を除くことにより調
製した特定領域一本鎖ＤＮＡ断片である請求項第２０ま
たは２１項記載の遺伝子解析装置。
【請求項２３】検体二本鎖ＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ
断片を準備すること、該一本鎖ＤＮＡ断片の高次構造を
所定の変性条件によって変性させること、該変性条件と
変性の結果との関係を示す変性曲線データを得ること、
該変性曲線データと前記検体二本鎖ＤＮＡ断片に対応す
る既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片から得られた一本鎖ＤＮ
Ａ断片による高次構造が変性するときの変性条件による
変性曲線データを比較することとよりなり、該比較が、
予め準備された既知の鋳型変性曲線データを所定の関数
の組み合わせとして定義したものと、新たに計測し入力
された信号曲線データを所定の関数の組み合わせとして
定義したものとを比較し、最も統計的誤差の少ない該鋳
型曲線データを検体二本鎖ＤＮＡ断片の計測された一本
鎖ＤＮＡ断片の配列特徴とする遺伝子解析方法。
【請求項２４】一つまたは複数の種類の一本鎖ＤＮＡ断
片を有する試料溶液を保持する手段、該一本鎖ＤＮＡ断
片を有する試料溶液の紫外領域の吸光度を計測する分光
手段と、該一本鎖断片が所定の条件のもとで形成する高
次構造を変性させるために前記試料溶液に所定の変性の
条件に応じた作用をおよぼす変性手段および該変性の条
件を制御する変性条件制御手段と、該変性条件制御の信
号と該分光計測の信号とを入力し蓄積し処理する信号処
理手段とを具備し、該変性条件制御手段によって該一本
鎖ＤＮＡ断片の高次構造の変性条件を変化させながら、
該一本鎖ＤＮＡ断片試料の該変性条件変化に対する変性
曲線データを得て、該変性曲線データと前記検体二本鎖
ＤＮＡ断片に対応する既知の多型二本鎖ＤＮＡ断片から
得られた一本鎖ＤＮＡ断片による高次構造が変性すると
きの変性条件による変性曲線データを比較して、検体二
本鎖ＤＮＡ断片の計測された一本鎖ＤＮＡ断片の配列特
徴とする遺伝子解析装置であって、該比較が、予め準備
された既知の鋳型変性曲線データを所定の関数の組み合
わせとして定義したものと、新たに計測し入力された信
号曲線データを所定の関数の組み合わせとして定義した
ものとの比較であることを特徴とする遺伝子解析装置。