JPH08191689A - ヒト・ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド発現用のポリデオキシリボヌクレオチド - Google Patents
ヒト・ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド発現用のポリデオキシリボヌクレオチドInfo
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒト・ガンマ・インターフエロン様ポリペプチ
ドの発現に用いるＤＮＡ配列、プラスミドおよび菌株を
提供する。 【構成】ヒト・ガンマ・インターフエロン様ポリペプチ
ドをコードする１４６のコドン配列よりなるポリデオキ
シリボヌクレオチド、それが組み込まれたプラスミドお
よびそのプラスミドで形質転換されたエシエリシア・コ
リ。 【効果】上記の形質転換菌株を培養することによりヒト
・ガンマ・インターフエロンとアミノ酸配列および組成
が実質的に一致しかつヒト・ガンマ・インターフエロン
の免疫学的、生物学的活性を有するポリペプチドが発現
される。
ドの発現に用いるＤＮＡ配列、プラスミドおよび菌株を
提供する。 【構成】ヒト・ガンマ・インターフエロン様ポリペプチ
ドをコードする１４６のコドン配列よりなるポリデオキ
シリボヌクレオチド、それが組み込まれたプラスミドお
よびそのプラスミドで形質転換されたエシエリシア・コ
リ。 【効果】上記の形質転換菌株を培養することによりヒト
・ガンマ・インターフエロンとアミノ酸配列および組成
が実質的に一致しかつヒト・ガンマ・インターフエロン
の免疫学的、生物学的活性を有するポリペプチドが発現
される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学によるヒト・
ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド（以下γ−Ｉ
ＦＮと略称する）の製造に関する。
ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド（以下γ−Ｉ
ＦＮと略称する）の製造に関する。
【０００２】本明細書に開示する化学合成ＤＮＡ分子
は、アミノ酸順序と組成とがヒト・ガンマ・インターフ
ェロンと実質的に一致し、かつヒト・ガンマ・インター
フェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリ
ペプチドを暗号化するＤＮＡ順序を特徴とする。
は、アミノ酸順序と組成とがヒト・ガンマ・インターフ
ェロンと実質的に一致し、かつヒト・ガンマ・インター
フェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリ
ペプチドを暗号化するＤＮＡ順序を特徴とする。
【０００３】
【従来の技術】インターフェロンは細胞に抗ビールス状
態を誘発し、また抗腫瘍性を示すといわれているたん白
質でアルファ，ベータ，ガンマの３群に分類されてい
る。
態を誘発し、また抗腫瘍性を示すといわれているたん白
質でアルファ，ベータ，ガンマの３群に分類されてい
る。
【０００４】γ−ＩＦＮについては、メッセンジャーＲ
ＮＡから逆転写酵素によって造った遺伝子を用いて遺伝
子工学的手法によりγ−ＩＦＮを生成させることが報告
されている（Ｎａｔｕｒｅ ２９５，５０３，１９８
２）が遺伝子の配列がメッセンジャーＲＮＡによって規
定されているため宿主細胞に適したコドンを選ぶことが
できないなどの欠点がある。
ＮＡから逆転写酵素によって造った遺伝子を用いて遺伝
子工学的手法によりγ−ＩＦＮを生成させることが報告
されている（Ｎａｔｕｒｅ ２９５，５０３，１９８
２）が遺伝子の配列がメッセンジャーＲＮＡによって規
定されているため宿主細胞に適したコドンを選ぶことが
できないなどの欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】γ−ＩＦＮ遺伝子を化
学的に合成すれば上記の欠点を克服でき、また任意に制
限酵素切断部位を付加することによりキメリックなポリ
ペプチドの造成も可能と考えられるが、該遺伝子は数百
塩基対で構成されるため合成が容易でない。
学的に合成すれば上記の欠点を克服でき、また任意に制
限酵素切断部位を付加することによりキメリックなポリ
ペプチドの造成も可能と考えられるが、該遺伝子は数百
塩基対で構成されるため合成が容易でない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこの困難に
挑んでγ−ＩＦＮ遺伝子の合成に成功し、この遺伝子を
用いて遺伝子工学的手法によりγ−ＩＦＮの製造する方
法を開拓した。
挑んでγ−ＩＦＮ遺伝子の合成に成功し、この遺伝子を
用いて遺伝子工学的手法によりγ−ＩＦＮの製造する方
法を開拓した。
【０００７】本発明は下記ヌクレオチド配列を有するポ
リデオキシリボヌクレオチド １ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＴＣ １０ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ２０ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ３０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＡＣ ４０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＧＡ ＣＴＧ ＧＣＡ ５０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ６０ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ７０ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＧＡ ８０ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｎ ＧＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ９０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＧＡ １００ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ １１０ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ １２０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＡ １３０ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ １４０ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＡ １４６ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ およびそれが組み込まれたプラスミド、ならびにこのプ
ラスミドで形質転換されたエシエリシア・コリに属する
菌株に関する。
リデオキシリボヌクレオチド １ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＴＣ １０ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ２０ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ３０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＡＣ ４０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＧＡ ＣＴＧ ＧＣＡ ５０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ６０ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ７０ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＧＡ ８０ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｎ ＧＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ９０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＧＡ １００ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ １１０ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ １２０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＡ １３０ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ １４０ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＡ １４６ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ およびそれが組み込まれたプラスミド、ならびにこのプ
ラスミドで形質転換されたエシエリシア・コリに属する
菌株に関する。
【０００８】上記のポリデオキシリボヌクレオチドの好
ましい例としては、図２に示される１−１４６のアミノ
酸配列をコードする配列を有し、５′−末端にＡＴＧの
ような翻訳開始コード、３′末端にＴＡＡのような翻訳
終止コードを有するものが挙げられる。
ましい例としては、図２に示される１−１４６のアミノ
酸配列をコードする配列を有し、５′−末端にＡＴＧの
ような翻訳開始コード、３′末端にＴＡＡのような翻訳
終止コードを有するものが挙げられる。
【０００９】遺伝子操作の便宜上、翻訳開始および終止
コードの各末端に制限酵素により切断されるヌクレオチ
ド配列を付加するのがよく、その好ましい例は５′末側
にＥｃｏＲＩで切断されるヌクレオチド配列、３′末側
にＳａｌＩで切断されるヌクレオチド配列を付加したも
のである。
コードの各末端に制限酵素により切断されるヌクレオチ
ド配列を付加するのがよく、その好ましい例は５′末側
にＥｃｏＲＩで切断されるヌクレオチド配列、３′末側
にＳａｌＩで切断されるヌクレオチド配列を付加したも
のである。
【００１０】上記のポリデオキシリボヌクレオチドは、
たとえば次のようにして合成することができる。先ず図
１に示される６２個の遺伝子断片（オリゴデオキシリボ
ヌクレオチド）をそれ自体公知の改良トリエステル法お
よび固相法を用いて合成し、次にこれらの断片をＴ４リ
ガーゼを用いて結合し完全なγ−ＩＦＮ遺伝子（図２参
照）とする。この合成遺伝子には図７に示すように制限
酵素切断部位が含まれている。これは活性部位構造の探
索やキメリックな遺伝子の造成を容易にするためであ
る。
たとえば次のようにして合成することができる。先ず図
１に示される６２個の遺伝子断片（オリゴデオキシリボ
ヌクレオチド）をそれ自体公知の改良トリエステル法お
よび固相法を用いて合成し、次にこれらの断片をＴ４リ
ガーゼを用いて結合し完全なγ−ＩＦＮ遺伝子（図２参
照）とする。この合成遺伝子には図７に示すように制限
酵素切断部位が含まれている。これは活性部位構造の探
索やキメリックな遺伝子の造成を容易にするためであ
る。
【００１１】次いで、上記の遺伝子をベクタープラスミ
ドに組み込む。その操作の一例は下記のようである。先
ずエシエリシア・コリのラクトースオペロンのプロモー
ター領域（９ｇ塩基対）をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩお
よびＣｌａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＫＯ７０
３を造成し、該プラスミドのＥｃｏＲＩとＳａｌＩ切断
部位に図２に示される５′末側にＥｃｏＲＩ、３′末側
にＳａｌＩ切断部位をもつ合成遺伝子を挿入してプラス
ミドｐＧＩＦを造成する（図９参照）。
ドに組み込む。その操作の一例は下記のようである。先
ずエシエリシア・コリのラクトースオペロンのプロモー
ター領域（９ｇ塩基対）をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩお
よびＣｌａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＫＯ７０
３を造成し、該プラスミドのＥｃｏＲＩとＳａｌＩ切断
部位に図２に示される５′末側にＥｃｏＲＩ、３′末側
にＳａｌＩ切断部位をもつ合成遺伝子を挿入してプラス
ミドｐＧＩＦを造成する（図９参照）。
【００１２】所望により、γ−ＩＦＮ遺伝子以外の遺伝
子を上記切断部位に挿入したプラスミドを造成し、この
プラスミドで形質転換した宿主細胞を培養すれば、ラク
トースプロモーターの支配下に該遺伝子による生産物を
生成させることができるので有利である。
子を上記切断部位に挿入したプラスミドを造成し、この
プラスミドで形質転換した宿主細胞を培養すれば、ラク
トースプロモーターの支配下に該遺伝子による生産物を
生成させることができるので有利である。
【００１３】宿主細胞としては、エシエリシア・コリに
属する菌株が用いられる。前記のように得たプラスミド
ｐＧＩＦを用いてエシエリシア属の菌株に形質転換す
る。菌株としてエシエリシア・コリＷＡ８０２を用いた
場合、形質転換株ＷＡ８０２／ｐＧＩＦが得られ、同株
はアンピシリン耐性（Ａｍｐr ）およびテトラサイクリ
ン感受性（Ｔｅｔs ）を有するので、それを利用して非
形質転換菌より分離することができる。
属する菌株が用いられる。前記のように得たプラスミド
ｐＧＩＦを用いてエシエリシア属の菌株に形質転換す
る。菌株としてエシエリシア・コリＷＡ８０２を用いた
場合、形質転換株ＷＡ８０２／ｐＧＩＦが得られ、同株
はアンピシリン耐性（Ａｍｐr ）およびテトラサイクリ
ン感受性（Ｔｅｔs ）を有するので、それを利用して非
形質転換菌より分離することができる。
【００１４】この形質転換株をたとえばＬ−ブロスのよ
うな培地中でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドを用いて誘導培養すると得られる菌体内にインタ
ーフェロン活性物質が生産される。
うな培地中でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドを用いて誘導培養すると得られる菌体内にインタ
ーフェロン活性物質が生産される。
【００１５】なお、エシエリシア・コリＷＡ８０２／ｐ
ＧＩＦ４はＳＢＭＧ１０５の識別表示を付して工業技術
院微生物工業研究所に寄託され、受託番号微工研菌寄第
６５２２号を付されている。
ＧＩＦ４はＳＢＭＧ１０５の識別表示を付して工業技術
院微生物工業研究所に寄託され、受託番号微工研菌寄第
６５２２号を付されている。
【００１６】
【実施例】以下実施例の形で本発明の態様を説明する
が、エシエリシア・コリは大腸菌と記載されている。
が、エシエリシア・コリは大腸菌と記載されている。
【００１７】 実施例 γ−ＩＦＮ遺伝子フラグメントの化学合成 図１に示したそれぞれＦ1 〜Ｆ62と名付けた６２個のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成は、以下に述
べる改良を除いては、基本的にはＫｅｎ−ｉｃｈｉ Ｍ
ｉｙｏｓｈｉ等により報告されている固相法〔Ｋｅｎ−
ｉｃｈｉ Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ ５５０７〕を用い
た。
リゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成は、以下に述
べる改良を除いては、基本的にはＫｅｎ−ｉｃｈｉ Ｍ
ｉｙｏｓｈｉ等により報告されている固相法〔Ｋｅｎ−
ｉｃｈｉ Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ ５５０７〕を用い
た。
【００１８】この改良技術によるオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの化学合成の概略は以下のごとくである。 ａ） 先ず図３に示す様にアミノメチル化ポリスチレン
樹脂に３′末端モノヌクレオシド、ユニットを固定化す
ることからはじめた。すなわち図３に示したアミノメチ
ル化ポリスチレン樹脂は１％ジビニルベンゼンで架橋
した樹脂を用い、この樹脂にβ−アラニンを２個連結し
た樹脂を合成した。この樹脂に３種類（Ｂはチミン，
Ｎ−ベンゾイルシトシン又はＮ−イソブチリルグアニ
ン）の化合物を作用させることにより、３種類の３′
末端ヌクレオサイドを樹脂に固定化した。ポリスチレン
樹脂を得た。
クレオチドの化学合成の概略は以下のごとくである。 ａ） 先ず図３に示す様にアミノメチル化ポリスチレン
樹脂に３′末端モノヌクレオシド、ユニットを固定化す
ることからはじめた。すなわち図３に示したアミノメチ
ル化ポリスチレン樹脂は１％ジビニルベンゼンで架橋
した樹脂を用い、この樹脂にβ−アラニンを２個連結し
た樹脂を合成した。この樹脂に３種類（Ｂはチミン，
Ｎ−ベンゾイルシトシン又はＮ−イソブチリルグアニ
ン）の化合物を作用させることにより、３種類の３′
末端ヌクレオサイドを樹脂に固定化した。ポリスチレン
樹脂を得た。
【００１９】この樹脂の合成法の例を図３中ＢはＮ−
イソブチリルグアニンの場合について示せば次の通りで
ある。アミノメチル化ポリスチレン・ＨＣｌ（ジビニル
ベンゼン１％，１００〜２００メッシュ，ＮＨ2 ：０．
６３ｍｍｏｌｅ／ｇ）樹脂２０ｇをＣＨ2 Ｃｌ2 １００
ｍｌでよく膨潤させた後、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−β−アラニ
ン（１．３４ｇ，１５．１ｍｍｏｌｅ）を加え、ＤＣＣ
（３．１ｌ，１５．１ｍｍｏｌｅ）を用いて室温３時間
縮合した。樹脂をガラスフィルターでろ別した後、ＣＨ
2 Ｃｌ2 ２００ｍｌで２回，ＤＭＦ１５０ｍｌで３回，
次いでピリジン１００ｍｌで３回洗う。次に２５％の無
水酢酸−ピリジン１００ｍｌで１時間樹脂を処理するこ
とにより未反応アミノ基をアセチル化した。次の樹脂を
２０％ＣＦ3 ＣＯＯＨ−ＣＨ2 Ｃｌ2 １２０ｍｌで室温
３０分処理することによりｔ−ＢＯＣ基を除去、次いで
５％トリエチルアミン−ＣＨ2 Ｃｌ2 ２００ｍｌで樹脂
を洗浄し、さらにＣＨ2 Ｃｌ2 １００ｍｌで４回樹脂を
洗った。同様の操作をもう一度くり返すことにより、図
３２の樹脂すなわち、アミノメチル化ポリスチレン樹脂
にβ−ａｌａｎｉｎｅが２個連結した樹脂を得た。ここ
で得た樹脂（図３）１０ｇをＤＭＦ６０ｍｌにけんだ
くし、図３化合物（ＢはＮ−イソブチリルグアニン）
１１ｍｍｏｌｅとトリエチルアミン１ｍｌを加え室温１
２時間振盪した。反応後、樹脂をろ別し、ＤＭＦ、続い
てピリジンで洗った後、１０％フェニルイソシアナート
ピリジン１５０ｍｌで３時間樹脂を処理することによ
り、未反応アミノ基を保護し、続いて樹脂をピリジン，
メタノールで洗った後Ｐ2 Ｏ5 存在下、減圧乾燥するこ
とにより、図３樹脂（ＢはＮ−イソブチリルグアニ
ン）を得た。
イソブチリルグアニンの場合について示せば次の通りで
ある。アミノメチル化ポリスチレン・ＨＣｌ（ジビニル
ベンゼン１％，１００〜２００メッシュ，ＮＨ2 ：０．
６３ｍｍｏｌｅ／ｇ）樹脂２０ｇをＣＨ2 Ｃｌ2 １００
ｍｌでよく膨潤させた後、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−β−アラニ
ン（１．３４ｇ，１５．１ｍｍｏｌｅ）を加え、ＤＣＣ
（３．１ｌ，１５．１ｍｍｏｌｅ）を用いて室温３時間
縮合した。樹脂をガラスフィルターでろ別した後、ＣＨ
2 Ｃｌ2 ２００ｍｌで２回，ＤＭＦ１５０ｍｌで３回，
次いでピリジン１００ｍｌで３回洗う。次に２５％の無
水酢酸−ピリジン１００ｍｌで１時間樹脂を処理するこ
とにより未反応アミノ基をアセチル化した。次の樹脂を
２０％ＣＦ3 ＣＯＯＨ−ＣＨ2 Ｃｌ2 １２０ｍｌで室温
３０分処理することによりｔ−ＢＯＣ基を除去、次いで
５％トリエチルアミン−ＣＨ2 Ｃｌ2 ２００ｍｌで樹脂
を洗浄し、さらにＣＨ2 Ｃｌ2 １００ｍｌで４回樹脂を
洗った。同様の操作をもう一度くり返すことにより、図
３２の樹脂すなわち、アミノメチル化ポリスチレン樹脂
にβ−ａｌａｎｉｎｅが２個連結した樹脂を得た。ここ
で得た樹脂（図３）１０ｇをＤＭＦ６０ｍｌにけんだ
くし、図３化合物（ＢはＮ−イソブチリルグアニン）
１１ｍｍｏｌｅとトリエチルアミン１ｍｌを加え室温１
２時間振盪した。反応後、樹脂をろ別し、ＤＭＦ、続い
てピリジンで洗った後、１０％フェニルイソシアナート
ピリジン１５０ｍｌで３時間樹脂を処理することによ
り、未反応アミノ基を保護し、続いて樹脂をピリジン，
メタノールで洗った後Ｐ2 Ｏ5 存在下、減圧乾燥するこ
とにより、図３樹脂（ＢはＮ−イソブチリルグアニ
ン）を得た。
【００２０】ここで得られた樹脂（図３、ＢはＮ−イ
ソブチリルグアニン）の一部をＭ．Ｊ．Ｇａｉｔらの方
法〔Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ，（１９８０）Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ １０８１〕を用いて樹
脂１ｇに固定化されている３′末端ヌクレオサイドの量
を定量したところ、０．１２ｍｍｏｌｅであった。樹脂
（Ｂはチミン又はＮ−ベンゾイルシトシン）も上記合
成法と同様な方法で製造した。樹脂の１ｇに固定化さ
れている３′末端ヌクレオシドの量はＢがチミンの場合
０．１２６ｍｍｏｌｅ、ＢがＮ−ベンゾイルシトシンの
場合０．１２５ｍｍｏｌｅであった。 ｂ） ここで得られた３種類の樹脂と図４に示した
３′燐酸ジエステルダイマーブロック（図４ｎは０）及
び３′燐酸ジエステルトリマーブロック（図４ｎは１）
を用い、一定の塩基配列を持ったＦ1 〜Ｆ62からなる６
２個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。即
ち、樹脂のジメトキシトリチル基（以下ＤＭＴｒと
略）を１０％トリクロル酢酸（以下ＴＣＡと略）−ＣＨ
Ｃｌ3 で処理することによりＤＭＴｒ基を除去した後、
樹脂に固定化されている３′ヌクレオシドユニット１
当量に対し、３′燐酸ジエステルダイマー（図４ｎは
０）４当量、又は３′燐酸ジエステルトリマー（図４、
ｎは１）３当量を逐次、縮合剤メシチレンスルホニルテ
トラゾリド（ＭｓＴｅ）２０〜５０当量を用いて縮合し
た。過剰の３′燐酸ジエステルブロック及び縮合剤は、
ガラスフィルターで反応混合物をろ化することにより容
易に除去することができる。
ソブチリルグアニン）の一部をＭ．Ｊ．Ｇａｉｔらの方
法〔Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ，（１９８０）Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ １０８１〕を用いて樹
脂１ｇに固定化されている３′末端ヌクレオサイドの量
を定量したところ、０．１２ｍｍｏｌｅであった。樹脂
（Ｂはチミン又はＮ−ベンゾイルシトシン）も上記合
成法と同様な方法で製造した。樹脂の１ｇに固定化さ
れている３′末端ヌクレオシドの量はＢがチミンの場合
０．１２６ｍｍｏｌｅ、ＢがＮ−ベンゾイルシトシンの
場合０．１２５ｍｍｏｌｅであった。 ｂ） ここで得られた３種類の樹脂と図４に示した
３′燐酸ジエステルダイマーブロック（図４ｎは０）及
び３′燐酸ジエステルトリマーブロック（図４ｎは１）
を用い、一定の塩基配列を持ったＦ1 〜Ｆ62からなる６
２個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。即
ち、樹脂のジメトキシトリチル基（以下ＤＭＴｒと
略）を１０％トリクロル酢酸（以下ＴＣＡと略）−ＣＨ
Ｃｌ3 で処理することによりＤＭＴｒ基を除去した後、
樹脂に固定化されている３′ヌクレオシドユニット１
当量に対し、３′燐酸ジエステルダイマー（図４ｎは
０）４当量、又は３′燐酸ジエステルトリマー（図４、
ｎは１）３当量を逐次、縮合剤メシチレンスルホニルテ
トラゾリド（ＭｓＴｅ）２０〜５０当量を用いて縮合し
た。過剰の３′燐酸ジエステルブロック及び縮合剤は、
ガラスフィルターで反応混合物をろ化することにより容
易に除去することができる。
【００２１】次に未反応５′水酸基を保護する為に、樹
脂を１０％無水酢酸−ピリジンで室温１時間処理するか
又は、１０％無水酢酸−ピリジン１０ｍｌに対し、４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）２０ｍｇを加えた
溶液で室温３０分処理することにより未反応５′水酸基
をアセチル化した。次に樹脂を１０％ＴＣＡで処理する
ことにより５′末端ＤＭＴｒ基を除去し、次の縮合反応
を行った。このような操作を所望の長さが得られるまで
くり返した。
脂を１０％無水酢酸−ピリジンで室温１時間処理するか
又は、１０％無水酢酸−ピリジン１０ｍｌに対し、４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）２０ｍｇを加えた
溶液で室温３０分処理することにより未反応５′水酸基
をアセチル化した。次に樹脂を１０％ＴＣＡで処理する
ことにより５′末端ＤＭＴｒ基を除去し、次の縮合反応
を行った。このような操作を所望の長さが得られるまで
くり返した。
【００２２】この一連の操作の例をＦ16フラグメントの
合成について示せば次の通りである。図３樹脂（Ｂは
Ｎ−イソブチリルグアニン）２００ｍｇを１０％ＴＣＡ
−ＣＨＣｌ3 ２０ｍｌで３０秒、３回処理することによ
り樹脂のＤＭＴｒ基を除去した樹脂を得た。この樹
脂に３′燐酸ダイマーブロック、ＣＡ，（図４、ｎ＝
０，Ｂ1 はＮ−ベンゾイルシトシン、Ｂ3 はＮ−ベンゾ
イルアデニン）９６μｍｏｌｅを加えピリジン３ｍｌと
３回共沸をくり返した後、ピリジン２ｍｌにけんだくさ
せ、縮合剤ＭｓＴｅ １ｍｍｏｌｅを用いて室温２時間
縮合反応を行った。反応後、過剰の３′燐酸ダイマー及
び縮合剤は反応混合物をガラスフィルターを用いてろ別
した後、得られる樹脂をピリジンでよく洗うことにより
容易に除去できる。次に未反応５′水酸基を保護する為
に樹脂を１０％無水酢酸−ピリジン２０ｍｌにけんだく
させ室温１時間振盪した。反応後、樹脂をグラスフィル
ターを用いてろ別し、ピリジン、続いてＣＨＣｌ3 でよ
く洗う。次に樹脂を１０％ＴＣＡ−ＣＨＣｌ3 ２０ｍｌ
で３０秒、３回処理することにより樹脂よりＤＭＴｒ基
を除去した。次に樹脂をＣＨＣｌ3 続いてピリジンでよ
く洗った後、同様にして所望の長さが得られるまでブロ
ック縮合を繰り返した。すなわちＦ−１６のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを合成する為には、ひきつづき次
の３′燐酸ダイマーブロック、ＣＣ，ＴＡ，ＧＡ，Ｔ
Ｃ，を順次用い、縮合反応をくり返すことによりＦ−１
６の塩基配列をもつ完全保護したオリゴデオキシリボヌ
クレオチド樹脂を得た。同様にして他のフラグメントＦ
1 〜Ｆ15及びＦ17〜Ｆ62の各フラグメントもヌクレオチ
ドの組合せを変えるほかは上記と同様な方法を用いて製
造した。
合成について示せば次の通りである。図３樹脂（Ｂは
Ｎ−イソブチリルグアニン）２００ｍｇを１０％ＴＣＡ
−ＣＨＣｌ3 ２０ｍｌで３０秒、３回処理することによ
り樹脂のＤＭＴｒ基を除去した樹脂を得た。この樹
脂に３′燐酸ダイマーブロック、ＣＡ，（図４、ｎ＝
０，Ｂ1 はＮ−ベンゾイルシトシン、Ｂ3 はＮ−ベンゾ
イルアデニン）９６μｍｏｌｅを加えピリジン３ｍｌと
３回共沸をくり返した後、ピリジン２ｍｌにけんだくさ
せ、縮合剤ＭｓＴｅ １ｍｍｏｌｅを用いて室温２時間
縮合反応を行った。反応後、過剰の３′燐酸ダイマー及
び縮合剤は反応混合物をガラスフィルターを用いてろ別
した後、得られる樹脂をピリジンでよく洗うことにより
容易に除去できる。次に未反応５′水酸基を保護する為
に樹脂を１０％無水酢酸−ピリジン２０ｍｌにけんだく
させ室温１時間振盪した。反応後、樹脂をグラスフィル
ターを用いてろ別し、ピリジン、続いてＣＨＣｌ3 でよ
く洗う。次に樹脂を１０％ＴＣＡ−ＣＨＣｌ3 ２０ｍｌ
で３０秒、３回処理することにより樹脂よりＤＭＴｒ基
を除去した。次に樹脂をＣＨＣｌ3 続いてピリジンでよ
く洗った後、同様にして所望の長さが得られるまでブロ
ック縮合を繰り返した。すなわちＦ−１６のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを合成する為には、ひきつづき次
の３′燐酸ダイマーブロック、ＣＣ，ＴＡ，ＧＡ，Ｔ
Ｃ，を順次用い、縮合反応をくり返すことによりＦ−１
６の塩基配列をもつ完全保護したオリゴデオキシリボヌ
クレオチド樹脂を得た。同様にして他のフラグメントＦ
1 〜Ｆ15及びＦ17〜Ｆ62の各フラグメントもヌクレオチ
ドの組合せを変えるほかは上記と同様な方法を用いて製
造した。
【００２３】ｃ） この様にして得た一定の塩基配列を
もって完全保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの
樹脂からの切り出し及び完全脱保護反応は、樹脂を濃ア
ンモニア水−ピリジン（２：１ｖ／ｖ）で５５℃１０時
間、つづいて８０％酢酸で室温１０分処理することによ
り得た（方法Ａ）。しかしながらフラグメント、Ｆ2 ，
Ｆ3 ，Ｆ5 ，Ｆ7 〜Ｆ10，Ｆ22〜Ｆ24，Ｆ26，Ｆ29，Ｆ
30，Ｆ33〜Ｆ42，Ｆ53〜Ｆ55，Ｆ57〜Ｆ62，はこの脱保
護条件では得ることができなかった。そこで、これらの
フラグメントについてＲｅｅｓｅらの方法〔Ｃ．Ｂ．Ｒ
ｅｅｓｅ，ｅｔａｌ，（１９８１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．９，４６１１〕を用いて完全脱保護した
（方法Ｂ）。
もって完全保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの
樹脂からの切り出し及び完全脱保護反応は、樹脂を濃ア
ンモニア水−ピリジン（２：１ｖ／ｖ）で５５℃１０時
間、つづいて８０％酢酸で室温１０分処理することによ
り得た（方法Ａ）。しかしながらフラグメント、Ｆ2 ，
Ｆ3 ，Ｆ5 ，Ｆ7 〜Ｆ10，Ｆ22〜Ｆ24，Ｆ26，Ｆ29，Ｆ
30，Ｆ33〜Ｆ42，Ｆ53〜Ｆ55，Ｆ57〜Ｆ62，はこの脱保
護条件では得ることができなかった。そこで、これらの
フラグメントについてＲｅｅｓｅらの方法〔Ｃ．Ｂ．Ｒ
ｅｅｓｅ，ｅｔａｌ，（１９８１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．９，４６１１〕を用いて完全脱保護した
（方法Ｂ）。
【００２４】これらの脱保護反応操作をフラグメントＦ
16及びＦ26について記せば次のごとくである。
16及びＦ26について記せば次のごとくである。
【００２５】方法Ａ：フラグメントＦ16の樹脂５０ｍｇ
をピリジン１ｍｌと濃アンモニア水２ｍｌで封管中５５
℃，１０時間振盪した後、樹脂をろ別、ろ液を減圧下濃
縮する。得られた残渣にトルエンを加え共沸をくり返す
ことによりピリジンを除く。次に、残渣に８０％酢酸２
ｍｌを加え室温１０分処理することにより完全脱保護し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドを得た。
をピリジン１ｍｌと濃アンモニア水２ｍｌで封管中５５
℃，１０時間振盪した後、樹脂をろ別、ろ液を減圧下濃
縮する。得られた残渣にトルエンを加え共沸をくり返す
ことによりピリジンを除く。次に、残渣に８０％酢酸２
ｍｌを加え室温１０分処理することにより完全脱保護し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドを得た。
【００２６】方法Ｂ：フラグメントＦ26の樹脂５０ｍｇ
をジオキサン−水（７：１ｖ／ｖ）３．５ｍｌに溶かし
た０．３Ｍの１，１，４，４，−テトラメチルグアニジ
ウム ２−ピリジンアルドキシメートで４０℃４８時間
処理した後、濃アンモニア水−ピリジン（２：１ｖ／
ｖ）３ｍｌで封管中５５℃，１０時間処理した。続いて
８０％酢酸２ｍｌで室温２０分処理することにより、完
全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドを得た。
をジオキサン−水（７：１ｖ／ｖ）３．５ｍｌに溶かし
た０．３Ｍの１，１，４，４，−テトラメチルグアニジ
ウム ２−ピリジンアルドキシメートで４０℃４８時間
処理した後、濃アンモニア水−ピリジン（２：１ｖ／
ｖ）３ｍｌで封管中５５℃，１０時間処理した。続いて
８０％酢酸２ｍｌで室温２０分処理することにより、完
全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドを得た。
【００２７】ｄ） 最終産物の分離、精製は高性能液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。この
ＨＰＬＣはＡＬＴＥＸ ｍｏｄｅｌ １１０Ａ液体クロ
マトグラフを使用し、溶媒Ａ（２０％ＣＨ3 ＣＮ−１ｍ
ＭＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ６．５）と溶媒Ｂ（２０％ＣＨ
3 ＣＮ−５００ｍ ＭＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ６．５）によ
る直線濃度勾配法を用い、Ｐａｒｔｉｓｉｌ １０ Ｓ
ＡＸ（Ｗｈａｔｍａｎ）カラム（φ４．６×２５０ｍ
ｍ）で化合物を分離、精製した。溶媒Ａから開始し、１
分毎に３％の溶媒Ｂを加えることにより、勾配をつけ
た。溶出は５８℃で、１分当り２ｍｌの流速で行った。
目的とするピークのものを集め、透析により脱塩し、凍
結乾燥した。この様にして得たＦ1 〜Ｆ62の６２個の完
全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの均一性
（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを用い、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰで５′末端を標識
した後、２０％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
によりチェックした。又、各々のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの塩基配列は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用い、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰで５′末端を標識した
後、ヌクレアーゼを用いて部分水解したものを、セルロ
ーズアセテートを用いるｐＨ３．５の電気泳動とＤＥＡ
Ｅ−セルローズによるホモクロマトグラフィーを行って
得られる二次元マッピング法で確認した〔Ｂａｍｂａｒ
ａ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（１９７４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｅｓ．Ｒｅｓ．１８８１〕。
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。この
ＨＰＬＣはＡＬＴＥＸ ｍｏｄｅｌ １１０Ａ液体クロ
マトグラフを使用し、溶媒Ａ（２０％ＣＨ3 ＣＮ−１ｍ
ＭＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ６．５）と溶媒Ｂ（２０％ＣＨ
3 ＣＮ−５００ｍ ＭＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ６．５）によ
る直線濃度勾配法を用い、Ｐａｒｔｉｓｉｌ １０ Ｓ
ＡＸ（Ｗｈａｔｍａｎ）カラム（φ４．６×２５０ｍ
ｍ）で化合物を分離、精製した。溶媒Ａから開始し、１
分毎に３％の溶媒Ｂを加えることにより、勾配をつけ
た。溶出は５８℃で、１分当り２ｍｌの流速で行った。
目的とするピークのものを集め、透析により脱塩し、凍
結乾燥した。この様にして得たＦ1 〜Ｆ62の６２個の完
全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの均一性
（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを用い、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰで５′末端を標識
した後、２０％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
によりチェックした。又、各々のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの塩基配列は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用い、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰで５′末端を標識した
後、ヌクレアーゼを用いて部分水解したものを、セルロ
ーズアセテートを用いるｐＨ３．５の電気泳動とＤＥＡ
Ｅ−セルローズによるホモクロマトグラフィーを行って
得られる二次元マッピング法で確認した〔Ｂａｍｂａｒ
ａ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（１９７４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｅｓ．Ｒｅｓ．１８８１〕。
【００２８】γ−ＩＦＮ遺伝子フラグメントのリゲーシ
ョン 化学合成した前記の６２のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドのフラグメント（１〜６２）を図５に示したリゲー
ション計画に従って４５０塩基対からなるγ−ＩＦＮに
相当する遺伝子（図２）をリゲーションした。以下詳細
に示す。
ョン 化学合成した前記の６２のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドのフラグメント（１〜６２）を図５に示したリゲー
ション計画に従って４５０塩基対からなるγ−ＩＦＮに
相当する遺伝子（図２）をリゲーションした。以下詳細
に示す。
【００２９】〔Ａ〕から〔Ｆ〕ブロックの合成を行っ
た。各ブロックの５′末端にあるフラグメント（１，１
４，１５，２４，２５，３２，３３，４４，４５，５
４，５５，６２）を除く残りの５０フラグメントそれぞ
れ１ｎｍｏｌを２２μｌの蒸留水に溶解し、９０℃で２
分間加熱後、直ちに０℃に冷却した。この水溶液に５μ
Ｃｉの〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（５１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
を加え、溶液を７０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2 キナーゼ緩衝液となる様に調整し、３
単位のポリヌクレオチドキナーゼを加え全容量を３０μ
ｌとした。３７℃で１５分間反応することにより５′末
端を32Ｐでラベルした。次にすべての５′末端をリン酸
化する為に４ｎｍｏｌのＡＴＰと３単位のポリヌクレオ
チドキナーゼを追加し３７℃で４５分間反応させ、９０
℃で５分間加熱することにより反応を止めた。上記のリ
ン酸化した２から１３及びリン酸化していない１及び１
４（Ａブロック），リン酸化した１６から２３及びリン
酸化していない１５及び２４（Ｂブロック），リン酸化
した２６から３１及びリン酸化していない２５及び３２
（Ｃブロック），リン酸化した３４から４３及びリン酸
化していない３３及び４４（Ｄブロック），リン酸化し
た４６から５３及びリン酸化していない４５及び５４
（Ｅブロック），リン酸化した５６から６１及びリン酸
化していない５５及び６２（Ｆブロック）をそれぞれ
２．１μｇを混合し透析チューブに入れ蒸留水に対して
４℃で１６時間透析し、未反応ＡＴＰ及びキナーゼ緩衝
液成分を除いた。この各Ａ〜Ｆブロックの透析したＤＮ
Ａ溶液を濃縮乾固し、１４．５μｌのリガーゼ緩衝液
（２０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．６，１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ）に溶解した。
た。各ブロックの５′末端にあるフラグメント（１，１
４，１５，２４，２５，３２，３３，４４，４５，５
４，５５，６２）を除く残りの５０フラグメントそれぞ
れ１ｎｍｏｌを２２μｌの蒸留水に溶解し、９０℃で２
分間加熱後、直ちに０℃に冷却した。この水溶液に５μ
Ｃｉの〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（５１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
を加え、溶液を７０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2 キナーゼ緩衝液となる様に調整し、３
単位のポリヌクレオチドキナーゼを加え全容量を３０μ
ｌとした。３７℃で１５分間反応することにより５′末
端を32Ｐでラベルした。次にすべての５′末端をリン酸
化する為に４ｎｍｏｌのＡＴＰと３単位のポリヌクレオ
チドキナーゼを追加し３７℃で４５分間反応させ、９０
℃で５分間加熱することにより反応を止めた。上記のリ
ン酸化した２から１３及びリン酸化していない１及び１
４（Ａブロック），リン酸化した１６から２３及びリン
酸化していない１５及び２４（Ｂブロック），リン酸化
した２６から３１及びリン酸化していない２５及び３２
（Ｃブロック），リン酸化した３４から４３及びリン酸
化していない３３及び４４（Ｄブロック），リン酸化し
た４６から５３及びリン酸化していない４５及び５４
（Ｅブロック），リン酸化した５６から６１及びリン酸
化していない５５及び６２（Ｆブロック）をそれぞれ
２．１μｇを混合し透析チューブに入れ蒸留水に対して
４℃で１６時間透析し、未反応ＡＴＰ及びキナーゼ緩衝
液成分を除いた。この各Ａ〜Ｆブロックの透析したＤＮ
Ａ溶液を濃縮乾固し、１４．５μｌのリガーゼ緩衝液
（２０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．６，１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ）に溶解した。
【００３０】この溶液を４０μｌガラス細管に入れ両端
を封管した後、２０ｍｌの水の入った１６．５ｍｍ試験
管に入れ９５℃で２分間加熱した。次に試験管ごと室温
に２時間放置し、ＤＮＡフラグメントをアニールさせた
後０℃に置いた。このＤＮＡ溶液をガラス細管より取り
出し、０．４ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴを含むリ
ガーゼ緩衝溶液とし３０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、全容量を８０μｌとして１５℃で１６時間反応させ
た。反応溶液を一部取り出し、７Ｍ尿素を含む１４％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行いラジオオートグラ
フでリゲーションの検討をした。その結果リゲーション
反応物の最大の大きさのものがそれぞれＡからＦの６ブ
ロックの目的物の大きさと一致した。次に上記のリゲー
ション反応物全量を７Ｍ尿素を含む１４％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。ラジオオートグラ
フによりＡからＦのそれぞれの位置を確認した後、その
部分のゲル片を切り出し、透析チューブに入れ、９ｍＭ
トリスほう酸（ｐＨ８．３，０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを
含む）緩衝液（溶出緩衝液）を満たし、チューブの両端
をとじた後、溶出緩衝液中で２００Ｖの定電圧で３時間
電気泳動することによりゲル中のＤＮＡを溶出させた。
次にＤＮＡを透析チューブより取り出し、凍結乾燥し
た。乾燥物を１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．０）に溶解後２倍量のエタノールを加え−８０℃
に３０分間置いた後、遠心分離によりＤＮＡを沈澱とし
て回収した。ＡからＦブロックのＤＮＡ沈澱を２０μｌ
の蒸留水に溶解後、その１μｌを７Ｍ尿素を含む１４％
ポリアクリルアミド電気泳動で検討した。その結果図１
０に示すように〔Ａ〕から〔Ｆ〕までの各ブロックのＤ
ＮＡの大きさに相当したほぼ均一のバンドが得られた。
Ａ〜Ｆ各ブロックのＤＮＡ溶液をキナーゼ緩衝液の組成
となる様に調整し、２ｎｍｏｌ ＡＴＰ及び６単位のポ
リヌクレオチドキナーゼを加え３７℃で１時間反応させ
各ブロックの５′末端をリン酸化した。〔Ａ〕，
〔Ｂ〕，〔Ｃ〕各ブロックのＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを混
合し、リガーゼ緩衝液組成となる様に調整し、０．４ｍ
Ｍ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴとなる様にＡＴＰ及びＤ
ＴＴを加え、全量を５０μｌとして、８単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用い１５℃で１６時間反応を行った。
〔Ｄ〕，〔Ｅ〕，〔Ｆ〕各ブロックのＤＮＡも同様にそ
れぞれ５ｐｍｏｌを混合し、１５℃で１６時間リゲーシ
ョンを行った。反応終了後それぞれ反応物の一部をと
り、７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動でリゲーションの検討をした。
を封管した後、２０ｍｌの水の入った１６．５ｍｍ試験
管に入れ９５℃で２分間加熱した。次に試験管ごと室温
に２時間放置し、ＤＮＡフラグメントをアニールさせた
後０℃に置いた。このＤＮＡ溶液をガラス細管より取り
出し、０．４ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴを含むリ
ガーゼ緩衝溶液とし３０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、全容量を８０μｌとして１５℃で１６時間反応させ
た。反応溶液を一部取り出し、７Ｍ尿素を含む１４％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行いラジオオートグラ
フでリゲーションの検討をした。その結果リゲーション
反応物の最大の大きさのものがそれぞれＡからＦの６ブ
ロックの目的物の大きさと一致した。次に上記のリゲー
ション反応物全量を７Ｍ尿素を含む１４％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。ラジオオートグラ
フによりＡからＦのそれぞれの位置を確認した後、その
部分のゲル片を切り出し、透析チューブに入れ、９ｍＭ
トリスほう酸（ｐＨ８．３，０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを
含む）緩衝液（溶出緩衝液）を満たし、チューブの両端
をとじた後、溶出緩衝液中で２００Ｖの定電圧で３時間
電気泳動することによりゲル中のＤＮＡを溶出させた。
次にＤＮＡを透析チューブより取り出し、凍結乾燥し
た。乾燥物を１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．０）に溶解後２倍量のエタノールを加え−８０℃
に３０分間置いた後、遠心分離によりＤＮＡを沈澱とし
て回収した。ＡからＦブロックのＤＮＡ沈澱を２０μｌ
の蒸留水に溶解後、その１μｌを７Ｍ尿素を含む１４％
ポリアクリルアミド電気泳動で検討した。その結果図１
０に示すように〔Ａ〕から〔Ｆ〕までの各ブロックのＤ
ＮＡの大きさに相当したほぼ均一のバンドが得られた。
Ａ〜Ｆ各ブロックのＤＮＡ溶液をキナーゼ緩衝液の組成
となる様に調整し、２ｎｍｏｌ ＡＴＰ及び６単位のポ
リヌクレオチドキナーゼを加え３７℃で１時間反応させ
各ブロックの５′末端をリン酸化した。〔Ａ〕，
〔Ｂ〕，〔Ｃ〕各ブロックのＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを混
合し、リガーゼ緩衝液組成となる様に調整し、０．４ｍ
Ｍ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴとなる様にＡＴＰ及びＤ
ＴＴを加え、全量を５０μｌとして、８単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用い１５℃で１６時間反応を行った。
〔Ｄ〕，〔Ｅ〕，〔Ｆ〕各ブロックのＤＮＡも同様にそ
れぞれ５ｐｍｏｌを混合し、１５℃で１６時間リゲーシ
ョンを行った。反応終了後それぞれ反応物の一部をと
り、７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動でリゲーションの検討をした。
【００３１】その結果図１１に示したように２２５ｂｐ
に相当する〔Ｉ〕及び〔II〕ブロックが合成されている
ことが判った。次に上記の反応溶液全量を７Ｍ尿素を含
む８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し
た。ラジオオートグラフにより、２２５塩基対ＤＮＡを
確認した後、その部分のゲル片を切り出し、前述の電気
泳動溶出法にてＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡ溶液を凍結
乾燥したのち、１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）溶液に溶解後２．５倍量のエタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。得られたＤＮＡに前述と同
様に０．５ｎｍｏｌＡＴＰ及び３単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼを加え、３７℃で１時間反応させた。〔Ｉ〕
〔II〕各ブロックのＤＮＡ １ｐｍｏｌを混合し、リガ
ーゼ緩衝液組成となる様に調整し０．４ｍＭ ＡＴＰ，
１０ｍＭ ＤＴＴとなる様にＡＴＰ及びＤＴＴを加え、
全量を２０μｌとして５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用
い１５℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応物
の一部をとり７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でリゲーションの検討をした。その結果を図
１２に示す。同図のＩ，IIはそれぞれ〔Ｉ〕，〔II〕ブ
ロックの分離精製したものを示す。
に相当する〔Ｉ〕及び〔II〕ブロックが合成されている
ことが判った。次に上記の反応溶液全量を７Ｍ尿素を含
む８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し
た。ラジオオートグラフにより、２２５塩基対ＤＮＡを
確認した後、その部分のゲル片を切り出し、前述の電気
泳動溶出法にてＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡ溶液を凍結
乾燥したのち、１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）溶液に溶解後２．５倍量のエタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。得られたＤＮＡに前述と同
様に０．５ｎｍｏｌＡＴＰ及び３単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼを加え、３７℃で１時間反応させた。〔Ｉ〕
〔II〕各ブロックのＤＮＡ １ｐｍｏｌを混合し、リガ
ーゼ緩衝液組成となる様に調整し０．４ｍＭ ＡＴＰ，
１０ｍＭ ＤＴＴとなる様にＡＴＰ及びＤＴＴを加え、
全量を２０μｌとして５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用
い１５℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応物
の一部をとり７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でリゲーションの検討をした。その結果を図
１２に示す。同図のＩ，IIはそれぞれ〔Ｉ〕，〔II〕ブ
ロックの分離精製したものを示す。
【００３２】また、Ｇはγ−ＩＦＮ全遺伝子のリゲーシ
ョンの結果を示したもので４５０塩基対に相当するＤＮ
Ａ分子が得られていることが判った。
ョンの結果を示したもので４５０塩基対に相当するＤＮ
Ａ分子が得られていることが判った。
【００３３】次に上記の反応溶液全量に１／１０量の３
Ｍ酢酸ナトリウムを加え２．５倍量のエタノールを加え
ることによりＤＮＡを沈澱として回収した。沈澱を１０
０μｌのＴＡ緩衝液（３３ｍＭトリス酢酸，ｐＨ７．
９，６６ｍＭ酢酸カリ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，
０．５ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、２０単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，２０単位の制限酵素ＳａｌＩを加え、３７℃
で１時間反応させた。反応液に１０μｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムを加え２．５倍量のエタノールを加えることによ
りＤＮＡを沈澱として回収した。ＤＮＡを８０％ホルム
アミド，１０ｍＭＮａＯＨ，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶
液に溶かし、７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離した。ラジオオートグラフによ
り、４５０塩基対を確認したのち、その部分のゲル片を
切り出し、透析チューブに入れ、溶出緩衝液を満たし、
シールした後同緩衝液中で２００Ｖの定電圧で３時間電
気泳動することによりゲル中のＤＮＡを溶出させた。次
にＤＮＡ溶液を透析チューブより取り出し、凍結乾燥し
た。乾固物を１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．０）に溶解後２．５倍量のエタノールを加え、Ｄ
ＮＡを沈澱として回収した。約０．０５ｐｍｏｌのγ−
ＩＦＮ遺伝子が得られた。このＤＮＡをキナーゼ緩衝液
１０μｌに溶解し２単位のポリヌクレオチドキナーゼ及
び０．１ｎｍｏｌＡＴＰを加え３７℃で１時間反応を行
い形質転換用のＤＮＡとした。
Ｍ酢酸ナトリウムを加え２．５倍量のエタノールを加え
ることによりＤＮＡを沈澱として回収した。沈澱を１０
０μｌのＴＡ緩衝液（３３ｍＭトリス酢酸，ｐＨ７．
９，６６ｍＭ酢酸カリ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，
０．５ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、２０単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，２０単位の制限酵素ＳａｌＩを加え、３７℃
で１時間反応させた。反応液に１０μｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムを加え２．５倍量のエタノールを加えることによ
りＤＮＡを沈澱として回収した。ＤＮＡを８０％ホルム
アミド，１０ｍＭＮａＯＨ，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶
液に溶かし、７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離した。ラジオオートグラフによ
り、４５０塩基対を確認したのち、その部分のゲル片を
切り出し、透析チューブに入れ、溶出緩衝液を満たし、
シールした後同緩衝液中で２００Ｖの定電圧で３時間電
気泳動することによりゲル中のＤＮＡを溶出させた。次
にＤＮＡ溶液を透析チューブより取り出し、凍結乾燥し
た。乾固物を１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．０）に溶解後２．５倍量のエタノールを加え、Ｄ
ＮＡを沈澱として回収した。約０．０５ｐｍｏｌのγ−
ＩＦＮ遺伝子が得られた。このＤＮＡをキナーゼ緩衝液
１０μｌに溶解し２単位のポリヌクレオチドキナーゼ及
び０．１ｎｍｏｌＡＴＰを加え３７℃で１時間反応を行
い形質転換用のＤＮＡとした。
【００３４】ｐＧＩＦプラスミドの造成 化学合成したγ−ＩＦＮ遺伝子を、大腸菌内で完全な蛋
白質として発現させる為、大腸菌ラクトースオペロンの
ＵＶ５プロモーターオペレーター領域の下流にγ−ＩＦ
Ｎ遺伝子を挿入できる大腸菌プラスミドｐＫＯ７０３の
造成を行い、γ−ＩＦＮ遺伝子をこのｐＫＯ７０３プラ
スミドにクローニングした。
白質として発現させる為、大腸菌ラクトースオペロンの
ＵＶ５プロモーターオペレーター領域の下流にγ−ＩＦ
Ｎ遺伝子を挿入できる大腸菌プラスミドｐＫＯ７０３の
造成を行い、γ−ＩＦＮ遺伝子をこのｐＫＯ７０３プラ
スミドにクローニングした。
【００３５】以下に本実験に用いた一連のプラスミドの
造成を詳述する（図９参照）。
造成を詳述する（図９参照）。
【００３６】（１） ｐＫＯ７０３プラスミドの造成 大腸菌ラクトースオペロンのＵＶ５プロモーターオペレ
ーター領域を含むプラスミドｐＫＯ７０３の造成を以下
に述べる方法で行った。
ーター領域を含むプラスミドｐＫＯ７０３の造成を以下
に述べる方法で行った。
【００３７】（Ａ） 制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＣｌａＩ切
断部位をうめたｐＢＲ３２２プラスミドの調整 ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ１．５μｇを２０μｌ中の１×Ｔ
Ａ反応液（３３ｍＭトリス酢酸緩衝液ｐＨ７．６，６６
ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび
０．５ｍＭジチオスレイトール）中で制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＣｌａＩそれぞれ５単位を用いて、３７℃，６０分
間切断した。反応液を６５℃，３０分間加熱し、酵素を
不活化した後、２．５倍量の冷エタノールを加えてＤＮ
Ａを沈澱物として得た。得られたＤＮＡ沈澱物をＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ反応液４０μｌに結局懸濁し、６５
℃，１０分間加熱後、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ各
々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつと１００ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール５μｌを加えた後、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ１単位を用いて、３７℃，６０分間反応させ
た。反応液を６５℃，３０分間加熱し、酵素を不活化し
た後、エタノール沈澱を行い、最終的に１５μｌの蒸留
水にＤＮＡ沈澱を溶解した。
断部位をうめたｐＢＲ３２２プラスミドの調整 ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ１．５μｇを２０μｌ中の１×Ｔ
Ａ反応液（３３ｍＭトリス酢酸緩衝液ｐＨ７．６，６６
ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび
０．５ｍＭジチオスレイトール）中で制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＣｌａＩそれぞれ５単位を用いて、３７℃，６０分
間切断した。反応液を６５℃，３０分間加熱し、酵素を
不活化した後、２．５倍量の冷エタノールを加えてＤＮ
Ａを沈澱物として得た。得られたＤＮＡ沈澱物をＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ反応液４０μｌに結局懸濁し、６５
℃，１０分間加熱後、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ各
々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつと１００ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール５μｌを加えた後、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ１単位を用いて、３７℃，６０分間反応させ
た。反応液を６５℃，３０分間加熱し、酵素を不活化し
た後、エタノール沈澱を行い、最終的に１５μｌの蒸留
水にＤＮＡ沈澱を溶解した。
【００３８】（Ｂ） 制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位をう
めたＬａｃＵＶ５プロモーターオペレーター領域ＤＮＡ
の調整 ラクトースオペロンのＵＶ５プロモーターオペレーター
領域を分離する為に以下の実験を行った。プラスミドｐ
ＫＯ６０１は２ケ所の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位間に
ラクトースオペロンのプロモーターオペレーター領域を
有するプラスミドである。このプラスミドｐＫＯ６０１
８０μｇを５００μｌ中の１×ＴＡ反応液中で、制限
酵素ＥｃｏＲＩ １５０単位を用い、３７℃６０分間反
応した。反応液を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、制限酵素ＥｃｏＲＩ粘着部位コヘシブエンド
を持つ９５塩基対のプロモーターオペレーター領域ＤＮ
Ａ断片をゲルより電気泳動により分離した（分離法につ
いては特願昭５６−１６３３０３号実施例参照）。
めたＬａｃＵＶ５プロモーターオペレーター領域ＤＮＡ
の調整 ラクトースオペロンのＵＶ５プロモーターオペレーター
領域を分離する為に以下の実験を行った。プラスミドｐ
ＫＯ６０１は２ケ所の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位間に
ラクトースオペロンのプロモーターオペレーター領域を
有するプラスミドである。このプラスミドｐＫＯ６０１
８０μｇを５００μｌ中の１×ＴＡ反応液中で、制限
酵素ＥｃｏＲＩ １５０単位を用い、３７℃６０分間反
応した。反応液を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、制限酵素ＥｃｏＲＩ粘着部位コヘシブエンド
を持つ９５塩基対のプロモーターオペレーター領域ＤＮ
Ａ断片をゲルより電気泳動により分離した（分離法につ
いては特願昭５６−１６３３０３号実施例参照）。
【００３９】エタノール沈澱後、ＤＮＡ沈澱を４０μｌ
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ反応液４０μｌに溶解し、６
５℃３０分間加熱後急冷し、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ各々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつと１
００ｍＭβ−メルカプトエタノール５μｌを加えた後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を用いて、３７℃６０
分間反応させた。反応液を６５℃３０分間加熱し、酵素
を不活化した後エタノール沈澱を行い、最終的に２０μ
ｌの蒸留水にＤＮＡを溶解した。
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ反応液４０μｌに溶解し、６
５℃３０分間加熱後急冷し、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ各々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつと１
００ｍＭβ−メルカプトエタノール５μｌを加えた後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を用いて、３７℃６０
分間反応させた。反応液を６５℃３０分間加熱し、酵素
を不活化した後エタノール沈澱を行い、最終的に２０μ
ｌの蒸留水にＤＮＡを溶解した。
【００４０】（Ｃ） （Ａ）および（Ｂ）で調整したプ
ラスミドとラクトースＵＶ５プロモーターオペレーター
領域ＤＮＡのリゲーション、並びに大腸菌への形質転換 （Ａ）で調整した制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ切断部
位を埋めたｐＢＲ３２２ＤＮＡ０．８μｇと（Ｂ）で調
整したラクトースオペレーターのＵＶ５プロモーターオ
ペレーター領域ＤＮＡ０．８μｇを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ２．５単位を用いて１６℃，２０時間リゲーションを
行った。（リゲーションの方法は特願昭５６−１６３３
０３号実施例に記されている方法に従った。）
ラスミドとラクトースＵＶ５プロモーターオペレーター
領域ＤＮＡのリゲーション、並びに大腸菌への形質転換 （Ａ）で調整した制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ切断部
位を埋めたｐＢＲ３２２ＤＮＡ０．８μｇと（Ｂ）で調
整したラクトースオペレーターのＵＶ５プロモーターオ
ペレーター領域ＤＮＡ０．８μｇを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ２．５単位を用いて１６℃，２０時間リゲーションを
行った。（リゲーションの方法は特願昭５６−１６３３
０３号実施例に記されている方法に従った。）
【００４１】リゲーション後エタノール沈澱を行いＤＮ
Ａ沈澱物を１０μｌの蒸留水に溶解し、大腸菌１２・Ｗ
Ａ８０２の形質転換を行った。（形質転換の方法は特願
昭５６−１６３３０３号実施例に記されている方法に従
った。）形質転換株はアンピシリン４０μｇ １ｍｌを
含有するＭ９Ｓ−Ｘｇａｌ培地〔ＮａＣｌ５ｇ，ＮＨ4
Ｃｌ１ｇ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５．９４ｇ，ＫＨ2 ＰＯ4 ３
ｇ（ｐＨ７．０）ＭｇＳＯ4 ０．２ｇ，カザミノ酸２
ｇ，グルコース５ｇ，５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド４００ｍｇ，寒
天１５ｇ，水１０００ｍｌ：以下Ｍ９Ｓ−Ｘｇａｌ培地
と略す〕上で培養し、アンピシリン耐性かつ濃青色のコ
ロニーを１０個選びＷＡ８０２／ｐＫＯ７０１〜ＷＡ８
０２／ｐＫＯ７１０と命名した。
Ａ沈澱物を１０μｌの蒸留水に溶解し、大腸菌１２・Ｗ
Ａ８０２の形質転換を行った。（形質転換の方法は特願
昭５６−１６３３０３号実施例に記されている方法に従
った。）形質転換株はアンピシリン４０μｇ １ｍｌを
含有するＭ９Ｓ−Ｘｇａｌ培地〔ＮａＣｌ５ｇ，ＮＨ4
Ｃｌ１ｇ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５．９４ｇ，ＫＨ2 ＰＯ4 ３
ｇ（ｐＨ７．０）ＭｇＳＯ4 ０．２ｇ，カザミノ酸２
ｇ，グルコース５ｇ，５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド４００ｍｇ，寒
天１５ｇ，水１０００ｍｌ：以下Ｍ９Ｓ−Ｘｇａｌ培地
と略す〕上で培養し、アンピシリン耐性かつ濃青色のコ
ロニーを１０個選びＷＡ８０２／ｐＫＯ７０１〜ＷＡ８
０２／ｐＫＯ７１０と命名した。
【００４２】制限酵素ＣｌａＩのプラスミドｐＢＲ３２
２上の認識部位はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモ
ーター領域内にあり、ｐＢＲ３２２プラスミドの制限酵
素ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ認識部位間に他のＤＮＡ断片が
挿入されれば、そのプラスミドを持つ大腸菌はテトラサ
イクリン感受性となる。しかしラクトースオペロンのＵ
Ｖ５プロモーターオペレーター領域のＤＮＡ断片が望ま
れる方向性に挿入されればそのプラスミドを持った形質
転換株はテトラサイクリン非感受性となることが期待で
きる。
２上の認識部位はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモ
ーター領域内にあり、ｐＢＲ３２２プラスミドの制限酵
素ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ認識部位間に他のＤＮＡ断片が
挿入されれば、そのプラスミドを持つ大腸菌はテトラサ
イクリン感受性となる。しかしラクトースオペロンのＵ
Ｖ５プロモーターオペレーター領域のＤＮＡ断片が望ま
れる方向性に挿入されればそのプラスミドを持った形質
転換株はテトラサイクリン非感受性となることが期待で
きる。
【００４３】そこで得られたＷＡ８０２／ｐＫＯ７０１
〜ＷＡ８０２／ｐＫＯ７１０株をテトラサイクリン１０
μｇ／ｍｌを含む普通栄養寒天培地上にシングルコロニ
ーを行い、テトラサイクリン感受性を調べた。その結果
ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０１，ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０
３，ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０６，ＷＡ８０２／ｐＫＯ７
０９がテトラサイクリン非感受性であった。そこでこれ
らの菌株よりプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ２μｇ
を２０μｌの１×ＴＡ反応液中で、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＨｐａII各々５単位を用いて３７℃６０分間反応
し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ラ
クトースオペロンのプロモーターオペレーター領域の方
向性を調べた。その結果ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０３，Ｗ
Ａ８０２／ｐＫＯ７０９は望まれる方向にプロモーター
オペレーター領域が挿入されていた。
〜ＷＡ８０２／ｐＫＯ７１０株をテトラサイクリン１０
μｇ／ｍｌを含む普通栄養寒天培地上にシングルコロニ
ーを行い、テトラサイクリン感受性を調べた。その結果
ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０１，ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０
３，ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０６，ＷＡ８０２／ｐＫＯ７
０９がテトラサイクリン非感受性であった。そこでこれ
らの菌株よりプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ２μｇ
を２０μｌの１×ＴＡ反応液中で、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＨｐａII各々５単位を用いて３７℃６０分間反応
し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ラ
クトースオペロンのプロモーターオペレーター領域の方
向性を調べた。その結果ＷＡ８０２／ｐＫＯ７０３，Ｗ
Ａ８０２／ｐＫＯ７０９は望まれる方向にプロモーター
オペレーター領域が挿入されていた。
【００４４】このｐＫＯ７０３プラスミドをγ−ＩＦＮ
遺伝子のクローニングに用いた。プラスミドｐＫＯ７０
３はＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位が１ケ所プロモーター
からのトランスクリプションの方向の下流にあり、ｐＢ
Ｒ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子はそのままプラ
スミド上に残っている為、化学的又はプラスミドより得
たＥｃｏＲＩとＳａｌＩ，ＢａｍＨｌのようなテトラサ
イクリン耐性構造遺伝子内を切断する制限酵素のコヘシ
ブエンドを持つ遺伝子をライゲーション反応を用いて、
プラスミドｐＫＯ７０３に容易に導入可能で、目的とす
るクローンをアンピシリン耐性テトラサイクリン感受性
菌として容易に選択することができる。
遺伝子のクローニングに用いた。プラスミドｐＫＯ７０
３はＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位が１ケ所プロモーター
からのトランスクリプションの方向の下流にあり、ｐＢ
Ｒ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子はそのままプラ
スミド上に残っている為、化学的又はプラスミドより得
たＥｃｏＲＩとＳａｌＩ，ＢａｍＨｌのようなテトラサ
イクリン耐性構造遺伝子内を切断する制限酵素のコヘシ
ブエンドを持つ遺伝子をライゲーション反応を用いて、
プラスミドｐＫＯ７０３に容易に導入可能で、目的とす
るクローンをアンピシリン耐性テトラサイクリン感受性
菌として容易に選択することができる。
【００４５】（２） プラスミドｐＧＩＦ4 の造成 プラスミドｐＫＯ７０３の１５μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＳａｌＩ各々１０単位用いて３０μｌの１００ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）５ｍＭ ＭｇＣｌ2 お
よび５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液中で３７℃６０分反応を行
った。反応液を６５℃３０分間加熱し、酵素を不活化し
た後０．７％アガロースゲル電気泳動を行い３．８ｋｂ
のＤＮＡ断片をゲルより電気泳動法を行って分離した。
エタノール沈澱後４．５μｌの蒸留水にＤＮＡを溶解し
た。このようにして得られたｐＫＯ７０３の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＳａｌＩ制限酵素断片ＤＮＡ０．３μｇと先
に得た５′−ＯＨ末端をリン酸化したγ−ＩＦＮ遺伝子
２９ｎｇを２４μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液中に溶
解し、６５℃１０分間加熱後、氷冷し１００ｍＭＤＴＴ
３μｌおよび４ｍＭのＡＴＰ３μｌを加え次いでＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ３単位を用いて１６℃，２０時間リゲーシ
ョンを行った。リゲーション反応液に２．５倍量の冷エ
タノールを加え、ＤＮＡをエタノール沈澱とした後、得
られたＤＮＡ沈澱に１０μｌの蒸留水を加え、大腸菌Ｗ
Ａ８０２の形質転換を行った。形質転換株はアンピシリ
ン４０μｇ／ｍｌを含有するＭ９Ｓ−Ｘｇａｌ培地上で
培養し、アンピシリン耐性かつ濃青色のコロニーを選択
し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含む普通栄養寒
天培地上にシングルコロニーを行い、テトラサイクリン
感受性を示すコロニーを選びＷＡ８０２／ｐＧＩＦ１〜
ＷＡ８０２／ｐＧＩＦ５と命名した。
Ｉ，ＳａｌＩ各々１０単位用いて３０μｌの１００ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）５ｍＭ ＭｇＣｌ2 お
よび５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液中で３７℃６０分反応を行
った。反応液を６５℃３０分間加熱し、酵素を不活化し
た後０．７％アガロースゲル電気泳動を行い３．８ｋｂ
のＤＮＡ断片をゲルより電気泳動法を行って分離した。
エタノール沈澱後４．５μｌの蒸留水にＤＮＡを溶解し
た。このようにして得られたｐＫＯ７０３の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＳａｌＩ制限酵素断片ＤＮＡ０．３μｇと先
に得た５′−ＯＨ末端をリン酸化したγ−ＩＦＮ遺伝子
２９ｎｇを２４μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液中に溶
解し、６５℃１０分間加熱後、氷冷し１００ｍＭＤＴＴ
３μｌおよび４ｍＭのＡＴＰ３μｌを加え次いでＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ３単位を用いて１６℃，２０時間リゲーシ
ョンを行った。リゲーション反応液に２．５倍量の冷エ
タノールを加え、ＤＮＡをエタノール沈澱とした後、得
られたＤＮＡ沈澱に１０μｌの蒸留水を加え、大腸菌Ｗ
Ａ８０２の形質転換を行った。形質転換株はアンピシリ
ン４０μｇ／ｍｌを含有するＭ９Ｓ−Ｘｇａｌ培地上で
培養し、アンピシリン耐性かつ濃青色のコロニーを選択
し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含む普通栄養寒
天培地上にシングルコロニーを行い、テトラサイクリン
感受性を示すコロニーを選びＷＡ８０２／ｐＧＩＦ１〜
ＷＡ８０２／ｐＧＩＦ５と命名した。
【００４６】プラスミドＤＮＡを分離後、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩとＳａｌＩ，ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII , 及びＥ
ｃｏＲＩとＢｇｌIIを用いて、プラスミドＤＮＡを切断
し、アガロース電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によりＤＮＡ断片の大きさを測定して、目的の
γ−ＩＦＮ遺伝子がクローニングされているＷＡ８０２
／ｐＧＩＦ４，ＷＡ８０２／ｐＧＩＦ５を確認した。こ
れらｐＧＩＦ４，ｐＧＩＦ５プラスミドでは、ラクトー
スオペロンのＵＶ５プロモーター領域のＳｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌｇａｎｏ ＤＮＡ塩基配列より１０塩基対下流にγ
−ＩＦＮ遺伝子の開始コドンＡＴＧが位置している。
ｏＲＩとＳａｌＩ，ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII , 及びＥ
ｃｏＲＩとＢｇｌIIを用いて、プラスミドＤＮＡを切断
し、アガロース電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によりＤＮＡ断片の大きさを測定して、目的の
γ−ＩＦＮ遺伝子がクローニングされているＷＡ８０２
／ｐＧＩＦ４，ＷＡ８０２／ｐＧＩＦ５を確認した。こ
れらｐＧＩＦ４，ｐＧＩＦ５プラスミドでは、ラクトー
スオペロンのＵＶ５プロモーター領域のＳｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌｇａｎｏ ＤＮＡ塩基配列より１０塩基対下流にγ
−ＩＦＮ遺伝子の開始コドンＡＴＧが位置している。
【００４７】
【表３】
【００４８】γ−ＩＦＮ遺伝子の塩基配列決定 ｐＧＩＦ４プラスミドＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＩ，制
限酵素ＳａｌＩ分解で得られる４５０塩基対のγ−ＩＦ
Ｎ遺伝子に相当する領域の塩基配列を図６に示した計画
に従って決定した。塩基配列の決定はＭａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．７４，５６０−５６４，１９７７）に準じて行
った。その結果４５０塩基対すべて最初のデザイン（図
２）通りであることを確認した。
限酵素ＳａｌＩ分解で得られる４５０塩基対のγ−ＩＦ
Ｎ遺伝子に相当する領域の塩基配列を図６に示した計画
に従って決定した。塩基配列の決定はＭａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．７４，５６０−５６４，１９７７）に準じて行
った。その結果４５０塩基対すべて最初のデザイン（図
２）通りであることを確認した。
【００４９】（３） ヒト・ガンマ・インタ−フェロン
様ポリペプチドの大腸菌体内での発現及び同定 Ｅ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４およびＷＡ８０２
／ｐＧＩＦ５において、γ−ＩＦＮ遺伝子はラクトース
オペロンのプロモーター領域の下流に挿入されている。
この為、ラクトースオペロンの支配下にγ−ＩＦＮは発
現されることが期待される。そこで以下に詳述する方法
によりＥ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４，ＷＡ８０
２／ｐＧＩＦ５菌体内でのγ−ＩＦＮの発現及び固定を
行った。菌株Ｅ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４とＷ
Ａ８０２／ｐＧＩＦ５をアンピシリン４０μｇ／ｍｌを
含むＭ９Ｓ−グリセロール培地（ＮａＣｌ ５ｇ，ＮＨ
4 Ｃｌ １ｇ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５．９４ｇ，ＫＨ2 ＰＯ
4 ３ｇ，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．２ｇ，グリセロール
２．５ｇ，カザミノ酸２ｇ，水１０００ｍｌ）２．０ｍ
ｌに各々接種し、３７℃一夜培養した。この培養液をア
ンピシリン４０μｇ／ｍｌを含む５ｍｌのＭ９Ｓ−グリ
セロール培地４本に吸光度ＯＤ６６０ｎｍが０．１にな
るように各々接種した後、３７℃で培養を行い、ＯＤ６
６０ｎｍが０．８に達した時、ラクトースオペロンの誘
導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピ
ラノシド（以下ＩＰＴＧと略称）を最終濃度１ｍＭにな
るように４本の培養試験管の内２本に加え、３７℃，
２．５時間さらに培養した。残り２本はＩＰＴＧを加え
ずに３７℃，２．５時間さらに培養した。これらの培養
液５ｍｌを３，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心後、菌体
を沈澱物として得た。ＩＰＴＧ添加、非添加の２本の菌
体沈澱物に１ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含む１×
ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ）０．５ｍｌを各々加え、菌体を超音波処理
した。又、ＩＰＴＧ添加、非添加の２本の菌体沈澱物に
１ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチームを含む１×ＰＢＳ０．５
ｍｌを加え、０℃，４０分間リゾチーム処理後、超音波
処理した。超音波処理した菌体０．５ｍｌを２５，００
０ｒｐｍで３０分間、４℃に於いて遠心を行い、上清を
γ−ＩＦＮの活性測定に用いた。
様ポリペプチドの大腸菌体内での発現及び同定 Ｅ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４およびＷＡ８０２
／ｐＧＩＦ５において、γ−ＩＦＮ遺伝子はラクトース
オペロンのプロモーター領域の下流に挿入されている。
この為、ラクトースオペロンの支配下にγ−ＩＦＮは発
現されることが期待される。そこで以下に詳述する方法
によりＥ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４，ＷＡ８０
２／ｐＧＩＦ５菌体内でのγ−ＩＦＮの発現及び固定を
行った。菌株Ｅ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４とＷ
Ａ８０２／ｐＧＩＦ５をアンピシリン４０μｇ／ｍｌを
含むＭ９Ｓ−グリセロール培地（ＮａＣｌ ５ｇ，ＮＨ
4 Ｃｌ １ｇ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５．９４ｇ，ＫＨ2 ＰＯ
4 ３ｇ，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．２ｇ，グリセロール
２．５ｇ，カザミノ酸２ｇ，水１０００ｍｌ）２．０ｍ
ｌに各々接種し、３７℃一夜培養した。この培養液をア
ンピシリン４０μｇ／ｍｌを含む５ｍｌのＭ９Ｓ−グリ
セロール培地４本に吸光度ＯＤ６６０ｎｍが０．１にな
るように各々接種した後、３７℃で培養を行い、ＯＤ６
６０ｎｍが０．８に達した時、ラクトースオペロンの誘
導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピ
ラノシド（以下ＩＰＴＧと略称）を最終濃度１ｍＭにな
るように４本の培養試験管の内２本に加え、３７℃，
２．５時間さらに培養した。残り２本はＩＰＴＧを加え
ずに３７℃，２．５時間さらに培養した。これらの培養
液５ｍｌを３，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心後、菌体
を沈澱物として得た。ＩＰＴＧ添加、非添加の２本の菌
体沈澱物に１ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含む１×
ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ）０．５ｍｌを各々加え、菌体を超音波処理
した。又、ＩＰＴＧ添加、非添加の２本の菌体沈澱物に
１ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチームを含む１×ＰＢＳ０．５
ｍｌを加え、０℃，４０分間リゾチーム処理後、超音波
処理した。超音波処理した菌体０．５ｍｌを２５，００
０ｒｐｍで３０分間、４℃に於いて遠心を行い、上清を
γ−ＩＦＮの活性測定に用いた。
【００５０】
【表２】 インターフェロンの活性の測定 コースター製プラスチック９６穴マルチプレート上で５
％新生仔牛血清を含むイーグル最少培地を用いてインタ
ーフェロンサンプルをマルチピペットにより希釈列をつ
くった。次に、各穴に１００μｌのＦＬ細胞（５×１０
5 細胞／ｍｌ）を加え、一夜３７℃，５％ＣＯ2 下で培
養した。培養上清を捨て、ＴＣＩＤ50の１００倍濃い濃
度のシンドビスウイルスを１００μｌ各穴に加え、３７
℃，５％ＣＯ2 下で一夜培養した。約１７時間後上清を
捨て、２０％エタノールを含む１％クリスタル紫溶液で
染色した。インターフェロンの力価は、ウイルスを加え
なかった穴と、インターフェロンを加えずウイルスのみ
を加えた穴との染色度の差の半分の染色度を示したイン
ターフェロンサンプルの希釈度をラボ単位／ｍｌとし
た。この検定系は国際標準のあるα型インターフェロン
と比較すると７〜２５倍の感度を示す。
％新生仔牛血清を含むイーグル最少培地を用いてインタ
ーフェロンサンプルをマルチピペットにより希釈列をつ
くった。次に、各穴に１００μｌのＦＬ細胞（５×１０
5 細胞／ｍｌ）を加え、一夜３７℃，５％ＣＯ2 下で培
養した。培養上清を捨て、ＴＣＩＤ50の１００倍濃い濃
度のシンドビスウイルスを１００μｌ各穴に加え、３７
℃，５％ＣＯ2 下で一夜培養した。約１７時間後上清を
捨て、２０％エタノールを含む１％クリスタル紫溶液で
染色した。インターフェロンの力価は、ウイルスを加え
なかった穴と、インターフェロンを加えずウイルスのみ
を加えた穴との染色度の差の半分の染色度を示したイン
ターフェロンサンプルの希釈度をラボ単位／ｍｌとし
た。この検定系は国際標準のあるα型インターフェロン
と比較すると７〜２５倍の感度を示す。
【００５１】インターフェロン活性が確かにヒト・ガン
マ・インターフェロン活性であるかどうかは、抗ヒト・
ガンマ・インターフェロン抗体を用いた免疫学的手法に
よって確かめられた。この場合、５０μｌインターフェ
ロン活性サンプルに１０μｌの抗ヒト・ガンマ・インタ
ーフェロン抗体（２，０００単位μｌ／ｍｌのヒト・ガ
ンマ・インターフェロン活性を失活させる活性をもつ）
を加え、室温で３時間放置後、遠沈（１０，０００回
転、５分）し、その上清をサンプルとした。
マ・インターフェロン活性であるかどうかは、抗ヒト・
ガンマ・インターフェロン抗体を用いた免疫学的手法に
よって確かめられた。この場合、５０μｌインターフェ
ロン活性サンプルに１０μｌの抗ヒト・ガンマ・インタ
ーフェロン抗体（２，０００単位μｌ／ｍｌのヒト・ガ
ンマ・インターフェロン活性を失活させる活性をもつ）
を加え、室温で３時間放置後、遠沈（１０，０００回
転、５分）し、その上清をサンプルとした。
【００５２】
【表１】 表１に示すように、本発明において得られた形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４およびＷＡ８０２
／ｐＧＩＦ５は、明らかにラクトースオペロン支配下に
ヒト・ガンマ・インターフェロン様物質を生産している
ことが認められ、非形質転換菌（ＷＡ８０２／ｐＫＯ７
０３）にはヒト・ガンマ・インターフェロン活性が認め
られなかった。
Ｅ．ｃｏｌｉＷＡ８０２／ｐＧＩＦ４およびＷＡ８０２
／ｐＧＩＦ５は、明らかにラクトースオペロン支配下に
ヒト・ガンマ・インターフェロン様物質を生産している
ことが認められ、非形質転換菌（ＷＡ８０２／ｐＫＯ７
０３）にはヒト・ガンマ・インターフェロン活性が認め
られなかった。
【００５３】上記の実施例の中でインターフェロン活性
を示したエシエリシア・コリの細胞破砕超遠心分離上清
をウルトロゲルＡＣＡ５４（直径０．７ｃｍ×高さ４７
ｃｍ）に添加し、ゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィによる分子量の推定を行った。生理的平衡塩類溶液
（１×ＰＢＳ）を用い０．７ｍｌずつ分画した。標準蛋
白としては、リボヌクレアーゼＡ（分子量１３，７０
０），キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５，００
０），オボアルブミン（分子量４３，０００）を用い
た。インターフェロン活性は、キモトリプシノーゲンＡ
とオボアルブミンの間に溶出され、この条件下でのイン
ターフェロン活性の主ピークの分子量は約３０，０００
と推定された（図１３参照）。
を示したエシエリシア・コリの細胞破砕超遠心分離上清
をウルトロゲルＡＣＡ５４（直径０．７ｃｍ×高さ４７
ｃｍ）に添加し、ゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィによる分子量の推定を行った。生理的平衡塩類溶液
（１×ＰＢＳ）を用い０．７ｍｌずつ分画した。標準蛋
白としては、リボヌクレアーゼＡ（分子量１３，７０
０），キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５，００
０），オボアルブミン（分子量４３，０００）を用い
た。インターフェロン活性は、キモトリプシノーゲンＡ
とオボアルブミンの間に溶出され、この条件下でのイン
ターフェロン活性の主ピークの分子量は約３０，０００
と推定された（図１３参照）。
【図１】γ−ＩＦＮ遺伝子合成に用いた６２個の各オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの配列を示す。
ゴデオキシリボヌクレオチドの配列を示す。
【図２】合成γ−ＩＦＮのアミノ酸配列および遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す。
ヌクレオチド配列を示す。
【図３】オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成反応工
程を示す。
程を示す。
【図４】オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成反応工
程を示す。
程を示す。
【図５】オリゴデオキシリボヌクレオチドのリゲーショ
ン計画を示す。
ン計画を示す。
【図６】合成γ−ＩＦＮ遺伝子の塩基配列の決定計画を
示す。
示す。
【図７】合成γ−ＩＦＮ遺伝子の制限酵素地図で、括弧
中の数字はＥｃｏＲＩ認識切断部位を起点とした場合の
塩基対で表わされる距離を示す
中の数字はＥｃｏＲＩ認識切断部位を起点とした場合の
塩基対で表わされる距離を示す
【図８】プラスミドｐＫＯ７０３の制限酵素切断地図
で、括弧中の数字はＥｃｏＲＩ認識切断部位を起点とし
た場合の塩基対で表わされる距離を示す。
で、括弧中の数字はＥｃｏＲＩ認識切断部位を起点とし
た場合の塩基対で表わされる距離を示す。
【図９】ｐＧＩＦプラスミドの造成工程を示す。
【図１０】合成したポリデオキシリボヌクレオチドＡ，
Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆブロックおよび分子量マーカーＭ
（φ×１７４ＲＦをＨｉｎｆＩで分解したもの）の１４
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるマッピング示
す。
Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆブロックおよび分子量マーカーＭ
（φ×１７４ＲＦをＨｉｎｆＩで分解したもの）の１４
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるマッピング示
す。
【図１１】図５に従ってリゲーションした〔Ｉ〕，〔Ｉ
Ｉ〕各ブロックおよび分子量マーカーＭ（φ×１７４Ｒ
ＦをＨｐａIIで分解したもの）の８％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によるマッピングを示す。
Ｉ〕各ブロックおよび分子量マーカーＭ（φ×１７４Ｒ
ＦをＨｐａIIで分解したもの）の８％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によるマッピングを示す。
【図１２】上記の〔Ｉ〕，〔ＩＩ〕各ブロック，合成γ
−ＩＦＮ遺伝子および分子量マーカーＭ（ｐＢＲ３２２
ＤＮＡをＨｐａIIで分解したもの）の６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によるマッピングを示す。
−ＩＦＮ遺伝子および分子量マーカーＭ（ｐＢＲ３２２
ＤＮＡをＨｐａIIで分解したもの）の６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によるマッピングを示す。
【図１３】インターフェロン活性を示したエシエリシア
・コリ細胞破砕遠沈上清のゲル濾過して得られた各分画
の分子量のグラフである。
・コリ細胞破砕遠沈上清のゲル濾過して得られた各分画
の分子量のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (11)
- 【請求項１】 下記ヌクレオチド配列を有するポリデオ
キシリボヌクレオチド。 １ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＴＣ １０ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ２０ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ３０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＡＣ ４０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＧＡ ＣＴＧ ＧＣＡ ５０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ６０ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ７０ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＧＡ ８０ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｎ ＧＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ９０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＧＡ １００ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ １１０ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ １２０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＡ １３０ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ １４０ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＡ １４６ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ - 【請求項２】 ５′末端に翻訳開始コード及び３′末端
に翻訳終止コードを有する請求項１記載のポリデオキシ
リボヌクレオチド。 - 【請求項３】 両末端に制限酵素により切断されるヌク
レオチド配列を付加し、好ましくは５′末端がＥｃｏＲ
Ｉ、３′末端がＳａｌＩで切断されるようにした請求項
１または２記載のポリデオキシリボヌクレオチド。 - 【請求項４】 下記のヌクレオチド配列を有するポリデ
オキシリボヌクレオチド １ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＴＣ １０ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ２０ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ３０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＡＣ ４０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＧＡ ＣＴＧ ＧＣＡ ５０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ６０ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ７０ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＧＡ ８０ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｎ ＧＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ９０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＧＡ １００ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ １１０ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ １２０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＡ １３０ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ １４０ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＡ １４６ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ が組み込まれたプラスミド。 - 【請求項５】 ポリデオキシリボヌクレオチドがその
５′末端にＥｃｏＲＩ、３′側にＳａｌＩ切断部位が付
加され、プラスミドｐＫＯ７０３のＥｃｏＲＩとＳａｌ
Ｉ切断部の間に組み込まれた請求項４のプラスミド。 - 【請求項６】 ｐＧＩＦよりなる請求項５記載のプラス
ミド。 - 【請求項７】 ｐＧＩＦ４よりなる請求項６記載のプラ
スミド。 - 【請求項８】 下記のヌクレオチド配列を有するポリデ
オキシリボヌクレオチド。 １ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＴＣ １０ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ２０ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ３０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＡＣ ４０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＧＡ ＣＴＧ ＧＣＡ ５０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ６０ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ７０ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＧＡ ８０ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｎ ＧＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ９０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＧＡ １００ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ １１０ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ １２０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＡ １３０ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ １４０ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＡ １４６ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ が組み込まれたプラスミドで形質転換されたエシエリシ
ア・コリに属する菌株。 - 【請求項９】 請求項５記載のプラスミドで形質転換さ
れた請求項８記載の菌株。 - 【請求項１０】 エシエリシア・コリＫ１２・ＷＡ８０
２／ｐＧＩＦよりなる請求項９記載の菌株。 - 【請求項１１】 エシエリシア・コリＫ１２・ＷＡ８０
２／ｐＧＩＦ４よりなる請求項１０記載の菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9458895A JP2599111B2 (ja) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | ヒト・ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド発現用のポリデオキシリボヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9458895A JP2599111B2 (ja) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | ヒト・ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド発現用のポリデオキシリボヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08191689A true JPH08191689A (ja) | 1996-07-30 |
| JP2599111B2 JP2599111B2 (ja) | 1997-04-09 |
Family
ID=14114446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9458895A Expired - Lifetime JP2599111B2 (ja) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | ヒト・ガンマ・インターフェロン様ポリペプチド発現用のポリデオキシリボヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2599111B2 (ja) |
-
1995
- 1995-03-27 JP JP9458895A patent/JP2599111B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2599111B2 (ja) | 1997-04-09 |
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