JPS6232887A - インタ−ロイキン１活性を示すポリペプチド及びそれをコ−ドするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインターロイキン１活性を示すポリペプチドを
コードするＤＮＡ　、　　インク−ロイキン１活性を示
すポリペプチド及びそのポリペプチドの誘導体並びにそ
れらの製造法に関する。

ゲリーらはヒト　マクロファージの培養土１ｎ中に、マ
イトーゲ／によるマウス胸腺細胞分裂作用を促進させる
物質を見い出し、これをリンパ球活性化因子（ｌｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅ　ａｃＨｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ。

以下ＬＡＦと略記する）と名付けたが、１９７９年以降
、インターロイキ７１（以下、ＩＬ−１と略記する）の
名称が用いられている。従って本明細書においてもこの
ような物質をインターロイキンｌとして扱う。

ＩＬ−１はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促進させ、また
Ｔ細胞に作用してリンホカイン、特にインターロイキン
２（Ｔ細胞増殖因子）の産生を促進させる効果を仔し、
抗体産生や細胞性免疫のＦＡ節に重要な役割を果たす因
子の一つと考えられている［　５ｔａｒｕｃｈ、Ｍ、Ｊ
、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３０．２１９１（＋９８３）コ。その他、プロスタグ
ラ／ジンＥやコラゲナーゼの産生促進、繊維芽細胞の増
殖促進、又はインターロイキ／２やインターフェロンの
存するＮＫ　（ナチュラルキラー）細胞活性化作用を増
強させる効果があると報告されている［：　Ｓｉｍｏｎ
、Ｐ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｔ、、　”　Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ″ｖｏ１．ｏ、ｐ、４７（＋９８２）＾ｃａｄｅ
ｎｃｅ　Ｉ’ｒｅｓｓ　ｌｎｃ、］　ａこのようにｌ−
１は免疫応答のみならず、生体の防御やその修？Ｊ１等
にも関与する生体物質であり、免疫不全症に対する治療
蘂や抗腫１ｇ剤としての臨床応用がｌｌＩ′ｌ待されて
いる。

ＩＬ−１のこれまでの地組方法は、主としてマクロファ
ージや末哨単核細胞又はマクロファージ様株化細胞（例
えばマ・クスＰ３８８Ｄ　＋細胞）や単球性又は弁開性
白血病細胞等を適当な誘導剤の存在下で培養し、その培
養上１？Ｉ中より単ｍするものである。

ヒ）ＩＬ−１は、ヒト単球性白血病株化細胞であるＵ９
３７細胞及びヒト末梢単核細胞の培養土７ｉ７から分離
精製され、その分子量がＩ！、３００及び１５．０００
ダルトンであると報告されている［Ｍｉｚｅｌ、Ｓ、ｎ
、、　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３１
．１８３４（１９８３）；Ｓｃｈ＋＋ｉｄｔ、Ｊ、Ａ、
、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｉｏｏ、７７２（１９８４）］
　　。

最近、マウスＰ３８ｇＤ　Ｉ細胞を用いマウスＩＬ−１
ポリペプチドをコードするｃ　ＤＮＡをクローニングし
、ＩＬ−１活性を有する１００個のアミノ酸からなるポ
リペプチドを大腸閏で生産させることに成功したと報告
されている［Ｌｏｗｅｄｉｃｏ　Ｐ４．　ｅｔａｌ、、
　Ｎａｔｕｒｅ、３１２，４５８（＋９８４）］　−ま
た、ヒトＩＬ−１に関しては、ヒト単核球或いはヒト　
マクロファージからヒトＩＬ−１ポリペプチドをコード
するｃ　ＤＮＡがクローニングされ、形質発現に成功し
たことが報告されている［Ａｕｒｏｎ、Ｐ、Ｅ、ｃｔ　
ａｔ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８１，７
９０？（１９８４）、Ｍａｒｃｈ、Ｃ，Ｊｅｔ　ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ　３１５，６４１（１９８５）］、上８
己のＩＬ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列が同一ではなく、複数のＩＬ−１の存在が示唆されて
いる。

一方、本発明者らは、逍伝子組み換え技術を応用してヒ
トＩＬ−１ポリペプチドを製造すべくｖ：１．α研究の
結果、ヒ）　ＩＩＬ−Ｇｏ細胞を用いてヒトＩＬ−１前
駆体ポリペプチドをコードするクローン化ｃ　ＤＮＡの
単層に成功し、このクローン化ｃＤＮＡに由来するＤＮ
Ａを組み込んだ組み換え体プラスミドで形質転換された
微生物中で、ヒ）　ＩＬ−１前駆体のＣ末端側１５９残
基からなるポリペプチドを生産させ、不純物を実質的に
含有しないヒトＩＬ−１ポリペプチドを単離することに
成功し特許出願を行っている（特開昭ＧＯ−１１２４７
４号）６更に研究を重ねた結果、ＩＬ−１の生物活性の
うち特に医薬品としての利用価値の高いＴ細胞の増殖に
及ぼす作用、すなわちＬＡＦ活性を発押するには、必ず
しも前記の１５９残基のアミノ酸配列を必要とせず、そ
れより少ない残基数のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドもＬＡＰ活性をイｒすることを兄い出し、本発明を完
成した。

本発明は、ＩＬ−１活性を示すポリペプチドをフードす
るＤＮＡ　１すなわち下記式［Ａ］で示されるアミノ酸
配列に対応する塩基配列、或いはそのＮ末端のアミ／ｆ
ｉ（Ｓｅｔ）から１７番目Ｃ＋＋ｅ）までのアミノ酸が
順次１個づつ除去されたそれぞれのアミノ酸配列に対応
する塩基配列を仔し又は含む新規Ｄ　Ｎ　Ａ及びその製
造法に関する。

Ｓｃｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｃ　　
Ｌｅｕ　　Ｓｃｒ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　ＬｙｓＴｙ
ｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＩＩｅ
Ｌｙ’ｓ　Ｔｙｒ　ＧｌｕＰｈｅ　ｌｌｃ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｎ　ＡｓＰ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　５ｅ
ｒ１１ｅ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ａｌｉ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　
Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡｌａ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＧｌｕ　
ＡｌａＶａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒＳｃｒ　Ｌｙｓ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＩＩＣＴｈｒ　Ｖａ
ｌ　ｌ１ｅＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　
Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＶａｌＴｈｒ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ
　Ｖａｌ　ＬｃｕＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｕ　ｌｌｃ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒｌｌｃ
　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｌｅｕ　Ｌｃｕ　ＰｈｃＰｈｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒ　ｌ１ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙ
ｒＰｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｌ１ｉｓ
　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ＋１ｅ　Ａｌａ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｖａ
ｔ　ＣｙｓＬａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　
Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｇｌ
ｎ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ
　　［Ａ］上言己ポリペプチド［Ａ］自体をコードする
ＤＮＡの典型的な塩基配列は次に示す通りである。

（５’）ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＡＧＣＴＴＣＣＴＧ
　ＡＧＣＡＡＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴ　
ｒ〜ＴＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣΔＴＣＡＡＡ　ＴＡＣＧＡＡ
ＴＴＣＡＴＣＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡＡ
Ｔ　ＣＡＡ　ＡＧＴＡＴＡ　ＡＴＴ　ＣＧＡ　ＧＣＣＡ
ＡＴ　ＧＡＴ　ＣＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＴ　ＧＣ
Ｔ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＴ
　ＧＡＡ　ＧＣＡＧＴＧ　　ＡＡＡ　　ＴＴＴ　　ＧＡ
ＣＡＴＧ　　ＧＧＴ　　ＧＣＴ　　ＴＡＴ　　ＡＡＧ　
　ＴＣＡＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　Ａ
ＡＡ　ＡＴＴ　ＡＣＣＧＴＧ　ＡＴＴＣＴＡ　ＡＧＡ　
ＡＴＣＴＣＡ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＴＡ
Ｔ　ＧＴＧＡＣＴ　ＧＣＣＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　Ｇ
ＡＣＣＡＡ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＴＧＣＴＧ　　ＡＡＧ
　　ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＣＣＴ　　ＧＡに　　ＡＴＡ
　　ＣＣＣＡＡＡ　　ＡＣＣＡＴＣＡｃＡ　ＧＧＴ　Ａ
ＧＴ　ＧＡＧ　ＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣ
ＴＧＧ　　ＧＡＡ　　ＡＣＴ　　ＣＡＣＧＧＣＡＣＴ　
　ＡＡＧ　　ＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡ　ＴＣＡ　ＧＴ
Ｔ　ＧＣＣＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＴＴＧ　ＴＴＴＡＴ
Ｔ　　ＧＣＣＡＣＡ　　ＡＡＧ　　ＣＡＡ　　ＧＡＣＴ
ＡＣＴＧＧ　　ＧＴＧ　　ＴＧＣＴＴＧ　　ＧＣＡ　　
ＧＧＧ　　ＧＧＧ　　ＣＣＡ　　ＣＣＣＴＣＴ　　ＡＴ
ＣＡＣＴ　　ＧＡＣＴＴＴ　　ＣＡＧ　　ＡＴＡ　　Ｃ
ＴＧ　　ＧＡＡ　　ＡＡＣＣＡＧ　　ＧＣＧ（３’）［
Ｉ３コ本発明はまた。ＩＬ−１活性を示すポリペプチド
、すなわち前記式［Ａ］で示されるアミノ酸配列をイｆ
するか、或いはそのＮ末端のアミノａ（Ｓｅｔ）から１
７番目（Ｉｌｅ）までのアミノ酸が順次１個づつ除去さ
れたそれぞれのアミノ酸配列を存する新規ポリペプチド
又はその誘４体及びその製造法にも関する。

上記ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの項生
の側鎖官能基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキ
シル基を利用して形成される誘導体を意味し、例えばカ
ルボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第−
或いは第二アミンとの酸アミド類、アミ７基のＮ−アシ
ル誘導体又はヒドロキシル基の０−アシル誘導体、さら
には該ポリペプチドのカルボキシル基又はアミ７基等と
で形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、アルギニ／、カフェイン、プロカイン、塩酸、グ
ルコン酸等との塩が挙げられる。

本発明のポリペプチドは、会合体として存在し得る場合
もあり、このような会合体も本発明のポリペプチドに包
含される。

以下に本発明のＤＮＡ及びポリペプチドについてその作
製並びに製造法について述べる。

ヒ）　ＩＬ−１前駆体ポリペプチドをコードする塩基配
列を任するＤＮＡは、例えば後記参考例１に示した方法
により単離することができる。

このＤＮＡを適当な制限酵素で切断したのち、これと必
要に応じて常法により合成したＤＮＡアダプターとを結
合することにより、本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列の５′末端に開始コドンＡＴＧ　、　３
’末端に終止コドンを存する塩基配列を含むＤＮＡ断片
を作製することができる。

これを適当なプロモーター及びシャイン・ダルガー７（
ＳＤ）配列に続いて結合させ、ベクターに組み込むこと
により、本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクタ
ーを得ることができる。

プロモーターとしては、例えばＩａｃ、　ｔｒｐ、　ｔ
ａｃ。

ｐｈｏＳ、　ｐｈｏ＾、　　ｐｔ、、　　ＳＶ４０初期
プロモーター等が挙げられる。ベクターとしては、形質
転換させる宿主中で増殖するものはすべて用いることが
できる。

例えば、プラスミド（ｐｎＲ３２２等）、ファージ（λ
）７一ジ誘導体等）、ウィルス（ＳＶ４０等）が挙げら
れる。また、う／ナラエイ　プラスミドも有用である。

これらの形質発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸苗
などに、例えばコーエ／らの方法［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、６９．２１１０（
＋９７２）］により導入することにより形質転換体を得
、次いで該形質転換体を培養することにより本発明のポ
リペプチド或いはそのＮ末端にメチオニンが付加したポ
リペプチドを産生させることができる。該生産物は使用
したプロモーターと形質発現ベクターの構築法により、
宿主中の細胞質内又は細胞質外に蓄積させることができ
る。細胞質外に分泌させるには、例えばアルカリホスフ
ァターゼの構造逍伝子（ｐｈｏ＾）やリン酸結合蛋白の
構造逍伝子（ｐｈｏＳ　）を用い、それらのシグナルペ
プチドをコードする領域に続いてポリペプチドをコード
するＤＮＡを結合させた形質発現ベクターを構築すれば
よい。

このようにして得られた形質転換体を、それぞれの形質
転換体に応じた適当な培養条件下で、目的のポリペプチ
ドが十分に産生されるまで培養したのち、培養物からポ
リペプチドを抽出する。産生したポリペプチドが細胞質
中に蓄積される場合は、例えば、リゾチーム消化と凍結
融解や超音波破砕、フレンチプレス等により宿主細胞を
破壊したのち、遠心性ｍ又は濾過にて抽出液を集める。

また、ペリプラスムに蓄積される場合は、例えばウィル
スキーらの方法［Ｊ、１１ａｃｔｅＮｏ１．．１２７，
５９５（１９７０）］に従って抽出することができる。

このようにして得られた粗製のポリペプチドは蛋白質の
一般的な精製法（限外ｄ過、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過、電気泳動。

アフィニティクロマトグラフィー？）に従い精製するこ
とにより、目的とするポリペプチドを実質的に純品とし
て得ることができる。

本発明のポリペプチドのうち、前記式［Ａ］で示される
アミノ酸配列のＮ末端側の１個、９個又は１４個のアミ
ノ酸が除去されたアミノ酸配列を佇するポリペプチドが
好ましいものとして挙げることができる。

本発明のポリペプチドの誘導体は、上記のようにして得
られたポリペプチドを原料として、これに脂肪層アルコ
ールを作用させ該ポリペプチドのエステル体を、カルボ
ン酸の反応性誘導体を作用させ該ポリペプチドのＮ−ア
シル又は０−アシル体を、第１アミン又は第２アミンを
作用させ該ポリペプチドのアミド体を、それぞれ形成せ
しめることができる。これらの反応は常法に従い行なわ
れる。さらには、本発明のポリペプチドに有機酸、無機
酸、塩基を常法により加えることにより本発明のポリペ
プチドの酸又はアルカリ塩を形成せしめることができる
。

（以下余白） 次に、本発明のポリペプチドの特性について以下に記述
する。

分子Ｑ、Ｎ末端アミノＭ、Ｃ末端アミノ酸及びＩＬ−１
活性の測定方法は次の通りである。

（１）　　分子ｆｆｉ測定 分子量はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）存在下に
おけるポリアクリルアミドゲル（ゲル０度１２．５％）
電気泳動分析により測定した。

実施例１〜３で得たそれぞれのポリペプチド溶液を等容
量の４％ＳＤＳ　、１０％２−メルカプトエタノール、
２０％グリセロール及び０．０２％ブロムフェノールブ
ルーを含む０．＋２５Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ
　Ｂ樹液（ｐｌＩＯ，８＞と混合し、３０分間室ａｔ’
放置後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
に付した。

泳動用溶媒として０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭＴｒｉ
ｓ−０，２Ｍグリシン液を用い、２００Ｊ？ルトで３時
間泳動させた。泳動終了後、クマシーブリリアントブル
ー６２５０を用いる染色で蛋白質の泳動位置を、また別
途にゲルを１■巾で切り出し各ゲル片を１％重炭酸ア／
モ二ウつ水溶Ｚに浸漬し、ゲル中のｆＪｆ白質を抽出し
た。各ゲル片から得たそれぞれの抽出液について後記す
る方法に従ってＴＬ−１活性を測定し、精製ポリペプチ
ドを得た。

分子量既知の標窄蛋臼賀としてホスフＪリラーゼｂ　（
ＭＷ９４，０００）　、　　ウシ血清アルブミン（ＭＷ
０７．０００＞　、オボアルプミｙ　ＭＷ　４３，００
０）　、炭酸脱水酵素（ＭＷ　３０，０００）　、大豆
トリプシン　インヒビター（ＭＷ　２０，１００）及び
α−ラクトアルブミン（ＭＷ　１４，４００）を用いた
。

Ｃ）　　Ｎ末端アミノ酸分析 （１）項に記載の方法により得られた精製ポリペプチド
について、ダンシル化法［Ｇｒａｙ、Ｗ、Ｒ，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｖｏｌＸＩ　、ｐＬ１９
（１９Ｂ？）］により、Ｎ末ｒＪアミノ酸を同定した。

精製ポリペプチド溶液の１００μｌに、ＩＯ％ＳＤＳの
ｌＯμ１．Ｎ−エチルモルフオリ／の１００μ！及びダ
ンシルクロリド（アセトン中５　ｍｇ／　ｍｌ）の５０
μｌを添加し、３７°Ｃで１時間加温した。更に、２１
１のアセトンを加え、析出した沈殿を遠心分層にて集め
、これを８０％アセトンにて洗浄した。沈殿を真空乾燥
させたのち、ｆ’Ｅ　Ｎ　ｌ−ｌＣｌの１００μｐに６
解し、真空密封ガラス口中で１０５°Ｃ，５〜１８時間
加熱した。

真空乾燥にて乾燥させたのち、水飽和酢酸エチルで抽出
し、ダンシル化されたアミノ酸をポリアミン　シート（
Ｃｈａｎｇ−Ｃｈｉｎ　Ｔｒａｄｉｎｇ　Ｃｏ、Ｔａｉ
ｗａｎ）を用いる二次元薄層クロマトグラフィー［Ｗｏ
ｏｄｓ、に、Ｒｏａｎｄ　Ｗａｎｇ、に、Ｔ、、１１ｉ
ｏｃｈｉｍ、ｌ１ｌｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　、　１３
３　、３０９（１９０７＞］により同定した。

（３）Ｃ末端アミノ酸分析 精製ポリペプチドＩｆＪ液の２０μ！に、１００ｍＭ酢
Ｍす）　ＩＪ　ウ１Ｊｌｉ＆　（ｐ１］５．４）　ノ＋
８μＬ　　１　％ＳＤＳの４μｌ及びカルボキシペプチ
ダーゼＹ　（０，１Ｂ／１）の２μ！を添加し、２５°
Ｃで５〜１５分静置した。この反応液の１０μａに１０
０ｍＭｆｆ１炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，３）の５
μ！及びダンシルクロリド（アセトン中５　ｍｇ／■１
）の１０μｌを添加し、３７℃で１時間加温した。更に
、酢酸２μ！及び酢酸エチルの２０μ！を加え、激しく
振丑したのち酢酸エチル層に回収されたダンシル化アミ
ノ酸を、ポリアミン　シートを用いる二次元Ｆｇ層クロ
マトグラフィーにより同定した。

＋４１　１Ｌ−１活性 ＩＬ−１活性は、マイトーダンによるマウス胸腺細胞分
裂作用を促進させる生物活性、すなわちり７３球活性化
因子（ＬＡＦ　）活性により評価した。

精製ポリペプチド溶液を５％牛脂児血１ｎを含む組織培
養用培地ＲＰＭ＋−１（＋４０にて希釈した。各希釈液
の５０ｕｌを９６穴平底型プレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ
ｓ、）に入れ、それぞれに２５μｇ／■１０度のフィト
ヘマグルチニン−ｐ　（Ｄｉｆｃｏ社）の５０μ！を添
加し、更にＣ３１１／　ｌｌｅマウスより採取した胸腺
細胞（ＩＸＩＯ７個／１）溶液の１００μ！を加え、３
７°Ｃで５％炭酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００％
で２日間培養した。

次いで、引−チミジンの１μＣｉを加え、更に１８時間
培養したのち、細胞内にとりこまれた刊−チミジン量を
計測することにより、　ＬＡＦ活性を測定した。

その結果を下表１に示す。

表　　　　１ 表中において、前記式［Ａ］で示されるポリペプチドの
Ｎ末端のＳｅｔが除去されたポリペプチドを、ＩＬ−１
（＋５７）　、同ポリペプチド［ＡコのＮ末端側の５ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｓｎ−Ｖａｔが除去されたポリペプチドを、ＩＬ−
１（１４９）　、同ポリペプチド［Ａ］のＮ末端側の５
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａ＋＋ｎ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｃｔが除去されたポリペプチドをＩＬ−１（１４
４）と略記した。

本発明のポリペプチドおよびその誘導体は、免疫不全治
療剤又は抗ｋＲ瘍剤として用いられうる。

本発明のポリペプチドおよびその誘４体の製剤化にあた
っては、溶液及びｉ＊結乾燥品のいずれでも良いが、長
期安定性の点から凍結乾操品が望ましい。そして試形剤
や安定化剤をｒＦｘ加するのが好ましい。安定化剤とし
ては、例えばアルブミン、グロブリフ、ゲラチン、プロ
タミノ、プロクミン塩。

グルコース、ガラクトース、キシロース、マンニット、
グルクロ／酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキ
シエチルデンプン、非イオン界面活性剤（ポリオキシエ
チレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル レンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンン
ルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレ７　１２　化ヒマ
シ油．ポリオキシエチレンヒマシ油。

ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエー
テル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロッ
クポリマー，ンルビタ／脂肪酸エステル、シ９糖脂肪酸
エステル、グリセリ／脂肪酸エステル）等が挙げられる
。これらの製剤は常法に従い製造することができる。

本明細書では２柾の簡略化のために以下の略号を使用す
る。

Ａ　　　　　アブ二／ Ｃ　　　　　シトシン Ｇ　　　　　グアニン Ｔ　　　　チミン Ａｌａ　　　　　アラニン 八ｒｇ　　　　　アルギニン Ａｓｎ　　　　　　アスパラギン Ａｓｌ）　　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　　　システィア Ｇｌｎ　　　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　　グリシ／ ＩＩ　ｉ　ｓ　　　　　　ヒスヂクン ＋１ｅ　　　　　　インロイシ／ Ｌｅｕ　　　　　　ロイ７ン Ｌｙｓリジ／ Ｍｅｔ　　　　　　メチオニン Ｐｈｅ　　　　　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　　　　プロリ／ Ｓｅｔセリ／ Ｔ）＋ｒ　　　　　スレオニン Ｔｒｐ）リプトファ／ Ｔｙｒ　　　　　　チロシン Ｖａｌ　　　　　バリン ＤＮＡ　　　　　デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　　　　　相補ＤＮＡ ｓ　ｓ　ｃ　ＤＮＡ　　　単鎖ｃ　ＤＮＡｄｓｃＤＮＡ
　　　二重Ｓｒ１ｃＤＮＡＲＮＡリボ核酸 ｍＲＮＡ　　　　　伝令ＲＮＡ ポリ（＾）ｍＲＮＡポリアデニル酸含有伝令ＲＮＡｄＡ
ＴＰ　　　　　デオキシアデノシン三リン酸ｄｃＴＰ　
　　　　デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　　　
デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　　　　　デオキ
シチミジン三リン酸オリゴ（ｄＣ）　　　オリゴデオキ
シシチジル酸オリゴ（ｄＧ）　　　オリゴデオキシグア
ニル酸オリゴ（ｄＴ）　　　オリゴデオキシチミジル酸
ポリ（Ａ）　　　　ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ）　　　　　ポリウリジル酸 ポリ（ｄＡ）　　　　ポリデオキシアデニル酸ポリ（ｄ
Ｃ）　　　　ポリデオキシシチジル酸ポリ（ｄＧ）　　
　　ポリデオキシグアニル酸ポリ（ｄＴ）　　　　ポリ
デオキシチミジル酸ＡＴＰ　　　　　　アデノシフ三す
／ｉ！ｌＩＥＤＴＡ　　　　　エチレンジアミ／四酢酸
ｋｂ　　　　　　キロ塩基 ｋｂｐ　　　　　　キロ塩基対 ｂｐ　　　　　　塩基対 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

また下記の実施例の理解を容易にするため第１、２図を
示した。

（以下余白） 実施例Ｉ ＩＬ−１活性を示すポリペプチド［Ｉ　Ｌ−１（＋５７
）］の″ＩＡ造 第２表のアミノ酸番号１１５〜２７１の１５７残基から
なるアミノ酸配列を有するポリペプチド生産用形質発現
プラスミド（ｐＨＬＰ３８４）を、参考例２に示しり方
法ニ従って＊築した。ただし、参考例２で用いた合成オ
リゴヌクレオチド　アダプター［Ｉ［１１にかえて、次
式で示される合成アダプターを用いた。

得られた形質発現プラスミドを参考例２に示した方法に
従って、Ｅ、ｃｏｌｌｌｌ［１Ｉ０１に導入し形質転換
体を得た。

この形質転換体をＬＩ３ブロス中３７°Ｃで一夜振盪培
養した。その菌体懸濁液のＩＯｍ＋を１１の改良Ｍ９培
地（組成：１．５％Ｎａ２ＨＰＯａ・ｌ２Ｈ２０，０，
３％ＫＨ２ＰＯａ。

０．０５％ＮａＣ１，０，１％ＮＨａＣ１、２ｍｇ／　
１ビタミンＩｌ＋。

０．５％カザミノ酸＋　２　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　
＋　０　、１　ｍＭ　Ｃ’ａＣｌ　２１０．５％ブドウ
糖）に接種し、３７℃で１時間培養し、次いでインドー
ル−３−アクリル酸を終濃度２０μｇ／１１になるよう
に加え、更に２４時間培養を継続した後、遠心分離によ
り菌体を集めた。菌体を１００１７７）０．１％リゾチ
ーム及び３０ｍＭ　ＮａＣ＋を含む５０　ｍＭＴｒｉｓ
−１１ＣＩ　（ＰＩ（８，０）　緩衝液に再懸濁し、０
°Ｃで３０分間静置した後、ドライアイス／エタノール
浴での凍結と３７℃での融解を繰り返した後、２１の１
０％ポリエチレンイミンを加え静置した。次いで、遠心
分離により菌体残渣を除き、Ｔ？′Ｉ澄な抽出液を得た
。

この抽出液に等容量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加
え静置したのち、遠心分離にて沈殿画分を集めた。この
沈殿画分を約１００１の２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ−Ｉ　
Ｃ１緩８Ｔ液（ｐＨ８，０）に溶解し、同１１衝液に対
して透析したのち、予め同Ｉｉ液にて平衡化されたＤＥ
ＡＥ−セファロースＣＬ−Ｏｎカラムに負荷した。

同緩衝液にて該カラムを充分洗浄したのち、ＮａＣｌ濃
度０〜０．５Ｍの濃度勾配にて溶出した。ＩＬ−１活性
を存する溶出画分を集め、限外濾過にてＱ縮したのち、
セファクリルＳ−２００によるゲル濾過に付し、ＩＬ−
１活性を存する両分を集めた。

この溶出液のＩＬ−１活性測定では、１×１０４倍希釈
液で４５　、３９４ｃｐ■の刹−チミジンの取り込みを
認め、ＩＬ−１活性を確認した。

実施例２ １Ｌ−１活性を示すポリペプチド［Ｉ　Ｌ−ＤＩ４９）
］の製造 第２表のアミノ酸番号１２３〜２７１の１４９残基から
なるアミノ酸配列を存するポリペプチド生産用形質発現
プラスミドを第１図に示すように構築した。

参考例２で得た組み換え体プラスミドｐＨＬＰ３８３か
ら制限酵素ＥｃｏＲＩとｌ１ｉｎｄＩｆｆにて、第２表
に示した塩基配列の第３９８番目から下流側の約４２２
ｂＰのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片に、常法によ
り合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させた。

別途に、プラスミドｐＨＬＰ３８３から制限酵素Ｃ１ａ
Ｉと旧ｎｄＩ［１にて切断し、トリプトファ／　プロモ
ーター頭載の一部及びアンピシリン耐性遺伝子とテトラ
サイクリン耐性逍伝子を含む大きなりＮＡ　ｆｒ片を得
た。

このＤＮＡ断片に、先にＮ製したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させることにより、１４９残基
のアミノ酸よりなるポリペプチド生産用形質発現プラス
ミド（ｐＨＬＰ３８５）を構築した。

このプラスミドｐＨＬｒ’３８５を用い、実施例１に示
したと同様の方法で形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉｌｌｌｌ
ｌＱＩ／ｐＨＬＰ３８５）を得、この形質転換体を培養
し、更にその菌体抽出液から目的とするポリペプチドを
＋１１した。

このポリペプチド液のＩＬ−１活性測定では、ｌＸ１０
４倍希釈液で２７　、７００ｃｐｍの引−チミジ／の取
り込みを認め、ＩＬ−１活性を確認した。

実施例３ の製造 第２表のアミノ酸番号１２８〜２７１の１４４残基から
なるアミノ酸配列を存するポリペプチド生産用形質発現
プラスミドを、実施例２に示した方法に従ってｖｌ築し
た。ただし、実施例２で用いた合成オリゴヌクレオチド
アダプター［Ｉ］にかえて、次式 で示される合成アダプターを用いることにより、！４４
残基のアミノ酸よりなるポリペプチド生産用形質発現プ
ラスミド（ｐＨＬＰａ８０）を構築した。

このプラスミドｐＨＬＰ３８Ｂを用い、実施例１に示し
たと同様の方法で形質転換体を得、この形質転換体を培
養し、更にその菌体抽出液から目的とするポリペプチド
を単離した。

このポリペプチドのＩＬ−１活性測定では、１×１０３
倍希釈液で１５，０９２ｃｐ−の’ｌ（−チミジンの取
り込みを認め、ＩＬ−１活性を確認した。

実施例４ １４３残基からなるポリペプチドの製造第２表のアミノ
酸番号１２９〜２７１の１４３残基からなるアミノ酸配
列を有するポリペプチド生産角形ＭＱ現プラスミド（ｐ
ｕｔｐ３８７）を、実施例２に示した方法に従って構築
した。ただし、実施例２で用いた合成オリゴヌクレオチ
ドアダプター［Ｉ］にかえて、次式 ％式％ で示される合成アダプターを用いた。

このプラスミドｐＨＬＰ３８７を用い、実施例１に示し
たと同様の方法で形質転換体を得、この形質転換体を培
養し、更にそのΔ体抽出液から目的とするポリペプチド
を単離した。

このポリペプチド液のＩＬ−１活性測定では、１０倍希
釈液で１２，７００ｃｐ■の上−チミジンの取り込みを
認めた。

（以下余白） 参考例１ ヒトＩＬ−１前駆体ポリペプチドをコードするｃ　ＤＮ
Ａのクローニング及び塩基配列の決定ＨＬ−Ｅ３０細胞
をペトリディフシュ（直径８０鳳）にＩ　Ｘ　１０７個
／　ｌ０ｍ１／　ｄｉｓｈの条件で播いた。培養液には
ＩＯ％牛脂児血１ｎ含仔のＲＰＭＩ−１８４０培地を用
い、分化誘導剤としてホルボール−１２−ミリステート
−１３−アセテートとビタミンＡＭをいずれも最終濃度
として５００ｎｇ／　ｍｌになるように添加した。３７
℃で５％炭酸ガス含存空気中、湿度９０〜１００％で２
日間培養したのち、培養液と浮遊細胞を吸引除去した。

分化した細胞が伸行したディツシュにＩＯ％牛脂児血清
含仔Ｒｒ’Ｍ１１６４０培地に誘導剤としてエンドトキ
シン（大腸菌由来のりボポリサブカライド）をＩＯμｇ
／閣１濃度に、蛋白合成阻害剤としてシクロへキシミド
を１Ｍｇ／■１濃度に添加した培地の１０１を加え、更
に５時間培養した。培養終了後、培養液を吸引除去し、
ディツシュ上に残った分化細胞を０．５％ラウロイルサ
ルコシン酸ナトリウム、５ｍＭクエン酸ナトリウム及び
０．１Ｍ　２−メルカプトエタノールを含む６Ｍグアニ
ジルチオシアネート液で溶解し、ホモジナイズした。こ
のホモジネートをＯ，ＩＭ　ＥＤＴＡ含を５．７Ｍ塩化
セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離機（ＲＰＳ２７
−２０一ター１日立工機）を用い２６，５００ｒｐｍで
２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレフトとして得た。こ
れを０．３５Ｍ　　ＮａＣｌ、　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ及
び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量に溶解し
、エタノール沈殿として回収した。

この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＩＯｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｔ−ＩＣＩ緩衝液（ｆ）８７．４）　　（以
下ＴＥ液という）２１に溶解し、６５℃で５分間加熱し
た。これにＮａＣ＋溶液を０．５Ｍとなるように加えた
後、あらかじめ０．５Ｍ　ＮａＣ＋を含むＴＥ液で平衡
化したオリゴ（ｄＴ）セルロース男ラムに付し、吸わし
たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出した。

ここで得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを以下の実験に用
いた。

■　ｃ　ＤＮＡの合成 （１）項で得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型として
グプラーとホフマンの方法［Ｇｅｎｅ２５，２０３（１
９８３）］に準じてｃ　ＤＮＡを合成した。該ポリ（Ａ
）　、　ｍＲＮＡ（６μｇ）を６μｌの蒸留水に溶解さ
せ、これに０．６μｌ０１００ｍＭ水酸化メチル水銀水
溶液を添加し室温で１０分間放置した１次いで、２０単
位のＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓ＋ｎ■、　Ｐｒｏ
ｍｅｇａＬｏｔｅｃ社製品）を含む５００ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール液の１，７μｌを添加した。室温で
５分間放置したのち、更に１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１．
２５ｍＭ　ｄＧＴＰ、　１．２５ｍＭ　ｄＡＴ＋’。

１．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ、　０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、Ｏ
，＋７μＭ　ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性、　７５０
Ｃｉ／　ｍ５ｏｌｅ）　、　４　ｔｔｇオリゴ（ｄＴ）
　１２〜＋ａ、　　１２０単位トリ骨髄、性白血病ウィ
ルス由来逆転写酵素を含む３２ｕｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）緩衝液を添加し、４２℃で６
０分間反応させた後、　ＥＤＴＡを加えて反応を停止さ
せた。フェノール／クロロホルム混液（１：１）で抽出
し、その水腹に酢酸アンモニウムを終濃度２．５Ｍにな
ルヨうに加え、エタノールにより反応生成物（ｓｓｃＤ
ＮＡ−ｍＲＮＡ複合体）を沈殿させた。コ（ＱｓｓｃＤ
Ｎ八−ｍＲＮＡ複合体を下記組成の反応緩衝液１００μ
！に溶解した。

反応緩衝液組成： ５　ｍＭ　ＭｇＣＩ２．　ｌ０ｍＭ　（ＮＨａ）　２ｓ
Ｏ４，１００ｍＭＫＣ１，０，１５ｍＭβ−ニコチンア
ミド　アデニン　ジヌクレオチド、４０μＭ　ｄＧＴＩ
’、　４０μＭｄＡＴＰ、　４０μＭｄＴＴＰ、　４０
μＭ　ｄＣＴＰ、及び５μｇウシ血１ｎアルブミン、　
１．２５単位大腸菌リボヌクレアーゼＩ夏、２１位大腸
ΔＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　　（ＰＨ７，５）　Ｂ衝／ＩＩｉ′。

該溶解液を１２゛Ｃで６０分間反応させ、これに２，５
単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを添加し、更に２２°Ｃで
６０分間反応させた。　ＥＤＴＡを加えて反応を停止さ
せた後、上記と同様に７エノール／クロロホルム混液で
抽出し、エタノールにより反応生成物（ｄｓｃＤＮＡ　
）を沈殿させ、回収した。

（３）　　ｄＣテール付付加　ＤＮＡの調製２項で得ら
れたｄｓｃＤＮＡを下記組成の反応緩衝液１００μｌに
溶解させ、３７℃で３０分間反応させ、ｄ　ｓ　ｃ　Ｄ
ＮＡにｄＣテールを付加させた。

反応緩衝液組成： ２　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭジチオスＬ／イトー
ル。

０．１ｍＭα−″Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性Ｉ　Ｃ！／　
ｍ５ｏｌｅ）及びＩＯ単単位ターミナルデオキシヌクレ
オリジルトランスフェラーゼ含有する１００ｍＭカコジ
ル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）。

反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノール
／クロロホルム混液フ抽出し、ｄＣテール付加ｄｓｃＤ
ＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。これを１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ及びｌ００ｍＭ　ＮａＣ＋を含む１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−）菖ＣＩ　（ＰＨ７，４）Ｉｎｎ液液て、
２μｇ／ｍｌの濃度に溶解させた。

（４）　組み換え体プラスミドの作製 ｄＧデテール加ＰｎＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｃ
ｓ、Ｌａｂｓ。

Ｉｎｃ、製）と（３）項で得られたｄＣテール付付加　
ｓ　ｃＤＮＡを１．５ｍｌのｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１
００ｍＭ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　（ｐＩ−１７，４）　１３衝液中、それぞれ１．５μ
ｇ及び０．０９μｇ含むように溶解混合させた後、６５
℃で１０分間、５７°Ｃで２時間、さらに４５℃で２時
間加温しアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶
液を調製した。

■　形質転換体のｉ！！択 （４）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、
Ｅ、ｃｏｌ＋χ１７７６株を形質転換させた。即ち、Ｅ
、ｃｏｌｉχ１７７６株を、ジアミノピメリ７ｍ１００
μｇ／ｍｌ及びチミジ／４θμｇ／ｍｌを補ったし一グ
ロス（組成＝ＩＩ当りトリプト７１０ｇ、酵母エキス５
　ｇ　、ＮａＣ１５ｇ、　　ブドウ糖１　ｇ　、　　Ｐ
）１７．２）　２０ｍ１中、３７℃で吸光度（ＧＯＯｎ
ｍ）が０．５となるまで培養し、菌体を遠心分離し、５
０ｍＭ　ＣａＣ＋２含有１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝
液（ｐＨ７，３）　１０ｕｌにて洗浄した。

集めた菌体を同じ緩衝液２１に懸濁させ、０℃で５分間
０置した。この懸濁液０．２１に上記組み換え体プラス
ミド溶液０．１１を添加混合し、０℃で１５分間り置し
、更に４２℃で２分間保持した後、上記の培養で用いた
のと同一組成のし−ブロス０．５１を加えて１時間振Ｗ
培養を行った。この培養液の一部を取り、上記組成に加
えてテトラサイタリン（１５μｇ／ｌ）が添加されたし
一グロス寒天平板に広げ３７°Ｃで約１２時間培養し、
テトラサイクリン耐性菌を進択してｃＤ、ＮＡライブラ
リーを作製した。

（６）　　クローニング （５）項で得られたｃＤＮＡう（ブラリーから、参考例
３で得た組み換え体プラスミドｐＲＬ＋５からウサギＩ
Ｌ−１をコードするクローン化ｃ　ＤＮＡの断片をプロ
ーブとして用いたコロニー　ハイプリダイゼーシクン試
験及びハイブリダイゼーシ１１７トランスレーシヨン試
験ＣＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、。

“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉＢ”３２９（＋９８０
）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、
］によりヒトＩＬ−１ポリペプチドをコードするｃ　Ｄ
ＮＡを含むプラスミドを存する形質転換体を選び出した
。

この組み換え体プラスミドをｐ　ＩＩ　Ｌ　４と名づけ
た。

（２）　クローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列の決定クロー
ン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列はＭ１３フ１−ジを用いるジ
テオキン法にて決定した。ＭＩ３ｍｐ１８及びＭ　１３
ａｐ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｐ−を旧ａｃｈｅｌｉ
ｃａ　＋ｓｌＪ：製）をクローニングベクターとし、旧
３ンークエノンングキフト（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔ
ｅｒｎａＮｏｎａｌ　ｐｌｃ社製）を用い、“ＭＩ３ク
ロー二／グ及びシークエ／シ７グハ７ドブコク″　（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃｔ
ｔ製）に従って実施した。

その塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸
は下記第２表に示すとおりであり、ヒトＩＬ−１前駆体
ポリペプチドをコードしている。

第１〜３番の塩基が開始コドンＡＴＧであり、第８１４
〜８１６番の塩基は終止コドンＴＡＧである。

（以下余白） 第２表 ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＣ
ＡＴＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＡ
ＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧ（１バυ。

［註］※×※は終止コド／を示す。

（）中の数字はアミノｌ！１番号を示す。

（以下余白） 参考例２ ヒ）　ＩＬ−１（＋５９残基）ポリペプチド生産用形質
転換体の作製 第２表のアミノ酸番号１１３〜２７＋のアミノ酸配列を
有する＋５９残基からなるヒトＩＬ−１ポリペプチド生
産用形質発現プラスミド（ｐＨ［、Ｐ２Ｓ５）を第２図
に示すように構笑した。

すなわち、参考例１−　（６１で得た組み換え体プラス
ミドｐ　ＩＩ　Ｌ　４から制限酵素Ｐｓｔ　Ｉによりク
ローン化ｃＤＮＡ部分を切り出し、更に制限酵素Ａｌｕ
Ｉを作用させ、第２表に示した塩基配列の第３５１番目
から下流側の約５３３ｂＰのＤＮＡ断片を得、更にこれ
に制限酵素ＢｓｔＮ　Ｉを作用させ、第２表の塩基配列
の第３５１番から第８０８番までに和光するＤＮＡ断片
を単離した。このＤＮＡ断片に、常法により合成した次
式 ％式％［］ 及び次式 ５′−ＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　［ＩＶコ３′−ＣＣＧＣＡＣ
ＴＡＣＴＴＣＧＡ で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターを順次Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、上記の
＋５９残基のアミノ酸からなるヒトＩＬ−１ポリペプチ
ドをコードする塩基配列の５′末端に開始コドンＡＴＧ
を付加し、更に終止コドンＴ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａを付
加したＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＩＩＩＬ−
１断片という。

一方、プラスミドｐＣＴ−１［１ｋｅｈａｒａ、Ｍ、ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８１，
５９５（ｉ（１９８４）］に制限酵酵素１ｐａＩとυ止
■を作用させ里プロモーター領域の一部を含む約３８０
ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断片に、常法
により合成した次式５式％（１ で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させた。

とｃＤ　ＤＮＡ　ＩＩｉ　片ニ、先ニＦＡ製したＩＩＩ
Ｌ−１断片をＴ４ＤＮΔリガーゼを用いて結合させ、Ｄ
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をプロモーター＋１１
Ｌ−１断片という。

別ａに、プラスミドｐＢＲ３２２に制限酵素Ａｖａ　Ｉ
とＰｖｕ　Ｕを作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７
ｋｂｐ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離
した。

このＤＮＡ断片の両端をＤＮＡポリメラーゼ■（クレノ
ー　フラグメント）及びｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＣ
ＴＰ。

ｄＴＴＰを用い平滑末端とし、その両端をＴ４　ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させた。このプラスミドベクター
をＰ［１Ｒ５Ｏという。さらに、このｐＩＩＲｓｏベク
ターに制限酵素ＡａｔＩＩと１ｌｉｎｄｌｌｌを作用さ
せ、大きなりＮＡ断片（約３．８ｋｂｐ）を単離精製し
た。

このＤＮＡ断片に先に調整したプロモーター＋１１Ｌ−
１断片をＴａ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させること
により、１５９残基からなるヒトＩＬ−１ポリペプチド
生産用形質発現プラスミドを構来した。この形質発現プ
ラスミドをＰＩＩＬＰ３８３と名づけた。

この形質発現プラスミド（ｐＨＬＰ３８３）を下記の方
法によりＥ、ｃｏｌｉ　１１８１０１に導入し形質転換
体を得た。

すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１ＢＩＯＩをＬブロス（組
成：１１当たり、トリプトンＩＯｇ、酵母エキス５ｇ、
ＮａＣ１５ｇ、　　ブドウＩＩ！　１　ｇ　；　ｐＨ７
，２）の５１に接種し、３７°Ｃで一夜培養した。その
菌体懸濁液の１ｍｌを１００菖ｌのＬブロスに接種し、
濁度（吸光度６５０ｎ鳳）がＯ，Ｇになるまで３７°Ｃ
で培養した。氷水中で３０分間静置後、菌体を遠心分離
により集め、これを５０１の５０ｍＭ　ＣａＣ＋　２に
懸濁し、０°Ｃで６０分間静置した。次いで、遠心性ｍ
により菌体を集め、２０％グリセリンを含む５０ｍＭ　
ＣａＣ＋２のｌ０ｗ１に再懸濁した。

この懸濁液に上記の形質発現ベクターｐＨＬＰ３８３を
添加し、これを氷水中で２０分間、４２°Ｃで１分間。

室温で１０分間インキュベートした後、ＬＢブロス（組
成；１１当たり、トリプト７１０ｇ　、酵母エキス５ｇ
及びＮａＣｌ　ＩＯｇ、　　ｐｌ−１７，５）を加え、
３７°Ｃで６０分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を
２５μｇ／−ｌアンピシリンを含むＬＩ３寒天平板に播
き、３７°Ｃで一夜培養した後、ア／ピンリ／耐性クロ
ーンを選択して形質転換体を得た。

（以下余白） 参考例３ ウサギＩＬ−１ｃＤＮＡのｙＡ製 （１）　ウサギＩＬ−１ｍＲＮＡの調製ウサギにプロピ
オニバクテリウム　アクネス死菌体を１別当たり＋００
■ｇの投与量で静脈内に注入し、８日後に屠殺した。直
ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したチューブを介し
てリン酸ｒＡ衝化生理食塩液を用い肺洗浄を操り返し、
肺胞マクロファージを採取した。この肺胞マクロファー
ジをｌθ％牛脂児血清含をのＲＰＭＩ−１６４０培地に
懸濁させてベトリディッシュ（直径８０曹）に１枚当た
りｌＸｌ０’個となるように播き、３７℃で５％炭酸ガ
ス含仔空気中、湿度９０〜１００％で前培養した。１時
間の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由来のりボポ
リサブカライド）　、　ＴＩ’Ａ（ホルボール−１２−
ミリステート−１３−アセテート）及びシクロへキシミ
ドをそれぞれ最終０度がＩＯμｇ／　ｍｌ、　５００ｎ
ｇ／　ｍｌ及びＩμｇ／ｍｌとなるように添加混和し、
更に培養を継続した。

４時間後に培養液を吸引除去し、ディツシュ上に残った
マクロファージから参考例１−（１）項に示した方法に
従ってポリ（＾）ｍＲＮＡを得た。

ここで得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡをアガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度１％、６Ｍ尿素存在下、　　ｐＨ４）に
付し、２．６〜３．７ｋｂの分子サイズに相当する泳動
位置からポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを回収した。

■　ｃ　ＤＮＡライブラリーの作製 （１）項で得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型として
、参考例１−（２）から６）に示した方法に準じて、　
ｃ　ＤＮＡライブラリーを作製した。

（３）　　クローニング 上Ｊ己のｃ　ＤＮＡライブラリーについて、ウサギＩＬ
−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため３２　ｐ標識ｃ　ＤＮ
Ａプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーンｇノ
試験をハナへンらの方法［Ｇｅｎｅ。

１０．０３（＋９８０）］に従って行った。エアトドキ
シン。

ＴＰＡ及びシクロへキシミドと共に培養［上３ｉ！　（
１）項参照コした肺胞マクロファージ及びこれらのｉＪ
Ω操作を省略した肺胞マクロファージからそれぞれ上記
（１）項の方法で得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型とし
て、参考例１−（２）項の方法で合成し、ｆｆｆｆ　ｐ
で標識したｃ　ＤＮＡをそれぞれ誘導プラス及びＨａマ
イナスプローブとした。この試験により誘導プラスのプ
ローブと結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブリ
ダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラスミドを有
する形質転換体を選別した。

次イテ、これらの遭択されたクローンについてハイブリ
ダイゼーシヨ／・トランスレージｇ７試験を上記（鳳）
項で得たポリ（＾）ｍＲＮＡを用い、ウサギＩＬ−１ｍ
ＲＮＡと強くハイブリダイズするクローンを選び出した
。

このクローンの有する組み換え体プラスミドをｐＲＬ＋
５と名づけた。

【図面の簡単な説明】

第１図は形質発現プラスミドＰＨＬＰ３８５の構築工程
を示す。尚、図中の式［１１は実施例２で示したオリゴ
ヌクレオチド　アダプターを音味する。 第２図は形質発現ベクターｐＨＬＰ３８３の構築工程を
示す。尚、図中の式［Ｉ［１１、［ＴＶ］　、　　［Ｖ
］は参考例２で示したそれぞれのオリゴヌクレオチド　
アダプターを特徴する 特許出願人　大日本製薬株式会社 代　　理　　人　　坪　　井　　存　　四　　部第１− ＪＬｕｌ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターロイキン１活性を示すポリペプチド又は
   その誘導体。
2. （２）下記式［Ａ］で示されるアミノ酸配列を有するか
   、或いはそのＮ末端から１７番目までのアミノ酸が順次
   １個づつ除去されたそれぞれのアミノ酸配列を有する特
   許請求の範囲第（１）項記載のポリペプチド又はその誘
   導体。 【アミノ酸配列があります】［Ａ］
3. （３）下記式で示されるアミノ酸配列を有する特許請求
   の範囲第（１）項記載のポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】
4. （４）下記式で示されるアミノ酸配列を有する特許請求
   の範囲第（１）項記載のポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】
5. （５）下記式で示されるアミノ酸配列を有するか、或い
   はそのＮ末端のＡｒｇが除去されたアミノ酸配列を有す
   る特許請求の範囲第（１）項記載のポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】
6. （６）特許請求の範囲第（３）〜（５）項記載のいずれ
   かのポリペプチドのＮ末端にＭｅｔが結合してなる特許
   請求の範囲第（１）項記載のポリペプチド。
7. （７）インターロイキン１活性を示すポリペプチドをコ
   ードする塩基配列を有し又は含むＤＮＡ。
8. （８）下記式［Ａ］で示されるアミノ酸配列に対応する
   塩基配列、或いはそのＮ末端から１７番目までのアミノ
   酸が順次１個づつ除去されたそれぞれのアミノ酸配列に
   対応する塩基配列を有し又は含む特許請求の範囲第（７
   ）項記載のＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります】
9. （９）下記式で示されるアミノ酸配列に対応する塩基配
   列を有し又は含む特許請求の範囲第（７）項記載のＤＮ
   Ａ。 【アミノ酸配列があります】
10. （１０）下記式で示されるアミノ酸配列に対応する塩基
    配列を有し又は含む特許請求の範囲第（７）項記載のＤ
    ＮＡ。 【アミノ酸配列があります】
11. （１１）下記式で示されるアミノ酸配列、或いはそのＮ
    末端のＡｒｇが除去されたアミノ酸配列に対応する塩基
    配列を有し又は含む特許請求の範囲第（７）項記載のＤ
    ＮＡ。 【アミノ酸配列があります】
12. （１２）下記式で示される塩基配列を有し又は含む特許
    請求の範囲第（７）項記載のＤＮＡ。 【塩基配列があります】
13. （１３）下記式で示される塩基配列を有し又含む特許請
    求の範囲第（７）項記載のＤＮＡ。 【塩基配列があります】
14. （１４）下記式で示される塩基配列を有し又は含む特許
    請求の範囲第（７）項記載のＤＮＡ。 【塩基配列があります】
15. （１５）下記式で示される塩基配列、或いはその５′末
    端のコドン（ＡＧＧ）が欠失した塩基配列を有し又は含
    む特許請求の範囲第（７）項記載のＤＮＡ。 【塩基配列があります】
16. （１６）特許請求の範囲第（７）〜（１５）項記載のい
    ずれかの塩基配列の５′末端に開始コドン及び／又は３
    ′末端に終止コドンが結合した塩基配列を有し又は含む
    特許請求の範囲第（７）項記載のＤＮＡ。
17. （１７）特許請求の範囲第（７）〜（１６）項記載のい
    ずれかのＤＮＡを組み込んだベクター。
18. （１８）ベクターが形質発現ベクターである特許請求の
    範囲第（１７）項記載のベクター。
19. （１９）ベクターが大腸菌中で増殖し得るベクターであ
    る特許請求の範囲第（１７）項又は第（１８）項記載の
    ベクター。
20. （２０）ベクターが大腸菌プラスミドである特許請求の
    範囲第（１７）〜（１９）項記載のいずれかのベクター
    。
21. （２１）ベクターがｐＨＬＰ３８４、ｐＨＬＰ３８５、
    ｐＨＬＰ３８６又はｐＨＬＰ３８７である特許請求の範
    囲第（２０）項記載のベクター。
22. （２２）特許請求の範囲第（１７）〜（２１）項記載の
    いずれかのベクターで形質転換された宿主。
23. （２３）形質転換された宿主が微生物である特許請求の
    範囲第（２２）項記載の宿主。
24. （２４）形質転換された宿主が大腸菌である特許請求の
    範囲第（２２）項又は第（２３）項記載の宿主。
25. （２５）特許請求の範囲第（７）〜（１６）項記載のい
    ずれかのＤＮＡを形質発現ベクターに組み込み、これに
    より形質転換された宿主を培養し、産生されるインター
    ロイキン１活性を示すポリペプチドを採取することを特
    徴とする該ポリペプチドの製造法。