JPH08198902A - Low molecular weight lipopolysaccharide - Google Patents
Low molecular weight lipopolysaccharideInfo
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- JPH08198902A JPH08198902A JP7012126A JP1212695A JPH08198902A JP H08198902 A JPH08198902 A JP H08198902A JP 7012126 A JP7012126 A JP 7012126A JP 1212695 A JP1212695 A JP 1212695A JP H08198902 A JPH08198902 A JP H08198902A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品等として使用し得る安全性が極めて高
く、かつ生物活性の高い新規な低分子量ＬＰＳを提供す
る。
【構成】 微生物菌体から得られ、ａ）タンパク質マー
カーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が
５，０００±２，０００であり、他に染色帯を認めない
こと、ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソ
サミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること、
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること、ｄ）リムラス活性が少なくとも１０ＥＵ
／ｎｇであること、の理化学的および生物学的性質を有
する新規な低分子量リポポリサッカライド。(57) [Abstract] [Purpose] To provide a novel low molecular weight LPS which has extremely high safety and can be used as a drug and has high biological activity. [Structure] Obtained from microbial cells, a) the molecular weight measured by SDS-PAGE using a protein marker is 5,000 ± 2,000, and no other staining zone is observed, b) Elson-Morgan The hexosamine content measured by the method is 1 to 3 / molecular weight 5,000,
c) 2-keto-3-as measured by the diphenylamine method
Deoxyoctonate content 1-3, molecular weight 5,000
0, d) limulus activity of at least 10 EU
/ Ng, a novel low molecular weight lipopolysaccharide having physicochemical and biological properties.
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】この発明は、特定の理化学的性質
および生物学的性質を有し、安全性が極めて高く（毒性
が低い）、かつ生物活性の高い新規な低分子量リポポリ
サッカライドに関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel low molecular weight lipopolysaccharide having specific physicochemical and biological properties, extremely high safety (low toxicity) and high biological activity. Is.
【０００２】[0002]
【従来の技術】リポポリサッカライド（lipopolysaccha
ride。以下ＬＰＳと記載することがある）は、大腸菌、
サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペ
プチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質および糖
からなる複合化合物であり、Ｏ抗原およびエンドトキシ
ンの活性成分として知られている［ジェー・エム・ギュ
ーセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen an
d R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バ
イオケミストリー(New Comprehensive Biochemistr
y)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacte
rial Cell Wall) 、第１８ページ、エルセヴィア(Elsev
ea) 、１９９４年］。ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質
を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれ
るオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている
（「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１
ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。2. Description of the Related Art lipopolysaccha
ride. Hereinafter sometimes referred to as LPS) is E. coli,
It is a complex compound consisting of lipids and sugars existing in the outer membrane surrounding the peptidoglycan of the cell wall of Gram-negative bacteria such as Salmonella and Pertussis, and is known as the active component of O antigen and endotoxin [J.M. Earl Huckenbeck (JM Ghuysen an
d R. Hakenbeck), `` New Comprehensive Biochemistr
y) ", Volume 27, Bacterial Cell Wall (Bacte
rial Cell Wall, page 18, Elsev
ea), 1994]. The basic structure of LPS is composed of lipid A having a specific lipid, an oligosaccharide called R core covalently bonded to it, and an O-specific polysaccharide (“Nikkei Biotechnology Latest Glossary”, No. 431).
Page, Nikkei McGraw-Hill, 1985).
【０００３】リピドＡの基本構造は多くの菌種に共通で
あり、基本骨格はβ−１、６結合のグルコサミニル・グ
ルコサミンからなりＣ−１位およびＣ−４´位にそれぞ
れリン酸を結合している場合が多い。各アミノ基は３−
ヒドロキシ脂肪酸を、水酸基は数種の飽和脂肪酸または
ヒドロキシ脂肪酸を結合し、独特の糖脂質を形成してい
るが、脂肪酸の種類は菌種によって多少異なっている。
少数例であるが基本骨格が全く異なり、２，３−ジアミ
ノ−２、３−ジデオキシ−Ｄ−グルコースのみからなる
例も報告されている（野間惟道編、「医科学大辞典第４
９巻」、第８２ページ、講談社、１９８４年）。The basic structure of lipid A is common to many bacterial species, and the basic skeleton is composed of glucosaminyl and glucosamine with β-1,6 linkages, and phosphates are bound at the C-1 and C-4 'positions, respectively. There are many cases. Each amino group is 3-
Hydroxy fatty acid and hydroxyl group combine several kinds of saturated fatty acid or hydroxy fatty acid to form a unique glycolipid, but the kind of fatty acid is slightly different depending on the bacterial species.
Although a small number of cases have completely different basic skeletons, an example consisting only of 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-glucose has also been reported (Nomori Michido, “Medical Science Dictionary No. 4”).
9 ", page 82, Kodansha, 1984).
【０００４】Ｒコアの構造はサルモネラ属のようにそれ
に属する大部分の菌種に共通である場合と、大腸菌のよ
うに部分的に異なる数種の構造が知られている場合とが
ある［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケ
ンベック(J.M. Ghuysen andR. Hakenbeck) 編、「ニュ
ー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Compr
ehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・
セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第２８３ペー
ジ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。一般にヘ
プトースと２−ケト−３−デオキシオクトネート（以下
ＫＤＯと記載する）が多くのＲコアに共通の構成成分で
あり、ＫＤＯを介してリピドＡと結合しているが、菌種
によっていずれか一方または双方が欠如しているＬＰＳ
の存在も知られている［ジェー・エム・ギューセンおよ
びアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenb
eck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミス
トリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７
巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wa
ll) 、第２９４〜２９５ページ、エルセヴィア(Elseve
a) 、１９９４年］。The structure of R core is common to most of the bacterial species belonging to it, such as Salmonella, or several partially different structures are known, such as Escherichia coli [J.・ JM Ghuysen and R. Hakenbeck, ed., "New Comprehensive Biochemistry (New Compr
ehensive Biochemistry) ", Volume 27, Bacterial
Bacterial Cell Wall, page 283, Elsevea, 1994]. Generally, heptose and 2-keto-3-deoxyoctonate (hereinafter referred to as KDO) are common components to many R cores, and they are bound to lipid A via KDO, but depending on the bacterial species, either LPS lacking one or both
Is also known [JM Guysen and R. Hakenb
eck), “New Comprehensive Biochemistry”, No. 27
Volume, Bacterial Cell Wa
ll), pages 294-295, Elseve
a), 1994].
【０００５】Ｏ特異多糖の構造は、構成成分の中で最も
多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原と
しての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖
の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、
または繰返し構造でないものも知られている。Ｏ特異多
糖の生合成はＲコアのそれとは異なる遺伝子の支配を受
けており、接合または形質導入により異なる菌種のＯ特
異多糖を置換することが可能であり、菌の毒力およびワ
クチンの研究等に応用されている［ジェー・エム・ギュ
ーセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen an
d R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バ
イオケミストリー(New Comprehensive Biochemistr
y)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacte
rial Cell Wall) 、第２６５〜２６７ページ、エルセヴ
ィア(Elsevea) 、１９９４年］。The structure of O-specific polysaccharides is the most diverse among the constituent components, is specific to the bacterial species, and exhibits so-called O-antigen activity. Generally characterized by a repeating structure of oligosaccharides consisting of several types of monosaccharides, but consisting of the same monosaccharide,
Alternatively, a non-repeating structure is also known. The biosynthesis of O-specific polysaccharide is controlled by a gene different from that of R-core, and it is possible to replace O-specific polysaccharide of different bacterial species by conjugation or transduction. Has been applied to [JM Ghuysen an
d R. Hakenbeck), `` New Comprehensive Biochemistr
y) ", Volume 27, Bacterial Cell Wall (Bacte
rial Cell Wall, pp. 265-267, Elsevea, 1994].
【０００６】ＬＰＳは極めて多様な薬理作用を有してい
るが、例えば抗原およびＬＰＳを同時に投与した場合、
免疫反応が増強されることから、ＬＰＳは現在ワクチン
効果を高める補助剤（アジュバント）の一種として重用
されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第３１２ペ
ージ、講談社、１９７３年）。従来、多種多様なＬＰＳ
が報告されているが、一般にどのような方法で抽出した
ＬＰＳであっても、１０6 〜１０7 の極めて大きな分子
量を有することが知られている（本間遜他編、「細菌内
毒素」、第２１１ページ、講談社、１９７３年）。その
後、比較的分子量の小さいＬＰＳも報告され、小麦由来
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量８，０００±１，００
０または５，０００±２，０００、リン酸数１〜４／分
子量８，０００、ヘキソサミン数６±２／分子量８，０
００、脂肪酸数６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数５
±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２４
５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４
９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平
４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報、
特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−４０９３７
号公報）、クロレラ由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量４０，０００〜９０，０００、リン酸数４±１／分子
量１万、ヘキソサミン数７±１／分子量１万、脂肪酸数
６±１／分子量１万、ＫＤＯ数２±１／分子量１万のＬ
ＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２
４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−
４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開
平４−４９２４０号公報、特開平５−１５５７７８号公
報、特開平６−４０９３７号公報）、大腸菌由来のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量３０，０００±５，０００、
リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／
分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±
１／分子量３万のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公
報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４
２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４
９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報）、百日
咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±
１，０００または９，０００±１，０００、リン酸数５
／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量
８，０００、脂肪酸数５／分子量８，０００、ＫＤＯ数
２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２
４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−
４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開
平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公
報）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４
０，０００±１０，０００または８，０００±４，００
０、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±
６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数
５±１／分子量３万のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号
公報）、セラチア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量５，０００±１，０００、リン酸数２±１／分子
量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，００
０、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特開
平６−４０９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公
報、特開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８
１号公報、特開平６−９０７４５号公報）、エンテロバ
クター属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，
５００±２，５００、リン酸数１〜２／分子量５，００
０、ヘキソサミン数７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ
数１〜２／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０
９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平
６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公報、
特開平６−９０７４５号公報）、パントエア属細菌由来
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５０
０、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン
数５±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量
５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報、特
開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公
報、特開平６−９０７４５号公報）、百日咳菌由来のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００、
リン酸数４／分子量６，０００、ヘキソサミン数１２／
分子量６，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量６，０００
のＬＰＳ（特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−
４０９３７号公報）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による分子量６，０００±１，０００または９，５００
±１，５００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソ
サミン数１６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１
／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−１８７６４
０）、アエロモナス・ヒドロフィア種菌由来のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，５００、リン酸
数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／
分子量５，０００、ＫＤＯ数０．８±０．５／分子量
５，０００のＬＰＳ（特開平６−１４１８４９号公
報）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量５，０００、リン数２／分子量５，０００、ヘキ
ソサミン数２／分子量５，０００、ＫＤＯ数５／分子量
５，０００［バイオセラピー(BIOTHERAPY)、第６巻、第
３号、第３５７ページ、１９９２年］等が報告されてい
る。 前記のとおり分子量５，０００前後のＬＰＳは、
既に報告されているが、これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
ける主染色帯が、５，０００または６，０００であると
同時に、分子量３万以上に相当する染色帯も存在してい
たのである。即ち、従来の分子量５，０００前後のＬＰ
Ｓは分子量３万以上のＬＰＳとの混合物であった。[0006] LPS has a wide variety of pharmacological actions, but when, for example, an antigen and LPS are administered simultaneously,
Since the immune response is enhanced, LPS is now heavily used as a kind of adjuvant (adjuvant) that enhances the vaccine effect (Hiroshi Honma et al., “Bacterial endotoxin”, page 312, Kodansha, 1973). Conventionally, various LPS
However, it is generally known that LPS extracted by any method has an extremely large molecular weight of 10 6 to 10 7 (Hiroshi Honma et al., “Bacterial endotoxin”, Page 211, Kodansha, 1973). After that, LPS having a relatively small molecular weight was also reported, and the molecular weight by wheat SDS-PAGE was 8,000 ± 1,000.
0 or 5,000 ± 2,000, phosphoric acid number 1 to 4 / molecular weight 8,000, hexosamine number 6 ± 2 / molecular weight 8.0
00, fatty acid number 6 ± 2 / molecular weight 8,000, KDO number 5
LPS with a molecular weight of ± 1 / 8,000 (JP-A-4-4924)
5, JP-A-4-49243, JP-A-4-4243
9242, JP-A-4-49241, JP-A-4-49244, JP-A-4-49240,
JP-A-5-155778, JP-A-6-40937
Gazette), molecular weight 40,000-90,000 by SDS-PAGE derived from Chlorella, phosphoric acid number 4 ± 1 / molecular weight 10,000, hexosamine number 7 ± 1 / molecular weight 10,000, fatty acid number 6 ± 1 / molecular weight 10,000. , KDO number 2 ± 1 / L with molecular weight 10,000
PS (JP-A-4-49245, JP-A-4-492
43, JP-A-4-49242, and JP-A-4-49242.
49241, JP 4-49244 A, JP 4-49240 A, JP 5-155778 A, JP 6-40937 A), SD derived from E. coli.
Molecular weight by S-PAGE 30,000 ± 5,000,
Phosphoric acid number 12 / molecular weight 30,000, hexosamine number 45 ± 6 /
Molecular weight 30,000, fatty acid number 18 / molecular weight 30,000, KDO number 5 ±
LPS having a molecular weight of 1 / 30,000 (JP-A-4-49245, JP-A-4-49243, JP-A-4-4924)
No. 2, JP-A-4-49241, JP-A-4-4
9244, JP-A-4-49240), molecular weight 6,000 ± by SDS-PAGE derived from B. pertussis.
1,000 or 9,000 ± 1,000, phosphoric acid number 5
LPS having a molecular weight of 8,000, a hexosamine number of 16 ± 2 / a molecular weight of 8,000, a fatty acid number of 5 / a molecular weight of 8,000, and a KDO number of 2 ± 1 / a molecular weight of 8,000 (JP-A-4-492).
45, JP-A-4-49243, and JP-A-4-49243.
49242, JP-A-4-49241, JP-A-4-49244, JP-A-4-49240), E. coli-derived SDS-PAGE molecular weight 4
20,000 ± 10,000 or 8,000 ± 4,000
0, phosphoric acid number 12 / molecular weight 30,000, hexosamine number 45 ±
6 / molecular weight 30,000, fatty acid number 18 / molecular weight 30,000, KDO number 5 ± 1 / molecular weight 30,000 LPS (JP-A-6-40937), molecular weight 5,000 ± 1 by SDS-PAGE derived from Serratia spp. 1,000, phosphoric acid number 2 ± 1 / molecular weight 5,000, hexosamine number 9 ± 1 / molecular weight 5,000
0, LPS having a KDO number of 2 ± 1 / molecular weight of 5,000 (JP-A-6-40937, JP-A-5-155778, JP-A-6-65092, JP-A-4-9948)
No. 1, JP-A-6-90745), molecular weight 6, by SDS-PAGE derived from Enterobacter bacteria.
500 ± 2,500, phosphoric acid number 1-2 / molecular weight 5,000
0, hexosamine number 7 ± 1 / molecular weight 5,000, KDO
LPS having a number of 1 to 2 / molecular weight of 5,000 (JP-A-6-40
No. 937, No. 5-155778, No. 6-65092, No. 4-99481.
JP-A-6-90745), a molecular weight of 6,500 ± 2,50 by SDS-PAGE derived from a Pantoea bacterium.
0, phosphoric acid number 2 ± 1 / molecular weight 5,000, hexosamine number 5 ± 1 / molecular weight 5,000, KDO number 2 ± 1 / molecular weight 5,000 (JP-A-6-40937, JP-A-6-937) 65092, JP-A-4-99481, JP-A-6-90745), S derived from B. pertussis.
Molecular weight by DS-PAGE 6,000 ± 1,000,
Phosphoric acid number 4 / molecular weight 6,000, hexosamine number 12 /
Molecular weight 6,000, KDO number 2 ± 1 / molecular weight 6,000
LPS (JP-A-5-155778, JP-A-6-
No. 40937), SDS-PAGE derived from B. pertussis.
Molecular weight of 6,000 ± 1,000 or 9,500
± 1,500, phosphoric acid number 5 / molecular weight 8,000, hexosamine number 16 ± 2 / molecular weight 8,000, KDO number 2 ± 1
/ LPS having a molecular weight of 8,000 (JP-A-4-18764)
0), SDS-derived from Aeromonas hydrophila
PAGE molecular weight 5,000 ± 1,500, phosphoric acid number 2 ± 1 / molecular weight 5,000, hexosamine number 9 ± 1 /
LPS having a molecular weight of 5,000, a KDO number of 0.8 ± 0.5 / a molecular weight of 5,000 (JP-A-6-141849), a molecular weight of 5,000 by SDS-PAGE derived from Pantoea bacteria, and a phosphorus number of 2 / molecular weight. 5,000, hexosamine number 2 / molecular weight 5,000, KDO number 5 / molecular weight 5,000 [BIOTHERAPY, Volume 6, No. 3, page 357, 1992] and the like have been reported. As described above, LPS having a molecular weight of about 5,000 is
As already reported, the main staining band in these SDS-PAGE was 5,000 or 6,000, and at the same time, there was a staining band corresponding to a molecular weight of 30,000 or more. That is, a conventional LP having a molecular weight of about 5,000
S was a mixture with LPS having a molecular weight of 30,000 or more.
【０００７】ＬＰＳの用途についてはこの発明の発明者
らにより、これまでに抗トキソプラズマ剤（特開平４−
４９２４５９号公報）、コレステロール低下剤（特開平
４−４９２４３号公報）、抗ヘルペス剤（特開平４−４
９２４２号公報）、抗リュウマチ剤（特開平４−４９２
４１号公報）、抗糖尿病剤（特開平４−４９２４４号公
報）、抗消化性潰瘍剤（特開平４−４９２４０号公
報）、免疫機能活性化剤（特開平４−９９４８１号公
報、特開平６−１４１８４９号公報）、経口・経皮免疫
機能促進剤（特開平４−１８７６４０号公報）、鎮痛剤
（特開平６−４０９３７号公報）、発育促進剤（特開平
３−１５５７７８号公報）、抗禁断症状剤（特開平６−
６５０９２号公報）等が提案されている。Regarding the use of LPS, the inventors of the present invention have hitherto been able to use an anti-toxoplasma agent (Japanese Unexamined Patent Publication No.
492459), cholesterol lowering agent (JP-A-4-49243), anti-herpes agent (JP-A-4-4).
9242), an anti-rheumatic agent (JP-A-4-492).
41), antidiabetic agents (JP-A-4-49244), anti-peptic ulcer agents (JP-A-4-49240), immune function activators (JP-A-4-99481, JP-A-6-9481). -141849), oral / transdermal immune function promoter (JP-A-4-187640), analgesic (JP-A-6-40937), growth promoter (JP-A-3-155778), anti Withdrawal agent (JP-A-6-
No. 65092) has been proposed.
【０００８】しかしながら、従来のＬＰＳは、安全性の
面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本
組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔ◆」、第１２
１ページ、朝倉書店、１９８７年）。一方、細菌の細胞
壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノー
ル−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal)
編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリ
ー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第
８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、
１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・ス
タブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology a
nd Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤ
ＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４
３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られてい
るが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコー
ル酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量
約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報
告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９
ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０
００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極
めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、
従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８
１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されている
が、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３
０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また
特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０
号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分
子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開
示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およ
びイオン交換において精製された標品であり、高分子量
ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子
量ＬＰＳが混在していた。However, it has been pointed out that the conventional LPS has a problem in clinical application from the viewpoint of safety (edited by the Japan Tissue Culture Society, “Cell Growth Factor part ◆”, No. 12).
1 page, Asakura Shoten, 1987). On the other hand, regarding the method for purifying LPS from the cell wall of bacteria, the conventional phenol-water extraction method [O. Westphal] was used.
Hen, Methods in Carbohydrate Chemistry, Volume 5, Page 83, Academic Press,
1965], Trichloroacetic acid extraction method [AM Staub, ed., Methods in Immunology.
And Immunochemistry (Methods in Immunology a
nd Immunochemistry), Volume 1, Page 28, Academic Press, 1967], ED
TA extraction method [Journal of Biological Chemistry, No. 24
No. 3, page 6384, 1968] and the like are known, and the LPS thus obtained has a molecular weight of about 20,000 in the presence of a surfactant such as sodium deoxycholate. It has been reported to dissociate into subunits (Haruma Ryo et al., "Bacterial endotoxin", No. 229).
Page, Kodansha, 1973). On the other hand, the molecular weight is 20,0
Regarding a method of obtaining only LPS of extremely low molecular weight of about 5,000 without including LPS of 00 or more,
It was not reported before. For example, JP-A-4-9948
No. 1 publication shows a diagram of SDS-PAGE. In addition to the dyeing zone having a molecular weight of about 6,000, a molecular weight of 3
There are clearly more than 10,000 dyed zones. Further, JP-A-4-187640 and JP-A-4-49240.
JP-A-5-155778 and JP-A-5-155778 disclose low-molecular-weight LPS having a molecular weight of 5,000 or 6,000, both of which are purified by the thermal phenol method and ion exchange. The step of completely eliminating the molecular weight LPS was not performed, and the high molecular weight LPS was mixed.
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】前記の通り、従来報告
されている低分子量のＬＰＳは、高分子量ＬＰＳを含む
混合物であって、例えば免疫機能活性化剤等の薬剤成分
として臨床的に用いるには、安全性の面からも、あるい
は薬効性能の面からも必ずしも満足のいくものではなか
った。。As described above, the low molecular weight LPS that has been reported so far is a mixture containing high molecular weight LPS, and is used clinically as a drug component such as an immune function activator. Was not always satisfactory in terms of safety or efficacy. .
【００１０】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、従来のＬＰＳに比して安全性が高
く（すなわち、毒性が低く）、かつ生物活性の優れた新
規なＬＰＳを提供することを目的としている。The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel LPS which is more safe (that is, less toxic) than conventional LPS and has excellent biological activity. It is intended to be provided.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】この発明の発明者らは、
前記のような課題を解決するため、鋭意研究をおこなっ
た結果、従来報告されているＬＰＳとは異なる新規な低
分子量ＬＰＳを発見し、しかもこの新規な低分子量ＬＰ
Ｓが、従来のＬＰＳに比べて極めて安全性が高く、かつ
生物活性も従来のＬＰＳに比して優れていることを見い
出し、この発明を完成した。SUMMARY OF THE INVENTION The inventors of the present invention have
As a result of earnest research to solve the above problems, a new low molecular weight LPS different from the previously reported LPS was discovered, and the novel low molecular weight LPS was found.
It was found that S is much safer than the conventional LPS and is superior in biological activity to the conventional LPS, and completed the present invention.
【００１２】すなわち、この発明は、微生物菌体から得
られ、次のａ）〜ｃ）の理化学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること を有する低分子量リポポリサッカライドを提供する。That is, the present invention is obtained from microbial cells and has the following physicochemical properties a) to c): a) The molecular weight measured by the SDS-PAGE method using a protein marker is 5,000 ± 2,000. And other dye bands are not substantially observed. B) The hexosamine content measured by the Elson-Morgan method is 1 to 3 / molecular weight 5,000. C) The 2-keto-3 measured by the diphenylamine method. −
Deoxyoctonate content 1-3, molecular weight 5,000
A low molecular weight lipopolysaccharide having a value of 0 is provided.
【００１３】さらにこの発明は、微生物菌体から得ら
れ、次のａ）〜ｆ）の理化学的および生物学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること ｆ）核酸含量が、１％以下であること を有する低分子量リポポリサッカライドをも提供する。Further, the present invention is obtained from microbial cells and has the following physicochemical and biological properties of a) to f): a) The molecular weight measured by SDS-PAGE using a protein marker is 5,000 ±. It is 2,000, and no other dyeing zone is substantially observed. B) The hexosamine content measured by the Elson-Morgan method is 1 to 3 / molecular weight 5,000. C) The measurement by the diphenylamine method 2- Keto-3-
Deoxyoctonate content 1-3, molecular weight 5,000
0) d) limulus activity of at least 10 EU / ng e) protein content of 1% or less f) nucleic acid content of 1% or less Low molecular weight lipopolysaccharide provide.
【００１４】また、この発明においては、前記の微生物
が、グラム陰性の微生物であることさらにはそのグラム
陰性微生物が、パントエア(Pantoea) 属に属する微生物
またはサルモネラ(Salmonella)属に属する微生物である
を望ましい態様としてもいる。 次にこの発明について
詳述する。なお、以下の説明において、百分率の表示
は、特に断りのない限り、重量による値である。Further, in the present invention, the above-mentioned microorganism is a Gram-negative microorganism, and the Gram-negative microorganism is a microorganism belonging to the genus Pantoea or a microorganism belonging to the genus Salmonella. It is also a desirable mode. Next, the present invention will be described in detail. In addition, in the following description, unless otherwise specified, percentages are expressed by weight.
【００１５】この発明の低分子量ＬＰＳは、グラム陰性
の微生物、例えば、パントエア属に属する微生物または
サルモネラ属に属する微生物等を、常法により培養し、
培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法、例え
ば、熱フェノール法［オー・ウエストファール(O. West
phal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミ
ストリー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５
巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Pr
ess)、１９６５年］、により抽出し、さらに、陰イオン
交換樹脂により精製して製造できる。すなわち、微生物
の菌体を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を蒸留水および等
容量の熱フェノールの混合液に添加して撹拌し、次いで
遠心分離して水層を回収し、この水層を透析してフェノ
ールを除去し、限外瀘過法により濃縮して粗ＬＰＳ画分
を採取し、この画分を常法の陰イオン交換クロマトグラ
フィー（例えば、モノＱ−セファロースまたはＱ−セフ
ァロースを使用する）により精製し、常法により脱塩す
る。The low-molecular-weight LPS of the present invention is obtained by culturing a Gram-negative microorganism, for example, a microorganism belonging to the genus Pantoea or a microorganism belonging to the genus Salmonella by a conventional method,
The cells are collected from the medium and a known method from the collected cells, for example, the hot phenol method [O. Westfal (O. West
phal), Methods in Carbohydrate Chemistry, 5th
Volume, Page 83, Academic Press
ess), 1965], and further purified by anion exchange resin. That is, the microbial cells are suspended in distilled water, the suspension is added to a mixed solution of distilled water and an equal volume of hot phenol, the mixture is stirred, and then centrifuged to recover an aqueous layer. Is dialyzed to remove phenol, concentrated by the ultrafiltration method to collect a crude LPS fraction, and this fraction is subjected to conventional anion exchange chromatography (for example, mono-Q-sepharose or Q-sepharose). Used) and desalted by a conventional method.
【００１６】このようにして得られた精製ＬＰＳは特開
平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０号公
報、特開平４−９９４８１号公報および特開平５−１５
５７７８号公報に開示される分子量５，０００から６，
０００程度のＬＰＳと実質的に等しい。さらに、得られ
た精製ＬＰＳを、例えばデオキシコール酸ナトリウム等
の界面活性剤の存在下でゲル瀘過し、低分子量ＬＰＳを
含有する画分のみを回収し、混在する高分子量ＬＰＳを
除去することによって、高度に精製されたこの発明の新
規な低分子量ＬＰＳを得ることができる。この界面活性
剤存在下でのゲル瀘過の工程は、特開平４−１８７６４
０号公報、特開平４−４９２４０号公報および特開平５
−１５５７７８号公報に開示される分子量５，０００か
ら６，０００程度のＬＰＳを更に高度に精製するための
ものであり、この工程により混在する高分子量ＬＰＳが
完全に排除されるのである。The purified LPS thus obtained is disclosed in JP-A-4-187640, JP-A-4-49240, JP-A-4-99481 and JP-A-5-15.
The molecular weights disclosed in Japanese Patent No.
Substantially equal to 000 LPS. Further, the obtained purified LPS is subjected to gel filtration in the presence of a surfactant such as sodium deoxycholate to collect only a fraction containing low molecular weight LPS, and remove mixed high molecular weight LPS. Makes it possible to obtain highly purified novel low molecular weight LPS of the present invention. The step of gel filtration in the presence of this surfactant is described in JP-A-4-18764.
No. 0, JP 4-49240 A and JP 5
This is for further highly purifying LPS having a molecular weight of about 5,000 to 6,000 disclosed in Japanese Patent Publication No. 155778, and high molecular weight LPS mixed in is completely eliminated by this step.
【００１７】以上の方法により製造されたこの発明の新
規な低分子量ＬＰＳは、後記する試験例１に示すとお
り、 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること ｆ）核酸含量が、１％以下であること という理化学的および生物学的性質を有し、かつ少なく
とも９８％の純度を有している。しかしながら、使用目
的によっては、精製の程度を低く（例えば、９０％）す
ることもできる。The novel low molecular weight LPS of the present invention produced by the above method has a molecular weight of 5,000 ± 2 measured by SDS-PAGE using a) protein marker as shown in Test Example 1 described later. 5,000 and substantially no other dyeing zone is observed. B) Hexosamine content measured by Elson-Morgan method is 1 to 3 / molecular weight 5,000. C) 2-Keto measured by diphenylamine method. -3-
Deoxyoctonate content 1-3, molecular weight 5,000
0) d) The limulus activity is at least 10 EU / ng e) The protein content is 1% or less f) The nucleic acid content is 1% or less. And having a purity of at least 98%. However, depending on the intended use, the degree of purification can be lowered (for example, 90%).
【００１８】この発明の新規な低分子量ＬＰＳは、免疫
機能活性化作用を有する医薬品、動物用薬品等として使
用することもできる。次に試験例を示し、この発明の低
分子量ＬＰＳについてさらに詳しく説明する。試験例１ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの理化学的およ
び生物学的性質を調べるために行った。 １）試料の調製 実施例１および参考例１と同一の方法により低分子量Ｌ
ＰＳおよびＬＰＳをそれぞれ調製した。 ２）試験方法 分子量の測定 低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２
ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１０μｇを１．
５ｍｌ容プラスチックチューブに秤取した。これとは別
に、１８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの
５％β−メルカプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素
溶液、１１２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．
８）および２２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤ
Ｓ処理液１０μｌを、前記各試料溶液に添加して十分混
合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、その後直ちに氷
水中に浸して急冷した。The novel low molecular weight LPS of the present invention can also be used as a drug having an activity of activating immune function, a drug for animals and the like. Next, test examples will be shown to further explain the low molecular weight LPS of the present invention. Test Example 1 This test was conducted to examine the physicochemical and biological properties of the low molecular weight LPS of the present invention. 1) Preparation of sample Low molecular weight L was measured by the same method as in Example 1 and Reference Example 1.
PS and LPS were prepared respectively. 2) Test method Measurement of molecular weight Dissolve low molecular weight LPS and LPS in distilled water respectively and
A solution having a concentration of mg / ml was prepared, and 10 μg of the solution was added to 1.
Weighed into a 5 ml plastic tube. Separately, 180 μl of 10% (w / v) SDS, 45 μl of 5% β-mercaptoethanol, 90 μl of CBB dye solution, 112.5 μl of 0.5 M Tris-HCl (pH 6.
8) and SD prepared by adding 22.5 μl of distilled water
10 μl of the S treatment liquid was added to each of the sample solutions and mixed well, and then immersed in a boiling water bath for 5 minutes, and immediately thereafter, immersed in ice water to be rapidly cooled.
【００１９】１０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１
７．９ｇのトリシンおよび３．０３ｇのトリスを１リッ
トルの蒸留水に溶解して調製した泳動緩衝液をスラブゲ
ル電気泳動槽（マリソル社製）に入れた。２０％ポリア
クリルアミドゲルを泳動槽に固定し、サンプル溝に検体
を入れ、電圧を５０Ｖに１時間、次いで、１５０Ｖに固
定して、色素がゲルより溶出するまで泳動を継続した。
泳動終了後に、銀染色キット１６１−０４４３（バイオ
ラッド社製）により室温で銀染色を行い、挙動を確認し
た。ヘキソサミン含有量の定量 ヘキソサミン含有量を、エルソン−モルガン(Elson-Mor
gan)法（日本生化学会編、「生化学実験講座」、第４
巻、第３７７〜３７９ページ、第１版、東京化学同人出
版、１９７６年）により次のとおり定量した。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、
その１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イ
ワキガラス社製）に秤取し、これに１００μｌの８ＮＨ
Ｃｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し、のち４ＮＮ
ａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨを７に調整した。そ
の１００μｌを秤取し、別のスクリューキャップ付きス
ピッツに入れ、２００μｌの試薬Ａを加え、１０５℃で
１．５時間加熱し、流水で冷却した。次いで、その１０
０μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加
え、更に６７μｌの試薬Ｂを加え、室温で１時間放置
し、５３５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線作成
用標準試料としては０〜８００μｇ／ｍｌのＮ−アセチ
ルグルコサミン（和光純薬社製）を用いた。 試薬Ａ：７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムとの混合液。 試薬Ｂ：１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒド、３
０ｍｌの濃塩酸および３０ｍｌの９６％エタノールの混
合液。 ＫＤＯ含量の定量 ＫＤＯ含有量をジフェニルアミン法［アナリティカル・
バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、第５
８巻、第１号、第１２３〜１２９ページ、１９７４年］
により次のとおり定量した。10 ml of 10% (w / v) SDS, 1
A migration buffer prepared by dissolving 7.9 g of tricine and 3.03 g of Tris in 1 liter of distilled water was placed in a slab gel electrophoresis tank (Marisol). A 20% polyacrylamide gel was fixed to a migration tank, a sample was put in the sample groove, the voltage was fixed to 50 V for 1 hour, and then fixed to 150 V, and migration was continued until the dye was eluted from the gel.
After the completion of the electrophoresis, silver staining was performed at room temperature using a silver staining kit 161-0443 (manufactured by Bio-Rad) to confirm the behavior. Determination of Hexosamine Content The hexosamine content was determined by Elson-Mor
gan) method (edited by the Japanese Biochemical Society, "Biochemistry Experiment Course", No. 4)
Volume, pp. 377-379, 1st edition, Tokyo Kagaku Doujin Shuppan, 1976). LPS was dissolved in distilled water to prepare a solution having a concentration of 2 mg / ml,
100 μl thereof was weighed into a Spitz with screw cap (made by Iwaki Glass Co., Ltd.), and 100 μl of 8NH
Add Cl and heat at 110 ° C for 16 hours, then add 4NN
The pH was adjusted to 7 by adding about 200 μl of aOH. 100 μl thereof was weighed out, put in another Spitz equipped with a screw cap, 200 μl of the reagent A was added, heated at 105 ° C. for 1.5 hours, and cooled with running water. Then 10
0 μl was taken, 670 μl of 96% ethanol was added, 67 μl of reagent B was further added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the absorbance at 535 nm was measured. As a standard sample for preparing a calibration curve, 0-800 μg / ml N-acetylglucosamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. Reagent A: a mixture of 75 μl acetylacetone and 2.5 ml 1.25N sodium carbonate. Reagent B: 1.6 g of p-dimethylbenzaldehyde, 3
Mixture of 0 ml concentrated hydrochloric acid and 30 ml 96% ethanol. Quantification of KDO content The KDO content was determined by the diphenylamine method [analytical
Biochemistry (Analytical Biochemistry), 5th
Volume 8, Issue 1, Pages 123-129, 1974]
Was quantified as follows.
【００２０】５００ｍｇのジフェニルアミン（和光純薬
社製）、５ｍｌのエタノール（和光純薬社製）、４５ｍ
ｌの氷酢酸（和光純薬社製）、５０ｍｌの濃塩酸（和光
純薬社製）を混合してＫＤＯ検出試薬を調製した。その
５００μｌに、０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で各試料を含
む２５０μｌの水溶液を混合し、１００℃の沸騰水浴中
で３０分間加熱し、のち恒温水（２４〜２５℃）中で３
０分間冷却し、分光光度計（日立製作所製。モデルＵ２
０１０）により４２０、４７０、６３０、６５０ｎｍで
の吸光度を測定した（測定値を各々Ａ４２０、Ａ４７
０、Ａ６３０、Ａ６５０と記載する）。標準試料とし
て、０．５μモルの濃度のＫＤＯアンモニウム塩（シグ
マ社製）水溶液２５０μｌを使用した。500 mg of diphenylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 5 ml of ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 45 m
1 L of glacial acetic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 50 ml of concentrated hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) were mixed to prepare a KDO detection reagent. To 500 μl thereof, 250 μl of an aqueous solution containing each sample at a concentration of 0.50 mg / ml was mixed, heated in a boiling water bath at 100 ° C. for 30 minutes, and then 3 times in constant temperature water (24 to 25 ° C.).
Cool for 0 minutes and spectrophotometer (manufactured by Hitachi Ltd. Model U2
010) to measure the absorbance at 420, 470, 630 and 650 nm (measured values are A420 and A47, respectively).
0, A630, and A650). As a standard sample, 250 μl of an aqueous KDO ammonium salt (manufactured by Sigma) solution having a concentration of 0.5 μmol was used.
【００２１】検体試料および標準試料の４種の測定値か
ら、式（１）によりＳ値を求め、検体試料および標準試
料のＳ値をそれぞれＳt およびＳs とした。次いで式
（２）によりＫＤＯのモル数Ｘを算出した。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ （１） Ｘ＝（０．５×Ｓs ×ＬＰＳ１モルの分子量）／（０．５×Ｓt ×１０6 ） （２） リムラス活性の測定 リムラス活性とは、１９６８年にレヴィンにより創案さ
れたカブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いたエン
ドトキシン定量法であるリムラステスト（鈴木郁生編、
「医薬品の開発第１４巻、医薬品の品質管理及び試験
法」、第２２７〜２４３ページ、廣川書店、１９９０
年）で陽性を呈することを意味し、このリムラステスト
はＬＰＳ検出法として知られている。標準品として、３
４５ｐｇ／ＥＵのイー・コリ(E. coli) ０１１１：Ｂ４
を用いてトキシカラーシステム（生化学工業社製）を使
用して測定した。 タンパク質含量 タンパク質含量を、ローリー法［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリ(Journal of Biological Che
mistry) 、第１９３巻、第６５ページ、１９５１年］に
より測定した。 核酸含量 核酸含量を、ＯＤ（２６０ｎｍ−３００ｎｍ）での測定
値（１ＯＤ＝４０μｇ）から定量した。 純度 純度（％）は、次式により算出した。From the four measured values of the specimen sample and the standard sample, the S value was obtained by the equation (1), and the S values of the specimen sample and the standard sample were designated as S t and S s , respectively. Then, the number of moles X of KDO was calculated by the formula (2). S = A420−A470 + A630−A650 (1) X = (0.5 × S s × LPS 1 mol molecular weight) / (0.5 × S t × 10 6 ) (2) Measurement of limulus activity What is limulus activity? Limulus test (edited by Ikuo Suzuki), an endotoxin quantification method using a horseshoe crab blood cell extract and a chromogenic synthetic substrate, which was invented by Levin in 1964.
"Pharmaceutical Development Vol. 14, Pharmaceutical Quality Control and Testing Methods", pp. 227-243, Hirokawa Shoten, 1990
This means that this limulus test is known as an LPS detection method. 3 as a standard product
45 pg / EU of E. coli 0111: B4
Was measured using a Toxicolor system (manufactured by Seikagaku Corporation). Protein content The protein content was determined by the Lowry method [Journal of Biological Chemistry.
mistry), vol. 193, p. 65, 1951]. Nucleic acid content The nucleic acid content was quantified from the measured value at OD (260 nm-300 nm) (1 OD = 40 μg). Purity Purity (%) was calculated by the following formula.
【００２２】純度＝［｛乾燥収量−（タンパク質含量＋
核酸含量）｝／乾燥収量］×１００ ３）試験結果 分子量 分子量測定の結果は、図１に示すとおりである。図１
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図であり、図中レーン１は同
時に泳動させたタンパク質およびペプチド分子量マーカ
ー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０．
１ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、
８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤ、２．５６ｋＤ（ファルマ
シア社製）］、レーン２、３および４はＬＰＳ（２０μ
ｇ、５μｇおよび１．２５μｇ）、レーン５、６、７お
よび８は低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５
μｇおよび０．３１μｇ）であり、図の縦軸は、分子量
を示す。Purity = [{dry yield- (protein content +
Nucleic acid content)} / dry yield] × 100 3) Test results Molecular weight The results of molecular weight measurement are shown in FIG. FIG.
Is a SDS-PAGE electrophoretic pattern, and in the figure, lane 1 is a protein and peptide molecular weight markers [94 kD, 67 kD, 43 kD, 30 kD, 20.
1 kD, 17.2 kD, 14.6 kD, 14.4 kD,
8.24 kD, 6.38 kD, 2.56 kD (Pharmacia)], lanes 2, 3 and 4 were LPS (20 μm).
g, 5 μg and 1.25 μg), lanes 5, 6, 7 and 8 are low molecular weight LPS (20 μg, 5 μg, 1.25).
μg and 0.31 μg), and the vertical axis of the figure shows the molecular weight.
【００２３】一般的に糖鎖を有する物質を電気泳動した
場合、レーン当たりのサンプル量が過剰の時には染色帯
が幅広くなり、見かけの分子量範囲が広くなる。図１の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥではレーン５から８は、同一試料の低
分子量ＬＰＳの量を変更して泳動したものであるが、試
料の泳動量が増えるに従い染色帯の幅が広がっている。
従って、正確な分子量を調べる目的では、１μｇ程度の
量が適当であり、レーン８が相当する。なお、レーン２
およびレーン５は、高分子量のＬＰＳの存在を確認する
ために多量の試料を泳動させたものである。In general, when a substance having a sugar chain is electrophoresed, when the amount of sample per lane is excessive, the dyeing band becomes wider and the apparent molecular weight range becomes wider. In SDS-PAGE of FIG. 1, lanes 5 to 8 were electrophoresed by changing the amount of low-molecular-weight LPS in the same sample, and the width of the staining band broadened as the amount of migration of the sample increased.
Therefore, for the purpose of investigating an accurate molecular weight, an amount of about 1 μg is appropriate and corresponds to lane 8. In addition, lane 2
And lane 5 is a large amount of sample electrophoresed to confirm the presence of high molecular weight LPS.
【００２４】低分子量ＬＰＳの分子量（レーン８より計
算）は、レーン１のサイズマーカから計算して染色帯の
中心値で５ｋＤａ、染色帯幅の範囲は４ｋＤａから７ｋ
Ｄａであった。また、レーン５では、２０μｇの低分子
量ＬＰＳを泳動させたにもかかわらず、レーン２のよう
に高分子量ＬＰＳは全く認められなかった。以上の結果
から、この発明の低分子量ＬＰＳの分子量は、５，００
０±２，０００であり、高分子量ＬＰＳが完全に除去さ
れていることが判明した。 ヘキソサミン含量 この発明の低分子量ＬＰＳのヘキソサミン数は２個／分
子量５，０００であった。 ＫＤＯ含量 この発明の低分子量ＬＰＳに含まれるＫＤＯは２．４個
／分子量５，０００であった。 リムラス活性 この発明の低分子量ＬＰＳのリムラス活性は４３．５Ｅ
Ｕ／ｎｇであり、これに対して、参考例１と同様の方法
で調製した従来のＬＰＳのリムラス活性は８．４ＥＵ／
ｎｇであった。 タンパク質含量 この発明の低分子量ＬＰＳのタンパク質含量は、０．６
８％以下であった。 核酸含量 この発明の低分子量ＬＰＳの核酸含量は０．５０％以下
であった。 純度 この発明の低分子量ＬＰＳの純度は９８％以上であっ
た。The molecular weight of low-molecular-weight LPS (calculated from lane 8) was 5 kDa at the center value of the staining zone calculated from the size marker in lane 1, and the range of the staining zone width was 4 kDa to 7 kDa.
It was Da. Further, in Lane 5, although 20 μg of low molecular weight LPS was electrophoresed, no high molecular weight LPS was observed as in Lane 2. From the above results, the low-molecular weight LPS of the present invention has a molecular weight of 5,000.
It was 0 ± 2,000, and it was found that the high molecular weight LPS was completely removed. Hexosamine Content The low molecular weight LPS of the present invention had a hexosamine number of 2 / molecular weight of 5,000. KDO Content The low molecular weight LPS of the present invention contained 2.4 KDO / molecular weight 5,000. Limulus activity The limulus activity of the low molecular weight LPS of the present invention is 43.5E.
U / ng, by contrast, the limulus activity of the conventional LPS prepared by the same method as in Reference Example 1 was 8.4 EU /
It was ng. Protein content The protein content of the low molecular weight LPS of the present invention is 0.6
It was 8% or less. Nucleic acid content The nucleic acid content of the low molecular weight LPS of the present invention was 0.50% or less. Purity The low molecular weight LPS of the present invention had a purity of 98% or higher.
【００２５】なお、微生物および製造法を変更して試験
したが、ほぼ同様な結果が得られた。試験例２ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの急性毒性を調
べるために行った。 （１）試料の調製および試験方法 実施例１と同一の方法で調製した低分子量ＬＰＳおよび
参考例１と同一の方法で調製したＬＰＳの毒性を、７週
齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールス・リバー社か
ら購入）を用いて試験した。１群４匹からなるマウス群
に、各試料を生理食塩水に溶解し、１匹あたり５．０、
１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与
した（ただし４０ｍｇ／Ｋｇの投与は低分子量ＬＰＳの
み）。投与後７２時間マウスの生死を観察した。 （２）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明
らかなように、静脈内投与の場合、この発明の低分子量
ＬＰＳではいずれの投与量においてもマウスの死亡例は
認められず、ＬＤ50は４０ｍｇ／ｋｇ以上であったが、
ＬＰＳでは１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で全数が
死亡し、ＬＤ50は６．０〜８．６ｍｇ／ｋｇであった。
なお、微生物の種類および低分子量ＬＰＳの製造法を変
更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。Although the test was carried out by changing the microorganism and the manufacturing method, almost the same result was obtained. Test Example 2 This test was conducted to examine the acute toxicity of the low molecular weight LPS of the present invention. (1) Preparation of sample and test method Toxicity of low-molecular weight LPS prepared by the same method as in Example 1 and LPS prepared by the same method as in Reference Example 1 was examined using 7 week-old C3H / He mice (Japan Charles. (Purchased from River Co.). Each sample was dissolved in physiological saline in a group of 4 mice, 5.0
It was administered intravenously at a rate of 10, 20 and 40 mg / kg (however, 40 mg / Kg was administered only for low molecular weight LPS). Live or dead mice were observed 72 hours after administration. (2) Test results The results of this test are shown in Table 1. As is clear from Table 1, in the case of intravenous administration, no death of mice was observed at any dose of the low molecular weight LPS of the present invention, and the LD 50 was 40 mg / kg or more.
All died at a dose of LPS in 10 and 20mg / kg, LD 50 was 6.0~8.6mg / kg.
Although the type of microorganism and the method for producing low molecular weight LPS were changed and tested, almost the same results were obtained.
【００２６】[0026]
【表１】 [Table 1]
【００２７】試験例３ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳを試験例２より
も多量に投与した場合の急性毒性を調べるために行っ
た。 （１）試料の調製および試験方法 試験例２と同一の低分子量ＬＰＳを１匹あたり４０、８
０および１６０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したこ
と、およびＬＰＳを１匹あたり５．０、または１０ｍｇ
／ｋｇの割合で静脈内に投与したことを除き、試験例２
と同一の方法により試験した。 （２）試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から
明らかなように、ＬＰＳ５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で２
５％が、また１０ｍｇ／ｋｇの投与量では７５％が死亡
した。これに対して、低分子量ＬＰＳにおいては４０ｍ
ｇ／ｋｇの投与量で死亡せず、８０および１６０ｍｇ／
ｋｇの投与量では、１００％が死亡した。 前試験例２
とこの試験例３の結果から、ＬＤ50を算出すると表３の
とおりである。表３から明らかなように、低分子量ＬＰ
ＳのＬＤ50の値はＬＰＳのそれに比べて、静脈内投与で
は約８倍であった。Test Example 3 This test was conducted to examine the acute toxicity of the low molecular weight LPS of the present invention administered in a larger amount than in Test Example 2. (1) Preparation of sample and test method The same low molecular weight LPS as in Test Example 2 was used for 40, 8 per animal.
Administered intravenously at a rate of 0 and 160 mg / kg, and LPS 5.0 or 10 mg per animal
Test Example 2 except that the compound was intravenously administered at a ratio of 1 / kg.
Tested by the same method as. (2) Test results The results of this test are shown in Table 2. As is clear from Table 2, at the dose of LPS 5.0 mg / kg, 2
5% and 75% died at a dose of 10 mg / kg. On the other hand, 40 m for low molecular weight LPS
No deaths at doses of g / kg, 80 and 160 mg /
At a dose of kg 100% died. Pre-test example 2
Table 3 shows the LD 50 calculated from the results of Test Example 3 above. As is clear from Table 3, low molecular weight LP
The LD 50 value of S was about 8 times higher than that of LPS by intravenous administration.
【００２８】これらの結果は、ＬＰＳの分子量の相違が
毒性に影響を及ぼすことを示しており、低分子量ＬＰＳ
は、従来のＬＰＳに比して極めて毒性の低いことが判明
したThese results show that the difference in the molecular weight of LPS affects toxicity, and low molecular weight LPS
Was found to be extremely less toxic than conventional LPS
【００２９】。..
【表２】 [Table 2]
【００３０】[0030]
【表３】 [Table 3]
【００３１】試験例４ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効
果を確認するために行った。各群３匹の７週齢の雄Ｃ３
Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールズ・リバー社より購入）
の尾静脈に、１匹あたり０．１、１．０、または１０μ
ｇの実施例１と同様の方法で製造した低分子量ＬＰＳ、
または参考例１と同じ方法で得られたＬＰＳを含む生理
食塩水０．２ｍｌを注射し、その１時間後に採血し常法
により血清を分離した。Test Example 4 This test was conducted to confirm the TNF producing effect of the low molecular weight LPS of the present invention. 7-week-old male C3 with 3 animals in each group
H / He mouse (purchased from Charles River Japan)
0.1, 1.0, or 10μ per animal in the tail vein of
g of low molecular weight LPS prepared in the same manner as in Example 1,
Alternatively, 0.2 ml of physiological saline containing LPS obtained by the same method as in Reference Example 1 was injected, and 1 hour later, blood was collected and serum was separated by a conventional method.
【００３２】このようにして得られた各血清中のＴＮＦ
活性を、Ｌ９２９細胞に対する毒性に基づく方法で測定
した。すなわち、Ｌ９２９細胞を５％ウシ胎児血清を含
有するＭＥＭ培地で８×１０４個／１００μｌの濃度に
調製し、これを９６穴平底プレートの各穴に１００μｌ
づつまき、３７℃で２時間、５％ＣＯ２存在下で培養し
た。その後アクチノマイシンＤを１μｌ／ｍｌとなるよ
うに添加し、ＭＥＭ培地で段階希釈した血清試料または
陽性対照ヒトＴＮＦ−α（旭化成社製）を５０μｌづつ
添加し、更に同じ条件で１８時間培養した。培地をアス
ピレーターで取り除いた後、３７℃のＰＢＳで洗浄し死
細胞を完全に取り除き、０．１％クリスタルバイオレッ
トを含む１％メチルアルコール溶液を加えて生細胞を染
色した。この染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を
指標として測定し、陽性対照として用いたＴＮＦ−αの
希釈率と吸光度との関係をもとにＴＮＦ活性を算定し
た。TNF in each serum thus obtained
Activity was measured by a method based on toxicity to L929 cells. That is, L929 cells were prepared at a concentration of 8 × 10 4 cells / 100 μl in MEM medium containing 5% fetal bovine serum, and 100 μl was prepared in each well of a 96-well flat bottom plate.
The cells were spun and cultured at 37 ° C. for 2 hours in the presence of 5% CO 2 . After that, actinomycin D was added to 1 μl / ml, and 50 μl of a serum sample serially diluted with MEM medium or positive control human TNF-α (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) was added and further cultured under the same conditions for 18 hours. After removing the medium with an aspirator, the cells were washed with PBS at 37 ° C. to completely remove dead cells, and 1% methyl alcohol solution containing 0.1% crystal violet was added to stain live cells. This staining degree was measured using the absorbance at OD (590 nm) as an index, and the TNF activity was calculated based on the relationship between the dilution rate of TNF-α used as a positive control and the absorbance.
【００３３】その結果は、表４に示すとおりであった。
表４においてＴＮＦ活性は各群３匹の平均値である。こ
の結果から、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効
果は、参考例１の方法で得られる従来のＬＰＳのそれを
上回ることが明らかとなった。The results are shown in Table 4.
In Table 4, the TNF activity is the average value of 3 animals in each group. From this result, it was revealed that the TNF producing effect of the low molecular weight LPS of the present invention exceeds that of the conventional LPS obtained by the method of Reference Example 1.
【００３４】[0034]
【表４】 [Table 4]
【００３５】参考例１ トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディ
フコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業社製。特級）
１０ｇを蒸留水１リットルに添加し、ＮａＯＨでｐＨを
７．５に調整し、オートクレーブで滅菌し、別に滅菌し
たグルコース（和光純薬工業社製。特級）を０．１％の
割合で添加した培地（以下Ｌ−肉汁培地と記載する）１
００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、−８
０℃で保存されているパントエア・アグロメランス(Pan
toea agglomerans) 保存菌株から単一コロニーを分離し
て接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を
１，０００ｍｌのＬ−肉汁培地の入った３リットル容の
坂口フラスコに接種し、同様に培養した。Reference Example 1 10 g of tryptone (manufactured by Difco), 5 g of yeast extract (manufactured by Difco), NaCl (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade)
10 g was added to 1 liter of distilled water, pH was adjusted to 7.5 with NaOH, sterilized by autoclave, and separately sterilized glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. special grade) was added at a rate of 0.1%. Medium (hereinafter referred to as L-broth medium) 1
In a 500 ml Sakaguchi flask containing 00 ml, -8
Pantoea agglomerans (Pan) stored at 0 ℃
toea agglomerans) A single colony was isolated from a stock strain and inoculated, shake-cultured at 35 ° C. overnight, and the whole amount was inoculated into a 3-liter Sakaguchi flask containing 1,000 ml of L-broth medium, It culture | cultivated similarly.
【００３６】さらに、７リットルのＬ−肉汁培地の入っ
た１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオ
エンジ社製）に培養した菌体を接種し、同条件で通気培
養し、のち集菌し、約７０ｇの湿菌体を回収し、これを
凍結保存した。凍結保存菌体約７０ｇを５００ｍｌの蒸
留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加
して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。
フェノール層を更に１回前記と同一の操作を反復し、回
収した２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除
去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・ト
ーヨー社製。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カッ
ト−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮し
た。Further, the cultivated cells were inoculated into a 10-liter tabletop fermenter (manufactured by Marubishi Bioengine Ltd.) containing 7 liters of L-broth medium, aerobically cultivated under the same conditions, and then collected. Then, about 70 g of wet bacterial cells was collected and stored frozen. About 70 g of the cryopreserved cells was suspended in 500 ml of distilled water, 500 ml of 90% hot phenol was added, and the mixture was stirred at 65 to 70 ° C. for 20 minutes, cooled, and cooled to 10.0.
The water layer was collected by centrifugation at 00G for 20 minutes at 4 ° C.
The same operation as above was repeated once more for the phenol layer, and the two aqueous layers collected were combined and dialyzed overnight to remove the phenol, and the dialyzed solution was ultrafiltered (Advantech Toyo). U.K., UK-200) was used for ultrafiltration with a molecular weight cut-off membrane of 200,000 under a nitrogen gas of 2 atm.
【００３７】得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶
解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交
換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファ
ロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含
む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００
ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と
同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥
し、約７０ｇの湿菌体から約３００ｍｇの精製ＬＰＳを
得た。The obtained crude LPS lyophilized product was dissolved in distilled water, sterilized by a filter, added with a buffer solution, and subjected to anion exchange chromatography (Pharmacia Co .; Q-Sepharose Fast Flow) to obtain 10 mM Tris. -Pass the sample solution through the column with a buffer containing HCl (pH 7.5) and 10 mM NaCl, and
mM NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
The limulus active fraction was eluted with. This eluate was ultrafiltered under the same conditions as above, desalted and concentrated, and freeze-dried to obtain about 300 mg of purified LPS from about 70 g of wet bacterial cells.
【００３８】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳
細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定
されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following examples.
【００３９】[0039]
実施例１ 参考例１と同一の方法で得た精製ＬＰＳ１００ｍｇを５
ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化緩衝液［３％デオキシコール
酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａおよび２０ｍＭトリス−塩
酸からなり、ｐＨ８．３］に溶解し、精製ＬＰＳ溶液２
０ｍｌをセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマ
シア社製）の上部に静かに重層し、溶出緩衝液［０．２
５％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、
０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍ
Ｍトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］により流速１６
ｍｌ／時で８００ｍｌ（５０時間）溶出した。Example 1 5 mg of 100 mg of purified LPS obtained by the same method as in Reference Example 1 was used.
Dissolved in a solubilization buffer [3% sodium deoxycholate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.2 M sodium chloride, 5 mM EDTA-2Na and 20 mM Tris-HCl, pH 8.3] at a concentration of mg / ml, Purified LPS solution 2
0 ml was gently layered on top of a Sephacryl S-200HR column (Pharmacia) and the elution buffer [0.2
5% sodium deoxycholate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.),
0.2 M sodium chloride, 5 mM EDTA and 10 m
M Tris-hydrochloric acid, pH 8.3] and a flow rate of 16
Elution was performed at 800 ml (50 hours) at ml / hour.
【００４０】ペリスタポンプＰＩ（ファルマシア社製）
を用いて流速を制御しながら、得られた溶出液を、フラ
クションコレクター（アドバンテック社製。ＳＦ２１２
０）により分画し、最初の２４０ｍｌ（２４フラクショ
ン分）を廃棄し、その後１０ｍｌ／フラクションで８０
フラクションまで分画した。溶出した各画分について原
液または希釈液でフェノール／硫酸法（福井作蔵、「還
元糖の定量法・第２版」、第５０〜５２ページ、学会出
版センター、１９９０年）により糖の定量を行い、溶出
状態を調べた。得られた溶出状態の結果から、ＬＰＳの
存在が予想される分画（フラクション３０〜６０）のう
ち、フラクション３７〜５５の各フラクション０．５ｍ
ｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＬＰＳの分画パタ
ーンを調べた。 その結果、フラクション４５−５５は
低分子量（分子量約５ｋＤ）ＬＰＳのみが認められ、フ
ラクション３７−４４は高分子分量および低分子量の両
方のＬＰＳが認められたので、フラクション４５−５５
の低分子量ＬＰＳ分画を次のとおりさらに精製した。Perista Pump PI (Pharmacia)
While controlling the flow rate using the, the obtained eluate was used as a fraction collector (manufactured by Advantech. SF212.
0), discard the first 240 ml (24 fractions) and then 80 ml at 10 ml / fraction
Fraction was fractionated. For each of the eluted fractions, the sugar was quantified by the phenol / sulfuric acid method (Sakuzo Fukui, “Quantitative method for reducing sugars, 2nd edition”, pages 50-52, Academic Publishing Center, 1990) using the undiluted solution or diluted solution. The elution state was examined. From the results of the elution state obtained, 0.5 m of each of the fractions 37 to 55 out of the fractions (fractions 30 to 60) in which the presence of LPS is expected.
SDS-PAGE was performed using 1 to examine the fractionation pattern of LPS. As a result, only low molecular weight (molecular weight about 5 kD) LPS was observed in fractions 45-55, and both high molecular weight and low molecular weight LPS were observed in fractions 37-44.
The low molecular weight LPS fraction of was further purified as follows.
【００４１】各画分を混合して凍結乾燥し、エタノール
に懸濁し、遠心分離によりエタノールに可溶なデオキシ
コール酸を除去し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収
した。低分子量ＬＰＳ画分のエタノール処理をさらに２
回反復し、デオキシコール酸を除去し、次に７０％エタ
ノールに再度懸濁し、遠心分離で緩衝液成分を除去し、
この操作をさらに３回反復し、低分子量ＬＰＳを不溶性
画分に回収し、凍結乾燥し、精製した低分子量ＬＰＳを
約２０ｍｇ得た。 実施例２ トリプトン（ディフコ社製）５ｇ、リン酸二水素カリウ
ム１．６ｇおよび塩化ナトリウム８ｇを精製水１，００
０ｍｌに溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した（以下こ
れを基礎培地という）。基礎培地１００ｍｌに４０％塩
化マグネシウム溶液１０ｍｌおよび０．４％マラカイト
グリン溶液３ｍｌを無菌的に添加し、これをマグネシウ
ム−マラカイトグリン培地とした。The respective fractions were mixed, freeze-dried, suspended in ethanol, the ethanol-soluble deoxycholic acid was removed by centrifugation, and low-molecular-weight LPS was recovered in the insoluble fraction. 2 more ethanol treatments of low molecular weight LPS fraction
Repeat to remove deoxycholic acid, then resuspend in 70% ethanol and centrifuge to remove buffer components,
This operation was further repeated 3 times, low-molecular weight LPS was collected in an insoluble fraction, and freeze-dried to obtain about 20 mg of purified low-molecular weight LPS. Example 2 5 g of tryptone (manufactured by Difco), 1.6 g of potassium dihydrogen phosphate and 8 g of sodium chloride were added to purified water of 1.00.
It was dissolved in 0 ml and sterilized at 121 ° C for 15 minutes (hereinafter referred to as basal medium). To 100 ml of the basal medium, 10 ml of 40% magnesium chloride solution and 3 ml of 0.4% malachitogrin solution were aseptically added to obtain a magnesium-malachitegrin medium.
【００４２】マグネシウム−マラカイトグリン培地１０
０ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、サルモ
ネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)保存菌株から単
一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養
し、そのまま全量を１，０００ｍｌのマグネシウム−マ
ラカイトグリン培地の入った３リットル容の坂口フラス
コに接種し、同一条件で培養した。Magnesium-malachite gulin medium 10
Into a 500 ml Sakaguchi flask containing 0 ml, a single colony was isolated from a stock strain of Salmonella minnesota and inoculated, and the mixture was shake-cultured overnight at 35 ° C., and the total amount was 1,000 ml of magnesium- A 3 liter Sakaguchi flask containing malachite gulin medium was inoculated and cultured under the same conditions.
【００４３】さらに、７リットルのマグネシウム−マラ
カイトグリン培地の入った１０リットル容の卓上型ファ
ーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を
接種し、同一条件で通気培養し、のち集菌し、約５０ｇ
の湿菌体を回収し、これを凍結保存した。凍結保存菌体
約５０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの
９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間
撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心
処理し、水層を回収した。フェノール層をさらに１回前
記と同一の操作で処理した。２回の水層を合し、１夜透
析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置
（アドヴァンテック・トーヨー社。ＵＫ−２００）を用
いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガ
ス下で限外瀘過濃縮をした。Further, the cultured cells were inoculated into a 10-liter tabletop fermenter (manufactured by Marubishi Bioengine) containing 7 liters of magnesium-malachitegrin medium, aerobically cultured under the same conditions, and then collected. Bacteria, about 50g
Wet cells were collected and cryopreserved. About 50 g of cryopreserved cells was suspended in 500 ml of distilled water, 500 ml of 90% hot phenol was added, stirred for 20 minutes at 65-70 ° C., cooled, and centrifuged at 10,000 G, 4 ° C. for 20 minutes. , The aqueous layer was collected. The phenol layer was treated once more by the same procedure as above. The two aqueous layers were combined, dialyzed overnight to remove phenol, and the dialyzed solution was filtered through an ultrafiltration device (Advantech Toyo Co., Ltd., UK-200) with a molecular weight cut-off membrane of 200,000. Ultrafiltration was concentrated under a nitrogen gas of 2 atm.
【００４４】得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶
解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交
換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファ
ロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含
む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００
ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と
同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥
し、約５０ｇの湿菌体から約２１０ｍｇの精製ＬＰＳを
得た。The obtained crude LPS lyophilized product was dissolved in distilled water, sterilized by a filter, added with a buffer, and subjected to anion exchange chromatography (Pharmacia Co .; Q-Sepharose Fast Flow) to obtain 10 mM Tris. -Pass the sample solution through the column with a buffer containing HCl (pH 7.5) and 10 mM NaCl, and
mM NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
The limulus active fraction was eluted with. This eluate was ultrafiltered under the same conditions as above, desalted and concentrated, and freeze-dried to obtain about 210 mg of purified LPS from about 50 g of wet bacterial cells.
【００４５】この精製ＬＰＳ８０ｍｇを実施例１と同一
の方法で、３％デオキシコール酸ナトリウムを含有する
可溶化緩衝液に溶解し、セファクリルＳ−２００ＨＲカ
ラム（ファルマシア社製）で展開し、低分子量ＬＰＳの
みを含有する画分を回収し、凍結乾燥後、エタノールに
懸濁し、遠心分離によりデオキシコール酸等の緩衝液成
分を除去し、凍結乾燥し、約５ｍｇの低分子量ＬＰＳを
得た。80 mg of this purified LPS was dissolved in a solubilization buffer containing 3% sodium deoxycholate in the same manner as in Example 1 and developed on a Sephacryl S-200HR column (Pharmacia) to give a low molecular weight LPS. The fraction containing only the above was collected, lyophilized, suspended in ethanol, the buffer component such as deoxycholic acid was removed by centrifugation, and lyophilized to obtain about 5 mg of low molecular weight LPS.
【００４６】この低分子量ＬＰＳの分子量、ＫＤＯ数お
よびヘキソサミン数を前記試験例１と同一の方法で測定
した結果、それぞれ６，０００、２．０１個／分子量
６，０００、および２．８個／分子量６，０００であっ
た。なお、参考のため図２に、サルモネラ・ミネソタ菌
株から精製された低分子量ＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ図
を示す。図中レーン１は蛋白質およびペプチドマーカー
［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋ
Ｄ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．
２４ｋＤ、６．３８ｋＤおよび２．５６ｋＤ（ファルマ
シア社製）］、レーン２、３および４はデオキシコール
酸ナトリウム存在化でのゲル瀘過前の精製ＬＰＳ（２０
μｇ、５μｇ、および１．２５μｇ）、レーン５、６、
７および８は、低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、
１．２５μｇ、および０．３１μｇ）である。The molecular weight, KDO number, and hexosamine number of this low-molecular-weight LPS were measured by the same method as in Test Example 1 above. The results were 6,000, 2.01 / molecular weight 6,000, and 2.8 / The molecular weight was 6,000. For reference, an SDS-PAGE diagram of low molecular weight LPS purified from Salmonella minnesota strain is shown in FIG. Lane 1 in the figure shows protein and peptide markers [94 kD, 67 kD, 43 kD, 30 kD, 20 kD.
D, 17.2 kD, 14.6 kD, 14.4 kD, 8.
24 kD, 6.38 kD and 2.56 kD (Pharmacia)], lanes 2, 3 and 4 are purified LPS (20%) before gel filtration in the presence of sodium deoxycholate.
μg, 5 μg, and 1.25 μg), lanes 5, 6,
7 and 8 are low molecular weight LPS (20 μg, 5 μg,
1.25 μg, and 0.31 μg).
【００４７】[0047]
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
より、医薬品等として使用し得る安全性が極めて高く、
かつ生物活性の高い低分子量ＬＰＳが提供される。As described in detail above, according to the present invention, the safety that can be used as a drug is extremely high,
A low molecular weight LPS having high biological activity is provided.
【図１】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。FIG. 1 is an SDS-PAGE diagram of each LPS sample.
【図２】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。FIG. 2 is an SDS-PAGE diagram of each LPS sample.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成７年２月３日[Submission date] February 3, 1995
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】０００８[Correction target item name] 0008
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【０００８】しかしながら、従来のＬＰＳは、安全性の
面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本
組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔII」、第１２
１ページ、朝倉書店、１９８７年）。一方、細菌の細胞
壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノー
ル−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal)
編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリ
ー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第
８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、
１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・ス
タブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology a
nd Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤ
ＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４
３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られてい
るが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコー
ル酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量
約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報
告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９
ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０
００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極
めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、
従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８
１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されている
が、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３
０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また
特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０
号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分
子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開
示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およ
びイオン交換において精製された標品であり、高分子量
ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子
量ＬＰＳが混在していた。However, it has been pointed out that the conventional LPS has a problem in clinical application from the viewpoint of safety (edited by the Japan Tissue Culture Society, “Cell Growth Factor part II ”, No. 12).
1 page, Asakura Shoten, 1987). On the other hand, regarding the method for purifying LPS from the cell wall of bacteria, the conventional phenol-water extraction method [O. Westphal] was used.
Hen, Methods in Carbohydrate Chemistry, Volume 5, Page 83, Academic Press,
1965], Trichloroacetic acid extraction method [AM Staub, ed., Methods in Immunology.
And Immunochemistry (Methods in Immunology a
nd Immunochemistry), Volume 1, Page 28, Academic Press, 1967], ED
TA extraction method [Journal of Biological Chemistry, No. 24
No. 3, page 6384, 1968] and the like are known, and the LPS thus obtained has a molecular weight of about 20,000 in the presence of a surfactant such as sodium deoxycholate. It has been reported to dissociate into subunits (Haruma Ryo et al., "Bacterial endotoxin", No. 229).
Page, Kodansha, 1973). On the other hand, the molecular weight is 20,0
Regarding a method of obtaining only LPS of extremely low molecular weight of about 5,000 without including LPS of 00 or more,
It was not reported before. For example, JP-A-4-9948
No. 1 publication shows a diagram of SDS-PAGE. In addition to the dyeing zone having a molecular weight of about 6,000, a molecular weight of 3
There are clearly more than 10,000 dyed zones. Further, JP-A-4-187640 and JP-A-4-49240.
JP-A-5-155778 and JP-A-5-155778 disclose low-molecular-weight LPS having a molecular weight of 5,000 or 6,000, both of which are purified by the thermal phenol method and ion exchange. The step of completely eliminating the molecular weight LPS was not performed, and the high molecular weight LPS was mixed.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical indication C12R 1:01)
Claims (4)
の理化学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること を有する低分子量リポポリサッカライド。1. The following a) to c) obtained from microbial cells:
A) The molecular weight measured by the SDS-PAGE method using a protein marker is 5,000 ± 2,000, and no other staining band is substantially observed. B) Measured by the Elson-Morgan method. Hexosamine content is 1 to 3 / molecular weight 5,000 c) 2-keto-3-determined by diphenylamine method
Deoxyoctonate content 1-3, molecular weight 5,000
A low molecular weight lipopolysaccharide having 0.
の理化学的および生物学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％（重量）以下であること ｆ）核酸含量が、１％（重量）以下であること を有する低分子量リポポリサッカライド。2. The following a) to f) obtained from microbial cells:
Physicochemical and biological properties of a) A) The molecular weight measured by SDS-PAGE using a protein marker is 5,000 ± 2,000, and no other staining band is substantially observed b) Elson-Morgan The hexosamine content measured by the method is 1 to 3 / molecular weight 5,000. C) 2-keto-3-measured by the diphenylamine method.
Deoxyoctonate content 1-3, molecular weight 5,000
0) d) Limulus activity of at least 10 EU / ng e) Protein content of 1% (wt) or less f) Nucleic acid content of 1% (wt) or less Molecular weight lipopolysaccharide.
項１または項２に記載の低分子量リポポリサッカライ
ド。3. The low molecular weight lipopolysaccharide according to claim 1 or 2, wherein the microorganism is a Gram-negative microorganism.
ea) 属に属する微生物またはサルモネラ(Salmonella)属
に属する微生物である請求項３に記載の低分子量リポポ
リサッカライド。4. The gram-negative microorganism is Pantoea (Panto).
The low molecular weight lipopolysaccharide according to claim 3, which is a microorganism belonging to the genus ea) or a microorganism belonging to the genus Salmonella.
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