JPH08198902A - 低分子量リポポリサッカライド - Google Patents
低分子量リポポリサッカライドInfo
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- JPH08198902A JPH08198902A JP7012126A JP1212695A JPH08198902A JP H08198902 A JPH08198902 A JP H08198902A JP 7012126 A JP7012126 A JP 7012126A JP 1212695 A JP1212695 A JP 1212695A JP H08198902 A JPH08198902 A JP H08198902A
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- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品等として使用し得る安全性が極めて高
く、かつ生物活性の高い新規な低分子量ＬＰＳを提供す
る。 【構成】 微生物菌体から得られ、ａ）タンパク質マー
カーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が
５，０００±２，０００であり、他に染色帯を認めない
こと、ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソ
サミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること、
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること、ｄ）リムラス活性が少なくとも１０ＥＵ
／ｎｇであること、の理化学的および生物学的性質を有
する新規な低分子量リポポリサッカライド。
く、かつ生物活性の高い新規な低分子量ＬＰＳを提供す
る。 【構成】 微生物菌体から得られ、ａ）タンパク質マー
カーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が
５，０００±２，０００であり、他に染色帯を認めない
こと、ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソ
サミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること、
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること、ｄ）リムラス活性が少なくとも１０ＥＵ
／ｎｇであること、の理化学的および生物学的性質を有
する新規な低分子量リポポリサッカライド。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、特定の理化学的性質
および生物学的性質を有し、安全性が極めて高く（毒性
が低い）、かつ生物活性の高い新規な低分子量リポポリ
サッカライドに関するものである。
および生物学的性質を有し、安全性が極めて高く（毒性
が低い）、かつ生物活性の高い新規な低分子量リポポリ
サッカライドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】リポポリサッカライド（lipopolysaccha
ride。以下ＬＰＳと記載することがある）は、大腸菌、
サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペ
プチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質および糖
からなる複合化合物であり、Ｏ抗原およびエンドトキシ
ンの活性成分として知られている［ジェー・エム・ギュ
ーセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen an
d R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バ
イオケミストリー(New Comprehensive Biochemistr
y)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacte
rial Cell Wall) 、第１８ページ、エルセヴィア(Elsev
ea) 、１９９４年］。ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質
を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれ
るオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている
（「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１
ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。
ride。以下ＬＰＳと記載することがある）は、大腸菌、
サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペ
プチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質および糖
からなる複合化合物であり、Ｏ抗原およびエンドトキシ
ンの活性成分として知られている［ジェー・エム・ギュ
ーセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen an
d R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バ
イオケミストリー(New Comprehensive Biochemistr
y)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacte
rial Cell Wall) 、第１８ページ、エルセヴィア(Elsev
ea) 、１９９４年］。ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質
を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれ
るオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている
（「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１
ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。
【０００３】リピドＡの基本構造は多くの菌種に共通で
あり、基本骨格はβ−１、６結合のグルコサミニル・グ
ルコサミンからなりＣ−１位およびＣ−４´位にそれぞ
れリン酸を結合している場合が多い。各アミノ基は３−
ヒドロキシ脂肪酸を、水酸基は数種の飽和脂肪酸または
ヒドロキシ脂肪酸を結合し、独特の糖脂質を形成してい
るが、脂肪酸の種類は菌種によって多少異なっている。
少数例であるが基本骨格が全く異なり、２，３−ジアミ
ノ−２、３−ジデオキシ−Ｄ−グルコースのみからなる
例も報告されている（野間惟道編、「医科学大辞典第４
９巻」、第８２ページ、講談社、１９８４年）。
あり、基本骨格はβ−１、６結合のグルコサミニル・グ
ルコサミンからなりＣ−１位およびＣ−４´位にそれぞ
れリン酸を結合している場合が多い。各アミノ基は３−
ヒドロキシ脂肪酸を、水酸基は数種の飽和脂肪酸または
ヒドロキシ脂肪酸を結合し、独特の糖脂質を形成してい
るが、脂肪酸の種類は菌種によって多少異なっている。
少数例であるが基本骨格が全く異なり、２，３−ジアミ
ノ−２、３−ジデオキシ−Ｄ−グルコースのみからなる
例も報告されている（野間惟道編、「医科学大辞典第４
９巻」、第８２ページ、講談社、１９８４年）。
【０００４】Ｒコアの構造はサルモネラ属のようにそれ
に属する大部分の菌種に共通である場合と、大腸菌のよ
うに部分的に異なる数種の構造が知られている場合とが
ある［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケ
ンベック(J.M. Ghuysen andR. Hakenbeck) 編、「ニュ
ー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Compr
ehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・
セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第２８３ペー
ジ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。一般にヘ
プトースと２−ケト−３−デオキシオクトネート（以下
ＫＤＯと記載する）が多くのＲコアに共通の構成成分で
あり、ＫＤＯを介してリピドＡと結合しているが、菌種
によっていずれか一方または双方が欠如しているＬＰＳ
の存在も知られている［ジェー・エム・ギューセンおよ
びアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenb
eck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミス
トリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７
巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wa
ll) 、第２９４〜２９５ページ、エルセヴィア(Elseve
a) 、１９９４年］。
に属する大部分の菌種に共通である場合と、大腸菌のよ
うに部分的に異なる数種の構造が知られている場合とが
ある［ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケ
ンベック(J.M. Ghuysen andR. Hakenbeck) 編、「ニュ
ー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(New Compr
ehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・
セル・ウオール(Bacterial Cell Wall) 、第２８３ペー
ジ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年］。一般にヘ
プトースと２−ケト−３−デオキシオクトネート（以下
ＫＤＯと記載する）が多くのＲコアに共通の構成成分で
あり、ＫＤＯを介してリピドＡと結合しているが、菌種
によっていずれか一方または双方が欠如しているＬＰＳ
の存在も知られている［ジェー・エム・ギューセンおよ
びアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenb
eck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミス
トリー(New Comprehensive Biochemistry)」、第２７
巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacterial Cell Wa
ll) 、第２９４〜２９５ページ、エルセヴィア(Elseve
a) 、１９９４年］。
【０００５】Ｏ特異多糖の構造は、構成成分の中で最も
多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原と
しての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖
の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、
または繰返し構造でないものも知られている。Ｏ特異多
糖の生合成はＲコアのそれとは異なる遺伝子の支配を受
けており、接合または形質導入により異なる菌種のＯ特
異多糖を置換することが可能であり、菌の毒力およびワ
クチンの研究等に応用されている［ジェー・エム・ギュ
ーセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen an
d R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バ
イオケミストリー(New Comprehensive Biochemistr
y)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacte
rial Cell Wall) 、第２６５〜２６７ページ、エルセヴ
ィア(Elsevea) 、１９９４年］。
多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原と
しての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖
の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、
または繰返し構造でないものも知られている。Ｏ特異多
糖の生合成はＲコアのそれとは異なる遺伝子の支配を受
けており、接合または形質導入により異なる菌種のＯ特
異多糖を置換することが可能であり、菌の毒力およびワ
クチンの研究等に応用されている［ジェー・エム・ギュ
ーセンおよびアール・ハッケンベック(J.M. Ghuysen an
d R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バ
イオケミストリー(New Comprehensive Biochemistr
y)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(Bacte
rial Cell Wall) 、第２６５〜２６７ページ、エルセヴ
ィア(Elsevea) 、１９９４年］。
【０００６】ＬＰＳは極めて多様な薬理作用を有してい
るが、例えば抗原およびＬＰＳを同時に投与した場合、
免疫反応が増強されることから、ＬＰＳは現在ワクチン
効果を高める補助剤（アジュバント）の一種として重用
されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第３１２ペ
ージ、講談社、１９７３年）。従来、多種多様なＬＰＳ
が報告されているが、一般にどのような方法で抽出した
ＬＰＳであっても、１０6 〜１０7 の極めて大きな分子
量を有することが知られている（本間遜他編、「細菌内
毒素」、第２１１ページ、講談社、１９７３年）。その
後、比較的分子量の小さいＬＰＳも報告され、小麦由来
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量８，０００±１，００
０または５，０００±２，０００、リン酸数１〜４／分
子量８，０００、ヘキソサミン数６±２／分子量８，０
００、脂肪酸数６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数５
±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２４
５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４
９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平
４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報、
特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−４０９３７
号公報）、クロレラ由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量４０，０００〜９０，０００、リン酸数４±１／分子
量１万、ヘキソサミン数７±１／分子量１万、脂肪酸数
６±１／分子量１万、ＫＤＯ数２±１／分子量１万のＬ
ＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２
４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−
４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開
平４−４９２４０号公報、特開平５−１５５７７８号公
報、特開平６−４０９３７号公報）、大腸菌由来のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量３０，０００±５，０００、
リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／
分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±
１／分子量３万のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公
報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４
２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４
９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報）、百日
咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±
１，０００または９，０００±１，０００、リン酸数５
／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量
８，０００、脂肪酸数５／分子量８，０００、ＫＤＯ数
２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２
４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−
４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開
平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公
報）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４
０，０００±１０，０００または８，０００±４，００
０、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±
６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数
５±１／分子量３万のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号
公報）、セラチア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量５，０００±１，０００、リン酸数２±１／分子
量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，００
０、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特開
平６−４０９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公
報、特開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８
１号公報、特開平６−９０７４５号公報）、エンテロバ
クター属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，
５００±２，５００、リン酸数１〜２／分子量５，００
０、ヘキソサミン数７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ
数１〜２／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０
９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平
６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公報、
特開平６−９０７４５号公報）、パントエア属細菌由来
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５０
０、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン
数５±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量
５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報、特
開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公
報、特開平６−９０７４５号公報）、百日咳菌由来のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００、
リン酸数４／分子量６，０００、ヘキソサミン数１２／
分子量６，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量６，０００
のＬＰＳ（特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−
４０９３７号公報）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による分子量６，０００±１，０００または９，５００
±１，５００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソ
サミン数１６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１
／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−１８７６４
０）、アエロモナス・ヒドロフィア種菌由来のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，５００、リン酸
数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／
分子量５，０００、ＫＤＯ数０．８±０．５／分子量
５，０００のＬＰＳ（特開平６−１４１８４９号公
報）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量５，０００、リン数２／分子量５，０００、ヘキ
ソサミン数２／分子量５，０００、ＫＤＯ数５／分子量
５，０００［バイオセラピー(BIOTHERAPY)、第６巻、第
３号、第３５７ページ、１９９２年］等が報告されてい
る。 前記のとおり分子量５，０００前後のＬＰＳは、
既に報告されているが、これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
ける主染色帯が、５，０００または６，０００であると
同時に、分子量３万以上に相当する染色帯も存在してい
たのである。即ち、従来の分子量５，０００前後のＬＰ
Ｓは分子量３万以上のＬＰＳとの混合物であった。
るが、例えば抗原およびＬＰＳを同時に投与した場合、
免疫反応が増強されることから、ＬＰＳは現在ワクチン
効果を高める補助剤（アジュバント）の一種として重用
されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第３１２ペ
ージ、講談社、１９７３年）。従来、多種多様なＬＰＳ
が報告されているが、一般にどのような方法で抽出した
ＬＰＳであっても、１０6 〜１０7 の極めて大きな分子
量を有することが知られている（本間遜他編、「細菌内
毒素」、第２１１ページ、講談社、１９７３年）。その
後、比較的分子量の小さいＬＰＳも報告され、小麦由来
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量８，０００±１，００
０または５，０００±２，０００、リン酸数１〜４／分
子量８，０００、ヘキソサミン数６±２／分子量８，０
００、脂肪酸数６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数５
±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２４
５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４
９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平
４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報、
特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−４０９３７
号公報）、クロレラ由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量４０，０００〜９０，０００、リン酸数４±１／分子
量１万、ヘキソサミン数７±１／分子量１万、脂肪酸数
６±１／分子量１万、ＫＤＯ数２±１／分子量１万のＬ
ＰＳ（特開平４−４９２４５号公報、特開平４−４９２
４３号公報、特開平４−４９２４２号公報、特開平４−
４９２４１号公報、特開平４−４９２４４号公報、特開
平４−４９２４０号公報、特開平５−１５５７７８号公
報、特開平６−４０９３７号公報）、大腸菌由来のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量３０，０００±５，０００、
リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／
分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±
１／分子量３万のＬＰＳ（特開平４−４９２４５号公
報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−４９２４
２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開平４−４
９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公報）、百日
咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±
１，０００または９，０００±１，０００、リン酸数５
／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量
８，０００、脂肪酸数５／分子量８，０００、ＫＤＯ数
２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−４９２
４５号公報、特開平４−４９２４３号公報、特開平４−
４９２４２号公報、特開平４−４９２４１号公報、特開
平４−４９２４４号公報、特開平４−４９２４０号公
報）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４
０，０００±１０，０００または８，０００±４，００
０、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±
６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数
５±１／分子量３万のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号
公報）、セラチア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量５，０００±１，０００、リン酸数２±１／分子
量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，００
０、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特開
平６−４０９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公
報、特開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８
１号公報、特開平６−９０７４５号公報）、エンテロバ
クター属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，
５００±２，５００、リン酸数１〜２／分子量５，００
０、ヘキソサミン数７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ
数１〜２／分子量５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０
９３７号公報、特開平５−１５５７７８号公報、特開平
６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公報、
特開平６−９０７４５号公報）、パントエア属細菌由来
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５０
０、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン
数５±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量
５，０００のＬＰＳ（特開平６−４０９３７号公報、特
開平６−６５０９２号公報、特開平４−９９４８１号公
報、特開平６−９０７４５号公報）、百日咳菌由来のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００、
リン酸数４／分子量６，０００、ヘキソサミン数１２／
分子量６，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量６，０００
のＬＰＳ（特開平５−１５５７７８号公報、特開平６−
４０９３７号公報）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による分子量６，０００±１，０００または９，５００
±１，５００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソ
サミン数１６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１
／分子量８，０００のＬＰＳ（特開平４−１８７６４
０）、アエロモナス・ヒドロフィア種菌由来のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，５００、リン酸
数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／
分子量５，０００、ＫＤＯ数０．８±０．５／分子量
５，０００のＬＰＳ（特開平６−１４１８４９号公
報）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量５，０００、リン数２／分子量５，０００、ヘキ
ソサミン数２／分子量５，０００、ＫＤＯ数５／分子量
５，０００［バイオセラピー(BIOTHERAPY)、第６巻、第
３号、第３５７ページ、１９９２年］等が報告されてい
る。 前記のとおり分子量５，０００前後のＬＰＳは、
既に報告されているが、これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
ける主染色帯が、５，０００または６，０００であると
同時に、分子量３万以上に相当する染色帯も存在してい
たのである。即ち、従来の分子量５，０００前後のＬＰ
Ｓは分子量３万以上のＬＰＳとの混合物であった。
【０００７】ＬＰＳの用途についてはこの発明の発明者
らにより、これまでに抗トキソプラズマ剤（特開平４−
４９２４５９号公報）、コレステロール低下剤（特開平
４−４９２４３号公報）、抗ヘルペス剤（特開平４−４
９２４２号公報）、抗リュウマチ剤（特開平４−４９２
４１号公報）、抗糖尿病剤（特開平４−４９２４４号公
報）、抗消化性潰瘍剤（特開平４−４９２４０号公
報）、免疫機能活性化剤（特開平４−９９４８１号公
報、特開平６−１４１８４９号公報）、経口・経皮免疫
機能促進剤（特開平４−１８７６４０号公報）、鎮痛剤
（特開平６−４０９３７号公報）、発育促進剤（特開平
３−１５５７７８号公報）、抗禁断症状剤（特開平６−
６５０９２号公報）等が提案されている。
らにより、これまでに抗トキソプラズマ剤（特開平４−
４９２４５９号公報）、コレステロール低下剤（特開平
４−４９２４３号公報）、抗ヘルペス剤（特開平４−４
９２４２号公報）、抗リュウマチ剤（特開平４−４９２
４１号公報）、抗糖尿病剤（特開平４−４９２４４号公
報）、抗消化性潰瘍剤（特開平４−４９２４０号公
報）、免疫機能活性化剤（特開平４−９９４８１号公
報、特開平６−１４１８４９号公報）、経口・経皮免疫
機能促進剤（特開平４−１８７６４０号公報）、鎮痛剤
（特開平６−４０９３７号公報）、発育促進剤（特開平
３−１５５７７８号公報）、抗禁断症状剤（特開平６−
６５０９２号公報）等が提案されている。
【０００８】しかしながら、従来のＬＰＳは、安全性の
面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本
組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔ◆」、第１２
１ページ、朝倉書店、１９８７年）。一方、細菌の細胞
壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノー
ル−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal)
編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリ
ー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第
８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、
１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・ス
タブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology a
nd Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤ
ＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４
３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られてい
るが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコー
ル酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量
約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報
告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９
ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０
００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極
めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、
従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８
１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されている
が、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３
０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また
特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０
号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分
子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開
示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およ
びイオン交換において精製された標品であり、高分子量
ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子
量ＬＰＳが混在していた。
面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本
組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔ◆」、第１２
１ページ、朝倉書店、１９８７年）。一方、細菌の細胞
壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノー
ル−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal)
編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリ
ー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第
８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、
１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・ス
タブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology a
nd Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤ
ＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４
３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られてい
るが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコー
ル酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量
約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報
告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９
ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０
００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極
めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、
従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８
１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されている
が、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３
０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また
特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０
号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分
子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開
示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およ
びイオン交換において精製された標品であり、高分子量
ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子
量ＬＰＳが混在していた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】前記の通り、従来報告
されている低分子量のＬＰＳは、高分子量ＬＰＳを含む
混合物であって、例えば免疫機能活性化剤等の薬剤成分
として臨床的に用いるには、安全性の面からも、あるい
は薬効性能の面からも必ずしも満足のいくものではなか
った。。
されている低分子量のＬＰＳは、高分子量ＬＰＳを含む
混合物であって、例えば免疫機能活性化剤等の薬剤成分
として臨床的に用いるには、安全性の面からも、あるい
は薬効性能の面からも必ずしも満足のいくものではなか
った。。
【００１０】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、従来のＬＰＳに比して安全性が高
く（すなわち、毒性が低く）、かつ生物活性の優れた新
規なＬＰＳを提供することを目的としている。
なされたものであり、従来のＬＰＳに比して安全性が高
く（すなわち、毒性が低く）、かつ生物活性の優れた新
規なＬＰＳを提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】この発明の発明者らは、
前記のような課題を解決するため、鋭意研究をおこなっ
た結果、従来報告されているＬＰＳとは異なる新規な低
分子量ＬＰＳを発見し、しかもこの新規な低分子量ＬＰ
Ｓが、従来のＬＰＳに比べて極めて安全性が高く、かつ
生物活性も従来のＬＰＳに比して優れていることを見い
出し、この発明を完成した。
前記のような課題を解決するため、鋭意研究をおこなっ
た結果、従来報告されているＬＰＳとは異なる新規な低
分子量ＬＰＳを発見し、しかもこの新規な低分子量ＬＰ
Ｓが、従来のＬＰＳに比べて極めて安全性が高く、かつ
生物活性も従来のＬＰＳに比して優れていることを見い
出し、この発明を完成した。
【００１２】すなわち、この発明は、微生物菌体から得
られ、次のａ）〜ｃ）の理化学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること を有する低分子量リポポリサッカライドを提供する。
られ、次のａ）〜ｃ）の理化学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること を有する低分子量リポポリサッカライドを提供する。
【００１３】さらにこの発明は、微生物菌体から得ら
れ、次のａ）〜ｆ）の理化学的および生物学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること ｆ）核酸含量が、１％以下であること を有する低分子量リポポリサッカライドをも提供する。
れ、次のａ）〜ｆ）の理化学的および生物学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること ｆ）核酸含量が、１％以下であること を有する低分子量リポポリサッカライドをも提供する。
【００１４】また、この発明においては、前記の微生物
が、グラム陰性の微生物であることさらにはそのグラム
陰性微生物が、パントエア(Pantoea) 属に属する微生物
またはサルモネラ(Salmonella)属に属する微生物である
を望ましい態様としてもいる。 次にこの発明について
詳述する。なお、以下の説明において、百分率の表示
は、特に断りのない限り、重量による値である。
が、グラム陰性の微生物であることさらにはそのグラム
陰性微生物が、パントエア(Pantoea) 属に属する微生物
またはサルモネラ(Salmonella)属に属する微生物である
を望ましい態様としてもいる。 次にこの発明について
詳述する。なお、以下の説明において、百分率の表示
は、特に断りのない限り、重量による値である。
【００１５】この発明の低分子量ＬＰＳは、グラム陰性
の微生物、例えば、パントエア属に属する微生物または
サルモネラ属に属する微生物等を、常法により培養し、
培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法、例え
ば、熱フェノール法［オー・ウエストファール(O. West
phal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミ
ストリー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５
巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Pr
ess)、１９６５年］、により抽出し、さらに、陰イオン
交換樹脂により精製して製造できる。すなわち、微生物
の菌体を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を蒸留水および等
容量の熱フェノールの混合液に添加して撹拌し、次いで
遠心分離して水層を回収し、この水層を透析してフェノ
ールを除去し、限外瀘過法により濃縮して粗ＬＰＳ画分
を採取し、この画分を常法の陰イオン交換クロマトグラ
フィー（例えば、モノＱ−セファロースまたはＱ−セフ
ァロースを使用する）により精製し、常法により脱塩す
る。
の微生物、例えば、パントエア属に属する微生物または
サルモネラ属に属する微生物等を、常法により培養し、
培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法、例え
ば、熱フェノール法［オー・ウエストファール(O. West
phal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミ
ストリー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５
巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Pr
ess)、１９６５年］、により抽出し、さらに、陰イオン
交換樹脂により精製して製造できる。すなわち、微生物
の菌体を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を蒸留水および等
容量の熱フェノールの混合液に添加して撹拌し、次いで
遠心分離して水層を回収し、この水層を透析してフェノ
ールを除去し、限外瀘過法により濃縮して粗ＬＰＳ画分
を採取し、この画分を常法の陰イオン交換クロマトグラ
フィー（例えば、モノＱ−セファロースまたはＱ−セフ
ァロースを使用する）により精製し、常法により脱塩す
る。
【００１６】このようにして得られた精製ＬＰＳは特開
平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０号公
報、特開平４−９９４８１号公報および特開平５−１５
５７７８号公報に開示される分子量５，０００から６，
０００程度のＬＰＳと実質的に等しい。さらに、得られ
た精製ＬＰＳを、例えばデオキシコール酸ナトリウム等
の界面活性剤の存在下でゲル瀘過し、低分子量ＬＰＳを
含有する画分のみを回収し、混在する高分子量ＬＰＳを
除去することによって、高度に精製されたこの発明の新
規な低分子量ＬＰＳを得ることができる。この界面活性
剤存在下でのゲル瀘過の工程は、特開平４−１８７６４
０号公報、特開平４−４９２４０号公報および特開平５
−１５５７７８号公報に開示される分子量５，０００か
ら６，０００程度のＬＰＳを更に高度に精製するための
ものであり、この工程により混在する高分子量ＬＰＳが
完全に排除されるのである。
平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０号公
報、特開平４−９９４８１号公報および特開平５−１５
５７７８号公報に開示される分子量５，０００から６，
０００程度のＬＰＳと実質的に等しい。さらに、得られ
た精製ＬＰＳを、例えばデオキシコール酸ナトリウム等
の界面活性剤の存在下でゲル瀘過し、低分子量ＬＰＳを
含有する画分のみを回収し、混在する高分子量ＬＰＳを
除去することによって、高度に精製されたこの発明の新
規な低分子量ＬＰＳを得ることができる。この界面活性
剤存在下でのゲル瀘過の工程は、特開平４−１８７６４
０号公報、特開平４−４９２４０号公報および特開平５
−１５５７７８号公報に開示される分子量５，０００か
ら６，０００程度のＬＰＳを更に高度に精製するための
ものであり、この工程により混在する高分子量ＬＰＳが
完全に排除されるのである。
【００１７】以上の方法により製造されたこの発明の新
規な低分子量ＬＰＳは、後記する試験例１に示すとお
り、 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること ｆ）核酸含量が、１％以下であること という理化学的および生物学的性質を有し、かつ少なく
とも９８％の純度を有している。しかしながら、使用目
的によっては、精製の程度を低く（例えば、９０％）す
ることもできる。
規な低分子量ＬＰＳは、後記する試験例１に示すとお
り、 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること ｆ）核酸含量が、１％以下であること という理化学的および生物学的性質を有し、かつ少なく
とも９８％の純度を有している。しかしながら、使用目
的によっては、精製の程度を低く（例えば、９０％）す
ることもできる。
【００１８】この発明の新規な低分子量ＬＰＳは、免疫
機能活性化作用を有する医薬品、動物用薬品等として使
用することもできる。次に試験例を示し、この発明の低
分子量ＬＰＳについてさらに詳しく説明する。試験例１ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの理化学的およ
び生物学的性質を調べるために行った。 １）試料の調製 実施例１および参考例１と同一の方法により低分子量Ｌ
ＰＳおよびＬＰＳをそれぞれ調製した。 ２）試験方法 分子量の測定 低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２
ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１０μｇを１．
５ｍｌ容プラスチックチューブに秤取した。これとは別
に、１８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの
５％β−メルカプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素
溶液、１１２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．
８）および２２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤ
Ｓ処理液１０μｌを、前記各試料溶液に添加して十分混
合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、その後直ちに氷
水中に浸して急冷した。
機能活性化作用を有する医薬品、動物用薬品等として使
用することもできる。次に試験例を示し、この発明の低
分子量ＬＰＳについてさらに詳しく説明する。試験例１ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの理化学的およ
び生物学的性質を調べるために行った。 １）試料の調製 実施例１および参考例１と同一の方法により低分子量Ｌ
ＰＳおよびＬＰＳをそれぞれ調製した。 ２）試験方法 分子量の測定 低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２
ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１０μｇを１．
５ｍｌ容プラスチックチューブに秤取した。これとは別
に、１８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの
５％β−メルカプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素
溶液、１１２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．
８）および２２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤ
Ｓ処理液１０μｌを、前記各試料溶液に添加して十分混
合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、その後直ちに氷
水中に浸して急冷した。
【００１９】１０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１
７．９ｇのトリシンおよび３．０３ｇのトリスを１リッ
トルの蒸留水に溶解して調製した泳動緩衝液をスラブゲ
ル電気泳動槽（マリソル社製）に入れた。２０％ポリア
クリルアミドゲルを泳動槽に固定し、サンプル溝に検体
を入れ、電圧を５０Ｖに１時間、次いで、１５０Ｖに固
定して、色素がゲルより溶出するまで泳動を継続した。
泳動終了後に、銀染色キット１６１−０４４３（バイオ
ラッド社製）により室温で銀染色を行い、挙動を確認し
た。ヘキソサミン含有量の定量 ヘキソサミン含有量を、エルソン−モルガン(Elson-Mor
gan)法（日本生化学会編、「生化学実験講座」、第４
巻、第３７７〜３７９ページ、第１版、東京化学同人出
版、１９７６年）により次のとおり定量した。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、
その１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イ
ワキガラス社製）に秤取し、これに１００μｌの８ＮＨ
Ｃｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し、のち４ＮＮ
ａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨを７に調整した。そ
の１００μｌを秤取し、別のスクリューキャップ付きス
ピッツに入れ、２００μｌの試薬Ａを加え、１０５℃で
１．５時間加熱し、流水で冷却した。次いで、その１０
０μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加
え、更に６７μｌの試薬Ｂを加え、室温で１時間放置
し、５３５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線作成
用標準試料としては０〜８００μｇ／ｍｌのＮ−アセチ
ルグルコサミン（和光純薬社製）を用いた。 試薬Ａ：７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムとの混合液。 試薬Ｂ：１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒド、３
０ｍｌの濃塩酸および３０ｍｌの９６％エタノールの混
合液。 ＫＤＯ含量の定量 ＫＤＯ含有量をジフェニルアミン法［アナリティカル・
バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、第５
８巻、第１号、第１２３〜１２９ページ、１９７４年］
により次のとおり定量した。
７．９ｇのトリシンおよび３．０３ｇのトリスを１リッ
トルの蒸留水に溶解して調製した泳動緩衝液をスラブゲ
ル電気泳動槽（マリソル社製）に入れた。２０％ポリア
クリルアミドゲルを泳動槽に固定し、サンプル溝に検体
を入れ、電圧を５０Ｖに１時間、次いで、１５０Ｖに固
定して、色素がゲルより溶出するまで泳動を継続した。
泳動終了後に、銀染色キット１６１−０４４３（バイオ
ラッド社製）により室温で銀染色を行い、挙動を確認し
た。ヘキソサミン含有量の定量 ヘキソサミン含有量を、エルソン−モルガン(Elson-Mor
gan)法（日本生化学会編、「生化学実験講座」、第４
巻、第３７７〜３７９ページ、第１版、東京化学同人出
版、１９７６年）により次のとおり定量した。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、
その１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イ
ワキガラス社製）に秤取し、これに１００μｌの８ＮＨ
Ｃｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し、のち４ＮＮ
ａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨを７に調整した。そ
の１００μｌを秤取し、別のスクリューキャップ付きス
ピッツに入れ、２００μｌの試薬Ａを加え、１０５℃で
１．５時間加熱し、流水で冷却した。次いで、その１０
０μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加
え、更に６７μｌの試薬Ｂを加え、室温で１時間放置
し、５３５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線作成
用標準試料としては０〜８００μｇ／ｍｌのＮ−アセチ
ルグルコサミン（和光純薬社製）を用いた。 試薬Ａ：７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムとの混合液。 試薬Ｂ：１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒド、３
０ｍｌの濃塩酸および３０ｍｌの９６％エタノールの混
合液。 ＫＤＯ含量の定量 ＫＤＯ含有量をジフェニルアミン法［アナリティカル・
バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、第５
８巻、第１号、第１２３〜１２９ページ、１９７４年］
により次のとおり定量した。
【００２０】５００ｍｇのジフェニルアミン（和光純薬
社製）、５ｍｌのエタノール（和光純薬社製）、４５ｍ
ｌの氷酢酸（和光純薬社製）、５０ｍｌの濃塩酸（和光
純薬社製）を混合してＫＤＯ検出試薬を調製した。その
５００μｌに、０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で各試料を含
む２５０μｌの水溶液を混合し、１００℃の沸騰水浴中
で３０分間加熱し、のち恒温水（２４〜２５℃）中で３
０分間冷却し、分光光度計（日立製作所製。モデルＵ２
０１０）により４２０、４７０、６３０、６５０ｎｍで
の吸光度を測定した（測定値を各々Ａ４２０、Ａ４７
０、Ａ６３０、Ａ６５０と記載する）。標準試料とし
て、０．５μモルの濃度のＫＤＯアンモニウム塩（シグ
マ社製）水溶液２５０μｌを使用した。
社製）、５ｍｌのエタノール（和光純薬社製）、４５ｍ
ｌの氷酢酸（和光純薬社製）、５０ｍｌの濃塩酸（和光
純薬社製）を混合してＫＤＯ検出試薬を調製した。その
５００μｌに、０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で各試料を含
む２５０μｌの水溶液を混合し、１００℃の沸騰水浴中
で３０分間加熱し、のち恒温水（２４〜２５℃）中で３
０分間冷却し、分光光度計（日立製作所製。モデルＵ２
０１０）により４２０、４７０、６３０、６５０ｎｍで
の吸光度を測定した（測定値を各々Ａ４２０、Ａ４７
０、Ａ６３０、Ａ６５０と記載する）。標準試料とし
て、０．５μモルの濃度のＫＤＯアンモニウム塩（シグ
マ社製）水溶液２５０μｌを使用した。
【００２１】検体試料および標準試料の４種の測定値か
ら、式（１）によりＳ値を求め、検体試料および標準試
料のＳ値をそれぞれＳt およびＳs とした。次いで式
（２）によりＫＤＯのモル数Ｘを算出した。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ （１） Ｘ＝（０．５×Ｓs ×ＬＰＳ１モルの分子量）／（０．５×Ｓt ×１０6 ） （２） リムラス活性の測定 リムラス活性とは、１９６８年にレヴィンにより創案さ
れたカブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いたエン
ドトキシン定量法であるリムラステスト（鈴木郁生編、
「医薬品の開発第１４巻、医薬品の品質管理及び試験
法」、第２２７〜２４３ページ、廣川書店、１９９０
年）で陽性を呈することを意味し、このリムラステスト
はＬＰＳ検出法として知られている。標準品として、３
４５ｐｇ／ＥＵのイー・コリ(E. coli) ０１１１：Ｂ４
を用いてトキシカラーシステム（生化学工業社製）を使
用して測定した。 タンパク質含量 タンパク質含量を、ローリー法［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリ(Journal of Biological Che
mistry) 、第１９３巻、第６５ページ、１９５１年］に
より測定した。 核酸含量 核酸含量を、ＯＤ（２６０ｎｍ−３００ｎｍ）での測定
値（１ＯＤ＝４０μｇ）から定量した。 純度 純度（％）は、次式により算出した。
ら、式（１）によりＳ値を求め、検体試料および標準試
料のＳ値をそれぞれＳt およびＳs とした。次いで式
（２）によりＫＤＯのモル数Ｘを算出した。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ （１） Ｘ＝（０．５×Ｓs ×ＬＰＳ１モルの分子量）／（０．５×Ｓt ×１０6 ） （２） リムラス活性の測定 リムラス活性とは、１９６８年にレヴィンにより創案さ
れたカブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いたエン
ドトキシン定量法であるリムラステスト（鈴木郁生編、
「医薬品の開発第１４巻、医薬品の品質管理及び試験
法」、第２２７〜２４３ページ、廣川書店、１９９０
年）で陽性を呈することを意味し、このリムラステスト
はＬＰＳ検出法として知られている。標準品として、３
４５ｐｇ／ＥＵのイー・コリ(E. coli) ０１１１：Ｂ４
を用いてトキシカラーシステム（生化学工業社製）を使
用して測定した。 タンパク質含量 タンパク質含量を、ローリー法［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリ(Journal of Biological Che
mistry) 、第１９３巻、第６５ページ、１９５１年］に
より測定した。 核酸含量 核酸含量を、ＯＤ（２６０ｎｍ−３００ｎｍ）での測定
値（１ＯＤ＝４０μｇ）から定量した。 純度 純度（％）は、次式により算出した。
【００２２】純度＝［｛乾燥収量−（タンパク質含量＋
核酸含量）｝／乾燥収量］×１００ ３）試験結果 分子量 分子量測定の結果は、図１に示すとおりである。図１
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図であり、図中レーン１は同
時に泳動させたタンパク質およびペプチド分子量マーカ
ー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０．
１ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、
８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤ、２．５６ｋＤ（ファルマ
シア社製）］、レーン２、３および４はＬＰＳ（２０μ
ｇ、５μｇおよび１．２５μｇ）、レーン５、６、７お
よび８は低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５
μｇおよび０．３１μｇ）であり、図の縦軸は、分子量
を示す。
核酸含量）｝／乾燥収量］×１００ ３）試験結果 分子量 分子量測定の結果は、図１に示すとおりである。図１
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図であり、図中レーン１は同
時に泳動させたタンパク質およびペプチド分子量マーカ
ー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０．
１ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、
８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤ、２．５６ｋＤ（ファルマ
シア社製）］、レーン２、３および４はＬＰＳ（２０μ
ｇ、５μｇおよび１．２５μｇ）、レーン５、６、７お
よび８は低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５
μｇおよび０．３１μｇ）であり、図の縦軸は、分子量
を示す。
【００２３】一般的に糖鎖を有する物質を電気泳動した
場合、レーン当たりのサンプル量が過剰の時には染色帯
が幅広くなり、見かけの分子量範囲が広くなる。図１の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥではレーン５から８は、同一試料の低
分子量ＬＰＳの量を変更して泳動したものであるが、試
料の泳動量が増えるに従い染色帯の幅が広がっている。
従って、正確な分子量を調べる目的では、１μｇ程度の
量が適当であり、レーン８が相当する。なお、レーン２
およびレーン５は、高分子量のＬＰＳの存在を確認する
ために多量の試料を泳動させたものである。
場合、レーン当たりのサンプル量が過剰の時には染色帯
が幅広くなり、見かけの分子量範囲が広くなる。図１の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥではレーン５から８は、同一試料の低
分子量ＬＰＳの量を変更して泳動したものであるが、試
料の泳動量が増えるに従い染色帯の幅が広がっている。
従って、正確な分子量を調べる目的では、１μｇ程度の
量が適当であり、レーン８が相当する。なお、レーン２
およびレーン５は、高分子量のＬＰＳの存在を確認する
ために多量の試料を泳動させたものである。
【００２４】低分子量ＬＰＳの分子量（レーン８より計
算）は、レーン１のサイズマーカから計算して染色帯の
中心値で５ｋＤａ、染色帯幅の範囲は４ｋＤａから７ｋ
Ｄａであった。また、レーン５では、２０μｇの低分子
量ＬＰＳを泳動させたにもかかわらず、レーン２のよう
に高分子量ＬＰＳは全く認められなかった。以上の結果
から、この発明の低分子量ＬＰＳの分子量は、５，００
０±２，０００であり、高分子量ＬＰＳが完全に除去さ
れていることが判明した。 ヘキソサミン含量 この発明の低分子量ＬＰＳのヘキソサミン数は２個／分
子量５，０００であった。 ＫＤＯ含量 この発明の低分子量ＬＰＳに含まれるＫＤＯは２．４個
／分子量５，０００であった。 リムラス活性 この発明の低分子量ＬＰＳのリムラス活性は４３．５Ｅ
Ｕ／ｎｇであり、これに対して、参考例１と同様の方法
で調製した従来のＬＰＳのリムラス活性は８．４ＥＵ／
ｎｇであった。 タンパク質含量 この発明の低分子量ＬＰＳのタンパク質含量は、０．６
８％以下であった。 核酸含量 この発明の低分子量ＬＰＳの核酸含量は０．５０％以下
であった。 純度 この発明の低分子量ＬＰＳの純度は９８％以上であっ
た。
算）は、レーン１のサイズマーカから計算して染色帯の
中心値で５ｋＤａ、染色帯幅の範囲は４ｋＤａから７ｋ
Ｄａであった。また、レーン５では、２０μｇの低分子
量ＬＰＳを泳動させたにもかかわらず、レーン２のよう
に高分子量ＬＰＳは全く認められなかった。以上の結果
から、この発明の低分子量ＬＰＳの分子量は、５，００
０±２，０００であり、高分子量ＬＰＳが完全に除去さ
れていることが判明した。 ヘキソサミン含量 この発明の低分子量ＬＰＳのヘキソサミン数は２個／分
子量５，０００であった。 ＫＤＯ含量 この発明の低分子量ＬＰＳに含まれるＫＤＯは２．４個
／分子量５，０００であった。 リムラス活性 この発明の低分子量ＬＰＳのリムラス活性は４３．５Ｅ
Ｕ／ｎｇであり、これに対して、参考例１と同様の方法
で調製した従来のＬＰＳのリムラス活性は８．４ＥＵ／
ｎｇであった。 タンパク質含量 この発明の低分子量ＬＰＳのタンパク質含量は、０．６
８％以下であった。 核酸含量 この発明の低分子量ＬＰＳの核酸含量は０．５０％以下
であった。 純度 この発明の低分子量ＬＰＳの純度は９８％以上であっ
た。
【００２５】なお、微生物および製造法を変更して試験
したが、ほぼ同様な結果が得られた。試験例２ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの急性毒性を調
べるために行った。 （１）試料の調製および試験方法 実施例１と同一の方法で調製した低分子量ＬＰＳおよび
参考例１と同一の方法で調製したＬＰＳの毒性を、７週
齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールス・リバー社か
ら購入）を用いて試験した。１群４匹からなるマウス群
に、各試料を生理食塩水に溶解し、１匹あたり５．０、
１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与
した（ただし４０ｍｇ／Ｋｇの投与は低分子量ＬＰＳの
み）。投与後７２時間マウスの生死を観察した。 （２）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明
らかなように、静脈内投与の場合、この発明の低分子量
ＬＰＳではいずれの投与量においてもマウスの死亡例は
認められず、ＬＤ50は４０ｍｇ／ｋｇ以上であったが、
ＬＰＳでは１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で全数が
死亡し、ＬＤ50は６．０〜８．６ｍｇ／ｋｇであった。
なお、微生物の種類および低分子量ＬＰＳの製造法を変
更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。
したが、ほぼ同様な結果が得られた。試験例２ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの急性毒性を調
べるために行った。 （１）試料の調製および試験方法 実施例１と同一の方法で調製した低分子量ＬＰＳおよび
参考例１と同一の方法で調製したＬＰＳの毒性を、７週
齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールス・リバー社か
ら購入）を用いて試験した。１群４匹からなるマウス群
に、各試料を生理食塩水に溶解し、１匹あたり５．０、
１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与
した（ただし４０ｍｇ／Ｋｇの投与は低分子量ＬＰＳの
み）。投与後７２時間マウスの生死を観察した。 （２）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明
らかなように、静脈内投与の場合、この発明の低分子量
ＬＰＳではいずれの投与量においてもマウスの死亡例は
認められず、ＬＤ50は４０ｍｇ／ｋｇ以上であったが、
ＬＰＳでは１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で全数が
死亡し、ＬＤ50は６．０〜８．６ｍｇ／ｋｇであった。
なお、微生物の種類および低分子量ＬＰＳの製造法を変
更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。
【００２６】
【表１】
【００２７】試験例３ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳを試験例２より
も多量に投与した場合の急性毒性を調べるために行っ
た。 （１）試料の調製および試験方法 試験例２と同一の低分子量ＬＰＳを１匹あたり４０、８
０および１６０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したこ
と、およびＬＰＳを１匹あたり５．０、または１０ｍｇ
／ｋｇの割合で静脈内に投与したことを除き、試験例２
と同一の方法により試験した。 （２）試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から
明らかなように、ＬＰＳ５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で２
５％が、また１０ｍｇ／ｋｇの投与量では７５％が死亡
した。これに対して、低分子量ＬＰＳにおいては４０ｍ
ｇ／ｋｇの投与量で死亡せず、８０および１６０ｍｇ／
ｋｇの投与量では、１００％が死亡した。 前試験例２
とこの試験例３の結果から、ＬＤ50を算出すると表３の
とおりである。表３から明らかなように、低分子量ＬＰ
ＳのＬＤ50の値はＬＰＳのそれに比べて、静脈内投与で
は約８倍であった。
も多量に投与した場合の急性毒性を調べるために行っ
た。 （１）試料の調製および試験方法 試験例２と同一の低分子量ＬＰＳを１匹あたり４０、８
０および１６０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したこ
と、およびＬＰＳを１匹あたり５．０、または１０ｍｇ
／ｋｇの割合で静脈内に投与したことを除き、試験例２
と同一の方法により試験した。 （２）試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から
明らかなように、ＬＰＳ５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で２
５％が、また１０ｍｇ／ｋｇの投与量では７５％が死亡
した。これに対して、低分子量ＬＰＳにおいては４０ｍ
ｇ／ｋｇの投与量で死亡せず、８０および１６０ｍｇ／
ｋｇの投与量では、１００％が死亡した。 前試験例２
とこの試験例３の結果から、ＬＤ50を算出すると表３の
とおりである。表３から明らかなように、低分子量ＬＰ
ＳのＬＤ50の値はＬＰＳのそれに比べて、静脈内投与で
は約８倍であった。
【００２８】これらの結果は、ＬＰＳの分子量の相違が
毒性に影響を及ぼすことを示しており、低分子量ＬＰＳ
は、従来のＬＰＳに比して極めて毒性の低いことが判明
した
毒性に影響を及ぼすことを示しており、低分子量ＬＰＳ
は、従来のＬＰＳに比して極めて毒性の低いことが判明
した
【００２９】。
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】試験例４ この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効
果を確認するために行った。各群３匹の７週齢の雄Ｃ３
Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールズ・リバー社より購入）
の尾静脈に、１匹あたり０．１、１．０、または１０μ
ｇの実施例１と同様の方法で製造した低分子量ＬＰＳ、
または参考例１と同じ方法で得られたＬＰＳを含む生理
食塩水０．２ｍｌを注射し、その１時間後に採血し常法
により血清を分離した。
果を確認するために行った。各群３匹の７週齢の雄Ｃ３
Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールズ・リバー社より購入）
の尾静脈に、１匹あたり０．１、１．０、または１０μ
ｇの実施例１と同様の方法で製造した低分子量ＬＰＳ、
または参考例１と同じ方法で得られたＬＰＳを含む生理
食塩水０．２ｍｌを注射し、その１時間後に採血し常法
により血清を分離した。
【００３２】このようにして得られた各血清中のＴＮＦ
活性を、Ｌ９２９細胞に対する毒性に基づく方法で測定
した。すなわち、Ｌ９２９細胞を５％ウシ胎児血清を含
有するＭＥＭ培地で８×１０４個／１００μｌの濃度に
調製し、これを９６穴平底プレートの各穴に１００μｌ
づつまき、３７℃で２時間、５％ＣＯ２存在下で培養し
た。その後アクチノマイシンＤを１μｌ／ｍｌとなるよ
うに添加し、ＭＥＭ培地で段階希釈した血清試料または
陽性対照ヒトＴＮＦ−α（旭化成社製）を５０μｌづつ
添加し、更に同じ条件で１８時間培養した。培地をアス
ピレーターで取り除いた後、３７℃のＰＢＳで洗浄し死
細胞を完全に取り除き、０．１％クリスタルバイオレッ
トを含む１％メチルアルコール溶液を加えて生細胞を染
色した。この染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を
指標として測定し、陽性対照として用いたＴＮＦ−αの
希釈率と吸光度との関係をもとにＴＮＦ活性を算定し
た。
活性を、Ｌ９２９細胞に対する毒性に基づく方法で測定
した。すなわち、Ｌ９２９細胞を５％ウシ胎児血清を含
有するＭＥＭ培地で８×１０４個／１００μｌの濃度に
調製し、これを９６穴平底プレートの各穴に１００μｌ
づつまき、３７℃で２時間、５％ＣＯ２存在下で培養し
た。その後アクチノマイシンＤを１μｌ／ｍｌとなるよ
うに添加し、ＭＥＭ培地で段階希釈した血清試料または
陽性対照ヒトＴＮＦ−α（旭化成社製）を５０μｌづつ
添加し、更に同じ条件で１８時間培養した。培地をアス
ピレーターで取り除いた後、３７℃のＰＢＳで洗浄し死
細胞を完全に取り除き、０．１％クリスタルバイオレッ
トを含む１％メチルアルコール溶液を加えて生細胞を染
色した。この染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を
指標として測定し、陽性対照として用いたＴＮＦ−αの
希釈率と吸光度との関係をもとにＴＮＦ活性を算定し
た。
【００３３】その結果は、表４に示すとおりであった。
表４においてＴＮＦ活性は各群３匹の平均値である。こ
の結果から、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効
果は、参考例１の方法で得られる従来のＬＰＳのそれを
上回ることが明らかとなった。
表４においてＴＮＦ活性は各群３匹の平均値である。こ
の結果から、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効
果は、参考例１の方法で得られる従来のＬＰＳのそれを
上回ることが明らかとなった。
【００３４】
【表４】
【００３５】参考例１ トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディ
フコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業社製。特級）
１０ｇを蒸留水１リットルに添加し、ＮａＯＨでｐＨを
７．５に調整し、オートクレーブで滅菌し、別に滅菌し
たグルコース（和光純薬工業社製。特級）を０．１％の
割合で添加した培地（以下Ｌ−肉汁培地と記載する）１
００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、−８
０℃で保存されているパントエア・アグロメランス(Pan
toea agglomerans) 保存菌株から単一コロニーを分離し
て接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を
１，０００ｍｌのＬ−肉汁培地の入った３リットル容の
坂口フラスコに接種し、同様に培養した。
フコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業社製。特級）
１０ｇを蒸留水１リットルに添加し、ＮａＯＨでｐＨを
７．５に調整し、オートクレーブで滅菌し、別に滅菌し
たグルコース（和光純薬工業社製。特級）を０．１％の
割合で添加した培地（以下Ｌ−肉汁培地と記載する）１
００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、−８
０℃で保存されているパントエア・アグロメランス(Pan
toea agglomerans) 保存菌株から単一コロニーを分離し
て接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を
１，０００ｍｌのＬ−肉汁培地の入った３リットル容の
坂口フラスコに接種し、同様に培養した。
【００３６】さらに、７リットルのＬ−肉汁培地の入っ
た１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオ
エンジ社製）に培養した菌体を接種し、同条件で通気培
養し、のち集菌し、約７０ｇの湿菌体を回収し、これを
凍結保存した。凍結保存菌体約７０ｇを５００ｍｌの蒸
留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加
して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。
フェノール層を更に１回前記と同一の操作を反復し、回
収した２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除
去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・ト
ーヨー社製。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カッ
ト−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮し
た。
た１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオ
エンジ社製）に培養した菌体を接種し、同条件で通気培
養し、のち集菌し、約７０ｇの湿菌体を回収し、これを
凍結保存した。凍結保存菌体約７０ｇを５００ｍｌの蒸
留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加
して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。
フェノール層を更に１回前記と同一の操作を反復し、回
収した２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除
去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・ト
ーヨー社製。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カッ
ト−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮し
た。
【００３７】得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶
解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交
換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファ
ロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含
む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００
ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と
同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥
し、約７０ｇの湿菌体から約３００ｍｇの精製ＬＰＳを
得た。
解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交
換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファ
ロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含
む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００
ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と
同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥
し、約７０ｇの湿菌体から約３００ｍｇの精製ＬＰＳを
得た。
【００３８】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳
細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定
されるものではない。
細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定
されるものではない。
【００３９】
実施例１ 参考例１と同一の方法で得た精製ＬＰＳ１００ｍｇを５
ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化緩衝液［３％デオキシコール
酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａおよび２０ｍＭトリス−塩
酸からなり、ｐＨ８．３］に溶解し、精製ＬＰＳ溶液２
０ｍｌをセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマ
シア社製）の上部に静かに重層し、溶出緩衝液［０．２
５％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、
０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍ
Ｍトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］により流速１６
ｍｌ／時で８００ｍｌ（５０時間）溶出した。
ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化緩衝液［３％デオキシコール
酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａおよび２０ｍＭトリス−塩
酸からなり、ｐＨ８．３］に溶解し、精製ＬＰＳ溶液２
０ｍｌをセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマ
シア社製）の上部に静かに重層し、溶出緩衝液［０．２
５％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、
０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍ
Ｍトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］により流速１６
ｍｌ／時で８００ｍｌ（５０時間）溶出した。
【００４０】ペリスタポンプＰＩ（ファルマシア社製）
を用いて流速を制御しながら、得られた溶出液を、フラ
クションコレクター（アドバンテック社製。ＳＦ２１２
０）により分画し、最初の２４０ｍｌ（２４フラクショ
ン分）を廃棄し、その後１０ｍｌ／フラクションで８０
フラクションまで分画した。溶出した各画分について原
液または希釈液でフェノール／硫酸法（福井作蔵、「還
元糖の定量法・第２版」、第５０〜５２ページ、学会出
版センター、１９９０年）により糖の定量を行い、溶出
状態を調べた。得られた溶出状態の結果から、ＬＰＳの
存在が予想される分画（フラクション３０〜６０）のう
ち、フラクション３７〜５５の各フラクション０．５ｍ
ｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＬＰＳの分画パタ
ーンを調べた。 その結果、フラクション４５−５５は
低分子量（分子量約５ｋＤ）ＬＰＳのみが認められ、フ
ラクション３７−４４は高分子分量および低分子量の両
方のＬＰＳが認められたので、フラクション４５−５５
の低分子量ＬＰＳ分画を次のとおりさらに精製した。
を用いて流速を制御しながら、得られた溶出液を、フラ
クションコレクター（アドバンテック社製。ＳＦ２１２
０）により分画し、最初の２４０ｍｌ（２４フラクショ
ン分）を廃棄し、その後１０ｍｌ／フラクションで８０
フラクションまで分画した。溶出した各画分について原
液または希釈液でフェノール／硫酸法（福井作蔵、「還
元糖の定量法・第２版」、第５０〜５２ページ、学会出
版センター、１９９０年）により糖の定量を行い、溶出
状態を調べた。得られた溶出状態の結果から、ＬＰＳの
存在が予想される分画（フラクション３０〜６０）のう
ち、フラクション３７〜５５の各フラクション０．５ｍ
ｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＬＰＳの分画パタ
ーンを調べた。 その結果、フラクション４５−５５は
低分子量（分子量約５ｋＤ）ＬＰＳのみが認められ、フ
ラクション３７−４４は高分子分量および低分子量の両
方のＬＰＳが認められたので、フラクション４５−５５
の低分子量ＬＰＳ分画を次のとおりさらに精製した。
【００４１】各画分を混合して凍結乾燥し、エタノール
に懸濁し、遠心分離によりエタノールに可溶なデオキシ
コール酸を除去し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収
した。低分子量ＬＰＳ画分のエタノール処理をさらに２
回反復し、デオキシコール酸を除去し、次に７０％エタ
ノールに再度懸濁し、遠心分離で緩衝液成分を除去し、
この操作をさらに３回反復し、低分子量ＬＰＳを不溶性
画分に回収し、凍結乾燥し、精製した低分子量ＬＰＳを
約２０ｍｇ得た。 実施例２ トリプトン（ディフコ社製）５ｇ、リン酸二水素カリウ
ム１．６ｇおよび塩化ナトリウム８ｇを精製水１，００
０ｍｌに溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した（以下こ
れを基礎培地という）。基礎培地１００ｍｌに４０％塩
化マグネシウム溶液１０ｍｌおよび０．４％マラカイト
グリン溶液３ｍｌを無菌的に添加し、これをマグネシウ
ム−マラカイトグリン培地とした。
に懸濁し、遠心分離によりエタノールに可溶なデオキシ
コール酸を除去し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収
した。低分子量ＬＰＳ画分のエタノール処理をさらに２
回反復し、デオキシコール酸を除去し、次に７０％エタ
ノールに再度懸濁し、遠心分離で緩衝液成分を除去し、
この操作をさらに３回反復し、低分子量ＬＰＳを不溶性
画分に回収し、凍結乾燥し、精製した低分子量ＬＰＳを
約２０ｍｇ得た。 実施例２ トリプトン（ディフコ社製）５ｇ、リン酸二水素カリウ
ム１．６ｇおよび塩化ナトリウム８ｇを精製水１，００
０ｍｌに溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した（以下こ
れを基礎培地という）。基礎培地１００ｍｌに４０％塩
化マグネシウム溶液１０ｍｌおよび０．４％マラカイト
グリン溶液３ｍｌを無菌的に添加し、これをマグネシウ
ム−マラカイトグリン培地とした。
【００４２】マグネシウム−マラカイトグリン培地１０
０ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、サルモ
ネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)保存菌株から単
一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養
し、そのまま全量を１，０００ｍｌのマグネシウム−マ
ラカイトグリン培地の入った３リットル容の坂口フラス
コに接種し、同一条件で培養した。
０ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、サルモ
ネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)保存菌株から単
一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養
し、そのまま全量を１，０００ｍｌのマグネシウム−マ
ラカイトグリン培地の入った３リットル容の坂口フラス
コに接種し、同一条件で培養した。
【００４３】さらに、７リットルのマグネシウム−マラ
カイトグリン培地の入った１０リットル容の卓上型ファ
ーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を
接種し、同一条件で通気培養し、のち集菌し、約５０ｇ
の湿菌体を回収し、これを凍結保存した。凍結保存菌体
約５０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの
９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間
撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心
処理し、水層を回収した。フェノール層をさらに１回前
記と同一の操作で処理した。２回の水層を合し、１夜透
析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置
（アドヴァンテック・トーヨー社。ＵＫ−２００）を用
いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガ
ス下で限外瀘過濃縮をした。
カイトグリン培地の入った１０リットル容の卓上型ファ
ーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を
接種し、同一条件で通気培養し、のち集菌し、約５０ｇ
の湿菌体を回収し、これを凍結保存した。凍結保存菌体
約５０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの
９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間
撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心
処理し、水層を回収した。フェノール層をさらに１回前
記と同一の操作で処理した。２回の水層を合し、１夜透
析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置
（アドヴァンテック・トーヨー社。ＵＫ−２００）を用
いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガ
ス下で限外瀘過濃縮をした。
【００４４】得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶
解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交
換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファ
ロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含
む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００
ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と
同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥
し、約５０ｇの湿菌体から約２１０ｍｇの精製ＬＰＳを
得た。
解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交
換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファ
ロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含
む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００
ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と
同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥
し、約５０ｇの湿菌体から約２１０ｍｇの精製ＬＰＳを
得た。
【００４５】この精製ＬＰＳ８０ｍｇを実施例１と同一
の方法で、３％デオキシコール酸ナトリウムを含有する
可溶化緩衝液に溶解し、セファクリルＳ−２００ＨＲカ
ラム（ファルマシア社製）で展開し、低分子量ＬＰＳの
みを含有する画分を回収し、凍結乾燥後、エタノールに
懸濁し、遠心分離によりデオキシコール酸等の緩衝液成
分を除去し、凍結乾燥し、約５ｍｇの低分子量ＬＰＳを
得た。
の方法で、３％デオキシコール酸ナトリウムを含有する
可溶化緩衝液に溶解し、セファクリルＳ−２００ＨＲカ
ラム（ファルマシア社製）で展開し、低分子量ＬＰＳの
みを含有する画分を回収し、凍結乾燥後、エタノールに
懸濁し、遠心分離によりデオキシコール酸等の緩衝液成
分を除去し、凍結乾燥し、約５ｍｇの低分子量ＬＰＳを
得た。
【００４６】この低分子量ＬＰＳの分子量、ＫＤＯ数お
よびヘキソサミン数を前記試験例１と同一の方法で測定
した結果、それぞれ６，０００、２．０１個／分子量
６，０００、および２．８個／分子量６，０００であっ
た。なお、参考のため図２に、サルモネラ・ミネソタ菌
株から精製された低分子量ＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ図
を示す。図中レーン１は蛋白質およびペプチドマーカー
［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋ
Ｄ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．
２４ｋＤ、６．３８ｋＤおよび２．５６ｋＤ（ファルマ
シア社製）］、レーン２、３および４はデオキシコール
酸ナトリウム存在化でのゲル瀘過前の精製ＬＰＳ（２０
μｇ、５μｇ、および１．２５μｇ）、レーン５、６、
７および８は、低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、
１．２５μｇ、および０．３１μｇ）である。
よびヘキソサミン数を前記試験例１と同一の方法で測定
した結果、それぞれ６，０００、２．０１個／分子量
６，０００、および２．８個／分子量６，０００であっ
た。なお、参考のため図２に、サルモネラ・ミネソタ菌
株から精製された低分子量ＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ図
を示す。図中レーン１は蛋白質およびペプチドマーカー
［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋ
Ｄ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．
２４ｋＤ、６．３８ｋＤおよび２．５６ｋＤ（ファルマ
シア社製）］、レーン２、３および４はデオキシコール
酸ナトリウム存在化でのゲル瀘過前の精製ＬＰＳ（２０
μｇ、５μｇ、および１．２５μｇ）、レーン５、６、
７および８は、低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、
１．２５μｇ、および０．３１μｇ）である。
【００４７】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
より、医薬品等として使用し得る安全性が極めて高く、
かつ生物活性の高い低分子量ＬＰＳが提供される。
より、医薬品等として使用し得る安全性が極めて高く、
かつ生物活性の高い低分子量ＬＰＳが提供される。
【図１】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。
【図２】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年２月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】しかしながら、従来のＬＰＳは、安全性の
面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本
組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔII」、第１２
１ページ、朝倉書店、１９８７年）。一方、細菌の細胞
壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノー
ル−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal)
編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリ
ー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第
８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、
１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・ス
タブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology a
nd Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤ
ＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４
３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られてい
るが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコー
ル酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量
約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報
告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９
ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０
００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極
めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、
従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８
１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されている
が、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３
０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また
特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０
号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分
子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開
示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およ
びイオン交換において精製された標品であり、高分子量
ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子
量ＬＰＳが混在していた。
面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（日本
組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔII」、第１２
１ページ、朝倉書店、１９８７年）。一方、細菌の細胞
壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノー
ル−水抽出法［オー・ウエストファール(O. Westphal)
編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリ
ー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第
８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、
１９６５年］、トリクロル酢酸抽出法［エー・エム・ス
タブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology a
nd Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９６７年］、ＥＤ
ＴＡ抽出法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第２４
３号、第６３８４ページ、１９６８年］等が知られてい
るが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコー
ル酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量
約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報
告されている（本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９
ページ、講談社、１９７３年）。一方、分子量２０，０
００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極
めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、
従来報告されていなかった。例えば特開平４−９９４８
１号公報には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されている
が、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３
０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また
特開平４−１８７６４０号公報、特開平４−４９２４０
号公報および特開平５−１５５７７８号公報において分
子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開
示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およ
びイオン交換において精製された標品であり、高分子量
ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子
量ＬＰＳが混在していた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】 微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｃ）
の理化学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること を有する低分子量リポポリサッカライド。 - 【請求項２】 微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｆ）
の理化学的および生物学的性質 ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に
染色帯を実質的に認めないこと ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン
含量が１〜３個／分子量５，０００であること ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−
デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，００
０であること ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇである
こと ｅ）タンパク質含量が、１％（重量）以下であること ｆ）核酸含量が、１％（重量）以下であること を有する低分子量リポポリサッカライド。 - 【請求項３】 微生物が、グラム陰性微生物である請求
項１または項２に記載の低分子量リポポリサッカライ
ド。 - 【請求項４】 グラム陰性微生物が、パントエア(Panto
ea) 属に属する微生物またはサルモネラ(Salmonella)属
に属する微生物である請求項３に記載の低分子量リポポ
リサッカライド。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01212695A JP4043533B2 (ja) | 1995-01-27 | 1995-01-27 | 低分子量リポポリサッカライド |
| PCT/JP1996/000135 WO1996023002A1 (en) | 1995-01-27 | 1996-01-25 | Low-molecular-weight lipopolysaccharide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01212695A JP4043533B2 (ja) | 1995-01-27 | 1995-01-27 | 低分子量リポポリサッカライド |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004284142A Division JP2005042120A (ja) | 2004-09-29 | 2004-09-29 | 低分子量リポポリサッカライド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08198902A true JPH08198902A (ja) | 1996-08-06 |
| JP4043533B2 JP4043533B2 (ja) | 2008-02-06 |
Family
ID=11796853
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01212695A Expired - Lifetime JP4043533B2 (ja) | 1995-01-27 | 1995-01-27 | 低分子量リポポリサッカライド |
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| WO2006038304A1 (ja) * | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Maruho Co., Ltd. | リポポリサッカライドを有効成分とする肛門圧低下外用剤 |
| JP2008183011A (ja) * | 2003-09-26 | 2008-08-14 | Genichiro Soma | 発酵及び培養方法、植物発酵エキス、植物発酵エキス末並びに該植物発酵エキス配合物 |
| JP2013231026A (ja) * | 2012-04-04 | 2013-11-14 | Nitto Denko Corp | ワクチン組成物 |
| JP2015023832A (ja) * | 2013-07-26 | 2015-02-05 | 克史 小早川 | 飲料水 |
| JP2018035084A (ja) * | 2016-08-30 | 2018-03-08 | 有限会社バイオメディカルリサーチグループ | 皮膚用抗菌組成物 |
| JP2020065490A (ja) * | 2018-10-24 | 2020-04-30 | 株式会社アンチエイジング・プロ | Ｌｐｓ高含有組成物の製造方法 |
| JP2021173650A (ja) * | 2020-04-27 | 2021-11-01 | 株式会社島津製作所 | 血清型判別方法 |
| JP2022160938A (ja) * | 2021-04-07 | 2022-10-20 | 有限会社バイオメディカルリサーチグループ | 発酵及び培養方法、リポ多糖、発酵エキス、発酵エキス末並びにその配合物 |
| WO2024058253A1 (ja) * | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Ｅｎｅｏｓ株式会社 | リポ多糖を含む組成物 |
| WO2024224651A1 (ja) * | 2023-04-24 | 2024-10-31 | 源一郎 杣 | リポ多糖、リポ多糖製造方法及びリポ多糖配合物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5511112B2 (ja) | 2011-06-14 | 2014-06-04 | 有限会社バイオメディカルリサーチグループ | 菌体破砕物及びその配合物 |
| CN105530958A (zh) * | 2013-10-03 | 2016-04-27 | 日东电工株式会社 | 粘膜疫苗组合物 |
| WO2015050181A1 (ja) * | 2013-10-03 | 2015-04-09 | 日東電工株式会社 | 注射ワクチン組成物 |
| RU2016109150A (ru) * | 2013-10-03 | 2017-11-10 | Нитто Денко Корпорейшн | Мукозальная вакцинная композиция |
| US10071155B2 (en) | 2013-10-03 | 2018-09-11 | Nitto Denko Corporation | Nasal mucosal vaccine composition |
| WO2021060127A1 (ja) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 有限会社バイオメディカルリサーチグループ | リポポリサッカライドの製造方法 |
| CA3177327A1 (en) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Andrew A. Dahl | Use of tlr4 modulator in the treatment of coccidiosis |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04187640A (ja) * | 1990-11-22 | 1992-07-06 | Chiba Seifun Kk | 経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免疫機能促進剤 |
| JPH05155778A (ja) * | 1991-12-02 | 1993-06-22 | Chiba Seifun Kk | Ｌｐｓを含む発育促進剤及び動物用発育促進剤 |
| JPH06141849A (ja) * | 1992-10-30 | 1994-05-24 | Genichiro Soma | Ｌｐｓ産生菌、ｌｐｓ、免疫機能活性化剤及び動物用免疫機能活性化剤 |
-
1995
- 1995-01-27 JP JP01212695A patent/JP4043533B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-25 WO PCT/JP1996/000135 patent/WO1996023002A1/ja not_active Ceased
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|---|---|---|---|---|
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| AU757122C (en) * | 1999-03-26 | 2004-11-25 | Genichiro Soma | Additives for crustacean or fish feeds and feeds |
| CN100473284C (zh) | 1999-03-26 | 2009-04-01 | 杣源一郎 | 用于甲壳类或鱼类的饲料添加剂及饲料 |
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| EP1676908A4 (en) * | 2003-09-26 | 2009-04-22 | Soma Genichiro | FERMENTATION AND CULTURE PROCESSES, FERMENTED PLANT EXTRACT, POWDER OF A FERMENTED PLANT EXTRACT AND COMPOSITION WITH THE FERMENTED PLANT EXTRACT |
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| EP2444480A1 (en) | 2003-09-26 | 2012-04-25 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant |
| WO2006038304A1 (ja) * | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Maruho Co., Ltd. | リポポリサッカライドを有効成分とする肛門圧低下外用剤 |
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| US9498527B2 (en) | 2012-04-04 | 2016-11-22 | Nitto Denko Corporation | Vaccine composition |
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