JPH08205874A - 修飾されたヌクレオチド結合部位を有するｄｎａシークエンシング用のｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

修飾されたヌクレオチド結合部位を有するｄｎａシークエンシング用のｄｎａポリメラーゼ

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JPH08205874A
JPH08205874A JP7268879A JP26887995A JPH08205874A JP H08205874 A JPH08205874 A JP H08205874A JP 7268879 A JP7268879 A JP 7268879A JP 26887995 A JP26887995 A JP 26887995A JP H08205874 A JPH08205874 A JP H08205874A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ＤＮＡシークエンシング用の有用なＤＮＡポリ
メラーゼを提供すること。 【解決手段】対応する天然に存在するＤＮＡポリメラー
ゼの能力と比較して、対応するデオキシヌクレオチドに
対してジデオキシヌクレオチドまたは他のデオキシヌク
レオチド類似体を取り込む能力を増加させるように修飾
されているＤＮＡポリメラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡシークエンシ
ングおよびＤＮＡシークエンシングのための自動化され
たおよび手動の方法に適するＤＮＡポリメラーゼに関す
る。
【０００２】本発明はTaborおよびRichardsonにより”
ＤＮＡシークエンシングのための修飾ヌクレオチド結合
部位を持つＤＮＡポリメラーゼ”と題され、１９９４年
１０月１７日に出願されたものの一部継続出願であり、
その全文は（図を含め）ここに引例として含まれてい
る。
【０００３】本発明は米国エネルギー省（契約番号 Ｄ
Ｅ−ＦＧ０２−８８ＥＲ６０６８８）からの基金を含む
政府の援助を受けている。米国政府は本発明にある種の
権利を持つであろう。
【０００４】
【従来の技術】以下にＤＮＡシークエンシング技術に関
する簡単な説明を記載する。これは本出願を読む人のた
めの一般的なガイドとして提供されているものであり、
ここに引用されたまたは明白にまたは暗黙のうちに参考
にされた技術が付随する請求の範囲に対する先行技術で
あることを容認するものではない。
【０００５】一般的に、ＤＮＡシークエンシングにおい
ては、一つの決められた末端および一つの可変の末端を
持つ一本鎖ＤＮＡ断片の４つの集団を発生させる。可変
の末端は一般的に特定のヌクレオチド塩基（グアニン
（Ｇ），アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはシトシン
（Ｃ））で終結する。４つの異なる断片の組は各々それ
らの長さに基づいて分離され（一つの方法では高分解能
ポリアクリルアミドゲル上で）；ゲル上の各々のバンド
はＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチドに共直線性に対応
しており、従って与えられたヌクレオチド塩基の配列中
における位置が同定される。TaborおよびRichardson,米
国特許第4,942,130および4,962,020号参照。
【０００６】ＤＮＡシークエンシングには二つの一般的
方法がある。一つの方法（MaxamおよびGilbertシークエ
ンシング）では，単離されたＤＮＡ断片ｏ化学的に分解
し、各々がその決められた末端で単一の放射性標識で標
識され、各々の反応により四つの塩基（Ｇ、Ａ，Ｔまた
はＣ）のうち一つまたはそれ以上の塩基で特異的に制限
切断される。もう一つの方法（ジデオキシまたは鎖停止
シークエンシング）ではＤＮＡ鎖の酵素的合成が行われ
る。Sanger et al.（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:546
3, 1977）。一般的に四つの別々の合成が行われ、各々
の反応はジデオキシヌクレオチドのような適当な鎖停止
ヌクレオチドの取り込みにより特定の塩基（Ｇ、Ａ，Ｔ
またはＣ）において停止する。放射活性標識ヌクレオシ
ド三リン酸の取り込みによりＤＮＡ断片が均一に標識さ
れ（末端標識のかわりに）、従ってより大きなＤＮＡ断
片はより放射強度が増加するので後者の方法が好適であ
る。さらに、32Ｐ標識ヌクレオチドのかわりに35Ｓ標識
ヌクレオチドが使用できるのでより鋭敏な決定ができ；
各々のレーンはＧ、Ａ，ＴまたはＣのみに対応するので
反応生成物をより簡単に解析することができる。ほとん
どのジデオキシシークエンシングに利用される酵素はＴ
７ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｔｔ
ｈその他のような好熱性生物から単離されたＤＮＡポリ
メラーゼである。頻度は低いが使用されるその他のポリ
メラーゼにはＡＭＶ逆転写酵素および大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼIのクレノー断片などが含まれる。
【０００７】ジデオキシ鎖停止法においては短い一本鎖
プライマーを一本鎖テンプレートにアニールさせる。プ
ライマーはジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＭＰ）が取
り込まれるまでデオキシヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を取
り込んでその３’末端において伸長する。ｄｄＮＭＰが
取り込まれたときその塩基で伸長が止められる。ｄｄＮ
ＴＰのかわりにその他の鎖停止剤を使用することがで
き、およびｄｄＮＴＰは以下に説明するように標識する
ことができる。
【０００８】上記の方法論を用いて、ＤＮＡ配列分析の
ための自動化システムが開発されてきた。ＥＧ＆Ｇによ
り製造された一つの装置は放射標識ヌクレオチドを用い
る伝統的なジデオキシ鎖停止反応を使用した。生じたＤ
ＮＡ生成物はゲル電気泳動により分離された。Toneguzz
o et al, 6 Biotechniques 460,1988。検出器はゲルの
底を通過しながら放射活性をスキャンする。配列決定さ
れるべき各々のテンプレートに対し四つの合成反応が、
ならびに各々のゲル上に四つのレーンが必要とされ、各
々の特定の鎖停止剤により停止された生成物のため別々
のレーンが使用された。
【０００９】Kambara et al, 6 Biotechnology 816, 19
88、は蛍光標識プライマーを使用した。生じた蛍光標識
生成物はゲルの底でレーザーで励起され、ＣＲＴモニタ
ーで蛍光が検出された。この方法もまた、配列決定され
るべき各々のテンプレートに対し四つの合成反応および
ゲル上の四つのレーンを必要とする。
【００１０】Applied Biosysytemsは、各々が異なる蛍
光マーカーで標識されている四つの異なるプライマーを
使用する装置を製造している。Smith et al., 13 Nuc.
Acid . Res. 2399, 1985；および321 Nature 674, 198
6。各々のプライマーは四つのジデオキシヌクレオチド
の内の一つを含む別々の反応において使用される。四つ
の反応を実施した後、混合物を合わせ、ゲル上の単一の
レーンでＤＮＡ断片を分画する。蛍光生成物をゲルを通
して電気泳動した後、ゲルの底においてレーザーを用い
てこれを検出する。このシステムは各々のテンプレート
について四つの別々のアニール反応および四つの別々の
合成反応を必要とするが、ゲル上の単一のレーンしか必
要としない。単一のレーンに四つ全てのバンドがあるた
め配列のコンピューター分析がより容易である。
【００１１】DuPontは異なる蛍光マーカーが四つのジデ
オキシヌクレオシド三リン酸の各々に結合された装置を
提供していた。Prober et al., 238 Science 336, 198
7。単一のアニーリング工程、単一のポリメラーゼ反応
（四つの標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸の各々を
含む）、およびシークエンシングゲルに単一のレーンし
か必要としない。ＤＮＡ生成物中の四つの異なる蛍光マ
ーカーはゲルにより電気泳動されながら別々に検出され
る。
【００１２】Englert et al.,米国特許第4,707,235号
（1987）は、実質的にゲルの全幅にわたって配置された
検出手段を有し、四つの別々のレーンにおいて検出手段
を通り過ぎて移動する標識ＤＮＡ生成物を検出すること
ができ、かつ試料が位置しているチャンネルまたはレー
ンを同定するマルチチャンネル電気泳動装置について記
載している。
【００１３】ＤＮＡ配列分析に現在使用されている方法
に固有なものとして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
のようなゲル浸透法により放射性または蛍光標識ＤＮＡ
生成物を分離し、続いてゲル中の移動の軸に沿ってお互
いに関してのそれらの位置を検出する必要がある。この
方法の正確度は、部分的にはゲルを通してほとんど同じ
距離を浸透したバンド中の信号の均質性により決定され
る。近くのバンド間の信号強度の相違または変異はいく
つかの問題を生じる。第一に、最も弱い信号を含むバン
ドを検出する能力により制限されている本方法の感度を
低下させる。第二には、弱い信号が鎖停止剤の取り込み
による真の信号であるか、またはポリメラーゼが解離し
たＤＮＡ中の休止部位に起因するアーチファクトである
かを決定する時に困難を生じる。第三に、一つのバンド
の強い信号はその隣の弱い信号を覆うであろうため、非
常に近いバンドの間のＤＮＡ配列決定の正確さが減少す
る。TaborおよびRicharsonの上記の文献を参照された
い。
【００１４】バンド強度の変化は、ほとんどのＤＮＡポ
リメラーゼの固有の性質に由来しうるであろう。ほとん
どのＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ配列分析に使用される
鎖停止ジデオキシヌクレオチドを判別（ｄｉｓｃｒｉｍ
ｉｎａｔｅ）する。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ
シークエンシングに利用できないほどｄｄＮＴＰを判別
する。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ、およびＶ
ｅｎｔＤＮＡポリメラーゼもまたｄｄＮＴＰを強く判別
する（各々、ｄｄＮＴＰの取り込みが対応するｄＮＴＰ
より千倍遅い）。TaborおよびRicharson（上記文献、両
方ともここに引例として含まれている）は、Ｔ７ ＤＮ
Ａポリメラーゼがこのスペクトラムの別の末端にあり、
ｄｄＮＴＰを数倍しか判別しないことを示した。もしＤ
ＮＡポリメラーゼが全ての配列で同じ程度にｄｄＮＴＰ
を判別するなら、この問題は単純にｄＮＴＰに対するｄ
ｄＮＴＰの比を変えることにより克服できる。そのよう
な試みは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼでなされている。しかしながら、判別の
程度は隣接するＤＮＡ配列により変化し、隣接する放射
活性断片の強度に大きな変異をもたらす。特定の断片の
強度は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩでは５０倍変化し得
るが、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼではたった数倍であ
る。その結果、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼにより生成さ
れたＤＮＡシークエンシングゲル上のバンド強度は類似
の強度であり、このことにより自動化法によるその検出
および分析を容易にしている。さらに、ジデオキシヌク
レオチドをデオキシヌクレオチドと同等に取り込むよう
にＴ７ ＤＮＡポリメラーゼによるジデオキシヌクレオ
チドに対する判別をさらに減らす方法が記載されてい
る。これらの方法および条件は、クレノーおよびＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼのような他のＤＮＡポリメラーゼに
よる判別も減少させるが除去しない。例えば、反応混合
物中のマグネシウムの代わりに、または、それに加えて
マンガンを使用すると、ジデオキシヌクレオチドに対す
る判別を減少または除去するであろう。そのような条件
下では、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼは二つの分子を区別
しないが、クレノー断片、Ｔａｑ、およびＶｅｎｔのよ
うな他のＤＮＡポリメラーゼはある程度区別する。例え
ば、クレノーはマンガン存在下でもｄｄＮＴＰを４倍も
判別する。さらに重要なことは、クレノーおよびＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼのような酵素による判別の全体の程
度が減少されても、特定の断片の強度はＤＮＡ中のある
種の配列における高い判別により４倍以上変わり得る。
これらのポリメラーゼおよび方法は現在、手動ＤＮＡシ
ークエンシング（すなわち、上記のようなシークエンシ
ング機を用いない）においてほとんど例外なく、および
自動化法で広く使用されている。マンガンの使用および
すべての部位でのｄｄＮＴＰに対する判別の欠如により
均一の強度のバンドが生じ、手動または自動化法による
シークエンスゲルの読みとりが容易になる。さらに、判
別性の欠如は配列分析の新規の方法（Tabor およびRich
ardson、前記文献）の使用を可能とする。この発見に基
づく方法が提供され、異なる比で四つすべてのｄｄＮＴ
Ｐを含む単一の反応を行い、ゲル電気泳動後各々の相対
強度を測定することによりＤＮＡ配列が決定される。次
のことが示されている：本発明のＤＮＡポリメラーゼ
は、ジデオキシヌクレオチド類似体と正常なヌクレオチ
ドとを有意に判別しない。すなわち、類似体が取り込ま
れる確率は正常なヌクレオチドが取り込まれる確率とほ
ぼ同じであるか、または類似体は少なくとも正常なもの
の少なくとも１／１０の効率で取り込まれる。本発明の
ポリメラーゼはまたその他の類似体も有意に判別しな
い。４つの正常なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＧ
ＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）に加え、シ
ークエンシング反応は他の型のヌクレオチド誘導体（通
常35Ｓ、32Ｐまたはその他の化学試薬により合成鎖を標
識するための放射性または蛍光標識ヌクレオシド三リン
酸のような；）の取り込みを必要とするため、前記のこ
とは重要である。ＤＮＡポリメラーゼが類似体を判別し
ない場合、類似体の取り込みの確率は通常のヌクレオチ
ドと同じであろう。標識ヌクレオシド三リン酸について
は、合成ＤＮＡ鎖を最少の放射活性を用いて効率的に標
識するためにこのことは重要である［4,942,130,COL 5:
5］。
【００１５】また以下のことも述べられている：シーク
エンス反応の結果をより簡単におよびより高い確度で読
み取ることを可能にするため、ほとんど同じ強度の近接
するバンドを生成する能力は有用である。さらに、特定
の鎖停止剤を用いるシークエンス反応からのＤＮＡ生成
物は近接するバンドとほとんど同じ強度を持つバンド群
を形成するため、バンド強度それ自身がそのようにして
形成された一連のバンドの特定の標識を与える。ある鎖
停止剤により生成したほぼ同じ分子量のＤＮＡ生成物の
数は、鎖停止剤の濃度に依存して変化する。したがっ
て、異なる濃度の各々四つの鎖停止剤を合成に用いる
と、一つの鎖停止剤を取り込んだＤＮＡ生成物は、その
数または量が異なることにより他の鎖停止剤を取り込ん
だほぼ同じ分子量のＤＮＡ生成物から区別され；その結
果、ＤＮＡ生成物のバンドは単純にその強度を近接する
バンドの強度と比較することにより鎖停止剤によるもの
と同定できる。その結果として、二つまたはそれ以上の
一連のＤＮＡ生成物（各々、異なる鎖停止剤を含む）を
単一のレーンでのゲル浸透に供し、各々のバンドの強度
を近接するバンドの強度と比較することにより同定す
る、すなわち互いに区別することができる。さらに、異
なる鎖停止剤を取り込んだＤＮＡ生成物の合成を別々
に、すなわち別々の容器で実施する必要がなく、一つの
反応容器中ですべて同時に実施でき、所望ならば各々に
対する異なる標識の代わりに同一の標識（例えば、放射
性同位元素、蛍光剤など）を全ての鎖停止剤について使
用することができ、このことにより方法を単純化するこ
とができる［4,962,020, col 3:1-35］。
【００１６】Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼによる触媒に対して、マグネシウムイ
オンをマンガンで置換することにより、ｄｄＮＴＰに対
するこれらのポリメラーゼの判別を４−１００倍減少さ
せることを示しているTaborおよびRichardson Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080(1989)、およびＴ７
ＤＮＡポリメラーゼを用いて均一の強度のジデオキシ
停止断片を発生させるためのピロホスファターゼおよび
マンガンイオンの使用を記載した、TaborおよびRichard
son J. Biol. Chem. 265, 8322-8328(1990)も参照され
たい。
【００１７】
【課題を解決するための手段】ジデオキシＤＮＡシーク
エンシングのためのいくつかのＤＮＡポリメラーゼの有
用性の低さは、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰ（または
その他のヌクレオチド類似体）を取り込むこれらのポリ
メラーゼの能力が低いことに一部起因していると考えら
れる。上に示したごとく、判別しない能力は判別を行う
酵素よりもより低い濃度のｄｄＮＴＰの使用を可能に
し、最も重要なことは、その長さにしたがってより均一
な強度のシークエンスゲル中のバンド形成パターンを提
供することである。これらの結果は両方とも、酵素を用
いる自動化シークエンシングをより容易にかつより有利
にし、より長いＤＮＡ配列をより高い確信をもって決定
することができる。
【００１８】本発明は、本来は判別を行うＤＮＡポリメ
ラーゼを、対応する天然に存在する酵素よりもｄｄＮＴ
Ｐに対してより判別しないように変換しうる方法を提供
する。この方法はポリメラーゼの遺伝的修飾を含み、ｄ
ＮＴＰの類似体を取り込むようにポリメラーゼの能力を
高める鍵となる位置におけるアミノ酸残基を提供する。
ＤＮＡポリメラーゼの特定の領域内におけるアミノ酸の
変更が、これらのＤＮＡポリメラーゼがジデオキシヌク
レオチドを取り込む能力に劇的な影響を与えることが決
定された；挿入された特定のアミノ酸残基がポリメラー
ゼがｄｄＮＴＰをより判別するかまたはより判別しなく
なるかを決定する。より効率的にジデオキシヌクレオチ
ドを取り込むようにＤＮＡポリメラーゼを修飾すると、
ＤＮＡシークエンシングでのそれらの有用性に驚くべき
効果を与えることが決定された。そのように修飾された
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの増幅（例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応による）、インビトロ突然変異発生および
ＤＮＡ断片の末端の充填などの他の一般的な分子生物学
の方法にも有用であることが証明されるであろう。本技
術とＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を変化させる既知の知識（TaborおよびRichardso
n、上記文献、により記載されているようなＴ７ ＤＮ
Ａポリメラーゼのような）を組み合わせ、およびシーク
エンシング反応におけるマンガンおよびピロホスファタ
ーゼの使用により、現在知られているものよりも著しく
優れた酵素を生成することが可能であろう。
【００１９】一つの特定の観点、すなわち、ＤＮＡシー
クエンシングにおいては、ＤＮＡシークエンシングに使
用する条件下、５０℃より上の温度（特に６０℃、７０
℃さらには８０℃より上の温度）においてヌクレオチド
の重合を触媒する能力を有する好熱性酵素が本分野では
よく知られている。そのような酵素は一般にこれらの温
度で増殖する生物体に存在する。しかしながら、これら
の酵素の多くはジデオキシヌクレオチドの取り込み能力
の制限等の制限を受けていると考えられる。以下に示す
方法を用いてこれらの酵素を修飾することにより、今や
当業者はいかなる所望の好熱性ＤＮＡポリメラーゼを
も、ジオキシヌクレオチドをより効率的に取り込むよう
に修飾することができる。そのような酵素は、自動化機
および手動でのシークエンシングの両方のＤＮＡシーク
エンシング、特にサイクルシークエンシングとして知ら
れている方法について現存する酵素よりも優れているで
あろう。サイクルシークエンシングにおいては、同一の
テンプレートから多数回のＤＮＡ合成が実施され、各々
のサイクル後に合成された鎖が熱変性により除去され
る；このことはシークエンシング反応においてはるかに
少ない量のＤＮＡテンプレートを使用することを可能に
する。
【００２０】比較的判別を行わない酵素であるＴ７ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ中のアミノ酸残基５２６がこの性質を
生み出していることを実験的に決定した。残基５２６の
修飾によりＴ７ ＤＮＡポリメラーゼの判別する能力を
大きく増加させることが可能であることを決定した。Ｔ
７ ＤＮＡポリメラーゼとその他のＤＮＡポリメラーゼ
との間のアミノ酸相同性に基づいて、他のＤＮＡポリメ
ラーゼ中の相同的な部位における残基の変更が、ジデオ
キシヌクレオチドを判別するその能力に同様に影響を与
えることを決定した。そのような相同的部位の例は大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩの残基７６２およびＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼの残基６６７である。これらの例の三
つすべてにおいて、この部位の残基がフェニルアラニン
（Ｆ）と異なること、例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラー
ゼにおけるようにチロシン（Ｙ）であることが重要であ
ることが示された。驚くべきことに、この一つのアミノ
酸残基の修飾が、一つのヒドロキシル基の付加によるも
のであっても、判別の程度に非常に大きな変化（２５０
−８０００倍）をもたらす。当業者はこの一つの部位の
変化に本発明が制限されないことを認識するであろう
し、今やポリメラーゼの判別を行う能力を減少させる他
の部位の変化も日常的な実験で容易に発見できるであろ
う。例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの１３個の別の
部位における修飾もまたｄｄＮＴＰを判別する酵素の能
力を増加させることを出願者は見いだしているが、ただ
しこれらの部位での変更の影響ははるかに少なく、たっ
た５−２０倍である。類似の方法を用いて、他のＤＮＡ
ポリメラーゼにおいてｄｄＮＴＰの判別に影響を及ぼす
他の部位を容易に同定することができ、それらをＤＮＡ
シークエンシングでの使用により有用にすることができ
る。そのような他の部位として、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩおよびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ間で非常に相同
している領域のアミノ酸残基が挙げられるが、これはこ
れらの領域はｄｄＮＴＰに対する結合領域の一部である
らしいためである；大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩにおい
てはこれらの領域として、領域６６５−６８１および７
５４−７８３、および可能性のあるのは領域７０９−７
３４、７９７−８６６および９１３−９２７の中の保存
または非保存アミノ酸からの、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
内の領域に類似の領域内のアミノ酸が含まれる。所望の
機能を与えるアミノ酸の変更はＴ７ ＤＮＡポリメラー
ゼのような非判別性酵素のアミノ酸、または日常的な実
験により選択できる他の機能的に等価なアミノ酸の対応
するアミノ酸と同一となるように選択できる。非保存ア
ミノ酸を変化させることにより、判別する能力のより意
味深い変更が得られる。非保存アミノ酸はポリメラーゼ
の一つの種と他の種で異なるアミノ酸であり、すなわ
ち、ポリメラーゼの５０％未満でしか観察されない。術
語”類似”は、通常認められている様式で使用されてい
る。従って、Ｐｏｌ Ｉポリメラーゼの類似体とはBrai
thwaiteおよびIto（後記）により記載されているような
アミノ酸配列を有するものであり、好適にはＳｐｏ２
ＤＮＡポリメラーゼのようにその中に記載されているポ
リメラーゼのＰｏｌ Ｉファミリーの他のメンバーに関
連するものである。そのような分析はFelsennsteinのPH
YLIPプログラムＩｄを用いて実行される。
【００２１】従って、本発明の第一の観点は、修飾され
たＤＮＡポリメラーゼをコードしている修飾された遺伝
子を特徴とする。この遺伝子は、対応する天然に存在す
るまたは非修飾ＤＮＡポリメラーゼと比較して、デオキ
シヌクレオチドと比較してジデオキシヌクレオチドを取
り込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼを生成
するように修飾されている。
【００２２】”増強された能力”とは、ＤＮＡポリメラ
ーゼがジデオキシヌクレオチドをより取り込むことがで
きることを意味している。すなわち、それはデオキシヌ
クレオチドと比較してジデオキシヌクレオチドに対し、
対応する天然に存在するＤＮＡポリメラーゼよりもより
少ない程度でしか判別しない。そのような判別を測定す
るための特別の方法が以下に提供される。術語”増強さ
れた”はそのようなジデオキシヌクレオチドを取り込む
能力が測定可能な相違を与えることを意味している。好
適な態様においては、これは天然に存在する酵素と比較
して少なくとも１０％の増加であるが、ジデオキシヌク
レオチドに対する判別のレベルが少なくとも１０から１
００倍、好適には１００−５００倍減少していることが
好ましい。そのような酵素の一つの例は大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩであり、それは（ここに指摘されているよ
うに）デオキシヌクレオチドと比較してジデオキシヌク
レオチドの取り込みを１４０ー１１００倍判別する。本
発明の方法により、酵素を実際にｄＮＴＰよりもｄｄＮ
ＴＰを好むように誘導化できる（たった一つまたは二つ
のアミノ酸の変更により）。すなわち、ジデオキシヌク
レオチドを取り込むポリメラーゼの能力が平均で１００
０倍増強された。
【００２３】句”対応する天然に存在するＤＮＡポリメ
ラーゼ”とは、本分野でよく知られているものであり天
然に見いだされるポリメラーゼを意味しており、それは
好適には実験室においてインビトロまたはインビボの両
方の操作で変えられていないものである。同様に、対応
する核酸とは天然に見いだされるＤＮＡポリメラーゼを
コードしている核酸である。これはそのようなポリメラ
ーゼをコードしている修飾核酸の比較のためのベースラ
インとして単に使用される。従って、テルムスアクアチ
カス（Thermus aquaticus）（”Ｔａｑ”とも名付けら
れている）のＤＮＡポリメラーゼのためのベースライン
は細菌テルムス アクアチカス（Ther mus aquaticus）
に存在するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを天然にコード
している核酸である。そのようなポリメラーゼ内で変更
してジデオキシヌクレオチドの取り込みの能力を変える
ことができる少なくとも一つの部位が提供される。これ
らの部位は単なる例であり本発明を制限するものではな
い。これは、ＤＮＡポリメラーゼの能力のこの性質を有
用に変えることができるという知識を身につけている当
業者に、そのような酵素をこれらの特定の部位または他
の等価な部位で変えるための方法論がここで提供されて
いるからである。
【００２４】ここに記載した本発明の実施態様におい
て、ＤＮＡポリメラーゼの修飾は一つまたはそれ以上の
アミノ酸の置換により行われる。しかしながら、修飾は
一つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入または一つまたは
それ以上のアミノ酸の欠失の形をとってもよいことが見
いだされるであろう。
【００２５】本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、Tabo
rおよびRichardson（上記文献）により記載されている
ような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性またはBarns
により（WO 92/06188）に記載されているようなＴａｑ
中の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のようなエキソ
ヌクレアーゼ領域を除去または変更するように修飾して
もよい。本発明のＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴＰを判
別する能力を変える突然変異は、好適には実質的にエキ
ソヌクレアーゼ活性に影響しない；このことは、突然変
異は酵素のポリメラーゼ領域内の、重合化の活性部位近
くにおいて生じ、単に取り込まれた類似体をそのエキソ
ヌクレアーゼ活性を介して除去するポリメラーゼの能力
を減少させることによる判別の減少ではない。本発明の
特に好適なＤＮＡポリメラーゼは、BraithwaiteおよびI
to（21 Nuc. Acid. Res. 787,1993、ここに引例として
含まれている、およびファミリーＡと称されている）に
より記載されているようなＰｏｌＩ型ポリメラーゼ、お
よびBraithwaiteおよびItoにより記載されており、ファ
ミリーＢと称されるようなポリメラーゼ アルファまた
はポリメラーゼII−型ＤＮＡポリメラーゼである。Brai
thwaiteおよびItoにより記載されている他のポリメラー
ゼファミリーもまた本発明で使用することができる。特
に、ｄＮＴＰ基質の結合部位近くの位置の極性、ヒドロ
キシ含有アミノ酸残基の存在が、効率的にジデオキシヌ
クレオチドを取り込むことができるポリメラーゼに重要
であることが見いだされた。理論に拘束されるわけでは
ないが、リボース部分の３’位にヒドロキシル基のない
ヌクレオチド（すなわちｄｄＮＴＰ）の高い判別には、
同時にこの重要部位のアミノ酸残基上にヒドロキシル基
がないことを必要とするという、予期された結果と逆で
あると考えている。別の言い方をすれば、両方のヒドロ
キシル基の不在により作り出された隙間または穴の存在
により類似体の判別がもたらされる。この結果を考える
と、関係が薄いＤＮＡポリメラーゼにおいてさえも重要
な残基を発見する方法が提供される；ｄＮＴＰが結合す
る領域において極性基を持つ残基を非極性基に付加する
ことは、ｄｄＮＴＰを判別するポリメラーゼの能力を減
少させるための有用なアミノ酸変更の候補である。例え
ば、ラットＤＮＡポリメラーゼｂ（ファミリーＡまたは
Ｂと、たとえあるにしてもわずかな相同性しか持たない
ＤＮＡポリメラーゼ）の２７２位のフェニルアラニン
は、Ｘ線解析研究によりプライマー−テンプレートとの
三成分複合体中でｄｄＣＴＰの３’位と接触しているこ
とが示されている（Pelletier et al., 264 Science 18
9, 1994）。本発明で説明された結果の知識は、ジデオ
キシヌクレオチドをより効率的に取り込むラットＤＮＡ
ポリメラーゼｂの突然変異体のスクリーニングにおいて
この残基をチロシンに修飾することを論理的な選択にし
ている。したがって、当業者はここに提供された情報を
用いて任意のＤＮＡポリメラーゼの判別性の表現型を変
えることができるであろう。
【００２６】ジデオキシヌクレオチドをより効率よく取
り込む本発明のいくつかのポリメラーゼの能力は特異的
であろう（すなわち、ジデオキシヌクレオチド類似体に
対する影響は他の類似体に対するよりもはるかに大き
い）。しかしながら、ポリメラーゼのいくつかは他の塩
基修飾類似体（例えば、電気泳動間のバンドの圧縮を除
くためのデオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）および
２’−デオキシ−７−デアザグアノシン ５’−三リン
酸（ｄｃ7ＧＴＰ）および自動化法に使用するための蛍
光標識デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオ
チド）の取り込みを助けるためにも有用である。さら
に、そのようなポリメラーゼはリボヌクレオチドをより
効率的に取り込むことができ、このことによりプロモー
ターを必要としないＲＮＡ合成を可能にすることができ
る。特に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびファミリー
ＡのＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラ
ーゼ）のような単一サブユニットＤＮＡ−依存ＲＮＡポ
リメラーゼ間の保存モチーフは、この領域（大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩの残基７５８から７６７）における突
然変異はｒＮＴＰに対する特異性を変化させるであろう
ことを示唆している。このことはＲＮＡ合成のためのプ
ロモーターを必要とせずにプライマーからの合成を効率
的に開始するＲＮＡポリメラーゼを遺伝子工学で作るこ
とを可能にする。同様に、ここで提供されるデータは、
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの残基６３１−６４０の修飾
はｄＮＴＰに対するその特異性を変化させるであろうこ
とを示唆している。このことはプロモーター配列からの
新規ＤＮＡ合成を開始し、プライマーを使用できない新
規のＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学を可能にする。
【００２７】好適な実施態様においては、修飾されたＤ
ＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性に必要な
宿主因子と組み合わせた場合、ＤＮＡシークエンシング
に使用するために十分なＤＮＡポリメラーゼ活性（例え
ば、少なくとも標準的なシークエンシング反応に使用さ
れるほど；および好適には本分野で定義されているよう
に少なくとも１００単位／ｍｇ酵素；好適にはポリメラ
ーゼ中の突然変異は以前のレベルを５−１０倍より多く
変化させない）を有しており；かつポリメラーゼのＤＮ
Ａシークエンシングでの使用を可能にする十分に低いエ
キソヌクレアーゼ活性（例えば５００単位／ｍｇ未満、
TaborおよびRichardson、上記文献を参照）を有してお
り；ＤＮＡポリメラーゼはＴ７型ＤＮＡポリメラーゼ
（例えば、Ｔ７，Ｔ３，ΦI、ΦII Ｈ，Ｗ３１、ｇｈ
−１，Ｙ，Ａ１１２２およびＳＰ６からなる群より選択
されるもの）のジデオキシヌクレオチド結合部位の一つ
またはそれ以上のアミノ酸を有している。好適には、修
飾ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス アクアチカス（Th
ermus aqraticus）、テルムス テルモフィラス（The rm
us thermophilus）、テルムス フラバス（Thermus fla
vus）、バシラス ステロテルモフィラス（Bacillus st
erothermophilus）およびＶｅｎｔ細菌によりコードさ
れるＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性酵素から修飾さ
れ；ジデオキシヌクレオチドを取り込むポリメラーゼの
能力は、例えばただ一つのアミノ酸の変化により、対応
する天然に存在するＤＮＡポリメラーゼと比較して少な
くとも１０倍、５０倍または最も好適には少なくとも１
００倍増加している。
【００２８】第二の観点においては、本発明は、対応す
る天然に存在するＤＮＡポリメラーゼの能力と比較して
ジデオキシヌクレオチドを取り込む増強された能力を有
する修飾ＤＮＡポリメラーゼを生成する方法を特徴とし
ている。本方法は、ＤＮＡポリメラーゼをコードしてい
る核酸分子を用意し、核酸によりコードされているポリ
メラーゼのジデオキシヌクレオチドを取り込む能力を著
しく（すなわち、少なくとも１０倍、５０倍または最も
好適には１００−１５０倍）変化させるヌクレオチド塩
基配列内の一つまたはそれ以上の部位における一つまた
はそれ以上の塩基を変更させるように核酸分子のヌクレ
オチド塩基配列に突然変異を起こさせ、または変化させ
ることを含む。
【００２９】第三の観点においては、本発明は、ＤＮＡ
分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法を特徴とし
ている。本方法は、ＤＮＡ分子にハイブリダイスしうる
プライマー分子とアニールされたＤＮＡ分子を用意し；
そしてアニールされた分子を少なくとも一つのデオキシ
ヌクレオチド三リン酸、天然に存在するポリメラーゼと
比較してジデオキシヌクレオチドを取り込む増強された
能力を持つように天然に存在するＤＮＡポリメラーゼを
修飾したＤＮＡポリメラーゼを含む容器内でインキュベ
ートすることを含む。ポリメラーゼは十分なＤＮＡポリ
メラーゼ活性およびＤＮＡシークエンシングに有用であ
る十分に低いエキソヌクレアーゼ活性を有する。特定の
ヌクレオチド塩基でＤＮＡ合成を停止させる少なくとも
一つのＤＮＡ合成停止剤もまた提供される。本方法はさ
らに、インキュベートした反応物のＤＮＡ生成物を大き
さに従って分離し、このことによりＤＮＡ分子の少なく
とも一部のヌクレオチド塩基配列を決定しうることを含
む。
【００３０】好適な実施態様においては、ＤＮＡポリメ
ラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、シークエ
ンシングは５０℃、６０℃または７０℃以上で実施さ
れ、かつＤＮＡポリメラーゼはテルムス アクアチカス
（Thermus aqraticus）、テルムス テルモフィラス（T
hermus thermophilus）、テルムス フラバス（Thermu s
flavus）、バシラス ステロテルモフィラス（Bacillu
s sterothermophilus）、テルモコッカス リトラリス
（Thermococcus litoralis）（Ｖｅｎｔ）、ピロコッカ
ス フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）ま
たはスルホロバスソルファタリカス（Sulfolobus solfa
taricus）によりコードされているＤＮＡポリメラーゼ
から誘導されたもの、すなわちアミノ酸残基に少なくと
も５０％の同一性を有するものである。
【００３１】別の好適な実施態様においては、ＤＮＡポ
リメラーゼは、ポリメラーゼ１ｍｇ当たり１０００、２
５０、１００、５０、１０またはさらに２単位未満のエ
キソヌクレアーゼ活性を有し、かつたった４、６または
１０塩基を有するプライマーを利用することができ；か
つインキュベーション工程の開始時の四つすべてのデオ
キシヌクレオチド三リン酸の濃度は停止剤（例えば、ｄ
ｄＮＴＰ）により停止されるまでＤＮＡ合成の継続を可
能とするのに十分なものである。
【００３２】サイクルシークエンシングについては、本
発明のポリメラーゼは今や他の酵素に比較して著しく少
ない量のジデオキシヌクレオチドの使用を可能とする。
すなわち、この方法は、サイクルシークエンシング反応
において四つすべてのジデオキシヌクレオチドに対し過
剰量のデオキシヌクレオチドを用意し、そしてサイクル
シークエンシング反応を実施することを含む。他の酵素
については、そのような反応に少なくとも一つの過剰の
ｄｄＮＴＰを加える必要があった。例えば、Sears et a
l., 13 BioTechniques 626, 1992、はＶｅｎｔポリメラ
ーゼについてｄＮＴＰに対し約１０倍過剰のｄｄＮＴＰ
の使用を記載しており、およびCarothers et al., 7 Bi
oTechniques 494, 1989、はＴａｑポリメラーゼに対し
ｄＮＴＰの少なくとも２倍過剰のｄｄＮＴＰの使用を記
載している。本発明においては、そのような過剰量の使
用は必要とされない。好適には、対応するｄｄＮＴＰに
対して２、５またはさらには１０倍以上過剰のｄＮＴＰ
が提供される。特別の例においては、本発明の修飾Ｔａ
ｑについて１０μＭ未満のｄｄＮＴＰが使用される。
【００３３】関連する観点においては、本発明は、上記
の修飾ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＩＴＰ、デアザＧＴ
Ｐ、ｄｄＮＴＰのような鎖停止剤およびマンガン含有溶
液または粉末からなる群より選択されるシークエンンシ
ングに必要な試薬を含むＤＮＡシークエンシングのため
のキットまたは溶液を特徴としている。
【００３４】別の観点においては、本発明は、修飾ＤＮ
Ａポリメラーゼをコードする核酸配列を用意し、宿主細
胞内でその核酸を発現させ、そして宿主細胞からＤＮＡ
ポリメラーゼを精製することによる、天然に存在するＤ
ＮＡポリメラーゼと比較してジデオキシヌクレオチドを
取り込む高められた能力を有する修飾ＤＮＡポリメラー
ゼを提供する方法を特徴としている。
【００３５】別の関連する観点においては、本発明は、
一つまたはそれ以上（好適には２、３または４）のデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸、上記のＤＮＡポリメラ
ーゼおよび第一の鎖停止剤を用いる、本質的に上に記載
したようなＤＮＡ鎖のシークエンシングのための方法を
特徴としている。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸
長させて、伸長したプライマーの長さが異なる第一のＤ
ＮＡ生成物の第一のシリーズを形成させ、各々の第一の
ＤＮＡ生成物はその伸長された末端に鎖停止剤を有し、
および各々の第一のＤＮＡ生成物の分子の数は長さが２
０塩基未満しか異なっていない実質的にすべてのＤＮＡ
生成物についてほとんど同じである。本方法はまた、ハ
イブダイズした混合物中に第一の鎖停止剤と異なる濃度
の第二の鎖停止剤を提供することを特徴としており、こ
こではＤＮＡポリメラーゼは伸長されたプライマーの長
さが異なる第二のＤＮＡ生成物の第二のシリーズを生成
し、各々の第二のＤＮＡ生成物はその伸長末端に第二の
鎖停止剤を有する。各々の第二のＤＮＡ生成物の分子の
数は、長さが互いに１から２０塩基しか異なっていない
実質的にすべての第二のＤＮＡ生成物についてほとんど
同じであり、および該第二のＤＮＡ生成物と２０塩基未
満の長さの違いを有するすべての第一のＤＮＡ生成物の
分子の数とは明らかに相違する。
【００３６】好適な実施態様においては、TaborおよびR
ichardson（上記文献）により記載されているように、
異なる生成物の作製に三つまたは四つのそのような鎖停
止剤を使用することができ、シークエンシング反応はマ
グネシウムイオンまたはマンガンまたは鉄イオン（０．
０５および１００ｍＭの間、好適には１および１０ｍＭ
の間での濃度で）と行われ；およびＤＮＡ生成物は四つ
未満のレーンのゲルで分子量に従って分離される。
【００３７】別の関連する観点においては、本発明は、
オリゴヌクレオチドプライマー、シークエンスされるべ
き核酸、１および４の間のデオキシリボヌクレオシド三
リン酸、上に記載したようなポリメラーゼおよび異なる
量の少なくとも二つの鎖停止剤を、オリゴヌクレオチド
プライマーが伸長してシークエンスされるべき核酸に相
補的な核酸断片を形成するのに好ましい条件下に混合す
ることによる核酸のシークエンス法を特徴としている。
本方法はさらに、大きさにより核酸断片を分離し、核酸
配列を決定することを含む。試薬はプライマー伸長生成
物中の標識の強度により互いに異なる。
【００３８】ＤＮＡシークエンシング反応のＤＮＡ生成
物を分離するためにゲル電気泳動を使用することが一般
的であるが、当業者は他の方法もまた使用しうることを
認めるであろう。従って、飛行時間型質量分析、電子顕
微鏡法および単一分子検出法のような方法を用いて異な
る断片の各々を検出することが可能である。
【００３９】本発明はまた、一つのプライマーおよびＤ
ＮＡ鎖から形成される少なくとも二つのシリーズのＤＮ
Ａ生成物を提供する試薬を含む反応器を有する自動化Ｄ
ＮＡシークエンシング装置を特徴としている。シリーズ
の各々のＤＮＡ生成物は分子量が異なり、一つの末端に
鎖停止剤を有する。試薬は上に記載したようなＤＮＡポ
リメラーゼを含む。本装置は、分離装置の一つの軸に沿
ってＤＮＡ生成物を分離し、一連のバンドを形成させる
ための分離手段を含む。これはまた、軸に沿って分離し
た後に各々のバンドの位置および強度を決定するための
バンド読みとり手段、および分離手段中に存在している
であろう標識からの光放出の波長からではなく軸に沿っ
たバンドの位置および強度のみからＤＮＡ鎖のＤＮＡ配
列を決定するコンピューター手段を含む。
【００４０】別の観点においては、本発明は以下のこと
を特徴としている：（ａ）クローン化断片および上に記
載したＤＮＡポリメラーゼを提供し、断片からＤＮＡ鎖
を合成するための条件下にクローン化断片とポリメラー
ゼを接触させることによる、クローン化ＤＮＡ断片のイ
ンビトロ突然変異発生方法。この条件は、断片と塩基対
を形成しうる個々の連続する複数の塩基を取り込み、か
つ断片と塩基対を形成できないヌクレオチド塩基を取り
込むことによりＤＮＡ鎖を形成する。（ｂ）プライマー
およびテンプレートを提供することによるテンプレート
ＤＮＡ断片のインビトロ突然変異発生法；このプライマ
ーはテンプレートの連続する塩基と塩基対を形成しうる
連続する塩基を有するが、ただし少なくとも一つの塩基
はテンプレートと塩基対を形成することができない。本
方法は、上記のようなＤＮＡポリメラーゼによりプライ
マーを伸長させることを含む。（ｃ）一本鎖領域の５’
末端を有する線状ＤＮＡ分子から平滑末端二本鎖ＤＮＡ
を生成する方法。分子の３’末端は二本鎖であり、３’
突出末端を有していない。本方法は、ＤＮＡ分子を一本
鎖領域に作用して平滑末端二本鎖ＤＮＡ分子を生成する
上記のＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートする
ことを含む。（ｄ）ＤＮＡ断片の３’末端がポリメラー
ゼにより伸長され、このことによりＤＮＡ断片への標識
デオキシヌクレオチドの付加により標識される条件下
に、ＤＮＡ断片を上記のＤＮＡポリメラーゼおよび標識
されたデオキシヌクレオチド種とともにインキュベート
することによるＤＮＡ断片の３’末端の標識法。（ｅ）
第一および第二のプライマーを二本鎖ＤＮＡ配列の反対
側の鎖にアニールし、アニールされた混合物を上記のＤ
ＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることによ
るＤＮＡ配列の増幅法。第一および第二のプライマー
は、アニール後３’末端が互いに向き合ってＤＮＡ配列
の反対側の鎖にアニールしており、増幅されるべきＤＮ
Ａ配列は二つのアニールされたプライマーの間に位置し
ている。
【００４１】さらに別の観点においては、本発明は残基
６６７にチロシンを有するテルムスアクアチカス（Ther
mus aqraticus）ＤＮＡポリメラーゼ、残基７６２にチ
ロシンを有する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、および大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ残基７６２と類似の位置、例え
ば、アミノ酸配列ＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7ＹＧ（式中
各々のＮは独立して任意のアミノ酸である）のＮ4位に
にチロシン残基を持つＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ
（）のような特定のＤＮＡポリメラーゼを特徴としてい
る。さらに、本発明は、配列ＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＹＧ
／Ｑ（式中各々のＮは独立して任意のアミノ酸である）
を有し、残基Ｎ1からＮ7の一つはｄｄＮＴＰの判別性が
減少されている（好適には非突然変異配列に比較して少
なくとも２０倍減少されている）ポリメラーゼを産生す
るように突然変異を起こされているＤＮＡポリメラーゼ
アルファファミリーの特定のポリメラーゼを特徴として
いる。本発明はまたこれらのＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする核酸も特徴としている。
【００４２】関連する観点においては、本発明は、唯一
の添加二価のカチオンとしてのマグネシウムの存在下
に、１００未満の平均連続移動性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖ
ｉｔｙ）を有し、ｄＮＴＰと比較してｄｄＮＴＰの取り
込みの判別が１００倍未満であり、または唯一の添加二
価のカチオンとしてのマグネシウムの存在下に、５０未
満の平均連続移動性を持ち、ｄＮＴＰと比較してｄｄＮ
ＴＰ取り込みの判別が５０または５倍未満である、逆転
写酵素を除くＤＮＡポリメラーゼを特徴としている。当
業者は連続移動性が常法により測定でき、Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼの平均連続移動性は少なくとも５００であ
り、クレノー断片は約４ー４０、および逆転写酵素は約
１５０−２００であることが示されることを認めるであ
ろう。そのような測定はここに引用されるTabor et a
l., J. Biol. Chem. 262:16212, 1987に記載されている
ように実施できる。これらの条件下において、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼの平均連続移動性は１００未満であ
ることが期待される。
【００４３】特に好適な態様においては、本発明は、例
えばマグネシウムの存在下に、ｄＮＴＰと比較してｄｄ
ＮＴＰに対する判別が１００倍未満の好熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを特徴としており、それは好適には１００未満
の平均連続移動性を有し、一つのプライマー−テンプレ
ートから他のものへ、１または１０秒に２回以上サイク
ルする。そのようなサイクルは常法により測定できる。
【００４４】本発明はまた、上記のＤＮＡポリメラーゼ
を用いるサイクルシークエンシングの方法を特徴とし、
また、ポリメラーゼがｄＮＴＰと比較してｄｄＮＴＰを
５０倍以上判別しないようにさせる位置において天然に
存在するアミノ酸の代わりにチロシンを有する細胞（ウ
イルスまたはミトコンドリアに対するものとして）ＤＮ
Ａポリメラーゼも特徴としている。
【００４５】別の態様では、示された部位でのアミノ酸
の置換が対応する天然のポリメラーゼのその他の性質の
変化を生じさせるであろう。さらに、本発明のポリメラ
ーゼはここに記載した方法で他のポリメラーゼと組み合
わせて用いてもよく、混合物中で各々のポリメラーゼの
優れた性質が利用される。
【００４６】本発明の他の特色および利点は以下のその
好適な実施態様および請求の範囲の記述から明らかにな
るであろう。
【００４７】
【発明の実施の形態】ジデオキシ抵抗性突然変異体 以下はいくぶん関連がある報文に関する簡単な議論であ
る。係争中の請求の範囲への従来の技術を許容するもの
ではなく、本発明の理解を助けるために提供されてい
る。
【００４８】Reha-Krantz et al.,バクテリオファージ
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの突然変異的分析、”ＤＮＡ
合成の忠実度：構造および機構的前途”と題されたミー
ティング、Beaufort,North Carolina,1989年11月24-29
日で発表されたポスター発表の抄録から、はＣ末端突然
変異体ではｄｄＮＴＰの利用が増加したことを記載して
いる。しかしながら、Reha-Krantz et al., J. Virolig
y 67,60-66(1993)は野生型Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ と
比較して突然変異体Ｌ４１２ＭはｄｄＧＴＰに対するＫ
ｉは５０倍低かったが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの突
然変異体および野生型の間にｄｄＧＴＰの取り込み効率
には変化は観察されなかったことを示している。６３ペ
ージに、”ｄｄＧＴＰへのＬ４１２Ｍ ＤＮＡポリメラ
ーゼの感度にもかかわらず、野生型およびＬ４１２Ｍ
ＤＮＡポリメラーゼによるｄｄＮＴＰの取り込みには相
違は観察されなかった”と述べている。また、”単一の
領域がＰＰｉまたはヌクレオチドのただ一つの結合部位
かどうか明かではない”とも述べている。さらに、Reha
-KrantzおよびNonay, J. Biol. Chem. 268, 5635-5643
(1994)は突然変異体Ｌ４１２Ｍおよびその他の突然変異
体Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの研究を報告している。
【００４９】Gibbs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 85,6672-6676(1988)およびLarder et al., the EMBO
Journal 6, 169-175(1987)は多数のヌクレオチド類似
体への抵抗性で選択された場合、ヘルペスＤＮＡポリメ
ラーゼで得られた突然変異のスペクトルについて記載し
ている：ピロホスフェート、ホスホノ酢酸およびホスホ
ノギ酸、アシクロビル、ビダラバイン、ガンシクロビル
およびブロモビニルデオキシウリジン。一つの薬剤に抵
抗する突然変異体の多くは他の薬剤（基質の異なる領域
に対する類似体でも）にも抵抗することを示している。
【００５０】Derse et al., J. Biol. Chem. 257,10251
-10260(1982)はホスホノギ酸（ピロホスフェート阻害
剤）存在下の増殖で選択されたヘルペス単純ウイルスＤ
ＮＡポリメラーゼの５つの組の突然変異体について記載
している。各々の組の突然変異体についてｄｄＧＴＰに
対する抵抗性が比較された（ページ１０２５６、表II
I）。すべてｄｄＧＴＰに対するＫｉが２０から１００
倍増加していた。
【００５１】Prasad et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88, 11363-11367(1991)は直接スクリーニング戦略
を用い、ＨＩＶ逆転写酵素内の単一の突然変異（Ｇｌｕ
８９からグリシンへの変化）がポリメラーゼをｄｄＧＴ
Ｐに対してより抵抗性にしていることを示した（同じ程
度の阻害を得るには約１０倍のｄｄＧＴＰを必要にし
た）。この突然変異はホスホノギ酸（ピロホスフェート
類似体）を含む多くの類似体に対し広範な抵抗性を与え
た。突然変異体はｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧ
ＴＰには等しく抵抗したが、ｄｄＡＴＰへの抵抗は弱か
った。
【００５２】Song et al., J. Viol. 66, 7568-7571(19
92)はヒト免疫不全ウイルスタイプＩ逆転写酵素のｇｌ
ｕ−８９を９つの異なるアミノ酸残基に突然変異させ、
ｄｄＧＴＰおよびホスホノギ酸（ピロホスフェート類似
体）に対する各々の突然変異体酵素の抵抗性を測定し
た。突然変異は２つの組に分類された；Ｇｌｕ−８９の
アラニン、グリシン、バリンまたはスレオニンへの置換
は野生型酵素に比較してｄｄＧＴＰおよびホスホノギ酸
の両方に抵抗性が高い酵素を生じ、一方セリン、グルタ
ミン、アスパラギン、アスパラギン酸およびリジンへの
突然変異はｄｄＧＴＰに対して中程度のまたは抵抗性が
ない酵素を生じた。どの突然変異も野生型酵素よりｄｄ
ＧＴＰに対し抵抗性が小さい酵素は生じさせなかった
（表I、ページ７５６９）。筆者らは彼らの結果および
逆転写酵素の結晶構造から、逆転写酵素の８９番目およ
び９０番目の残基がｄＮＴＰ結合ポケットの部分を形成
していると推測している。
【００５３】ｄｄＮＴＰ選択性を生じる突然変異の近く
の突然変異による大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ突然変異
体蛋白質の性質に関する報文は以下のものである：Carr
oll et al., Biochemistry 30,804-813(1991)は２つの
突然変異体（Ｔｙｒ７６６ＳｅｒおよびＴｙｒ７６６Ｐ
ｈｅ）の普通のデオキシヌクレオチドに対する誤取り込
みを研究した。Polesky et al., J. Biol. Chem. 265,1
4579-14591(1990)は２つの異なる性質を持つ突然変異を
特徴付けた：（１）チロシン７６６、アルギニン８４
１、およびアスパラギン８４５；著者らはこれらの残基
は入ってくるｄＮＴＰと接触することを示唆している。
（２）グルタミン８４９、アルギニン６６８およびアス
パラギン酸８８２；著者らはこれらの残基は触媒に含ま
れていることを示唆している。Polesky et al., J. Bio
l. Chem. 267:8417(1992)、はアルギニン６６８、グル
タミン８４９およびアスパラギン酸８８２およびさらに
アスパラギン酸７０５およびグルタミン酸７１０での突
然変異を特徴付けている。この研究において、著者らは
アルファ−チオ−置換ｄＮＴＰ（すなわち、リン酸部分
での類似体）の取り込みを見ている。Pandey et al.,
J. Biol. Ch em. 269, 13259-13265(1994)は大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのリジン７５８をアラニンおよびアル
ギニンに変化させた二つの突然変異体に注目した。著者
らはBasu et al., Biochemistry 26, 1704-1709(1987)
が同じリジン７５８がｄＮＴＰの結合に関係しているこ
とを示していることを指摘している。このことが化学的
に示された；ＤＮＡポリメラーゼＩがヌクレオチド類似
体、ピリドキサール 5'-リン酸を用いて共有結合で修
飾され、リジン７５８が修飾されるべき残基であるとい
われている。
【００５４】Beese et al., Biochemistry 321:14095-1
4101(1993)はｄＮＴＰまたはピロホスフェートと複合体
を形成したＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片の共結
晶の構造について記載している。著者はｄＮＴＰはヘリ
ックスＯに隣接して結合していると述べている。著者ら
は以下の報告をしている：（ａ）”Ｍｇ−ｄＣＴＰ複合
体において、シトシンがＨｉｓ８８１と相互作用し、一
方、糖はＰｈｅ７６４［ｓｉｃ．，７６２］と相互作用
している（図３および５）。”（ｂ）”しかしながら、
二成分複合体中のｄＮＴＰの少なくともｄＮＭＰ部分の
位置は、プライマーテンプレートＤＮＡとの触媒的に相
関した複合体の位置とは同じではないらしいと結論され
た。”（ｃ）”ｄＮＴＰの塩基のための全結合部位はテ
ンプレート鎖へのワトソンークリック水素結合およびプ
ライマー鎖の３’塩基上のそのスタッキングにより形成
されるので、二成分複合体中の塩基のための結合部位が
完全に偶然ということはありそうもなく、条件に依存し
ていくつかの位置に結合できるという我々の観察と一致
している。”（ｄ）”二成分複合体の結晶で観察された
ｄＮＴＰの結合部位は、溶液の研究で観察されたものと
同じである。しかしながら、この二成分複合体からプラ
イマーおよびテンプレートＤＮＡ存在下でのｄＮＴＰと
の複合体モデルへの外挿には十分な注意が必要である。
ｄＮＴＰの糖および塩基部分は正しいコンホメーション
で結合されたプライマー−テンプレートＤＮＡを必要と
する。
【００５５】JoyceおよびSteitz,63 Ann.Rev.Bioc.777,
1994（本発明に対する従来の技術であるとは認められて
いない）は種々のＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの関
係を議論している。ＤＮＡポリメラーゼの”パー
ム”（”フィンガー”よりも）サブドメインの３つの機
能を示している−すなわち、触媒中心プライマーの３’
末端の結合部位およびｄＮＴＰ結合部位。ＨＩＶ−１逆
転写酵素においてＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の結合に影
響する突然変異は残基６７−７０付近であることが示さ
れている。”また糖のヌクレオチド塩基の位置からは何
等有用な結論導き出せないが、クレノー断片およびｄＮ
ＴＰリン酸基間の接触の同定において結晶性二成分複合
体からの情報が役に立つであろう”とも述べられてい
る。前のパラグラフにおいて”ポリメラーゼ−ｄＮＴＰ
二成分複合体を形成できるが、そのような複合体は触媒
的には応答能がない”と述べられている。さらにデー
タ”Ｐｈｅ７６２の近くにデオキシリボースが配置され
るであろう”および”モデルとして作られたテンプレー
ト鎖に近接するフィンガードメインに位置しているＴｙ
ｒ７６６（クレノー断片ヘリックスＯ内）の突然変異体
はデオキシおよびジデオキシヌクレオチド基質間の判別
に影響する．．．”ことが示されている。しかしなが
ら、”クレノー断片において、三成分複合体中のｄＮＴ
Ｐの結合（Ｋm(dNTP)に反映される）に影響することが
観察されている突然変異はフィンガーサブドメイン内ま
たは近くのポリメラーゼの裂け目の一側面に位置してい
る。この様に同定された位置は遠くはヘリックスＱのＮ
末端（Ａｒｇ８４１およびＡｓｎ８４５）、ヘリックス
Ｏの露出した面（Ｔｈｒ７６６、Ｐｈｅ７６２およびＡ
ｒｇ７５４）および触媒中心近くの近接する残基（Ａｓ
ｐ７０５およびＧｌｕ７１０を含む。動力学的方法の利
点は三成分複合体が証明されることである；しかしなが
ら、上に議論したごとく、他の構造的証拠なしにテンプ
レート相互作用により開始される直接の影響を区別する
のは不可能である。さらに、前にリストした側鎖はｄＮ
ＴＰ分子より大きな領域を包含しており、それ故、全部
はそれと直接接触されない。これらの研究により示され
たクレノー断片の領域はテンプレート鎖と広い範囲の接
触をしていると考えられたので、上に述べられた残基の
サブセットはｄＮＴＰと直接接触しており、一方、残り
はテンプレートＤＮＡを結合しているというのが妥当な
説明である。
【００５６】Pelletier et al.,264 Science 1891,およ
びSawaya et al., 264 Science 1930,1994（本発明にた
いする従来の技術であるとは認められていない）は反対
に，ＰｏｌβのヘリックスＭ−Ｎ（クレノーのヘリック
スＪ−Ｋに類似している）内の残基２７１−２７４が”
共通の機能、ヌクレオチド判別を行っている”ことを示
している。
【００５７】Sousa et al. 364 Nature 593,1993（本発
明にたいする従来の技術であるとは認められていない）
はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの３次元構造およびその大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとの相同性が記載されてい
る。彼らの観察結果は”ＫＦ（クレノー断片）（ｂ−鎖
１４［残基９１６から９２８］およびＣ末端）のＣ末端
要素は重合化の間ｄＮＴＰのデオキシリボース部分と接
触し、ｒＮＴＰおよびｄＮＴＰ基質を判別する”ことを
示唆すると記載している。
【００５８】ジデオキシチミジンのようなジデオキシヌ
クレオシドはＴ７ファージ増殖の強い阻害剤である。Ｄ
ＮＡ合成の阻害はＴ７ ＤＮＡ内へのジデオキシヌクレ
オチドの取り込みの結果であることが実験で示されてい
る。ジデオキシヌクレオシドは非感染大腸菌には阻害を
示さない。大腸菌ＤＮＡ合成を阻害しないことへの説明
はわからないが、細胞の取り込み、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼIIIによるそれらの取り込みに対する高いレベル
の判別、三リン酸への不十分なリン酸化または効率のよ
い除去により説明できるであろう。どの場合においても
Ｔ７突然変異体ファージが生じることが観察され、寒天
プレート上に約１０-3の頻度でジデオキシヌクレオシド
を含む正常なプラークを得ることができる。多くのこれ
らの突然変異の位置が図１に示されている。それらは遺
伝子５蛋白質内に残っている。突然変異体遺伝子５蛋白
質は天然の遺伝子５蛋白質よりもｄｄＮＴＰをより強く
判別する（数倍）。この組のいくつかはｄＮＴＰのリボ
ース部分の認識に重要なポリメラーゼの領域の輪郭をな
している。
【００５９】ジデオキシヌクレオシドを用いるこの選択
により得られた突然変異はリボース部分を認識する遺伝
子５蛋白質の領域の変化に基づいていることに注目する
のは重要なことである。しかしながら、そのような突然
変異が他のヌクレオチド類似体に劇的な影響を持つであ
ろうことは可能である。さらに、他の類似体存在下のフ
ァージの増殖に基づき、他のヌクレオチド類似体の強い
判別を行う他のＴ７突然変異体の選択に同一の方法を使
用することも可能である。
【００６０】表Iを参照すると、種々のＤＲ突然変異体
が示されており、アミノ酸の置換は表に記されている。
アミノ酸置換の特徴は表の右側に示されている。これら
の突然変異体の位置はＴ７ ＤＮＡポリメラーゼのパー
ムおよびフィンガー領域を通して図１に示されている。
サム領域は可動性領域であり、生成物デュープレックス
ＤＮＡのマイナーグルーブと相互作用する；パーム領域
は活性中心、プライマーの３’末端の結合部位であり、
ｄＮＴＰ結合に寄与する；フィンガー領域は合成部位に
近いｓｓテンプレートと相互作用しｄＮＴＰ結合に寄与
する。これらの突然変異体は色々なポリメラーゼに渡っ
て広く分散されており、すべてジデオキシヌクレオチド
の取り込みに比較的小さな影響を示した（ジデオキシヌ
クレオチドの取り込み能力をただ５−２０倍減少させ
た）。さらに、これらの突然変異体のいくつかはＤＮＡ
ポリメラーゼＩに比較的非相同な領域に位置している。
従って、これらからはｄｄＮＴＰ判別に関与する他のＰ
ｏｌＩ酵素内部位の位置の指摘ができない。
【００６１】
【表１】 表I Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼジデオキシ−抵抗性突然変異体の要約突然変異体 単離体Ｎｏ． 修飾 ＤＲ１ １ Ａｌａ４２５→Ｔｈｒ 疎水性→極性 ＤＲ２ １ Ｐｈｅ４３４→Ｓｅｒ 疎水性→極性 Ｇｌｙ４４２→Ｓｅｒ 疎水性→極性 ＤＲ３ １ Ｖａｌ４４３→Ｉｌｅ 疎水性→疎水性 ＤＲ４ ２ Ａｒｇ４４４→Ｈｉｓ 強塩基→弱塩基 ＤＲ５ １ Ａｒｇ４４４→Ｃｙｓ 強塩基→中性、極性 ＤＲ６ ８ Ｓｅｒ４７７→Ｐｈｅ 極性→疎水性 ＤＲ７ ４ Ａｓｐ５０４→Ａｓｎ 塩基性→中性 ＤＲ８ ２ Ａｌａ５１３→Ｔｈｒ 疎水性→極性 ＤＲ９ ２ Ｔｈｒ５１７→Ｉｌｅ 極性→疎水性 ＤＲ１０ １ Ａｌａ５３２→Ｓｅｒ 疎水性→極性 ＤＲ１１ １ Ａｒｇ５６６→Ｃｙｓ 強塩基→中性、極性 ＤＲ１２ １ Ａｌａ６１９→Ｔｈｒ 疎水性→極性 ＤＲ１３ ３ Ａｌａ７００→Ｔｈｒ 疎水性→極性要約 ７ 疎水性→極性 ３ 強塩基→中性、極性または弱塩基 ２ 極性→疎水性 １ 疎水性→疎水性インビトロ突然変異発生 Ｔ７のクローン化遺伝子５のインビトロ突然変異発生が
遺伝子５蛋白質の構成に使用され、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩの異なる領域がＴ７遺伝子５蛋白質の類似また
は相同領域に置換された。上に議論したように、我々は
ヌクレオチド類似体を取り込むこれらの酵素の能力の決
定および、これらの類似体に対する判別の程度に特に興
味を持っている。図２を参照すると、Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの間のハイブ
リッドが形成される領域は、領域Ａ−Ｅとして印を付け
て示されている。
【００６２】図３を参照すると、領域Ｃがポリメラーゼ
の他の領域より著しく大きな効果を持っているリボ選択
性領域を提供することが決定されている。これら他の領
域のいくつかは特に図３に示されている。
【００６３】図４ー６を参照すると、この領域のアミノ
酸の置換でポリメラーゼのリボ選択性を、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ型からＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ型へお
よび逆に変換することが可能なことが決定された。従っ
て、ＰｏｌＩ型ポリメラーゼのこの領域を標的とした突
然変異発生によりポリメラーゼのリボ選択性を著しく変
えることができる。効果は少なくとも５０−１００倍で
あり、一般的には５００倍以上である。
【００６４】ＤＮＡポリメラーゼ 本発明に有用なＤＮＡポリメラーゼにはＴ７型ＤＮＡポ
リメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラ
グメントおよびＴａｑポリメラーゼを含む”ＰｏｌＩ型
ＤＮＡポリメラーゼ”と称される相同的ポリメラーゼの
組に属しているものが含まれる。
【００６５】本発明に有用なＤＮＡポリメラーゼにはＴ
７型ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、ΦＩ、ΦII、Ｈ
Ｗ３１、ｇｈ−１、Ｙ、Ａ１１２２またはＳＰ６）を含
む相同的ポリメラーゼの組に属しているものが含まれ
る。相同的ポリメラーゼとはDelarue et al., Protein
Engineering 3,461-467(1990)に記載されているような
酵素を意味しており、それにＤＮＡポリメラーゼのＰｏ
ｌ Ｉファミリーが整頓され並べられている。それには
またポリメラーゼの６つのファミリーからの保存配列モ
チーフが整列されている：Ｐｏｌ ＩからのＤＮＡポリ
メラーゼ、ＰｏｌアルファおよびＰｏｌベータファミリ
ー、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およ
びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；彼らの結果はすべ
てのポリメラーゼ間でいくつかの残基が保存されている
ことを示唆している。彼らの整列（図３、ページ４６
３）に従うと、ここで同定された選択性残基（大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのフェニルアラニン７６２）は”モ
チーフＢ”にある。ＤＮＡポリメラーゼのＰｏｌ Ｉフ
ァミリーに加えて、モチーフＢはＤＮＡポリメラーゼの
ＰｏｌアルファファミリーおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼのＴ７ファミリーに見いだされる；従ってこ
の整列は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ヘルペスＤＮＡポ
リメラーゼ、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを
含むポリメラーゼの他のファミリーで突然変異させなけ
ればならない残基を強く示唆している。
【００６６】さらに、Joyce,Current Opinion in Struc
tural Biology 1, 123-129(1991)は多くのポリメラーゼ
からのＤＮＡ配列を比較し、少数の重要な活性部位残基
が保存されていることを示唆している。特に、ｐｏｌ
Ｉファミリー（Ｔ７、ｐｏｌＩ、Ｔａｑ）およびｐｏｌ
アルファファミリー（Ｔ４、Φ２９、ヘルペス）のポリ
メラーゼ間の類似性を議論している。図１（ページ１２
４）でJoyceはこれらの２つのファミリー内の５つの不
変異性残基の位置を示している；これらにはリジン７５
８、チロシン７６６およびグリシン７６７が含まれてい
る；これらはすべてここで同定された選択性残基（フェ
ニルアラニン７６２）の非常に近くに存在する。
【００６７】これらのポリメラーゼは、シークエンシン
グ反応のＤＮＡ生成物をゲル中で走らせた場合、好適に
はほとんど均一の強度（約１．５から２．０倍の強度の
変化）の近接するバンドを産生する条件下でのＤＮＡシ
ークエンシングで使用された。近接したとは、６０００
（すなわち２０塩基）までの分子量の相違によるＤＮＡ
生成物により示されるバンドを含むことを意味してい
る。この強度の実際の値はTaborおよびRichardson（上
記文献）に記載されているごとくゲルの長さに沿って減
少するであろう。バンド強度はバンド内のＤＮＡ生成物
の数を反映している。蛍光発生または放射性同位元素の
ような標識がそのようなＤＮＡ生成物の数を反映する強
度の容易に検出可能なバンドの産生に使用された。従っ
て、本発明において一つの鎖停止剤による一つのシーク
エンシング反応に由来する近接バンドはほとんど同じ数
のＤＮＡ生成物を持ち、従って均一のバンド強度であ
る。シークエンシング条件にはマンガン（IIおよびII
I）、第一鉄および第二鉄イオンのような特定の二価ま
たは三価カチオンの存在下でのポリメラーゼのインキュ
ベーションが含まれる；ＤＮＡ合成に検出可能な影響を
与えないまたは有害である一価および二価のカチオンに
はＫ、Ｎａ、Ｂａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｃｃ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃ
ｕ、Ｎｉ、ＳｉおよびＺｎが含まれる。アニオンは重要
ではない、例えば、塩素、酢酸塩および硫酸塩が適して
いる。これらの条件下、ジデオキシヌクレオシドのよう
な鎖停止剤にたいする要求は本発明のための酵素で数倍
減らされるであろう。利用可能な二価金属イオンの濃度
の制御を助けるため、この溶液にキレート剤も加えられ
る。例えば、クエン酸塩またはイソクエン酸塩が加えら
れる。これらのキレートは例えば、広い範囲のマンガン
濃度にわたり、遊離のマンガンイオンの濃度を１０およ
び１００μＭの間に維持すると考えられている。すなわ
ち、キレート剤は緩衝剤として働いている。
【００６８】
【表２】大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ間のヘ
リックスＯ内のドメイン交換のｄｄＮＴＰに対する判別
性への影響。３つのポリメラーゼの配列は最初の残基の
番号とともに一番上に示されている。これら３つのポリ
メラーゼの保存配列の下にＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｔ７）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ）およ
びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）で特性付けら
れた突然変異体が示されており、突然変異を起こした残
基に下線が付けられている。各々の突然変異体は実施例
２に記載したＳＤＳゲル分析によるｄｄＮＭＰとｄＮＭ
Ｐの取り込みの相対速度が試験され、右側に結果が示さ
れている。突然変異体Ｔ７ Ｃ−Ｔ８、Ｐｏｌ Ｉ Ｃ
−Ｋ６およびＴａｑ Ｃ−Ｑ５がさらなる分析のため野
生型蛋白質とともに精製された。
【００６９】 酵素 配列 ｄｄＮＴＰ判別 Pol I 754 R R S A K A I N F G L I Y G 高い Taq 658 R R A A K T I N F G V L Y G 高い T7 517 R D N A K T F I Y G F L Y G 低い Consensus R A K G Y G T7 WT R D N A K T F I Y G F L Y G 低い T7 C-T2 R R S A K A I N F G L I Y G 高い T7 C-T3 R R S A K T F I Y G F L Y G 低い T7 C-T4 R D N A K A I N F G F L Y G 高い T7 C-T5 R D N A K A I I Y G F L Y G 低い T7 C-T6 R D N A K T F N F G F L Y G 高い T7 C-T2 R D N A K T F N Y G F L Y G 低い T7 C-T3 R D N A K T F I F G F L Y G 高い Pol I WT R R S A K A I N F G L I Y G 高い Pol I C-K1 R D N A K T F I Y G F L Y G 低い Pol I C-K2 R R S A K T F I Y G L I Y G 低い Pol I C-K3 R R S A K T F N F G L I Y G 高い Pol I C-K4 R R S A K A I I Y G L I Y G 低い Pol I C-K5 R R S A K A I I F G L I Y G 高い Pol I C-K6 R R S A K A I N Y G L I Y G 低い Taq WT R R A A K T I N F G V L Y G 高い Taq C-Q1 R D N A K T I N F G V L Y G 高い Taq C-Q2 R R A A K T F I Y G F L Y G 低い Taq C-Q3 R R A A K T I I Y G V L Y G 低い Taq C-Q4 R R A A K T I I F G V L Y G 高い Taq C-Q5 R R A A K T I N Y G V L Y G 低い 特異性残基 ↑ 本発明のＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡテンプレートの長
さによるジデオキシヌクレオチド類似体およびデオキシ
ヌクレオチド間を有意には判別しない。すなわち、これ
らのポリメラーゼは３’ヒドロキシル基を持つヌクレオ
チドに対しそれを持たないもの（すなわち、リボースの
３’位に２つの水素を持っている）を有意に判別しな
い。しかしながら、これらのポリメラーゼはマンガンま
たは鉄の存在下においても、ヌクレオシドの他の位置の
修飾を判別するであろう。例えば本ポリメラーゼはデオ
キシヌクレオチドと比べ、結合された蛍光基を持ついく
つかのジデオキシヌクレオチド類似体を判別するであろ
う。しかしながら、本ポリメラーゼはジデオキシヌクレ
オチドへの修飾の存在または不在に基づいて、隣のまた
は近接したヌクレオチドを異なる程度では判別しない。
このように本ポリメラーゼはこれらの類似体を強く判別
するが、非修飾ジデオキシヌクレオシドに比較してＤＮ
Ａシークエンシング反応にはより高い濃度を必要とせ
ず、近接するバンドの強度は依然として均一であろう。
【００７０】このように本発明のポリメラーゼは鎖停止
剤の取り込みの均一な効率を提供する（全取り込みが異
なっても）。さらに、本発明の他のポリメラーゼは対応
する天然に存在する酵素よりも蛍光ｄｄＮＴＰでより均
一なバンドを与えるであろう（非標識または放射性標識
ｄｄＮＴＰによるほど均一ではないが）。
【００７１】本発明に有用な鎖停止剤には２’，３’ジ
デオキシ構造を持つジデオキシヌクレオシドが含まれ
る。本発明に有用な他の試薬は、特定の塩基でＤＮＡシ
ークエンシング反応を特異的に停止でき、および上記の
条件下ポリメラーゼによる判別を受けないものである。
【００７２】特定の鎖停止剤またはシークエンシング反
応混合物の他の成分と組み合わされたどの特定のＤＮＡ
ポリメラーゼが本発明に有用であるかを決定するため
に、TaborおよびRichardson（上記文献）に記載されて
いるような標準的なシークエンシング反応が実施され、
シークエンシングゲル中のバンド形成の広がりおよび近
接バンドの均一性が調べられた。もしポリメラーゼ反応
がプライマーを少なくとも２０塩基伸長させなかったら
ば使用された条件には適していない。２倍またはそれ以
下の範囲内の隣接するバンドの均一性は本発明で有用で
あり、好適には均一性とは１．０−１．５倍の範囲内で
ある。同様に、最適なカチオン濃度または本発明に有用
な他の潜在的なカチオンが種々の条件下でのこのシーク
エンシング反応の使用により決定された。例えば、カチ
オンが０．００５−１００ｍＭの範囲で試験された。そ
のような実験の例は以下に記載されている：任意の一つ
の酵素についてｄＮＴＰと比較した対応するｄｄＮＴＰ
の取り込み能力は、決められた範囲でのＤＮＡ合成を停
止させること（決められた分子量より小さなバンドの産
生で検出された）を可能にするのに必要なｄｄＮＴＰと
ｄＮＴＰの比として測定された。すなわち、シークエン
シングゲルの特定の範囲内で反応で産生されたバンドが
終了する。このように、もし一つの酵素が他の酵素と比
較して与えられたｄｄＮＴＰを１０００倍以上判別する
ならば、ゲルの同一の範囲の対応する部位で終わるバン
ドを得るにはｄＮＴＰに対し１０００倍以上の比のｄｄ
ＮＴＰが必要であろう。
【００７３】エキソヌクレアーゼ活性 本発明のＤＮＡポリメラーゼは好適には５０％未満、よ
り好適には１％未満、および最も好適には０．１％未満
の正常または天然に付随するレベルのエキソヌクレアー
ゼ活性を持っている（ポリメラーゼ分子当たりの活性の
量）。正常または天然に付随するレベルとは例えば非修
飾Ｔ７型ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を意味
している。以下に記載したようなChase et al.,(249 J.
Biol. Ch em.,4545, 1974)の方法の改良法により測定さ
れた、ポリメラーゼのｍｇ当たりに通常付随する活性は
約５０００単位である。エキソヌクレアーゼはテンプレ
ートに間違って塩基対生成されている新しく合成された
塩基を切り出すことによりＤＮＡ合成の忠実度を上げ
る。そのような付随エキソヌクレアーゼ活性はＤＮＡシ
ークエンシング反応の質に有害であろう。ヌクレオチド
濃度が落ちた場合、ポリメラーゼ活性はエキソヌクレア
ーゼ活性と同じような速度まで遅くなり、その結果全体
でのＤＮＡ合成がなくなるか、または合成されたＤＮＡ
の分解さえ起こるので、付随エキソヌクレアーゼ活性は
ヌクレオチド前駆体の最小必要濃度を上げることにな
る。
【００７４】より重要なことは、付随エキソヌクレアー
ゼ活性は二次構造妨害物を持つテンプレート中の領域で
ＤＮＡポリメラーゼの空転を起こさせるであろう。ポリ
メラーゼがそのような構造に近づいた場合、その合成速
度は通過しようとするほど遅くなる。ポリメラーゼが立
ち往生した場合、付随エキソヌクレアーゼは新しく合成
されたＤＮＡを切り出すであろう。その結果、合成およ
び切り出しの多数の循環を起こすであろう。このことに
より、ポリメラーゼは結局ヘアピンを通過して合成し
（シークエンシング反応の質には有害ではない）；また
はポリメラーゼが合成鎖から解離するであろう（４つす
べてのシークエンシング反応において同じ位置に人工の
バンドを生じる）；または鎖停止剤が高頻度で取り込ま
れ、シークエンシングゲル中の異なる断片の強度に広範
囲の変異が生じる。このことは与えられた部位での鎖停
止剤の取り込みの頻度がポリメラーゼが鎖停止ヌクレオ
チドを取り込まなければならない機会の回数とともに増
加するために起こる。
【００７５】理想的なシークエンシング反応はゲルを通
して均一の強度のバンドを与える断片を生成する。この
ことはすべての放射活性断片にたいしＸ線フィルムの最
適な暴露を得るために必須である。もし放射活性バンド
の強度が変化していれば、より薄くなったバンドは検出
されないであろう。全ての断片に均一な放射活性強度を
得るには、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ上の各々の位置
を同じ間隔および同じ時間で費やさなければならず、任
意の位置での付加または除去に優先を示してはならな
い。このことは、もしＤＮＡポリメラーゼに付随するエ
キソヌクレアーゼがなければ起こり、そのためそれはテ
ンプレートに沿った各々の位置で鎖停止ヌクレオチドを
取り込むただ一回の機会を持っているであろう。
【００７６】短いプライマー 本発明のＤＮＡポリメラーゼは好適には１０塩基または
それ未満、（より長いものも同様に）、最も好適には４
−２０塩基（例えば６塩基、これは３つのグループで使
用でき１８−ｍｅｒと等価物を形成する）のプライマー
を利用することができる。短いプライマーを利用できる
能力はＤＮＡシークエンシングに多くの重要な利点を提
供する。より短いプライマーは通常の１７−ｍｅｒプラ
イマーより安価であり、合成がより容易である。それら
はより速くＤＮＡテンプレート上の相補的部位にアニー
ルし、そのためシークエンシング反応をより速くする。
さらに、ＤＮＡシークエンシングに小さな（例えば、６
または７塩基）オリゴヌクレオチドプライマーを利用す
る能力は、長いＤＮＡ断片のシークエンシングにそれで
なければ不可能な戦略を可能にする。例えば、８０−４
０００ランダムヘキサマーを含むキットが発生でき、そ
のどれもがクローニングベクター内のどの部位とも相補
的でない。統計的には８０のヘキサマー配列の一つが配
列決定されるべきＤＮＡ断片に沿って平均５０塩基毎に
生じるであろう。３０００塩基の配列の決定にはただ５
回のシークエンシングサイクルしか必要としないであろ
う。第一に、”普遍的”プライマー（例えば、New Engl
and Biolabs #1211、配列5'GTAAAACGAACGGCCAGT3'）が
挿入物の一つの末端の約６００塩基の配列に使用される
であろう。このシークエンシング反応の結果を用いて、
決定された配列の末端近くの領域に相同的なキットから
新しいプライマーが拾い上げられるであろう。第二のサ
イクルでは、次の６００塩基の配列がこのプライマーを
用いて決定されるであろう。この過程の５回の繰り返し
により、サブクローニングを必要とせず、および新規の
オリゴヌクレオチドプライマーの化学的合成なしに３０
００塩基の完全な配列が決定されるであろう。そのよう
な短いプライマーの使用はシークエンシング反応にＴ７
の遺伝子２．５および遺伝子４タンパク質を含ませるこ
とにより促進されるであろう。
【００７７】インビトロ突然変異誘発 ポリメラーゼ遺伝子の突然変異誘発は標準的なＰＣＲ技
術（下記参照）を用いて実施された。
【００７８】ｄｄＮＴＰの判別 唯一の二価カチオンとしてのマグネシウムの存在下、Ｔ
７ ＤＮＡポリメラーゼは約３−４倍ｄｄＮＴＰを判別
する（他の既知のどんなポリメラーゼよりも低い）。次
に最も近いのは逆転写酵素であり、約１０−５０倍ｄｄ
ＮＴＰを判別する（Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの３−１
０倍）。これら二つに続いて、文献で特徴付けられてい
るすべての他の既知のＤＮＡポリメラーゼは少なくとも
１００倍、およびしばしば１０，０００倍またはそれ以
上ｄｄＮＴＰを判別する。
【００７９】マンガン存在下ではＴ７ ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによる判別は減
少する；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼでは３．７から１へ
減少し、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩでは５５０
から３．９に（ｄｄＡＴＰに対して）減少した。出願者
が最初に、唯一の二価カチオンとしてマグネシウムイオ
ンの存在下１００未満の連続移動性を持ち（プライマー
ーテンプレートから解離する前に与えられたプライマー
から伸長された平均の長さとして定義される；逆転写酵
素はこの定義によると約１５０−２００の連続移動性を
持っており、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼはこれより大き
い連続移動性を持っている）、ｄｄＮＴＰの取り込みに
対し１００倍未満の判別を行うＤＮＡポリメラーゼを提
供した。対照的に、Ｔａｑのような既知のＤＮＡポリメ
ラーゼのほとんどは１００未満の連続移動性を持ち、ｄ
ｄＮＴＰの取り込みに対し１００倍以上の判別を行う。
【００８０】従来Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのような高
い連続移動性を持つポリメラーゼはプライマー−テンプ
レートに数分の長さまで結合されたままで残り、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩのような低い連続移動性のポリメ
ラーゼは一つのプライマーテンプレートから他のものへ
数秒毎に（または１００倍以上の頻度で）循環している
と信じられていた。例えば、Tabor, et al. J. Biol. C
hem. 262,16212-16223(1987)参照。ジデオキシ取り込み
からではない停止によるバックグラウンドを減少させる
ので連続移動性はＤＮＡシークエンシングには都合のよ
いことであり、遅いサイクリング時間は欠点である。例
えば、もしポリメラーゼが特定の配列で解離するとすれ
ば、大過剰のポリメラーゼが存在しない限りシークエン
シングゲル上に強い人工のバンドが生じるであろう。一
方、急速に循環するポリメラーゼでは、一つの酵素分子
がシークエンシング反応の経過中に多くの異なるプライ
マーを伸長させるであろうのでより少ないポリメラーゼ
で使用でき、およびプライマー末端は多くの異なるポリ
メラーゼ分子により伸長される機会を持つであろうの
で、強い特異的停止の機会を減少させる。
【００８１】しかしながら、均一の強度のバンドを与え
およびより少ないｄｄＮＴＰの使用を可能にするため
に、急速に循環しまたｄｄＮＴＰを効率的に取り込むポ
リメラーゼがより良好である。そのようなポリメラーゼ
が低いエキソヌクレアーゼ活性を持つかまたは全く持た
ず、および加ピロリン酸分解によるバンドの分解を防ぐ
ためピロホスファターゼを加えるのもまた好適である。
【００８２】唯一の二価カチオンとしてマグネシウムで
ＤＮＡシークエンシング反応を実施できることも好適で
ある（すなわち、マンガン非存在下）。第一に、ポリメ
ラーゼはマグネシウムに比べマンガンでより不活性にな
りがちである（例えば、Taborおよび Richardson. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080(1989)参
照）。第二に、ポリメラーゼは広い範囲のマグネシウム
濃度で活性である一方、最適活性はほとんどの場合に非
常に鋭く、低い最適マンガン濃度が必要とされる（ｉ
ｄ）。および、最適マンガン濃度ではｄｄＮＴＰに対す
る判別の減少への効果が小さく、より高い濃度ではポリ
メラーゼの活性が落ちる。第三に、マンガンはキットに
含ませるには都合のよい金属イオンではない；容易に沈
澱を生じる（特により高いｐＨで）。第四に、マンガン
がどの好熱性ポリメラーゼについてもｄｄＮＴＰの判別
を減少させるための金属イオンとして効果があるのかど
うか明かではない（すなわち、より高い温度で）。
【００８３】本発明の前に、我々は判別と連続移動性の
間に相関があると述べている（Taborおよび Richardso
n. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080(198
9)）。
【００８４】”ＤＮＡポリメラーゼＩは低い連続移動性
を持っており、１０ヌクレオチド未満の取り込み後に解
離する。ｄｄＮＴＰ非存在下のＤＮＡ合成の間に部位か
ら酵素が解離する頻度およびその部位でのｄｄＮＴＰの
取り込みに対する判別の程度の間に強い関係がある（未
発表データ）。このことは、ＤＮＡポリメラーゼＩは連
続移動性合成の間はｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを類似の
速度で取り込む；しかしながら、合成が連続移動性でな
い場合、ｄＮＴＰはｄｄＮＴＰに優先して取り込まれる
ことを示唆している。このモデルはＴ７ ＤＮＡポリメ
ラーゼと比較してのＤＮＡポリメラーゼＩによるｄｄＮ
ＴＰ取り込みのより大きな変異を説明できる、なぜな
ら、前者は後者に比べ２桁大きな値の連続移動性を持っ
ているからである（引用省略）。
【００８５】このように、我々はここに記載した突然変
異体が突然変異体酵素の進行性を本当に増加させるとい
う証拠を観察していないので、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼでの本発明の結果
は驚くべきものである。
【００８６】好熱性ポリメラーゼ ｄｄＮＴＰに対する判別が１００分の１以下である好熱
性ポリメラーゼが特に本発明で有用である。さらに、唯
一の二価カチオンとしてのマグネシウムの存在下ｄｄＮ
ＴＰに対する判別が１００分の１以下であり、好適には
一つのプライマー−テンプレートから別のものへのサイ
クルが１秒当たり１回またはそれ以上のものが有用であ
る。好熱性ポリメラーゼは最適ＤＮＡポリメラーゼ活性
が６０℃以上で１５分の反応性を持つポリメラーゼとし
て定義される。
【００８７】均一バンド強度 マンガンはｄｄＮＴＰに対するクレノー断片の判別を５
５０から３．９に減少させるが、Taborおよび Richards
on（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080(198
9)）は個々のバンドの強度にまだ広範囲の変異があるこ
と（図２参照 同上）を示している。このように、Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼから離れても、本発明はクレノー
断片のように急速に循環するポリメラーゼおよび唯一の
二価カチオンとしてのマグネシウムの存在下でも（ほと
んどのポリメラーゼの活性に好適な条件、下記参照）均
一な強度を持つバンドを産生する好熱性生物由来のポリ
メラーゼを初めて提供する。急速に循環する酵素は以下
に記載した本分野では既知の方法により決定できる。
【００８８】特異的ポリメラーゼ これまでの情報から上に議論した望まれる性質を持つで
あろう以下のポリメラーゼを容易に作製することが可能
である。もしエキソヌクレアーゼレベルが十分に低く、
ポリメラーゼの活性が十分ならば（これらの両方とも本
分野ではよく知られている）これらのポリメラーゼの各
々をシークエンシング法に使用できる。各々のアミノ酸
部位に関してはBraithwaiteおよびItoを参照されたい。
【００８９】１．ＰｌｏＩファミリー Ｐｈｅ７６２が変換された大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
（変換とは非判別性を与える例えばＴｙｒまたは等価な
アミノ酸との置換を意味している）。
【００９０】
【表３】Ｐｈｅ７１１が変換されたストレプトコッカス
ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）ＤＮＡポ
リメラーゼＩ Ｐｈｅ６６７が変換されたテルムス アクアチカス（Th
ermus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｐｈｅ６６６が変換されたテルムス フラバス（Thermu
s Flavus）ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｐｈｅ５７０が変換されたバクテリオファージＴ５ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ Ｌｅｕ５２６が変換されたバクテリオファージＳｐｏ１
ＤＮＡポリメラーゼ Ｐｈｅ６９０が変換されたバクテリオファージＳｐｏ２
ＤＮＡポリメラーゼ ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼ、天然のＴｙｒ７５
３または非判別活性が減少されていないこの位置での変
換体。そのようなポリメラーゼは以前にＤＮＡシークエ
ンシングに使用されたことはない。低レベルのｄｄＮＴ
Ｐ判別性が期待されるのでそのような方法に有用であろ
うと信じられる。必要なら、ポリメラーゼ活性に付随す
るエキソヌクレアーゼ活性を減じるように修飾できるで
あろう。
【００９１】２． ポリメラーゼアルファファミリー
（ポリメラーゼIIファミリーとも呼ばれる） Delarue et al., Protein Engineering 3, 461-467(199
0)はポリメラーゼの二つのファミリー（ポリメラーゼＩ
ファミリーおよびポリメラーゼアルファファミリー）が
三つの共通のモチーフを共有していることを示してい
る。彼らが”モチーフＢ”と呼んだ領域にジデオキシリ
ボースの特異性に関すると同定された残基が含まれてい
る。この領域はポリメラーゼＩファミリー中、配列ＫＮ
1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7ＹＧ（ここでＮ4は特異的残基であ
り：もしＮ4がフェニルアラニンであれば、高い判別性
であり、もしＮ4がチロシンであれば低い判別性であ
る）により特徴付けられる。ポリメラーゼアルファファ
ミリーにおいては、配列はＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＹＧ
（保存残基との間では塩基が一つ少ない）。従ってポリ
メラーゼＩ型酵素とちょうど同じにこのモチーフ（リジ
ン（Ｋ）およびチロシン（Ｙ）の間）内の残基の変化が
これらのポリメラーゼのｄｄＮＴＰに対する判別度を減
少させるであろう。これらの結果は以下の様である：
【表４】 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼII Ile494-Phe499 ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ Leu341-Ser346 Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ Leu384-Leu389 Ｍ２ ＤＮＡポリメラーゼ Leu381-Leu386 Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ Ile558-Leu563テルミュオコッカス リトラリス （Thermuococcus litoralis) ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ） Leu492-Tyr497ピロコッカス フリウサス （Pyrococcus feriosus） ＤＮＡポリメラーゼ Leu489-Phe494スルフォロブス ソルファタリカス （Sulfolobus solfataricus） ＤＮＡポリメラーゼ Val604-Thr609 ヒトＤＮＡポリメラーゼ アルファ Leu951-His956Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼＩ （アルファ） Leu945-His950Ｓ．ポンベ （pombe）ＤＮＡポリメラーゼＩ（アルファ） Leu931-His936ドロソフィラ メラノガスター （Drosophila melanogaster） ＤＮＡポリメラーゼアルファ Leu960-His965トリパノソーマ ブルーセイ （Trypanosoma brucei） ＤＮＡポリメラーゼ アルファ Leu845-His850 ヒトＤＮＡポリメラーゼ デルタ Val695-Val700 ウシＤＮＡポリメラーゼ デルタ Val694-Val699Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼIII （デルタ） Ile702-Val707Ｓ．ポンベ （pombe）ＤＮＡポリメラーゼIII（デルタ） Val681-Val686 熱帯熱マラリアＤＮＡポリメラーゼ（デルタ） Ile692-Val697Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼII （イプシロン） Val82-Phe830Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼＲｅｖ３ Leu1087-Thr1092 単純ヘルペスウイルス タイプ１ ＤＮＡポリメラーゼ Val812-Val817 エキンヘルプスウイルス タイプ１ ＤＮＡポリメラーゼ Val813-Val818 水痘帯状ヘルペスウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Val776-Val781 エプスタイン−バールウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Cys682-Val687 ヘルペスウイルス サイミリ ＤＮＡポリメラーゼ Val671-Val676 ヒトサイトメガロウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Val811-Phe816 マウスサイトメガロウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Val717-Phe722 ヒトヘルペスウイルス タイプ６ ＤＮＡポリメラーゼ Ile667-Val672 湖水ナマズウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile750-His755 クロレラウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile586-Val591 鶏頭ウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile648-Vai653 ワクシニアウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile637-Val642コリストニューラ ビエニス （Choristoneura biennis） ＤＮＡポリメラーゼ Ile669-Leu674オートグラファ カリホルニカ （Autographa californica） 核多面化ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡポリメラーゼ Arg606-Ile611 マイマイガ核多面化ウイルスＤＮＡポリメラーゼ Arg624-Ile629 アデノウイルスー２ＤＮＡポリメラーゼ Leu696-Leu701 アデノウイルスー７ＤＮＡポリメラーゼ Leu762-Leu767 アデノウイルスー１２ＤＮＡポリメラーゼ Leu694-Leu699 Ｓ−１トウモロコシＤＮＡポリメラーゼ Leu618-Leu623カリオ ニューロスポラ インターメジア （Kalio neurospora intermedia）ＤＮＡポリメラーゼ Leu776-Leu777 ｐＡＩ２アスコボラス イマーサス （Ascobolus immersus） ＤＮＡポリメラーゼ Leu951-leu956 ｐＣＬＫ１ クラビセプス プルプレア （Claviceps purpurea） ＤＮＡポリメラーゼ Leu831-Leu836マランハル ニューロスポラ クラッサ （Maranhar neurospora crassa） ＤＮＡポリメラーゼ Leu752-Leu757 ｐＥＭ アガリカス ビトルキス （Agricus bitorquis） ＤＮＡポリメラーゼ Leu573-Leu578 ｐＧＫＬ１ クライベロマイセス ラクチス （Kluyveromyces lactis） ＤＮＡポリメラーゼ Ile785-Leu790 ｐＧＫＬ２ クライベロマイセス ラクチス （Kluyveromyces lactis） ＤＮＡポリメラーゼ Ile770-Gly776 ｐＳＫＬ サッカロマイセス クライベリ （Saccaromyces kluyveri） ＤＮＡポリメラーゼ Ile775-Gly781 上述のポリメラーゼのうち代表的なものについて、対応
する位置のアミノ酸残基を以下に示す。
【００９２】
【表５】 生物 遺伝子バンク 部分配列 * Thermus aquaticus D32013 RRAAKTINFGVLYG Streptococcus pneumoniae J04479 RRNAKAVNFGVVYG Bacillus stearothermophilus L42111 RRQAKAVNFGIVYG Bacillus caldotenax D12982 RRQAKAVNFGIVYG Deinococcus radiodurans L14581 RRAAKTVNFGVLYG Thermus thermophilus D28878 RRAAKTVNFGVLYG Thermus flavus X66105 RRAAKTINFGVLYG Phage SPO1 M84415 RTASKKIQFGIVYQ Phage SPO2 X01458,K02752 RQKGKVAELALGYQ *
【００９３】
【実施例】以下は種々のポリメラーゼの連続移動性およ
びサイクル時間を決定するための方法の実施例である。
また、ポリメラーゼによる判別レベルを決定するための
実施例および本発明に有用なその他の方法が提供されて
いる。
【００９４】実施例１．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の突
然変異誘発および突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの過剰
産生 突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングお
よび発現には標準的な技術が使用された。大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノー断片）およ
びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメント（Ｋｌ
ｅｎＴａｑまたは＿Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Barn
es, 112 Gene 29,1992参照、またはStoffel断片、Lawy
er et al, 2 PCR Methods Appl 275, 1993参照）、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼにおける突然変異体発生のための出発材料はＴ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御の下で発現され
た。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体のための出
発材料であるＴ７ ＤＮＡポリメラーゼの＿２８アミノ
酸欠失のための遺伝子（TaborおよびRichardson 264,
J. Biol. Chem. 6447, 1989参照）はｌａｃプロモータ
ーの制御下、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼによる連続移動
的ＤＮＡ合成に必要な因子である大腸菌チオレドキシン
（TaborおよびRichardson、上記文献）を産生する株中
で発現された。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体
Ｆ６６７Ｙのための遺伝子はＰＣＲおよび制限消化に続
いての連結を用いる標準的技術により＿Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼを産生する遺伝子から完全長Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼを産生する遺伝子に移された。
【００９５】突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを作製する
ための突然変異発生はSarkarおよびSommer 8 Bio Techn
iques 404,1990により記載されている方法に類似したＰ
ＣＲによる標準突然変異発生技術を用いて実施された。
４より多いのアミノ酸残基が交換されているハイブリッ
ドを作製するためには、２つのハイブリッドプライマー
が作製され、それによりＰＣＲが最初に供与体ＤＮＡ上
で実施され、続いてその生成物がハイブリッド分子を発
生する受容体ＤＮＡ上でのＰＣＲに使用された。領域の
交換が４アミノ酸またはそれ未満のハイブリッドの作製
には、移されるべき全領域ならびに受容体の適当なフラ
ンキング配列を含む単一のＰＣＲプライマーが合成さ
れ、そのプライマーが直接ハイブリッド分子の作製に使
用される。
【００９６】突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの過剰産生
は標準技術を用いて実施された（例えば、Current Prot
ocols in Molecular Biology,Ausubel et al,eds.,16
章,1994参照）。突然変異体蛋白質はイオン交換クロマ
トグラフィーを含む常法により精製された。大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ突然変異体の精製には、例えばJoyce
およびGrindley 80 Proc. Natl. Acad. Sci. 1830, 198
3を参照されたい。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ突然変
異体の精製には、例えばEngelke et al.191 Anal ytical
Biochemistry 396, 1990を参照されたい。Ｔ７ ＤＮＡ
ポリメラーゼ突然変異体の精製には、例えばTaborおよ
びRichardson 264, J. Biol. Chem. 6447,1989を参照さ
れたい。各々の精製された突然変異体蛋白質のポリメラ
ーゼ特異的活性はこれらの引例に記載されている標準法
により決定された。
【００９７】実施例２．デオキシヌクレオチドに比較し
てジデオキシヌクレオチドの取り込み効率が改良された
突然変異体のためのＤＮＡポリメラーゼの迅速なスクリ
ーニング ＳＤＳ活性ゲル分析により突然変異体ＤＮＡポリメラー
ゼのジデオキシヌクレオチド取り込み能力がスクリーニ
ングされた。方法はSpanosおよびHubscher 91Methods i
n Enzymology 263, 1983およびKarawya et al. 135 Ana
lytical Bioch emistry 318, 1983により記載されている
方法を改良したものである。簡単に記すと、10mlの細胞
が４から６時間誘導されその後ペレット化される。細胞
ペレットを0.3ml 25mM トリスＨＣｌ,pH7.0,5mM ＥＤＴ
Ａに懸濁する。20μlの再懸濁化された細胞を1%ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）、2%メルカプトエタノー
ル、30%グリセロール、0.04%ブロモフェノールブルーお
よび100mMトリスＨＣｌ,pH6.8を含む溶液40μlと混合す
る。混合物を３７℃で５分間インキュべートし、その２
０μｌずつを二重に二つのＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル上にのせる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルは、8%ポ
リアクリルアミド、0.27%ビスアクリルアミド、190mMト
リスＨＣｌ、pH8.8、0.05%ＳＤＳ、および25μg/ml変性
サケ精子ＤＮＡを含む分解用ゲルおよび5%ポリアクリル
アミド、0.17%ビスアクリルアミド、150mMトリスＨＣ
ｌ、pH6.8、および0.1%ＳＤＳを含む濃縮用ゲルからな
っている。二つのゲルは190mMトリスＨＣｌ、pH8.8およ
び0.05%ＳＤＳからなる電気泳動緩衝液中、１３℃の一
定温度にて１００Ｖで１３時間電気泳動する。
【００９８】電気泳動後、４℃にて８時間以上かけ、そ
の間各々500mlの復元緩衝液（50mMトリスＨＣｌ,pH7.
5、5mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトール、40m
MＫＣｌ、400gμ/mlウシ血清アルブミン、16%グリセロ
ールおよび0.95mMＥＤＴＡ）を４回交換して洗浄する。
【００９９】復元蛋白質は6mlの復元緩衝液、1.5μMの
４ｄＮＴＰ、４μｌの［ａ−32Ｐ］ｄＡＴＰ（800Ci/ミ
リモル、10mCi/ml）および80μgの精製チオレドキシン
中、二つのゲルの各々をインキュベートすることにより
ＤＮＡポリメラーゼ活性がアッセイされる。混合物の一
つはまた30μMのｄｄＴＴＰ（ｄＴＴＰに対して２０倍
モル過剰）も含む。混合物は３７℃で４時間インキュベ
ートした（好熱性ＤＮＡポリメラーゼに対しては７０℃
で２時間）。
【０１００】インキュベーション後、ゲルを5%トリクロ
ロ酢酸および1%ピロリン酸ナトリウムを４回交換して８
時間洗浄した。次にゲルを乾燥しオートラジオグラフィ
ーを行った。
【０１０１】ｄｄＴＴＰに対する突然変異体ＤＮＡポリ
メラーゼの判別が上がったかまたは下がったかを決定す
るために、ｄｄＴＴＰ存在下または非存在下でインキュ
ベーションを行った二つのゲル上の放射活性バンドの強
度を比較し、非修飾ＤＮＡポリメラーゼの二つのバンド
の信号の比が各々の突然変異体の二つのバンドの信号の
比と比較された。もし突然変異でＤＮＡポリメラーゼの
ｄｄＴＴＰに対する判別が悪くなっていたら、非修飾Ｄ
ＮＡポリメラーゼに比較して突然変異体ＤＮＡポリメラ
ーゼのｄｄＴＴＰが存在するバンドの放射活性の大きな
比率の低下があるであろう。例えばこれらの条件下ｄｄ
ＴＴＰ存在下または非存在下で実施される反応におい
て、誘導された大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ７
ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ５２６Ｆを含む細胞
で観察された放射活性バンドはほとんど同じ強度（２倍
以内）である。対照的に、誘導された大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ突然変異体Ｆ７２６ＹまたはＴ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ含有細胞では、ｄｄＴＴＰ存在下で実施され
た反応のゲル上のバンドはｄｄＴＴＰ非存在下で実施さ
れた反応での対応するバンドの強度の５％未満であっ
た。
【０１０２】このアッセイはジデオキシヌクレオチドの
判別能力を多数のＤＮＡポリメラーゼ突然変異体につい
てスクリーニングする迅速な方法として示されている。
判別の相対的速度の少なくとも５倍の変化を検出でき
る。しかしながら、このアッセイの後興味を引く可能性
のある突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの精製、および各
々の突然変異体のジデオキシヌクレオチドの判別に対す
る影響を正確に決定するために以下に記載したような精
製蛋白質のより厳密なアッセイで追試を行わなければな
らない。
【０１０３】以下の実施例は、種々のポリメラーゼに対
する連続移動性およびサイクル時間の決定法、ポリメラ
ーゼによるｄｄＮＴＰに対する判別レベルの決定法、Ｄ
ＮＡシークエンシングゲル上のジデオキシ停止断片によ
り発生したバンドの均一性の決定法およびＤＮＡ配列分
析における本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用法であ
る。
【０１０４】実施例３．一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡ−５’32
Ｐ−標識４０−ｍｅｒプライマー複合体の製造と精製 テンプレートは米国特許第4,795,699号に記載されてい
るような９９５０の長さのヌクレオチド、Ｍ１３ ｍＧ
Ｐ１−２一本鎖ＤＮＡである（図９）。ファージＭ１３
ｍＧＰ１−２はＡＴＣＣに第40303号として寄託され
ている。Ｍ１３ｍＧＰ１−２一本鎖ＤＮＡはTabor et a
l.,262 J.Biol.Chem. 16212,1987に記載されているごと
く精製された。簡単に記すと、ファージは２回のＣｓＣ
ｌ濃度勾配遠心分離により精製され、ＣｓＣｌを透析に
より除去し、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム存在下でフェ
ノールおよびクロロホルムによりファージからＤＮＡを
除去し、抽出されたＤＮＡは20mMトリスＨＣｌ，pH7.
5、2mMＥＤＴＡに対してよく透析し、４℃で貯蔵した。
Ｍ１３ ｍＧＰ１−２一本鎖ＤＮＡの濃度は8.1Ａ2 60単
位＝1mg/mlまたはマイクロリットル当たり0.3ピコモル
Ｍ１３ ｍＧＰ１−２テンプレートの吸光係数を用いて
分光測定により決定される。
【０１０５】プライマーは常法により合成された配列5'
d(TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA)3'を持
つ合成４０−ｍｅｒである。これはＭ１３ ｍＧＰ１−
２ＤＮＡのヌクレオチド９０３１から８９９２と相補的
である（配列は上記特許'699参照）。プライマーは末端
標識に先立ってイオン交換クロマトグラフィーまたは変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。
【０１０６】プライマーは本質的にTabor et al（上記
文献）に記載されているごとく標識化されテンプレート
にアニールされる。プライマーは40mMトリスＨＣｌ,pH
7.5、10mMＭｇＣｌ2、5mMジチオスレイトール、100mMＮ
ａＣｌ、50μg/mlＢＳＡ、50μCi［ ｇ32Ｐ］ＡＴＰ、6
000Ci/mmol、5ピコモルのプライマーおよびホスファタ
ーゼ活性を持たないＰｓｅＴ１突然変異体から調製され
た１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応
混合物（15μl）中で５’末端標識された。混合物は３
７℃で１５分、続いてキナーゼを不活性化するため７０
℃で１５分インキュベートする。60μlの一本鎖Ｍ１３
ｍＧＰ１−２ＤＮＡ（0.25mg/ml）、6μlの1MＮａＣｌ
および3μlの0.2MＭｇＣｌ2を加え、混合物は３０分以
上かけて徐々に７０℃から室温（約２０−２５℃）まで
冷却する。混合物は次にフェノールおよびクロロホルム
の１：１混合物で抽出し、マイクロ遠心機で３０秒遠心
分離した後、水層（70μl）を20mMトリスＨＣｌ,pH7.
5、2mMＥＤＴＡ、100mMＮａＣＬで平衡化したセファロ
ースＣＬ−６Ｂの1mlのカラムにのせる。標識プライマ
ー−テンプレート複合体は平衡化に用いたものと同じ緩
衝液でカラムから溶出される；標識化合物は空隙容量中
に溶出される。溶出後、複合体は約200,000cpm/μlの比
活性を有する約50μg/ml（μｌあたり０．０１５ピコモ
ル分子）の濃度である。
【０１０７】実施例４．希釈試験によるＤＮＡポリメラ
ーゼの連続移動性の決定 連続移動性は本質的にTabor et al（上記文献）およびT
aborおよびRichardson,84 Proc.Natl.Acad.Sci USA 476
7,1987に記載されている酵素希釈により決定された。反
応はＤＮＡシークエンシングに使用された伸長／停止反
応と同一の条件で実施されたが（TaborおよびRichardso
n、上記文献）、ｄｄＮＴＰは除いてあり、およびいく
つかの反応ではポリメラーゼ分子より過剰のプライマー
−テンプレート分子を存在させるためポリメラーゼ濃度
が減らされている。プライマー−テンプレートは実施例
３に記載したような一本鎖Ｍ１３ＤＮＡにアニールされ
た一つの５’末端標識プライマーから成っている。
【０１０８】伸長反応混合物は実質的にTabor et al
（上記文献）に記載されているように調製された。各々
の反応混合物（18μl）は1.0μlの実施例３に記載され
たようなアニールされた32Ｐ−標識プライマー−Ｍ１３
ＤＮＡ（〜0.015ピコモル、〜200,000cpm）、40mMトリ
スＨＣｌ,pH8.0、5mMＭｇＣｌ2、5mMジチオスレイトー
ル、および300μM ４ｄＮＴＰを含む。混合物は３７℃
（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７０℃）で１分間イン
キュベートされた。反応は分析されるＤＮＡポリメラー
ゼの希釈液（20mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mMメルカプト
エタノール、および0.05%ウシ血清アルブミンで希釈さ
れている）2μlを加えることにより開始された。反応混
合物はさらに３７℃（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７
０℃）で３０秒かまたは３分間インキュベートされた。
指定時間に8μlを採り、変性ポリアクリルアミドゲル電
気泳動のためには8μlの90%ホルムアミド、20mM ＥＤＴ
Ａ、0.05%ブロムフェノールブルーかまたはアルカリ性
アガロースゲル電気泳動のためには2μlの100mM ＥＤ
ＴＡ、2%ドデシル硫酸ナトリウムに加えられた。
【０１０９】試料は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動かまたはアルカリ性アガロースゲル電気泳動で分析さ
れる。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は平均連続
移動性が５００ヌクレオチド未満のポリメラーゼの分析
に最も適しており、一方、アルカリ性アガロースゲル電
気泳動は５００ヌクレオチドより大きい平均連続移動性
を持つＤＮＡポリメラーゼの連続移動性のより感度のよ
い評価を与える；しかしながら、両方の方法とも任意の
ＤＮＡポリメラーゼの平均連続移動性の決定に十分使用
できる。
【０１１０】変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り連続移動性を決定するには、ホルムアミド中の試料を
９０℃に２分間加熱し、直後に各々の試料の6μlを8%ポ
リアクリルアミド、0.4%N,N'-メチレンビスアクリルア
ミド、7M尿素を溶解した100mMトリスーホウ酸、pH8.3、1
mMＥＤＴＡからなるゲル上にのせる。電気泳動は2000V
で９０分である（ブロムフェノールブルーがゲルのボト
ムをちょうど流出するまで）。また適した５’32Ｐ−末
端標識分子量マーカーもゲルにのせると、１００から５
００の長さの断片の大きさの決定が可能である。そのよ
うな適したマーカーの例は、常法を用いてアルカリ性ホ
スファターゼで脱リン酸化され、次に［ｇ−32Ｐ］ＡＴ
ＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’32
Ｐ−末端標識されているＴ７ Ｈｐａｌ断片である（Sa
mbrook et al.,1989, Molecular Cloning ALaboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y. pp.6.2
0-6.21およびAusubel et al.,1989,Current Protocols
in Molecular Biology,Greene Publishing Associates
and Wiley Interscience,N.Y.）。電気泳動後、真空下
ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。オート
ラジオグラフィー後、放射活性標識断片の分布をホスホ
イメージャー分析（Molecular Dynamics）で決定する。
【０１１１】アルカリ性アガロースゲル電気泳動による
生成物は(1)Villani et al,.256 J. Biol.Chem.8202,198
1,(2)Sabatino et al.,27 Biochemistry 2998,1988 (3)
Sambrook,et al.（上記文献）に記載されているごとく
分析された。アガロースゲルの調製には1.5%アガロース
を含む2mM ＥＤＴＡ溶液、pH8.0（250ml）を電子レンジ
中で加熱してアガロースを溶解させた後放置して６０℃
に冷却する。8.75mlの1N ＮａＯＨ（最終濃度35mMのＮ
ａＯＨ）を加え、そのゲルをアガロースゲル電気泳動流
し型に注ぐ。ゲルは使用２時間前に準備する。電気泳動
緩衝液は35mMＮａＯＨおよび2mM ＥＤＴＡである。上に
記載したような10μlの試料（20mM ＥＤＴＡ、0.4%ドデ
シル硫酸ナトリウム）に1μlの1N ＮａＯＨを加え６０
℃で１０分間加熱する事により変性させて電気泳動試料
を調製する。各々の試料に7μlの75%グリセロール、0.2
%ブルモクレゾールグリーンを加えた後試料をアルカリ
性アガロースゲル上にのせる。電気泳動は４℃にて150m
Aの一定電流で１５時間実施する（ブロモクレゾールグ
リーンが約14cm移動するまで）。電気泳動チャンバーは
26cm（長さ）x20cm（幅）x2cm（高さ）である。電気泳
動後、ゲルを10%トリクロロ酢酸に２時間浸し、真空下
乾燥後オートラジオグラフィーを行う。オートラジオグ
ラフィー後、放射活性標識断片の分布をホスホイメージ
ャー分析（Molecular Dynamics）で決定する。
【０１１２】ＤＮＡポリメラーゼの連続移動性を試験す
るため、プライマーの部分のみが（例えば25%）伸長さ
れるが大多数（例えば75%）は未変化で残るまで反応混
合物中のそのポリメラーゼ濃度を２倍ずつ希釈する（４
０ヌクレオチドの長さ）。これらの条件下ＤＮＡポリメ
ラーゼ濃度の２倍の増加または減少は伸長されるプライ
マーの分画の約２倍の増加または減少を生じるはずであ
る。伸長された標識断片の平均の長さはオートラジオグ
ラフの視覚的検査またはホスホイメージャーを用いる定
量により決定される。例えばこの試験を用い、その連続
移動因子チオレドキシンと複合体化されているエキソヌ
クレアーゼ欠損Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、SE
QUENASE Version2、United States Biochemical Corpor
etion）は５００ヌクレオチドより大きな平均連続移動
性を持っているが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー断片は５０ヌクレオチド未満の連続移動性しか持っ
ていない事が示された。
【０１１３】実施例５．ＤＮＡポリメラーゼのサイクル
速度の決定 サイクルの速度は本質的にTabor et al（上記文献）に
記載されているごとく決定された。反応はＤＮＡシーク
エンシングに使用された伸長／停止反応と同一の条件で
実施されたが（TaborおよびRichardson、上記文献）、
ｄｄＮＴＰは除いてあり、およびいくつかの反応ではポ
リメラーゼ分子より過剰のプライマー−テンプレート分
子を存在させるためポリメラーゼ濃度が減らされてい
る。プライマー−テンプレートは実施例３に記載したよ
うな一本鎖Ｍ１３ＤＮＡにアニールされた一つの５’末
端標識プライマーから成っている。
【０１１４】最初に例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
の大フラグメント（クレノー断片）を用いてポリメラー
ゼ分子に対するプライマー−テンプレート分子の機能的
割合を決定するための試験が実施される。１０秒で標識
プライマー−テンプレート分子の２０％を伸長させるの
に必要なポリメラーゼ分子の濃度を決定するため、実施
例４に記載したごとく希釈実験が実施される。プライマ
ー−テンプレートに対するポリメラーゼのこの割合は
１：５に等しいかまたはそれ未満であるように規定され
ており、以下のようにポリメラーゼのサイクルの最大速
度の決定に使用される。
【０１１５】前の節に規定したように１：５に等しいか
またはそれ未満であるプライマー−テンプレートに対す
るポリメラーゼの比を用いて実施例４に記載したように
伸長反応が実施される。反応は試験されるポリメラーゼ
に最適な条件下（すなわち、緩衝液、ｐＨ、塩、温度）
実施される。１０秒、２０秒、４０秒および８０秒後に
一部を採取し、反応を停止させて実施例４に記載したよ
うに生成物を分析した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの
大フラグメントのように低い連続移動性（１００ヌクレ
オチド未満）を持つＤＮＡポリメラーゼにおいて、試料
は好適には変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析された。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのように高い連
続移動性（１００ヌクレオチド以上）を持つＤＮＡポリ
メラーゼにおいて、試料は好適にはアルカリ性アガロー
スゲル電気泳動により分析された。電気泳動後、ゲルを
真空下乾燥させオートラジオグラフィーまたはホスホイ
メージャーで分析した。
【０１１６】Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのように非常に
ゆっくりとサイクルするポリメラーゼで反応を実施する
場合、１０秒および８０秒の間で伸長されなっかたプラ
イマーの数に有意な減少（すなわち、２倍未満）はなか
った。それ故、１０秒および８０秒の時点の間に非伸長
標識プライマーの数が２倍以上減少しないならば、ＤＮ
Ａポリメラーゼは７０秒に１度より遅くサイクルしてい
る。急速にサイクルするポリメラーゼに対しては１０秒
および８０秒の時点の間で非伸長プライマーの数が著し
い割合で（すなわち２倍以上）で減少するであろう。こ
れらのポリメラーゼのサイクルの速度を決定するため、
以下の方程式が使用される： Ｒ＝Ｎ1ｘＬ（ｔ2）／｛Ｌ（ｔ1）ｘ（ｔ2−ｔ1）｝ 式中： Ｒ＝サイクルの最小速度（秒当たりのサイクル）； Ｎ1＝機能的ＤＮＡポリメラーゼ分子に対するプライマ
ー−テンプレート分子の比（上記の実施例ではＮ1＝
５）； Ｌ（ｔ1）＝試験されているＤＮＡポリメラーゼの最大
連続移動性（ヌクレオチド）。実施例３に記載したごと
くＤＮＡポリメラーゼを制限した条件下（１０秒の時点
でプライマーの２０％のみしか伸長されない）標識プラ
イマーから伸長されるヌクレオチドの最大数として定義
される； Ｌ（ｔ2）＝時間ｔ2（この実施例では８０秒）での標識
プライマーの伸長の最大長（ヌクレオチド）； ｔ1＝試料の一部が採取される最も短い時間、またはこ
の実施例では１０秒； ｔ2＝試料の一部を採取する前に反応が進行させられる
最も長い時間、またはこの実施例では８０秒。
【０１１７】この試験が大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの
大フラグメントについて実施された場合、秒当たり０．
２サイクルより大きい値が得られた。
【０１１８】実施例６および７は一本鎖Ｍ１３ＤＮＡテ
ンプレートにアニールされた一つの５’32Ｐ標識４０−
merプライマーおよびゲル電気泳動に基づいた分析を用
いる未知のＤＮＡポリメラーゼについてジデオキシヌク
レオチドの取り込みの効率を決定するための試験法を提
供する。実施例６はジデオキシヌクレオチドを効率的に
取り込むＤＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型Ｔ７ Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ
６６７Ｙ）に最適であり、一方、実施例７はジデオキシ
ヌクレオチドの取り込みを強く判別するＤＮＡポリメラ
ーゼ（例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼＹ５２６Ｆお
よび野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に最適であ
る。
【０１１９】実施例６．１：１のｄＮＴＰとｄｄＮＴＰ
の比を用いるデオキシヌクレオチドと比較したジデオキ
シヌクレオチドの取り込み速度のゲル電気泳動による決
定 この試験の最初の応用はＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ突然変異体Ｆ７６２Ｙまたは
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｆ６６７Ｙのよ
うにジデオキシヌクレオチドを効率的に取り込むＤＮＡ
ポリメラーゼにおいてのｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの
取り込みの絶対的な比の決定である。任意のＤＮＡポリ
メラーゼのｄｄＮＴＰに対する判別の程度を示す事もで
きる；しかしながら、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ突然変
異体Ｙ５２６Ｆ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼのようにｄｄＮＴＰを強く判
別するＤＮＡポリメラーゼに対しては判別の程度を正確
に決定するにはｄＮＴＰに対して高い比率のｄｄＮＴＰ
が必要であり、それは実施例７に詳細に記載されてい
る。
【０１２０】ＤＮＡ合成反応は実施例３に記載したごと
く調製された32Ｐ−末端標識４０mer−Ｍ１３ｍＧＰ１
−２ ＤＮＡテンプレート複合体で実施される。反応の
緩衝液、ｐＨ、塩および温度に関しては、試験されてい
るＤＮＡポリメラーゼに最適な反応条件が使用された。
ＤＮＡポリメラーゼ濃度は１０分の反応でプライマーの
ほとんどが伸長され、およびジデオキシヌクレオチドの
取り込みにより停止されるように選択された。反応混合
物は１００μＭの４ｄＮＴＰおよび１００μＭの４つの
ｄｄＮＴＰの内の１つを含む。
【０１２１】４つのｄｄＮＴＰの各々を取り込む６つの
ＤＮＡポリメラーゼの能力を比較するためにこの試験を
使用した。試験されたＤＮＡポリメラーゼは（１）エキ
ソヌクレアーゼ領域に２８アミノ酸が欠損し、およびチ
オレドキシンと１対１の比で複合体を形成しているＴ７
ＤＮＡポリメラーゼ（TaborおよびRichardson 264J.B
iol.Chem. 6447,1989）（”Ｔ７ ＤＮＡポリメラー
ゼ”とここで称されている）、（２）大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩの大フラグメント、通常クレノー断片と呼ば
れている（”大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ”とここで称
されている）、（３）テルムス アクアチカス（Thermu
s aquaticus）からの非修飾ＤＮＡポリメラーゼ（”Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ”とここで称されている）、
（４）残基５２６のチロシンがフェニルアラニンに変換
されている前記のＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（”Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼＹ５２６Ｆ”とここで称されてい
る）、（５）残基７６２のフェニルアラニンがチロシン
に変換されている上記の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（”大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７６２Ｙ”とこ
こで称されている）および（６） 残基６６７のフェニ
ルアラニンがチロシンに変換されている上記のＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（”Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ
６６７Ｙ”とここで称されている）である。
【０１２２】対応するｄＮＴＰと比較した４つのｄｄＮ
ＴＰの各々の使用の相対速度を上に示したＤＮＡポリメ
ラーゼについて試験するために、反応混合物（８μl）
には1.0μlの実施例３に記載されたようなアニールされ
た32Ｐ−標識プライマー−Ｍ１３ ＤＮＡ（〜0.015ピ
コモル、〜200,000cpm）、40mMトリスＨＣｌ,pH8.0、5m
MＭｇＣｌ2、5mMジチオスレイトール、50mM ＮａＣｌ、
100μM ４ｄＮＴＰ、および100μM ｄｄＣＴＰが含まれ
ている。反応混合物にはまた、ＤＮＡポリメラーゼによ
る明かな判別を増加させるであろう加ピロリン酸分解
（pyrophosphorolysis，TaborおよびRichardson 265 J.
Biol.Chem. 8322,1990）を阻害するために10ngの酵母無
機ピロホスファターゼが含まれている。20mMトリスＨＣ
ｌ,pH7.5、10mM２−メルカプトエタノール、および0.05
%ウシ血清アルブミンに希釈した約0.025単位／μlの濃
度までの各々のＤＮＡポリメラーゼ2μlの添加により反
応が開始された。各々のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、
１５分の反応でｄｄＮＴＰ非存在下、標識プライマーの
ほとんどを５００ヌクレオチドより長く伸長するのに十
分であった。反応混合物は３７℃（Ｔ７ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼＹ５２６Ｆ、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ Ｆ７６２Ｙ）または７０℃（Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙ）
で１５分インキュベートされた。反応は10μlの90%ホル
ムアミド、20mM ＥＤＴＡ、0.05%ブロモフェノールブル
ーの添加により停止させた。ゲルにのせる直前に試料を
９０℃で２分間加熱し、各々の試料の6μlを8%ポリアク
リルアミド、0.4% Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミド、7M尿素を含む100mMトリスーホウ酸,pH8.3、1mM
ＥＤＴＡから成るゲル上にのせる。電気泳動は2000Vで
９０分であった（ブロムフェノールブルーがゲルのボト
ムをちょうど流出するまで）。電気泳動後、真空下ゲル
を乾燥させオートラジオグラフィーを行う。オートラジ
オグラフィー後、放射活性標識断片の分布をホスホロイ
メージャー分析（Molecular Dynamics）で決定する。も
しくは、ジデオキシ停止バンドの相対的強度がSciScan
5000イメージングデンシトメーター（United States Bi
ochemical Corp）のような装置を用いてオートラジオグ
ラムを走査することにより決定できるであろう。
【０１２３】四つの反応の組が（各々はｄＮＴＰと当モ
ル濃度の単一のｄｄＮＴＰを含む）上記の六つのＤＮＡ
ポリメラーゼの各々と実施された場合、ＤＮＡポリメラ
ーゼの三つとの反応（Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼＹ５２
６Ｆ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ）の結果では伸長されたプライマーの放
射活性のほとんど（＞５０％）がゲルの先端まで（３０
０塩基より長い断片に対応する）移動した。断片の大き
さの増加にともなう信号の予想される指数関数的減衰に
基づくと、このことはこれら三つのＤＮＡポリメラーゼ
による判別は四つ全てのｄｄＮＴＰに対して１００倍よ
り大きかったことに対応する。これら三つのＤＮＡポリ
メラーゼによるｄｄＮＴＰに対する判別の正確な測定は
下記実施例７の試験を用いて得られる。
【０１２４】他の三つのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７
６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙ）
におけるオートラジオグラムは全ての反応において一連
のジデオキシ停止断片を示した。一般に、標識合成断片
の平均の長さはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙ
が最も低く、フィルムに数日暴露しても約六つの放射活
性標識ジデオキシ停止断片しか認められなかった。大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７６２Ｙによる標識断片の
平均の長さはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙに
よるものよりもわずかに長く、Ｔ７ ＤＮＡポリメラー
ゼよりも著しく長かった。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼに
より合成された場合より大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
Ｆ７６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７
Ｙにより合成された場合の方が断片はより均一の強度で
あった。
【０１２５】断片中の放射活性の分布はホスホイメージ
ャー分析（Molecular Dynamics）により定量された。各
々のレーンの標識プライマーの総量はＤＮＡポリメラー
ゼが存在していない三つの対照反応を行うことにより決
定され、非伸長プライマーの位置のゲル上の各々の対応
する放射活性バンドの放射活性が決定された。放射活性
標識プライマーのいくつかの調製試料では、あるパーセ
ント（＜１０％）は使用されたＤＮＡポリメラーゼの濃
度に無関係にどんなＤＮＡポリメラーゼによっても伸長
されなかった；このバックグラウンドレベルはｄｄＮＴ
Ｐを含む一連の四つの反応の非伸長プライマーの位置に
残っている放射活性のパーセントを測定し、先に決定さ
れたカウント総数からこれらの４つの値の平均を差し引
くことにより決定される。この値はＤＮＡポリメラーゼ
により伸長され得るプライマーのカウント総数として定
義される。
【０１２６】最初の三つのジデオキシ停止断片のカウン
ト総数（すなわち、放射活性）が４つのｄｄＮＴＰの各
々に対しＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ Ｆ７６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼＦ６６７Ｙについて決定された。値はＤＮＡポリメ
ラーゼにより伸長され得るプライマーのカウント総数に
対する最初の三つのジデオキシ停止断片のカウント数の
パーセントとして下記の表に示されている。
【０１２７】
【表６】 ポリメラーゼ反応 ddGTP ddATP ddTTP ddCTP T7 DNA ポリメラーゼ 67% 66% 76% 61% 大腸菌 DNA ポリメラーゼ I F762Y 95% 92% 96% 92% Taq DNA ポリメラーゼ F667Y 97% 95% 95% 99% ジデオキシヌクレオチドを取り込む各々のＤＮＡポリメ
ラーゼの効率のさらに別の試験として、有意の信号を持
つ各々の断片中のカウント数が各々の反応に対して決定
され、データがマッキントッシュプログラムKaleidogra
ph 3.0版（Synergy Software）を用いて断片数の関数と
してプロットされた。得られたプロットはKaleidograph
ライブラリールーチンを用いて指数関数的減衰曲線に適
合された。減衰曲線は下記の方程式で与えられる： Ｙ＝ｅMX 式中： Ｙ＝１−（伸長可能なプライマーの総数と比較した断片
１からＸ中の標識プライマーの分画） Ｘ＝断片数（第一のジデオキシ停止断片が１である） Ｍ＝データに対しKaleidographライブラリールーチンに
より計算させた指数関数的減衰関数。
【０１２８】下記の表においてＴ７ ＤＮＡポリメラー
ゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＦ７６２ＹおよびＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙを用いる４つのｄｄ
ＮＴＰ反応の各々について以下のデータが提供される： Ｎ、各々の指数関数曲線への適合に使用された断片の数 Ｍ、上記のように計算された指数関数的減衰関数 Ｄ、特定のｄＮＴＰの使用を対応するｄｄＮＴＰの使用
に対する比として与えられた判別因子（両方のヌクレオ
チドが等しい濃度で存在するとき）。ＤはＸ＝１の時の
Ｙを決定するためのＭの計算値を用いて上記の式から計
算され、ｄｄＮＴＰに対してｄＮＴＰを優先する比をＹ
／（１−Ｙ）としてＤが定義される。
【０１２９】Ｒ2、データの相関指数、Kaleidographラ
イブラリールーチンにより計算される。これはバンド強
度の変異性、または特定のジデオキシヌクレオチドを取
り込むＤＮＡポリメラーゼの能力の配列特異的変異性を
評価するものである。
【０１３０】
【表７】 ポリメラーゼ ddNTP N M D R2 Ｔ７ ＤＮＡ ddGTP 8 -0.375 2.2 0.813 ポリメラーゼ ddATP 6 -0,356 2.3 0.996 ddTTP 5 -0.450 1.8 0.997 ddCTP 8 -0.317 2.7 0.889 大腸菌ＤＮＡ ddGTP 5 -1.03 0.56 0.999 ポリメラーゼＩ ddATP 5 -0.860 0.72 0.998 Ｆ７６２Ｙ ddTTP 5 -1.06 0.54 1.000 ddCTP 6 -0.842 0.75 1.000 Ｔａｑ ＤＮＡ ddGTP 5 -1.18 0.45 0.995 ポリメラーゼ ddATP 6 -0.997 0.59 0.997 Ｆ６６７Ｙ ddTTP 6 -1.01 0.56 0.996 ddCTP 4 -1.44 0.32 0.996 平均値： Ｔ７ ＤＮＡ 4 ddNTP 2.3 .924 ポリメラーゼ 大腸菌ＤＮＡ 4 ddNTP 0.64 .999 ポリメラーゼ Ｉ Ｆ７６２Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡ 4 ddNTP 0.48 .996 ポリメラーゼ Ｆ６６７Ｙ 要約すると、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼはｄｄＮＴＰを
平均で２．３倍判別しており、一方、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ Ｆ７６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼＦ６６７Ｙは実際に各々平均で１．６倍（１／０．
６４）および２．１倍（１／０．４８）ｄＮＴＰよりも
ｄｄＮＴＰを好んでいる。Ｒ2の比較は、Ｔ７ ＤＮＡ
ポリメラーゼよりも大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７
６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙで
隣接する断片の強度がより均一であることを示してい
る。均一度のより正確な測定には、各々の位置での強度
の減衰を減少させるように各々の反応でｄｄＮＴＰを減
少させることにより（例えば５倍）、分析に多数の断片
を含ませることができる（実施例１３参照）。
【０１３１】新規のＤＮＡポリメラーゼによるｄｄＮＴ
Ｐに対する判別の量を決定するためには上に記載した反
応と類似の反応が実施されるであろうし、Ｔ７ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（SEQUENASE Version 2.0,United States
Biochemical Corporation）を用いて平行して同一の反
応が実施され、すべての反応が同一のゲルで分析され
る。新しいＤＮＡポリメラーゼで得られたジデオキシ停
止バンドの分布をＴ７ＤＮＡポリメラーゼで得られたも
のと最初に比較することにより、新しいＤＮＡポリメラ
ーゼがＴ７ ＤＮＡポリメラーゼより多くまたは少なく
ｄｄＮＴＰを判別するかが示されるであろう。例えば、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７６２Ｙを用いたその
ような視覚的評価は、４ｄｄＮＴＰの各々との反応に対
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７６２Ｙを用いた
反応でのゲル上に見ることができる断片の数がＴ７ Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いたものより少ない（および平均
の大きさが小さい）ことを示している。上記のように新
しいＤＮＡポリメラーゼの指数関数的減衰因子（Ｍ）、
ｄＮＴＰと相対的なｄｄＮＴＰの利用の平均相対速度
（Ｄ）、および強度の変異性（Ｒ2）を計算するために
前に記載した分析法に類似のより定量的な分析が実施で
きるであろう。
【０１３２】本試験で起こり得る複雑な問題は、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼに付随する5'から3'へのエキソヌ
クレアーゼ活性および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよ
び天然のＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（上記の実験で使用
された＿２８Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ欠損突然変異体
ではない）に付随する3'から5'へのエキソヌクレアーゼ
活性のようにＤＮＡポリメラーゼが付随するエキソヌク
レアーゼ活性を持っている場合である。5'から3'へのエ
キソヌクレアーゼ活性はプライマーの5'末端上の標識物
を除去でき検出される放射活性信号を減少させるので有
害である。この問題は反応混合物中のＤＮＡポリメラー
ゼの量を減少させることにより部分的に避けることがで
きる。前の実施例において、0.025単位のＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼでは5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活
性による明かな放射活性の損失無しに事実上すべてのプ
ライマーがジデオキシヌクレオチドの取り込みにより停
止されるまで伸長されているが、一方Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼ活性を４０倍増加させると（または反応当た
り１単位）、プライマーの5'末端から事実上すべての32
Ｐが失われている。5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活
性を持つＤＮＡポリメラーゼの判別の程度を測定する別
の方法は実施例８−１０に記載されたような異なるアッ
セイを使用することである。
【０１３３】3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性はＤ
ＮＡポリメラーゼが実際に行うより以上にｄｄＮＴＰを
判別するようにするため、上記のアッセイを複雑化させ
る（例えば、TaborおよびRichardson,86 Proc.Natl.Aca
d.Sci.4076,1987参照）。これは一度ジデオキシヌクレ
オチドが取り込まれても、このエキソヌクレアーゼ活性
は優先的にジデオキシヌクレオチドを除去できるのでＤ
ＮＡ合成を続けることができその結果、断片の長さが増
加することになる。好適には、上記の試験でアッセイさ
れる酵素ではそのような3'から5'へのエキソヌクレアー
ゼ活性は失われている；修飾されたＴ７ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（SEQUENASE,United States Biochemical Corpor
ation）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレ
アーゼ欠損Ｖｅｎｔ（テルモコッカス リトラリス（Th
ermococcus litoralis））ＤＮＡポリメラーゼ（New En
gland Biolabsカタログ番号257）、エキソヌクレアーゼ
欠損Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ピロコッカス（Pyrococcus）
ＧＢ−１）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs
カタログ番号259）、エキソヌクレアーゼ欠損Ｐｆｕ
（ピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosu
s））ＤＮＡポリメラーゼ（Stratageneカタログ番号600
163）およびエキソヌクレアーゼ欠損クレノー断片（大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、United States Biochemica
l Corporationカタログ番号70057）がその例である。大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）などのいく
つかの例では3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性は弱
く、本アッセイを有意に妨害しない（TaborおよびRicha
rdson 264 J.Biol.Chem.6447,1989）。試験される新規
ＤＮＡポリメラーゼがｄｄＮＴＰの判別の正確な測定を
妨害する3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性を持って
いるかどうかを決定する一つの方法は、６０分までの異
なる時点で試料の一部を採取して上記の実験を実施する
ことである。もし、ジデオキシ停止断片の大きさの分布
が時間とともに増加したら、そのような3'から5'へのエ
キソヌクレアーゼ活性がアッセイを妨害しているようで
あるし、もし断片の分布が時間で一定ならば、そのよう
な活性は有意な影響を与えていない。もし平均断片長が
時間とともに増加したら、より短いインキュベーション
時間を使用し、および／または時間がたっても断片の大
きさが一定に留まるような範囲までＤＮＡポリメラーゼ
の濃度を減少させなければならない。
【０１３４】加ピロリン酸分解またはポリメラーゼの逆
の反応は3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性と同様の
効果を持つことができ、ＤＮＡポリメラーゼから鎖停止
ジデオキシヌクレオチドを除き断片の長さをさらに増加
させる（TaborおよびRichardson 265 J.Biol.Chem.832
2,1990参照）。この活性はＤＮＡ合成の間に蓄積されお
よび加ピロリン酸分解に必要な基質であるピロリン酸を
除くために反応混合物中にピロホファターゼを含ませる
ことにより容易に避けることができる。
【０１３５】実施例７．ｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの
比を変化させることによるデオキシヌクレオチドと比較
したジデオキシヌクレオチドの取り込み速度のゲル電気
泳動による決定 この実施例は実施例６に記載したものと類似している。
ジデオキシヌクレオチドの取り込みを強く判別するＤＮ
Ａポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼＹ
５２６Ｆ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ）に好適な試験法であるが、効率的
にｄｄＮＴＰを取り込むＤＮＡポリメラーゼ（例えば、
Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ突然変異体 Ｆ７６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼＦ６６７Ｙ）についてもうまく適用できる。本試
験においては二つの異なるＤＮＡポリメラーゼ調製試料
に対しｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの比が変えられ（反応の他
の態様はすべて同一に保ちながら）、試験される二つの
ＤＮＡポリメラーゼにおいて同じような平均長の断片を
得るのに必要とされる比を決定するためにジデオキシ停
止放射活性標識化断片の分布が比較される。
【０１３６】一連の断片の平均の長さは二つの方法の内
の一つにより決定される。第一はｄｄＮＭＰを効率よく
取り込むＤＮＡポリメラーゼに最適なものであり、一つ
のＤＮＡポリメラーゼを用い、ｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰの
比を２倍ずつ変化させた一連の反応物を暴露させたオー
トラジオグラムを評価して観察できる最も大きな断片の
位置を決定し、第二のＤＮＡポリメラーゼを用いた類似
の一連のものと比較して、二つのＤＮＡポリメラーゼに
関して同じような大きさの断片を発生するために必要な
比を決定する。可視できる放射活性バンドの外観を印付
ける第一線の位置は通常比較的シャープであり、容易に
目で観察される。しかしながら、ホスホイメージャーを
用い、ゲルの先端から出発してゲルの下の方へ移動さ
せ、単位面積当たりあるしきい値の放射活性が存在する
各々のレーン中の位置を探し出すことによりそのような
位置をより正確に決定することも可能である。
【０１３７】いくつかのＤＮＡポリメラーゼはジデオキ
シヌクレオチドの取り込みを非常に強く判別するので、
そのような場合は変性ポリアクリルアミドゲル上の最も
大きいジデオキシ停止断片の位置を明瞭に検出できるほ
ど十分なｄｄＮＴＰを反応液に加えるのが困難である。
そのようなＤＮＡポリメラーゼに対しては、異なる系列
中のジデオキシ停止断片の長さを比較するためにアルカ
リ性アガロースゲル電気泳動を使用することができる。
もし変性ポリアクリルアミドゲルを用いるなら、次に同
じような平均長のジデオキシ停止断片の発生させるため
に必要とされる二つのＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴ
Ｐ：ｄＮＴＰの比を決定する別の方法は、一つまたはい
くつかのバンドに焦点を合わせ試験されている二つのＤ
ＮＡポリメラーゼに対しこれらの断片の放射活性の特定
のレベルを得るのに必要なｄｄＮＴＰとｄＮＴＰの比を
ホスホイメージャーにより分析して決定する。
【０１３８】これらの試験は実施例６に記載した六つの
ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施された。反応条件はｄ
ＮＴＰおよびｄｄＮＴＰの濃度を除いて実施例６に記載
した条件と同一である。すべての反応混合物は10μlの
４ｄＮＴＰを含む。四つのｄｄＮＴＰの各々の濃度は六
つのＤＮＡポリメラーゼに対して以下の範囲で２倍ずつ
変化させた：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ Ｆ７６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼＦ６６７Ｙ、0.02μMから1μM、およびＴ７
ＤＮＡポリメラーゼＹ５２６Ｆ、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ100から2,000
μM。実施例６に記載したごとく反応が実施され、試料
は変性ポリアクリルアミドゲルにより分析された。ゲル
の乾燥、オートラジオグラフィーおよびホスホイメージ
ャーは実施例６に記載した通りである。下記の表はこの
実験の結果を要約している；Ｔ７ ＤＮＡポリメラー
ゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７６２ＹおよびＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙに示されている値
はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰを１：１の比で使用して得られ
たジデオキシ停止断片の強度の指数関数的減衰の速度の
統計的分析により実施例６で得られた絶対比である。Ｔ
７ ＤＮＡポリメラーゼＹ５２６Ｆ、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対して
得られた値は各々Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ Ｆ７６２ＹおよびＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼＦ６６７Ｙを用いて発生させた系列と同じ
ような平均長のジデオキシ停止断片の系列を発生させる
のに必要とされるｄｄＮＴＰとｄＮＴＰの比を決定する
ことにより得られた；すなわち、野生型および突然変異
体ＤＮＡポリメラーゼの各々の組に対しジデオキシ停止
断片の同じような分布を与えるｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰ比
が決定された。強く判別する酵素（すなわち、決定的位
置にフェニルアラニンを含むもの）との反応で使用され
るｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰ比を比較的非判別的な酵素（す
なわち、決定的位置にチロシンを含むもの）でジデオキ
シ停止断片の同じような分布を得るために使用されたｄ
ｄＮＴＰ：ｄＮＴＰ比で割ると、同じようなｄＮＴＰの
代わりにｄｄＮＴＰが使用されることにおける二つのＤ
ＮＡポリメラーゼ間の効率の相違に対応する因子を与え
る。この因子は以下にＴ７ ＤＮＡポリメラーゼＹ５２
６Ｆ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼのために示された値を得るために各々Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
Ｆ７６２ＹおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙ
で得られた絶対比が乗ぜられる。
【０１３９】
【表８】 ポリメラーゼ 取り込み速度比 dG/ddG dA/ddA dT/ddT dC/ddC Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ 3.2 3.3 2.8 3.7 Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼＹ５２６Ｆ 6,400 7,300 8,400 11,000 大腸菌 ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｉ 140 720 1,100 250 大腸菌 ＤＮＡ ポリメラーゼＩ Ｆ７６２Ｙ 0.56 0.72 0.54 0.75 Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 1,400 4,700 4,500 2,600 Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼＦ６６７Ｙ 0.45 0.59 0.56 0.32 下記の表はｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰを使用するこ
とに対して、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの決
定的選択性残基のフェニルアラニンの代わりにチロシン
に変えたことの影響を要約している。
【０１４０】
【表９】 残基 平均速度 ｄＮ／ｄｄＮ ｄｄＮＴＰの使用 の改良 Ｔ７ ＤＮＡ チロシン（ＷＴ） ３．０ ３，０００Ｘ ポリメラーゼ フェニルアラニン ８，０００ 大腸菌ＤＮＡ フェニルアラニン（ＷＴ） ６００ ポリメラーゼＩ チロシン ０．６ １，０００Ｘ ＴａｑＤＮＡ フェニルアラニン（ＷＴ） ３．０００ ポリメラーゼ チロシン ０．５ ６，０００Ｘ 新規のＤＮＡポリメラーゼの判別の程度の決定のために
この試験を使うには、最初に広い範囲のｄｄＮＴＰとｄ
ＮＴＰの比を用いて上記の反応が実施され、変性ポリア
クリルアミドゲル上のジデオキシ停止断片の分布が標準
（例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）のものと比較される
であろう。同じような平均の長さのＤＮＡ断片を持つレ
ーンと釣り合わせ、新規ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴ
Ｐ：ｄＮＴＰ比をＴ７ ＤＮＡポリメラーゼで使用され
た比で割るとＴ７ ＤＮＡポリメラーゼと相対的な新規
ＤＮＡポリメラーゼによるｄｄＮＴＰに対する判別の程
度が得られる。
【０１４１】ＤＮＡポリメラーゼの修飾がｄｄＮＴＰを
判別する能力を減少させた（すなわち、ジデオキシヌク
レオチドをより効率よく取り込む）かどうかを決定する
ために本試験を使用するには、同一の単位数の修飾およ
び非修飾ＤＮＡポリメラーゼが上記のｄｄＮＴＰとｄＮ
ＴＰをの種々の比で含む一連の反応で使用されるであろ
う。二つの酵素に対しｄｄＮＴＰとｄＮＴＰが同一の比
でジデオキシ停止断片の平均の長さが比較される。もし
修飾がＤＮＡポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドを
より効率よく取り込む結果を与えるなら、ｄＮＴＰ対ｄ
ｄＮＴＰが同じ比では非修飾ＤＮＡポリメラーゼを使用
した反応のジデオキシ停止断片の平均の長さに比較して
修飾ＤＮＡポリメラーゼを使用したものの方がより短い
であろうし、一方、もし修飾によりＤＮＡポリメラーゼ
がｄｄＮＴＰをより判別するようになるなら修飾ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いた反応で平均の長さがより長くなる
であろう。
【０１４２】この試験はＤＮＡポリメラーゼの修飾でｄ
ｄＮＴＰ類似体（例えば、蛍光標識を付けたｄｄＮＴ
Ｐ）を判別する能力が減少したかどうかを決定するため
にも使用できる。この試験は試験されている類似体の濃
度が解っていなくても可能である。この例として四つの
ダイデオキシターミネーター（DyeDeoxy Terminators、
Applied Biosystemsにより製造されている、部品番号40
1150）の各々の使用におけるＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙの能力
を比較した。これらのダイデオキシターミネーターは四
つのｄｄＮＴＰの各々に共有結合で結合された四つの異
なる蛍光発色団を持っている（より詳細には実施例１２
参照）。四つのダイデオキシターミネーターの各々に対
し、ダイデオキシターミネーターに対するｄＮＴＰの比
を２倍づつ１６０００倍の範囲に渡って変化させ、ジデ
オキシ停止断片の同一の平均の長さが得られる二つの酵
素の各々に必要とされる比を決定するためオートラジオ
グラムのジデオキシ停止断片のパターンを比較する。下
記の表はこれらの結果を要約している。各々のターミネ
ーターにおいて”比”と記されている欄は、Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ対Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６
７Ｙで同一の平均の長さの断片を与えるのに必要とされ
るｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの比を表している。通常
のｄｄＮＴＰのごとく、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ
６６７Ｙは非修飾Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが行うよ
りもより効率的に（少なくとも４００倍）蛍光ｄｄＮＴ
Ｐ誘導体を取り込む。
【０１４３】
【表１０】 ダイデオキシターミネーター 比 Ｇ ターミネーター ＞４００ Ａ ターミネーター ＞２，０００ Ｔ ターミネーター ＞２，０００ Ｃ ターミネーター ＞２，０００ 前に議論したように、使用しているＤＮＡポリメラーゼ
が付随するエキソヌクレアーゼ活性を持っている場合、
この試験の使用において一つの複雑な問題が生じる。5'
から3'へのおよび3'から5'へのエキソヌクレアーゼが起
こす問題、およびそれらの影響を最小にする方法は実施
例６に議論されている。ポリメラーゼの修飾がジデオキ
シヌクレオチドを取り込むその能力を減少させるかどう
かを決定するための試験を行う場合、この効果を持つこ
とができる一組の突然変異体は正常では非常に活性な3'
から5'へのエキソヌクレアーゼ活性を不活性にするもの
である（例えば、TaborRichardson 84,Proc.Natl.Acad.
Sci.4767,1987参照）。この突然変異体の組は本特許で
は特許請求されていない。もしジデオキシヌクレオチド
を取り込むＤＮＡポリメラーゼの能力の明かな増強を与
える修飾ＤＮＡポリメラーゼを持っているならば、それ
がポリメラーゼ領域にあるかまたはエキソヌクレアーゼ
領域にあるかを決定することが望まれ、それは酵素の修
飾型および非修飾型でエキソヌクレアーゼアッセイを実
施することが必要である；酵素のエキソヌクレアーゼ活
性に基本的に影響を及ぼす突然変異は酵素のポリメラー
ゼ活性よりもエキソヌクレアーゼ活性により大きな影響
を与えるであろう。好適には、32Ｐ−ｄｄＡＭＰで３’
末端が標識されたＤＮＡ基質でエキソヌクレアーゼ活性
が測定されるであろう（実施例２１参照）。実施例６の
ように、ＤＮＡポリメラーゼによる見かけのｄｄＮＴＰ
判別増加を避けるため、これらの反応における加ピロリ
ン酸分解を阻害することが重要である。これは反応にピ
ロホスファターゼを含ませることにより容易に達成され
る。
【０１４４】実施例８．一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ−非標識４
０−ｍｅｒプライマー複合体上のＤＮＡ合成の阻害によ
るジデオキシヌクレオチドの取り込み効率の決定 本実施例においてはｄｄＮＴＰに対するＤＮＡポリメラ
ーゼの感度が標準ＤＮＡ合成反応を阻害する種々の濃度
でのｄｄＮＴＰの能力を測定することにより決定され
た。ＤＮＡ合成アッセイはTaborおよびRichardson 264
J.Biol.Chem. 6447,1989に記載されている方法を改良し
たものである。４０−ｍｅｒプライマーおよびＭ１３ｍ
ＧＰ１−２テンプレートは実施例３に記載した通りであ
る。2μgのＭ１３ｍＧＰ１−２ＤＮＡ、6ピコモルのプ
ライマー（テンプレートに対し１０倍モル過剰）、40mM
トリスＨＣｌ,pH8.0、10mM ＭｇＣｌ2、100mM ＮａＣｌ
を含む反応混合物中で（1X=25μl）プライマーがＭ１３
ｍＧＰ１−２一本鎖ＤＮＡテンプレートにアニールされ
た。混合物は６５℃で２分間インキュベートした後３０
分以上かけて室温まで冷却した。標準反応混合物（45μ
l）は22mMトリスＨＣｌ,pH8.0、5.5mM ＭｇＣｌ2、55mM
ＮａＣｌ、300μM ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよ
び［3Ｈ］ＴＴＰ（30cpm/pmol）、および四つのｄｄＮ
ＴＰの一つまたは四つのｄｄＮＴＰすべてを含む。反応
混合物はまた、ＤＮＡポリメラーゼによる見かけの判別
の増加を起こす加ピロリン酸分解を阻害するために10ng
の酵母無機ピロホスファターゼも含む（TaborおよびRic
hardson 265 J.Biol.Chem. 8322,1990）。混合物は３７
℃で１分間（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７０℃）イ
ンキュベートし、20mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mM ２−
メルカプトエタノールおよび0.05%ウシ血清アルブミン
に希釈した試験ＤＮＡポリメラーゼの希釈液（0.01から
1単位）の5μlを添加することにより反応を開始させ
た。反応混合物はさらに３７℃で１０分間（好熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼでは７０℃）インキュベートする。5μl
の100mMＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、45μlを
Whatman DE81フィルターディスク上へスポットする。デ
ィスクは150mlの0.3Mギ酸アンモニウム（pH8.0）で４
回、続いて100mMの90%エタノールで２回洗浄する（各々
５−１０分）。次にディスクをランプ下で乾燥させ、5m
lのfluor（Opti-Fluor O,Packard）存在下シンチレーシ
ョンカウンターで計数する。各々のディスク上の放射活
性の量から全ＤＮＡ合成量を計算する。
【０１４５】試験される特定のＤＮＡポリメラーゼは上
に示唆した以外の最適の緩衝液、ｐＨ、塩または温度条
件を持っているであろう。各々のＤＮＡポリメラーゼは
その酵素に最適の特異的ポリメラーゼ活性を与える条件
下で試験されなければならない。
【０１４６】ＤＮＡポリメラーゼの修飾がジデオキシヌ
クレオチドを判別する能力を減少させるかどうかを決定
するには、最初にｄｄＮＴＰ非存在下、酵素の修飾およ
び非修飾型の両方で活性が酵素濃度とほとんど直線的に
変化するような範囲を決定するためＤＮＡポリメラーゼ
濃度を変化させて一連の反応が実施される。酵素濃度は
酵素の両方の形に対しこの直線範囲にあるように選択さ
れる；例えば、約３０％のテンプレートが１０分で複製
されるような酵素濃度はそのような直線範囲に入ってい
るであろう。
【０１４７】適当な酵素濃度が選択されたら、ＤＮＡ合
成の５０％を阻害するのに必要とされる濃度を決定する
ために一つのｄｄＮＴＰまたは好適には四つすべてのｄ
ｄＮＴＰの量を変化させて一連の反応を実施する。例え
ば上記の条件下（300μM、４ｄＮＴＰ）、下記の濃度の
４ｄｄＮＴＰの混合物が下記の六つのＤＮＡポリメラー
ゼに対してのＤＮＡ合成の５０％阻害に必要とされた。
【０１４８】
【表１１】 ポリメラーゼ ［４ｄｄＮＴＰ］ ５０％阻害 Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．１μＭ Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｙ５２６Ｆ ３００μＭ 大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｉ ２０μＭ 大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｉ Ｆ７６２Ｙ ０．０４μＭ ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ １５０μＭ ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ Ｆ６６７Ｙ ０．４μＭ この試験は新規ＤＮＡポリメラーゼの修飾がｄｄＮＴＰ
を判別する能力を減少させるかどうかを決定するために
使用できる；もし突然変異がこの効果を示さないなら
ば、上記のアッセイ中のＤＮＡ合成の５０％阻害に４ｄ
ｄＮＴＰのより高い濃度が必要とされるであろう。
【０１４９】実施例９．合成プライマー−テンプレート
複合体への［ａ−32Ｐ］ｄＡＭＰ取り込みの測定による
ジデオキシヌクレオチド取り込み効率の決定 この実施例においては合成プライマー−テンプレート内
の一つの部位での取り込みによりｄＮＴＰおよびｄｄＮ
ＴＰ間の競合がアッセイされる。このアッセイは判別に
おける配列特異的変異による複雑化を避けるため、一つ
の部位への二つの基質の取り込みの比較に制限するとい
う点で他のアッセイと異なる。この比較的単純なアッセ
イはＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴＰ判別能力の予備的
なスクリーニングに適しているが、ｄｄＮＴＰの判別は
しばしばＤＮＡ配列分析における重要な問題である隣接
する配列による影響を強く受けるので（例えば、Tabor
およびRichardson 265 J.Biol.Chem. 8322,1990参
照）、実施例６−８に示されたアッセイの排除に使用さ
れるべきではない。
【０１５０】次に示した二つのプライマー−テンプレー
トがこの実施例で用いられた。最初のものはｄＡＴＰ対
ｄｄＡＴＰ間の判別の決定に使用され；一方、第二のも
のはｄＣＴＰ対ｄｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ対ｄｄＴＴＰおよ
びｄＧＴＰ対ｄｄＧＴＰ間の判別の決定に使用される。
【０１５１】
【表１２】 プライマー−テンプレート Ａ： ５’ GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA ３’ ３’ GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC ５’ プライマー−テンプレート Ｂ： ５’ GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA ３’ ３’ GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTCAGTTTT ５’ 各々の反応混合物は各々２５ピコモルのプライマーおよ
びテンプレートを含む。プライマーおよびテンプレート
は一緒に混合され40mMトリスＨＣｌ,pH8.0、10mM Ｍｇ
Ｃｌ2、100mM ＮａＣｌを含む反応混合物中で（1X=10μ
l）アニール化された。混合物は６５℃で２分間インキ
ュベートし、３０分以上かけて室温まで冷却した。プラ
イマー−テンプレートＡで反応を実施するための標準反
応混合物（45μl）は22mMトリスＨＣｌ,pH8.0、5.5mM
ＭｇＣｌ2、55mM ＮａＣｌ、25ピコモルのプライマー−
テンプレートＡ複合体、5μM［ａ−32Ｐ］ｄＧＴＰ（4,
000cpm/ピコモル）および濃度を変化させたｄＡＴＰお
よびｄｄＡＴＰを含む。反応混合物はまた、ＤＮＡポリ
メラーゼによる見かけの判別の増加を起こす加ピロリン
酸分解を阻害するために10ngの酵母無機ピロホスファタ
ーゼも含む（TaborおよびRichardson 265 J.Biol.Chem.
8322,1990）。混合物は３７℃で１分間（好熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼでは７０℃）インキュベートし、20mMトリ
スＨＣｌ,pH7.5、10mM ２−メルカプトエタノールおよ
び0.05%ウシ血清アルブミンに希釈した試験ＤＮＡポリ
メラーゼの希釈液（0.01から1単位）の5μlを添加する
ことにより反応を開始させた。反応混合物はさらに３７
℃で１０分間（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７０℃）
インキュベートする。5μlの100mMＥＤＴＡの添加によ
り反応を停止させ、45μlをWhatman DE81フィルターデ
ィスク上へスポットする。ディスクは150mlの0.3Mギ酸
アンモニウム（pH8.0）で４回、続いて100mMの90%エタ
ノールで２回洗浄する（各々５−１０分）。次にディス
クをランプ下で乾燥させ、5mlのfluor（Opti-Fluor O,P
ackard）存在下シンチレーションカウンターで計数す
る。各々のディスク上の放射活性の量から取り込まれた
［32Ｐ］ｄＧＭＰ量が決定された。一度一つのｄＡＭＰ
残基が取り込まれたらｄＧＭＰ残基の取り込みのための
阻害が取り除かれ、四つの［32Ｐ］ｄＧＭＰが各々のプ
ライマーに取り込まれるであろうことが仮定され、従っ
て取り込まれたｄＡＭＰの数は取り込まれたｄＧＭＰの
数の４分の１である。
【０１５２】すべての反応は分析するＤＮＡポリメラー
ゼを一定の量にして実施される；ＤＮＡポリメラーゼの
量は10μMのｄＡＴＰ存在下およびｄｄＡＴＰ非存在下
での１０分のインキュベーションによりテンプレートの
一本鎖領域中の全ｄＣＭＰ残基の５０％を複製するのに
十分な量でなければならない。試験される特定のＤＮＡ
ポリメラーゼは上に示唆した条件と異なる最適の緩衝
液、ｐＨ、塩または温度条件をもっているであろう。各
々のＤＮＡポリメラーゼはその酵素に最適な特定のポリ
メラーゼ活性を与える条件下で試験されなければならな
い。対照反応もｄＡＴＰおよびｄｄＡＴＰ非存在下で実
施されなければならない；これにより各々の試料から差
し引かれるバックグラウンドＤＮＡ合成が決められる。
これは一般にｄＡＴＰ存在下で得られるＤＮＡ合成の１
０％未満である。
【０１５３】ＤＮＡ合成を５０％阻害するのに必要とさ
れるｄｄＡＴＰ量を決定するため、10μM ｄＡＴＰおよ
び種々の濃度のｄｄＡＴＰで反応が実施される。10μM
ｄＡＴＰ存在下ＤＮＡ合成を５０％阻害するのに必要と
されるｄｄＡＴＰ濃度の例が下記の表に示されている。
ポリメラーゼは実施例６に記載した通りである。
【０１５４】
【表１３】 ポリメラーゼ ［ｄｄＡＴＰ］ ５０％阻害 Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ 〜３０μＭ Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｙ５２６Ｆ ＞５００μＭ 大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｉ ＞５００μＭ 大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｉ Ｆ７６２Ｙ 〜６μＭ ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ ＞５００μＭ ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ Ｆ６６７Ｙ 〜５μＭ ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰの判別を測定
するための類似の試験を実施するには、上記の反応と同
一の反応が実施されるが、ただしプライマー−テンプレ
ートＡの代わりにプライマー−テンプレートＢが使用さ
れ、反応液は10μMのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴ
Ｐおよび5μMの［ａ−32Ｐ］ｄＡＴＰ（4,000cpm／ピコ
モル）および濃度を変化させたｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ
またはｄｄＣＴＰを含む。
【０１５５】他の実施例同様に、3'から5'へのエキソヌ
クレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼはこのアッセ
イを妨害し、類似体の取り込みレベルでの判別によるも
のよりも酵素のｄｄＮＴＰに対する判別性を高める。さ
らに、高レベルのエキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素は
反応混合物中のすべてのｄＮＴＰを消費してしまい（特
に、これらの反応において比較的低い濃度でｄＮＴＰが
存在する場合）正味のＤＮＡ合成が起こらなくなる（例
えば、天然のＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、TaborおよびR
ichardson 264 J.Biol.Chem.6447,1989参照）。これら
の場合においてＤＮＡポリメラーゼの濃度および反応の
インキュベーション時間はｄｄＮＴＰ非存在下でのＤＮ
Ａ合成が最大のレベルで得られるように調整されていな
ければならない。
【０１５６】実施例１０．合成プライマー−テンプレー
ト複合体への［ａ−32Ｐ］ｄｄＮＭＰ取り込み効率の決
定 この実施例においては合成プライマー−テンプレート中
の一つの部位での取り込みについてｄＮＴＰおよびｄｄ
ＮＴＰ間の競合がアッセイされる。このアッセイは標識
が［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴＰであり、従ってｄｄＡＭＰの
取り込みが測定されているという点で実施例９と異な
る。このアッセイはｄｄＮＴＰがプライマーの３’末端
内へ取り込まれ鎖停止剤として作用し、または単にＤＮ
Ａポリメラーゼに結合して実際にプライマー内に取り込
まれることなく更なるＤＮＡ合成を妨害することにより
ＤＮＡポリメラーゼを阻害するかどうかの試験に使用す
ることができる。
【０１５７】以下の実施例においてｄｄＡＭＰの取り込
みは［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴＰおよびプライマー−テンプ
レートＡ（実施例９）を使用して測定される：
【表１４】 プライマーテンプレート Ａ： ５’ GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA ３’ ３’ GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC ５’ ［ａ−32Ｐ］ｄｄＧＭＰ、［ａ−32Ｐ］ｄｄＣＭＰおよ
び［ａ−32Ｐ］ｄｄＴＭＰの取り込みも同様に適当なテ
ンプレート（例えば、実施例９のプライマー−テンプレ
ートＢ）で試験できる。
【０１５８】各々の反応混合物は各々２５ピコモルのプ
ライマーおよびテンプレートを含む（プライマー−テン
プレートＡ、上記参照）。プライマーおよびテンプレー
トは一緒に混合され40mMトリスＨＣｌ,pH8.0、10mM Ｍ
ｇＣｌ2、100mM ＮａＣｌを含む反応混合物中で（1X=10
μl）アニールされた。混合物は６５℃で２分間インキ
ュベートし、３０分以上かけて室温まで冷却する。標準
反応混合物（45μl）は22mMトリスＨＣｌ,pH8.0、5.5mM
ＭｇＣｌ2、55mM ＮａＣｌ、25ピコモルのプライマー
−テンプレートＡ複合体、2.5μM［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴ
Ｐ（非標識ｄｄＡＴＰで4,000cpm/ピコモルの比活性ま
で希釈されたAmersham PB10235、>5,000Ci/ピコモル）
および濃度を変化させたｄｄＡＴＰを含む。反応混合物
はまた、ＤＮＡポリメラーゼによる見かけの判別の増加
を起こす加ピロリン酸分解を阻害するために10ngの酵母
無機ピロホスファターゼも含む（TaborおよびRichardso
n 265J.Biol.Chem. 8322,1990）。混合物は３７℃で１
分間（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７０℃）インキュ
ベートし、20mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mM ２−メルカ
プトエタノールおよび0.05%ウシ血清アルブミンに希釈
した試験ＤＮＡポリメラーゼの希釈液の5μl（0.01から
1単位）を添加することにより反応を開始させた。反応
混合物はさらに３７℃で１０分間（好熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼでは７０℃）インキュベートする。5μlの100mM
ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、45μlをWhatman
DE81フィルターディスク上へスポットする。ディスク
は150mlの0.3Mギ酸アンモニウム（pH8.0）で４回、続い
て100mMの90%エタノールで２回洗浄する（各々５−１０
分）。次にディスクをランプ下で乾燥させ、5mlのfluor
（Opti-Fluor O,Packard）存在下シンチレーションカウ
ンターで計数する。各々のディスク上の放射活性の量か
ら取り込まれた［32Ｐ］ｄｄＡＭＰ量が決定された。
【０１５９】すべての反応は分析するＤＮＡポリメラー
ゼを一定の量にして実施される；ＤＮＡポリメラーゼの
濃度はｄＡＴＰ非存在下１０分間のインキュベーション
でプライマー−テンプレートＡ内への［32Ｐ］ｄｄＡＭ
Ｐの最も高い水準の取り込みを与える濃度でなければな
らない。試験される特定のＤＮＡポリメラーゼは上に示
唆した条件と異なる最適の緩衝液、ｐＨ、塩または温度
条件をもっているであろう。各々のＤＮＡポリメラーゼ
はその酵素に最適な特定のポリメラーゼ活性を与える条
件下で試験されなければならない。
【０１６０】ｄｄＮＴＰの判別レベルの決定にこのアッ
セイを使用するために、反応は2.5μMｄＡＴＰ存在（［
32Ｐ］ｄｄＡＭＰの濃度と当モル）または非存在下、一
定の量のＤＮＡポリメラーゼおよび［32Ｐ］ｄｄＡＴＰ
で実施され、ｄＡＴＰの存在が［32Ｐ］ｄｄＡＭＰの取
り込みに与えた影響が決定される。もしＤＮＡポリメラ
ーゼがｄｄＡＭＰおよびｄＡＭＰの取り込みを判別せ
ず、および3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性を持た
ないとしたら、ｄＡＴＰの添加は［32Ｐ］ｄｄＡＭＰの
取り込みを５０％阻害するであろう。
【０１６１】この試験はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ
６６７ＹのようにｄｄＮＭＰを効率よく取り込むＤＮＡ
ポリメラーゼに最適である。ｄｄＮＭＰを強く判別する
ＤＮＡポリメラーゼには、ｄｄＮＴＰをより高い濃度で
使用できるので標識がｄｄＮＴＰとの競合に使用されて
いるもの以外のｄＮＴＰ内にある前記のアッセイが好適
である。
【０１６２】しかしながら、ｄｄＮＭＰを強く判別する
ＤＮＡポリメラーゼにおいて、もし与えられた突然変異
がｄｄＮＭＰに対する判別レベルを減少させているかど
うかを試験することに関心がある場合には、ｄＡＴＰ非
存在下、この基質で非修飾ＤＮＡポリメラーゼをアッセ
イし（ＤＮＡポリメラーゼ濃度の関数として［32Ｐ］ｄ
ｄＡＭＰの取り込みを測定する）、突然変異体酵素の取
り込み速度とその取り込み速度を比較することによりこ
のアッセイが使用できる。もし突然変異がｄｄＡＴＰに
対する判別を減少させているならば、突然変異体酵素は
［32Ｐ］ｄｄＡＭＰの取り込みに対しより高い比活性を
持っていなければならない。
【０１６３】他の実施例同様に、3'から5'へのエキソヌ
クレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼはこのアッセ
イを妨害し、類似体の取り込みレベルでの判別によるも
のよりも酵素のｄｄＮＴＰに対する判別性を高める。お
よび実施例９のように、高いレベルのエキソヌクレアー
ゼ活性を持つ酵素はすべてのｄＮＴＰを使い果たすこと
ができるので正味の［32Ｐ］ｄｄＡＭＰの取り込みが起
こらない。これらの場合、試験されているＤＮＡポリメ
ラーゼによる［32Ｐ］ｄｄＡＭＰの取り込みの最大水準
が得られるようにＤＮＡポリメラーゼの濃度および反応
のインキュベーション時間を調整しなければならない。
【０１６４】上記のすべての方法は伸長されたプライマ
ーの長さまたはプライマー状のＤＮＡ合成量の検出が放
射活性に基づくものである。ＤＮＡポリメラーゼによる
ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率はまた非放射活
性によっても測定できる。Applied Biosystems モデル
３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシステムで検出する
蛍光プライマーまたは蛍光ダイ−デオキシターミネータ
ーが使用される二つの実施例が以下に示されている。
【０１６５】実施例１１．一本鎖ＤＮＡにアニールされ
た蛍光プライマーおよびゲル電気泳動を用いたジデオキ
シヌクレオチドの取り込み効率の決定 この実施例では蛍光標識プライマーが一本鎖ＤＮＡにア
ニールされ、ＤＮＡ合成反応はｄｄＮＴＰとｄＮＴＰの
種々の比を用いて実施された。試料は次にApplied Bios
ystems モデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシス
テムにかけ、各々の蛍光断片の長さはゲル電気泳動の直
接蛍光検出により決定された。反応はTaborおよびRicha
rdson 265 J.Biol.Chem.8322,1990に記載されているよ
うに実施された。使用されたプライマーは”Ｆａｍ”プ
ライマー（Applied Biosystems）である。使用されたＤ
ＮＡは実施例３に記載したような一本鎖Ｍ１３ｍＧＰ１
−２である。プライマーは2μgのＭ１３ｍＧＰ１−２
ＤＮＡ、5ngのプライマー、40mMトリスＨＣｌ,pH8.0、1
0mM ＭｇＣｌ2、および100mM ＮａＣｌを含む反応混合
物中で（1X=10μl）Ｍ１３ｍＧＰ１−２一本鎖ＤＮＡに
アニールされた。混合物は６５℃で２分間インキュベー
トし、３０分以上かけて室温まで冷却する。標準反応混
合物（18μl）は22mMトリスＨＣｌ,pH8.0、5.5mM Ｍｇ
Ｃｌ2、55mM ＮａＣｌおよび濃度を変化させた４ｄＮＴ
Ｐおよび四つのｄｄＮＴＰの内の一つを含む。反応混合
物はまた、ＤＮＡポリメラーゼによる見かけの判別の増
加を起こす加ピロリン酸分解を阻害するために10ngの酵
母無機ピロホスファターゼも含む（TaborおよびRichard
son 265 J.Biol.Chem. 8322,1990）。混合物は３７℃で
１分間（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７０℃）インキ
ュベートし、20mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mM ２−メル
カプトエタノールおよび0.05%ウシ血清アルブミンに希
釈した試験ＤＮＡポリメラーゼの希釈液の2μl（0.01か
ら1単位）を添加することにより反応を開始させた。反
応混合物はさらに３７℃で１０分間（好熱性ＤＮＡポリ
メラーゼでは７０℃）インキュベートする。反応液に8
μlの20mM ＤＴＰＡ、1M酢酸カリウム,pH5.0および60μ
lのエタノールを加える。遠心分離後、ＤＮＡを6μlの8
0%ホルムアミド、10mMトリスＨＣｌ,pH8.0および1mM Ｅ
ＤＴＡに再懸濁し、使用説明書に従ってApplied Biosys
tems モデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシステ
ムにかける直前に８０℃に２分間加熱する。
【０１６６】試験される特定のＤＮＡポリメラーゼは上
に示唆した条件と異なる最適の緩衝液、ｐＨ、塩または
温度条件をもっているであろう。各々のＤＮＡポリメラ
ーゼはその酵素に最適な特定のポリメラーゼ活性を与え
る条件下で試験されなければならない。ＤＮＡポリメラ
ーゼの濃度は１０分間の反応でジデオキシヌクレオチド
が取り込まれるまでほとんどのプライマーが少なくとも
数百ヌクレオチド伸長されるのに十分なほどでなければ
ならない。
【０１６７】ｄｄＮＴＰに対するｄＮＴＰの比は約３０
０塩基に最適のピーク強度が得られるように調節され
る。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対しては約
10μMの４ｄＮＴＰおよび200-600μMのｄｄＮＴＰが最
適であり、一方Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙ
に対しては300μMの４ｄＮＴＰおよび0.5-5μMのｄｄＮ
ＴＰが最適である。
【０１６８】ＤＮＡポリメラーゼの修飾がジデオキシヌ
クレオチドを判別する能力を減少させているかどうかを
決定するには、非修飾および修飾ＤＮＡポリメラーゼの
両方に対してｄｄＮＴＰに対するｄＮＴＰの割合を変化
させて反応を実施しなければならず、修飾ＤＮＡポリメ
ラーゼが非修飾酵素よりｄｄＮＴＰをより効率的に利用
しているかどうかを決定するために異なる長さのジデオ
キシ停止断片の強度が比較される。
【０１６９】実施例１２．ゲル電気泳動による蛍光ジデ
オキシヌクレオチドの取り込み効率の決定 この実施例においては非蛍光プライマーが一本鎖ＤＮＡ
にアニールされ、ＤＮＡ合成反応が単一の蛍光標識ｄｄ
ＮＴＰに種々の割合のｄＮＴＰを用いて実施される。試
料は次にApplied Biosystems モデル３７３Ａ ＤＮＡ
シークエンシングシステムにかけ、各々の蛍光断片の長
さはゲル電気泳動の直接蛍光検出により決定された。本
実施例で使用されたプライマーは実施例３に記載したよ
うな４０−ｍｅｒであり、テンプレートは実施例３に記
載したような一本鎖Ｍ１３ｍＧＰ１−２である。プライ
マーは2μgのＭ１３ｍＧＰ１−２ ＤＮＡ、6ピコモルの
プライマー（テンプレートの１０倍モル過剰）、40mMト
リスＨＣｌ,pH8.0、10mMＭｇＣｌ2、および100mM Ｎａ
Ｃｌを含む反応混合物中で（1X=10μl）Ｍ１３ｍＧＰ１
−２一本鎖ＤＮＡテンプレートにアニールされた。混合
物は６５℃で２分間インキュベートし、３０分以上かけ
て室温まで冷却する。標準反応混合物（18μl）は22mM
トリスＨＣｌ,pH8.0、5.5mM ＭｇＣｌ2、55mM ＮａＣｌ
および濃度を変化させた４ｄＮＴＰおよび四つの蛍光標
識ｄｄＮＴＰの内の一つを含む。四つの蛍光標識ｄｄＮ
ＴＰはApplied Biosysytemsからのもので（Ｔａｑダイ
デオキシターミネーターサイクルシークエンシングキッ
ト、部品番号401150）、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ”ダイデオ
キシターミネーター”と称されている（Ｔａｑダイデオ
キシターミネーターサイクルシークエンシングキットの
ためのマニュアル、部品番号901497、Rev.E）。反応混
合物はまた、ＤＮＡポリメラーゼによる見かけの判別の
増加を起こす加ピロリン酸分解を阻害するために10ngの
酵母無機ピロホスファターゼも含む（TaborおよびRicha
rdson 265 J.Biol.Chem. 8322,1990）。混合物は３７℃
で１分間（好熱性ＤＮＡポリメラーゼでは７０℃）イン
キュベートし、20mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mM ２−メ
ルカプトエタノールおよび0.05%ウシ血清アルブミンに
希釈した試験ＤＮＡポリメラーゼの希釈液の2μl（0.01
から1単位）を添加することにより反応を開始させた。
反応混合物はさらに３７℃で１０分間（好熱性ＤＮＡポ
リメラーゼでは７０℃）インキュベートする。反応液に
8μlの20mM ＥＤＴＡ、1M酢酸カリウム,pH5.0および60
μlのエタノールを加える。遠心分離後、ＤＮＡを6μl
の80%ホルムアミド、10mMトリスＨＣｌ,pH8.0および1mM
ＤＴＰＡに再懸濁し、使用説明書に従ってApplied Bio
systems モデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシス
テムにかける直前に８０℃に２分間加熱する。
【０１７０】試験される特定のＤＮＡポリメラーゼは上
に示唆した条件と異なる最適の緩衝液、ｐＨ、塩または
温度条件をもっているであろう。各々のＤＮＡポリメラ
ーゼはその酵素に最適な特定のポリメラーゼ活性を与え
る条件下で試験されなければならない。これらの反応で
使用されるＤＮＡポリメラーゼの濃度は１０分間の反応
でジデオキシヌクレオチドが取り込まれるまでほとんど
のプライマーが少なくとも数百ヌクレオチド伸長される
のに十分な濃度でなければならない。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼのように5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性
を持つＤＮＡポリメラーゼに対しては、断片の5'末端を
有意のパーセントで分解するこの活性を避けるためにＤ
ＮＡポリメラーゼの濃度を十分に低く保たなければなら
ない。
【０１７１】ＤＮＡポリメラーゼが蛍光ｄｄＮＴＰを強
くまたは弱く判別するかどうかを決定するために、20μ
Mの４ｄＮＴＰおよび0.01μlのApplied Biosystemsによ
り提供されている各々のダイデオキシターミネーター
（商品番号401150）を用いて反応が実施された。Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼがこれらの条件下で使用された場
合、蛍光のほとんどはゲルの先端の取り込まれていない
ダイ−ｄｄＮＴＰ中かまたは数百の塩基の長さより大き
い断片中にある。対照的に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼＦ６６７Ｙがこれらの条件下で使用された場合、蛍光
のほとんどは数百の塩基の長さ未満の断片中にあり、お
よびゲルの先端の全蛍光の著しく低いパーセントしか取
り込まれていないダイ−ｄｄＮＴＰに存在しなかった。
【０１７２】ＤＮＡポリメラーゼの修飾がジデオキシヌ
クレオチドを判別する能力を減少させているかどうかを
決定するには、非修飾および修飾ＤＮＡポリメラーゼの
両方に対してダイデオキシターミネーターに対するｄＮ
ＴＰの割合を変化させて反応が実施され、修飾ＤＮＡポ
リメラーゼが非修飾酵素よりダイデオキシターミネータ
ーをより効率的に使用しているかを決定するために得ら
れた蛍光断片の平均の長さが比較された。
【０１７３】以下の実施例は異なるＤＮＡポリメラーゼ
により合成されたジデオキシ停止断片から作り出される
バンド強度の均一性を試験するために提供されるもので
ある。実施例１３．一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ−５’32Ｐ−標
識４０−ｍｅｒ複合体およびゲル電気泳動を用いるジデ
オキシヌクレオチド取り込みの均一性の決定 この実施例ではジデオキシヌクレオチド取り込みの均一
性が一本鎖Ｍ１３ＤＮＡテンプレートで伸長された５’
32Ｐ−末端標識プライマーで測定される。三つの活性が
ジデオキシ停止断片のバンド強度の変異を起こすことが
できる。一つはエキソヌクレアーゼ活性であり、いくつ
かの配列では優先的である；これは化学的または遺伝学
的手段により選択的に活性を除去することにより避けら
れる（例えば、TaborおよびRichardson 264 J.Biol.Che
m.6447,1989参照）。第二は加ピロリン酸分解であり；
これはＤＮＡ合成の間に蓄積され、加ピロリン酸分解に
必要な基質であるピロリン酸を分解するピロホスファタ
ーゼを反応混合物中に含ませることにより容易に避ける
ことができる。第三はジデオキシヌクレオチドの取り込
みにおける配列特異的変異である。バンド強度の変異は
ＤＮＡ配列分析に有害であり、決定されるＤＮＡ配列の
正確性を減少させる。この試験はジデオキシヌクレオチ
ドをより効率的に取り込むであろう突然変異体ＤＮＡポ
リメラーゼを含む異なるＤＮＡポリメラーゼにより合成
された断片中のバンド強度の変異性の程度を比較するた
めに計画された。
【０１７４】プライマー、テンプレートおよび反応条件
は実施例６および７に記載したものと同一である。テン
プレートは実施例３に記載されているＭ１３ ｍＧＰ１
−２一本鎖ＤＮＡであり、プライマーはまた実施例３に
記載されている４０−ｍｅｒである。使用された反応条
件は、緩衝液、ｐＨ、塩および反応温度に関して試験さ
れるＤＮＡポリメラーゼに最適な条件である。マグネシ
ウムが反応混合物中に存在する唯一の金属イオンである
ことが好適である（すなわち、反応はマンガンを添加せ
ずに実施される）。ＤＮＡポリメラーゼの濃度はプライ
マーのほとんどが１０分の反応で伸長され、ジデオキシ
ヌクレオチドの取り込みにより停止されるように選ばれ
る。ｄｄＮＴＰに対するｄＮＴＰの割合は試験される特
定のＤＮＡポリメラーゼに対し平均断片サイズが約１０
０−３００ヌクレオチドであるように調節される。ｄｄ
ＣＴＰジデオキシヌクレオチドで停止される断片は強度
の最も大きな変異を持つ傾向があるので均一性の試験に
使用するにはｄｄＣＴＰが好適なｄｄＮＴＰである。
（例えば、TaborおよびRichardson 86 Proc.Natl.Aca d.
Sci.4076,1989参照）。ゲル電気泳動、オートラジオグ
ラフィーおよびバンド強度の分析は実施例６に記載した
ようにゲルのスキャンニングかまたはホスホイメージャ
ー分析による。電気泳動は約５５ヌクレオチドの長さの
断片がゲルのボトムにつくまで実施される（色素ブロモ
フェノールブルーがゲルのボトムを通り抜け、および色
素キシレンシアノールがゲルのボトムから約８ｃｍの
所）。
【０１７５】与えられた一連のｄｄＮＭＰ−停止断片
（例えば、一連のｄｄＣＭＰ−停止断片）に対してはゲ
ルのボトムから最初の２０断片が決定された（好適には
ホスホイメージャー分析により）。もしくは、最初の２
０断片の相対的強度を決定するためオートラジオグラム
がイメージングデンシトメーターによりスキャンでき
る。これらの強度は次にその変異性を決定するため実施
例６に記載したごとく統計的に分析される。例えば、そ
の値はマッキントッシュプログラムKaleidograph 3.0版
（Synergy Software）によりプロットできる。得られた
プロットはKaleidograph ライブラリールーチンの機能
を使用して指数関数的減衰曲線に適合される。データの
相関指数Ｒ2はKaleidograph ライブラリールーチンによ
り計算される。これはバンド強度の変異の尺度である。
新規ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＲ2の値が例
えば、マグネシウムまたはマンガン存在下（Taborおよ
びRichardson 265 J.Biol.Chem. 8322,1990参照）の＿
２８Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase Version2.
0, United States Biomchemical Corporation）、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片または突然変異Ｆ
７６２Ｙを持つクレノー断片）またはＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼ（野生型または突然変異体Ｆ６６７Ｙ）など
の既知のＤＮＡポリメラーゼを使用して得られた値と比
較される。これらの既知のＤＮＡポリメラーゼで得られ
たＲ2値は標準値として使用され、それにより新規ＤＮ
Ａポリメラーゼの均一性が比較される。
【０１７６】実施例１４．一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡ−非標
識プライマーおよびゲル電気泳動を用いた［ａ−32Ｐ］
ｄｄＮＭＰ取り込みの均一性の決定 この実施例ではジデオキシヌクレオチド取り込みの均一
性が一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡテンプレートにアニールされ
た非標識プライマーを使用し、ＤＮＡ合成を［ａ−
32Ｐ］ｄｄＡＴＰ存在下で実施して測定される。大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼお
よびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼＹ５２６Ｆのようにｄｄ
ＮＴＰを強く判別する酵素の使用においては必要とされ
るｄｄＮＴＰの高い濃度を使用しなければならず、ジデ
オキシヌクレオチド停止断片の均一性の測定には実施例
１３に記載した試験が好適である。この実施例の試験は
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
Ｆ７６２ＹおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦ６６７
Ｙのようにジデオキシヌクレオチドを効率よく取り込む
酵素での使用には最適である。
【０１７７】この実施例のプライマー、テンプレートお
よび一般的反応は以下の例外を除いて実施例８に記載し
たものと同じである。テンプレートは実施例３に記載し
たＭ１３ ｍＧＰ１−２一本鎖ＤＮＡであり、プライマ
ーは同様に実施例３に記載した４０−ｍｅｒである。使
用される反応条件は緩衝液、ｐＨ、塩および反応温度に
関して試験されるＤＮＡポリメラーゼに最適のものであ
る。マグネシウムが唯一の金属イオンとして反応混合物
に存在することが好適である（すなわち、反応はマンガ
ンを添加せずに実施される）。反応は50μMのｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、および濃度を変化させた
ｄＡＴＰおよび［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴＰで実施される。
ｄＡＴＰおよび［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴＰの濃度は約１０
０ヌクレオチドの長さの断片の放射活性の量が最大にな
るように選択される。ゲル電気泳動および放射活性断片
の分析に関するすべての他の面は実施例１３に記載した
通りである。
【０１７８】実施例１５．一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡ−蛍光
標識プライマー複合体およびゲル電気泳動を用いるジデ
オキシヌクレオチド取り込みの均一性の決定 この実施例においては、反応は実施例１１に記載したご
とく実施される。テンプレートは実施例３に記載したＭ
１３ ｍＧＰ１−２一本鎖ＤＮＡであり、プライマーは
同様に実施例３に記載した４０−ｍｅｒである。使用さ
れる反応条件は緩衝液、ｐＨ、塩および反応温度に関し
て試験されるＤＮＡポリメラーゼに最適のものである。
マグネシウムが唯一の金属イオンとして反応混合物に存
在することが好適である（すなわち、反応はマンガンを
添加せずに実施される）。ＤＮＡポリメラーゼの濃度は
プライマーのほとんどが１０分の反応で伸長され、およ
びジデオキシヌクレオチドの取り込みにより停止される
ように選択される。ｄｄＮＴＰに対するｄＮＴＰの割合
は、試験される特定のＤＮＡポリメラーゼに対して平均
断片サイズが約１００−２００ヌクレオチドになるよう
に調節される。ｄｄＣＴＰジデオキシヌクレオチドで停
止される断片は強度の最も大きな変異を持つ傾向がある
ので均一性の試験に使用するにはｄｄＣＴＰが好適なｄ
ｄＮＴＰである。（例えば、TaborおよびRichardson 86
Proc.Natl.Acad.Sci.4076,1989参照）。プライマーか
らの最初の５０までのジデオキシ停止断片（約２００ヌ
クレオチド）の強度が決定され、実施例１３に記載した
ごとく統計的に分析された。試験されるＤＮＡポリメラ
ーゼについて相関指数Ｒ2が決定され、実施例１３に記
載されるような既知のＤＮＡポリメラーゼで得られた値
と比較される。もしくは、最初の５０のバンドの高さが
決定され、隣接するバンドの高さの比が計算されて変異
性の測定に使用された；試験されるＤＮＡポリメラーゼ
で実施された反応から得られるこれらの比の最大値およ
び平均値が実施例１３に記載したような既知のＤＮＡポ
リメラーゼを用いて実施した反応から得られた値と比較
される。
【０１７９】実施例１６．ゲル電気泳動による蛍光ジデ
オキシヌクレオチド取り込みの均一性の決定 この実施例においては、反応は実施例１２に記載したご
とく実施される。特定のＤＮＡポリメラーゼにおいての
ダイデオキシターミネーター取り込みの均一性を決定す
るため、ｄＮＴＰおよび特定のダイデオキシターミネー
ターの濃度は平均１００−２００ヌクレオチド長の蛍光
標識断片が得られるように選択された。蛍光の強度はプ
ライマーから１０−４０の断片で決定された（蛍光標識
プライマーに近い最初の１０断片は無視された）。断片
は実施例１３に記載したごとく統計的に分析され、平均
変異性が指数関数的減衰曲線に合わせられたデータの相
関指数Ｒ2が決定された。得られたＲ2の値は実施例１３
に記載したように既知のＤＮＡポリメラーゼを用いて得
られた値と比較される。ＤＮＡポリメラーゼ内の特定の
突然変異がより少ない変異性を持つバンドを生成するよ
うなＤＮＡポリメラーゼを与えるかどうかを決定するに
は、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼで得られたＲ2値を
非修飾ＤＮＡポリメラーゼで得られた値と比較する。
【０１８０】実施例１７．効率よくジデオキシヌクレオ
チドを取り込むＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ配
列分析 本発明のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列分析は、
電気泳動による分離に適した平均長のジデオキシ停止断
片が得られるように調節したｄｄＮＴＰに対するｄＮＴ
Ｐの割合を用い、標準法で実施された。大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩの大フラグメント内の突然変異体”クレノ
ー断片Ｆ７６２Ｙ”については、反応は本質的に修飾Ｔ
７ ＤＮＡポリメラーゼと同じように実施され、Tabor
およびRichardson 米国特許第4,795,699号、Taborおよ
びRichardson 86 Proc.Natl.Acad. Sci.USA 4767,1987お
よびSEQUENASEマニュアル”SEQUENASEを用いるＤＮＡシ
ークエンシングのための段階的プロトコール”第３版、
United States Biomchemical Corporationに記載されて
いる。クレノー断片Ｆ７６２Ｙは修飾Ｔ７ ＤＮＡポリ
メラーゼよりジデオキシヌクレオチドを約５倍効率的に
取り込むので、伸長−停止混合物中のｄｄＮＴＰ濃度を
修飾Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼで推奨されている標準混
合物（Sequenaseマニュアル、上記文献）と比較して５
分の１に減少させなければならない。
【０１８１】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙの
ような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列分
析はInnis et al. 85, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9436,1
988により記載されているが、以下の改良を行った。Inn
isらは１：６ｄＧＴＰ：ｄｄＧＴＰ、１：３２ｄＡＴ
Ｐ：ｄｄＡＴＰ、１：４８ｄＴＴＰ：ｄｄＴＴＰおよび
１：１６ｄＣＴＰ：ｄｄＣＴＰのｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ
比を推奨しているが、これらの比は野生型Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼと比較してＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
Ｆ６６７Ｙによる４ｄｄＮＴＰの使用が３，０００−
８，０００倍より効率的であることを考えにいれて調節
しなければならない。したがって、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼＦ６６７Ｙによる伸長−停止反応は100μMの４ｄ
ＮＴＰおよび0.1-5μMの四つのｄｄＮＴＰの各々を含ま
なければならない；ｄｄＮＴＰ各々の正確な量はＤＮＡ
配列の最適な決定のために望ましい平均断片サイズに基
づいて調節される。ＤＮＡシークエンシング反応のその
他の面はおよび変性ゲル電気泳動はInnisら（上記文
献）に記載されているとおりである。
【０１８２】実施例１８．ジデオキシヌクレオチドを効
率よく取り込む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるサ
イクルＤＮＡ配列分析 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙのような熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼによるサイクルＤＮＡシークエン
シングはCarothers et al. 7 BioTechniques 494,1987
に記載されているように実施されるが、ただし：（１）
四つのデオキシ／ジデオキシ混合物は250μMの四つすべ
てのｄＮＴＰおよび0.1-10μMの各々のｄｄＧＴＰ、ｄ
ｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰを含み、各々の
ｄｄＮＴＰの正確な量はＤＮＡ配列の最適な決定のため
に望ましい平均断片サイズに基づいて経験的に調節され
る。（２）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの代わりにＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙが使用される；Caroth
ers et al.（上記文献）により推奨されているものと同
じ単位数のＤＮＡポリメラーゼを使用する。（３）特定
の配列でのＤＮＡポリメラーゼによる見かけの判別を増
加させることができる加ピロリン酸分解（バンド強度の
均一性を減少させる、TaborおよびRichardson 265 J.Bi
ol.Chem. 8322,1990）を阻害するために反応混合物は10
ngの無機ピロホスファターゼを含む。好適にはこのピロ
ホスファターゼは例えばテルムステルモフィラス（Ther
mus thermophilus）（Hohne et al. 47 Biomed.Biochi
m.A cta 941,1988）のような好熱生物から精製される。
【０１８３】実施例１９．修飾Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび蛍光プライマーを用いた自動化サイクルＤＮ
Ａシークエンシング Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙのような熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼおよびApplied Biosystems Dye P
rimersによるサイクルＤＮＡシークエンシングはApplie
d Biosystemsマニュアル（部品番号901482、Rev.B）に
記載されている方法の変法である。この方法は以下の変
形を除きマニュアルに記載されている方法と同一であ
る：（１）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比較してＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７ＹによるｄｄＮＴＰの
より効率的な使用を考えにいれてｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ
混合物は変形されなければならない。Applied Biosyste
msマニュアルに掲げられている混合物の代わりに使用さ
れるべき新しい混合物は以下のものである：
【表１５】dG/ddG混合物＝100μM c7dGTP、dATP、dTTPお
よびdCTP、および0.05μM ddGTP dA/ddA混合物＝100μM c7dGTP、dATP、dTTPおよびdCTP、お
よび0.3μM ddATP dT/ddT混合物＝100μM c7dGTP、dATP、dTTPおよびdCTP、お
よび0.25μM ddTTP dC/ddC混合物＝100μM c7dGTP、dATP、dTTPおよびdCTP、お
よび0.15μM ddCTP ｄｄＮＴＰの濃度は応用に依存して特定のサイズの範囲
の断片中の蛍光強度を最大にするように変化させなけれ
ばならない。例えば、ｄｄＮＴＰの濃度を増加させると
より短い長さの断片の蛍光が増加するであろう。（２）
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの代わりにＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼＦ６６７Ｙが使用される。標準ＤＮＡポリ
メラーゼアッセイ条件下でアッセイされる場合、両方の
場合において同一単位数の酵素が使用される。もしく
は、同一の数のＤＮＡポリメラーゼ分子が使用できる。
（３）特定の配列でのＤＮＡポリメラーゼによる見かけ
の判別を増加させることができる加ピロリン酸分解（バ
ンド強度の均一性を減少させる、TaborおよびRichardso
n 265 J.Biol.Chem. 8322,1990）を阻害するために反応
混合物は10ngの無機ピロホスファターゼを含む。好適に
はこのピロホスファターゼは例えばテルムス テルモフ
ィラス（Thermus thermophilus）（Hohne et al. 47 Bi
omed.Biochim.Acta 941,1988）のような好熱生物から精
製される。本方法のその他のすべての点はApplied Bios
ystemsマニュアル（上記文献）に記載されている方法と
同じである。
【０１８４】実施例２０．修飾Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび蛍光色素ターミネーターを用いた自動化サイ
クルＤＮＡシークエンシング Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙのような熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼおよびApplied Biosystems ダイ
デオキシターミネーターによるサイクルＤＮＡシークエ
ンシングはApplied Biosystemsマニュアル（部品番号90
1497、Rev.E）に記載されている方法の変法である。こ
の方法は以下の変形を除きマニュアルに記載されている
方法と同一である：（１）マニュアルは各々のシークエ
ンシング反応液（20μl反応液）に希釈されていない四
つのダイデオキシターミネーターの各々1μlの使用を要
求している。この実施例において、ターミネーターはＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比較してＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼＦ６６７Ｙにより数百倍以上効率的に取り込
まれるので、ターミネーターはシークエンシング反応混
合物への添加に先立って希釈されなければならない。下
記の希釈液の各々の1μlが1μlの非希釈ターミネーター
溶液の代わりに各々のシークエンシング反応液に加えら
れる：
【表１６】ダイデオキシ Ｇ ターミネーター、 Ｈ2
Ｏで５００分の１に ダイデオキシ Ａ ターミネーター、 Ｈ2Ｏで１，５
００分の１に ダイデオキシ Ｔ ターミネーター、 Ｈ2Ｏで１，５
００分の１に ダイデオキシ Ｃ ターミネーター、 Ｈ2Ｏで１，０
００分の１に これらの希釈は概算である；各々のダイデオキシターミ
ネーターの正確な希釈はプライマーからの決定されるべ
きＤＮＡ配列の塩基の数に依存して経験的に決定される
べきである。（２）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの代わ
りにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦ６６７Ｙが使用され
る。標準ＤＮＡポリメラーゼアッセイ条件下でアッセイ
される場合、両方の場合において同一単位数の酵素が使
用される。もしくは、同一の数のＤＮＡポリメラーゼ分
子が使用できる。（３）特定の配列でのＤＮＡポリメラ
ーゼによる見かけの判別を増加させることができる加ピ
ロリン酸分解（バンド強度の均一性を減少させる、Tabo
rおよびRichardson 265 J. Biol.Chem. 8322,1990）を阻
害するために反応混合物は10ngの無機ピロホスファター
ゼを含む。好適にはこのピロホスファターゼは例えばテ
ルムス テルモフィラス（Thermus thermophilus）（Ho
hne et al. 47 Biomed. Biochim. Acta 941,1988）のよ
うな好熱生物から精製される。
【０１８５】この方法は従来の方法よりも５００分の１
以下しかダイデオキシターミネーターを使用せず、反応
完了後に取り込まれなかったダイデオキシターミネータ
ーに付随する問題も少なくなっている。従って、Applie
d Biosystemsマニュアル（上記文献）に推奨されている
ように試料をスピンカラムを通過させ、取り込まれてい
ないダイデオキシターミネーターを除去する必要がな
い。むしろ、試料はエタノールで沈澱でき、5μlの脱イ
オン化ホルムアミドおよび1μlの50mM ＥＤＴＡ,pH8.0
に溶解し、９０℃に２分間加熱し、373A使用説明書に指
示に従ってAppliedBiosystems 373A ＤＮＡシークエン
シングシステムにかける。ダイデオキシターミネーター
を効率よく取り込むＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮ
ＡポリメラーゼＦ６６７Ｙのような）ではエタノール沈
澱によるＤＮＡシークエンシング反応液の濃縮は必要と
しない；好適には高い濃度のプライマーおよびｄＮＴＰ
を用いて実施されるＤＮＡサイクルシークエンシング反
応は（下記参照）、等量の脱イオン化ホルムアミドの添
加により停止でき、９０℃に２分間加熱し、すぐにAppl
ied Biosystems 373A ＤＮＡシークエンシングシステ
ムにかけられる。これにより、ＤＮＡ配列決定の試料を
調整する研究者の時間が大幅に節約される。
【０１８６】上記の方法は比較的低い濃度のｄＮＴＰを
最初に使用している（7.5μM のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰお
よびｄＣＴＰおよび37.5μMのｄＩＴＰ）。サイクルＤ
ＮＡシークエンシング反応の間、ｄＮＴＰが使用される
につれてｄＮＴＰの濃度は減少する。ｄＮＴＰのこの濃
度（7.5μM未満）はほとんどのＤＮＡポリメラーゼにお
ける最大のＤＮＡポリメラーゼ活性に最適な濃度より低
い濃度である。使用されてきたＤＮＡポリメラーゼはｄ
ｄＮＴＰを強く判別し、ｄＮＴＰに対して高い割合のｄ
ｄＮＴＰを必要とするので、この低濃度が従来のプロト
コールには必要であった。ダイデオキシターミネーター
判別性がより弱い本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用
は、ここでより高い濃度のｄＮＴＰの使用を可能にす
る。例えば上記のプロトコールにおいて、１０倍高い濃
度のｄＮＴＰおよびダイデオキシターミネーターが使用
できる；すなわち、75μM のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよび
ｄＣＴＰおよび375μMのｄＩＴＰ、および四つのダイデ
オキシターミネーターの各々の以下の希釈：ダイデオキ
シ Ｇ ターミネーター、Ｈ2Ｏで５０分の１に；ダイ
デオキシ Ａ ターミネーター、Ｈ2Ｏで１５０分の１
に；ダイデオキシ Ｔターミネーター、Ｈ2Ｏで１５０
分の１に；ダイデオキシ Ｃ ターミネーター、Ｈ2Ｏ
で１００分の１に。このように、この実施例においては
ダイデオキシターミネーター濃度は少なくとも５０分の
１従来のプロトコールの濃度よりも低い。
【０１８７】実施例２１．［32Ｐ］ｄｄＡＭＰ停止ＤＮ
Ａ基質を用いるエキソヌクレアーゼアッセイ ３’［32Ｐ］ｄｄＡＭＰ停止ＤＮＡ基質は、10μgの二
本鎖ウシ胸腺ＤＮＡ、40mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mM
ＭｇＣｌ2、5mMジチオスレイトール、50mM ＮａＣｌ、5
0μg/mlウシ血清アルブミン、および10単位のＨｉｎｄ
ＩＩＩを含む反応混合物中で天然のウシ胸腺ＤＮＡを消
化する事により調製した。３７℃で６０分インキュベー
ション後、5μlの［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴＰ（Amersham P
B10235,>5000Ci/ミリモル）および５単位のSequenase V
ersion 2.0（United States Biochemical Corporatio
n、カタログ番号70775）を加え、混合物を２０℃で１５
分間インキュベートする。反応混合物は等量のフェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：２
４：１）で一度抽出し、20mMトリスＨＣｌ,pH7.5、2mM
ＥＤＴＡ、100mM ＮａＣｌで平衡化したセファデックス
Ｇ１００（Pharmacia）の1mlのカラムへのせて分画す
る。ボイドボリュームで溶出する３’32Ｐ−標識ＤＮＡ
は全ＤＮＡのng当たり約500cpmの比活性を持っている。
【０１８８】エキソヌクレアーゼアッセイのための反応
混合物は（90μl）、40mMトリスＨＣｌ,pH7.5、10mM Ｍ
ｇＣｌ2、10mMジチオスレイトール、50mM ＫＣｌおよび
1ミリモルの３’32Ｐ−標識ＤＮＡを含む。反応混合物
はまた痕跡量のピロリン酸を除去するために10ngの酵母
無機ピロホスファターゼが含まれており、それにより加
ピロリン酸分解を妨害する（TaborおよびRichardson 26
5 J.Biol.Chem. 8322,1990）。この混合物を２０℃で１
分プレインキュベートし、次に10μlの適当な酵素希釈
液を添加する。指示された時間３７℃でインキュベーシ
ョンした後、30μlのウシ血清アルブミン（10mg/ml）お
よび30μlのトリクロロ酢酸（100% w/v）を加えること
により反応を停止する。沈澱したＤＮＡは０℃で１５分
間インキュベートし、12,000gで３０分遠心分離してペ
レット化する。上清の100μl中の酸可溶性放射活性を測
定する。３’［32Ｐ］ｄｄＡＭＰ−ＤＮＡエキソヌクレ
アーゼ活性の１単位は１５分で１ピコモルの［32Ｐ］ｄ
ｄＡＭＰの酸可溶化を触媒する。
【０１８９】その他の実施態様も以下の請求の範囲に含
まれる。
【０１９０】
【配列表】
【０１９１】配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０１９２】配列番号：２ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 5 10
【０１９３】配列番号：３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０１９４】配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０１９５】配列番号：５ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０１９６】配列番号：６ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０１９７】配列番号：７ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０１９８】配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Ala Ile Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０１９９】配列番号：９ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Asn Phe Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０２００】配列番号：１０ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Asn Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０２０１】配列番号：１１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Phe Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０２０２】配列番号：１２ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０２０３】配列番号：１３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０２０４】配列番号：１４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０２０５】配列番号：１５ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Thr Phe Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０２０６】配列番号：１６ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Ile Tyr Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０２０７】配列番号：１７ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Ile Phe Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０２０８】配列番号：１８ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Tyr Gly Leu Ile Tyr Gly 5 10
【０２０９】配列番号：１９ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 5 10
【０２１０】配列番号：２０ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 5 10
【０２１１】配列番号：２１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly 5 10
【０２１２】配列番号：２２ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Ile Tyr Gly Val Leu Tyr Gly 5 10
【０２１３】配列番号：２３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Ile Phe Gly Val Leu Tyr Gly 5 10
【０２１４】配列番号：２４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Tyr Gly Val Leu Tyr Gly 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はバクテリオファージＴ７の遺伝子５によ
りコードされるＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の図
による表示であり、パームおよびフィンガー領域、種々
のジデオキシ抵抗性（ＤＲ）突然変異体の位置、Ａ−Ｅ
と標識された領域の位置およびｄｄＮＴＰ判別に関与す
る一つの部位の位置が示されている。
【図２】図２はＤＮＡポリメラーゼIの３次元的表示で
あり、領域Ａ−Ｅの位置を示している。
【図３】図３はＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼのリボ
選択性領域の図による表示であり、アミノ酸は普遍的な
一文字コードで示されている。図の左に最初のアミノ酸
番号が示されており、およびデオキシヌクレオチドと比
較したジデオキシヌクレオチドに対する判別の程度は右
に示されている。
【図４】図４は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのリボ選
択性領域の修飾の図による表示である。
【図５】図５は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのリボ選択
性領域の修飾の図による表示である。
【図６】図６は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのリボ選
択性領域の修飾の図による表示である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】ＤＮＡシークエンシングには二つの一般的
方法がある。一つの方法（MaxamおよびGilbertシークエ
ンシング）では，単離されたＤＮＡ断片を化学的に分解
し、各々がその決められた末端で単一の放射性標識で標
識され、各々の反応により四つの塩基（Ｇ、Ａ，Ｔまた
はＣ）のうち一つまたはそれ以上の塩基で特異的に制限
切断される。もう一つの方法（ジデオキシまたは鎖停止
シークエンシング）ではＤＮＡ鎖の酵素的合成が行われ
る。Sanger et al.（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:546
3, 1977）。一般的に四つの別々の合成が行われ、各々
の反応はジデオキシヌクレオチドのような適当な鎖停止
ヌクレオチドの取り込みにより特定の塩基（Ｇ、Ａ，Ｔ
またはＣ）において停止する。放射活性標識ヌクレオシ
ド三リン酸の取り込みによりＤＮＡ断片が均一に標識さ
れ（末端標識のかわりに）、従ってより大きなＤＮＡ断
片はより放射強度が増加するので後者の方法が好適であ
る。さらに、32Ｐ標識ヌクレオチドのかわりに35Ｓ標識
ヌクレオチドが使用できるのでより鋭敏な決定ができ；
各々のレーンはＧ、Ａ，ＴまたはＣのみに対応するので
反応生成物をより簡単に解析することができる。ほとん
どのジデオキシシークエンシングに利用される酵素はＴ
７ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｔｔ
ｈその他のような好熱性生物から単離されたＤＮＡポリ
メラーゼである。頻度は低いが使用されるその他のポリ
メラーゼにはＡＭＶ逆転写酵素および大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼIのクレノー断片などが含まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、Tabo
rおよびRichardson（上記文献）により記載されている
ような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性またはBarns
により（WO 92/06188）に記載されているようなＴａｑ
中の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のようなエキソ
ヌクレアーゼ領域を除去または変更するように修飾して
もよい。本発明のＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴＰを判
別する能力を変える突然変異は、好適には実質的にエキ
ソヌクレアーゼ活性に影響しない；このことは、突然変
異は酵素のポリメラーゼ領域内の、重合化の活性部位近
くにおいて生じ、単に取り込まれた類似体をそのエキソ
ヌクレアーゼ活性を介して除去するポリメラーゼの能力
を減少させることによる判別の減少ではない。本発明の
特に好適なＤＮＡポリメラーゼは、BraithwaiteおよびI
to（21 Nuc. Acid. Res. 787,1993、ここに引例として
含まれている、およびファミリーＡと称されている）に
より記載されているようなＰｏｌＩ型ポリメラーゼ、お
よびBraithwaiteおよびItoにより記載されており、ファ
ミリーＢと称されるようなポリメラーゼ アルファまた
はポリメラーゼII−型ＤＮＡポリメラーゼである。Brai
thwaiteおよびItoにより記載されている他のポリメラー
ゼファミリーもまた本発明で使用することができる。特
に、ｄＮＴＰ基質の結合部位近くの位置の極性、ヒドロ
キシ含有アミノ酸残基の存在が、効率的にジデオキシヌ
クレオチドを取り込むことができるポリメラーゼに重要
であることが見いだされた。理論に拘束されるわけでは
ないが、この発見は、リボース部分の３’位にヒドロキ
シル基のないヌクレオチド（すなわちｄｄＮＴＰ）の高
い判別には、同時にこの重要部位のアミノ酸残基上にヒ
ドロキシル基がないことを必要とするという、予期され
た結果と逆であると考えている。別の言い方をすれば、
両方のヒドロキシル基の不在により作り出された隙間ま
たは穴の存在により類似体の判別がもたらされる。この
結果を考えると、関係が薄いＤＮＡポリメラーゼにおい
てさえも重要な残基を発見する方法が提供される；ｄＮ
ＴＰが結合する領域において極性基を持つ残基を非極性
基に付加することは、ｄｄＮＴＰを判別するポリメラー
ゼの能力を減少させるための有用なアミノ酸変更の候補
である。例えば、ラットＤＮＡポリメラーゼｂ（ファミ
リーＡまたはＢと、たとえあるにしてもわずかな相同性
しか持たないＤＮＡポリメラーゼ）の２７２位のフェニ
ルアラニンは、Ｘ線解析研究によりプライマー−テンプ
レートとの三成分複合体中でｄｄＣＴＰの３’位と接触
していることが示されている（Pelletier et al., 264
Science 189, 1994）。本発明で説明された結果の知識
は、ジデオキシヌクレオチドをより効率的に取り込むラ
ットＤＮＡポリメラーゼｂの突然変異体のスクリーニン
グにおいてこの残基をチロシンに修飾することを論理的
な選択にしている。したがって、当業者はここに提供さ
れた情報を用いて任意のＤＮＡポリメラーゼの判別性の
表現型を変えることができるであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】別の関連する観点においては、本発明は、
一つまたはそれ以上（好適には２、３または４）のデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸、上記のＤＮＡポリメラ
ーゼおよび第一の鎖停止剤を用いる、本質的に上に記載
したようなＤＮＡ鎖のシークエンシングのための方法を
特徴としている。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸
長させて、伸長したプライマーの長さが異なる第一のＤ
ＮＡ生成物の第一のシリーズを形成させ、各々の第一の
ＤＮＡ生成物はその伸長された末端に鎖停止剤を有し、
および各々の第一のＤＮＡ生成物の分子の数は長さが２
０塩基未満しか異なっていない実質的にすべてのＤＮＡ
生成物についてほとんど同じである。本方法はまた、ハ
イブリダイズした混合物中に第一の鎖停止剤と異なる濃
度の第二の鎖停止剤を提供することを特徴としており、
ここではＤＮＡポリメラーゼは伸長されたプライマーの
長さが異なる第二のＤＮＡ生成物の第二のシリーズを生
成し、各々の第二のＤＮＡ生成物はその伸長末端に第二
の鎖停止剤を有する。各々の第二のＤＮＡ生成物の分子
の数は、長さが互いに１から２０塩基しか異なっていな
い実質的にすべての第二のＤＮＡ生成物についてほとん
ど同じであり、および該第二のＤＮＡ生成物と２０塩基
未満の長さの違いを有するすべての第一のＤＮＡ生成物
の分子の数とは明らかに相違する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】さらに別の観点においては、本発明は残基
６６７にチロシンを有するテルムスアクアチカス（Ther
mus aqraticus）ＤＮＡポリメラーゼ、残基７６２にチ
ロシンを有する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、および大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ残基７６２と類似の位置、例え
ば、アミノ酸配列ＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7ＹＧ（式中
各々のＮは独立して任意のアミノ酸である）のＮ4位に
チロシン残基を持つＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラー
ゼ（）のような特定のＤＮＡポリメラーゼを特徴として
いる。さらに、本発明は、配列ＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｙ
Ｇ／Ｑ（式中各々のＮは独立して任意のアミノ酸であ
る）を有し、残基Ｎ1からＮ7の一つはｄｄＮＴＰの判別
性が減少されている（好適には非突然変異配列に比較し
て少なくとも２０倍減少されている）ポリメラーゼを産
生するように突然変異を起こされているＤＮＡポリメラ
ーゼアルファファミリーの特定のポリメラーゼを特徴と
している。本発明はまたこれらのＤＮＡポリメラーゼを
コードする核酸も特徴としている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５５】JoyceおよびSteitz,63 Ann.Rev.Bioc.777,
1994（本発明に対する従来の技術であるとは認められて
いない）は種々のＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの関
係を議論している。ＤＮＡポリメラーゼの”パー
ム”（”フィンガー”よりも）サブドメインの３つの機
能を示している−すなわち、触媒中心、プライマーの
３’末端の結合部位およびｄＮＴＰ結合部位。ＨＩＶ−
１逆転写酵素においてＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の結合
に影響する突然変異は残基６７−７０付近であることが
示されている。”また糖のヌクレオチド塩基の位置から
は何等有用な結論を導き出せないが、クレノー断片およ
びｄＮＴＰリン酸基間の接触の同定において結晶性二成
分複合体からの情報が役に立つであろう”とも述べられ
ている。前のパラグラフにおいて”ポリメラーゼ−ｄＮ
ＴＰ二成分複合体を形成できるが、そのような複合体は
触媒的には応答能がない”と述べられている。さらにデ
ータ”Ｐｈｅ７６２の近くにデオキシリボースが配置さ
れるであろう”および”モデルとして作られたテンプレ
ート鎖に近接するフィンガードメインに位置しているＴ
ｙｒ７６６（クレノー断片ヘリックスＯ内）の突然変異
体はデオキシおよびジデオキシヌクレオチド基質間の判
別に影響する．．．”ことが示されている。しかしなが
ら、”クレノー断片において、三成分複合体中のｄＮＴ
Ｐの結合（Ｋm(dNTP)に反映される）に影響することが
観察されている突然変異はフィンガーサブドメイン内ま
たは近くのポリメラーゼの裂け目の一側面に位置してい
る。この様に同定された位置は遠くはヘリックスＱのＮ
末端（Ａｒｇ８４１およびＡｓｎ８４５）、ヘリックス
Ｏの露出した面（Ｔｈｒ７６６、Ｐｈｅ７６２およびＡ
ｒｇ７５４）および触媒中心近くの近接する残基（Ａｓ
ｐ７０５およびＧｌｕ７１０を含む。動力学的方法の利
点は三成分複合体が証明されることである；しかしなが
ら、上に議論したごとく、他の構造的証拠なしにテンプ
レート相互作用により開始される直接の影響を区別する
のは不可能である。さらに、前にリストした側鎖はｄＮ
ＴＰ分子より大きな領域を包含しており、それ故、全部
はそれと直接接触されない。これらの研究により示され
たクレノー断片の領域はテンプレート鎖と広い範囲の接
触をしていると考えられたので、上に述べられた残基の
サブセットはｄＮＴＰと直接接触しており、一方、残り
はテンプレートＤＮＡを結合しているというのが妥当な
説明である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】Sousa et al. 364 Nature 593,1993（本発
明にたいする従来の技術であるとは認められていない）
はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの３次元構造およびその大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとの相同性が記載されてい
る。彼らの観察結果は”ＫＦ（クレノー断片）のＣ末端
要素（ｂ−鎖１４［残基９１６から９２８］およびＣ末
端）は重合化の間ｄＮＴＰのデオキシリボース部分と接
触し、ｒＮＴＰおよびｄＮＴＰ基質を判別する”ことを
示唆すると記載している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】ジデオキシチミジンのようなジデオキシヌ
クレオシドはＴ７ファージ増殖の強い阻害剤である。Ｄ
ＮＡ合成の阻害はＴ７ ＤＮＡ内へのジデオキシヌクレ
オチドの取り込みの結果であることが実験で示されてい
る。ジデオキシヌクレオシドは非感染大腸菌には阻害を
示さない。大腸菌ＤＮＡ合成を阻害しないことへの説明
はわからないが、細胞の取り込み、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼIIIによるそれらの取り込みに対する高いレベル
の判別、三リン酸への不十分なリン酸化または効率のよ
い除去により説明できるであろう。どの場合においても
Ｔ７突然変異体ファージが生じることが観察され、寒天
プレート上に約１０-3の頻度でジデオキシヌクレオシド
を含む正常なプラークを得ることができる。多くのこれ
らの突然変異の位置が図１に示されている。それらは遺
伝子５蛋白質内に残っている。突然変異体遺伝子５蛋白
質は天然の遺伝子５蛋白質よりもｄｄＮＴＰをより強く
判別する（数倍）。この変異の組のいくつかはｄＮＴＰ
のリボース部分の認識に重要なポリメラーゼの領域の輪
郭をなしている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】図４ー６（および表２）を参照すると、こ
の領域のアミノ酸の置換でポリメラーゼのリボ選択性
を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ型からＴ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ型へおよび逆に変換することが可能なことが
決定された。従って、ＰｏｌＩ型ポリメラーゼのこの領
域を標的とした突然変異発生によりポリメラーゼのリボ
選択性を著しく変えることができる。効果は少なくとも
５０−１００倍であり、一般的には５００倍以上であ
る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】
【表２】大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ間のヘ
リックスＯ内のドメイン交換のｄｄＮＴＰに対する判別
性への影響。３つのポリメラーゼの配列は最初の残基の
番号とともに一番上に示されている。これら３つのポリ
メラーゼの保存配列の下にＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｔ７）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ）およ
びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）で特性付けら
れた突然変異体が示されており、突然変異を起こした残
基に下線が付けられている。各々の突然変異体は実施例
２に記載したＳＤＳ活性ゲル分析によるｄｄＮＭＰとｄ
ＮＭＰの取り込みの相対速度が試験され、右側に結果が
示されている。突然変異体Ｔ７ Ｃ−Ｔ８、Ｐｏｌ Ｉ
Ｃ−Ｋ６およびＴａｑ Ｃ−Ｑ５がさらなる分析のた
め野生型蛋白質とともに精製された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６９】 酵素 配列 ｄｄＮＴＰ判別 Pol I 754 R R S A K A I N F G L I Y G 高い Taq 658 R R A A K T I N F G V L Y G 高い T7 517 R D N A K T F I Y G F L Y G 低い Consensus R A K G Y G T7 WT R D N A K T F I Y G F L Y G 低い T7 C-T2 R R S A K A I N F G L I Y G 高い T7 C-T3 R R S A K T F I Y G F L Y G 低い T7 C-T4 R D N A K A I N F G F L Y G 高い T7 C-T5 R D N A K A I I Y G F L Y G 低い T7 C-T6 R D N A K T F N F G F L Y G 高い T7 C-T7 R D N A K T F N Y G F L Y G 低い T7 C-T8 R D N A K T F I F G F L Y G 高い Pol I WT R R S A K A I N F G L I Y G 高い Pol I C-K1 R D N A K T F I Y G F L Y G 低い Pol I C-K2 R R S A K T F I Y G L I Y G 低い Pol I C-K3 R R S A K T F N F G L I Y G 高い Pol I C-K4 R R S A K A I I Y G L I Y G 低い Pol I C-K5 R R S A K A I I F G L I Y G 高い Pol I C-K6 R R S A K A I N Y G L I Y G 低い Taq WT R R A A K T I N F G V L Y G 高い Taq C-Q1 R D N A K T I N F G V L Y G 高い Taq C-Q2 R R A A K T F I Y G F L Y G 低い Taq C-Q3 R R A A K T I I Y G V L Y G 低い Taq C-Q4 R R A A K T I I F G V L Y G 高い Taq C-Q5 R R A A K T I N Y G V L Y G 低い 特異性残基 ↑ 本発明のＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡテンプレートの長
さによるジデオキシヌクレオチド類似体およびデオキシ
ヌクレオチド間を有意には判別しない。すなわち、これ
らのポリメラーゼは３’ヒドロキシル基を持つヌクレオ
チドに対しそれを持たないもの（すなわち、リボースの
３’位に２つの水素を持っている）を有意に判別しな
い。しかしながら、これらのポリメラーゼはマンガンま
たは鉄の存在下においても、ヌクレオシドの他の位置の
修飾を判別するであろう。例えば本ポリメラーゼはデオ
キシヌクレオチドと比べ、結合された蛍光基を持ついく
つかのジデオキシヌクレオチド類似体を判別するであろ
う。しかしながら、本ポリメラーゼはジデオキシヌクレ
オチドへの修飾の存在または不在に基づいて、隣のまた
は近接したヌクレオチドを異なる程度では判別しない。
このように本ポリメラーゼはこれらの類似体を強く判別
し、非修飾ジデオキシヌクレオシドに比較してＤＮＡシ
ークエンシング反応にはより高い濃度を必要とするが、
近接するバンドの強度は依然として均一であろう。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７３】エキソヌクレアーゼ活性 本発明のＤＮＡポリメラーゼは好適には５０％未満、よ
り好適には１％未満、および最も好適には０．１％未満
の正常または天然に付随するレベルのエキソヌクレアー
ゼ活性を持っている（ポリメラーゼ分子当たりの活性の
量）。正常または天然に付随するレベルとは例えば非修
飾Ｔ７型ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を意味
している。以下に記載したようなChase et al.,(249 J.
Biol. Ch em.,4545, 1974)の方法の改良法により測定さ
れた、ポリメラーゼのｍｇ当たりに通常付随する活性は
約５０００単位のエキソヌクレアーゼ活性である。エキ
ソヌクレアーゼはテンプレートに間違って塩基対生成さ
れている新しく合成された塩基を切り出すことによりＤ
ＮＡ合成の忠実度を上げる。そのような付随エキソヌク
レアーゼ活性はＤＮＡシークエンシング反応の質に有害
であろう。ヌクレオチド濃度が落ちた場合、ポリメラー
ゼ活性はエキソヌクレアーゼ活性と同じような速度まで
遅くなり、その結果全体でのＤＮＡ合成がなくなるか、
または合成されたＤＮＡの分解さえ起こるので、付随エ
キソヌクレアーゼ活性は反応に加えなければならないヌ
クレオチド前駆体の最小必要濃度を上げることになる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７５】理想的なシークエンシング反応はゲル全体
を通して均一の強度のバンドを与える断片を生成する。
このことはすべての放射活性断片にたいしＸ線フィルム
の最適な暴露を得るために必須である。もし放射活性バ
ンドの強度が変化していれば、より薄くなったバンドは
検出されないであろう。全ての断片に均一な放射活性強
度を得るには、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ上の各々の
位置で同じ時間間隔を費やさなければならず、任意の位
置でのヌクレオチドの付加または除去に優先を示しては
ならない。このことは、もしＤＮＡポリメラーゼに付随
するエキソヌクレアーゼがなければ起こり、そのためそ
れはテンプレートに沿った各々の位置で鎖停止ヌクレオ
チドを取り込むただ一回の機会を持っているであろう。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７６】短いプライマー 本発明のＤＮＡポリメラーゼは好適には１０塩基または
それ未満、（より長いものも同様に）、最も好適には４
−２０塩基（例えば６塩基、これは３つのグループで使
用でき１８−ｍｅｒと等価物を形成する）のプライマー
を利用することができる。短いプライマーを利用できる
能力はＤＮＡシークエンシングに多くの重要な利点を提
供する。より短いプライマーは通常の１７−ｍｅｒプラ
イマーより安価であり、合成がより容易である。それら
はより速くＤＮＡテンプレート上の相補的部位にアニー
ルし、そのためシークエンシング反応をより速くする。
さらに、ＤＮＡシークエンシングに小さな（例えば、６
または７塩基）オリゴヌクレオチドプライマーを利用す
る能力は、長いＤＮＡ断片のシークエンシングにそれで
なければ不可能な戦略を可能にする。例えば、８０−４
０００ランダムヘキサマーを含むキットが発生でき、そ
のどれもがクローニングベクター内のどの部位とも相補
的でない。統計的には８０のヘキサマー配列の一つが配
列決定されるべきＤＮＡ断片に沿って平均５０塩基毎に
生じるであろう。３０００塩基の配列の決定にはただ５
回のシークエンシングサイクルしか必要としないであろ
う。第一に、”普遍的”プライマー（例えば、New Engl
and Biolabs #1211、配列5'GTAAAACGAACGGCCAGT3'）が
挿入物の一つの末端の約６００塩基の配列に使用される
であろう。このシークエンシング反応の結果を用いて、
決定された配列の末端近くの領域に相同的な新しいプラ
イマーがキットから拾い上げられるであろう。第二のサ
イクルでは、次の６００塩基の配列がこのプライマーを
用いて決定されるであろう。この過程の５回の繰り返し
により、サブクローニングを必要とせず、および新規の
オリゴヌクレオチドプライマーの化学的合成なしに３０
００塩基の完全な配列が決定されるであろう。そのよう
な短いプライマーの使用はシークエンシング反応にＴ７
の遺伝子２．５および遺伝子４タンパク質を含ませるこ
とにより促進されるであろう。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７９】マンガン存在下ではＴ７ ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによる判別は減
少する；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼでは３．７から１へ
減少し、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩでは５５０
から３．９に（ｄｄＡＴＰに対して）減少した。出願者
が最初に、唯一の二価カチオンとしてマグネシウムイオ
ンの存在下１００未満の連続移動性を持ち（プライマー
−テンプレートから解離する前に与えられたプライマー
から伸長された平均の長さとして定義される；逆転写酵
素はこの定義によると約１５０−２００の連続移動性を
持っており、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼはこれより大き
い連続移動性を持っている）、ｄｄＮＭＰの取り込みに
対し１００倍未満の判別を行うＤＮＡポリメラーゼを提
供した。対照的に、Ｔａｑのような既知のＤＮＡポリメ
ラーゼのほとんどは１００未満の連続移動性を持ち、ｄ
ｄＮＭＰの取り込みに対し１００倍以上の判別を行う。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８１】しかしながら、均一の強度のバンドを与え
およびより少ないｄｄＮＴＰの使用を可能にするため
に、急速に循環しまたｄｄＮＭＰを効率的に取り込むポ
リメラーゼがより良好である。そのようなポリメラーゼ
が低いエキソヌクレアーゼ活性を持つかまたは全く持た
ず、および加ピロリン酸分解によるバンドの分解を防ぐ
ためピロホスファターゼを加えるのもまた好適である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８２】唯一の二価カチオンとしてマグネシウムで
ＤＮＡシークエンシング反応を実施できることも好適で
ある（すなわち、マンガン非存在下）。第一に、ポリメ
ラーゼはマグネシウムに比べマンガンでより不活性にな
りがちである（例えば、Taborおよび Richardson. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080(1989)参
照）。第二に、ポリメラーゼは広い範囲のマグネシウム
濃度で活性である一方、最適活性はほとんどの場合に非
常に鋭く、低い最適マンガン濃度が必要とされる（同
上）。および、最適マンガン濃度では、ポリメラーゼの
活性がはるかに低いようなより高い濃度の場合よりもｄ
ｄＮＴＰに対する判別の減少への効果が小さい。第三
に、マンガンはキットに含ませるには都合のよい金属イ
オンではない；容易に沈澱を生じる（特により高いｐＨ
で）。第四に、マンガンがどの好熱性ポリメラーゼにつ
いてもｄｄＮＴＰの判別を減少させるための金属イオン
として効果があるのかどうか明かではない（すなわち、
より高い温度で）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８４】”ＤＮＡポリメラーゼＩは低い連続移動性
を持っており、１０ヌクレオチド未満の取り込み後に解
離する。ｄｄＮＴＰ非存在下のＤＮＡ合成の間に部位か
ら酵素が解離する頻度およびその部位でのｄｄＮＭＰの
取り込みに対する判別の程度の間に強い関係がある（未
発表データ）。このことは、ＤＮＡポリメラーゼＩは連
続移動性合成の間はｄＮＭＰおよびｄｄＮＭＰを類似の
速度で取り込む；しかしながら、合成が連続移動性でな
い場合、ｄＮＭＰはｄｄＮＭＰに優先して取り込まれる
ことを示唆している。このモデルはＴ７ ＤＮＡポリメ
ラーゼと比較してのＤＮＡポリメラーゼＩによるｄｄＮ
ＭＰ取り込みのより大きな変異を説明できる、なぜな
ら、後者は前者に比べ２桁大きな値の連続移動性を持っ
ているからである（引用省略）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８５】このように、我々はここに記載した突然変
異体が突然変異体酵素の連続移動性を本当に増加させる
という証拠を観察していないので、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼでの本発明の
結果は驚くべきものである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８６】好熱性ポリメラーゼ ｄｄＮＴＰに対する判別が１００倍以下である好熱性ポ
リメラーゼが特に本発明で有用である。さらに、唯一の
二価カチオンとしてのマグネシウムの存在下ｄｄＮＴＰ
に対する判別が１００倍以下であり、好適には一つのプ
ライマー−テンプレートから別のものへのサイクルが１
秒当たり１回またはそれ以上のものが有用である。好熱
性ポリメラーゼは６０℃以上で１５分の反応において最
適ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つポリメラーゼとして定
義される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８７】均一バンド強度 マンガンはｄｄＡＴＰに対するクレノー断片の判別を５
５０から３．９に減少させるが、Taborおよび Richards
on（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080(198
9)）は個々のバンドの強度にまだ広範囲の変異があるこ
と（図２参照 同上）を示している。このように、Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼから離れても、本発明はクレノー
断片のように急速に循環するポリメラーゼおよび唯一の
二価カチオンとしてのマグネシウムの存在下でも（ほと
んどのポリメラーゼの活性に好適な条件、下記参照）均
一な強度を持つバンドを産生する好熱性生物由来のポリ
メラーゼを初めて提供する。急速に循環する酵素は以下
に記載した本分野では既知の方法により決定できる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９１】２． ポリメラーゼアルファファミリー
（ポリメラーゼIIファミリーとも呼ばれる） Delarue et al., Protein Engineering 3, 461-467(199
0)はポリメラーゼの二つのファミリー（ポリメラーゼＩ
ファミリーおよびポリメラーゼアルファファミリー）が
三つの共通のモチーフを共有していることを示してい
る。彼らが”モチーフＢ”と呼んだ領域にジデオキシリ
ボースの特異性に関すると同定された残基が含まれてい
る。この領域はポリメラーゼＩファミリー中、配列ＫＮ
1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7ＹＧ（ここでＮ4は特異的残基であ
り：もしＮ4がフェニルアラニンであれば、高い判別性
であり、もしＮ4がチロシンであれば低い判別性であ
る）により特徴付けられる。ポリメラーゼアルファファ
ミリーにおいては、配列はＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＹＧ
（保存残基の間では塩基が一つ少ない）。従ってポリメ
ラーゼＩ型酵素とちょうど同じにこのモチーフ（リジン
（Ｋ）およびチロシン（Ｙ）の間）内の残基の変化がこ
れらのポリメラーゼのｄｄＮＴＰに対する判別度を減少
させるであろう。これらの残基は以下の様である：
【表４】 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼII Ile494-Phe499 ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ Leu341-Ser346 Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ Leu384-Leu389 Ｍ２ ＤＮＡポリメラーゼ Leu381-Leu386 Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ Ile558-Leu563テルミュオコッカス リトラリス （Thermuococcus litoralis) ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ） Leu492-Tyr497ピロコッカス フリウサス （Pyrococcus feriosus） ＤＮＡポリメラーゼ Leu489-Phe494スルフォロブス ソルファタリカス （Sulfolobus solfataricus） ＤＮＡポリメラーゼ Val604-Thr609 ヒトＤＮＡポリメラーゼ アルファ Leu951-His956Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼＩ （アルファ） Leu945-His950Ｓ．ポンベ （pombe）ＤＮＡポリメラーゼＩ（アルファ） Leu931-His936ドロソフィラ メラノガスター （Drosophila melanogaster） ＤＮＡポリメラーゼアルファ Leu960-His965トリパノソーマ ブルーセイ （Trypanosoma brucei） ＤＮＡポリメラーゼ アルファ Leu845-His850 ヒトＤＮＡポリメラーゼ デルタ Val695-Val700 ウシＤＮＡポリメラーゼ デルタ Val694-Val699Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼIII （デルタ） Ile702-Val707Ｓ．ポンベ （pombe）ＤＮＡポリメラーゼIII（デルタ） Val681-Val686 熱帯熱マラリアＤＮＡポリメラーゼ（デルタ） Ile692-Val697Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼII （イプシロン） Val82-Phe830Ｓ．セレビジエ （cerevisiae）ＤＮＡポリメラーゼＲｅｖ３ Leu1087-Thr1092 単純ヘルペスウイルス タイプ１ ＤＮＡポリメラーゼ Val812-Val817 エキンヘルプスウイルス タイプ１ ＤＮＡポリメラーゼ Val813-Val818 水痘帯状ヘルペスウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Val776-Val781 エプスタイン−バールウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Cys682-Val687 ヘルペスウイルス サイミリ ＤＮＡポリメラーゼ Val671-Val676 ヒトサイトメガロウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Val811-Phe816 マウスサイトメガロウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Val717-Phe722 ヒトヘルペスウイルス タイプ６ ＤＮＡポリメラーゼ Ile667-Val672 湖水ナマズウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile750-His755 クロレラウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile586-Val591 鶏頭ウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile648-Val653 ワクシニアウイルス ＤＮＡポリメラーゼ Ile637-Val642コリストニューラ ビエニス （Choristoneura biennis） ＤＮＡポリメラーゼ Ile669-Leu674オートグラファ カリホルニカ （Autographa californica） 核多面化ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡポリメラーゼ Arg606-Ile611 マイマイガ核多面化ウイルスＤＮＡポリメラーゼ Arg624-Ile629 アデノウイルスー２ＤＮＡポリメラーゼ Leu696-Leu701 アデノウイルスー７ＤＮＡポリメラーゼ Leu762-Leu767 アデノウイルスー１２ＤＮＡポリメラーゼ Leu694-Leu699 Ｓ−１トウモロコシＤＮＡポリメラーゼ Leu618-Leu623カリオ ニューロスポラ インターメジア （Kalio neurospora intermedia）ＤＮＡポリメラーゼ Leu776-Leu777 ｐＡＩ２アスコボラス イマーサス （Ascobolus immersus） ＤＮＡポリメラーゼ Leu951-leu956 ｐＣＬＫ１ クラビセプス プルプレア （Claviceps purpurea） ＤＮＡポリメラーゼ Leu831-Leu836マランハル ニューロスポラ クラッサ （Maranhar neurospora crassa） ＤＮＡポリメラーゼ Leu752-Leu757 ｐＥＭ アガリカス ビトルキス （Agricus bitorquis） ＤＮＡポリメラーゼ Leu573-Leu578 ｐＧＫＬ１ クライベロマイセス ラクチス （Kluyveromyces lactis） ＤＮＡポリメラーゼ Ile785-Leu790 ｐＧＫＬ２ クライベロマイセス ラクチス （Kluyveromyces lactis） ＤＮＡポリメラーゼ Ile770-Gly776 ｐＳＫＬ サッカロマイセス クライベリ （Saccaromyces kluyveri） ＤＮＡポリメラーゼ Ile775-Gly781 上述のポリメラーゼのうち代表的なものについて、対応
する位置のアミノ酸残基を以下に示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４１】ＤＮＡポリメラーゼの修飾がｄｄＮＴＰを
判別する能力を減少させた（すなわち、ジデオキシヌク
レオチドをより効率よく取り込む）かどうかを決定する
ために本試験を使用するには、同一の単位数の修飾およ
び非修飾ＤＮＡポリメラーゼが上記のｄｄＮＴＰとｄＮ
ＴＰを種々の比で含む一連の反応で使用されるであろ
う。二つの酵素に対しｄｄＮＴＰとｄＮＴＰが同一の比
でジデオキシ停止断片の平均の長さが比較される。もし
修飾がＤＮＡポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドを
より効率よく取り込む結果を与えるなら、ｄＮＴＰ対ｄ
ｄＮＴＰが同じ比では非修飾ＤＮＡポリメラーゼを使用
した反応のジデオキシ停止断片の平均の長さに比較して
修飾ＤＮＡポリメラーゼを使用したものの方がより短い
であろうし、一方、もし修飾によりＤＮＡポリメラーゼ
がｄｄＮＴＰをより判別するようになるなら修飾ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いた反応で平均の長さがより長くなる
であろう。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７３】以下の実施例は異なるＤＮＡポリメラーゼ
により合成されたジデオキシ停止断片から作り出される
バンド強度の均一性を試験するために提供されるもので
ある。実施例１３．一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ−５’32Ｐ−標識４０
−ｍｅｒ複合体およびゲル電気泳動を用いるジデオキシ
ヌクレオチド取り込みの均一性の決定 この実施例ではジデオキシヌクレオチド取り込みの均一
性が一本鎖Ｍ１３ＤＮＡテンプレートで伸長された５’
32Ｐ−末端標識プライマーで測定される。三つの活性が
ジデオキシ停止断片のバンド強度の変異を起こすことが
できる。一つはエキソヌクレアーゼ活性であり、いくつ
かの配列では優先的である；これは化学的または遺伝学
的手段により選択的に活性を除去することにより避けら
れる（例えば、TaborおよびRichardson 264 J.Biol.Che
m.6447,1989参照）。第二は加ピロリン酸分解であり；
これはＤＮＡ合成の間に蓄積され、加ピロリン酸分解に
必要な基質であるピロリン酸を分解するピロホスファタ
ーゼを反応混合物中に含ませることにより容易に避ける
ことができる。第三はジデオキシヌクレオチドの取り込
みにおける配列特異的変異である。バンド強度の変異は
ＤＮＡ配列分析に有害であり、決定されるＤＮＡ配列の
正確性を減少させる。この試験はジデオキシヌクレオチ
ドをより効率的に取り込むであろう突然変異体ＤＮＡポ
リメラーゼを含む異なるＤＮＡポリメラーゼにより合成
された断片中のバンド強度の変異性の程度を比較するた
めに計画された。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スタンレー・テーバー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，ローウェル・ストリート ９エイ (72)発明者 チャールズ・シー・リチャードソン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02167, チェスナット・ヒル，チェスナット・ヒ ル・ロード 78

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】対応する天然に存在するＤＮＡポリメラー
    ゼの能力と比較して、対応するデオキシヌクレオチドに
    対してジデオキシヌクレオチドまたは他のデオキシヌク
    レオチド類似体を取り込む能力を増加させるように修飾
    されているＤＮＡポリメラーゼ。
  2. 【請求項２】対応する天然に存在するＤＮＡポリメラー
    ゼの能力と比較して、対応するデオキシヌクレオチドに
    対してジデオキシヌクレオチドを取り込む能力を増加さ
    せるように、ポリメラーゼのジデオキシヌクレオチド結
    合部位中において修飾されているＤＮＡポリメラーゼ。
  3. 【請求項３】ポリメラーゼのジデオキシヌクレオチド結
    合部位中において、天然に存在するアミノ酸の代わりに
    チロシンを有するＤＮＡポリメラーゼ。
  4. 【請求項４】対応する天然に存在するＤＮＡポリメラー
    ゼの能力と比較して、対応するデオキシヌクレオチドに
    対してジデオキシヌクレオチドを取り込む能力を少なく
    とも２０倍増加させるように修飾されているＤＮＡポリ
    メラーゼ。
  5. 【請求項５】デオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレ
    オチドとを１００倍未満で区別するＤＮＡポリメラー
    ゼ。
  6. 【請求項６】唯一の二価カチオンとしてのマグネシウム
    の存在下に、ｄＮＭＰと比較してｄｄＮＭＰを１００倍
    未満で判別する好熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
  7. 【請求項７】Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ，Ｔ
    ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ，Ｔｈｅｒｍ
    ｕｓ ｆｌａｖｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔ
    ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
    ｌｉｔｏｒａｌｉｓ，およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆ
    ｕｒｉｏｓｉｓからなる群より選択される生物に由来す
    る、請求項６記載のＤＮＡポリメラーゼ。
  8. 【請求項８】残基６６７においてチロシンを有する、Ｔ
    ｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラー
    ゼ。
  9. 【請求項９】大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの残基７６２の
    類似位置にチロシン残基を有する、天然に存在しないＰ
    ｏｌ I型ＤＮＡポリメラーゼ。
  10. 【請求項１０】デオキシヌクレオチド結合部位において
    アミノ酸配列ＫＮ1Ｎ2Ｎ3ＹＮ5Ｎ6Ｎ7ＹＧ／Ｑ（式中、
    各々のＮは独立して任意のアミノ酸である）を含む、Ｐ
    ｏｌI型ＤＮＡポリメラーゼ。
  11. 【請求項１１】ＤＮＡシークエンシングにおいて用いる
    ことが可能なように十分に低いエキソヌクレアーゼ活性
    を有する、請求項１−１０のいずれかに記載のＤＮＡポ
    リメラーゼ。
  12. 【請求項１２】１００未満の平均連続移動性を有する、
    請求項１−１１のいずれかに記載のＤＮＡポリメラー
    ゼ。
  13. 【請求項１３】大腸菌のＤＮＡポリメラーゼIの６６６
    −６８２、７１０−７５５、７５５−７８４、７９８−
    ８６７および９１４−９２８に対応する領域から選択さ
    れる領域中のアミノ酸において修飾されているＰｏｌI
    型ＤＮＡポリメラーゼ。
  14. 【請求項１４】配列ＫＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7ＹＧ（式
    中、各々のＮは独立して任意のアミノ酸である）を有
    し、ここで前記Ｎの１つはｄｄＮＭＰの取り込みに対す
    る判別がｄＮＭＰの取り込みの５０倍より多くないポリ
    メラーゼを与えるように修飾されていることを特徴とす
    るＤＮＡポリメラーゼアルファ。
  15. 【請求項１５】非変異ポリメラーゼと比較して少なくと
    も２０倍以上効率的にｄｄＮＭＰを取り込むポリメラー
    ゼを与えるようにＮ1からＮ6のいずれかにおいて修飾さ
    れている、請求項１４記載のＤＮＡポリメラーゼアルフ
    ァ。
  16. 【請求項１６】請求項１−１５のいずれかに記載のＤＮ
    Ａポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】請求項１−１５のいずれかに記載のＤＮ
    Ａポリメラーゼを製造する方法であって、 （ａ）ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子を用意
    し； （ｂ）ヌクレオチド塩基配列内の１つまたはそれ以上の
    部位における１つまたはそれ以上の塩基を変更させるよ
    うに該核酸分子に突然変異を起こさせ；そして （ｃ）該変異させた核酸分子により発現される修飾され
    たＤＮＡポリメラーゼを回収する；の各工程を含む方
    法。
  18. 【請求項１８】ジデオキシシークエンシングによりＤＮ
    Ａ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であっ
    て、鎖伸長に用いられる酵素が請求項１−１５のいずれ
    かに記載のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする
    方法。
  19. 【請求項１９】前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼであり、前記シークエンシングが５０℃
    より高い温度において実施される、請求項１８記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】核酸のシークエンシング方法であって、
    オリゴヌクレオチドプライマー、シークエンスされるべ
    き核酸、１および４の間のデオキシリボヌクレオシド三
    リン酸、請求項１−１５のいずれかに記載のＤＮＡポリ
    メラーゼおよび異なる量の少なくとも２つの鎖停止剤
    を、該オリゴヌクレオチドプライマーが伸長してシーク
    エンスされるべき核酸に相補的な核酸断片を形成するの
    に好ましい条件下に混合し；大きさにより核酸断片を分
    離し；そして核酸配列を決定し、ここで該試薬はプライ
    マー伸長生成物中の標識の強度により互いに異なる；の
    各工程を含む方法。
  21. 【請求項２１】請求項１−１５のいずれかに記載のＤＮ
    Ａポリメラーゼを用いることを特徴とするサイクルシー
    クエンシング方法。
  22. 【請求項２２】サイクルシークエンシング反応において
    ４つのｄｄＮＴＰの各々に対し過剰量または同量の４つ
    のｄＮＴＰを用意し；そして該サイクルシークエンシン
    グ反応を実施する；の各工程を含む、請求項２１記載の
    サイクルシークエンシング方法。
  23. 【請求項２３】サイクルシークエンシング反応において
    対応するデオキシヌクレオチドと比較して１０倍未満の
    量の４つすべての蛍光標識したジデオキシヌクレオチド
    を用意し；そして該サイクルシークエンシング反応を実
    施する；の各工程を含む、請求項２１記載のサイクルシ
    ークエンシング方法。
  24. 【請求項２４】請求項１−１５のいずれかに記載の修飾
    されたＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする、Ｄ
    ＮＡシークエンシング用キット。
  25. 【請求項２５】自動化ＤＮＡシークエンシング装置であ
    って、１つのプライマーおよびＤＮＡ鎖から形成される
    少なくとも二つのシリーズのＤＮＡ生成物を提供する試
    薬を含む反応器、ここで該試薬は請求項１−１５のいず
    れかに記載のＤＮＡポリメラーゼを含み、該シリーズの
    該ＤＮＡ生成物の各々は分子量が異なりかつ１つの末端
    に鎖停止剤を有しており；分離装置の１つの軸に沿って
    該ＤＮＡ生成物を分離し一連のバンドを形成させるため
    の分離手段、ここで１つのシリーズ中の実質的にすべて
    の近傍バンドの強度はほぼ同一であり、任意のシリーズ
    中の実質的にすべての近傍バンドの強度は他のシリーズ
    のものと異なり；軸に沿って分離した後に各々のバンド
    の位置および強度を決定するためのバンド読みとり手
    段；および分離手段中に存在しているであろう標識から
    の光放出の波長からではなく軸に沿ったバンドの位置お
    よび強度のみからＤＮＡ鎖のＤＮＡ配列を決定するコン
    ピューター手段；を含むことを特徴とする装置。
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