JPH08205882A - タキサン型ジテルペンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の培養
細胞および／または培養組織をコロナチン類、またはコ
ロナチン類産生菌、それら菌類の培養液、もしくはそれ
ら菌類の培養抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を
含む培地中で培養し、得られる培養物および／または培
地からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とす
るタキサン型ジテルペンの製造方法。 【効果】 本発明方法は、タキサン型ジテルペンの生産
性の向上を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等
の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有
用であるタキソール(Taxol)は、イチイ科イチイ属植物
であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT)よ
り単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と
関連する複雑なエステルグループを有している。タキソ
ールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールは天然のまたは栽培された植物体中か
ら採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高
さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であ
り、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に
大量のタキソールを得ることは困難である。もし、タキ
ソールおよび／またはタキソールの前駆物質であるバッ
カチンIII等のタキサン型ジテルペンの合成が組織培養
を利用して行なうことができれば、樹木を伐採する事な
く、大量のタキソールを容易に得ることができるので有
利である。

【０００３】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Taxu
s brevifolia NUTT）培養細胞によるタキソール生産が
米国で特許〔US Patent:5019504〕になっているが、そ
のタキソール生産量は1〜3mg/lと記載されており、工業
的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソ
ールの生産性は不安定であり、選抜で一次的には生産性
の高い細胞が得られるが、継代培養してその含量を維持
することは難しい〔E.R.M.Wickremesine et al., Worl
d Congress on Cell and Tissue Culture(1992)〕。

【０００４】一方、タキソール生産法の先行技術として
は、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII(bacc
atin III) からの半合成法がHoltonらの米国特許に開示
されている〔US Patent:5015744〕。植物の組織培養法
を用いれば、バッカチンIII等の半合成原料の生産も可
能であり、本法によるタキソール生産にも有利である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
組織培養により、タキサン型ジテルペンの簡便な製造法
を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、タキサン
型ジテルペンの生産方法を開発するため、種々の生理活
性物質のスクリーニングをおこなった。鋭意研究の結
果、タキサン型ジテルペン産生植物植物の培養細胞また
は培養組織をコロナチン類、またはコロナチン類産生
菌、それら菌類の培養液、もしくはそれら菌類の培養抽
出物から選ばれる少なくとも１種以上を含む培地中で培
養を行うと、培養物中のタキサン型ジテルペン生産性が
向上することを見いだし、本発明を完成した。

【０００７】コロナチン類は、シュードモナス菌が生産
するクロロシス誘導物質として発見され、植物に対して
壊死、エチレンの生成促進、老化促進を誘導する活性が
あり、ジャスモン酸と同様にポテトの塊茎を肥大促進す
る作用も有している。

【０００８】すなわち、本発明はタキサン型ジテルペン
を産生する植物の培養細胞または培養組織を、コロナチ
ン類、またはコロナチン類産生菌、それら菌類の培養
液、もしくはそれら菌類の培養抽出物から選ばれる少な
くとも１種以上を含む培地中で培養し、得られる培養物
および／または培地からタキサン型ジテルペンを回収す
ることを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法で
ある。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、
タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はな
く、例えばタキソール、１０−デアセチルタキソール、
７−エピタキソ−ル、バッカチンIII 、１０−デアセチ
ルバッカチンIII 、７−エピバッカチンIII 、セファロ
マニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセ
ファロマニン、バッカチンVI、タキソールＣ、タキシシ
ンI、タキシシンIII、タキシンI、タキシンII、タキサ
ギフィン、タキサン１ａ、キシロシルセファロマニン、
キシロシルタキソール等が挙げられる。

【００１０】本発明の組織培養に用いられるタキサン型
ジテルペンを産生する植物としては、例えばセイヨウイ
チイ(Taxus baccata LINN)、イチイ(T. cuspidata SIE
B.etZUCC)、キャラボク(T. cuspidata SIEB.et ZUCC va
r. nana REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifolia
NUTT)、カナダイチイ(T. canadiensis MARSH)、中国イ
チイ(T. chinensis)、T.media等のイチイ属植物をあげ
ることができる。

【００１１】前記植物の組織培養は、本発明によりコロ
ナチン類、またはコロナチン類産生菌、それら菌類の培
養液、もしくはそれら菌類の培養抽出物から選ばれる少
なくとも１種以上を添加する以外は、従来から知られて
いる方法によって行なうことができる。

【００１２】コロナチン類産生菌としては、Pseudomona
s属、Xanthomonas属が知られている。Pseudomonas属と
しては、具体的には、P. syringae（IFO 3310）、P. gl
ycinea、P. tabaci（IFO 3508、IFO 14081）、P. aptata
（IFO 12655）、P. coronafaciens、P. phaseolicola
（IFO 12656、IFO 14078）、P. mori（IFO 14053、IFO 14
054、IFO 14055）、P. helianthi（IFO 14077）等を例示
できる。また、Xanthomonas属としては、X. campestris
（IFO 13303、IFO 13551）、X. citri、X. cucurbitae
（IFO 13552）、X. phaseoli（IFO 13553、IFO 1355
4）、X. pruni（IFO 3780、IFO 13557）等を例示でき
る。

【００１３】コロナチン類としては、下記の一般式
（Ｉ）：

【００１４】

【化６】 または一般式（II) ：

【００１５】

【化７】

【００１６】[式中Ｒ¹は、水酸基、ＯＲ²（ここでＲ²
は、炭素数１〜６のアルキル基または炭水化物残基を表
す。）、ＯＭ¹ （ここでＭ¹ は、アルカリ金属原子、ア
ルカリ土類金属原子またはＮＨ₄を表す。）、またはＮ
Ｒ^3aＲ^3b｛ここで、Ｒ^3a、Ｒ^3bは、それぞれ独立して水
素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアル
キル基、アミノ酸残基、または一般式（III)：

【化８】 （ここで、Ｒ⁴は、水素原子、水酸基、炭素数１〜６の
アルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、または、次
式 −ＣＯ−Ｒ⁷ （式中Ｒ⁷は、水酸基、ＯＭ² （ここでＭ² は、アルカ
リ金属原子、アルカリ土類金属原子またはＮＨ₄を表
す。）、ＮＲ^8aＲ^8b（ここで、Ｒ^8a、Ｒ^8bは、それぞれ
独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
〜６のアルキル基、アミノ酸残基を表す。）、またはＯ
Ｒ⁹ （ここでＲ⁹ は、炭素数１〜６のアルキル基、また
は炭水化物残基を表す。）を表す。）で示される基を表
し；Ｒ^5a 、Ｒ^5b、Ｒ^6a、およびＲ^6bは、それぞれ独立
して水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、ま
たは炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。）で示される
基を表す。）を表し；Ｒ^10a、Ｒ^10b 、Ｒ^11a 、Ｒ^11b、
Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ^14a 、Ｒ^14b 、Ｒ^15a 、Ｒ^15b、
Ｒ^16a 、Ｒ^16b 、Ｒ¹⁷、およびＲ¹⁹は、水素原子、水酸
基、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数１〜６の
アルコキシ基を表し；Ｒ¹⁸は、水素原子、炭素数１〜６
のアルキル基、または炭水化物残基を表し；式中の五員
環および六員環は、隣接する炭素原子間で二重結合を形
成してもよい。］で示される化合物等が挙げられる。

【００１７】前記一般式（I)、(II)、(III) において、
Ｒ² 、Ｒ^3a、Ｒ^3b、Ｒ⁴ 、Ｒ^5a、Ｒ ^5b、Ｒ^6a、Ｒ^6b、Ｒ
^8a、Ｒ^8b、Ｒ⁹ 、Ｒ^10a 、Ｒ^10b 、Ｒ^11a 、Ｒ^11b 、Ｒ
¹²、Ｒ¹³、Ｒ^14a 、Ｒ^14b 、Ｒ^15a 、Ｒ^15b 、Ｒ^16a 、
Ｒ^16b 、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹で表される炭素数１〜６のア
ルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ
−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブ
チル基、sec−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル
基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル
基、イソヘキシル基等が挙げられる。

【００１８】前記一般式（I)、(II)、(III) において、
Ｒ⁴ 、Ｒ^5a、Ｒ^5b、Ｒ^6a、Ｒ^6b、Ｒ ^10a 、Ｒ^10b 、Ｒ
^11a 、Ｒ^11b 、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ^14a 、Ｒ^14b 、Ｒ^15a 、
Ｒ^15b、Ｒ^16a 、Ｒ^16b 、Ｒ¹⁷、またはＲ¹⁹で表される
炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキシ
基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ
基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ
基、t-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、ネオペンチル
オキシ基、t-ペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基、
イソヘキシルオキシ基等が挙げられる。

【００１９】Ｒ¹ またはＲ⁷ がＯＭ¹ またはＯＭ² であ
る場合において、Ｍ¹ またはＭ² で表されるアルカリ金
属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナト
リウム、カリウム、カルシウム等が挙げられる。

【００２０】Ｒ¹またはＲ⁷が、ＮＲ^3aＲ^3bまたはＮＲ^8a
Ｒ^8bである場合において、Ｒ^3a、Ｒ ^3b、Ｒ^8a、またはＲ
^8bで表される炭素数１〜６のアシル基は、直鎖、分岐鎖
のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プ
ロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル
基、アクリロイル基等が挙げられる。

【００２１】Ｒ¹ またはＲ⁷ がＮＲ^3aＲ^3bまたはＮＲ^8a
Ｒ^8bである場合において、Ｒ^3a、Ｒ ^3b、Ｒ^8a、Ｒ^8bで表
されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル基、
バリル基、グルタミル基、リジル基を例示することがで
きる。

【００２２】Ｒ¹ またはＲ⁷ がＯＲ² またはＯＲ⁹ であ
る場合において、Ｒ² 、Ｒ⁹ で表される炭水化物残基と
しては、グルコピラノシル基が挙げられる。

【００２３】前記一般式（II) においてＲ¹⁸が、炭水化
物残基である場合としては、例えばグルコピラノシル基
が挙げられる。

【００２４】コロナチン類の好ましい化合物としては、
コロナチン（式IV) 、あるいはコロナファシック酸（式
V)が挙げられる。なかでもコロナチンは、式 (Ｉ) のな
かでも活性がもっとも強く、その構造は、コロナファッ
シック酸と２−エチル−１−アミノシクロプロパン−１
−カルボン酸とがアミド結合したものである。

【００２５】

【化９】

【００２６】

【化１０】

【００２７】本発明で使用されるコロナチン類には種々
の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存
在するが、それぞれの異性体を単独で用いても、混合物
の形で用いてもよい。

【００２８】コロナチン類、またはコロナチン類産生
菌、それら菌類の培養液、もしくはそれら菌類の培養抽
出物を培地に添加する場合は、コロナチン類の培地にお
ける濃度は通常０.００１〜１０００μＭとすることが
必要であり、特に０.０１〜１００μＭの範囲に調整す
ることが本発明の方法にとって好ましい。

【００２９】本発明の組織培養に使用される培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・
メディウム(1981年) 〔Woody Plant Medium〕の培地、
ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培
地等が挙げられる。

【００３０】これら培地に植物ホルモンを添加し、更に
必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸
等を添加することもできる。

【００３１】炭素源としては、シュクロース、マルトー
ス、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら
糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用で
きる。

【００３２】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。

【００３３】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA)、ナフタレン酢酸(NAA)、２,４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(2,4-D)等のオーキシン類、カイネチン、
ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用
いられる。

【００３４】ビタミン類としては、例えばビオチン、チ
アミン（ビタミンＢ1）、ピリドキシン（ビタミンＢ
6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用
いられる。

【００３５】アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。

【００３６】一般に前記の各成分は、無機成分が約0.1
μM、ないし100mM、炭素源が約1〜約30g/l、植物ホルモ
ン類が約0.01〜約10μM、ビタミン類及びアミノ酸類が
それぞれ約0.1〜約100mg/lの濃度で用いられる。

【００３７】尚、本発明には液体培地及び寒天やゲラン
ガム等を通常0.1〜1％含有する固形培地のいずれも使用
できるが、通常は液体培地が好ましい。

【００３８】本発明の組織培養においては、上記植物の
根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片
または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従
来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用
することができる。

【００３９】これらの組織または細胞を本発明によりコ
ロナチン類、またはコロナチン類産生菌、それら菌類の
培養液、もしくはそれら菌類の培養抽出物から選ばれる
少なくとも１種以上を含む培地を用いて培養すると、無
添加の場合と比較してタキサン型ジテルペンの高生産性
培養組織又は培養細胞が得られる。

【００４０】植物細胞培養物にコロナチン類を添加する
と、ある種の二次代謝に関与する生合成系が活性化され
ることが報告されているが〔W. Weiler et al., FEBS L
etters 345: 1 (1994)〕、タキサン型ジテルペン産生植
物の組織培養において培地添加物としてコロナチン類を
存在させて組織培養をおこなった例は報告されておら
ず、しかもそれによりタキサン型ジテルペンの産生量が
増大することは予想外のことであった。

【００４１】また、イチイ培養細胞に微生物または微生
物培養抽出物をエリシッターとして利用し、タキサン型
ジテルペンの生産性を高める方法は、国際公開ＷＯ９３
／１７１２１、US Patent:５０１９５０４に明記されて
いる。しかし、これらの特許においてはエリシッターと
して明記してあるものの、効果の程度については定かで
はない。また、これらの中には本発明で使用するコロナ
チン類産生菌であるPseudomonas属、Xanthomonas属に関
する記載はない。従って、コロナチン類産生菌、それら
菌類の培養液、またはそれら菌類の培養抽出物を存在さ
せてイチイ細胞の培養を行い、タキサン型ジテルペンの
産生量が増大することは予想外のことであった。

【００４２】以上のようにして、タキサン型ジテルペン
を産生する植物の培養細胞または培養組織を、コロナチ
ン類、またはコロナチン類産生菌、それら菌類の培養
液、もしくはそれら菌類の培養抽出物から選ばれる少な
くとも１種以上を含む培地中で培養を行うことによって
得られる培養物および／または培地からメタノール等の
有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分
離することができる。また、培地中に適当な吸着剤や有
機溶媒を共存させ、連続的にタキサン型ジテルペンを回
収することができる。

【００４３】本発明の組織培養の好ましい一例として
は、次の方法が挙げられる。

【００４４】先ずイチイ属に属する植物の植物体、例え
ば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片
を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラン
ト・メディウムの固体培地上に置床し、10〜35℃で14〜
60日程度経過させて組織片の一部をカルス化させる。こ
のようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度
が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安
定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュート
や根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち
細胞の生育速度が均質であるものをいう。

【００４５】この安定化したカルスを増殖に適した液体
培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体
培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速
度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又
は該カルスを構成する細胞は、コロナチン類を含有する
固体培地又は液体培地で培養される。

【００４６】コロナチン類産生菌の増殖は、一般細菌培
養用培地あるいは最少培地でおこなう。

【００４７】本発明に使用するコロナチン類産生菌培養
液としては、一例としてそれら菌類を培養した培養液を
無菌ろ過したものが挙げられる。

【００４８】また、コロナチン類産生菌培養抽出物とし
ては、一例としてそれら菌類を培養した培養液をオート
クレーブ（１２０℃、１５分間）したもの、あるいはそ
れら菌類の培養液を酸性条件で酢酸エチルなどの有機溶
媒により抽出したもの、あるいはさらにコロナチン、コ
ロナファシック酸を含む画分としてSephadex LH 20カラ
ムなどにより部分精製したものが挙げられる。

【００４９】コロナチン類、またはコロナチン類産生
菌、それら菌類の培養液、もしくはそれら菌類の培養抽
出物は、培養細胞が対数増殖期ないし定常期に添加する
ことがもっとも効果的であり、この中でも特に対数増殖
期から定常期に移行する時期に添加することが本発明の
方法にとって好ましい。たとえば、２１日おきに細胞を
移植している場合には７〜１６日目がコロナチン類、ま
たはコロナチン類産生菌、それら菌類の培養液、もしく
はそれら菌類の培養抽出物の添加の適期にあたる。ま
た、添加方法としては、一度に所定の量を添加してもよ
いし、数回に分けて逐次添加してもよい。

【００５０】本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が増殖速度が
大きいので好適である。また、培養期間としては、１４
〜４２日間が好適である。

【００５１】本発明の培養方法において液体培地を用い
た場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーション
または濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞
および／または培地から目的とするタキサン型ジテルペ
ンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離すること
ができる。

【００５２】本発明の効果を高める方法として、特願平
６−３６１５６、６−１０４２１１、６−１０４２１
２、６−１０４２１３号明細書にタキサン系化合物の生
産促進物質として開示されている、ジャスモン酸及びそ
の誘導体の存在下に培養する方法との併用が挙げられ
る。ジャスモン酸類としては、例えば、一般式（VI) ：

【００５３】

【化１１】

【００５４】［式中、Ｒ⁰ は次式： −（ＣＨ₂ ）_n −ＣＯ−Ｒ²⁵ ｛式中、Ｒ²⁵は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金
属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ₄ を表す。）、
ＮＲ^26a Ｒ^26b （ここで、Ｒ^26a 、Ｒ^26b は、それぞれ
独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ²⁷
（ここで、Ｒ²⁷ は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭
水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を
表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表
し；Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e及びＲ^1fは、それぞ
れ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は
炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ²⁰、Ｒ²¹、
Ｒ²²、Ｒ²³及びＲ^24a は、それぞれ水素原子又は炭素数
１〜６のアルキル基を表し；Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³ −Ｃ⁴ −
Ｃ⁵ −Ｃ⁶ からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結
合を含んでいてもよく；Ｒ^24b は、水酸基又は−Ｏ−炭
水化物残基を表し；前記５員環は隣接する環員炭素原子
間で二重結合を形成してもよい。］で示される化合物、
または一般式（VII)：

【００５５】

【化１２】

【００５６】［式中、Ｒ⁰ は次式： −（ＣＨ₂ ）_n −ＣＯ−Ｒ²⁵ ｛式中、Ｒ²⁵は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金
属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ₄ を表す。）、
ＮＲ^26a Ｒ^26b （ここで、Ｒ^26a 、Ｒ^26b は、それぞれ
独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ²⁷
（ここで、Ｒ²⁷は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水
化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表
し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e及びＲ^1fは、それぞれ水
素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素
数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ
²³及びＲ²⁴は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のア
ルキル基を表し；Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³ −Ｃ⁴ −Ｃ⁵ −Ｃ⁶
からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んで
いてもよく；前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二
重結合を形成してもよい。］で示される化合物、又は一
般式 (VIII) ：

【００５７】

【化１３】

【００５８】［式中、Ｒ⁰ は次式： −（ＣＨ₂ ）_n −ＣＯ−Ｒ²⁵ ｛式中、Ｒ²⁵は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金
属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ₄ を表す。）、
ＮＲ^26a Ｒ^26b （ここで、Ｒ^26a 、Ｒ^26b は、それぞれ
独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ²⁷
（ここで、Ｒ²⁷は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水
化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表
し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e及びＲ^1fは、それぞれ水
素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素
数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ
²³及びＲ²⁴は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のア
ルキル基を表し；Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³ −Ｃ⁴ −Ｃ⁵ −Ｃ⁶
からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んで
いてもよく；前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二
重結合を形成してもよい。］で示される化合物等が挙げ
られる。

【００５９】前記一般式（VI) 、（VII)及び (VIII) に
おいて、Ｒ⁰ 、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ^1f、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ^24a 、Ｒ²⁵、
Ｒ^26a 、Ｒ ^26b 、又はＲ²⁷で表される炭素数１〜６のア
ルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル
基、sec-ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イ
ソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−
ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。

【００６０】前記一般式（VI) 、（VII)及び (VIII) に
おいて、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e又はＲ^1fで表さ
れる炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメト
キシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキ
シ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ
基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペン
チルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオ
キシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基
等が挙げられる。

【００６１】Ｒ²⁵がＯＭである場合において、Ｍで表さ
れるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子として
は、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げら
れる。Ｒ²⁵がＮＲ^26a Ｒ^26b である場合において、Ｒ
^26a 、Ｒ^26b で表される炭素数１〜６のアシル基は、直
鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセ
チル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘ
キサノイル基、アクリロイル基等が挙げられる。

【００６２】Ｒ²⁵がＮＲ^26a Ｒ^26b である場合におい
て、Ｒ^26a 、Ｒ^26b で表されるアミノ酸残基としては、
例えばイソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基
が挙げられる。Ｒ²⁵がＯＲ²⁷である場合において、Ｒ²⁷
で表される炭水化物残基としては、例えばグルコピラノ
シル基が挙げられる。前記一般式（VI) において、Ｒ
^24b が−Ｏ−炭水化物残基である場合における炭水化物
残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられ
る。

【００６３】前記一般式（VI) 、（VII)又は (VIII) で
示される化合物の好ましいものとしては、Ｒ⁰ が−（Ｃ
Ｈ₂ ）_n ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ₂ ）_n ＣＯＯＣＨ₃ であ
り、Ｒ⁰ 、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ^1f、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ^24a、Ｒ²⁴が、それぞれ水
素原子を表すか、或いはＣ¹ とＣ² 、Ｃ³ とＣ⁴ 、又は
Ｃ ³ とＣ⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物が挙げら
れる。

【００６４】前記一般式（VI) で示されるジャスモン酸
類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合
物が挙げられる。 （化合物Ａ）

【００６５】

【化１４】

【００６６】（化合物Ｂ）

【００６７】

【化１５】

【００６８】（化合物Ｃ）

【００６９】

【化１６】

【００７０】（化合物Ｄ）

【００７１】

【化１７】

【００７２】前記一般式 (VII)で示されるジャスモン酸
類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合
物が挙げられる。 （化合物Ｅ）

【００７３】

【化１８】

【００７４】（化合物Ｆ）

【００７５】

【化１９】

【００７６】（化合物Ｇ）

【００７７】

【化２０】

【００７８】（化合物Ｈ）

【００７９】

【化２１】

【００８０】前記一般式（VIII) で示されるジャスモン
酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化
合物が挙げられる。 （化合物Ｉ） Ｒ⁰ ：−（ＣＨ₂ ）_n ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ₂ ）_n ＣＯ
ＯＣＨ₃ （ｎ＝１〜３） Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ^1f、Ｒ²⁰ Ｒ²¹ Ｒ
²²，Ｒ²³，Ｒ²⁴：Ｈ Ｃ³ −Ｃ⁴ 間：二重結合 （化合物Ｊ） Ｒ⁰ ：−ＣＨ₂ ＣＯＯＨ Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ^1f，Ｒ²⁰ Ｒ²¹ Ｒ
²²，Ｒ²³，Ｒ²⁴：Ｈ また、前記一般式（VIII) で示される化合物は、５員環
が、更に水酸基で置換されていてもよく、隣接する環員
炭素原子間で二重結合を形成してもよい。

【００８１】５員環が、更に水酸基で置換された化合
物、又は隣接する環員炭素原子間で二重結合が形成され
た化合物の具体例としては、例えば、以下に示す化合物
が挙げられる。 （化合物Ｋ）

【００８２】

【化２２】

【００８３】（化合物Ｌ）

【００８４】

【化２３】

【００８５】（化合物Ｍ）

【００８６】

【化２４】

【００８７】（化合物Ｎ）

【００８８】

【化２５】

【００８９】前記ジャスモン酸類には種々の立体異性体
（シストランス異性体、光学異性体）が存在するが、そ
れぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いて
もよい。以上のジャスモン酸類は、全てタキサン型ジテ
ルペンの生産性向上に効果を有するが、中でも前記一般
式（VI) 、(VII) 、及び(VIII)においてＲ⁰ が−ＣＨ₂
ＣＯＯＨ又は−ＣＨ₂ ＣＯＯＣＨ₃ であり、Ｒ^1a、
Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ ^1f、Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ
²³、Ｒ²⁴、Ｒ^24a が水素原子であり、Ｃ³ とＣ⁴ の間で
二重結合を形成している化合物であるジャスモン酸又は
ジャスモン酸メチル、ツベロン酸又はツベロン酸メチ
ル、及びククルビン酸又はククルビン酸メチルが生産性
向上に対する効果の大きさの点から特に好ましい。

【００９０】これらジャスモン酸類は、合成により、又
は植物からの抽出等により調製される（H. Yamane et a
l., Agric. Biol. Chem., 44, 2857-2864(1980) ）。一
方、ジャスモン酸類は、生長促進や組織の成熟、病害抵
抗性の発現にかかわる諸反応を誘起する植物ホルモン様
物質として、種々の植物が自ら生産することが、吉原照
彦著、植物細胞工学第２巻第４号523〜531頁（1990年）
に記載されている。

【００９１】従って、前記ジャスモン酸類は、培養系外
から添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に
自ら生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸
類の培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法と
しては、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物或い
は植物抽出物などの培地への添加を例示することがで
き、具体的にはM.J.Mueller et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.,90(16),7490-7494 (1993) に記載の、
カビ細胞壁画分を添加する方法を例示することができ
る。更に、使用する培養細胞又は培養組織に、機械的に
又は紫外線、熱などによって部分的に傷害を与えること
によっても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めること
が可能であり、具体的には、R.A.Cleeman et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,89(11), 4938-4941 (198
9) に記載の、機械的に一部の細胞を破壊する方法を例
示することができる。

【００９２】ジャスモン酸類は、水に対して難溶性のた
め、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界
面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離
形のジャスモン酸類は、そのまま用いてもよいし、アル
カリで中和して塩にして用いてもよい。

【００９３】ジャスモン酸類は、５員環カルボニル基の
α位が、酸、アルカリ、熱によってエピマー化を起こす
ため、不安定なシス型より安定なトランス型になりやす
い。天然又は合成ジャスモン酸を用いた平衡実験では、
トランス型が90％、シス型が10％の状態で存在する。一
般にはシス型の方が活性が強いとされているが、本発明
で使用することができるジャスモン酸類は、前記式（V
I)(VII)(VIII)で示される全ての立体異性体化合物及び
その混合物を包含する。

【００９４】ジャスモン酸類は、培地における濃度は0.
01〜1000μＭであり、この中でも特にジャスモン酸類の
濃度を0.1〜500μＭの範囲に調整することが好ましい。

【００９５】ジャスモン酸類は、培養細胞の対数増殖期
ないし定常期に添加することが効果的であり、この中で
も特に対数増殖期から定常期に移行する時期にジャスモ
ン酸類を添加することが好ましい。また、内在性ジャス
モン酸類の生産量を高めるための処理の時期についても
これと同様である。例えば、21日おきに細胞を移植して
いる場合には７〜16日目がジャスモン酸類の添加又は内
在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の適期
にあたる。また、ジャスモン酸類の添加及び内在性ジャ
スモン酸類の生産量を高める処理は、一度に行ってもよ
いし、複数回に分けて行ってもよい。

【００９６】また本発明は、特願平６−１４６８２６号
明細書に開示されている、培養器内の気相中の酸素濃度
を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に制御し
て培養を行うか、或いは組織及び／又は細胞と接する流
動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度に
於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培
養する方法とも併用することができる。

【００９７】ここで、培養初期とは、培養開始時ないし
培養開始後７日目をいい、培養器内の気相中の酸素濃
度、又は組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の
溶存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うことが好ま
しい。また、制御の期間としては、培養全期間を通して
該条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部期間の
みを制御してもよく、特に限定するものではないが、全
培養期間中の、少なくとも３日間制御することが好まし
い。

【００９８】培養器内の気相中の酸素濃度は、４ないし
15％に制御することが必要であり、特に６ないし12％に
制御することが好ましい。また、流動性の培地中の溶存
酸素濃度は、その温度における飽和溶存酸素濃度値の１
ないし75％に制御することが必要であり、特に10ないし
75％に制御することが好ましい。

【００９９】また、本発明は、特願平５−２８４８９３
号、同６−１０４２１３号明細書に開示されている、細
胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも１つ
の層に含まれる細胞を培養する方法と併用することもで
きる。細胞を比重によって分離する方法としては、一般
に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、細胞を重
層した後、遠心分離する方法が知られている。

【０１００】遠心分離用媒体としては、Ficoll、Percol
l （共にPharmacia LKB Biotechnology 社製）、ショ
糖、塩化セシウム等が用いられる。密度勾配を形成する
層の数に特に制限はない。各層の比重差は、特に限定さ
れるものではなく、また各比重差は同じであっても異な
っていてもよい。従って、この密度勾配の定義には勾配
が連続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数が
無限大、各層の比重差が０に近い状態）も含む。

【０１０１】このようにして密度勾配を形成し、細胞を
重層、遠心分離することにより細胞を比重の違いにより
複数の層に分けることができる。作成する層の比重は、
通常1.00〜1.20g/ml、好ましくは1.03〜1.11g/mlの範囲
である。培養の対象となる層としては、少なくとも１つ
の層を選択し、また全ての層を選択して培養してもよ
い。

【０１０２】複数の層を選択して培養する場合、これら
の複数の層は、それぞれ個別に培養することもできる
が、選択した複数の層のうちの２層以上の層を混合して
培養することもできる。タキサン型ジテルペン産生能の
高い培養細胞は、通常、比重が1.07以下の層に含まれる
細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件
により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定さ
れるものではない。また、単に比重の違いによって分画
しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジ
テルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、よ
り確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得す
るためには、分画された全ての層の細胞を一定期間培養
した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃
度を測定し、それらの中からタキサン型ジテルペン高産
生細胞を含む層を選択することが望ましい。

【０１０３】また、例えば1.07g/mlのように、ある１つ
の特定の比重の遠心分離媒体を作成し、前述の方法で遠
心分離することによっても、培養細胞を比重の違いによ
り複数の層に分けることができる。

【０１０４】また、本発明は、特願平６−２０１１５０
号明細書に記載されている、重金属を含む化合物類、重
金属イオンを含む錯イオン類、及び重金属イオンから選
ばれた少なくとも一つの存在下に培養する方法との併用
が挙げられる。ここで、重金属としては、銀に代表され
る銅族、コバルトに代表的される鉄族を使用することが
好ましく、当該重金属を含む化合物、当該重金属を含む
錯イオン類、又は当該金属イオンの形で使用することが
好ましい。特にチオ硫酸銀イオンが好ましい。重金属の
濃度は１０^-8Ｍ〜１０^-2Ｍが好ましい。また、本発明
は、特願平６−２０１１５１号明細書に記載されてい
る、アミン類の存在下に培養する方法との併用が挙げら
れる。ここでアミン類としては、ポリアミン類、具体的
にはプトレッシン、スペルミジン、スペルミン、エチレ
ンジアミン、N,N-ジエチル-1,3- プロパンジアミン、ジ
エチレントリアミン、及びこれらの化合物の塩より成る
群から選ばれる少なくとも一種以上を使用することが好
ましい。アミン類の濃度は１０^-8Ｍ〜１０^-1Ｍが好まし
い。

【０１０５】また、本発明は、特願平６−２９１７８３
号明細書に記載されている、サイクロデキストリンなど
の環状多糖類の存在下に培養する方法との併用が挙げら
れる。

【０１０６】また、本発明にかかる方法と、上述の先願
特許に記載の方法のいくつか又はすべてを組み合わせる
ことも可能である。

【０１０７】以上のようにして得られた組織又は細胞か
ら、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタキサ
ン型ジテルペンを分離することができる。

【０１０８】

【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。

【０１０９】〔実施例１〕ナフタレン酢酸を10^-5Mの濃
度になるように添加したウッディー・プラント・メディ
ウムの固体培地（ゲランガム0.25重量％）に、前もって
2％アンチホルミン溶液または70％エタノール溶液等で
滅菌処理したセイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)の茎
の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してセイヨウ
イチイカルスを得た。次にこのカルス１g（新鮮重）
を、上記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラン
ト・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラスコに移
し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、12
0rpm）し、21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速
めた。

【０１１０】一方、コロナチン類産生菌としてPseudomo
nas syringae（IFO 3310）を用い、まず細菌培養用８０
２培地（Polypepton 1.0%, Yeast extract 0.2%, MgSO₄
・7H₂O 0.1%, pH 7.0）３ｍｌ入りの試験管で、１８０ｒ
ｐｍ、３０℃で２４時間培養し菌を増殖する。次に増殖
した菌を含む上記培養液１００μｌをグルコース最少培
地（glucose 8.8g/l, KH₂PO₄ 2.6g/l, Na₂HPO₄・2H₂O 6.
9g, NH₄Cl 2.5g/l, Na ₂SO₄ 1g/l, FeSO₄ 0.01g/l, MnSO
₄ 0.01g/l, MgCl₂ 0.05g/l, pH6.8）５０ｍｌ入りの三
角フラスコに移し、さらに３０℃で２４時間培養した。
このようにして得られたコロナチン類産生菌培養液を約
１／２０に濃縮後、２Ｎ H₂SO₄でｐＨを３に調整し、酢
酸エチルで抽出した。得られたカルボン酸画分を減圧乾
燥の後、エタノール２ｍｌに溶解し、その無菌ろ過液を
コロナチン類産生菌培養抽出液とした。

【０１１１】得られたセイヨウイチイ培養細胞１ｇ（新
鮮重）を、ウッディー・プラント・メディウムの液体培
地20ml入りの三角フラスコに移して25℃で14日間振盪培
養した。培養14日目にコロナチン類産生菌培養抽出液50
μlを培地に添加し、さらに7日間培養した。

【０１１２】培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞をろ
過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定
し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求め
た。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキ
サン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカ
チンIII と比較定量することによってタキサン型ジテル
ペン収量を測定した。その結果を表１に示す。

【０１１３】〔比較例１〕実施例１において、コロナチ
ン類産生菌培養抽出液を添加しない以外は該実施例と同
様に操作した。その結果を表１に示す。

【０１１４】〔実施例２〕実施例１において、コロナチ
ン類産生菌抽出液のかわりにPseudomonas syringaeを最
小培地で培養後無菌ろ過した液１ｍｌを添加して培養す
る以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に
示す。

【０１１５】〔実施例３〕実施例１において、コロナチ
ン類産生菌抽出液のかわりにPseudomonas syringaeを最
小培地で培養後オートクレーブした液１ｍｌを添加して
培養する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を
表１に示す。

【０１１６】〔実施例４〕実施例１において、コロナチ
ン類産生菌としてXanthomonas campestris（IFO13551）
を用いた以外は該実施例と同様に操作した。その結果を
表１に示す。

【０１１７】〔実施例５〕実施例１において、コロナチ
ン類産生菌としてPseudomonas syringaeを培養14日目の
イチイ培養培地に直接植菌し、さらに7日間培養した。
培養終了後は、該実施例と同様に操作した。その結果を
表１に示す。

【０１１８】〔実施例６〕実施例１において、コロナチ
ン類産生菌としてXanthomonas campestrisを培養14日目
のイチイ培養培地に直接植菌し、さらに7日間培養し
た。培養終了後は、該実施例と同様に操作した。その結
果を表１に示す。

【０１１９】

【表１】

【０１２０】〔実施例７〕ナフタレン酢酸を10^-5Mの濃
度になるように添加したウッディー・プラント・メディ
ウムの固体培地（ゲランガム0.25重量％）に、前もって
2％アンチホルミン溶液または70％エタノール溶液等で
滅菌処理したセイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)の茎
の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してセイヨウ
イチイカルスを得た。次にこのカルス１g（新鮮重）
を、上記成分を同じ濃度で添加した液体ウッディー・プ
ラント・メディウム20ml入りの三角フラスコに移し、ロ
ータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、120rpm）
し、21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

【０１２１】このようにして得られた培養細胞１ｇ（新
鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加した液体ウッディ
ー・プラント・メディウム20ml入りの三角フラスコに移
して25℃で14日間振盪培養した。培養14日目にコロナチ
ン類としてコロナチン〔式（IV）〕をその終濃度が0.00
1〜1000μＭになるように添加し、さらに7日間培養し
た。

【０１２２】培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾
過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定
し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求め
た。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキ
サン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカ
チンIII と比較定量することによってタキサン型ジテル
ペン収量を測定した。その結果を表２に示す。

【０１２３】〔比較例２〕実施例７において、コロナチ
ンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その
結果を表２に示す。

【０１２４】〔実施例８〕実施例７において、コロナチ
ン類としてＮ−コロナファコイルバリン〔式（ＩＸ) 〕
を１μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表２に示す。

【０１２５】

【化２６】

【０１２６】〔実施例９〕実施例７において、コロナチ
ン類としてコロナチンのメチルエステルを１μＭ添加す
る以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に
示す。

【０１２７】〔実施例１０〕実施例７において、コロナ
チン類としてコロナファシック酸〔式（V)〕を１０μＭ
添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を
表２に示す。

【０１２８】〔実施例１１〕実施例７において、コロナ
チン類としてコロナファシック酸のメチルエステルを１
０μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。その
結果を表２に示す。

【０１２９】〔実施例１２〕実施例７と同様にして得ら
れたメディアイチイ(Taxus media) 培養細胞を用い、コ
ロナチン類としてコロナチンをその終濃度が１μＭにな
るように添加する以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表２に示す。

【０１３０】〔比較例３〕実施例１２において、コロナ
チンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表２に示す。

【０１３１】

【表２】

【０１３２】

【発明の効果】本発明によれば、コロナチン類、または
コロナチン類産生菌、それら菌類の培養液、もしくはそ
れら菌類の培養抽出物から選ばれる少なくとも１種以上
を含む組織培養培地を用いたタキサン型ジテルペン産生
植物の組織培養によって、大量のタキサン型ジテルペン
を簡便に得ることが可能になった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＤＵ Ｚ Ｃ０７Ｈ 13/00 15/20 // Ｃ０７Ｈ 15/18 (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の
   培養細胞および／または培養組織をコロナチン類、また
   はコロナチン類産生菌、それら菌類の培養液、もしくは
   それら菌類の培養抽出物から選ばれる少なくとも１種以
   上を含む培地中で培養し、得られる培養物および／また
   は培地からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴
   とするタキサン型ジテルペンの製造方法。
2. 【請求項２】 コロナチン類が下記の一般式（Ｉ）： 【化１】 または一般式（II）： 【化２】 [式中Ｒ¹は、水酸基、ＯＲ²（ここでＲ² は、炭素数１
   〜６のアルキル基または炭水化物残基を表す。）、ＯＭ
   ¹ （ここでＭ¹ は、アルカリ金属原子、アルカリ土類金
   属原子またはＮＨ₄を表す。）、またはＮＲ^3aＲ^3b（こ
   こで、Ｒ^3a、Ｒ^3bは、それぞれ独立して水素原子、炭素
   数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基、アミ
   ノ酸残基、または一般式（III)： 【化３】 （ここで、Ｒ⁴は、水素原子、水酸基、炭素数１〜６の
   アルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、または、次
   式 −ＣＯ−Ｒ⁷ （式中Ｒ⁷は、水酸基、ＯＭ² （ここでＭ² は、アルカ
   リ金属原子、アルカリ土類金属原子またはＮＨ₄を表
   す。）、ＮＲ^8aＲ^8b（ここで、Ｒ^8a、Ｒ^8bは、それぞれ
   独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
   〜６のアルキル基、アミノ酸残基を表す。）、またはＯ
   Ｒ⁹ （ここでＲ⁹ は、炭素数１〜６のアルキル基、また
   は炭水化物残基を表す。）を表す。）で示される基を表
   し；Ｒ^5a 、Ｒ^5b、Ｒ^6a、およびＲ^6bは、それぞれ独立
   して水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、ま
   たは炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。）で示される
   基を表す。）を表し；Ｒ^10a、Ｒ^10b 、Ｒ^11a 、Ｒ^11b、
   Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ^14a 、Ｒ^14b 、Ｒ^15a 、Ｒ^15b、
   Ｒ^16a 、Ｒ^16b 、Ｒ¹⁷、およびＲ¹⁹は、水素原子、水酸
   基、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数１〜６の
   アルコキシ基を表し；Ｒ¹⁸は、水素原子、炭素数１〜６
   のアルキル基、または炭水化物残基を表し；式中の五員
   環および六員環は、隣接する炭素原子間で二重結合を形
   成してもよい。］で表されることを特徴とする請求項１
   に記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
3. 【請求項３】 コロナチン類がコロナチン（式IV) であ
   ることを特徴とする請求項１に記載のタキサン型ジテル
   ペンの製造方法。 【化４】
4. 【請求項４】 コロナチン類がコロナファシック酸（式
   V)であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン型
   ジテルペンの製造方法。 【化５】
5. 【請求項５】 タキサン型ジテルペンが、タキソール、
   １０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バ
   ッカチンIII 、１０−デアセチルバッカチンIII 、７−
   エピバッカチンIII 、セファロマニン、１０−デアセチ
   ルセファロマニン、７−エピセファロマニン、バッカチ
   ンVI、タキソールＣ、タキシシンI、タキシシンIII、タ
   キシンI、タキシンII、タキサギフィン、タキサン１
   ａ、キシロシルセファロマニン、及びキシロシルタキソ
   ールよりなる群から選ばれる少なくとも１種類以上であ
   ることを特徴とする請求項１に記載のタキサン型ジテル
   ペンの製造方法。
6. 【請求項６】 タキサン型ジテルペンを産生する植物が
   イチイ属植物であることを特徴とする請求項１記載に記
   載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
7. 【請求項７】 タキサン型ジテルペンを産生する植物が
   Taxus baccataであることを特徴とする請求項１に記載
   のタキサン型ジテルペンの製造方法。
8. 【請求項８】 タキサン型ジテルペンを産生する植物が
   Taxus mediaであることを特徴とする請求項１に記載の
   タキサン型ジテルペンの製造方法。
9. 【請求項９】 コロナチン類産生菌がPseudomonas属で
   あることを特徴とする請求項１に記載のタキサン型ジテ
   ルペンの製造方法。
10. 【請求項１０】 コロナチン類産生菌がPseudomonas sy
    ringaeであることを特徴とする請求項１に記載のタキサ
    ン型ジテルペンの製造方法。
11. 【請求項１１】 コロナチン類産生菌がXanthomonas属
    であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン型ジ
    テルペンの製造方法。
12. 【請求項１２】 コロナチン類産生菌がXanthomonas ca
    mpestrisであることを特徴とする請求項１に記載のタキ
    サン型ジテルペンの製造方法。
13. 【請求項１３】 コロナチン類産生菌の培養液が、それ
    ら菌類の培養液を無菌ろ過したものであることを特徴と
    する請求項１に記載のタキサン型ジテルペンの製造方
    法。
14. 【請求項１４】 コロナチン類産生菌の培養抽出物が、
    それら菌類の培養培養液を酸性条件で有機溶媒により抽
    出したものであることを特徴とする請求項１に記載のタ
    キサン型ジテルペンの製造方法。
15. 【請求項１５】 コロナチン類産生菌の培養抽出物が、
    それら菌類の培養液を加熱処理したものであることを特
    徴とする請求項１に記載のタキサン型ジテルペンの製造
    方法。
16. 【請求項１６】 培地中のコロナチン類の濃度が 0.00
    1〜1000μＭであることを特徴とする請求項１に記載の
    タキサン型ジテルペンの製造方法。