JPH08205884A - 通気攪拌培養によるバクテリアセルロースの製造方法及び培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 通気攪拌培養におけるバイオセルロースの生
産速度を増加させること。 【構成】 ２重量％のバクテリアセルロースを含み、か
つ塑性粘度が１５〜２０ポイズであるような模擬液を用
いて測定した酸素移動容量係数（ＫＬａ）が約２５〜５
０／hrである装置条件下で、少なくとも一定期間セルロ
ース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の範囲の酸素移動
容量係数（ＫＬａ）を達成し得る培養装置及び該特定の
範囲のＫＬａの条件下でセルロース性物質を生産する能
力を有する微生物（以下、「セルロース生産菌」とい
う。）に属する菌体を用いるセルロース性物質（以下、
「バクテリアセルロース」又は「ＢＣ」という。）を製
造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＢＣ（バクテリアセルロース）は可食性
であり食品分野で利用されるほか水系分散性に優れてい
るので食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料
生地の強化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー
添加物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値があ
る。ＢＣは木材パルプ等から製造されるセルロースに較
べ、フィブリルの断片幅が２ケタ程度も小さいことを特
徴とする。従って、ＢＣの離解物はミクロフィブリルの
かかる構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分
子用補強剤として各種の産業用用途がある。このような
セルロース性離解物を紙状または固型状に固化した物質
は高い引張弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的
特徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用
素材としての応用がある。

【０００３】ＢＣの製造方法に関しては、特開昭６２−
２６５９９０号、特開昭６３−２０２３９４号及び特公
平６−４３４４３号等にＢＣの製造方法に関する記載が
ある。セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされ
ている栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキ
ス、燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／He
strin 培地（Schramm ら、J. General Biology, ll, p
p.123〜129, l954 ）が知られている。また、このよう
な栄養培地に、培地中の特定栄養素によるセルロース生
成促進因子である、イノシトール、フィチン酸及びピロ
ロキノリンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公
報；高井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３
７〜２４４頁）等を添加したり、更には、カルボン酸又
はその塩（特願平５−１９１４６７号）、インベルター
ゼ（特願平５−３３１４９１号）及びメチオニン（特願
平５−３３５７６４号）を添加することによって、セル
ロース性物質の生産性が向上することが見い出されてい
る。また、従来より、微生物を培養する培養形式として
は、静置、振盪もしくは通気攪拌培養等が用いられてき
た。また、培養操作法としては、いわゆる回分発酵法、
流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等が使
用されてきた。尚、攪拌手段としては、例えばインペラ
ー（攪拌羽根）、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポ
ンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等が使用されて
いる。インペラーの種類としては、門型羽根、タービン
羽根、ヘリカルリボン羽根及びスクリュー羽根等が知ら
れている。

【０００４】ところで、工業的な発酵プロセス一般に於
いては、培養の酸素要求量を通気と攪拌で充足させてい
る。しかし、多くの発酵プロセスでは発酵槽の酸素供給
能で生産性が律速されており、従って、微生物の培養に
際して酸素供給に影響を与える要因を検討することは重
要であると考えられる。培養系で空気中の酸素が菌体に
移動するに際して、気泡から液相への酸素移動は次式に
よって代表される。

【数１】 ここで、ＣＬは培養液中の溶存酸素濃度（mmol／ｌ）、
ｔは時間（hr）、

【数２】 は一定時間における溶存酸素濃度の変化、すなわち酸素
移動速度（mmol／ｌ・hr）、ＫＬは液境膜の酸素移動速
度係数（cm／hr）、ａは単位体積当たりの気液界面積
（cm² ／cm³)、Ｃ^* は気泡の酸素分圧と平衡な溶存酸素
濃度（mmol／ｌ）である。ＫＬは酸素の気相から液相へ
の移動の抵抗の逆数であり、（Ｃ^* −ＣＬ）は酸素が抵
抗に逆らって移動するための推進力(driving force）で
あるとみなすことができる。発酵系のＫＬとａを測定す
ることは大変困難なことであるから、この２項を掛け合
わせたＫＬａを酸素移動容量係数と呼んで用いている。
ＫＬａのディメンジョンは時間の逆数で、通常hr^-1で表
す。酸素移動容量係数は発酵槽の酸素移動能を表す目安
となるもので、同じ条件ではＫＬａの大きいもののほう
が酸素移動の能力が大きいことを示す。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来の、特に通気攪拌
培養における回分及び流加発酵法にあっては、セルロー
ス生産菌の培養によって培養液中にＢＣが蓄積されてく
るのに伴い、培養期間の後半には培養液の粘度が増加
し、その結果、培養系全体を均一かつ充分に攪拌混合す
ることが著しく困難になる為、酸素の供給（通気）が不
充分となって菌によるＢＣの生産速度が低下していたの
である。そこで、本発明者等は、酸素供給能力の指標で
あるＫＬａに関して優れた装置性能を有する培養装置を
開発し、本発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、門型羽
根とタービン羽根を同一槽内に備えたことを特徴とする
培養装置に係わるものである。門型羽根及びタービン羽
根自体は従来公知の種々の形態のものを使用することが
できる。例えばタービン羽根としては、一般的なラシュ
トンタービンの他に、ディスクのないパドル型やパドル
型の直上にディスクを備えたもの、湾曲パドル型、スカ
バー型及びマリンインペラー型等を使用することができ
る。本発明の培養装置に於いて、門型羽根とタービン羽
根とは、同一槽内に於いて同一軸又は別個の軸に備える
ことができる。タービン羽根を門型羽根と同一軸上でそ
の下（Ａ）又は中間部分（Ｂ）に備える装置が好適であ
る（図１参照）。門型羽根は培養液に均一な混合を起こ
させる軸流及び幅流方向の流動を与え、一方、タービン
羽根は部分的に高い剪断により気泡の微細化の挙動を与
えるものであるが、これらの２種類の形態の羽根を同一
装置内に備えることによって、以下に示されるように従
来技術からは予想外の高いＫＬａが得られるのである。

【０００７】更に、本発明は攪拌羽根を槽内水平軸上に
備えて成る培養装置に係わるものである。攪拌羽根とし
ては、すでに「インペラー」として従来公知のものを使
用できる。これらのものから２種以上を水平同軸上に設
けることも可能である。この型の装置によっても、培養
液の流動性が向上し、高いＫＬａが得られるのである。
尚、水平軸は約８０°まで傾けて使用することができ
る。ＫＬａは培養において重要で一般的な装置性能の指
標であるが、対照となる液の性質や攪拌羽根の形状、回
転数により変化する。本発明者等は目的とするバクテリ
ア・セルロースの液性（セルロース生産菌の培養液）に
近い模擬液を設定し、そこでＫＬａで評価することによ
り、生産性の向上に直接関係した因子として評価するこ
とができる。この評価系で測定すれば、攪拌羽根の形状
と回転数は任意の条件を選ぶことができる。

【０００８】ＫＬａの測定方法：２重量％のバクテリア
セルロースを含み、かつ塑性粘度が１５〜２０ポイズで
あるような模擬液を全量３Ｌのガラス製ジャーファーメ
ンターの６０％に張り込んだ状態で測定する。攪拌羽根
を回転させながら窒素を通気することにより溶存酸素濃
度を０〜１０％飽和状態とした模擬液に、次に酸素分圧
２０〜２１％の空気を通気し、これによって上昇する溶
存酸素濃度を溶存酸素電極を用いて測定する。ＫＬａは
前記（数１）式より求められるが、簡便には、５〜３０
秒毎に溶存酸素濃度を測定し、時間ｔ１での溶存酸素濃
度ＤＯ１と時間ｔ２での溶存酸素濃度ＤＯ２から以下の
式でＫＬａを求める。 （（ＤＯ２−ＤＯ１）／（ｔ２−ｔ１））／（Ｃ^* −
（ＤＯ１＋ＤＯ２）／２）、単位（／hr） （但し、式
中Ｃ^* は気泡の酸素分圧と平衡な溶存酸素濃度）

【０００９】以上の系を用いる測定によると、図２に示
されるように、所要動力５〜１５０kg・cm/sec・L の範
囲で、従来から一般的な培養で用いられているタービン
型羽根では回転数４００〜１，２００rpm でＫＬａは５
／hr以下であり、特願平５−２８４９９０で用いられて
いるような門型羽根では回転数４００〜１，２００rpm
でＫＬａは約２〜１５／hrである。因みに回転数をこれ
以上大きくしても、動力がうまく液全体に伝わらず、Ｋ
Ｌａの上昇は望めない。一方、本発明の装置で用いる攪
拌羽根を使用すると回転数４００〜１，２００rpm でＫ
Ｌａは約２０〜５０／hrを達成できる。回転数を更に上
げればＫＬａの値も増加するが、ＫＬａが約５０／hr以
上になると消費動力に対するＫＬａの増加効率が低くな
り、経済的側面からはさほど有効ではない。従って、本
発明の培養装置は、例えばセルロース生産菌を培養する
場合のように、培養液の粘度が高い培養系に使用するの
に特に適している。

【００１０】本発明はまた、ＫＬａが約２５以上、特に
約２５〜５０／hrである装置条件下で、少なくとも一定
期間セルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製
造する方法に係わる。本明細書中、「ＫＬａが約２５〜
５０／hrである装置条件」とは、当該培養装置の攪拌羽
根を、本明細書中で定義した前述の測定系に適用して得
られるところの数値である。培養に際してどの時期にど
の程度の期間をかかる特定の装置条件下に制御するかは
菌体の種類、培地の組成及び培養装置の種類等に応じて
等業者が適宜選択しうる。菌体の増殖と共に培地の粘度
が増加してくるため、通常は少なくとも、培養液中のセ
ルロース濃度が５ｇ／Ｌ以上となる時期、又は生産速度
が０．２ｇ／Ｌ／hrとなる時期に一定期間上記特定の範
囲のＫＬａを達成して培養系に充分な酸素の供給を行な
うようにすることが好ましい。この特定の装置条件を培
養期間中、断続的に設けることも可能である。

【００１１】本発明方法の好適態様としては、本発明の
培養装置を用いる方法である。本発明の培養装置は、す
でに記載したように、優れたＫＬａ性能、特に１００cp
以上のような高粘度状態、又はビンガム塑性を示す流体
条件下でかかる高いＫＬａを達成することのできる培養
装置である。本発明の方法によって、極めて高いバイオ
セルロースの生産速度が得られるのである。本発明方法
を実施するに際しては、前述の培養形式・培養操作法に
加えて、特願平６−１９２２８７号に記載されている
「培養装置と浮上分離装置及びエッジフィルター等の分
離装置の間で菌体を含む培養液を循環させるセルロース
性物質の製造方法であって、該分離装置に於いて、生産
物であるセルロース性物質を菌体及び培養液から分離す
ることを特徴とする、前記方法」及び特願平６−１９２
２８８号に記載されている「セルロース生産菌を培養し
てセルロース性物質を製造する方法であって、培養期間
中、培養系からの培養液の引き抜き及び該引き抜き量と
ほぼ等容量の新たな培養液の供給を連続的に行なうこと
によって、培養中の培養液に於けるセルロース性物質の
濃度を例えば１０ｇ／Ｌ以下、又は酸素消費速度が１５
μmol ／Ｌ／hr以上に保つことができるように低く維持
することを特徴とする前記製造方法」を採ることもでき
る。

【００１２】本発明において使用されるセルロース生産
菌は、例えば、ＢＰＲ２００１株に代表されるアセトバ
クター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファ
ーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp. sucroferm
entans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter
xylinum ）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシ
リナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリ
アヌス（A. pasteurianus ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセ
トバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバ
クター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバク
ター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌、その
他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、サルシナ
属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アルカリ
ゲネス属、アエロバクター属、アゾトバクター属及びズ
ーグレア属並びにそれらをＮＴＧ（ニトロソグアニジ
ン）等を用いる公知の方法によって変異処理することに
より創製される各種変異株である。尚、ＢＰＲ２００１
株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後１９９
４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５４５）に移管されている。

【００１３】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリ
コール、エタノール等を単独或いは併用して使用するこ
とができる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解
物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、
サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロ
ースに加えて使用することもできる。 また、窒素源と
しては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或
いは無機の窒素源を使用することができ、或いはＢａｃ
ｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅ
ａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天然栄養源
を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビ
タミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−
１Ｈピロロ〔２，３，５〕−キノリン−４，５−ジオ
ン、亜硫酸パルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加し
てもよい。

【００１４】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、前述のセルロース生成促進因子を適宜培
地中に添加することもできる。例えば、酢酸菌を生産菌
として用いる場合には、培養のｐＨは３ないし７に、好
ましくは５付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、
好ましくは２５〜３５℃の範囲で行う。培養装置に供給
する酸素濃度は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％
であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合及び培
地に対する菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適
宜選択し得るものである。

【００１５】本発明の方法によって製造されるＢＣは菌
体はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれ
る菌体を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く
処理を施すことが出来る。不純物を取り除くためには、
水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸
ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチ
ームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソー
ダ、デオキシコール酸などの界面活性剤による処理、常
温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用し
て行い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去
することができる。このようにして得られた本発明でい
うセルロース性物質とは、セルロース及び、セルロース
を主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及びβ−１，３、β
−１，２等のグルカンを含むものである。ヘテロ多糖の
場合のセルロース以外の構成成分はマンノース、フラク
トース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラ
ムノース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸
等である。尚、これ等の多糖が単一物質である場合もあ
るし２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよ
い。

【００１６】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ 以下の条件で、本発明の製造方法を実施した。本明細書
中で特定した測定系に於いてＫＬａが約２〜１５／hrで
あるような従来の培養装置（門型羽根、タービン羽根及
びダブルヘリカルリボン）、及び同じ条件下でＫＬａが
約２５〜５０／hrである本発明の培養装置（タービン羽
根が門型羽根と同一軸上でその中に備えられた装置
（Ａ）、タービン羽根が門型羽根と同一軸上でその下に
備えられた装置（Ｂ）及び攪拌羽根（門型羽根）が水平
軸（横軸）上に備えられた装置（Ｃ））を使用して、前
記ＢＰＲ２００１株（図３及び図６）、ＢＰＲ３００１
Ｎ株（平成６年６月１０日付寄託済、受託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１４３６１）（図４）及びＢＰＲ２００１株から
ＮＴＧ処理によって得られた新規変異株（図５及び図
７）を以下の条件で培養した。培養条件 ：前培養として、１２５mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地
の入った５００ml容のバッフル付フラスコにＢＰＲ２０
０１株等を植菌し、２８℃、３日間振とう培養した。次
に、この菌液を２リットルのＣＳＬ−Ｆｒｕ培地が入っ
た３リットル容のジャーに全量添加した。その後、通気
量は６６０ml／分とし、攪拌は溶存酸素が充足されるよ
うに４００〜１２００rpm に制御して本培養を行なっ
た。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】 ビタミン混合物 化合物 ｍｇ／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１９】得られた生産速度を図３〜図５に、消費糖
収率を図６及び図７に示す。これらの結果から、本発明
方法によって一定期間維持される最高のＫＬａを約２５
〜５０／hrの範囲にすることで、バイオセルロースの生
産速度が著しく増加したことがわかる。尚、各図中、Ｂ
Ｃ蓄積量（ｇ／Ｌ）は、培養終了後、培養液中の固形物
を集積し、水洗して培地成分を除去した後、ＩＮＮａＯ
Ｈ水溶液中で８０℃、２０分間処理して菌体を除去し
た。さらに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロー
スを水洗した後、８０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重
量を測定することで求めた。また消費糖収率（％）は以
下のようにして求めた。 消費糖収率（％）の計算 Ｙ_BC＝ＢＣ／（ＲＣ_MF−ＲＣ_BF）＊１００ Ｙ_BC ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／Ｌ） ＲＣ_MF：培地の糖濃度（ｇ／Ｌ） ＲＣ_BF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／Ｌ）

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の装置で用いる攪拌羽根の好適態様を
示す。

【図２】 各種攪拌羽根で達成されるＫＬａの値を示
す。

【図３】 各種攪拌羽根を用いた培養装置で一定期間維
持された最高のＫＬａとバイオセルロースの生産速度を
示す。

【図４】 各種攪拌羽根を用いた培養装置で一定期間維
持された最高のＫＬａとバイオセルロースの生産速度を
示す。

【図５】 各種攪拌羽根を用いた培養装置で一定期間維
持された最高のＫＬａとバイオセルロースの生産速度を
示す。

【図６】 各種攪拌羽根を用いた培養装置で一定期間維
持された最高のＫＬａとバイオセルロースの消費糖収率
の関係を示す。

【図７】 各種攪拌羽根を用いた培養装置で一定期間維
持された最高のＫＬａとバイオセルロースの消費糖収率
の関係を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:02） (72)発明者 吉永 文弘 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２重量％のバクテリアセルロースを含
   み、かつ塑性粘度が１５〜２０ポイズであるような模擬
   液を用いて測定した酸素移動容量係数（ＫＬａ）が約２
   ５〜５０／hrである装置条件下で、少なくとも一定期間
   セルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造す
   る方法。
2. 【請求項２】 門型羽根とタービン羽根を同一槽内に備
   えて成る培養装置を使用する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 攪拌羽根を槽内水平軸上に備えて成る培
   養装置を使用する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 門型羽根とタービン羽根を同一槽内に備
   えて成る培養装置。
5. 【請求項５】 攪拌羽根を槽内水平軸上に備えて成る培
   養装置。