JPH0994094A - 高菌体培養によるバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 バクテリアセルロースの高収量かつ高速度型
生産プロセスを提供すること。 【解決手段】 培養液中の炭素源の濃度を該炭素源の基
質資化定数の約２倍以上に維持しながらセルロース生産
菌を培養してセルロース性物質を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、炭素源の培養液中
濃度を一定の値以上に維持しながら、セルロース性物質
を生産する能力を有する微生物（以下、「セルロース生
産菌」という。）に属する菌体を用いるセルロース性物
質（以下、「バクテリアセルロース」又は「ＢＣ」とい
う。）を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＢＣ（バクテリアセルロース）は可食性
であり食品分野で利用されるほか水系分散性に優れてい
るので食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料
生地の強化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー
添加物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値があ
る。ＢＣは木材パルプ等から製造されるセルロースに較
べ、フィブリルの断片幅が２ケタ程度も小さいことを特
徴とする。従って、ＢＣの離解物はミクロフィブリルの
かかる構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分
子用補強剤として各種の産業用用途がある。このような
セルロース性離解物を紙状または固型状に固化した物質
は高い引張弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的
特徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用
素材としての応用がある。

【０００３】ＢＣの製造方法に関しては、特開昭６２−
２６５９９０号、特開昭６３−２０２３９４号及び特公
平６−４３４４３号等にＢＣの製造方法に関する記載が
ある。セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされ
ている栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキ
ス、燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／He
strin 培地（Schramm ら、J. General Biology, ll, p
p.123〜129, 1954 ）が知られている。また、このよう
な栄養培地に、培地中の特定栄養素によるセルロース生
成促進因子である、イノシトール、フィチン酸及びピロ
ロキノリンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公
報；高井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３
７〜２４４頁）等を添加したり、更には、カルボン酸又
はその塩（特願平５−１９１４６７号）、インベルター
ゼ（特願平５−３３１４９１号）及びメチオニン（特願
平５−３３５７６４号）を添加することによって、セル
ロース性物質の生産性が向上することが見い出されてい
る。又、特定の範囲の酸素移動容量係数（ＫＬａ）の条
件下でセルロース生産菌を培養する方法も提案されてい
る（特願平７−３１７８７号）。また、従来より、微生
物を培養する培養形式としては、静置、振盪もしくは通
気攪拌培養等が用いられてきた。また、培養操作法とし
ては、いわゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分
発酵法及び連続発酵法等が使用されてきた。尚、攪拌手
段としては、例えばインペラー（攪拌羽根）、エアーリ
フト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら
手段の組合せ等が使用されている。インペラーの種類と
しては、門型羽根、タービン羽根、ヘリカルリボン羽根
及びスクリュー羽根等が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】高収量かつ高速度型生
産プロセスを目指し、反復シード量を通常の約５％〜約
１０％から約３０％に増やすと、糖消費速度は速くなっ
たが収率が低下し、結果としてＢＣ生産速度は向上しな
かった。そこで、収率低下の原因と考えられる項目につ
いて３０％シード反復回分培養系を用いて検討した結
果、収率低下は菌株のＢＣ生産力価の低下、酸素不足、
及び攪拌混合不良によってもたらされたものではなく、
培養後半にＣ源やＮ源などの基本栄養成分が不足するこ
とによって、菌の死滅速度が高まるとともに菌のＢＣ生
産活性が低下することによって起こることが判明した。
本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、培養液
中の炭素源の濃度を該炭素源の基質資化定数の約２倍以
上に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロー
ス性物質を製造する方法に係わる。本発明方法は、回分
培養、反復回分培養において菌体シード量（植菌量）を
通常の約５〜約１０％とした場合でも実施可能である
が、それに較べて高い量、例えば約２０％以上、又は約
３０％以上としたような場合や、流加培養、連続培養に
おいて培養槽内の菌体濃度が高く維持されるような場合
に有利に用いることができる。更に、本発明方法は、炭
素源以外のＢＣ生産に必須な栄養源による制限がない条
件下で行なうとより好ましい。

【０００６】ここで、基質資化定数（Ｋ_s ）とは、以下
の式：

【数１】 〔ここで、ｓは残存基質濃度、Ｋ_s は基質資化定数（通
常ミカエリス定数と呼ばれ、μがμ_max の 1／2 を示す
基質濃度に等しい。）。尚、（μ）は対数増殖期の菌の
生育を示す次式で表される。

【数２】 ここで、ｘは菌体の濃度、ｔは培養時間（hr）、μは比
増殖速度（hr^-1）である。〕中で示される値である。
尚、基質資化定数及び対数増殖期の菌の生育を示す上記
式は、例えば、微生物培養工学（田口久治、永井史郎
編、共立出版（１９８５年）の第６２頁及び第２頁に夫
々記載されている。従って、基質資化定数は、微生物と
或る基質との親和性を表すものであり、培養基質濃度と
基質の比消費速度との関係から、特定の微生物と炭素源
等の基質に関して実験的に求めることができる。

【０００７】培養液中の炭素源等の基質濃度をある値以
上に維持する具体的な方法としては、例えば、回分培養
に於いて、その培養後期（生育減衰期及び定常期）に培
養系に常時基質濃度をモリタリングして、炭素源等を追
加供給（feed）することが挙げられる。また、連続培養
に於いては、培養期間中、常時基質濃度をモリタリング
して、或る設定値以下になったときに、自動的に該基質
を追加供給することや、供給速度を上げる、もしくは供
給培地中の基質濃度を上げる等して定常状態での基質濃
度を上げることも有効である。本発明方法に於いて、炭
素源の他に、例えばＣＳＬ等の他の基質も同時に、又は
別途追加供給すると更に有利である。

【０００８】本発明方法を実施するに際しては、前述の
培養形式・培養操作法に加えて、特願平６−１９２２８
７号に記載されている「培養装置と浮上分離装置及びエ
ッジフィルター等の分離装置の間で菌体を含む培養液を
循環させるセルロース性物質の製造方法であって、該分
離装置に於いて、生産物であるセルロース性物質を菌体
及び培養液から分離することを特徴とする、前記方法」
及び特願平６−１９２２８８号に記載されている「セル
ロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方
法であって、培養期間中、培養系からの培養液の引き抜
き及び該引き抜き量とほぼ等容量の新たな培養液の供給
を連続的に行なうことによって、培養中の培養液に於け
るセルロース性物質の濃度を例えば１０ｇ／Ｌ以下、又
は酸素消費速度が１５μmol ／Ｌ／hr以上に保つことが
できるように低く維持することを特徴とする前記製造方
法」を採ることもできる。

【０００９】本発明において使用されるセルロース生産
菌は、例えば、ＢＰＲ２００１株に代表されるアセトバ
クター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファ
ーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp. sucroferm
entans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter
xylinum ）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシ
リナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリ
アヌス（A. pasteurianus ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセ
トバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバ
クター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバク
ター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌、その
他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、サルシナ
属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アルカリ
ゲネス属、アエロバクター属、アゾトバクター属及びズ
ーグレア属並びにそれらをＮＴＧ（ニトロソグアニジ
ン）等を用いる公知の方法によって変異処理することに
より創製される各種変異株である。尚、ＢＰＲ２００１
株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後１９９
４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５４５）に移管されている。

【００１０】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. 1, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フルク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリ
コール、エタノール等を単独或いは併用して使用するこ
とができる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解
物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、
サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロ
ースに加えて使用することもできる。また、窒素源とし
ては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アン
モニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或い
は無機の窒素源を使用することができ、或いはＢａｃｔ
−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅａ
ｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天然栄養源を
使用してもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−１
Ｈピロロ〔２，３，５〕−キノリン−４，５−ジオン、
亜硫酸パルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加しても
よい。

【００１１】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、前述のセルロース生成促進因子を適宜培
地中に添加することもできる。例えば、酢酸菌を生産菌
として用いる場合には、培養のｐＨは３ないし７に、好
ましくは５付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、
好ましくは２５〜３５℃の範囲で行う。培養装置に供給
する酸素濃度は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％
であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合は培養
方法に応じて当業者が適宜選択し得るものである。

【００１２】本発明の方法によって製造されるＢＣは菌
体はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれ
る菌体を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く
処理を施すことが出来る。不純物を取り除くためには、
水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸
ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチ
ームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソー
ダ、デオキシコール酸などの界面活性剤による処理、常
温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用し
て行い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去
することができる。このようにして得られた本発明でい
うセルロース性物質とは、セルロース及び、セルロース
を主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及びβ−１，３、β
−１，２等のグルカンを含むものである。ヘテロ多糖の
場合のセルロース以外の構成成分はマンノース、フラク
トース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラ
ムノース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸
等である。尚、これ等の多糖が単一物質である場合もあ
るし２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよ
い。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下の実施例により、本発明をさ
らに詳細に説明する。

【００１４】参考例 まず、ＢＰＲ２００１株から得られた変異株であって高
重合度セルロース生産菌であるＢＰＲ３００１Ａ株（平
成７年６月１２日付寄託済、受託番号ＦＥＲＭＰ−１４
９８２）のフルクトースに対する基質資化定数（Ｋ_s ）
を以下のようにして求めた。実験条件 前培養として、１２５mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地（培地組成
は表１）の入った５００ml容のバッフル付きフラスコに
ＢＰＲ３００１Ａ株を植菌し、２８℃、３日間振とう培
養した。次に、この菌液６０mlを５４０mlのＣＳＬ−Ｆ
ｒｕ培地が入った１リットル容のジャーに全量添加して
主培養を開始した。この時の初発糖濃度は４０ｇ／Ｌ、
初発ＣＳＬ濃度は４ｖ／ｖ％とした。その後、通気量は
２００ml／分とし、攪拌は溶存酸素が充足されるように
２００〜１２００ｒｐｍに制御して１回目の回分培養を
行なった。経時的に培養液中の糖濃度と菌体濃度を測定
し、区間比糖消費速度ν（ｇ／ＯＤ・hr）と区間平均糖
濃度Ｓを算出した。区間平均糖濃度（Ｓ）の逆数（１／
Ｓ）と区間比糖消費速度の逆数（１／ν）をプロットし
た（図２）。この解析法では得られた直線のＸ軸切片が
（−１／Ｋ_s ）に等しい。最小自乗法によって（１／
Ｓ）：（１／ν）プロットの直線のＸ軸切片を求める
と、 （１／ν）＝２１．４７９×（１／Ｓ）＋２．０６４ 故に Ｋ_s ＝２１．４７９／２．０６４ ＝１０．４（ｇ／Ｌ）

【００１５】

【実施例】実施例１ 以下の条件で、本発明の製造方法を実施した。ＢＰＲ３
００１Ａ株を以下の条件で反復回分培養した。培養条件 ：前培養として、１２５mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地
（培地組成は表１）の入った５００ml容のバッフル付き
フラスコにＢＰＲ３００１Ａ株等を植菌し、２８℃、３
日間振とう培養した。次に、この菌液６０mlを５４０ml
のＣＳＬ−Ｆｒｕ培地が入った１リットル容のジャーに
全量添加した。この時の初発糖濃度は４０ｇ／Ｌ、初発
ＣＳＬ濃度は４ｖ／ｖ％とした。その後、通気量は２０
０ml／分とし、攪拌は溶存酸素が充足されるように２０
０〜１２００rpm に制御して１回目の回分培養を行っ
た。回分培養開始後、残糖濃度が５ｇ／Ｌ以下になった
時点で、ジャーから１８０mlの培養液を無菌的に引き抜
き、４２０mlのＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った別の１リッ
トル容のジャーに植菌した。この時の初発糖濃度は４０
ｇ／Ｌ、初発ＣＳＬ濃度は４ｖ／ｖ％とした。この際、
菌体シード量は約３０％であった。反復回分培養開始後
１８時間目から２７時間経過後まで、５０wt／ｖ％の殺
菌フルクトース水溶液を流加し、培養系の糖濃度を約２
０ｇ／Ｌ（基質資化定数の約２倍に相当する）に維持し
た系１、フルクトース５０wt／ｖ％とＣＳＬ２５ｖ／ｖ
％との殺菌混合水溶液を流加して培養系の糖濃度を約２
０ｇ／Ｌに維持した系２、これらの追加供給をしない
で、糖濃度が培養後期で約２０ｇ／Ｌ以下に低下したま
まの系３を比較した。 ＊菌体シード量の計算法 菌体シード量（％）＝植菌量(ml)／（植菌量(ml)＋培地
量(ml)）×１００ 例えば、５４０mlの培地の入ったジャーに６０mlの菌液
を植菌した場合、菌体シード量＝６０／（６０＋５４
０）×１００＝１０％となる。

【００１６】

【表１】培地組成

【００１７】

【表２】 ビタミン混合物 化合物 ｍｇ／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１８】

【表３】塩類混合液 クエン酸鉄アンモニウム １．５ｇ／Ｌ 塩化カルシウム １．５ｇ／Ｌ モリブデン酸アンモニウム ０．１ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７水塩 ０．２ｇ／Ｌ 硫酸マンガン４水塩 ０．１ｇ／Ｌ 硫酸銅５水塩 ２ｍｇ／Ｌ

【００１９】以上の系から得られた生菌数とＢＣ蓄積の
経時変化を図１に示す。更に、消費糖収率の結果を表４
に示す。

【００２０】

【表４】

【００２１】反復後１８〜２７hrの区間収率を比較して
みると、系３では菌の死滅が著しく、区間収率も低い
が、系１又は系２では生菌数はいずれも増加しており、
区間収率も系３よりも高かった。系２よりも系１での区
間収率が低いのは、系１ではＣＳＬ等の炭素源以外のＢ
Ｃ生産に必須な栄養源がＢＣ生産を制限しているためで
あろうと考えられる。尚、図中、ＢＣ蓄積量（ｇ／Ｌ）
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、ＩＮＮａＯＨ水溶液中で８０
℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８
０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。また消費糖収率（％）は以下のようにして求め
た。 消費糖収率（％）の計算 Ｙ_BC＝ＢＣ／（ＲＣ_MF−ＲＣ_BF）＊１００ Ｙ_BC ：消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／Ｌ） ＲＣ_MF：培地の糖濃度（ｇ／Ｌ） ＲＣ_BF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／Ｌ）

【図面の簡単な説明】

【図１】 生菌数とＢＣ蓄積の経時変化を示す。黒丸及
び白丸は系３、黒四角及び白四角は系１、並びに黒三角
及び白三角は系２を夫々示す。

【図２】 フラクトースを炭素源としたときの３００１
Ａ株の１／ν：１／Ｓの関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉永 文弘 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 培養液中の炭素源の濃度を該炭素源の基
   質資化定数の約２倍以上に維持しながらセルロース生産
   菌を培養してセルロース性物質を製造する方法。
2. 【請求項２】 菌体シード量が約３０％以上である請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】 反復回分培養で行なう請求項１又は２記
   載の方法。
4. 【請求項４】 炭素源以外のセルロース性物質生産に必
   須である栄養源による制限がない条件下で行なう請求項
   １ないし３のいずれか一項に記載の方法。