JPH0822196B2 - 綿の再生及び形質転換 - Google Patents

綿の再生及び形質転換

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JPH0822196B2 JP1501312A JP50131289A JPH0822196B2 JP H0822196 B2 JPH0822196 B2 JP H0822196B2 JP 1501312 A JP1501312 A JP 1501312A JP 50131289 A JP50131289 A JP 50131289A JP H0822196 B2 JPH0822196 B2 JP H0822196B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は綿特にゴシピウム・ヒルスツムL.（Gossypiu
m hirsutum L.）種の綿の植物再生及び形質転換に向け
られたものである。
近年、異った分類学的群に属する植物からの各種起源
の多くの組織がin vitro組織培養において確立されてい
る。そのような培養の生育及び分化を調節する幾つかの
因子も又決定されている。異った植物ホルモン群及び直
接的或いは間接的に作用する植物成長制御体の間の微妙
な相互作用の確立は単独或いは相乗的組合せてある程度
細胞、組織及び器官の間に存在するある種の相関関係へ
の洞察を与えてきた。しかしながら、この情報は決して
完全ではない。
しばらくの間、植物細胞培養液は非分化増殖状態に無
限に維持されうることが知られていた。しかしながら、
最近になって組織、器官或いは全植物生物体の再分化が
実験的に誘発されうることが見出された。スクーグ（Sk
oog）等による“Chemical regulation of growth and o
rgan formation in plant tissues cultured invitro,"
symp.Soc.Exp.Biol.11:18−130,1958,（ここにおいて準
用する）により、サイトキニン対オーキシンの相対比が
タバコ髄組織における器官発生の性質を決定することが
示されている。カルス培養液からの再組織或いは再生
は、共に究極的にはin vitroの再発達に導く苗発生原基
或いは胚の形成を含むものである。
器官発生対胚発生についての傾向は、尚関連する種及
び化学的及び／又は物理的性質のある種の引金因子に応
じて異る。
1902年に、ハーバーラント（Haberlandt）、“Kultur
versuche mit isolierten pflanzenzellen,"Mat.Kl.Kai
s.Wiss.Wien111:62（ここにおいて準用する）は、植物
細胞は全植物を産出する能力を有すると仮定し、これが
何時の日か細胞培養において示されるであろうことを予
言した。1965年に、ライナート（Reinert）“Untersuch
ungen uber die morphogenese an Gewebekulturen,"Be
r.dt.Bot.Ges.71:15、及びスチュワート（Steward）等
“Growth and organized development of cultured cel
ls/II、Organization in cultures grown from freely
suspended cells,"Am.J.Bot.45:705−708、は独立に研
究しながらin vitroの体細胞胚発生を確認した。これら
の両文献はここに引用する。実験的に体細胞胚発生を操
作するに際し、細胞培地の二成分、オーキシン及び窒素
源が決定的役割を果たすものと思われる。
又、体細胞胚発生の過程は、二つの段階、先ず高濃度
のオーキシンの存在下における胚発生能力を有する細胞
の誘発及び第二にオーキシンの不存在下或いは低濃度に
おける胚細胞集団の胚への発達として起こることが示さ
れた。
器官発生或いは胚発生の誘発はカルスにおける区別さ
れた構造パターンに導く。幾つかの植物種の詳細な研究
は、苗木、芽或いは胚の発達に導く発達経路についてあ
る種の一般化を行うことを可能にした。
組織培養技術の器官発生或いは胚発生を介しての植物
の再生への適用は、おそらく工業的応用への継代発生に
おける基本的研究の中で最も重要な寄与を残すものと思
われる。
ビーズレー（Beasley）は1971年に綿の胚珠の培養液
におけるカルスの形成を報告している〔“In vitrocult
ure of fertilized cotton ovules,"Bioscience21:906:
907、1971、ここにおいて準用する〕。後にスー（Hsu）
等〔“Callus induction by（２−chlorethyl）phospho
nic（CPA）acid in cultured couuon ovules,"Physiol.
Plant36:150−153、1976、ここにおいて準用する〕は、
培地へのCPA及びジベレリン酸の添加による胚珠から得
られたカルスの生育の刺激を観察している。その他の外
植片例えば（ａ）葉〔デビス（Devis）等、“In vitro
culture of callus tissues and cell suspensions fro
m okra（Hibiscus esculentus）and cotton（Gossypium
hirsutum,"In vitro9:395−398、1974（ここにおいて
準用する）〕；（ｂ）胚軸〔シェンク（Schenk）等、
“Medium and technique for induction and growth of
monocotylednous and dicotyledonous plant cell cul
tures,"Can.J.Bot.50:199−204、1972（ここにおいて準
用する）〕；及び（ｃ）子葉〔ラニ（Rani）等、“Esta
blishment of Tissue Cultures of Cotton,"Plant Sci.
Lett.7:163−169、1976、（ここにおいて準用する）〕
からのカルス培養液がゴシピウム・ヒルスツム及びG.ア
ルボレウム(G.arboreum)に対して確立されている。
カッターマン（Katterman）等〔The influence of a
strong reducing agent upon initiation of callus fr
om the germinating seedling of Gossypium barbadens
e,"Physiol.Plant 40:98−101、1977（ここにおいて準
用する）〕は、G.バーバデンス（G.barbadense）の子葉
からのコンパクトなカルスが根を形成し、一つの場合に
おいて完全な植物の再生も又得られたことを観察した。
スミス（Smith）等〔“Defined conditions for the in
itiation and growth of cotton callus in vitro，Gos
sypium arboreum,"in vitro13:329−334、1977（ここに
おいて準用する）〕はG.アルボレウムの胚軸−由来の開
始及び二次培養の条件を決定した。引続きプライス（Pr
ice）等〔“Callus cultures of six specis of cotton
（Gossypium L.）on defined media,"Pl.Sci.Lett.8:11
5−119、1977及び“Tissue culture of Gossypium spec
ies and its potential in cotton genetics andcrop i
mprovement,"Beltwide Cotton Production Research Co
nference Proc.pp.51−55、1977、of the National Cot
ton Council,Memphis（各々ここに準用する）〕は５種
のゴシピウムからのカルスの開始及び二次培養の条件を
規定した。
多くの植物種の培養液を確立する際の共通の問題の一
つは、培養培地中の外植片の「褐色化」である。綿にお
いては、このポリフェノール類の浸出はスクロースをグ
ルコースで置換し、及び培養液を10日毎に新鮮な培地に
移すことにより克服された。グルコース補給培地上での
３〜４回の継代後、褐色は完全に消滅し、培養液をスク
ロース補給培地に戻すことができた。誘発に伴う困難が
あったものの、二次培養時のカルスの褐色及び維持はあ
る種のゴシピウム種については克服され、カルス培養液
から植物を再生する全ての試みは不首尾であるか幾つか
の時間のかかる工程を含むものであった。タビニドス及
びハミルトン（Davidonis and Hamilton）〔“Plant Pe
generation from Callus Tissue of Gossypium hirsutu
m,"L.Plant Sci.Lett.32:89−93、1983、（ここに準用
する）〕は培養の開始後２年後に終に胚の形成されたこ
とを報告している。
多くの生育物質例えば植物ホルモン及び合成成長制御
化合物が植物再生をin vitroでもたらすために細胞培養
培地中に利用されてきたが、異った物質の植物再生に及
ぼす効果の一般化は到達されておらず、特定化は更に少
ない。事実、同一物質が異った植物種に適用された場合
には成長を制御、向上させるか或いは全く効果がないか
のいずれかである。従って、ある種の標準的操作とは別
に、任意の新しい種に対する植物再生のための作業処方
に到達する困難な課題が必然的に残り、又多くの大きさ
の順序により植物形質転換を達成するより困難な課題が
残る。
本発明は実生から切出されたセグメントからの綿植物
の迅速な再生方法を提供する。説明される方法は高度の
繰返し可能性及び信頼性を与え、又それは綿植物の遺伝
子形質転換を可能にする。
発明の概要 綿植物の体細胞からの任意の形質転換を伴った再生方
法が提供される。
種子が殺菌され、暗所で生育されて実生にされる。実
生は外植片の一源であり、通常胚軸及び子葉である。も
う一つの源は発達する果実の未熟接合子胚である。外植
片を細分し、第一のカルス生育培地（グルコースを含
有）中で、カルスが外植片から発達する時間培養する
（該培地は、フェノール分泌に対抗し、外植片の細胞を
刺激して分割及び増殖するようにさせる）。カルスはフ
ェノール分泌段階を通過後、カルスを胚発生カルスに発
達させる新鮮なカルス生育培地（スクロースを含有）に
移される。胚を次いで二次培養により多い胚発生カルス
を産出するか或いはもう一つの生育培養（植物発芽培
地）に移し、苗を発達させるのに十分な期間培養し、そ
れをもう一つの生育期間後に温室に移し、次いで畑に移
し、それから種子を栽培することのできる成熟植物に成
長させる。
胚は、又浮遊液中で培養することもできる。この操作
においては生育期間後に約600ミクロンより大きいより
好ましくは約800ミクロンより大きい胚発生塊（胚発生
カルス又はその部分のこと）を含有する胚を単離し、植
物産生に利用する。より小さいカルスは植物形成カルス
に成長するようにカルス生育培地に再循環されるか或い
は胚源として維持される。
形質転換は外植片、カルス或いは浮遊液発達の段階で
生ずる。形質転換は外植片、カルス及び／又は胚発生カ
ルスを綿に外来性の発現性遺伝子配列を含有するアグロ
バクテリウムベクターの作用に遺伝子が細胞内に転移す
るのに十分な時間曝すことを含む。残存アグロバクテリ
ウムを次いでアグロバクテリウムに対して毒性の抗生物
質を用いて死滅させる。この後形質転換された苗に発達
するための形質転換細胞及び／又は胚発生カルスの選択
を行った。浮遊培養においては、形質転換及び／又は選
択は細胞及び胚発生には余りにも未熟なカルスからの胚
発生カルスの分離前或いは後に行われうる。
独特の表現型形質の植物を得ることができ、通常植物
細胞成長に抑制的な抗生物質に対して耐性を有する新規
綿植物、殺草剤、真菌病原体に対して増大した耐性を有
する綿植物及びより良好な収率及び改良された繊維品質
を示す綿植物が提供される。
図面の簡単な説明 第１図は、形質転換の確立領域を示す組織培養技術に
よる種子からの綿植物の発達のための好ましい操作を図
示する。
第２図は、葉（14）及び根（16）を含む各種発達段階
における体細胞胚（12）を有する綿の胚発生カルス（1
0）の写真図である。
第３図は、第２図に図示されるような胚発生カルス培
養液を形成するために単離された後期球状段階における
体細胞綿胚の写真図である。
第４図は、第２図と同様に胚発芽培地上に発達する綿
の胚及び若い苗（18）の写真図である。
第５図は、綿の浮遊培養液からの胚発生細胞の小塊の
写真図である。
第６図は、浮遊培養液からの球状段階の写真図であ
る。
第７図は、発生する葉（14）及び根（16）を示す浮遊
培養液から得られる発芽胚を図示する。
第８図は、胚発芽培地上に生育する綿の苗の発達を図
示する。
第９図〜第15図は、綿の遺伝的形質転換を図示し、第
９図はカナマイシン耐性の遺伝子を含有する形質転換綿
細胞からの細胞コロニー（20）の発達を示す。
第10図は、第９図の選択された抗生物質耐性細胞から
抗生物質補給培地上に発達する体細胞胚を示す。
第11図は、殺草剤グリホセートに耐性を付与する遺伝
子を含有する形質転換された体細胞胚の発芽胚を示す。
第12図は、第11図の胚から発達した綿の苗を示す。
第13図は、葉14及び根16の発達を有する鱗翅目の昆虫
に耐性を付与するように形質転換された発芽体細胞胚を
示す。
第14図は、第13図の胚から発達された苗を示す。
第15図は、カナマイシンに対する耐性を示す形質転換
された胚から発達された品種Siokraの苗を示す。
第16図は、Btプロトキシン遺伝子の５′末端を含有す
るプラスミドmp19/btの造築を示す。
第17図は、Btプロトキシンコード化配列の５′末端に
融合されたCaMV遺伝子VIプロモーターを含有するプラス
ミドであるmp19/bt ca/delの造築を示す。
第18図は、CaMV転写停止シグナルに融合されたプロト
キシンの３′コード化領域を有するプラスミドであるp7
02/btの造築を示す。
第19図は、CaMVプロモーター及びターミネータ配列が
隣接した完全なプロトキシンコード化配列を含有するpB
R322/bt14の造築を示す。
第20図はpRK252/Tn903/BalIIの造築を示す。
第21図はPCIB5の造築を示す。
第22図及び第23図はpCIB4の造築を示す。
第24図はpCIB2の造築を示す。
第25図は、Ｔ−DNA境界及び植物選択の遺伝子を含有
する広宿主範囲のプラスミドであるpCIB10の造築を示
す。
第26図はpCIB10/19Sbtの造築を示す。
第27図はpCIB710の造築を示す。
第28図はpCIB10/710の造築を示す。
第29図はpCIB10/35Stbの造築を示す。
第30図はpCIB10/35Sbt（KpnI）の造築を示す。
第31図はpCIB10/35Stb（BclI）の造築を示す。
第32図はpCIB10/35Sbt（607）の造築を示す。
第33図は、ベクターDEI PEP10を図示する。
第34図は、バーティシリウム蔓延畑に植付けられた綿
再生体から構成される畑試験を示す。
第35図は、第33図に示された畑試験における再生SJ4
植物の後代を示す。バーティシリウム真菌に対して改良
された耐性を有するソマクローナル変種は矢印で示され
る。
具体的説明 本発明は綿植物特にゴシピウム・ヒルスツム（Gossyp
ium hirsutum）属の植物の畑における伝播のための体細
胞からの組織培養による再生に向けられたものである。
任意にこれらの細胞は外来遺伝子情報を含むように形質
転換されてよい。
本発明に従って有用な各種生育培地は下記の通りであ
る。
上記の溶液の任意のものを用い、下記操作を用いて１
培地を調整する。ベースとして200mlのイオン交換水
を提供し、各種原液を１について述べられた量で添加
する。例えば、最終培地において10mlの原液が用いられ
るべき場合には、10mlの原液が200mlの蒸留水に添加さ
れる。塩類の溶液中の存在を確保するために原液は通常
上記配合に示される順序に従って添加される。十分に混
合後、追加のイオン交換水を混合物に添加し、それを必
要な500mlにし、混合物のpHを約5.8〜6.0に調整する。
最終容量を1000mlにし、通常組織培養寒天或いはその等
価物を約0.8重量％の濃度まで添加する。これは流動性
を減少するために溶液に何等かの固体性を与えるための
ものである。混合物を次いで15〜21ポンド／平方インチ
において約５〜20分間消毒して汚染生物を殺し、適当に
ラベルして無菌培地として貯蔵する。
簡単に述べると、綿の種子を殺菌し、基礎寒天培地な
どの適当な種子発芽培地上において暗所で実生を産生す
るのに十分な時間発芽させる。通常の生育期間は約４週
間まで、典型的には７〜14日間である。
外植片のセグメントを実生から切出す。外植片は胚軸
或いは子葉から得られるものが好ましい。或いは又、温
室或いは畑に生育した綿植物の発達する果実から得られ
る未熟胚を外植片として同様に用いることができる。試
験セグメントは適当な第一のカルス生育培地、好ましく
はグルコースを含む完全ムラシゲ及びスクーグ（MS）栄
養培地上で培養される。生育は約25〜約35℃の温度にお
いて約16時間の光及び約８時間の闇の光／闇サイクルに
おいて培養することにより行われる。培養は、培地が栄
養成分が消費されるに従って定期的間隔で交換され、約
３〜約４週間未分化カルスが形成されるまで継続される
操作である。カルスを第二カルス生育培地、好ましくは
炭素源としてナフタレン酢酸（NAA）及びスクロースを
補給されたMS培地に移し、３〜４カ月間培養されて胚を
産出する。
胚は次いで第二カルス生育培地中に維持され、胚供給
を維持するか或いは好ましくはカゼイン加水分解物及び
アンモニウム源を含有するビーズレー及びテインの培地
などの植物発芽培地に移され、２〜３週間培養されて苗
を産出する。
苗は高湿度条件下に土壌に移され、次いで温室内のよ
り大きいポットに移植され、最終的に成熟まで成長する
ために畑に移される。
ここに簡単に説明した方法を用いて首尾良く組織及び
浮遊培養によりゴシピウム・ヒルスツム種の綿における
体細胞胚形成を誘発し、最終的にSJ2、SJ4、SJ5、B164
4、B1810、B2724、GC510及びC1を含むゴシピウム・ヒル
スツムのアカラ品種及び非アカラ（Acala）「ピッカ
ー」シオクラ（Siokra）及び「ストリッパー」種FC2017
のカルス培養物から得られる胚軸及び子葉から成熟植物
を得た。培養物は、新規形質或いは性質を有する正常な
植物に形質転換された。
より詳細には、この操作は先ず綿種子の殺菌を含む。
適当な殺菌は種子を95％エタノールに２〜３分間浸漬
し、無菌水中で１回以上濯ぎ、次いで種子を次亜塩素酸
ナトリウムの15％溶液中に15〜20分間浸漬し、及び無菌
水で数回濯ぐことにより達成される。
殺菌種子を次いで種子発芽培地と称される第一の培地
に移す。種子発芽培地は通常の塩含量の一つである。適
当な発芽培地はホワイトの培地或いは半強度MS培地（半
分の成分強度）を含む基礎寒天培地である。発芽は通常
暗所内で約12〜約14日間に亘って起こる。
胚軸及び／又は子葉が発芽した種子から好ましく切出
され、セグメントに細分或いは切断され、生育物質を補
給されたMS培地などの第一のカルス生育培地上で培養さ
れる。現在好ましい培地は、約0.4mg/lのチアミン塩酸
塩、約30g/lのグルコース、約2mg/lのナフタレン酢酸、
約1mg/lのキネチン、普通の生育制御剤及び約100mg/lの
イノシトール及び寒天を補給されたMS培地である。チア
ミン塩酸塩は通常0.1〜約0.5mg/lの濃度範囲であり得、
グルコースは約20〜約30g/l、ナフタレン酢酸は約１〜
約10mg/l、キネチンは約１〜約2mg/l、及びイノシトー
ルは約50〜約100mg/lの範囲でありうる。
培養液は約25〜約35℃、好ましくは約30℃の温度にお
いて約16時間の光及び約８時間の闇の光／闇サイクルで
維持される。約2000〜4000ルクス、より好ましくは約30
00〜4000ルクスの光強度を有するのが好ましい。
形成されたカルスは３〜４週間間隔で定期的に二次培
養され、新鮮な第一のカルス生育培地に移される。外植
片の培養においては、培養培地の黒色化により証明され
るように、外植片からのフェノール化合物の分泌が生じ
うる。この場合には、培地はより規則的に交換される。
黒色化は培養培地を10日間毎に交換することにより避け
られた。通常３回〜５回の培地交換後にフェノール分泌
が消滅する。これが生ずる場合には、第一のカルス生育
培地をスクロースを含有する或いは炭素源としてスクロ
ースを補給された新鮮なカルス生育培地で置換すること
ができる。
３〜４週間の培養後、活発なカルスが外植片の切断表
面上に発達する。これらのカルスを次いで好ましくは、
約１〜約10mg/l、好ましくは約１〜約5mg/lのNAAと組合
わされたMS培地である新鮮な第二のカルス生育維持培地
に移す。サイトキニンは０〜約1mg/lの濃度で用いられ
る。カルス生育培地は種子発芽培地よりも10倍より多い
塩を含有する高塩含量培地として特徴付けられる。第一
及び第二のカルス生育培地の本質的相違は炭素源であ
る。フェノール分泌の間にはグルコースが用いられる。
分泌が停止した時点ではスクロースが用いられる。カル
ス生育培地の残りは同一のままであるか又は変化させる
ことができる。
これらのカルスを通常約５〜７継代後或いはカルスの
一部にアントシアニン色素形成が明らかとなるまで新鮮
なカルス生育培地に定期的間隔で移し、その後黄白色胚
発生カルスが発達する。
胚発生カルスを次いで選択的に二次培養し、規則的二
次培養により維持する。胚発生カルスは各種発達段階の
体細胞胚を含有する。あるものは小苗への生育を可能に
する発達点に到達している。しかしながら、殆んどは更
に発達を必要とする。あるものは発芽まで進行してお
り、その他のものは将来の使用のための胚源として維持
される。
第２図を参照すると、異った大きさの体細胞胚12を有
し、あるものが発生する葉14及び根16を有するアカラ綿
10のカルスを示すこの段階の発達が図示されている。第
３図は、後期球状段階で単離された体細胞胚を図示す
る。
第４図を参照すると、体細胞胚をここで胚発芽培地と
称される通常アンモニア或いはその等価物の形態での窒
素に富んだ培地である第三の生育培地に移すことにより
更に発達が達成される。適当な培地としては、好ましく
は約500mg/lまでのカゼイン加水分解物を補給されたビ
ーズレー及びテインの培地が挙げられる。
発芽は体細胞胚から起こり、２〜３週間以内に６枚ま
での葉及び良好な根系統のよく発達した苗18が通常系さ
れる。
この段階において、苗を小さな塊で土壌に移し、高湿
度条件下に標準的インキュベーター内で生育される。温
度は通常約25〜30℃に維持される（第７図参照）。
ある生育期間後、小植物を温室内のより大きいポット
に移植し、その後畑に移植して成熟まで生育する。生育
植物の全ては好ましくは温室内で生育させながら或いは
畑条件内で自己受粉するのが好ましく、種子を採集す
る。種子を次いで発芽させ、４〜５週令の実生を後代列
試験その他の標準的植物育成操作のために畑に移す。上
記操作を実施することにより約６〜約８カ月の期間中に
約35％の外植片から生育可能な綿植物が産出される。
胚発生綿細胞の浮遊培養液中における増殖 生育胚発生カルスを植物に発達させる代りに、カルス
をより小さい細片に切断し、更に浮遊培養技術を用いて
発達させてもよい。
この操作においては、浮遊濃度は通常第二カルス生育
培地（NAAを補給されたMS培地）などの8mlのカルス生育
培地に対して約750〜1000mgのカルス部数であり、浮遊
状態で生育される。好ましい実施態様において、カルス
の浮遊液はＴ管内に挿入され、約16時間の光及び約８時
間の闇の光方式下に約1.5rpmで回転するローラードラム
上に置かれる。生育は約３〜４週間である。
約３〜４週間毎に、浮遊液を過して第５図の群に図
示されるような胚発生カルスの大きい細胞塊を除去し、
第６図に示されるように後期球状段階において単離され
る。液は３〜４週間の生育期間栄養培地に戻される。
この操作を約３〜４週間の間隔で大きい塊の栽培と共に
何回も繰返し、その時点で培地を全部或いは部分的に新
鮮なカルス生育培地で補給する。好ましくは、４容以上
の新鮮な培地を約１容の残存浮遊液に対して添加する。
現在用いられるフィルターは、約600ミクロンより大き
い、好ましくは800ミクロンより大きいメッシュ径を有
するのが好ましく、600ミクロン未満の粒径を有する細
胞集団は植物に発達しないのに対し、600ミクロンより
大きい、好ましくは800ミクロンより大きい細胞集団は
胚発生となり生育可能な植物に発達することのできる十
分な分化を行ったことが観察された。
浮遊培養は又胚発生カルスを液体胚生育培地を約20ml
のMS及び2.0mg/l濃度のNAAの量で含有するDelong或いは
三角フラスコなどのフラスコに移すことによって開始す
ることもできる。フラスコをジャイロ式シェーカー上に
置き、毎分約100〜110ストロークで振盪する。３〜４週
間後に、浮遊液は上記のような過に適したものにな
り、大細胞塊を植物発達のために取出す。
より典型的には、第３回或いは第４回二次培養後に、
Ｔ管或いはDelong或いは三角フラスコからの細胞浮遊液
をNAA（2.0mg/l）を含有する寒天−固化MS培地或いはカ
ゼイン加水分解物（500mg/l）及び窒素源を含有するビ
ーズレー及びテインの培地上にプレート培養する。３〜
４週間以内に発達する胚を有する胚発生カルスが目に見
えるようになる。同様に、より大きい塊を上記培地上に
プレート培養した場合には、発達する胚を有する胚発生
塊を生ずる。
両浮遊成長方法において、MS培地を用いて胚の促進及
び／又は保持を行うのに対し、迅速植物発達のためには
発芽培地が用いられる。
実生外植片は必要に応じて形質転換することができ
る。この操作においては、殺菌種子の子葉及び／又は胚
軸セグメントを用いることができる。子葉が好ましい。
セグメントを抗生物質、例えばカナマイシンに対する
耐性などのコード（遺伝マーカー）を含有するアグロバ
クテリウムベクターを含む培地内にベクターが遺伝子を
外植片の細胞に転移するのに十分な時間置く。通常１分
乃至24時間の範囲の接触時間が用いられ、間欠的或いは
静かな撹拌が伴なわれる。外植片を次いで取出し、NAA
（2mg/l）を補給したMS培地などの寒天−固化カルス生
育培地上に置き、25〜35℃、好ましくは30℃で16:8時間
光：闇の方式で15〜200時間インキュベートする。
インキュベーション後、外植片を好ましくは200mg/l
の抗生物質セフォタキシムを補給した同一培地に移す。
セフォタキシムは、残存するアグロバクテリウムの増殖
及び植物組織の過剰成長を防止するために含ませられ
る。或いは又外植片をNAA（2mg/l）を補給したMS培地で
濯ぎ、更に濯ぐ前に４〜28時間インキュベートし、次い
でセフォタキシムを含有する同一培地をインキュベート
することができる。新鮮な培地上での４〜５週間の培養
の終りに、発達カルス即ち主たるカルスを主たる外植片
組織の残部から分離し、NAA（2mg/l）、セフォタキシム
（200mg/l）及び硫酸カナマイシンなどの抗生物質（50m
g/l）を含有するMS培地に移される。抗生物質（カナマ
イシン）の存在下において成長するその能力により同定
される形質転換された主たるカルスを選択し、胚を発達
させ、発芽させ、及び植物を上記操作に従って得る。
細胞浮遊液の形質転換を達成することも実施可能であ
る。７〜14日間、通常７〜10日間の通常の二次培養生育
細胞に引続いて、細胞を沈澱させて上澄液を除去する。
残存濃縮浮遊細胞を4000×ｇで５分間遠心分離させ、過
剰の培地を廃棄する。濃縮浮遊培養液をアグロバクテリ
ウムを含有する8mlの同一培地に再浮遊させる。浮遊液
を「Ｔ」管に移し、適当に撹拌してインキュベーション
を行う。
細菌付着及びDNA転移を行わせるための約２〜24時
間、好ましくは３〜５時間のインキュベーション後、浮
遊液を取出し沈澱させる。細菌を含む上澄液を廃棄し、
細胞を新鮮な培地で洗浄する。浮遊液は必要に応じて約
５分間遠心分離し、上澄液を除去してよい。いずれの場
合にも、細胞を同一培地に再浮遊させ、「Ｔ」管或いは
フラスコに移して浮遊二次培養を再開する。この目的は
細胞培養液内に残される未付着アグロバクテリウムベク
ターの量を最少にすることである。
約15〜約200時間、典型的には15〜約72時間、好まし
くは18〜20時間後に、浮遊液を過して大きい塊を除去
し、新鮮な液体培地で洗浄して沈澱させる。浮遊液をセ
フォタキシム（200mg/l）を含有する新鮮な液体培地に
再浮遊させ、ペトリ皿内の固化培地上でプレート培養す
る。
或いは又、浮遊液をセフォタキシムを含有する新鮮な
培地に再浮遊させ、更に４〜28日間生育させてからペト
リ皿内の固化培地上でプレート培養してもよい。細胞濃
度は１容の浮遊細胞プラス３容のセフォタキシムを有す
る培地である。10〜300mg/l好ましくは約20〜200mg/lよ
り好ましくは約40〜80mg/lのカナマイシンがネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ（NPT）遺伝子を発現する
形質転換細胞の選択のために培地内に含ませられる。選
択濃度のカナマイシン中で増殖する細胞及び胚を更に上
記の如くここに説明する操作に従って全植物に発芽及び
再生することのできる成熟体細胞胚に生育させる。
上記操作を用い、第９図を参照して形質転換の結果で
ある各種細胞コロニーが示される。抗生物質カナマイシ
ンに対して耐性を示す綿細胞20が存在する。第10図を参
照すると、抗生物質MS培地上の体細胞胚に発達する形質
転換カルスが示されている。第11図はカナマイシン耐性
を有するように確立され殺草剤グリホセードに耐性を有
するように形質転換された形質転換体細胞胚を示す。第
12図は第11図の胚からの植物を示す。第13図はMS培地上
に生育する鱗翅目昆虫に耐性を有するように形質転換さ
れた細胞を示し、第14図においてはビーズレー及びテイ
ンの培地に移されたものを示し、第15図は第14図の苗の
より成熟した苗への更なる発達を示す。
綿再生 実施例１ 子葉外植片から出発する植物の再生 ゴッシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）の
アカラ（Acala）綿品種SJ2の種子を、95％アルコールと
３分間接触させて殺菌し、次いで無菌水で２回濯ぎ、次
亜塩素酸ナトリウムの15％溶液に15分間浸漬し、次いで
無菌水で濯いだ。殺菌種子を暗所中で基礎寒天培地上で
約14日間発芽させて実生を産出した。この実生の子葉を
２〜４mm2のセグメントに切断し、それを無菌的に0.mg/
lのチアミン−HCl、30g/lのグルコース、2.0mg/lのナフ
タレン酢酸（NAA）、1mg/lのキネチン、100mg/lのｍ−
イノシトール、及び寒天（0.8％）を補給されたムラシ
ゲ及びスクーグ（MS）主及び従塩類よりなるカルス誘発
培地に移した。培養物を約2000〜4000ルクスの光強度を
与える蛍光光線（冷昼光）を有するパーシバルインキュ
ベーター内で16時間の光及び８時間の闇の条件下で約30
℃においてインキュベートした。
カルスは培養組織セグメント上に３〜４週間以内に形
成され、白色乃至灰−緑色であった。形成されたカルス
を100mg/lのｍ−イノシトール、20g/lのグルコース、2m
g/lのナフタレン酢酸（NAA）及び寒天よりなるカルス生
育培地上に３週間乃至４週間毎に二次培養した。組織外
植片をカルス誘発培地上に最初に置いた後４〜６カ月後
に体細胞胚が形成された。カルス及び胚は３週間乃至４
週間毎に新鮮なカルス生育培地上に二次培養することに
よりカルス生育培地上に維持した。
組織片上に形成された体細胞胚は新鮮なカルス生育培
地或いはビーズレー及びテイン（Beasley＆Ting）の培
地（胚発芽培地）のいずれかに外植した。
体細胞胚から形成された体苗を1200mg/lの硝酸アンモ
ニウム及び有機窒素源として500mg/lのカゼイン加水分
解物を含有するビーズレー及びテインの培地上に移し
た。培地を凝固剤（Gelrite）により固化し、苗をマゼ
ンタボックス内に入れた。
体細胞胚は３カ月以内に苗に発達した。これらの苗は
６枚乃至８枚の葉を根に付け、約３〜８インチの長さで
あり、土壌に移し、高湿度下にインキュベーター中で３
乃至４週間、次いで温室に移した。硬化後、植物は又開
放耕地にも移された。
実施例２ 培地として、全培地成分が半分の濃度に減少された半
強度MS培地を用いた他は実施例１の操作を繰返した。本
質的に同一の結果が得られた。
実施例３ 外植片が胚軸セグメントとされた他は実施例１及び２
の操作を繰返した。本質的に同一の結果が得られた。
実施例４ 外植片が未熟接合子胚とされた他は実施例１及び２の
操作を繰返した。本質的に同一の結果が得られた。
実施例５ アカラ綿品種SJ4、SJ5、SJ2C−１、GC510、B1644、B2
724、B1810、ピッカー品種Siokra及びストリッパー品種
FC2017を用いて実施例１及び２の操作を繰返した。全て
首尾よく再生された。
実施例６ 体細胞胚を形成することのできるカルスを得る程度ま
で実施例１の操作を繰返した。約750〜1000mgの活発に
生育する胚発生カルス片をＴ管内の0.4mg/lチアミンHC
l、20g/lグルコース、100mg/lのイノシトール及びナフ
タレン酢酸（2mg/l）を補給したMS主及び従塩類よりな
る液体浮遊培養培地8ml単位中に浮遊させ、16:8光対闇
方式下において1.5rpmで回転するローラードラム上に置
いた。ここでも又約2000〜4500ルクスの光強度が蛍光光
線（冷昼光）により与えられた。
４週間後に、浮遊液を840ミクロン径のナイロンメッ
シュを通して過して、より大きい細胞塊を除去した。
840ミクロンより小さい画分を沈澱させ、約20〜25mlの
新鮮な浮遊培養培地で１回洗浄した。この浮遊液をＴ−
管（管当り2ml）に移し、各管を6mlの新鮮な浮遊培養培
地で希釈した。これらの培養液を上記操作を10〜12日間
隔で繰返すことにより維持した。即ち浮遊液を過し、
840ミクロンより小さい細胞凝集物を含有する画分のみ
を新鮮な浮遊培養培地に移した。全ての場合において、
840ミクロンより大きい細胞塊を含有する塊はカルス生
育培地上に置かれて成熟体胚を得た。
カルス生育培地上に形成された体細胞胚を取出し、胚
発芽培地に移し、実施例１の方法を用いて発芽させ、苗
及び次いで畑生育植物に発達させた。
実施例７ 浮遊培養液を750〜1000mgの胚発生カルスを2mg/l NAA
を含有する15〜20mlのMS液体培地を含むDelongフラスコ
に移すことにより形成した以外は、実施例６の操作を繰
返した。この培養液含有フラスコをジャイロ式シェーカ
ーに置き、100〜110ストローク／分で振盪した。３週間
後に浮遊液を840ミクロンナイロンメッシュを通して
過し、実施例４と同様にして植物生育用の大細胞塊を除
去した。840ミクロン未満の浮遊物を沈澱させ、MS液体
培地中で一度洗浄し、２〜5mlのMS液体培地に再浮遊さ
せた。浮遊液を１〜2mlの浮遊液及び15mlの新鮮なMS液
体培地を含有するDelongフラスコ内の新鮮な培地に移す
ことにより二次培養した。培養液をこの操作を７〜10日
間間隔で繰返すことにより維持した。各二次培養におい
ては、840ミクロン未満の浮遊物のみを二次培養し、大
きい塊（840ミクロン以上）を植物生育のために用い
た。
実施例８ 実施例６及び７の浮遊生育操作を用いる３回或いは４
回の二次培養後、1.5〜2.0mlのＴ管及びDelongフラスコ
からの細胞浮遊液を各場合において2mg/l NAAを含有す
る寒天−凝固MS培地及び500mg/lのカゼイン加水分解物
を含有するズーズレー及びティン培地上にプレート培養
した。３〜４週間以内に発達する胚を有する胚発生カル
スが目に見えるようになった。再び、840ミクロン以上
の細胞塊をカルス生育培地上でプレート培養し、発達す
る胚を有する胚発生塊を生じ、それは究極的に植物に成
長した。
線形質転換 実施例９ アグロバクテリアLBA4434による腫瘍状−表現型を形成
する形質転換 アカラ綿浮遊培養液をＴ管内で培地（2mg/l NAAを含
有するMS培地）を７日乃至10日毎に取変えながら３〜４
カ月間二次培養した。その後、いずれの培地交換後にお
いても細胞を沈澱させ、形質転換のために栽培すること
ができる。上澄液をピペッティングにより除去し、細胞
をアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株LBA4434で
形質転換した。アグロバクテリウム菌株LBA4434は〔Hoe
kema,A.et.,Nature303:179〜180、1983、ここにおいて
準用する〕に説明されており、Tiプラスミド−由来二元
植物形質転換系を含む。そのような二元系においては、
一つのプラスミドはTi−プラスミドのＴ−DNAを含有
し、第二のプラスミドはTi−プラスミドのvir−領域を
含む。これらの二つのプラスミドが共働して植物形質転
換を行う。菌株LBA4434においては、Ｔ−DNAプラスミド
pAL1050はpTiAch5のTL、オクトピンTi−プラスミドを含
み、菌株LBA4434中のvir−プラスミドpAL4404はpTiAch5
の完全な毒性領域を含む〔Ooms,G.et.,Plasmid7:15〜2
9、1982、ここにおいて準用する〕。菌株LBA4434はオラ
ンダ、ライデン大学生化学部のRobert Schilperoort博
士から利用可能である。
形質転換アグロバクテリウム菌株をグリセロール原液
から取り、少量の一昼夜培養液に接種し、それから次の
日50ml培養液を接種した。アグロバクテリアをNaOHでpH
7.2に調整した水中ｌ当り5gの牛肉エキス、1gの酵素エ
キス、5gのペプトン、5gのスクロースを含有するYEB培
地上で生育させた。消毒後、1mlの2N MgCl2を添加し、
その後その他の菌株を殺すために必要な抗生物質を添加
した。50mlの一晩培養液の600nmにおける吸光度を読取
り、培養液を遠心分離し、形成されたペレットを植物細
胞生育培地（MS培地プラス2mg/lのNAA）に0.5の600nmに
おける最終吸光度まで再浮遊させた。
8mlのこのアグロバクテリウムLBA4434の細菌浮遊液を
上澄液の除去後浮遊植物細胞を含有する各Ｔ−管に添加
した。植物及び細菌細胞を含むＴ−管を撹拌して細胞を
再浮遊させ、ローラードラムに３時間戻してアグロバク
テリアを植物細胞に付着させた。これらの細胞を次いで
沈澱させ、残存上澄液を除去した。新鮮な生育培地のア
リコートをＴ管に添加し、浮遊液を残存する任意のアグ
ロバクテリアの存在下においてローラードラム上で18〜
20時間インキュベートさせた。この時間後、細胞を再び
沈澱させ、上澄液を除去し、細胞をセフォタキシム（20
0μg/ml）を含有する生育培地溶液で２回洗浄した。洗
浄後各Ｔ管からの細胞をセフォタキシム（全ての場合に
おいて200μg/ml）含有する10mlの生育培地に再浮遊さ
せ、浮遊液の1mlのアリコートをペトリ皿上でプレート
培養させた。
感染細胞は植物ホルモンを添加されなかった生育培地
上で成長し、組織がＴ−DNAにおける野性種の植物ホル
モン遺伝子を受取ったことを確立した。これらの細胞は
腫瘍を発達させ、更に培養物の形質転換を示した。
実施例10 カナマイシン耐性非−腫瘍状表現型を形成する綿の形質
転換 実施例９で得られた浮遊培養液をＴ−DNA含有二元ベ
クターpCIB10［Rothstein,S.J.et al.Gene53:153−16
1、1987、ここにおいて準用する］並びにpAL4404vir−
プラスミドを含有するアグロバクテリアを用いて形質転
換した。pCIB10のＴ−DNAは酵素ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼをコード化するTn5からのコード化領
域であるノパリンシンターゼからのプロモーター及びノ
パリンシンターゼからのターミネーターより構成される
キメラ遺伝子を含有する。pCIB10を含有するアグロバク
テリアはカナマイシン（50μg/ml）を含有するYEB培地
上で生育させた。形質転換は細胞及びアグロバクテリア
を生ずる1mlのアリコートをカナマイシン（50μg/ml）
或いはG418（25μg/ml）のいずれかを含有する選択培地
上に直ちにプレート培養した以外は、実施例10と同様に
して達成された。形質転換植物組織におけるnos/neo/no
sキメラ遺伝子の発現はこの組織の両抗生物質の存在下
における選択を可能にする。２〜４週間以内に形質転換
組織の存在が選択プレート上で明らかとなった。未感染
組織並びに追加されたコントロール組織は生育の徴候を
示さず、褐色に変って死滅した。形質転換組織はカナマ
イシン及びG418の両者の存在下において極めて良好に成
長した。
この時点で、良好に生育していた組織片を新鮮な選択
培地に二次培養した。これらの組織片上に形成された体
細胞胚を新鮮な非選択性生育培地に外植した。胚が分化
及び発芽を開始した時点において、即ちそれらが根の形
成を開始し２或いは３枚の葉を有した時点において、そ
れらを実施例１で説明した生育培地を含有するマゼンタ
ボックスに移した。苗が６〜８枚の枚を有するまで生育
させ、その時点でそれを寒天培地から取出した。
苗を今度ポット内の土壌に入れ、湿度を維持するため
にビーカーで覆い、パーシバルインキュベーターに４〜
８週間入れた。この時点で植物をビーカーから取出し、
温室に移した。植物は温室で成長し開花し、結実した。
実施例11 用いられた形質転換アグロバクテリアがＴ−DNAベク
ターDEI PEP10並びにpAL4404virプラスミドを含有した
以外は、実施例10の操作に従った。第33図に示されるDE
I PEP10は更に植物ゲノム内で一体化するためにBamHIで
分割されたA.ツメファンエンス（A.Tumefaciens）（菌
株Ｃ−58）からの二つのＴ−DNA Pst I切断右境界配
列、パッセンジャーメイズホスホエノールピルベートカ
ルボキシラーゼ遺伝子（ペプカーゼ遺伝子）、及び植物
内で発現可能で抗生物質カナマイシン及びG418に耐性を
与えるキメラ遺伝子（NOS/NPT/TK）を利用するものであ
る。このキメラ遺伝子はTn5からネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼIIコード化領域であるノパリンシンセ
ターゼプロモーター、及び単純ヘルペスウィルスチミジ
ンキナーゼ遺伝子からのターミ−ネーターを利用する。
形質転換後、胚発生カルス及び胚をカナマイシン（50mg
/l）上の選択により得た。この濃度（50mg/l）における
カナマイシン上でプレート培養された対照（非−形質転
換カルス）からは耐性カルスは得られなかった。
実施例12 線浮遊培養液細胞のグリフォゼート耐性表現型への形質
転換 用いられた形質転換アグロバクテリアがＴ−DNAベク
ターpPMG85/587［Fillatti,J.et al.,Mol.Gen.Genet.20
6:192−199、1987、ここにおいて準用する］並びにpAL4
404virプラスミドを含有した以外は実施例10の操作に従
った。このプラスミドpPMG85/587は植物内で発現が可能
な３個のキメラ遺伝子を保有する。二つの遺伝子は抗生
物質カナマイシン及びG418に耐性を与えるネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ（NPT）をコード化する。S.t
yphimurium）の変異体aroA遺伝子からのコード化配列を
含有する第３番目のキメラ遺伝子は殺草剤グリホゼート
［Comai,et al.,Science221:370−371、1983、ここにお
いて準用する］に耐性を与える。pPMG85/587を含有する
アグロバクテリアはカナマイシン（100μg/ml）を含有
する培地上で生育した。形質転換は浮遊液を28日間生育
させ、その時点で1mlのアリコートを選択抗生物質を含
有する培地上でプレート培養した以外は、実施例10と同
様にして達成した。形質転換植物組織内のNPTキメラ遺
伝子の発現がこの組織の両抗生物質上での選択を可能に
した。この場合に、選択抗生物質はカナマイシンであっ
た（50μg/ml）。
２〜４週間以内に形質転換組織が選択プレート上に明
らかになった。植物組織、個々の胚及びカルスを次いで
殺草剤グリホゼート1mMを含有する生育培地上に置いた
ところ、形質転換組織は良好な成長を続けた。カルス及
び胚の両者のタンパク質の抽出及び分析はグリホゼート
耐性遺伝子の産成物の存在を確認した。
実施例13 綿浮遊培養細胞のハイグロマイシン耐性非−腫瘍状表現
型への形質転換 形質転換アグロバクテリアとしてＴ−DNA二元ベクタ
ーpCIB715［Rothstein,S.J.et al.,Gene53:153−161、1
987］並びにvirプラスミドを含有するものを用いた以外
は、実施例10の形質転換に従った。pCIB715のＴ−DNAは
カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S転写体［Ode
ll et al.,Nature 313:810−812、1985、ここにおいて
準用する］からのプロモーター及びターミネーター及び
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ［Gritz,
L.及びJ.Davis,Gene25:179−188、ここにおいて準用す
る］のコード化領域より構成されるキメラ遺伝子を含有
する。pCIB715を含有するアグロバクテリアを、カナマ
イシン（50μg/ml）を含有するYEB上で生育させた。
形質転換は1mlのアリコートを選択抗生物質として50
μg/mlハイグロマイシンを含有する培地上で直ちにプレ
ート培養した以外は再び実施例10と同様にして達成し
た。形質転換植物組織におけるキメラハイグロマイシン
遺伝子の発現はハイグロマイシンを含有する培地上での
この組織の選択を可能にする。形質転換組織は選択生育
培地上で実施例８と同様にして生育され、形質転換が起
ったことを確立した。
実施例14 鱗翅目の昆虫に対する耐性を付与する綿浮遊培養細胞の
形質転換 以下に示す変更をした以外は実施例10の操作に従っ
た。異った形質転換アグロバクテリアを用いた。又、植
物組織を形質転換物質の選択のために抗生物質上で選択
した後にそれを更にここに規定するBT遺伝子の発現のた
めに選択した。
用いられたアグロバクテリアはその中に次のキメラバ
チルス．ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）
内毒素遺伝子（“BT遺伝子”）を挿入したＴ−DNAベク
ターpCIB10［Rothstein et.,Gene53:153−161（198）、
ここにおいて準用する］を含有した。
このアグロバクテリアベクターを調製するために、Ca
MV遺伝子VIプロモーター及びプロトキシンコード化配列
を融合した。ファージベクターmp19［Yanish−Perron e
t al、1985］の誘導体を先ず造築した。工程を第16図及
び第17図に示す。先ず、155個のヌクレオチド５′乃至
プロトキシンコード化領域及び隣接の1346個のコード化
配列のヌクレオチドを含有するDNA断片をmp19に挿入す
る。ファージmp19ds rf（二本鎖複製形態）DNAを制限エ
ンドヌクレアーゼSacI及びSmaIで消化し、約7.2−kbpベ
クター断片を低ゲル化温度アガロースによる電気泳動後
に標準的操作により精製した。プロトキシン遺伝子を含
む約10kbp（キロベース対）のバチルス・ツリンギエン
シスDNAを含有するプラスミドpKU25/4を、スイス国、バ
ーゼル、CIBA−Geigy社のJ.Nueesch博士から得た。プラ
スミドpKU25/4に存在するプロトキシン遺伝子のヌクレ
オチド配列を下記式１に示す。プラスミドpKU25/4DNAを
エンドヌクレアーゼHpaI及びSacIで消化し、一般式１の
ヌクレオチド２〜1505を含有する1503bp断片を精製し
た。この断片は約155bpのバクテリアプロモーター配列
及び1346bpのプロトキシンコード化配列の出発部分を含
有する。各断片の約100ngを次いで混合し、T4DNAリガー
ゼを添加し、15℃で一晩インキュベートした。得られた
混合物をE.コリ（E.Coli）菌株HB101中に形質転換し、
指示体細菌E.コリJM101と混合し、プレート培養した。
１個のファージ（mp19/bt）を更に下記造築のために用
いた。
次いで、CaMV遺伝子VIプロモーターを含有するDNAの
断片及び遺伝子VIのためのコード化配列のいくつかをmp
19/bt中に挿入した。ファージmp19/bt ds rf DNAをBamH
Iで消化し、DNAポリメラーゼの大断片で処理し、ブラン
ト末端を創出し、エンドヌクレアーゼPstIで再切断し
た。より大きいベクター断片を上記の如く電気泳動によ
り精製した。プサミスドpABD1は［Paszkowski et al.,E
MBO J.3、2717−2722（1984）、ここにおいて準用す
る］に説明されている。プラスミドpABD1DNAをPstI及び
HindIIIで消化する。CaMV遺伝子VIプロモーター及び約7
5bpの遺伝子VIコード化配列を含有する約465bp長の断片
を精製した。これらの二つの断片を連結し、上記の如く
プレート培養した。得られた組換えファージの一つのmp
19/btcahは遺伝子VIコード化配列の一部であるCaMV遺伝
子VIプロモーター配列、プロトキシンコード化配列の上
流の約155bpのバチルス・ツリンジエンシスDNA及び約13
46bpのプロトキシンコード化領域を含有した。これらの
CaMVプロモーター配列を正確にプロトキシンコード化配
列に融合するために、介在DNAをmp19/btcaDNAのオリゴ
ヌクレオチド−指示突然変異誘発を用いて削除した。配
列（５′）TTCGGATTGTTATCCATGGTTGGAGGTCTGA（３）を
有するDNAオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems
DNAシンセサイザーを用いて通常の操作により合成し
た。このオリゴヌクレチドはCaMAプロモーター［（Hoh
n、Current Topics、Microbiology and Immunology,9
6、193−235（1982）、ここにおいて準用する）中のヌ
クレオチド5762〜5778］の３′末端におけるファージmp
19/btcaDNA及びプロトキシンコード化配列の開始部（上
記一般式Ｉのヌクレオチド156〜172）における配列と相
補的である。突然変異誘発の一般的操作は［Zoller and
Smith,、Meth.Enzym.,100、468−500（1983）、ここに
おいて準用する。］に記載されているものである。約５
μｇの一本鎖のファージmp19/btca DNAを40μｌの容量
で0.3mgのホスホリル化オリゴヌクレオチドと混合し
た。混合物を65℃に５分間加熱し、50℃に冷却し、ゆっ
くり４℃まで冷却した。次いで緩衝液ヌクレオチドトリ
ホスフェート、ATP、T4DNAリガーゼ及びDNAポリメラー
ゼの大断片を添加し、15℃において［Zoller及びSmith
Meth.Enzym.,100，、468−500（1983）、ここにおいて
準用する］に説明されるように一晩インキュベートし
た。アガロースゲル電気泳動後、円形二本鎖DNAを精製
し、E.コリ菌株JM101中にトランスフェクションした。
得られたプラークを32P−標識化オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズする配列についてスクリーニングし、フ
ァージをDNA制限エンドヌクレアーゼ分析により分析し
た。得られたファージクローンの中にはCaMV遺伝子VIプ
ロモーターとプロトキシンコード化配列間の不所望の配
列を正確に欠失したものがあった。このファージをmp19
/btca/delと称する（第17図参照）。
次に、プロトキシン遺伝子の３′コード化領域がCaMV
転写停止シグナルに融合したプラスミドを造築した。工
程を第18図に示す。先ず、プラスミドpABDI DNAをエン
ドヌクレアーゼBamHI及びBalIIで消化し、CaMV転写ター
ミネーター配列を含有する0.5kbp断片を単離した。次に
プラスミドpUC19［Yanisch−Perron et al.,Gene33、10
3−119（1985）、ここにおいて準用する］をBamHIで消
化し、0.5kbp断片を混合しT4DNAリガーゼとインキュベ
ートした。このDNAのE.コリ菌株HB101中への形質転換
後、プラスミドp702と称される生じたクローンの一つが
得られ、それは第18図に示される構造を有する。次にプ
ラスミドp702DNAをエンドヌクレアーゼSacI及びSmaIで
切断し、より大きい約3.2kbp断片をゲル電気泳動により
単離した。プラスミドpKU25/4DNAをエンドヌクレアーゼ
AhaIII及びSacIで消化し、プロトキシンコード化配列
（nt 1504〜3773）を含有する2,3−kbp断片（一般式１
のヌクレオチド1502〜3773）をゲル電気泳動後に単離し
た。これらの二つのDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼと
インキュベートし、E.コリ菌株HB101中に形質転換し
た。得られたプラスミドはp702/btであった（第18
図）。
最後に、ファージmp19/btca/del ds rf DNA及びプラ
スミドp702/btの部分を連結してCaMVプロモーター及び
ターミネーター配列の隣接した完全プロトキシンコード
化配列を含有するプラスミドを創出した（第18図参
照）。ファージmp19/btca/del DNAをエンドヌクレアー
ゼSacI及びSphIで消化し、約1.75kbpの断片をアガロー
スゲル電気泳動に従って精製した。同様に、プラスミド
p702/bt DNAをエンドヌクレアーゼSacI及びSalIで消化
し、約2.5kbpの断片を単離した。最後に、プラスミドpB
R322DNA［Bolivar et al.,Gene、2、95−113（1977）、
ここにおいて準用する］をSalI及びSphIで消化し、より
大きい4.2kbp断片を単離した。全ての三つのDNA断片を
混合し、T4DNAリガーゼとインキュベートし、E.コリ菌
株HB101中に形質転換した。得られるプラスミドPBR322/
bt14はバチルス・ツリンギエンシス結晶タンパク質コー
ド化配列に融合したCaMV遺伝子プロモーター及び翻訳開
始シグナル及びそれに続いてCaMV転写停止シグナルを含
有するPBR322の誘導体である（第19図に示される）。
ベクターpCIB10は、このキメラ遺伝子のアグロバクテ
リウムツメファシエンスを介する植物へのトランスファ
ーに有用なTi−プラスミド−由来ベクターである。この
ベクターはミズリー州、セントルイス、ワシントン大学
のW.Barnes博士から得られる広宿主範囲プラスミドpRK2
52から得られる。このベクターは又Tn903からのアグロ
バクテリウムにおけるカナマイシン耐性に対する遺伝子
及びTiプラスミドpTiT37からの左及び右Ｔ−DNA境界配
列も含有する。境界配列の間には、プラスミドpUC18か
らのポリリンカー領域及び植物内のカナマイシン耐性を
付与するキメラ遺伝子がある。
先ず、プラスミドpRK252を修飾してテトラサイクリン
耐性を付与する遺伝子をトランスポソンTn903からカナ
マイシンに対する耐性を付与するものと置換し［Oka et
al.,J.Mol.Biol.,147、217−226（1981）、ここにおい
て準用する］、又pRK252における独特なEcoRI部位をBal
II部位で置換することにより修飾した（これらの修飾の
概要について第20図参照）。プラスミドpRK252を先ずエ
ンドヌクレアーゼSalI及びSmaIで消化し、次いでDNAポ
リメラーゼＩの大断片で処理してブラント末端を創出
し、大ベクター断片をアガロースゲル電気泳動で精製し
た。次に、プラスミドp368をエンドヌクレアーゼBamHI
で消化し、DNAポリメラーゼの大断片で処理し、約1050
−bt断片をアガロースゲル電気泳動後に単離した。この
断片は抗生物質カナマイシンに耐性を付与するトランス
ポソンTn903からの遺伝子を含有する［Oka et al.,J.Mo
l.Biol.,147、217−226（1981）、ここにおいて準用す
る］、両断片を次いでDNAポリメラーゼの大断片で処理
してブラント末端を創出した。両断片を混合し、T4DNA
リガーゼと15℃で一晩インキュベートした。E.コリ菌株
HB101中への形質転換及びカナマイシン耐性コロニーの
選択後、プラスミドpRK252/Tn903を得た（第19図参
照）。
プラスミドpRK252/Tn903をそのEcoRI部位で消化後、
E.コリDNAポリメラーゼの大断片で処理してブラント末
端を創出した。この断片を合成BalII制限部位リンカー
に添加し、T4DNAリガーゼと一晩インキュベートした。
得られたDNAを過剰のBalII制限エンドヌクレアーゼで消
化し、より大きいベクター断片をアガロースゲル電気泳
動により精製した。得られた断片を再びT4DNAリガーゼ
とインキュベートしてその新たに添加されたBalII付着
端を介して再円形化した。E.コリ菌株HB101中に形質転
換後プラスミドpRK252/Tn903/BalIIが得られた（第20図
参照）。
TiプラスミドＴ−DNA境界、プラスミドpUC19のポリリ
ンカー領域及び植物におけるカナマイシン耐性の選択遺
伝子を含有するプラスミドpBR322の誘導体を造築した
（第21図参照）。プラスミドpBR325/Eco29はノパリンTi
プラスミドpTiT37からの1.5−kbp EcoRI断片を含有す
る。この断片はＴ−DNA左境界配列を含有する［Yadav e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79、6322−6326（198
2）、ここにおいて準用する］。この断片のEcoRI末端を
HindIII末端で置換するためにプラスミドpBR325/Eco29D
NAをEcoRIで消化し、次いでヌクレアーゼS1でインキュ
ベートし、次いでDNAポリメラーゼの大断片とインキュ
ベーションを行い、ブラント末端を創出し、次いで合成
HindIIIリンカーと混合し、T4DNAリガーゼとインキュベ
ートした。得られたDNAをエンドヌクレアーゼClaI及び
過剰のHindIIIで消化し、得られたＴ−DNA左境界を含有
する1,1−kbp断片をゲル電気泳動により精製した。次い
で、プラスミドpUC19のポリリンカー領域をプラスミドD
NAのエンドヌクレアーゼEcoRI及びHindIIIによる消化に
より単離し、より小さい断片（約53bp）をアガロースゲ
ル電気泳動により単離した。次に、プラスミドpBR322を
エンドヌクレアーゼEcoRI及びClaIで消化し、その他の
二つの単離断片と混合し、T4DNAリガーゼとインキュベ
ートし、E.コリ菌株HB101中に形質転換した。得られた
プラスミドpCIB5はプラスミドpBR322の誘導体中にポリ
リンカー及びＴ−DNA左境界を含有する（第21図参
照）。
植物中でのカナマイシン耐性の発現のための遺伝子を
含有するプラスミドを造築した（第22図及び第23図参
照）。プラスミドBin6は英国、ケンブリッジ、Plant Br
eeding InstituteのM.Bevan博士から得られた。このプ
ラスミドはBevanによる［Nucl.Acids.Res.,12、8711−8
721（1984）、ここにおいて準用する］の文献に説明さ
れている。プラスミドBin6DNAをEcoRI及びHindIIIで消
化し、キメラネオマイシンホスホトランスファラーゼ
（NPT）遺伝子を含有する約1.5kbpの大きさの断片を単
離し、アガロースゲル電気泳動により精製した。この断
片を次いでエンドヌクレアーゼEcoRI及びHindIIIで切断
されたプラスミドpUC18DNAと混合した。T4DNAリガーゼ
とのインキュベーション後、得られたDNAをE.コリ菌株H
B101中に形質転換した。得られたプラスミドをpUC18/ne
oと称する。このプラスミドDNAはネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子とノパリンシンダーゼのターミ
ネーター配列との間に不所望のBaHI認識配列を含有する
［Bevan、Nucl.Acids.Res.,12、8711−8721（1984）
（ここにおいて準用する）参照］。この認識配列を除去
するためにプラスミドpUC18/neoをエンドヌクレアーゼB
amHIで消化後、DNAポリメラーゼの大断片で処理してブ
ラント末端を創出した。断片を次いでT4DNAリガーゼと
インキュベートして断片を再円形化し、E.コリ菌株HB10
1中に形質転換した。得られたプラスミドpUC18/neo（Ba
m）はBamHI認識部位を失っていた。
Ｔ−DNA右境界配列を次いでキメラNPT遺伝子の次に添
加した（第24図参照）。プラスミドpBR325/Hind23はプ
ラスミドpTiT37の3,4−kbp HinsIII断片を含有する。こ
の断片は右Ｔ−DNA境界配列を含有する［Bavan et al.,
Nucl.Acids Res.,11、369〜385、ここにおいて準用す
る］。プラスミドpBR325/Hind23DNAをエンドヌクレアー
ゼSacII及びHindIIIで切断し、右境界を含有する1.0kbp
断片を単離し、アガロースゲル電気泳動に従って精製し
た。プラスミドpUC18/neo（Bam）DNAをエンドヌクレア
ーゼSacII及びHindIIIで消化し、4.0kbpベクター断片を
アガロースゲル電気泳動により単離した。これらの二つ
の断片を混合し、T4DNAリガーゼとインキュベートし、
E.コリ菌株HB101中に形質転換した。得られたプラスミ
ドpcIB4（第23図に示す）は、プラスミドpUC18の誘導体
中にＴ−DNA右境界及びカナマイシン耐性のための植物
−選択性マーカーを含有する。
次に、Ｔ−DNA左及び右境界の両者を植物選択性カナ
マイシン耐性遺伝子及び境界間のpUC18のポリリンカー
と共に含有するプラスミドを造築した（第28図参照）。
プラスミドpCIB4DNAをエンドヌクレアーゼHindIIIで消
化後、DNAポリメラーゼの大断片で処理してブラント末
端を創出した後、エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し
た。キメラカナマイシン耐性遺伝子及びＴ−DNAの右境
界を含有する2.6−kbp断片をアガロースゲル電気泳動に
より単離した。プラスミドpCIB5DNAをエンドヌクレアー
ゼAatIIで消化し、T4DNAポリメラーゼで処理してブラン
ト末端を創出し、次いでエンドヌクレアーゼEciRIで切
断した。より大きいベクター断片をアガロースゲル電気
泳動により精製し、pCIB4断片と混合し、T4DNAリガーゼ
とインキュベートし、E.コリ菌株HB101中にインキュベ
ートした。得られたプラスミドpCIB2（第24図に示す）
は二つのＴ−DNA境界間に目的配列を含有するプラスミ
ドpBR322の誘導体である。
以下の工程はベクターpCIB10の造築を完結し、第25図
に示される。プラスミドpCIB2DNAをエンドヌクレアーゼ
EcoRVで消化し、BalII認識部位を含有する合成リンカー
を上記の如く添加する。過剰のBalIIエンドヌクレアー
ゼで消化後、約2.6−kbp断片をアガロースゲル電気泳動
に従って単離した。上記プラスミドpRK252/Tn903/BalII
（第20図参照）をエンドヌクレアーゼBalIIで消化し、
次いでホスファターゼで消化して再円形化を防止した。
これらの二つのDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼとイン
キュベートし、E.コリ菌株HB101中に形質転換した。得
られたプラスミドが完成ベクターpCIB10である。
キメラプロトキシン遺伝子のベクターpCIB10中への挿
入は、第26図に示される工程によって行われる。プラス
ミドpBR322/bt17DNAをエンドヌクレアーゼPvuI及びSalI
で消化し、次いで部分的にエンドヌクレアーゼBamHIで
消化した。キメラ遺伝子を含有する約4.2−kbpの大きさ
のBamHI−SalI断片をアガロースゲル電気泳動に従って
単離し、エンドヌクレアーゼBamHI及びSalIで消化され
たプラスミドpCIB10DNAと混合した。T4DNAリガーゼとの
インキュベーション及びE.コリ菌株HB101中の形質転換
後第26図に示されたプラスミドはプラスミドベクターpC
IB10中にキメラプロトキシン遺伝子を含有した。
プラスミドpCIB/19SbtをE.コリHB101からアグロバク
テリウムに転移するために、中間体E.コリ宿主菌株S17
−１を用いた。この、コロラド州ボールダーのAgrigene
tics Research Corp.から得られる菌株はプラスミドpCI
B10を接合を介してアグロバクテリウムに直接転移して
裸プラスミドDNAの直接アグロバクテリウム中への形質
転換させる必要性を回避する可動化機能を含有する［菌
株S17−１に対する文献は、Simon et al.,“Moleculsr
Genetics of the Bacteria−Plant Interaction"、A.Pu
hler編、Springer Verlag,ベルリン、98〜106頁、198
3、（ここにおいて準用する）である］。先ず、プラス
ミドpCIB10/19Sbt DNAを塩化カルシウム処理S17−１細
胞中に導入する。次いで形質転換S17−１細胞の培養液
及びアグロバクテリウムツメファシエンス菌株LBA4404
［Ooms et al.,Gene、14 33−50（1981）、ここにおい
て準用する）］を混合し、Ｎ寒天（Difco）プレート上
で室温において一晩交配した。得られた細菌の１白銀耳
をAB最小培地上にストリークし［Chilton et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、77、7347−7351（1974）、ここに
おいて準用する］、50μg/mlのカナマイシンと共にプレ
ート培養し、28℃でインキュベートした。コロニーを同
一培地上に再ストリークし、次いでNB寒天プレート上に
再ストリークした。遅い成長コロニーをつつき出し、AB
最小培地上にカナマインシと共にストリークし、単一コ
ロニーを単離した。この操作はpCIB10/19Sbtプラスミド
を含有するアグロバクテリアを選択するものである。
バチルス・ツリンギエンシスプロトキシンキメラ遺伝
子のCaMV35Sプロモーターによる造築は、第27図に示さ
れたように造築されたCaMV35Sプロモーターカセットプ
ラスミドpCIB710の造築により達成された。このプラス
ミドはCaMVプロモーター及び35SRNA転写体に対する転写
停止配列を含有した［Covey、S.N.,Lomonossoff,G.P.,
及びHull,R.,Nucleic Acids Research Vol.9、6735−67
47（1981）、ここにおいて準用する］。CaMV DNAの1149
−bp BalII制限断片［Hohn et al.,Current Topics in
Microbiology and Immunology,96、194−220、及びAppe
ndices Ato G（1982）、ここにおいて準用する］をプラ
スミドpLV111（サンディエゴのカリフォルニア大学のS.
Howell博士から得られたもの；或いはこの断片は直接Ca
MV DNAから単離することができる）から前記の如く調製
アガロース電気泳動により単離し、BamHI−切断プラス
ミドpUC19DNAと混合し、T4DNSリガーゼで処理し、E.コ
リ中に形質転換した。得られたプラスミド中のBamHI制
限部位はBglII付着端のBamHI付着端への連結により破壊
された。pUC19/35Sと称される得られたプラスミドを次
いでオリゴヌクレオチド−指示in−vitro突然変異誘発
において用いてHohn文献におけるCaMVヌクレオチド7483
の直後にBamHI認識配列GGATCCを挿入した。得られたプ
ラスミドpCIB710はBamHI制限部位により分離されたCaMV
35Sプロモーター領域及び転写停止領域を含有する。こ
のBamHI部位に挿入されたDNA配列はCaMV転写制御配列に
より植物内で発現される。pCIB710は転写の開始点及びB
amHI部位の間に如何なるATG翻訳開始コドンも含有しな
い。
CaMV35Sプロモーター／ターミネーターカセットのpCI
B10中への挿入は第28図に概略図示される工程により行
われた。プラスミドpCIB10及びpCIB710DNAsをEcoRI及び
SalIで消化し、混合し、連結した。得られたpCIB10/710
は植物形質転換ベクターpCIB10に挿入されたCaMV35Sプ
ロモーター／ターミネーターカセットを有する。CaMV35
S配列は、pCIB10のＴ−DNA境界の間にあり、従って植物
形質転換における植物ゲノム中に挿入される。
バチルス・ツリンギエンシスプロトキシン遺伝子のpC
IB10/710中への挿入は第29図に概略図示される工程によ
り行われた。プロトキシン遺伝子源としては、プラスミ
ドpCIB10/19SbtをBamHI及びNcoIで消化し、プロトキシ
ン遺伝子を含有する3,6−kb断片を調製ゲル電気泳動に
より単離した。この断片を次いで配列５′−CATGGCCGGA
TCCGGC−３′を有する合成NcoI−BamHIアダプターと混
合し、次いでBamHIで消化した。この工程はプロトキシ
ン断片の両末端にBamHI付着端を創出す。この断片を次
いでBamHI−切断pCIB10/710中に挿入した。第29図に示
される得られたプラスミドpCIB10/35SbtはCaMV35Sプロ
モーターと転写停止配列の間にプロトキシン遺伝子を含
有する。
プラスミドpCIB10/35Sbtのアグロバクテリウムツメフ
ァシエンス菌株LBA4404中への転移は前記の通りであっ
た。
約725個のアミノ酸を含有する欠失バチルスツリンギ
エンシスプロトキシンの造築及びこの欠失遺伝子をCaMV
35Sプロモーターと共に含有するキメラ遺伝子の造築
は、一般式１に示された配列における位置2325において
KpnI制限エンドヌクレアーゼにおいて切断することによ
って、遺伝子のCOOH−末端部分を除去して行われた。プ
ラスミドpCIB10/35Sbt（第29図）をBamHI及びKpnIで消
化し、欠失プロトキシン遺伝子を含有する約2.2−kbpの
BamHI/KpnI断片を調製アガロースゲル電気泳動により単
離した。３′末端におけるKpnI部位をBamHI部位に転換
するために、断片をKpnI/BamHIアダプターオリゴヌクレ
オチドと混合し、連結した。この断片を次いでBamHI−
切断pCIB10/710と混合した（第28図）。
約645個のアミノ酸を含有する欠失プロトキシン遺伝
子を一般式１に示された配列における2090位におけるBc
lI制限エンドヌクレアーゼ部位において切断して遺伝子
のCOOH−末端部分を除去することにより作成した。プラ
スミドpCIB10/35Sbt（第29図）をBamHI/BclIで消化し、
欠失プロトキシン遺伝子を含有する約1.9−kbpのBamHI/
BcII断片を調製アガロースゲル電気泳動により単離し
た。BclIはBamHIと適合性の付着端を創出するので、こ
の断片をBamHI−切断pCIB10/710（第28図）に連結する
前に更に操作が必要とされない。第31図に示された構造
pCIB10/35Sbt（BclI）を有する得られたプラスミドはカ
ナマイシン上で選択された。
pCIB10/35Sbt（KpnI）と命名され、第30図に示される
得られた形質転換体は約725のアミノ酸の欠失プロトキ
シン遺伝子を含有する。これらの形質転換体はカナマイ
シン上で選択される。
欠失プロトキシン遺伝子はBamHI切断部位（GGATCC）
を導入することにより作られた。これはpCIB10/35Sbtか
らのプロトキシン配列を含有するBamHI断片をmp18中に
クローニングし、及び上記標準オリゴヌクレオチド突然
変異誘発を用いることによりなされる。突然変異誘発
後、二本鎖複製形態DNAをM13クローンから調製し、それ
を次いでBamHIで消化する。欠失プロトキシン遺伝子を
含有する約1.9−kbp断片をBamHI−切断pCIB10/710中に
挿入する。第32図に示される構造pCIB10/35Sbt（607）
を有する得られたプラスミドをカナマイシン上で選択す
る。
pCIB10/Sbt（607）が用いられた。形質転換は選択性
抗生物質を含有する培地上で1mlのアリコートを直ちに
プレート培養した以外は、実施例７と同様にして達成さ
れた。この選択培地はカナマイシン（50μg/ml）或いは
G418（25μg/ml）を含有した。両形質転換植物組織中に
おけるNRTキメラ遺伝子の発現がいずれの抗生物質上で
この組織の選択を可能にする。
２〜４週間以内で形質転換組織が選択プレート上に明
らかとなった。植物物質はカナマイシン或いはG418上で
選択した。植物組織（個々の胚或いはカルス）を次いで
緩衝液で抽出し、BT遺伝子生成物の発現についてELISA
アッセイにより測定した。抽出の条件は次の通りであ
る:100mgの組織当り、50mM NaCO3（pH9.5）、0.05％Tri
ton、0.05％Tween、100nM NaCl、10mM EDTA、1mMロイペ
プチン、及び1mM PMSFを含有する0.1mlの抽出緩衝液中
でホモジナイズする。ロイペプチン及びPMSFは使用直前
に100×原液から添加する。組織をモーター駆動乳棒で
磨砕した。抽出後、2M TrispH7を添加してpHを8.0〜8.5
に調整し、次いでベックマンマイクロヒュージ12中で12
000rpmで遠心分離し（４℃で10分間）、上澄液を酵素結
合免疫吸着剤アッセイ（「ELISA」）のために保存し
た。
ELISA技術は一般的道具として［M.F.Clark et al.Met
hods in Enzymology118:742−766（1986）、ここにおい
て準用する］により説明されている。
Bt毒素用のELISAは標準操作を用いて開発され、トラ
ンスジェニック植物物質をBt配列の発現について分析す
るために用いられた。この操作のために、ELISAプレー
トをエタノールで予備処理し、及びアフィニティ精製ウ
サギ抗−Bt抗血清（50μｌ）をホウ酸−緩衝化塩水（下
記参照）中の３μg/ml濃度でプレートに添加する。これ
を４℃で一晩インキュベートさせた。抗血清が勾配精製
Bt結晶によるウサギの免疫化に応答して産生され［Ang,
B.J.＆ Nickerson,K.W.;Appl.Environ.Microbiol.36:6
25−626（1978）、ここにおいて準用する］、ドデシル
硫酸ナトリウムで可溶化し、ELISA洗浄緩衝液（下記参
照）で洗浄した。それを次いで室温で１時間ブロッキン
グ緩衝液（下記参照）で処理し、ELISA洗浄緩衝液で洗
浄した。植物抽出液を50μｇのタンパク質を与える量で
添加した（これは典型的には約５μｌの抽出液であ
る）。タンパク質としての葉抽出緩衝液は、カリフォル
ニア州、リッチモンド、Bio−Rad社から得られる市販の
キットを用いてBradford法により求める［Bradford,M.,
Anal.Biochem.72:248（1976）、ここにおいて準用す
る］。葉抽出液の希釈が必要な場合には、ELISA稀釈液
（下記参照）を用いる。これを４℃で一晩インキュベー
トさせる。ELISA洗浄緩衝液で洗浄後、50μｇアフィニ
ティ精製ヤギ抗−Bt抗血清をELISA稀釈液中の３μg/ml
タンパク質の濃度で添加する。これを37℃で１時間イン
キュベートさせ、次いでELISA洗浄緩衝液で洗浄する。
アルカリホスファターゼに結合した50μｌのウサギ抗−
ヤギ抗体［ミズリー州、セントルイス、Sigma Chemical
s社から市販のもの］を、ELISA稀釈液中に1:500に稀釈
し、37℃で１時間インキュベートさせ、次いでELISA洗
浄緩衝液で洗浄する。50μｌの基質［ELISA基質緩衝液
（下記参照）中0.6mg/mlのｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート］を添加し、室温で30分間インキュベートする。反
応は50μｌの3M NaOHを添加することにより停止する。
修正ELISA読取機［カリフォルニア州、スタンフォー
ド、Hewlet Packard社］における405nmでの吸光度を読
取る。
pCIB10/35SBt（BclI）で形質転換した植物組織は、こ
のELISA操作を用いて分析した際に陽性反応を示し、Bt
遺伝子の発現を示した。
EPBS（ELISAリン酸緩衝塩水） 10mM Naホスフェート：Na2HPO4 4.68g/4l NaH2PO4・H2O 0.976g/4l 140mM NaCl NaCl 32.7g/4l pHは約7.4であるべきである。
ホウ酸緩衝塩水 100mMホウ酸 25mM Naボレート 75mM NaCl pHを必要に応じてHCl或いはNaOHで8.4〜8.5に調整す
る。
ELISAブロッキング緩衝液 EPBS中 １％ BSA 0.02％ Naアジド ELISA洗浄緩衝液 10mM Tris−HCl pH8.0 0.05％ Tween 20 0.02％ Naアジド 2.5M TRIS ELISA稀釈液 EPBS中 0.05％ Tween 20 １％ BSA 0.02％ Naアジド ELOSA基質緩衝液 500ml中 48mlジエタノールアミン 24.5mg MgCl2 HClでpH9.8に調整。
ELISA基質 25ml基質緩衝液中15mgのｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト。
バイオアッセイに対しては、これらのアグロバクテリ
アによる形質転換から得られた抗生物質耐性細胞培養液
からの細胞浮遊液を開始した。浮遊液をG418（25mg/l）
で補給した培地中で生育させ、７〜10日間間隔で新鮮な
抗生物質含有培地中に二次培養した。次いでこれらの培
養液の試料を培養アッセイに用いて鱗翅目昆虫に対する
毒性を試験した。20mlのこれらの培養液のアリコートを
沈澱させ（細胞容積＝３〜4ml）、抗生物質に欠ける培
地中に再浮遊させた。浮遊液を次いでこの培地中におい
て追加の２日間生育させて細胞から残存抗生物質を欠乏
させた。3/4オンス部分のカップの底に湿潤Whatman 2.3
cm紙の２枚の円盤を置いた。0.2cm深さの形質転換浮
遊培養細胞の層を紙円盤上に置いた。新たに孵化した
マンデュカ・セレクタ（Manduca sexta）或いはヘリオ
ティス・ビレセンス（Heliothis virescens）幼虫を各
部分のカップ中に入れた。対照例は非形質転換浮遊培養
細胞で、飼育した幼虫により構成された。円盤は必要に
応じて２日間間隔で更新された。マンデュカ幼虫は通常
より多くの植物物質を必要とする。形質転換細胞で飼育
された幼虫の成長速度及び死亡率を、未形質転換細胞で
飼育された幼虫の成長速度と対比して５日後に評点した
ところ、形質転換綿細胞におけるBt遺伝子産生物の毒性
が明らかに認められた。
実施例15 チーズクロスのシート上に置かれたヘリオティス・ビ
レセンスの卵は、ノースカロライナ州レイリーのノース
カロライナ州立大学のTabacco Insect Control Laborat
oryから得られた。チーズクロスシートをカバーされた
大ガラスビーカーに移し、湿潤紙タオルで湿度を維持し
て29℃でインキュベートした。卵は３日以内に孵化し
た。孵化後なるべく早く、幼虫（カップ当り１匹の幼
虫）をカバーされた3/4オンスのプラスチックカップに
移した。各カップは綿の葉の円盤を含有する。幼虫は細
い荒毛塗料ブラシを用いて移した。
1cm直径の葉の円盤は綿植物の葉から切抜きカップ内
の円形湿潤紙上に幼虫と共に置いた。各植物について
若い及び古い両方の葉である少なくとも６〜10枚の葉の
円盤について試験した。葉の円盤は２日間間隔或いは必
要に応じて取り変えて幼虫を飼育した。形質転換された
植物の葉上で飼育される幼虫の成長速度［全レプリカ昆
虫の大きさ或いは合一重量］及び死亡率を未形質転換綿
の葉で飼育される幼虫のそれらと比較した。
pCIB10/35SB5（BclI）で形質転換された綿の円盤で飼
育される幼虫は、対照例と比較して成長速度の減少及び
死亡率の増大を示す。
ある数の我々の再生植物（５〜10％）は、再生過程の
結果として遺伝的に継承可能な表現型変化を獲得したよ
うに見えることが観察された。この変化はソマクローナ
ル変化として知られている。以下の実施例は我々の再生
操作の結果としてのソマクローナル変化を如何にして用
いられて商業的に有用な新しい形質を綿の品種中に導入
したかを例示するものである。
実施例16 真菌病源体に耐性の綿再生体 実施例１の操作に従い、品種SJ5及びSJ4の得られた再
生綿植物を硬化し、土壌中に入れた。これらの植物は自
己受粉させ、F1世代を表わす種子を集めた。
バーティシリウム（Verticillium）に対して耐性の再
生体（ソマクローナル変種）を得るためにF1世代をバー
ティシリウム蔓延畑に植付けて、後代列分析を行った。
品種SJ4及びSJ5の種子を畑に代照例として植付けた。バ
ーティシリウム真菌に対して親品種より耐性のあるソマ
クローナル変種は総合的植物の活力、収量及び病気に伴
う葉の徴候の不存在を評価することにより僅かの後代列
（５％）中に確認された。第33図は、バーティシリウム
蔓延畑内に植付けられた再生体の後代列を示す。第34図
は品種SJ4のバーティシリウム耐性ソマクローナル変種
を示す。この真菌病源体に対する耐性の改良は、遺伝的
に安定であることが判明し、引続く世代に継代された。
実施例17 変更された成長性癖を有する綿再生体 病気蔓延土壌中に植付ける代りにF1世代を綿育成苗床
に植付けた以外は、実施例13の操作に従った。F1再生後
代の総合的成長性癖を対照例品種のそれと対比した。成
長性癖においてより均一であり、且つ親品種より丈の短
いソマクローナル変種が確認された。我々の試みにおい
てphy6と同定された一つのSJ5再生体は親品種より丈が2
0％短かった。この種の成長性癖は狭い列（30インチ列
間隔）の栽培条件下において生育される綿においては望
ましいものである。これらの形質は遺伝的に安定であ
り、引続く世代に継代された。
実施例18 改良された繊維形質を有する綿再生体 F1後代の再生体を綿育成苗床内に植付け結実させた以
外は、実施例13の操作に従った。ボールが成熟した時点
で、綿を収穫し、長さ、均一性、引張強度、弾性及びミ
クロネールを含む幾つかの繊維品質形質の分析に付し
た。これらの形質の１以上において親品種に対して有意
に改良されたソマクローナル変種が確認された。F2後代
（F1の細胞受粉）からの代表的データを下記表１に含ま
せる。星印を付けた統計学的に有意であり、引続く世代
において真に生育することが判明したSJ5再生体におけ
る改良を表わす。
実施例19 改良した収量を有する綿再生体 品種SJ4のF1後代の再生体を非再生対照例と共に複製
収率試験において植付けた以外は、実施例13の操作に従
った。より均一な成長性癖及びより活力のある成長性癖
を示した一つの変種は、同一試験における親品種よりも
４％多い綿を生産した。データを下記第２表に示す。
収率の４％増大は、100万エーカーを越す綿が毎年栽
培されているカリフォルニアにおいて平均的綿生産者に
対してエーカー当り殆んど20ドルの収益を表わす。
実施例20 殺草剤（カナマイシン）に耐性の綿再生体 綿品種B1644の浮遊培養液を実施例５の方法に従って
発達させた。浮遊培養液を、実施例６と同様であるが、
しかし殺草剤（抗生物質）カナマイシン（25mg/l）を補
給した寒天培地上にプレート培養した。殆んどの細胞が
死滅したが、僅か（１〜５％）は耐性であり生残った。
これらを選択的に増大濃度のカナマイシンにより最終濃
度が50mg/lに到達するまで補給された寒天−固化培地上
で二次培養した。胚をこのカルスから次いで発達させ耐
性胚をカナマイシン耐性植物に発芽させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラジャセカラン，カンニアー アメリカ合衆国 91024 カリフォルニア, シエラ マドレ，エスペランザ アベニュ ー 116シー (72)発明者 グリュラ，ジョン ウィリアム アメリカ合衆国 91104 カリフォルニア, パサデナ，クウィーンズベリ ロード 2077 (72)発明者 ハドスペス，リチャード ローン アメリカ合衆国 91001 カリフォルニア, アルタデナ，ブレーバーン ロード 1512 (72)発明者 イエノフスキ，リチャード リー アメリカ合衆国 91006 カリフォルニア, アルカディア，ウェスト ノーマン アベ ニュー 628 (56)参考文献 Ｒ．Ｃ．Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａ ｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｓ，５（３），1986，Ｐ．178−181

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記工程よりなることを特徴とする綿植物
    の体細胞からの再生方法： ａ）綿外植片を与える工程； ｂ）その綿外植片を炭素源としてグルコースを含む第一
    の固体カルス生育培地中においてカルスを形成する外植
    片からのフェノール類の分泌が終了し且つ未分化カルス
    が外植片から発達するのに十分な時間培養する工程； ｃ）そのカルスをフェノール類の分泌の終了時に炭素源
    としてスクロースを含む第二の固体胚分化培地に移す工
    程； ｄ）そのカルスを第二の固体胚分化培地において少なく
    とも１つの胚を与える胚発生カルスを発達させるのに十
    分な時間培養する工程； ｅ）胚を植物発芽培地中に移す工程；及び ｆ）胚を植物発芽培地上で胚から苗を発達させるのに十
    分な時間培養する工程。
  2. 【請求項２】下記工程よりなることを特徴とする綿植物
    の体細胞からの再生方法： ａ）綿外植片を、組織培養によるカルス生育のために、
    第一の固体カルス生育培地上でカルスを形成する外植片
    からのフェノール類の分泌が終了し且つ胚発生カルスの
    形成を可能にするのに十分な時間培養する工程； ｂ）そのカルスをフェノール類の分泌の終了時に炭素源
    としてスクロースを含む第二の固体カルス生育培地に移
    し、そのカルスを第二の固体生育培地上で胚発生カルス
    を発達させて少なくとも１つの胚を与えるのに十分な時
    間培養する工程； ｃ）第二の固体カルス生育培地中に形成された胚発生カ
    ルスをスクロースを含む液体カルス生育培地中に細別及
    び浮遊させ、該浮遊培養液中の該胚発生カルスから少な
    くとも600ミクロンの大きさの胚発生塊を発達させる工
    程； ｄ）600ミクロンより大きい大きさの胚発生塊を液体カ
    ルス生育培地から回収する工程； ｅ）600ミクロンより大きい大きさの胚発生塊を植物発
    芽培地において、塊から苗を発達させるのに十分な時間
    生育させる工程。
  3. 【請求項３】生育開始時の浮遊培養液が8mlの液体胚発
    育培地当り750乃至約1000mgのカルス部分を含有する請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】下記工程を含んでなることを特徴とする請
    求項１〜３の何れか１つに記載の綿植物の再生方法： ａ）第一の固体カルス生育培地がチアミン塩酸塩、ナフ
    タレン酢酸、及びキネチン及びイノシトールを補給され
    た完全或いは半−強度のムラシゲ及びスクーグ生育培地
    であり、約25乃至35℃の温度において、約2000乃至約40
    00ルクスの光強度での約16時間の光及び約８時間の闇の
    日光サイクル下において、カルスを形成する外植片から
    のフェノール類の分泌が終了し且つ未分化カルスが外植
    片から形成するのに十分な時間培養する工程； ｂ）第二の固体カルス生育培地がスクロース及び約１乃
    至約10mg/lのナフタレン酢酸を含んでなる完全或いは半
    −強度のムラシゲ及びスクーグ生育培地であり、及びカ
    ルスを約25乃至約35℃の温度において約2000乃至約4000
    ルクスの光強度での約16時間の光及び約８時間の闇の日
    光サイクル下において黄色乃至白色胚発生カルスが形成
    されるのに十分な時間培養する工程。
  5. 【請求項５】植物発芽培地が窒素源に富んだビーズレー
    及びティン（Beasley and Ting）の培地である請求項１
    〜４の何れか１つに記載の方法。
  6. 【請求項６】グルコースを含む第一の固体カルス生育培
    地を、フェノール類の分泌が終了する時まで、少なくと
    も10日毎に替える請求項１〜５の何れか１つに記載の方
    法。
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