JPH0822842B2 - アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド - Google Patents
アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリドInfo
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- JPH0822842B2 JPH0822842B2 JP63146089A JP14608988A JPH0822842B2 JP H0822842 B2 JPH0822842 B2 JP H0822842B2 JP 63146089 A JP63146089 A JP 63146089A JP 14608988 A JP14608988 A JP 14608988A JP H0822842 B2 JPH0822842 B2 JP H0822842B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は構造式（Ｉ） ［式中、R1,R2,R3は同一もしくは異なり、 -(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）である。］で示されるアルギ
ニル−３−tert−アルキルオキシカルボニル−４−ニト
ロアニリドおよびその酸付加塩に関する。
ニル−３−tert−アルキルオキシカルボニル−４−ニト
ロアニリドおよびその酸付加塩に関する。
本発明の化合物（Ｉ）は、酵素活性測定用の発色性基
質の合成原料として有用であり、特に、トリプシン、ウ
ロキナーゼ、トロンビン等の、塩基性アミノ酸のカルボ
キシル基側を加水分解する特異性を有する酵素の酵素活
性測定用の発色性基質の合成の出発原料として有用であ
る。
質の合成原料として有用であり、特に、トリプシン、ウ
ロキナーゼ、トロンビン等の、塩基性アミノ酸のカルボ
キシル基側を加水分解する特異性を有する酵素の酵素活
性測定用の発色性基質の合成の出発原料として有用であ
る。
（２）従来の技術 ヒト血漿中のトリプシン、ウロキナーゼ、トロンビン
などの酵素を定量する方法として、酵素の作用によつて
発色性化合物を解離する基質を用いて定量する方法があ
る。この方法においては、酵素と基質とを反応させて発
色性化合物を解離させ、一定の波長の光の吸光度を測定
して対象とする酵素を定量する。
などの酵素を定量する方法として、酵素の作用によつて
発色性化合物を解離する基質を用いて定量する方法があ
る。この方法においては、酵素と基質とを反応させて発
色性化合物を解離させ、一定の波長の光の吸光度を測定
して対象とする酵素を定量する。
かかる測定法において用いる酵素活性測定用基質は、
酵素に対する高感度、特異性、分解物の易検出性と共に
水あるいは緩衝液に対しての溶解性の良いことが要求さ
れる。
酵素に対する高感度、特異性、分解物の易検出性と共に
水あるいは緩衝液に対しての溶解性の良いことが要求さ
れる。
特開昭59-106446にはトロンビン、カリクレイン、ウ
ロキナーゼ、プラスミン等の酵素活性用基質として式
（II） （式中ＸはＨあるいは一般にペプチド合成に用いられる
保護基、ＡおよびＢはアミノ酸あるいはその誘導体残
基）で表わされる発色性基質が提案されている。Ｒは-O
CnH2n+1のエステル型のもの、-NHCnH2n+1のアミド型の
もの、あるいはアミノ酸残基のものが記載されている
が、Ｒ＝OHのカルボキシル型のものは記載されていな
い。
ロキナーゼ、プラスミン等の酵素活性用基質として式
（II） （式中ＸはＨあるいは一般にペプチド合成に用いられる
保護基、ＡおよびＢはアミノ酸あるいはその誘導体残
基）で表わされる発色性基質が提案されている。Ｒは-O
CnH2n+1のエステル型のもの、-NHCnH2n+1のアミド型の
もの、あるいはアミノ酸残基のものが記載されている
が、Ｒ＝OHのカルボキシル型のものは記載されていな
い。
（３）発明が解決しようとする課題 カルボキシル型の酵素活性測定用基質は水或いは緩衝
液に対する溶解性の点からしてエステル型やアミド型の
ものに比べ好ましいと考えられ、またカルボキシル型に
することによつて酵素に対する特異性が生じることも考
えられるので同タイプの基質の開発が望まれているが、
次のような理由によつて合成することが極めて困難であ
る。
液に対する溶解性の点からしてエステル型やアミド型の
ものに比べ好ましいと考えられ、またカルボキシル型に
することによつて酵素に対する特異性が生じることも考
えられるので同タイプの基質の開発が望まれているが、
次のような理由によつて合成することが極めて困難であ
る。
上記基質の合成は、特開昭59-106446に示されている
ように下記反応式で表わされる反応によつて行なわれ
る。
ように下記反応式で表わされる反応によつて行なわれ
る。
上記反応において、カルボキシル型の基質を得るために
Ｒ＝OHである化合物（ｂ）を用いると、当該カルボキシ
ル基の存在のために副生成物を生じ目的とする基質を高
収率で得ることは困難である。副反応を防止するために
は、カルボキシル基を上記公開特許明細書に示されてい
るようにエステル、アミド等として保護する必要があ
る。この場合には、カルボキシル型の基質を得ようとす
れば、後でエステル基等の保護基を除去しなければなら
ない。しかしながら、上記公開特許明細書に記載された
ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、メチルアミ
ド、エチルアミドなどの第１級や第２級アルコールのエ
ステル又はアミドの場合には、かかる保護基の除去操作
によつて基質分子中の他のペプチド結合が解裂するおそ
れがあるため、第１級や第２級アルコールのエステル、
又はアミドである保護基を除去できないのである。
Ｒ＝OHである化合物（ｂ）を用いると、当該カルボキシ
ル基の存在のために副生成物を生じ目的とする基質を高
収率で得ることは困難である。副反応を防止するために
は、カルボキシル基を上記公開特許明細書に示されてい
るようにエステル、アミド等として保護する必要があ
る。この場合には、カルボキシル型の基質を得ようとす
れば、後でエステル基等の保護基を除去しなければなら
ない。しかしながら、上記公開特許明細書に記載された
ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、メチルアミ
ド、エチルアミドなどの第１級や第２級アルコールのエ
ステル又はアミドの場合には、かかる保護基の除去操作
によつて基質分子中の他のペプチド結合が解裂するおそ
れがあるため、第１級や第２級アルコールのエステル、
又はアミドである保護基を除去できないのである。
本発明は以上に述べたような問題点を解決して上記式
（II）においてＲ＝OHの基質を合成することが可能な中
間体を提供することを目的とする。
（II）においてＲ＝OHの基質を合成することが可能な中
間体を提供することを目的とする。
（４）課題を解決するための手段 このような状況の下において我々が鋭意研究を行つた
結果、式（Ｉ） ［式中、R1,R2,R3は同一もしくは異なり、 -(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）である。］で表わされる新規
化合物（アルギニル−３−tert−アルキルオキシカルボ
ニル−４−ニトロアニリド）またはその酸付加塩が上記
目的を達成するために有効であることを見出し、本発明
を完成させるに至つた。
結果、式（Ｉ） ［式中、R1,R2,R3は同一もしくは異なり、 -(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）である。］で表わされる新規
化合物（アルギニル−３−tert−アルキルオキシカルボ
ニル−４−ニトロアニリド）またはその酸付加塩が上記
目的を達成するために有効であることを見出し、本発明
を完成させるに至つた。
上記式（Ｉ）において、 としては、例えば以下のものが挙げられる。
式（Ｉ）の新規化合物は酸付加塩であつてもよく、か
かる酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、
リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸
塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホ
ン酸塩などの有機酸塩等がある。
かる酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、
リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸
塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホ
ン酸塩などの有機酸塩等がある。
式（Ｉ）の新規化合物またはその酸付加塩は、カルボ
キシル型の酵素活性測定用基質を合成するための中間体
として極めて有用である。即ち、後述する参考例１で示
す如く、ジペプチドまたはその誘導体、例えばＤ−γ−
（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシンと式
（Ｉ）の化合物、例えば 部分のtert−アルキルエステルがｔ−ブチルエステルで
ある化合物を反応せしめ、次いで得られる化合物のtert
−アルキルエステルを酸分解にて脱離することによつ
て、高収率で且つ容易にカルボキシル型の新規な酵素活
性測定用基質が得られる。
キシル型の酵素活性測定用基質を合成するための中間体
として極めて有用である。即ち、後述する参考例１で示
す如く、ジペプチドまたはその誘導体、例えばＤ−γ−
（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシンと式
（Ｉ）の化合物、例えば 部分のtert−アルキルエステルがｔ−ブチルエステルで
ある化合物を反応せしめ、次いで得られる化合物のtert
−アルキルエステルを酸分解にて脱離することによつ
て、高収率で且つ容易にカルボキシル型の新規な酵素活
性測定用基質が得られる。
本発明に係る式（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩
は、以下に示す反応式によつて合成することができる。
は、以下に示す反応式によつて合成することができる。
第一段階でＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アル
ギニン（III）水和物と５−アミノ−２−ニトロ安息香
酸−tert−アルキルエステル（IV）とをペプチド合成で
よく用いられているDCC法で脱水縮合し、Ｎα−ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−アルギニル−３−tert−アルキ
ルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド（Ｖ）を得
る。
ギニン（III）水和物と５−アミノ−２−ニトロ安息香
酸−tert−アルキルエステル（IV）とをペプチド合成で
よく用いられているDCC法で脱水縮合し、Ｎα−ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−アルギニル−３−tert−アルキ
ルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド（Ｖ）を得
る。
次いで第２段階で、Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−アルギニル−３−tert−アルキルオキシカルボニル
−４−ニトロアニリド（Ｖ）の加水分解を行い、アルギ
ニンのα−アミノ基を保護するｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（BOC）基のみを酸分解して除去する。ここで問題
となるのは通常用いられているBOC基の脱離方法ではｔ
−ブチルエステル等のtert−アルキルエステルも切断さ
れてしまうため目的とする化合物を得ることができない
ことである。この点を解決するため我々は鋭意検討の結
果、塩酸、酢酸及びジメチルホルムアミドの存在下、好
ましくは2N塩酸−酢酸−ジメチルホルムアミドという条
件下で保護基の脱離を行うことにより、BOC基のみを選
択的に脱離させることが可能であることを見出した。
ル−アルギニル−３−tert−アルキルオキシカルボニル
−４−ニトロアニリド（Ｖ）の加水分解を行い、アルギ
ニンのα−アミノ基を保護するｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（BOC）基のみを酸分解して除去する。ここで問題
となるのは通常用いられているBOC基の脱離方法ではｔ
−ブチルエステル等のtert−アルキルエステルも切断さ
れてしまうため目的とする化合物を得ることができない
ことである。この点を解決するため我々は鋭意検討の結
果、塩酸、酢酸及びジメチルホルムアミドの存在下、好
ましくは2N塩酸−酢酸−ジメチルホルムアミドという条
件下で保護基の脱離を行うことにより、BOC基のみを選
択的に脱離させることが可能であることを見出した。
しかして、式（Ｖ）の化合物の如く、アルギニン部分
のα−アミノ基がBOC基で保護されかつｔ−ブチルエス
テル等のtert−アルキルエステルを有する化合物を用い
て、これを特定の条件下で保護基の脱離反応に付すこと
によつて、初めて本発明の式（Ｉ）の化合物の合成が可
能になつたものである。従つてかかる式（Ｖ）の化合
物、及びかかる式（Ｖ）の化合物を塩酸、酢酸及びジメ
チルホルムアミドの存在下、好ましくは2N塩酸−酢酸−
ジメチルホルムアミドの系で脱保護して式（Ｉ）の化合
物を得る方法を提供することも本発明の目的の１つであ
る。
のα−アミノ基がBOC基で保護されかつｔ−ブチルエス
テル等のtert−アルキルエステルを有する化合物を用い
て、これを特定の条件下で保護基の脱離反応に付すこと
によつて、初めて本発明の式（Ｉ）の化合物の合成が可
能になつたものである。従つてかかる式（Ｖ）の化合
物、及びかかる式（Ｖ）の化合物を塩酸、酢酸及びジメ
チルホルムアミドの存在下、好ましくは2N塩酸−酢酸−
ジメチルホルムアミドの系で脱保護して式（Ｉ）の化合
物を得る方法を提供することも本発明の目的の１つであ
る。
上記の方法においては、式（Ｖ）の化合物としてアル
ギニン部分の保護基がBOC基である場合の外、1,1−ジメ
チルプロピルオキシカルボニル基、1,1−ジメチルブチ
ルオキシカルボニル基、1,1−ジメチルペンチルオキシ
カルボニル基、３−エチルペンチル−３−イルオキシカ
ルボニル基等の第３級炭素を持つアルコールのエステル
である場合の式（Ｖ）の化合物等にも適用できる。
ギニン部分の保護基がBOC基である場合の外、1,1−ジメ
チルプロピルオキシカルボニル基、1,1−ジメチルブチ
ルオキシカルボニル基、1,1−ジメチルペンチルオキシ
カルボニル基、３−エチルペンチル−３−イルオキシカ
ルボニル基等の第３級炭素を持つアルコールのエステル
である場合の式（Ｖ）の化合物等にも適用できる。
（５）発明の効果 以上の詳述した如く本発明の特徴は、式（II）に表わ
されるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の合成のた
めの出発原料として式（Ｉ）の化合物が優れているとこ
ろにある。
されるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の合成のた
めの出発原料として式（Ｉ）の化合物が優れているとこ
ろにある。
例えば、式（II）に表わされるカルボキシル型の化合
物を、カルボキシル基無保護の原料、アルギニル−３−
カルボキシ−４−ニトロアニリドを原料として用いて合
成を行つた場合、カルボキシル基の存在のために副反応
が生じ易いことは、ペプチド合成一般に言えることであ
る。そのため、目的とするカルボキシル型の化合物を高
収率で得ることは困難である。又、原料として、メチ
ル、エチル、イソブチル等のエステルとしてカルボキシ
ル基を保護した化合物を用いた場合、最終的にはかかる
エステルを脱離してカルボキシル型の目的化合物とする
ために、かかるエステルの加水分解操作を必要とするた
め、ペプチド鎖に悪影響を及ぼす。あるいは又、ベンジ
ルエステルのように還元で脱離できる保護基で保護した
原料を用いた場合には、その還元の際、基質中のニトロ
基まで還元されてしまうためかかる原料は使用できな
い。これらの保護基を用いた原料に対し、保護基として
ｔ−ブチルエステル等のtert−アルキルエステルを用い
た本発明の化合物（Ｉ）は、カルボキシル基が保護され
ているため副反応が抑えられ、かつかかる保護基は容易
に脱離することが出来るため、ペプチド鎖および最終的
に得られる基質に悪影響を及ぼすこと無しに、参考例１
に示すごとく、カルボキシル型の酵素活性測定用基質で
ある目的物を高収率で得ることが出来る。
物を、カルボキシル基無保護の原料、アルギニル−３−
カルボキシ−４−ニトロアニリドを原料として用いて合
成を行つた場合、カルボキシル基の存在のために副反応
が生じ易いことは、ペプチド合成一般に言えることであ
る。そのため、目的とするカルボキシル型の化合物を高
収率で得ることは困難である。又、原料として、メチ
ル、エチル、イソブチル等のエステルとしてカルボキシ
ル基を保護した化合物を用いた場合、最終的にはかかる
エステルを脱離してカルボキシル型の目的化合物とする
ために、かかるエステルの加水分解操作を必要とするた
め、ペプチド鎖に悪影響を及ぼす。あるいは又、ベンジ
ルエステルのように還元で脱離できる保護基で保護した
原料を用いた場合には、その還元の際、基質中のニトロ
基まで還元されてしまうためかかる原料は使用できな
い。これらの保護基を用いた原料に対し、保護基として
ｔ−ブチルエステル等のtert−アルキルエステルを用い
た本発明の化合物（Ｉ）は、カルボキシル基が保護され
ているため副反応が抑えられ、かつかかる保護基は容易
に脱離することが出来るため、ペプチド鎖および最終的
に得られる基質に悪影響を及ぼすこと無しに、参考例１
に示すごとく、カルボキシル型の酵素活性測定用基質で
ある目的物を高収率で得ることが出来る。
本発明の化合物（Ｉ）を原料として得られる例えば参
考例１で得られるカルボキシル型の酵素活性測定用基質
Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシ
ル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド
（VI）・２塩酸塩は、参考例２で示すように、CHR-TRY
（Pentapharm社）を対照とした場合、トリプシンに対す
る反応性が1.88倍、正常血清に対する反応性が20分の１
であり、トリプシン用基質としてその反応性および特異
性で優れている。
考例１で得られるカルボキシル型の酵素活性測定用基質
Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシ
ル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド
（VI）・２塩酸塩は、参考例２で示すように、CHR-TRY
（Pentapharm社）を対照とした場合、トリプシンに対す
る反応性が1.88倍、正常血清に対する反応性が20分の１
であり、トリプシン用基質としてその反応性および特異
性で優れている。
以上のように本発明の化合物（Ｉ）は、式（II）で表
わされるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の出発原
料として優れていることは明らかである。
わされるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の出発原
料として優れていることは明らかである。
更には、本発明の化合物（Ｉ）から得られるカルボキ
シル型の酵素活性測定用基質は、酵素に対する反応性、
特異性等において極めて優れている。
シル型の酵素活性測定用基質は、酵素に対する反応性、
特異性等において極めて優れている。
（６）実施例 以下に本発明の化合物（Ｉ）の合成法について実施例
で具体的に説明する。
で具体的に説明する。
実施例１ （ｉ）Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニル
−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニトロアニリ
ド（Ｖ）（式（Ｖ）においてR1,R2,R3がメチルである化
合物）の合成 Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニン（II
I）塩酸塩・水和物27.41g（83.4ミリモル）と５−アミ
ノ−２−ニトロ−安息香酸−ｔ−ブチルエステル（IV）
（式（IV）においてR1,R2,R3がメチルである化合物）1
9.87g（83.4ミリモル）を167mlの無水ピリジンに溶解
後、−５℃に冷却攪拌下、Ｎ−Ｎ′−ジシクロヘキシル
カルボジイミド37.86g（183.5ミリモル）を83mlのピリ
ジンに溶解した溶液を滴下し、混合物を室温で一夜攪拌
反応した。反応終了後、酢酸エチル333mlを反応液中に
加え、析出したジシクロヘキシルウレアを濾別した後、
溶媒を減圧留去し、そこに750mlの酢酸エチルを加え不
溶物を濾取することにより37.32g（収率84.3％）のＮα
−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニル−３−ｔ−
ブチルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド（Ｖ）を
得た。
−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニトロアニリ
ド（Ｖ）（式（Ｖ）においてR1,R2,R3がメチルである化
合物）の合成 Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニン（II
I）塩酸塩・水和物27.41g（83.4ミリモル）と５−アミ
ノ−２−ニトロ−安息香酸−ｔ−ブチルエステル（IV）
（式（IV）においてR1,R2,R3がメチルである化合物）1
9.87g（83.4ミリモル）を167mlの無水ピリジンに溶解
後、−５℃に冷却攪拌下、Ｎ−Ｎ′−ジシクロヘキシル
カルボジイミド37.86g（183.5ミリモル）を83mlのピリ
ジンに溶解した溶液を滴下し、混合物を室温で一夜攪拌
反応した。反応終了後、酢酸エチル333mlを反応液中に
加え、析出したジシクロヘキシルウレアを濾別した後、
溶媒を減圧留去し、そこに750mlの酢酸エチルを加え不
溶物を濾取することにより37.32g（収率84.3％）のＮα
−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニル−３−ｔ−
ブチルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド（Ｖ）を
得た。
（ii）アルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−
４−ニトロアニリド（Ｉ）（式（Ｉ）においてR1,R2,R3
がメチルである化合物）の合成 ここで得たＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アル
ギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニトロ
アニリド（Ｖ）7.97g（15ミリモル）をDMF9mlと酢酸3ml
に溶解し、氷冷攪拌下、2N塩酸−酢酸60mlを加え、浴温
15℃で30分間反応させ、Ｎα保護基の選択的脱離を行つ
た。反応終了後、反応溶液に酢酸エチル36mlを加え、そ
の溶液を2.5lのエーテル中に注ぐことにより沈殿を得、
濾取、減圧乾燥して粗結晶6.48gを得た。更にその結晶
を、Dowex2×８（酢酸型）［Dow Chemical］カラム（溶
離液メタノール）により精製し当量分の0.1N塩酸−メタ
ノールを加え、エーテルにて沈殿させることにより、ア
ルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニト
ロアニリド（Ｉ）・２塩酸塩の結晶5.68g（収率81.0
％）を得た。
４−ニトロアニリド（Ｉ）（式（Ｉ）においてR1,R2,R3
がメチルである化合物）の合成 ここで得たＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アル
ギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニトロ
アニリド（Ｖ）7.97g（15ミリモル）をDMF9mlと酢酸3ml
に溶解し、氷冷攪拌下、2N塩酸−酢酸60mlを加え、浴温
15℃で30分間反応させ、Ｎα保護基の選択的脱離を行つ
た。反応終了後、反応溶液に酢酸エチル36mlを加え、そ
の溶液を2.5lのエーテル中に注ぐことにより沈殿を得、
濾取、減圧乾燥して粗結晶6.48gを得た。更にその結晶
を、Dowex2×８（酢酸型）［Dow Chemical］カラム（溶
離液メタノール）により精製し当量分の0.1N塩酸−メタ
ノールを加え、エーテルにて沈殿させることにより、ア
ルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニト
ロアニリド（Ｉ）・２塩酸塩の結晶5.68g（収率81.0
％）を得た。
融点 65〜95℃（分解） 比旋光度 ▲［α］25 D▼＝＋41.5℃（Ｃ＝１、水） この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー（ｎ−
ブタノール：酢酸：水＝4:1:2）で単一スポツト（Rf＝
0.48）を与えた。
ブタノール：酢酸：水＝4:1:2）で単一スポツト（Rf＝
0.48）を与えた。
元素分析値：C17H28N6O5Cl2・1/2H2Oとして 実測値（％） C:42.77 H:6.20 N:17.60 理論値（％） C:42.86 H:6.14 N:17.64 （７）参考例 以下に参考例１として、本発明の化合物（Ｉ）を原料
とするＤ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−
グリシル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロア
ニリド（VI）の合成を具体的に説明すると共に、参考例
２として、CHR-TRY（Pentapharm社）を対照とした酵素
活性測定用基質としての式（VI）の化合物の各種酵素お
よび正常血清に対する反応性についての測定結果を示
す。
とするＤ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−
グリシル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロア
ニリド（VI）の合成を具体的に説明すると共に、参考例
２として、CHR-TRY（Pentapharm社）を対照とした酵素
活性測定用基質としての式（VI）の化合物の各種酵素お
よび正常血清に対する反応性についての測定結果を示
す。
参考例１ 化合物（Ｉ）・２塩酸塩2.34g（５ミリモル）をDMF10
mlに溶解後、氷冷下、Ｎ−エチルモルホリン0.65ml（５
ミリモル）を滴下し、５分間攪拌反応した後、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）
−グルタミル−グリシン−4,6−ジメチルピリミジル−
２−チオエステル248g（５ミリモル）をDMF10mlに溶解
した溶液を氷冷下に加え、室温で一夜攪拌反応した。反
応終了後、減圧下DMFを留去し、残渣に酢酸エチル100ml
を加え、冷５％塩酸50mlで２回、飽和食塩水50mlで１
回、10％炭酸水素ナトリウム水溶液50mlで２回、飽和食
塩水50mlで２回順次洗浄し、無水マグネシウム上で脱水
乾燥後、溶媒を減圧留去し、セフアデツクスLH-20クロ
マト（溶離液：メタノール）で精製し、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グル
タミル−グリシル−アルギニル−３−ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−４−ニトロアニリド（VII）2.56g（収率8
0.0％）を得た。
mlに溶解後、氷冷下、Ｎ−エチルモルホリン0.65ml（５
ミリモル）を滴下し、５分間攪拌反応した後、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）
−グルタミル−グリシン−4,6−ジメチルピリミジル−
２−チオエステル248g（５ミリモル）をDMF10mlに溶解
した溶液を氷冷下に加え、室温で一夜攪拌反応した。反
応終了後、減圧下DMFを留去し、残渣に酢酸エチル100ml
を加え、冷５％塩酸50mlで２回、飽和食塩水50mlで１
回、10％炭酸水素ナトリウム水溶液50mlで２回、飽和食
塩水50mlで２回順次洗浄し、無水マグネシウム上で脱水
乾燥後、溶媒を減圧留去し、セフアデツクスLH-20クロ
マト（溶離液：メタノール）で精製し、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グル
タミル−グリシル−アルギニル−３−ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−４−ニトロアニリド（VII）2.56g（収率8
0.0％）を得た。
ここで得た化合物（VII）2.42g（３ミリモル）を酢酸
3mlに溶解し、氷冷下、2N塩酸−酢酸15ml（30ミリモ
ル）を滴下し、室温で１時間反応した。反応終了後、50
0mlのエーテルに反応液を注ぎ、析出物を濾取し、トヨ
パールHW40Fクロマト（溶離液:30％酢酸）［東洋曹達］
により精製し、Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グル
タミル−グリシル−アルギニル−３−ｔ−カルボキシ−
４−ニトロアニリド・２塩酸塩（VI）を1.5g（収率75
％）得た。以下にその物性及び分析結果を示す。
3mlに溶解し、氷冷下、2N塩酸−酢酸15ml（30ミリモ
ル）を滴下し、室温で１時間反応した。反応終了後、50
0mlのエーテルに反応液を注ぎ、析出物を濾取し、トヨ
パールHW40Fクロマト（溶離液:30％酢酸）［東洋曹達］
により精製し、Ｄ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グル
タミル−グリシル−アルギニル−３−ｔ−カルボキシ−
４−ニトロアニリド・２塩酸塩（VI）を1.5g（収率75
％）得た。以下にその物性及び分析結果を示す。
融点 108〜147℃（分解） 比旋光度 ▲［α］25 D▼＝−58.0℃（Ｃ＝１、水） この結晶は、シリカゲル薄層クロマトグラフイー（ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝4:1:2）で単一スポツト（Rf
＝0.42）を与えた。
−ブタノール：酢酸：水＝4:1:2）で単一スポツト（Rf
＝0.42）を与えた。
元素分析値：C25H40N8O9Cl2・7/5H2Oとして 実測値（％） C:43.44 H:6.17 N:16.13 理論値（％） C:43.34 H:6.23 N:16.17 参考例２ １）基質液：各基質液は水に溶解し、10mMとして使用し
た。
た。
２）緩衝液：緩衝種、NaCl、およびそれらの濃度、pH
（25℃）は酵素により次の通りとした。
（25℃）は酵素により次の通りとした。
３）使用酵素 ４）反応停止液:10％酢酸水溶液 ５）測定法 ａ）各種酵素 緩衝液0.5mlと基質液0.1mlをシリコン処理した硬質ガ
ラス製試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃
恒温槽中にて10分間予加温する。
ラス製試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃
恒温槽中にて10分間予加温する。
次いで、酵素試薬0.05mlを加えて酵素反応を37℃で10
分間実施する。
分間実施する。
正確に10分後、反応停止液2.5mlを加えて、酵素反応
を停止後、37℃で10分間放置後、405nmの吸光度を測定
する。
を停止後、37℃で10分間放置後、405nmの吸光度を測定
する。
ｂ）正常血清 緩衝液0.5mlと基質液0.1mlをシリコン処理した硬質ガ
ラス製試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃
恒温槽中にて５分間予加温する。
ラス製試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃
恒温槽中にて５分間予加温する。
次いで、正常血清0.1mlを加えて酵素反応を37℃で５
分間実施する。
分間実施する。
正確に５分後、反応停止液2.0mlを加えて、酵素反応
を停止後、37℃で10分間放置後、405nmの吸光度を測定
する。
を停止後、37℃で10分間放置後、405nmの吸光度を測定
する。
６）測定結果（ａの吸光度を１とする） 略号 Z:ベンジルオキシカルボニル Glu:グルタミン酸 Gly:グリシン Arg:アルギニン PNA:P−ニトロアニリン 5ANBA:5−アミノ−２−ニトロ安息香酸 HCl:塩酸 上記の測定結果から明らかなように、本発明の化合物
（Ｉ）から得られる化合物（VI）のトリプシンに対する
反応性はCHR-TRYの1.88倍、正常血清に対する反応性は2
0分の１であり、化合物（VI）がトリプシン活性測定用
基質として、反応性及び特異性において優れている。
（Ｉ）から得られる化合物（VI）のトリプシンに対する
反応性はCHR-TRYの1.88倍、正常血清に対する反応性は2
0分の１であり、化合物（VI）がトリプシン活性測定用
基質として、反応性及び特異性において優れている。
Claims (1)
- 【請求項１】下記構造式（Ｉ） ［式中、R1,R2,R3は同一もしくは異なり、 -(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）である。］で示されるアルギ
ニル−３−tert−アルキルオキシカルボニル−４−ニト
ロアニリドおよびその酸付加塩。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63146089A JPH0822842B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド |
| US07/365,418 US5115099A (en) | 1988-06-14 | 1989-06-13 | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| DE68928304T DE68928304T2 (de) | 1988-06-14 | 1989-06-14 | Substrate für die Bestimmung von Enzymaktivität und Zwischenverbindungen für die Synthese dieser Substrate sowie Prozess der Herstellung der Zwischenverbindungen |
| EP89110781A EP0347734A3 (en) | 1988-06-14 | 1989-06-14 | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| EP92113199A EP0513863B1 (en) | 1988-06-14 | 1989-06-14 | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63146089A JPH0822842B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH023660A JPH023660A (ja) | 1990-01-09 |
| JPH0822842B2 true JPH0822842B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=15399885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63146089A Expired - Fee Related JPH0822842B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0822842B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114184562B (zh) * | 2021-11-19 | 2024-07-26 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种发色底物法测定尿激酶活性的方法 |
-
1988
- 1988-06-14 JP JP63146089A patent/JPH0822842B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THROMBOSIS AND HAEMO STASIS=1986 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH023660A (ja) | 1990-01-09 |
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