JPH023660A - アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド - Google Patents
アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリドInfo
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- JPH023660A JPH023660A JP14608988A JP14608988A JPH023660A JP H023660 A JPH023660 A JP H023660A JP 14608988 A JP14608988 A JP 14608988A JP 14608988 A JP14608988 A JP 14608988A JP H023660 A JPH023660 A JP H023660A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（１）産業上の利用分野
本発明は構造式（Ｉ）
しυυ−し−ち
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は同一もしくは異なり、（Ｃ
Ｈ２）ｎＣＨ３（ｎ ＝０〜３）である。］で示される
アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル
−４−ニトロアニリドおよびその酸付加塩に関する。
Ｈ２）ｎＣＨ３（ｎ ＝０〜３）である。］で示される
アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル
−４−ニトロアニリドおよびその酸付加塩に関する。
本発明の化合物（Ｉ）は、酵素活性測定用の発色性基質
の合成原料として有用であり、特に、トリプシン、ウロ
キナーゼ、トロンビン等の、塩基性アミノ酸のカルボキ
シ側を加水分解する特異性を有する酵素の酵素活性測定
用の発色性基質の合成の出発原料として有用である。
の合成原料として有用であり、特に、トリプシン、ウロ
キナーゼ、トロンビン等の、塩基性アミノ酸のカルボキ
シ側を加水分解する特異性を有する酵素の酵素活性測定
用の発色性基質の合成の出発原料として有用である。
（２）従来の技術
ヒト血漿中のトリプシン、ウロキナーゼ、トロンビンな
どの酵素を定量する方法として、酵素の作用によって発
色性化合物を解離する基質を用いて定量する方法がある
。この方法においては、酵素と基質とを反応させて発色
性化合物を解離させ、一定の波長の光の吸光度を測定し
て対象とする酵素を定量する。
どの酵素を定量する方法として、酵素の作用によって発
色性化合物を解離する基質を用いて定量する方法がある
。この方法においては、酵素と基質とを反応させて発色
性化合物を解離させ、一定の波長の光の吸光度を測定し
て対象とする酵素を定量する。
かかる測定法において用いる酵素活性測定用基質は、酵
素に対する高感度、特異性、分解物の易検出性と共に水
あるいは緩衝液に対して溶解性の良いことが要求される
。
素に対する高感度、特異性、分解物の易検出性と共に水
あるいは緩衝液に対して溶解性の良いことが要求される
。
特開昭５９−１０６４４６にはトロンビン、カリクレイ
ン、ウロキナーゼ、プラスミン等の酵素活性用基質とし
て式（ＩＩ） る特異性が生じることも考えられるので同タイプの基質
の開発が望まれているが、次のような理由によって合成
することが極めて困難である。
ン、ウロキナーゼ、プラスミン等の酵素活性用基質とし
て式（ＩＩ） る特異性が生じることも考えられるので同タイプの基質
の開発が望まれているが、次のような理由によって合成
することが極めて困難である。
上記基質の合成は、特開昭５９−１０６４４６に示され
ているように下記反応式で表わされる反応によって行な
われる。
ているように下記反応式で表わされる反応によって行な
われる。
（式中ＸはＨあるいは一般にペプチド合成に用いられる
保護基、ＡおよびＢはアミノ酸あるいはその誘導体残基
）で表わされる発色性基質が提案されている。Ｒは一〇
ＣｎＨ２ｎ＋１のエステル型のもの、−ＮＨＣｎＨ２ｎ
＋１のアミド型のもの、あるいはアミノ酸残基のものが
記載されているが、Ｒ＝ＯＨのカルボキシル型のものは
記載されていない。
保護基、ＡおよびＢはアミノ酸あるいはその誘導体残基
）で表わされる発色性基質が提案されている。Ｒは一〇
ＣｎＨ２ｎ＋１のエステル型のもの、−ＮＨＣｎＨ２ｎ
＋１のアミド型のもの、あるいはアミノ酸残基のものが
記載されているが、Ｒ＝ＯＨのカルボキシル型のものは
記載されていない。
（３）発明が解決しようとする課題
カルボキシル型の酵素活性測定用基質は水或いは緩衝液
に対する溶解性の点からしてエステル型やアミド型のも
のに比べ好ましいと考えられ、またカルボキシル型にす
ることによって酵素に対す上記反応において、カルボキ
シル型の基質を得るためにＲ＝ＯＨである化合物（ｂ）
を用いると、当該カルボキシ基の存在のために副生成物
を生じ目的とする基質を高収率で得ることは困難である
。副反応を防止するためには、カルボキシ基を上記公開
特許明細書に示されているようにエステル、アミド等と
して保護する必要がある。この場合には、カルボキシル
型の基質を得ようとすれば、後でエステル基等の保護基
を除去しなければならない。しかしながら、上記公開特
許明細書に記載されたｎ−ブチルエステル、イソブチル
エステル、メチルアミド、エチルアミドなどの第１Ｉｓ
Ｌや第２１＆アルコールのエステル又はアミドの場合に
は、かかる保護基の除去操作によって基質分子中の他の
ペプチド結合が解裂するおそれがあるため、第１級や第
２級アルコールのエステル、又はアミドである保護基を
除去できないのである。
に対する溶解性の点からしてエステル型やアミド型のも
のに比べ好ましいと考えられ、またカルボキシル型にす
ることによって酵素に対す上記反応において、カルボキ
シル型の基質を得るためにＲ＝ＯＨである化合物（ｂ）
を用いると、当該カルボキシ基の存在のために副生成物
を生じ目的とする基質を高収率で得ることは困難である
。副反応を防止するためには、カルボキシ基を上記公開
特許明細書に示されているようにエステル、アミド等と
して保護する必要がある。この場合には、カルボキシル
型の基質を得ようとすれば、後でエステル基等の保護基
を除去しなければならない。しかしながら、上記公開特
許明細書に記載されたｎ−ブチルエステル、イソブチル
エステル、メチルアミド、エチルアミドなどの第１Ｉｓ
Ｌや第２１＆アルコールのエステル又はアミドの場合に
は、かかる保護基の除去操作によって基質分子中の他の
ペプチド結合が解裂するおそれがあるため、第１級や第
２級アルコールのエステル、又はアミドである保護基を
除去できないのである。
本発明は以上に述べたような問題点を解決して上記式（
ＩＩ）においてＲがカルボキシル型の基質を合成するこ
とが可能な中間体を提供することを目的とする。
ＩＩ）においてＲがカルボキシル型の基質を合成するこ
とが可能な中間体を提供することを目的とする。
（４）課題を解決するための手段
このような状況の下において我々が鋭意研究を行った結
果、式（Ｉ） Ｒ８ ［式中、Ｒ１，Ｌｌ、Ｒ３は同一もしくは異なり、−（
ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ ＝ Ｏ〜３）である。１で表さ
れる新規化合物（アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキル
オキシカルボニル−４−ニトロアニリド）またはその酸
付加塩が上記目的を達成するために有効であることを見
出し、本発明を完成させるに至った。
果、式（Ｉ） Ｒ８ ［式中、Ｒ１，Ｌｌ、Ｒ３は同一もしくは異なり、−（
ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ ＝ Ｏ〜３）である。１で表さ
れる新規化合物（アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキル
オキシカルボニル−４−ニトロアニリド）またはその酸
付加塩が上記目的を達成するために有効であることを見
出し、本発明を完成させるに至った。
Ｒ１
Ｒ３
以下のものが挙げられる。
式（Ｉ）の新規化合物は酸付加塩であってもよく、かか
る酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リ
ン酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸塩、
リンゴ酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホン酸
塩などの有機酸塩等がある。
る酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リ
ン酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸塩、
リンゴ酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホン酸
塩などの有機酸塩等がある。
式（Ｉ）の新規化合物またはその酸付加塩は、カルボキ
シル型の酵素活性測定用基質を合成するための中間体と
して極めて有用である。即ち、後述する参考例１で示す
如く、ジペプチドまたはその誘導体、例えばＤ−γ−（
３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシンと式（Ｉ
）の化合物、例えば第１段階 Ｒ。
シル型の酵素活性測定用基質を合成するための中間体と
して極めて有用である。即ち、後述する参考例１で示す
如く、ジペプチドまたはその誘導体、例えばＤ−γ−（
３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシンと式（Ｉ
）の化合物、例えば第１段階 Ｒ。
Ｊ
ブチルエステルである化合物を反応せしめ、次いで得ら
れる化合物のｔｅｒｔ−アルキルエステルを加水分解に
て脱離することによって、高収率で且つ容易にカルボキ
シル型の新規な酵素活性測定用基質が得られる。
れる化合物のｔｅｒｔ−アルキルエステルを加水分解に
て脱離することによって、高収率で且つ容易にカルボキ
シル型の新規な酵素活性測定用基質が得られる。
本発明に係る式（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩は、
以下に示す反応式によって合成することができる。
以下に示す反応式によって合成することができる。
（Ｖ）
第２段階
第一段階でＮ’ −ｔ−ブチルオキシカルボニル−アル
ギニン（ＩＩＩ ）水和物と５−アミノ−２−ニトロ安
息香酸−ｔｅｒｔ−アルキルエステル（ＩＶ）とをペプ
チド合成でよく用いられているＢＯＣ法で脱水綜合し、
ＮＯ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニル−３−
ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニ
リド（Ｖ）を得る。
ギニン（ＩＩＩ ）水和物と５−アミノ−２−ニトロ安
息香酸−ｔｅｒｔ−アルキルエステル（ＩＶ）とをペプ
チド合成でよく用いられているＢＯＣ法で脱水綜合し、
ＮＯ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニル−３−
ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニ
リド（Ｖ）を得る。
次いで第２段階で、ＮＱ −ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボ
ニル−４−ニトロアニリド（Ｖ）の加水分解を行い、ア
ルギニンのα−アミノ基を保護する１ −ブチルオキシ
カルボニル（ＢＯＣ）基のみを加水分解して除去する。
ル−アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボ
ニル−４−ニトロアニリド（Ｖ）の加水分解を行い、ア
ルギニンのα−アミノ基を保護する１ −ブチルオキシ
カルボニル（ＢＯＣ）基のみを加水分解して除去する。
ここで問題となるのは通常用いられているＢＯＣ基の脱
離方法ではｔ−ブチルエステル等のｔｅｒｔ−アルキル
エステルも切断されてしまうため目的とする化合物を得
ることができないことである。この点を解決するため我
々は鋭意検討の結果、塩酸、酢酸及びジメチルスルホキ
シドの存在下、好ましくは２Ｎ塩酸−酢酸−ジメチルホ
ルムアミドという条件下で保護基の脱離を行うことによ
り、ＢＯＣ基のみを選択的に脱離させることが可能であ
ることを見出した。
離方法ではｔ−ブチルエステル等のｔｅｒｔ−アルキル
エステルも切断されてしまうため目的とする化合物を得
ることができないことである。この点を解決するため我
々は鋭意検討の結果、塩酸、酢酸及びジメチルスルホキ
シドの存在下、好ましくは２Ｎ塩酸−酢酸−ジメチルホ
ルムアミドという条件下で保護基の脱離を行うことによ
り、ＢＯＣ基のみを選択的に脱離させることが可能であ
ることを見出した。
しかして、式（Ｖ）の化合物の如く、アルギニン部分の
α−アミノ基がＢＯＣ基で保護されかつｔ−ブチルエス
テル等のｔｅｒｔ−アルキルエステルを有する化合物を
用いて、これを特定の条件下で保護基の脱離反応に付す
ことによって、初めて本発明の式ＣＩ）の化合物の合成
が可能になったものである。従ってかかる式（Ｖ）の化
合物、及びかかる式（Ｖ）の化合物を塩酸、酢酸及びジ
メチルホルムアミドの存在下、好ましくは２Ｎ塩酸−酢
酸−ジメチルホルムアミドの系で脱保護して式（Ｉ）の
化合物を得る方法を提供することも本発明の目的の１つ
である。
α−アミノ基がＢＯＣ基で保護されかつｔ−ブチルエス
テル等のｔｅｒｔ−アルキルエステルを有する化合物を
用いて、これを特定の条件下で保護基の脱離反応に付す
ことによって、初めて本発明の式ＣＩ）の化合物の合成
が可能になったものである。従ってかかる式（Ｖ）の化
合物、及びかかる式（Ｖ）の化合物を塩酸、酢酸及びジ
メチルホルムアミドの存在下、好ましくは２Ｎ塩酸−酢
酸−ジメチルホルムアミドの系で脱保護して式（Ｉ）の
化合物を得る方法を提供することも本発明の目的の１つ
である。
上記の方法においては、式（Ｖ）の化合物としてアルギ
ニン部分の保護基がＢＯＣ基である場合の外、１，１−
ジメチルプロピルオキシカルボニル基、１，１−ジメチ
ルブチルオキシカルボニル基、１．１−ジメチルペンチ
ルオキシカルボニル基、３−エチルベンチルー３−イル
オキシカルボニル基等の第３級炭素を持つアルコールの
エステルである場合の式（Ｖ）の化合物等にも適用でき
る。
ニン部分の保護基がＢＯＣ基である場合の外、１，１−
ジメチルプロピルオキシカルボニル基、１，１−ジメチ
ルブチルオキシカルボニル基、１．１−ジメチルペンチ
ルオキシカルボニル基、３−エチルベンチルー３−イル
オキシカルボニル基等の第３級炭素を持つアルコールの
エステルである場合の式（Ｖ）の化合物等にも適用でき
る。
（５）発明の効果
以上に詳述した如く本発明の特徴は、式（ＩＩ）に表わ
されるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の合成のた
めの出発原料として式（Ｉ）の化合物が優れているとこ
ろにある。
されるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の合成のた
めの出発原料として式（Ｉ）の化合物が優れているとこ
ろにある。
例えば、式（ＩＩ ）に表わされるカルボキシル型の化
合物を、カルボキシル基無保護の原料、アルギニル−３
−カルボキシ−４−ニトロアニリドを原料として用いて
合成を行った場合、カルボキシル基の存在のために副反
応が生じ易いことは、ペプチド合成一般に言えることで
ある。そのため、目的とするカルボキシル型の化合物を
高収率で得ることは困難である。又、原料として、メチ
ル、エチル、イソブチル等のエステルとしてカルボキシ
ル基を保護した化合物を用いた場合、最終的にはかかる
エステルを脱離してカルボキシル型の目的化合物とする
ために、かかるエステルの加水分解操作を必要とするた
め、ペプチド鎖に悪影響を及ぼす。あるいは又、ベンジ
ルエステルのように還元で脱離できる保護基で保護した
原料を用いた場合には、その還元の際、基質中のニトロ
基まで還元されてしまうためかかる原料は使用できない
。
合物を、カルボキシル基無保護の原料、アルギニル−３
−カルボキシ−４−ニトロアニリドを原料として用いて
合成を行った場合、カルボキシル基の存在のために副反
応が生じ易いことは、ペプチド合成一般に言えることで
ある。そのため、目的とするカルボキシル型の化合物を
高収率で得ることは困難である。又、原料として、メチ
ル、エチル、イソブチル等のエステルとしてカルボキシ
ル基を保護した化合物を用いた場合、最終的にはかかる
エステルを脱離してカルボキシル型の目的化合物とする
ために、かかるエステルの加水分解操作を必要とするた
め、ペプチド鎖に悪影響を及ぼす。あるいは又、ベンジ
ルエステルのように還元で脱離できる保護基で保護した
原料を用いた場合には、その還元の際、基質中のニトロ
基まで還元されてしまうためかかる原料は使用できない
。
これらの保護基を用いた原料に対し、保護基としてｔ−
ブチルエステル等のｔｅｒｔ−アルキルエステルを用い
た本発明の化合物（Ｉ）は、カルボキシル基が保護され
ているため副反応が抑えられ、かつかかる保護基は容易
に脱離することが出来るため、ペプチド鎖および最終的
に得られる基質に悪影響を及ぼすこと無しに、参考例１
に示すごとく、カルボキシル型の酵素活性測定用基質で
ある目的物を高収率で得ることが出来る。
ブチルエステル等のｔｅｒｔ−アルキルエステルを用い
た本発明の化合物（Ｉ）は、カルボキシル基が保護され
ているため副反応が抑えられ、かつかかる保護基は容易
に脱離することが出来るため、ペプチド鎖および最終的
に得られる基質に悪影響を及ぼすこと無しに、参考例１
に示すごとく、カルボキシル型の酵素活性測定用基質で
ある目的物を高収率で得ることが出来る。
本発明の化合物（Ｉ）を原料として得られる例えば参考
例１で得られるカルボキシル型の酵素活性測定用基質Ｄ
−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシル
−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド（
ＶＩ）・２塩酸塩は、参考例２で示すように、ＣＨＲ−
ＴＲＹ （Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）を対照とした場合
、トリプシンに対する反応性が１．８８倍、正常血清に
対する反応性が２０分の１であり、トリプシン用基質と
してその反応性および特異性で優れている。
例１で得られるカルボキシル型の酵素活性測定用基質Ｄ
−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシル
−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド（
ＶＩ）・２塩酸塩は、参考例２で示すように、ＣＨＲ−
ＴＲＹ （Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）を対照とした場合
、トリプシンに対する反応性が１．８８倍、正常血清に
対する反応性が２０分の１であり、トリプシン用基質と
してその反応性および特異性で優れている。
以上のように本発明の化合物（Ｉ）は、式（ＩＩ）で表
わされるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の出発原
料として優れていることは明らかである。
わされるカルボキシル型の酵素活性測定用基質の出発原
料として優れていることは明らかである。
更には、本発明の化合物（Ｉ）から得られるカルボキシ
ル型の酵素活性測定用基質は、酵素に対する反応性、特
異性等において極めて優れている。
ル型の酵素活性測定用基質は、酵素に対する反応性、特
異性等において極めて優れている。
（６）実施例
以下に本発明の化合物（Ｉ）の合成法について実施例で
具体的に説明する。
具体的に説明する。
実施例１
Ｎ′−ジシクロへキシルカルボジイミド３７．８６ ｇ
（１８３，５ミリモル）を８３ ｒｎｅのピリジンに溶
解した溶液を滴下し、混合物を室温で一夜撹拌反応した
。
（１８３，５ミリモル）を８３ ｒｎｅのピリジンに溶
解した溶液を滴下し、混合物を室温で一夜撹拌反応した
。
反応終了後、酢酸エチル３３３ｍｅを反応液中に加え、
析出したジシクロへキシルウレアを濾別した後、溶媒を
減圧留去し、そこに７５０ｍ４’の酢酸エチルを加え不
溶物を濾取することにより３７．３２ ｇ （収率８４
．３％）のＮｆｌ −ｔ−ブチルオキシカルボニル−ア
ルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニト
ロ−アニリド（Ｖ）を得た。
析出したジシクロへキシルウレアを濾別した後、溶媒を
減圧留去し、そこに７５０ｍ４’の酢酸エチルを加え不
溶物を濾取することにより３７．３２ ｇ （収率８４
．３％）のＮｆｌ −ｔ−ブチルオキシカルボニル−ア
ルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニト
ロ−アニリド（Ｖ）を得た。
ＮＧ −ｔ−ブチルオキシカルボニル−アルギニン（Ｉ
ＩＩ ）塩酸塩・水和物２７．４１ ｇ （８３，４ミ
リモル）と５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸−七−ブ
チルエステル（■）（式（■）においてＲ工、Ｒ２，Ｒ
３がメチルである化合物） １９．８７ ｇ （８３，
４ミリモル）を１６７ｍ４’の無水ピリジンに溶解後、
−５°Ｃに冷却撹拌下、Ｎ−ここで得たＮＱ −ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−アルギニル−３−ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−４−ニトロ−アニリド（Ｖ ） ７．
９７ ｇ （１５ミリモル）をＤＭＦ ９ ｍｅと酢酸
３ ｍｌ！に溶解し、水冷撹拌下、２Ｎ塩酸−酢酸６０
ｍｅを加え、浴温１５°Ｃで３０分間反応させ、Ｎ”保
護基の選択的脱離を行った。反応終了後、反応溶液に酢
酸エチル３６ｍｔ’を加え、その溶液を２゜５ｅのエー
テル中に注ぐことにより沈殿を得、濾取、減圧乾燥して
粗結晶６．４８ ｇを得た。更にその結晶を、Ｄｏｗｅ
ｘ２ Ｘ ８（酢酸型）［ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ ］
カラム（溶離液メタノール）により精製し当量分の０．
ＩＮ塩酸−メタノールを加え、エーテルにて沈殿させる
ことにより、アルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−４−ニトロアニリド（Ｉ）・２塩酸塩の結晶５．
６８ ｇ （収率８１．０％）を得た。
ＩＩ ）塩酸塩・水和物２７．４１ ｇ （８３，４ミ
リモル）と５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸−七−ブ
チルエステル（■）（式（■）においてＲ工、Ｒ２，Ｒ
３がメチルである化合物） １９．８７ ｇ （８３，
４ミリモル）を１６７ｍ４’の無水ピリジンに溶解後、
−５°Ｃに冷却撹拌下、Ｎ−ここで得たＮＱ −ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−アルギニル−３−ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−４−ニトロ−アニリド（Ｖ ） ７．
９７ ｇ （１５ミリモル）をＤＭＦ ９ ｍｅと酢酸
３ ｍｌ！に溶解し、水冷撹拌下、２Ｎ塩酸−酢酸６０
ｍｅを加え、浴温１５°Ｃで３０分間反応させ、Ｎ”保
護基の選択的脱離を行った。反応終了後、反応溶液に酢
酸エチル３６ｍｔ’を加え、その溶液を２゜５ｅのエー
テル中に注ぐことにより沈殿を得、濾取、減圧乾燥して
粗結晶６．４８ ｇを得た。更にその結晶を、Ｄｏｗｅ
ｘ２ Ｘ ８（酢酸型）［ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ ］
カラム（溶離液メタノール）により精製し当量分の０．
ＩＮ塩酸−メタノールを加え、エーテルにて沈殿させる
ことにより、アルギニル−３−ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−４−ニトロアニリド（Ｉ）・２塩酸塩の結晶５．
６８ ｇ （収率８１．０％）を得た。
融点 ６５〜９５°Ｃ（分解）
比旋光度 ［α］Ｄ＝＋４１．５°（Ｃ＝１、水）この
結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポット（Ｒｆ
：０．４８ ）を与えた。
結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポット（Ｒｆ
：０．４８ ）を与えた。
元素分析値：Ｃ０７Ｈ２８Ｎ６０．Ｃｅ２・１１２Ｈ２
０として実測値（％） Ｃ：４２．７７Ｈ：６．２Ｏ
Ｎ：１７．６０理論値（％） Ｃ：４２．８６Ｈ二６
．１４ Ｎ ：１７．６４（７）参考例 以下に参考例１として、本発明の化合物（Ｉ）を原料と
するＤ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グ
リシル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロアニ
リド（ＶＩ）の合成を具体的に説明すると共に、参考例
２として、ＣＨＲ−ＴＲＹ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）
を対照とした酵素活性測定用基質としての式（Ｖｌ）の
化合物の各種酵素および正常血清に対する反応性につい
ての測定結果を示す。
０として実測値（％） Ｃ：４２．７７Ｈ：６．２Ｏ
Ｎ：１７．６０理論値（％） Ｃ：４２．８６Ｈ二６
．１４ Ｎ ：１７．６４（７）参考例 以下に参考例１として、本発明の化合物（Ｉ）を原料と
するＤ−γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グ
リシル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ニトロアニ
リド（ＶＩ）の合成を具体的に説明すると共に、参考例
２として、ＣＨＲ−ＴＲＹ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）
を対照とした酵素活性測定用基質としての式（Ｖｌ）の
化合物の各種酵素および正常血清に対する反応性につい
ての測定結果を示す。
参考例１
化合物（Ｉ）・２塩酸塩２．３４ｇ（５ミリモル）をＤ
ＭＦｌｏｍｅに溶解後、水冷下、Ｎ−エチルモルホリン
０．６５ ｍｅ （５ミリモル）を滴下し、５分間撹拌
反応した後、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｄ−′γ−
（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシン−４゜
６−シメチルビリミジルー２−チオエステル２４８ｇ（
５ミリモル）をＤＭＦ １０ ｍｌに溶解した溶液を水
冷下に加え、室温で一夜撹拌反応した。反応終了後、減
圧下ＤＭＦを留去し、残渣に酢酸エチル１００ｍｅを加
え、冷５％塩酸５０ｍｅで２回、飽和食塩水５０ｍｅで
１回、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液５０ｍｅで２回
、飽和食塩水５０ｍｅで２回順次洗浄し、無水マグネシ
ウム上で脱水乾燥後、溶媒を減圧留去し、セファデック
スＬＨ−２０クロマト（溶離液：メタノール）で精製し
、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｄ−γ−（３−ペンチ
ルオキシ）−グルタミル−グリシル−アルギニル−３−
ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド（■
）２．５ｅｇ（収＄８０．０％）を得た。
ＭＦｌｏｍｅに溶解後、水冷下、Ｎ−エチルモルホリン
０．６５ ｍｅ （５ミリモル）を滴下し、５分間撹拌
反応した後、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｄ−′γ−
（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシン−４゜
６−シメチルビリミジルー２−チオエステル２４８ｇ（
５ミリモル）をＤＭＦ １０ ｍｌに溶解した溶液を水
冷下に加え、室温で一夜撹拌反応した。反応終了後、減
圧下ＤＭＦを留去し、残渣に酢酸エチル１００ｍｅを加
え、冷５％塩酸５０ｍｅで２回、飽和食塩水５０ｍｅで
１回、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液５０ｍｅで２回
、飽和食塩水５０ｍｅで２回順次洗浄し、無水マグネシ
ウム上で脱水乾燥後、溶媒を減圧留去し、セファデック
スＬＨ−２０クロマト（溶離液：メタノール）で精製し
、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｄ−γ−（３−ペンチ
ルオキシ）−グルタミル−グリシル−アルギニル−３−
ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド（■
）２．５ｅｇ（収＄８０．０％）を得た。
ここで得た化合物（■）２．４２ｇ（３ミリモル）を酢
酸３ｍｅに溶解し、水冷下、２Ｎ塩酸−酢酸１５ ｍ？
（３０ミリモル）を滴下し、室温で１時間反応した。
酸３ｍｅに溶解し、水冷下、２Ｎ塩酸−酢酸１５ ｍ？
（３０ミリモル）を滴下し、室温で１時間反応した。
反応終了後、５００ｍｅのエーテルに反応液を注ぎ、析
出物を濾取し、トヨバー、）Ｌ／ＨＷ４０Ｆクロマト（
溶離液：３０％酢酸）［東洋曹達］により精製し、Ｄ−
γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシル−
アルギニル−３−ｔ−カルボキシ−４−ニトロアニリド
・２塩酸塩（ＶＩ）を１．５ｇ（収率７５％）得た。以
下にその物性及び分析結果を示す。
出物を濾取し、トヨバー、）Ｌ／ＨＷ４０Ｆクロマト（
溶離液：３０％酢酸）［東洋曹達］により精製し、Ｄ−
γ−（３−ペンチルオキシ）−グルタミル−グリシル−
アルギニル−３−ｔ−カルボキシ−４−ニトロアニリド
・２塩酸塩（ＶＩ）を１．５ｇ（収率７５％）得た。以
下にその物性及び分析結果を示す。
融点 １０８〜１４７°Ｃ（分解）
比旋光度 ［α］Ｄニー５８．０°（Ｃ＝１、水）この
結晶は、シリカゲル薄層クロマトグラフィー （ｎ−ブ
タノール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポット（Ｒ
ｆ＝０．４２）を与えた。
結晶は、シリカゲル薄層クロマトグラフィー （ｎ−ブ
タノール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポット（Ｒ
ｆ＝０．４２）を与えた。
元素分析値：Ｃ２５Ｈ４ｏＮ８ｏ９Ｃｅ２・７１５Ｈ２
０として実測値（％） Ｃ：４３．４４Ｈ：６．１７
Ｎ：１６．１３理論値（％） Ｃ：４３．３４Ｈ：６
．２３Ｎ：１６．１７参考例２ １）基質液：各基質液は水に溶解し、１０ｍＭとして使
用した。
０として実測値（％） Ｃ：４３．４４Ｈ：６．１７
Ｎ：１６．１３理論値（％） Ｃ：４３．３４Ｈ：６
．２３Ｎ：１６．１７参考例２ １）基質液：各基質液は水に溶解し、１０ｍＭとして使
用した。
２）緩衝液：緩衝種、ＮａＣ（、およびそれらの濃度、
ｐＨ（２５°Ｃ）は酵素により次の通りとした。
ｐＨ（２５°Ｃ）は酵素により次の通りとした。
３）使用酵素
４）反応停止液＝１０％酢酸水溶液
５）測定法
ａ）各種酵素
緩衝液０．５ ｍｌと基質液０．１ ｍｅをシリコン処
理した硬質ガラス製試験管又はプラスチック製試験管に
採取し、３７°Ｃ恒温槽中にて１０分間予加温する。
理した硬質ガラス製試験管又はプラスチック製試験管に
採取し、３７°Ｃ恒温槽中にて１０分間予加温する。
次いで、酵素試薬０．０５ ｍｅを加えて酵素反応を３
７°Ｃで１０分間実施する。
７°Ｃで１０分間実施する。
正確に１０分後、反応停止液２．５ ｍ（を加えて、酵
素反応を停止後、３７°Ｃで１０分間放置後、４０５
ｎｍの吸光度を測定する。
素反応を停止後、３７°Ｃで１０分間放置後、４０５
ｎｍの吸光度を測定する。
ｂ）正常血清
緩衝液０．５ ｍｅと基質液０．１ ｒｎｅをシリコン
処理した硬質ガラス製試験管又はプラスチック製試験管
に採取し、３７°Ｃ恒温槽中にて５分間予加温するｄ次
いで、正常血清０．１ ｍｅを加えて酵素反応を３７０
０で５分間実施する。
処理した硬質ガラス製試験管又はプラスチック製試験管
に採取し、３７°Ｃ恒温槽中にて５分間予加温するｄ次
いで、正常血清０．１ ｍｅを加えて酵素反応を３７０
０で５分間実施する。
正確に５分後、反応停止液２．Ｏｍｅを加えて、酵素反
応を停止後、３７°Ｃで１０分間放置後、４０５ ｎｍ
の吸光度を測定する。
応を停止後、３７°Ｃで１０分間放置後、４０５ ｎｍ
の吸光度を測定する。
６）測定結果 （ａの吸光度を１とする）ａ ： ＣＨ
Ｒ−ＴＲＹ （Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）Ｚ −Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡ−ＨＣ（ｂ： 化合物■ ２ＨＣ４’ −Ｈ−Ｄ −Ｇｌｕ （−００Ｈ（Ｃ２Ｈ
３）２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−５ＡＮＢＡ略号 ２：ペンジルオキシカルボニル Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ｇ１ｙニゲリシン Ａｒｇ ：アルギニン ＰＮＡ：Ｐ−ニトロアニリン ５ＡＮＢＡ：５−アミノ−２−ニトロ安息香酸ＨＣ（：
塩酸 上記の測定結果から明らかなように、本発明の化合物（
Ｉ）から得られる化合物（ＶＩ）のトリプシンに対する
反応性はＣＨＲ−ＴＲＹの１．８８倍、正常血清に対す
る反応性は２０分の１であり、化合物（ＶＩ）がトリプ
シン活性測定用基質として、反応性及び特異性において
優れている。
Ｒ−ＴＲＹ （Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）Ｚ −Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡ−ＨＣ（ｂ： 化合物■ ２ＨＣ４’ −Ｈ−Ｄ −Ｇｌｕ （−００Ｈ（Ｃ２Ｈ
３）２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−５ＡＮＢＡ略号 ２：ペンジルオキシカルボニル Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ｇ１ｙニゲリシン Ａｒｇ ：アルギニン ＰＮＡ：Ｐ−ニトロアニリン ５ＡＮＢＡ：５−アミノ−２−ニトロ安息香酸ＨＣ（：
塩酸 上記の測定結果から明らかなように、本発明の化合物（
Ｉ）から得られる化合物（ＶＩ）のトリプシンに対する
反応性はＣＨＲ−ＴＲＹの１．８８倍、正常血清に対す
る反応性は２０分の１であり、化合物（ＶＩ）がトリプ
シン活性測定用基質として、反応性及び特異性において
優れている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記構造式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３は同一もしくは異なり
、−（ＣＨ＿２）＿ｎＣＨ＿３（ｎ＝０〜３）である。 ］で示されるアルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキ
シカルボニル−４−ニトロアニリドおよびその酸付加塩
。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63146089A JPH0822842B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド |
| US07/365,418 US5115099A (en) | 1988-06-14 | 1989-06-13 | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| DE68928304T DE68928304T2 (de) | 1988-06-14 | 1989-06-14 | Substrate für die Bestimmung von Enzymaktivität und Zwischenverbindungen für die Synthese dieser Substrate sowie Prozess der Herstellung der Zwischenverbindungen |
| EP89110781A EP0347734A3 (en) | 1988-06-14 | 1989-06-14 | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| EP92113199A EP0513863B1 (en) | 1988-06-14 | 1989-06-14 | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63146089A JPH0822842B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH023660A true JPH023660A (ja) | 1990-01-09 |
| JPH0822842B2 JPH0822842B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=15399885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63146089A Expired - Fee Related JPH0822842B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | アルギニル−３−ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−４−ニトロアニリド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0822842B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114184562A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-03-15 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种发色底物法测定尿激酶活性的方法 |
-
1988
- 1988-06-14 JP JP63146089A patent/JPH0822842B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THROMBOSIS AND HAEMO STASIS=1986 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114184562A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-03-15 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种发色底物法测定尿激酶活性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0822842B2 (ja) | 1996-03-06 |
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