JPH0822878B2 - インスリン類似体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、天然ヒトインスリンＢ鎖の29位アミノ酸が
改変され、さらにその他の部位も改変されていることあ
るインスリンの類似体に関する。このインスリン類似体
は天然のヒトインスリンの生物学的活性を保持している
一方で、二量体化または自己会合して高分子量体になり
にくいので、比較的迅速に活性が発現する。

本発明は、式： ［式中、A21はアラニン、アスパラギン、アスパラギン
酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、スレオニ
ン、またはセリンであり、 B1はフェニルアラニン、アスパラギン酸、または不存
在であり、 B2はバリン、またはB1が不存在の場合に不存在であっ
てもよく、 B3はアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、 B9はセリンまたはアスパラギン酸であり、 B10はヒスチジンまたはアスパラギン酸であり、 B28はリシン、グルタミンまたはノルロイシンであ
り、 B29はプロリンであり、 B30はアラニン、スレオニン、または不存在であり、 Ｚは−OH、−NH₂、−OCH₃、または−OCH₂CH₃であり、 ＸはArg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys、Lys-Ar
g、または不存在であり、 ＹはＸが存在する場合にのみ存在することができ、そ
れが存在する場合は、Glu、または配列： ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-
Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Al
a-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- のすべて、もしくはこの配列のＮ末端Gluから始まるそ
の一部からなるアミノ酸である］ で示されるインスリン類似体を提供するものである。

さらに、１つまたはそれ以上の製薬的に許容され得る
賦形剤と共に、式（Ｉ）で示されるインスリン類似体の
有効量を含有している糖尿病を処置するための医薬製剤
をも開示し、特許請求するものである。

式（Ｉ）は、本発明のインスリン類似体のアミノ酸配
列を簡単に描いたものである。使用しているアミノ酸の
略語は、以下の通りの通常の意味を有する：略 語 アミノ酸 Aba α−アミノ酪酸 Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cya システイン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リシン Met メチオニン Nle ノルロイシン Nva ノルバリン Orn オルニチン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン B28はリシン、グルタミンまたはノルロイシンであ
る。リシンはB28において特に最も好ましいアミノ酸で
ある。B29はプロリンである。本発明の特に好ましいイ
ンスリン類似体は、B28がリシンであり、B29がプロリン
であるインスリン類似体、すなわちＢ鎖の28位および29
位において天然のヒトインスリンアミノ酸配列が入れか
わっている本発明の類似体である。

本発明のインスリン類似体にはさらに改変を含有させ
ることもある。すなわちB28およびB29位以外の位置にお
けるインスリン類似体の改変である。具体的には、Ａ鎖
の21位のAsn残基（すなわちカルボキシ末端）をAla、As
p、Gln、Glu、Gly、Thr、またはSerと置換することが望
ましい場合もあり、このように置換するときには、Ala
との置換が好ましい。同様に、Ｂ鎖における３位のAsn
残基をアスパラギン酸（Asp）に置換することが望まし
い場合がある。このような任意の置換は、Asnが低いpH
および高いpHの両者における転移反応および脱アミド化
に特に感受性であるので、本類似体のpH極値における安
定性を増大させる効果を有する。当業者ならば、本発明
のインスリン類似体のグルタミン残基が同様に脱アミド
化および転移に対して感受性であり得ることも容易に理
解されるであろう。したがって、それをグルタミン酸で
置換することも、本発明の範囲内に包含される。さら
に、本発明のインスリン類似体における任意の置換とし
ては、B10位のヒスチジン残基をアスパラギン酸アミノ
酸と置換、B1位のフェニルアラニン残基をアスパラギン
酸と置換、B30位のスレオニン残基をアラニンと置換、B
9位のセリン残基をアスパラギン酸と置換、B1位のアミ
ノ酸のみの欠失（デス−B1）またはB2位の欠失（デス−
B2）との組合わせ、およびB-30位のスレオニンの欠失
（デス−B30）（これらのあらゆる組合わせもあり得
る）が挙げられる。

本発明のインスリン類似体は、以下のアミノ酸または
ジペプチドを付加することによって、B-30末端を改変す
ることもできる:Arg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Ly
s、またはLys-Arg。これらが存在する場合、式（Ｉ）中
では基Ｘとして表す。このような延長がある場合、好ま
しいものはArg-Argである。

さらに、B-30におけるこのような延長が存在する場
合、この類似体は、得られたB30延長末端にグルタミン
酸（Glu）、または配列： ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Glu-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-
Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Al
a-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- のすべてもしくはこの配列のＮ末端Gluから始まるその
一部からなるアミノ酸配列を付加することによってさら
に改変することができる。このアミノ酸またはアミノ酸
配列が存在する場合、式（Ｉ）では基Ｙとして表してい
る。この配列が前述の配列の一部のみである場合、それ
は、この配列のＮ末端、すなわちグルタミン酸（Glu）
残基から始まるあらゆる一部分であり得る。

上記の定義中、Ｘ、またはＸとＹとの組合わせ物は、
天然のヒトインスリンの生成時における生物学的前駆体
である分子、ヒト・プロインスリン中に見いだされる結
合ペプチドのすべて、またはその一部である。

Ｙについての好ましい配列は、以下の配列である： ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Le
u-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-
Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-、 ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Le
u-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-
Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-、 ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Le
u-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-
Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-、 ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Le
u-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-
Ala-Leu-Glu-、 ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Le
u-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-
Ala-、および ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-。

さらに、Ｘのみが、またはＸおよびＹが共に、存在、
または存在しなくても、末端基:Zは−OH、−NH₂、−OCH
₃、または−OCH₂CH₃のいずれであってもよい。好ましく
は、Ｚは−OHである。

上述のように、本発明は、インスリン類似体の医薬的
に許容され得る塩類を包含している。このような塩のう
ち好ましい塩類は、亜鉛、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、またはカルシウムの塩である。

本発明のインスリン類似体は、古典的な液体法、固相
法、半合成法、および近年利用可能となった組換えDNA
法などの種々の認識されたペプチド合成法のいずれによ
っても製造することが可能である。

固相法では、アミノ酸配列は、不溶性の樹脂に固定し
た最初のＣ−末端アミノ酸から連続的に構築される。こ
の固相法の手順は、スチュアート（J.Stewart）らのSol
id-Phase Peptide Synthesis,フリーマン・アンド・C
o.,サンフランシスコ,1969に記載されている。

一般に固相法は、所望のペプチドのＣ−末端アミノ酸
残基に相当するアミノ酸を不溶性樹脂の支持体に引っ掛
け（アンカーし）、次いでこの樹脂固相化Ｃ−末端アミ
ノ酸から開始してペプチド鎖を形成させる。個々のアミ
ノ酸を、所望のアミノ酸配列になるまで連続して導入す
る。あるいは、小さなペプチドフラグメントを製造し、
所望の順序でそのペプチド鎖を導入することもできる。
ペプチド鎖は、合成時に終始固定されたままであり、鎖
が完了したなら、ペプチドを樹脂から開裂する。

ペプチド鎖をポリスチレン樹脂に結合するには、Ｃ−
末端部のカルボキシ基とその樹脂マトリックスに存在す
る結合部位としての特異的メチレン基との間に、エステ
ル結合を生成させることによって行う。

アミノ酸は、ペプチド結合を生成させるための当業界
周知の方法によって結合される。１つの方法は、カルボ
キシ基がペプチドフラグメントの遊離Ｎ−末端アミノ基
とより反応し易くなった誘導体にアミノ酸を変換するこ
とである。たとえば、アミノ酸は、保護アミノ酸をクロ
ロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸sec−
ブチル、またはクロロギ酸イソブチルと反応させて混合
無水物に変換することができる。また、アミノ酸は、2,
4,5−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェ
ニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、または１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールから生成されるエステルなどの活性
エステルに変換することができる。

もう１つのカップリング法では、N,N′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（DCC）、またはN,N′−ジイソプ
ロピルカルボジイミド（DIC）などの適当なカップリン
グ剤を用いる。シュローダー（Schroder）およびルーク
（Lubke）のThe Peptides、アカデミック・プレス、196
5年第III章を参照のこと。

カップリング反応時には、ペプチド合成に使用する各
アミノ酸の反応性のα−アミノ基に関連する副反応を防
ぐため、その官能基を保護しなければならないことを認
識すべきである。さらに認識すべきことは、特定のアミ
ノ酸は反応性の側鎖官能基（たとえば、スルフヒドリ
ル、ε−アミノ、β−およびγ−カルボキシ、イミダゾ
ール、グアニド、およびヒドロキシ）を含有しており、
このような官能基も最初および以後のカップリング工程
時に保護しなければならないことである。適当な保護基
は当業界既知である。たとえば、マックオミー（McOmi
e）編のProtective Groups In Organic Chemistry、プ
レノーン・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、19
73、および米国特許第4,617,149号を参照のこと。

具体的に保護基を選択するに当たっては、特定の条件
を守らなければならない。α−アミノ保護基は、（１）
カップリング反応に用いられる条件下でα−アミノ基を
不活性にしなければならず、（２）側鎖の保護基は除去
せずに、かつペプチドフラグメントの構造を変化させな
い条件下で、カップリング反応後に容易に除去できなけ
ればならず、そして（３）カップリング反応直前の活性
化の際にラセミ化の起こる可能性が排除されていなけれ
ばならない。側鎖保護基は、（１）カップリング反応に
用いられる条件下で側鎖官能基を不活性にしておかなけ
ればならず、（２）α−アミノ保護基を除去するときに
用いられる条件下で安定でなければならず、そして
（３）ペプチド鎖の構造を変化させない条件下で、所望
のアミノ酸配列の形成完了時に容易に除去できなければ
ならない。

ペプチド合成に有用であると知られている保護基は、
それを除去するために使用される試剤との反応性が種々
異なっていることは、当業者にとって明らかであろう。
たとえば、トリフェニルメチル、および２−（ｐ−ビフ
ェニルイル）イソプロピルオキシカルボニルなどの特定
の保護基は非常に不安定であり、温和な酸性条件下で開
裂し得る。他の保護基、たとえばｔ−ブチルオキシカル
ボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオ
キシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニルなどはそれほど不安定でなく、これらを除去す
るには、トリフルオロ酢酸、塩酸、または酢酸中のトリ
フルオロ化ホウ素などの中程度に強い酸が必要である。
さらに、ベンジルオキシカルボニル、ハロベンジルオキ
シカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、
シクロアルキルオキシカルボニル、およびイソプロピル
オキシカルボニルなどのその他の保護基もより不安定で
なく、それらを除去するには、フッ化水素、臭化水素、
またはトリフルオロ酢酸中のトリフルオロ酢酸ホウ素な
どのより強い酸が必要である。

所望のペプチド配列が生成されたなら、その保護され
たペプチドを樹脂支持体から開裂しなければならず、ま
たすべての保護基を除去しなければならない。この開裂
反応と保護基の除去は、同時に、または段階的に行うこ
とができる。樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン
樹脂である場合、樹脂にペプチドをアンカーする結合
は、Ｃ−末端部の遊離カルボキシ基と、樹脂マトリック
スに存在する多くのクロロメチル基のなかの１つとの間
に形成されるエステル結合である。このアンカー結合
は、エステル結合を分解し得ること、および樹脂マトリ
ックスに浸透し得ることが知られている試剤によって開
裂することができる。１つの特に簡便な方法は、液体無
水フッ化水素で処理することによるものである。この試
剤はペプチドを樹脂から開裂するばかりでなく、すべて
の保護基を除去することもできる。したがって、この試
剤を使用すれば、完全に脱保護されたペプチドが直接的
に得られる。保護基を除去することなく、ペプチドを開
裂することを望む場合、保護ペプチド−樹脂にメタノリ
シスを施せば、Ｃ−末端カルボキシ基がメチル化された
保護ペプチドを得ることができる。次いで、得られたメ
チルエステルを温和なアルカリ条件下で加水分解すれ
ば、遊離のＣ−末端カルボキシルを得ることができる。
次いで、ペプチド鎖の保護基を、液体フッ化水素などの
強酸で処理して除去すればよい。メタノリシスに特に有
用な方法は、保護ペプチド−樹脂をクラウンエーテルの
存在下にメタノールおよびシアン化カリウムで処理す
る、モア（G.Moore）らのPeptides,Proc,5th Amer.Pep
t.Symp.,グッドマン（M.Goodman）およびメインホッフ
ァー（J.Meienhofer）編，ジョーン・ウィレイ，ニュー
ヨーク,1977,518-521頁の方法である。

保護ペプチドを樹脂から開裂させるもう１つの方法
は、アンモノリシスに、またはヒドラジンで処理するこ
とに、基づくものである。所望ならば、得られたＣ−末
端アミドまたはヒドラジドを加水分解して遊離のＣ−末
端カルボキシルにし、常法により保護基を除去すること
ができる。

さらに、Ｎ−末端α−アミノ基に存在する保護基は、
樹脂支持体から保護ペプチドを開裂する前、またはそれ
と同時に優先的に除去し得ることは理解されるであろ
う。

本発明のインスリン類似体のＡおよびＢ鎖は、組換え
DNA法によっても調製することができる。これらの調製
では、そのような合成にとって今日常法である手法によ
り、ＡまたはＢ鎖の所望のペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列を調製する。これらの方法は、一般に
は、所望のコード化配列のフラグメントとその相補配列
とをコードしているオリゴヌクレオチドを調製すること
を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、コード化配列
の１つのフラグメントが相補配列の２つのフラグメント
とオーバーラップするように、またその逆となるように
設計する。これらオリゴヌクレオチドを対合して結合さ
せ、最終的に所望の遺伝子配列を得る。

この配列を、クローニングベクターにおける、コード
されたペプチド産物が発現できる位置に挿入する。適当
なクローニングベクターは遺伝子発現の制御配列を少な
くとも１部分含有する。

本発明のインスリン類似体のＡ鎖およびＢ鎖はさら
に、組換えDNA法を使ってプロインスリン様前駆体分子
を介して製造することもできる。フランク（Frank）ら
のPeptides:Synthesis-Structure-Function,Proc.7th A
m.Pept.Symp.,リッチ（D.Rich）およびグロス（E.Gros
s）（1981）を参照のこと。

Ａ鎖およびＢ鎖のそれぞれを組み合わせる工程は、そ
れらをどのようにして製造したかに関係なく、チャンス
（Chance）らのPeptides:Synthesis,Structure and Fun
ction:Proc.of 7th American Peptide Symposium（198
1）の方法によって行うことができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
が、これらを本発明の限定と解してはならない。尚、本
実施例で引用し、本明細書に添付している図面はすべて
正確なスケールで描いていない。

実施例１ Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン A.組換え法誘導化Ａ鎖の調製 ヒトインスリンＡ鎖をコードしている遺伝子を化学的
に合成し、それを大腸菌（E.coli）内で発現させること
により、ヒトインスリンＡ鎖を組換えDNA法で調製し
た。簡単に説明すると、ブロック・ホスホトリエステル
法によって、種々のトリヌクレオチドを長さがデカ〜ペ
ンタデカまでのヌクレオチド合成フラグメントにし、Ａ
鎖をコードしている遺伝子を合成した。その遺伝子は、
EcoRIおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼに係る１本鎖
粘着末端を有していた。それらをβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子（β‐gal）を含有する適当な発現ベクターに挿
入し、メチオニンコドンを介してβ‐gal遺伝子と結合
しているＡ鎖を有するキメラプラスミドを作成した。プ
ロモーターとしてはβ‐gal遺伝子でなく、トリプトフ
ァンシンセターゼ遺伝子（trp L E′）を使用するのが
好ましく、そうすれば高レベルの発現が得られる。その
キメラプラスミドを大腸菌に形質転換し、前駆タンパク
質、すなわちβ‐gal-met-A鎖（または、trp L E′プロ
モーター系を使用する場合はtrp L E′‐met-A鎖）が発
現された。前駆タンパク質を臭化シアンで処理してメチ
オニン結合を開裂させ、精製後、ヒトインスリンＡ鎖を
作成した。以下に記載するように、Ｂ鎖（Ｓ−スルホネ
ート）との結合に利用されるＳ−スルホン化Ａ鎖を、酸
化的スルフィトリシスにより作成した。

ヒトインスリンＡ鎖遺伝子の化学的合成については、
クレア（Crea）らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75,576
5-5769（1978）に徹底して詳細に記載されている。ヒト
インスリンＡ鎖をコードしている化学的に合成した遺伝
子の大腸菌内における発現は、ゴーデル（Goeddel）ら
のProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.76,101-110（1979）に徹
底して詳細に記載されている。

B.B鎖類似体の調製［Lys（B28）、Pro（B29）］ アプライド・バイオシステムズ430Aペプチド合成機
（ソフトウェア改訂1.4を内蔵）を使用し、粗製のペプ
チジル樹脂を調製した。0.5ミリモル（mMol）の出発固
相樹脂（t-BOC-Thr（Bzl）OCH₂ Pam樹脂）を使用した
（0.76mMol/g×0.658g）。使用したアミノ酸はすべてBO
C保護されており、グルタミン酸およびヒスチジンを除
き、すべて購入したものを直接使用した（すなわち、ア
プライド・バイオシステムズI nc.から市販されている
カートリッジ各々は保護アミノ酸約2mmolを含有す
る）。グルタミン酸およびヒスチジンはペプチドズ・イ
ンターナショナル・コーポレーションから入手し、所望
の保護アミノ酸約2mmolを含有するようカートリッジに
それぞれ移した。粗製のペプチジル樹脂を乾燥（減圧下
に室温で一晩）した後、その重量を測定して出発重量と
比較することで、理論的な重量増加を確認した。試料を
少量採取し、アミノ酸分析にかけ、所望のアミノ酸が正
しい量で付加されていることを確認した。

ペプチジル樹脂１部に対してHF（５％v/vエチルメル
カプタンおよび５％v/v m−クレゾールを含有）10部（v
/w）の溶液中、０℃で約１時間撹拌することによって、
ペプチドをペプチジル樹脂から開裂し、側鎖を脱保護し
た。吸引してHFをほとんど除去した後、得られたペプチ
ドをエチルエーテル中で沈殿させた。エチルエーテルで
数回洗浄した後、吸引濾過し、次いでペプチドを、0.1M
トリス、0.1M 硫酸ナトリウム、および0.01M 四チ
オン酸ナトリウムを含有する7M脱イオン化尿素約200ml
に溶解した。得られた溶液のpHを5N NaOHで8.5に調節
し、４℃において一晩激しく撹拌した。

得られたＳ−スルホン化ペプチド溶液を、室温におい
て、セファデックスG-25（微細）の５×215cmカラムに
入れた。その試料を50mM重炭酸アンモニウムで溶出（室
温、20ml/分）した。流出液を276nmでモニターした。フ
ラクション20mlを採取し、所望のフラクションをまと
め、さらに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によっ
て以下のように精製した。

所望のフラクションのプールを2.5×30cmDuPont C8の
9-12μHPLCカラムに注ぎ込み（pumped onto）、100mM
重炭酸アンモニウム中アセトニトリルを一次関数的に増
量するグラジエントで溶出する（室温、2.6ml/分）。流
出液を280nmでモニターする。フラクション25mlを採取
する。分析用HPLCにより、どのフラクションが保持して
いるか否かを分析し、フラクションを選択した。所望の
フラクションをまとめ、凍結乾燥し、上記のようにして
製造したＡ鎖との組合わせに使用した。これについて
は、以下に記載する。

C.Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリンの調製 チャンス（Chance）らの操作法（上掲）によって、Ａ
鎖およびＢ鎖を組合わせた。組換えDNA誘導化Ａ鎖Ｓ−
スルホネート700mg、および合成Lys（B28）、Pro（B2
9）Ｂ鎖Ｓ−スルホネート140mg（両者とも既述のように
して得た）を、環境温度下、0.1M グリシン緩衝液70ml
および14mlにそれぞれ溶解し、5N 水酸化ナトリウムで
各々pH10.5に調節し、次いで５℃に冷却した。環境温度
下、0.1M グリシン緩衝液中、濃度10.5mg/mlのジチオ
トレイトール（DTT）6mlを調製し、5N 水酸化ナトリウ
ムでpHを10.5に調節し、次いで５℃に冷却した。

Ａ鎖およびＢ鎖溶液を一緒にし、次いでDTT溶液5.21m
lを素早く加えた（SH/SSO₃ ^-＝0.90）。200ml容量ガラス
製遠心管の栓をせず、その中で、５℃において、反応溶
液を2.5時間撹拌した。氷酢酸45mlを加え、得られた溶
液を５℃で一晩放置した。

得られた沈殿混合物を５℃において、20分間、2000rp
mで遠心した。上清をペレットの1M酢酸洗液を一緒に
し、５℃のモル酢酸中、５×200cmセファデックスG-50
（極微細カラム）に入れ、重力により溶出させた。３日
間、20分フラクションを採取した。得られたフラクショ
ンを276nmで分析し、いくつかは分析用HPLCによって分
析した。Lys（B28）、Pro（B29）配列のインスリン類似
体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥し、試料
125mgを得た。この試料を逆相HPLC［2.12×25cm DuPont
C8カラムを使用し、0.1M NaH₂PO₄（pH2.2）中、アセト
ニトリルを一次関数的に増量するグラジエントで溶出す
る（室温、2.6ml/分）］によってさらに精製した。溶出
液を276nmでモニターした。分析用HPLCによって、選択
したフラクションを検定した。所望のフラクションをま
とめ、以下のようにしてpH7のHPLCでさらに精製した。

低いpHのHPLC調製物をまとめたものを、氷浴中、0.1M
（NH₄)₂HPO₄で約２倍に希釈した。氷浴中、冷した2N水
酸化ナトリウムによりそのpHを７に調節した。溶出緩衝
液が0.1M pH7（NH₄)₂HPO₄／アセトニトリルであること
を除いては、低pH調製物で行った条件と同一の条件下
で、同じHPLCカラムに、試料を入れ、溶出した。

pH7の調製HPLCによるプールを氷浴中で冷凍し、0.1％
水性トリフルオロ酢酸（TFA）で２回希釈した。1N 塩
酸を加え（冷状態、氷浴中の試料）、pHを３に低下させ
た。この試料をVydac C4、またはDuPont C8 HPLCカラム
（2.12×25cm）に入れ、0.1％水性TFA中、アセトニトリ
ルを一次関数的に増量するグラジエントで溶出する。溶
出液を214nmまたは276nmでモニターした。所望のフラク
ションをまとめ、凍結乾燥し、逆相HPLCにより97％より
も高い純度の所望の類似体41mgを得た。

実施例２ Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリンを調製するため
の２番目の方法は、酵素による半合成（逆タンパク質分
解）を利用し、デス−オクタペプチドインスリン（A
_1-21−B_1-22）を合成オクタペプチドと結合することで
あった。デス−オクタペプチドインスリンは、ブロマー
（Bromer）およびチャンス（Chance）のBiochim.Biophy
s.Acta,133:219-223（1967）「デス−オクタペプチド−
インスリンの調製法およびその特性化」に記載されてい
るように天然のブタまたはヒトインスリンをトリプシン
消化することによって入手した。合成オクタペプチド:G
ly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thrは、既述の態様の自動
固相合成機によって調製した。

デス−オクタペプチドインスリン（435mg）および合
成Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr465mgを、ジメチル
スルホキシド１部、1,4−ブタンジオール２部、および
0.25Mトリス酢酸緩衝液pH7.3（１部）を含有する溶液15
ml中で混合した。得られた溶液をホットプレート上で暖
め、ペプチドを完全に溶解させた。次いで、この溶液を
37℃でインキュベートし、ブタのトリプシン90mgを加え
た。この溶液を時々撹拌しながら、37℃で90分間置い
た。0.05N 塩酸135mlを溶液に加え、この反応を終止さ
せた。

標題のインスリン類似体を含有する酸性溶液を2.5×2
5cm C−8 Zorbax HPLCカラムに入れ、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2.2緩衝液中、一次関数的に増量させ
るアセトニトリルのグラジエントで溶出することによっ
て、該類似体を精製した。溶出液を276nmでモニターし
た。所望のフラクションをまとめ、水で２倍に希釈し、
１×25cm C−８ウルトラスフェア（Ultrasphere）HPLC
カラムに入れた。0.5％水性TFA中、一次関数的に増量さ
せるアセトニトリルのグラジエントで類似体を溶出し
た。溶出液を276nmでモニターした。所望のフラクショ
ンを再びまとめ、凍結乾燥し、精製された類似体125mg
を得た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および
質量スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5809.2（理論値:5808.7）。

分解能約1500のVG-ZAB-25Eダブル焦点質量スペクトル
分光器（double focusing mass spectrometer）を使用
し、本明細書に記載している高速原子衝撃質量スペクト
ル分析を得た。ヒトインスリン類似体を、シュウ酸を含
有するグリセロールおよびチオグリセロールの混液に溶
解した。ヨウ化セシウムをこの装置の検量に使用し、m/
z5300からm/z6500で磁気的にスキャンする。得られたデ
ータは平均質量＋１として表わされる。

参考例１ Aba（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（384mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Aba-Pro
-Thr362mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン75mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸137mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C−8 Vydacカラム
上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフル
オロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントを使用して
カラムから溶出させた。精製されたインスリン類似体を
含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して59mgを得
た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量
スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5765.7（理論値:5765.6）。

参考例２ Ala（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（290mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro
-Thr310mgを、ジメチルスルホキシド部１部、1,4−ブタ
ンジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）
１部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタト
リプシン60mgを加えた。37℃で60分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸90mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅い（shallow）アセトニ
トリルのグラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、10×250mm C−８ウルトラス
フェアカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.
5％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエン
トでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類似
体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して43mg
を得た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および
質量スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5752.3（理論値:5751.6）。

参考例３ Arg（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（290mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Arg-Pro
-Thr310mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン60mgを加えた。37℃で60分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸90mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、10×250mm C−８ウルトラス
フェアカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.
5％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエン
トでカラムから溶出させた。精製されたインスリン類似
体を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して103m
gを得た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、およ
び質量スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5836.1（理論値:5836.7）。

参考例４ Asn（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（409mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asn-Pro
-Thr398mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液14ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン81mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸136mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydacカラム
上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフル
オロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムか
ら溶出させた。精製されたインスリン類似体を含有する
フラクションをまとめ、凍結乾燥して56mgを得た。その
構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクト
ル分析（MS）によって確認した。

MS:5794.7（理論値:5794.6）。

参考例５ Asp（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（400mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro
-Thr388mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン78mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸137mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydacカラム
上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.1％トリフル
オロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムか
ら溶出させた。精製されたインスリン類似体を含有する
フラクションをまとめ、凍結乾燥して85mgを得た。その
構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクト
ル分析（MS）によって確認した。

MS:5795.7（理論値:5795.6）。

実施例３ Asp（B10）、Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン A.Asp（B10）、Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン
Ｂ鎖の調製 アプライド・バイオシステムズ430Aペプチド合成機
（ソフトウェア改訂1.4を内蔵）を使用し、粗製のペプ
チジル樹脂を調製した。0.5ミリモル（mMol）の出発固
相樹脂（t-BOC-Thr（Bzl）OCH₂Pam樹脂）を使用した
（0.72mMol/g×0.705g）。使用したアミノ酸はすべてBO
C保護されており、グルタミン酸、アスパラギン酸およ
びヒスチジンを除き、すべて購入したものを直接使用し
た（すなわち、アプライド・バイオシステムズI nc.か
ら市販されているカートリッジは、各々に保護アミノ酸
約2mmolを含有する）。グルタミン酸、アスパラギン酸
およびヒスチジンは商業的供給元から入手し、所望の保
護アミノ酸約2mmolを含有するようカートリッジそれぞ
れに移した。粗製のペプチジル樹脂を乾燥（減圧下に室
温で一晩）した後、その重量を測定して出発重量と比較
することで、理論的な重量増加であることを確認した。
試料を少量採取し、アミノ酸分析にかけ、所望のアミノ
酸が正しい比率で付加されていることを確認した。

ペプチジル樹脂１部に対してHF（５％v/v p−チオク
レゾールおよび５％v/v m−クレゾールを含有）10部（v
/w）の溶液中、０℃で約１時間撹拌することによって、
ペプチドをペプチジル樹脂から開裂し、側鎖を脱保護し
た。吸引してHFをほとんど除去した後、得られたペプチ
ドをエチルエーテル中で沈殿させた。エチルエーテルで
数回洗浄した後、吸引濾過し、次いでペプチドを、0.1M
トリス、35mg/ml硫酸ナトリウム、および25mg/ml四チ
オン酸ナトリウムを含有する8M 塩酸グアニジン（pH1
1）約120mlに溶解した。得られた溶液のpHを5N NaOHで
8.8に調節し、室温で３時間激しく撹拌した。

得られたＳ−スルホン化ペプチド溶液を、室温におい
て、セファデックスG-25（中級）の５×215cmカラムに
入れた。その試料を50mM重炭酸アンモニウムで溶出した
（室温、21ml/分）。溶出液を276nmでモニターした。各
々25mlのフラクションを採取し、所望のフラクションを
まとめ、さらに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
よって以下のように精製した。

所望のフラクションのプールを2.5×30cm DuPont C8
の9-12μHPLCカラムに注ぎ込み、100mM 重炭酸アンモ
ニウム中アセトニトリルを一次関数的に増量するグラジ
エントで溶出する（室温、2.6ml/分）。溶出液を280nm
でモニターする。フラクション（各々25ml）を採取し
た。分析用HPLC分析により、どのフラクションが保持し
ているか決定し、フラクションを選択した。所望のフラ
クションをまとめ、凍結乾燥し、以下のようにして、製
造したＡ鎖との組合わせに使用した。

B.Asp（B10）、Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン
Ｂ鎖とヒトインスリンＡ鎖との組合わせ チャンス（Chance）らの操作法（上掲）によって、Ａ
鎖およびＢ鎖を組合わせた。組換えDNA誘導化Ａ鎖Ｓ−
スルホネート2g、および合成Asp（B10）、Lys（B28）、
Pro（B29）Ｂ鎖Ｓ−スルホネート400mgを、環境温度
下、0.1M グリシン緩衝液200mlおよび40mlにそれぞれ
溶解し、5N 水酸化ナトリウムで各々pH10.5に調節し、
次いで５℃に冷却した。環境温度下、0.1M グリシン緩
衝液中、濃度15.5mg/mlのジチオトレイトール（DTT）溶
液を調製し、5N 水酸化ナトリウムでpHを10.5に調節
し、次いで５℃に冷却した。

得られたＡ鎖およびＢ鎖溶液を一緒にし、次いでDTT
溶液15.9mlを素早く加えた（SH/SSO₃＝1.0）。200ml容
量ガラス製遠心管の栓をせず、その中で、４℃におい
て、反応溶液を19.6時間撹拌した。氷酢酸129mlを加
え、得られた溶液を４℃に１時間放置した。

得られた沈殿混合物を４℃において、30分間、2000rp
mで遠心した。上清をmilli-Q水292mlおよびアセトニト
リル73mlと混合し、逆相HPLC［2.5×30cm Vydac C18カ
ラムを使用し、0.1M NaH₂PO₄（pH2.1）中、アセトニト
リルを一次関数的に増量するグラジエントで溶出する
（室温、2.6ml/分）］によってさらに精製した。得られ
た溶出液を280nmでモニターした。分析用HPLCによっ
て、選択したフラクションを検定し、所望のフラクショ
ンをまとめ、0.1％水性トリフルオロ酢酸（TFA）で２倍
に希釈し、次いでウルトラスフェア オクチルHPLCカラ
ム（1.0×25cm）に入れ、0.1％水性TFA中、アセトニト
リルを一次関数的に増量するグラジエントで溶出した。
溶出液を280nmでモニターした。分析用HPLCによって、
選択したフラクションを検定し、所望のフラクションを
まとめ、再度、若干アセトニトリルのグラジエントが異
なるが、前記と同一のカラムおよび条件を使用する方法
によって再精製した。適当なフラクションをまとめ、凍
結乾燥し、逆相HPLCにより93％よりも高い純度のインス
リン類似体65mgを得た。その構造を、アミノ酸分析（第
１表）、および質量スペクトル分析（MS）によって確認
した。

MS:5786.1（理論値:5786.7）。

参考例６ Cya（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン オクタペプチドのシステインをシステイン酸形態に変
換するため、過ギ酸酸化を行った。合成オクタペプチ
ド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cys-Pro-Thr363mgを、氷冷フ
ラスコ中で、調製したばかりの過ギ酸36mlに溶解し、穏
やかに１時間撹拌した。得られた酸化物を水で10倍に希
釈し、凍結乾燥した。この凍結乾燥物を半合成に使用し
た。

ブタのデス−オクタペプチドインスリン（222mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cya-Pro
-Thr225mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液18ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン45mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸242mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydacカラム
上に注ぎ込んだ。脱塩されたタンパク質を、0.5％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラ
ムから溶出させた。精製されたインスリン類似体を含有
するフラクションをまとめ、凍結乾燥して16mgを得た。
その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペ
クトル分析（MS）によって確認した。

MS:5831.5（理論値:5831.7）。

実施例４ Gln（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（290mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gln-Pro
-Thr310mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン60mgを加えた。37℃で60分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸90mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、10×250mm C-18ウルトラスウ
ェアカラム上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5
％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエント
でカラムから溶出させた。精製されたインスリン類似体
を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して87mgを
得た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質
量スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5809.4（理論値:5808.6）。

参考例７ Glu（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（402mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro
-Thr398mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液14ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン80mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸136mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して59mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5809.6（理論値:5809.6）。

参考例８ Gly（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（412mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gly-Pro
-Thr376mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン79mgを加えた。37℃で180分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸147mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.1％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して11mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5737.2（理論値:5737.6）。

参考例９ His（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（400mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-His-Pro
-Thr398mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン79mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸237mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.1％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して79mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5816.9（理論値:5817.7）。

参考例10 Ile（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（409mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ile-Pro
-Thr398mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン81mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸136mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して57mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5793.7（理論値:5793.7）。

参考例11 Leu（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（418mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Leu-Pro
-Thr410mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液14ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン83mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸136mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して74mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5793.8（理論値:5793.7）。

実施例５ Nle（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（290mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nle-Pro
-Thr310mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン60mgを加えた。37℃で60分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸90mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、10×250mm C−８ ウルトラ
フェア上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％ト
リフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントでカ
ラムから溶出させた。精製されたインスリン類似体を含
有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して54mgを得
た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量
スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5794.6（理論値:5793.7）。

参考例12 D-Lys（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（392mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-D-L
ys-Thr387mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタ
ンジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）
１部を含有する溶液13.5ml中で混合した（37℃）。ブタ
トリプシン78mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌し
ながら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸136.5mlに
加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250m
m C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性
リン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルの
グラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して94mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5809.0（理論値:5808.7）。

参考例13 Met（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（350mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Met-Pro
-Thr366mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液12ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン71mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸118mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.1％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して72mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5811.8（理論値:5811.7）。

参考例14 Orn（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（290mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Orn-Pro
-Thr310mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン60mgを加えた。37℃で90分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸90mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、10×250mm C−８ ウルトラ
スフェア上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％
トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントで
カラムから溶出させた。精製されたインスリン類似体を
含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して89mgを得
た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量
スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5795.2（理論値:5794.7）。

参考例15 Phe（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（290mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Phe-Pro
-Thr310mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン60mgを加えた。37℃で80分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸90mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.1％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して17mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5827.9（理論値:5827.7）。

実施例６ Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（339mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Pro
-Thr363mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液9ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン70mgを加えた。37℃で80分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸108mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、10×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、10×250mm C−８ ウルトラ
スフェア上に注ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％
トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルのグラジエントで
カラムから溶出させた。精製されたインスリン類似体を
含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥して97mgを得
た。その構造を、アミノ酸分析（第１表）、および質量
スペクトル分析（MS）によって確認した。

MS:5778.6（理論値:5777.6）。

参考例16 Ser（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（412mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ser-Pro
-Thr390mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン80mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸137mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して37mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5768.1（理論値:5767.6）。

参考例17 Thr（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（437mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Thr-Pro
-Thr420mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液14.5ml中で混合した（37℃）。ブタト
リプシン86mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しな
がら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸135.5mlに
加え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250m
m C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性
リン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルの
グラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して78mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5781.9（理論値:5781.6）。

参考例18 Trp（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（310mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Trp-Pro
-Thr325mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10.5ml中で混合した（37℃）。ブタト
リプシン64mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しな
がら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸140mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して47mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5866.2（理論値:5866.7）。

参考例19 Tyr（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（391mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Tyr-Pro
-Thr400mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液13ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン79mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸137mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して30mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5843.7（理論値:5843.7）。

参考例20 Val（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（400mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Val-Pro
-Thr383mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液12ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン78mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸238mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で４倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.1％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して74mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5780.0（理論値:5779.6）。

参考例21 Nva（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン ブタのデス−オクタペプチドインスリン（292mg）お
よび合成オクタペプチド:Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nva-Pro
-Thr279mgを、ジメチルスルホキシド１部、1,4−ブタン
ジオール２部、および0.25M トリス緩衝液（pH7.3）１
部を含有する溶液10ml中で混合した（37℃）。ブタトリ
プシン57mgを加えた。37℃で120分間、時折撹拌しなが
ら、この溶液を充分に混合した。

この時点で、得られた混合物を0.05N 塩酸240mlに加
え、反応を終止させた。得られた全溶液を、21×250mm
C−8 Zorbax カラム上に注ぎ込み、0.1M 一塩基性リ
ン酸ナトリウムpH2緩衝液中、浅いアセトニトリルのグ
ラジエントで生成物を溶出させた。

分析用HPLCによって決定した適当なフラクションをま
とめ、水で２倍に希釈し、25×300mm C-18 Vydac上に注
ぎ込んだ。脱塩化タンパク質を、0.5％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルのグラジエントでカラムから溶出
させた。精製されたインスリン類似体を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥して51mgを得た。その構造
を、アミノ酸分析（第１表）、および質量スペクトル分
析（MS）によって確認した。

MS:5780.0（理論値:5779.6）。

実施例７ 既述の操作法により、以下のインスリン類似体をさらに
調製した。

（ａ）Asp（B1）、Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインス
リン （ｂ）デス（Phe-B1）、Lys（B28）、Pro（B29）ヒトイ
ンスリン （ｃ）デス（Phe-B1）、Asp（B10）、Lys（B28）、Pro
（B29）ヒトインスリン （ｄ）デス（Phe-B1、Val-B2）、Lys（B28）、Pro（B2
9）ヒトインスリン （ｅ）デス（Phe-B1、Val-B2）、Asp（B10）、Lys（B2
8）、Pro（B29）ヒトインスリン （ｆ）Gly（A21）、Asp（B10）、Lys（B28）、Pro（B2
9）ヒトインスリン （ｇ）Ala（A21）、Asp（B10）、Lys（B28）、Pro（B2
9）ヒトインスリン （ｈ）デス（Thr-B30）、Lys（B28）、Pro（B29）ヒト
インスリン 実施例８ Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン 組換えベクターおよび宿主の構築 A.プラスミドpCZR126Sの構築 1.プラスミドpKC283の単離 大腸菌（E.coli）K12 BE1201/pKC283の凍結乾燥品
は、受託番号NRRL B-15830のもと、ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリー（Northern Regional Re
search Laboratory,Peoria,Illinois 61604）から入手
される。この凍結乾燥品をLB培地［１中にバクト−ト
リプトン10g、バクト−酵母エキス5gおよびNaCl10gを含
有、pHを7.5に調節］（10ml）の入った試験管内にデカ
ンテーションし、32℃で２時間インキュベートする。こ
の時点で培養物を50μg/mlアンピシリンとし、次いで32
℃で一夜インキュベートする。大腸菌K12 BE1201/pKC28
3細胞は細胞性DNAに組込まれている温度感受性のcIリプ
レッサー遺伝子を含有しているので、32℃で培養した。
本明細書中、以後の実施例に記載しているように、この
プラスミドの単離操作に野性型のラムダpLリプレッサー
遺伝子を含む細胞、またはラムダpLプロモーターを含ま
ない細胞を用いる場合には、インキュベーション温度は
37℃とする。

一夜培養物の少量をとり、大腸菌K12 BE1201/pKC283
の単一のコロニー単離体が得られる様な方法で、50μg/
mlアンピシリンを含むLB−寒天（15g/lバクト−寒天を
含むLB培地）平板上に蒔いた。得られた単一のコロニー
を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地（10ml）に接種
し、激しく振盪しながら32℃で一夜インキュベートし
た。この一夜培養物10mlを50μg/mlアンピシリン含有の
LB培地（500ml）に接種し、激しく振盪しながら培養物
を定常相に達するまで32℃においてインキュベートし
た。

以下の操作は、マニアティス等［Maniatis et al.,モ
レキュラー・クローニング（Molecular Cloning）,Cold
Spring Harbor Laboratory］の方法を脚色したもので
ある。

４℃、4000gで10分間遠心することによって細胞を集
め、その上清を捨てた。得られた細胞ペレットを氷冷の
STE緩衝液［0.1M NaCl;10mMトリス‐HCl（pH7.8）；お
よび1mM EDTA］（100ml）で洗浄した。洗浄後、得られ
た細胞ペレットを5mg/mlリゾチーム含有の溶液１［50mM
グルコース;25mMトリス‐HCl（pH8.0）；および10mM ED
TA］（10ml）に再懸濁し、室温で10分間放置した。次い
で、このリゾチーム処理した細胞に溶液２［0.2N NaOH
および１％ SDS］（20ml）を加え、この溶液を反転させ
て穏やかに混合した。この混合物を氷上で10分間インキ
ュベートした。

この溶菌細胞混合物に氷冷した5M酢酸カリウム（pH4.
8）（15ml）を加え、溶液を反転混合した。この溶液を
氷上で10分間インキュベートした。水（28.5ml）および
5M酢酸カリウム（60ml）に氷酢酸（11.5ml）を加えるこ
とによって5M酢酸カリウム溶液を調製した；得られた溶
液はカリウムについては3M、そして酢酸塩については5M
である。

この溶菌細胞混合物を、ベックマン（Beckman）SW27
（またはその同等の機器）中、４℃、20,000rpmで20分
間遠心した。細胞DNAと残骸は管の底にペレットを形成
した。上清約36mlを回収し、イソプロパノール（0.6容
量）を加えて混合し、得られた溶液を室温で15分間放置
した。室温、12,000gで30分間遠心することによってプ
ラスミドDNAを集めた。上清を捨て、DNAペレットを70％
エタノールにより室温で洗浄した。このエタノール洗液
をデカントし、ペレットを真空デシケーター中で乾燥し
た。次いで、このペレットをTE緩衝液［10mMトリス‐HC
l（pH8.0）および1mM EDTA］（8ml）中に再懸濁した。

このDNA溶液にCsCl（8g）を加えた。各10mlのCsCl-DN
A溶液に10mg/mlの臭化エチジウム水溶液（約0.8ml）を
加えた。最終の溶液密度は約1.55g/mlであり、臭化エチ
ジウム濃度は約600μg/mlであった。この溶液をベック
マン50型遠心管に移し、パラフィンオイルで上部まで満
たし、封をし、そして20℃、45,000rpmで24時間遠心し
た。遠心後、普通光のもとで２つのDNAバンドが観察さ
れた。管からキャップを取った後、遠心管の側面から挿
入する＃21皮下注射針の注射器を用いて下方のDNAバン
ドを採取した。

水飽和の１−ブタノールで数回抽出して臭化エチジウ
ムを除去した。TE緩衝液に対して透析することによって
CsClを除去した。緩衝フェノール、次いでクロロホルム
で抽出した後、DNAを70％エタノールで沈澱させ、洗浄
し、そして乾燥した。約1mgのプラスミドpKC283が得ら
れ、これをTE緩衝液中、約１μg/μｌの濃度、４℃で保
存した。プラスミドpKC283の制限部位および機能地図を
添付の第１図に示す。

2.プラスミドpKC283PXの構築 実施例１で調製したプラスミドpKC283 DNA（約10μ
ｌ）を、10×中−塩制限緩衝液［500mM NaCl;100mMトリ
ス‐HCl（pH7.5）;100mM MgCl₂；および10mM DTT］（20
μｌ）、1mg/ml BSA（20μｌ）、制限酵素PvuII（５μ
ｌ）［〜50単位（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Bethesda Research Laboratories;BRL）の定義）；本
明細書中で用いる制限酵素のすべてはここから入手し
た］、および水（145μｌ）と混合し、得られた反応液
を37℃で２時間インキュベートした。本明細書中に記載
の制限酵素反応は、フェノール、次いでクロロホルムで
抽出することによって常法通り停止させ、続いてDNAを
沈澱させ、エタノール洗浄し、そしてDNAをTE緩衝液に
再懸濁させる。このようにしてPvuII消化を停止させた
後、PvuII消化プラスミドpKC283 DNAを沈澱させ、次い
でTE緩衝液（５μｌ）に再懸濁した。

XhoIリンカー（５′‐CCTCGAGG-3′）［約600ピコモ
ル（pM）］を、５×キナーゼ緩衝液［300mMトリス‐HCl
（pH7.8）;50mM MgCl₂；および25mM DTT］（10μｌ）、
5mM ATP（５μｌ）、水（24μｌ）、T4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ［0.5μl;P−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−L Bi
ochemicals）の定義で約2.5単位］、1mg/ml BSA（５μ
ｌ）、および10mMスペルミジン（５μｌ）を含む混合物
中、該混合物を37℃で30分間インキュベートすることに
よってキナーゼ処理した。

このキナーゼ処理したXhoIリンカー（約12.5μｌ）を
PvuII−消化プラスミドpKC283 DNA（５μｌ）に加え、
次いでこのDNAに、10×リガーゼ緩衝液［300mMトリス−
HCl（pH7.6）;100mM MgCl₂；および50mM DTT］（2.5μ
ｌ）、1mg/ml BSA（2.5μｌ）、5mM ATP（７μｌ）、T4
DNAリガーゼ［2.5μl;約2.5単位（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルスの定義）］、10mMスペルミジン（2.5μｌ）、およ
び（水３μｌ）を加えた。得られたライゲーション（連
結）反応液を４℃で一夜インキュベートした。ライゲー
ション反応の後、反応混合物の組成を高−塩緩衝液［0.
1M NaCl;0.05Mトリス−HCl（pH7.5）;10.0mM MgCl₂；お
よび1mM DTT］の組成に調節した。この混合物に制限酵
素XhoI（約10μl;100単位）を加え、得られた反応液を3
7℃で２時間インキュベートした。

反応を停止させ、XhoI消化DNAを析出させ、再懸濁
し、そしてライゲーション混合物にXhoIリンカーを加え
ないということ以外は上記と同様にして連結させた。連
結したDNAは所望のプラスミドpKC283PXを構成してい
た。プラスミドpKC283PXの制限部位および機能地図を添
付の第２図に示す。

3.大腸菌K12 MO（λ⁺）/pKC283PXの構築 大腸菌K12 MO（λ⁺）は、ノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリーズから、受託番号NRRL B-15993
のもと、凍結乾燥品の形で入手することができる。大腸
菌K12 MO（λ⁺）は野性型のラムダpL cIリプレッサー遺
伝子を含有しているので、本発明のハイブリッドpL-lpp
プロモーターからの転写は、この大腸菌K12 MO（λ⁺）
細胞内では起こらない。この凍結乾燥品を復元し、MO
（λ⁺）の単一コロニーを単離し、そしてインキュベー
ション温度が37℃であることと増殖培地にアンピシリン
を用いないこと以外は、実質的に実施例29A1の方法に従
ってMO（λ⁺）細胞の一夜培養物（10ml）を調製した。

一夜培養物（50μｌ）を10mM MgSO₄および10mM MgCl₂
含有のLB培地（5ml）に接種した。この培養物を、激し
く振盪しながら37℃で一夜インキュベートした。翌朝、
培養物を10mM MgSO₄および10mM MgCl₂含有のLB培地で20
0mlに希釈した。この希釈培養物を激しい振盪下におい
て、550nmでの吸光度（A₅₅₀）が約0.5（これは約１×10
⁸細胞/mlの細胞密度を示す）に達するまで、37℃でイン
キュベートした。氷−水浴中で10分間、培養物を冷却
し、次に４℃において、4000gで10分間遠心して細胞を
集めた。得られた細胞ペレットを冷10mM MgSO₄（100m
l）に再懸濁した後、直ちに遠心して再度ペレット化し
た。この細胞ペレットを30mM CaCl₂（100ml）に再懸濁
し、氷上で20分間インキュベートした。

遠心して細胞を再び集め、30mM CaCl₂（10ml）中に再
懸濁した。細胞0.5mlづつを実施例29A2で調製した連結D
NAに加えた（このDNAは30mM CaCl₂に調製しておい
た）。この細胞−DNA混合物を氷上で１時間インキュベ
ートし、42℃で90秒間熱ショックを与えた後、氷上で約
２分間冷凍した。この細胞−DNA混合物を125ml容量のフ
ラスコ中、LB培地（10ml）に希釈し、37℃で１時間イン
キュベートした。この100μｌ部分量づつをアンピシリ
ン含有のLB−寒天平板上にプレートし、コロニーが現わ
れるまで37℃でインキュベートした。

コロニーを個々に培養し、各コロニーのプラスミドDN
Aを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べた。プラ
スミドDNAの単離は、実施例29A1の方法に従って小さい
スケールで行ったが、所望の大腸菌K12 MO（λ⁺）/pKC2
83PX形質転換体が同定されるまではCsCl勾配の工程を削
除した。プラスミドpKC283PXの制限部位および機能地図
を添付の第２図に示す。

4.大腸菌K12MO（λ⁺）/pKC283-Lの構築 実施例29A1の方法に従って調製したプラスミドpKC283
PX DNA（10μｇ）を、10×高‐塩緩衝液（20μｌ）、1m
g/mlBSA（20μｌ）、制限酵素BglII（５μl;〜50単
位）、制限酵素XhoI（５μl;〜50単位）、および水（15
0μｌ）に溶解し、得られた反応液を37℃で２時間イン
キュベートした。反応を止め、BglII-XhoI消化DNAを沈
澱させた後、このDNAをTE緩衝液（５μｌ）に再懸濁し
た。

BglIIおよびXhoI制限酵素切断の特徴を有する１本鎖D
NA末端のDNAリンカーを合成し、キナーゼ処理した。こ
のリンカーのキナーゼ処理は実質的に実施例29A2の方法
に従って行った。このDNAリンカーは次の構造を有して
いる： このリンカーは、当業界でよく知られている方法によ
り、１本鎖のデオキシオリゴヌクレオチドから合成し
た。その１本鎖のデオキシオリゴヌクレオチドは、市販
の装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems,850 Lincoln Centre Drive,Foster City,
CA 94404）から市販されている380A DNA合成機によって
合成することができる（この装置はホスホルアミダイト
の化学を利用するものである）。DNAを合成するための
他の方法も当業界で知られている。１本鎖DNA合成のた
めの通常の改良ホスホトリエステル法は、イタクラ等
［Itakura et al.,Science 198:1056,1977］、およびク
レア等［Crea et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:576
5,1978］に開示されている。さらに、DNA合成に特に好
ましい方法は、シング等［Hsiung et al.,Nucleic Acid
Research 11:3227,1983］、およびナラン等［Narang e
t al.,Methods in Enzymology 68:90,1980］に開示され
ている。

このリンカーとBglII-XhoI消化プラスミドpKC283PXと
を実質的に実施例29A2の方法に従って連結させた。連結
したDNAは所望のプラスミドpKC283-Lを構成していた。
プラスミドpKC283-Lの制限部位および機能地図を添付の
第３図に示す。プラスミドpKC283-L DNAを用いて大腸菌
K12 MO（λ⁺）を形質転換し、実質的に実施例29A3の方
法に従って、得られた大腸菌K12 MO（λ⁺）/pKC283-L形
質転換体を同定した。

5.大腸菌K12 MO（λ⁺）/pKC283-LBの構築 実質的に実施例29A1の方法に従って調製したプラスミ
ドpKC283-L DNA（約10μｇ）を、10×高−塩緩衝液（20
μｌ）、1mg/ml BSA（20μｌ）、制限酵素XhoI（５μl;
〜50単位）、および水（155μｌ）に溶解し、得られた
反応液を37℃で２時間インキュベートした。次いで、95
％エタノール（３容量）と3M酢酸ナトリウム（1/10容
量）を加え、ドライアイス−エタノール浴中で５分間イ
ンキュベートすることにより反応混合物からXhoI−消化
プラスミドpKC283-L DNAを沈澱させ、そして遠心した。
得られたDNAペレットを70％エタノールで洗浄して乾燥
し、10×ニック−トランスレーション緩衝液［0.5Mトリ
ス−HCl（pH7.2）;0.1M MgSO₄；および1mM DTT］（２μ
ｌ）、デオキシヌクレオチド三リン酸各2mMづつを含む
溶液（１μｌ）、水（15μｌ）、クレノウ（大腸菌DNA
ポリメラーゼＩの大きいフラグメント）（１μl;〜６単
位（Ｐ−Ｌバイオケミカルズの定義））、および1mg/ml
BSA（１μｌ）中に再懸濁した。得られた反応液を25℃
で30分間インキュベートし、この溶液を70℃で５分間イ
ンキュベートすることにより反応を止めた。

BamHIリンカー（５′‐CGGGATCCCG-3′）をキナーゼ
処理し、XhoI−消化してクレノウ処理したプラスミドpK
C283-L DNAに、実質的に実施例29A2の方法に従って連結
させた。この連結反応の後、高−塩緩衝液中、37℃で約
２時間、このDNAをBamHI（約100単位）で消化した。こ
のBamHI消化の後、実質的に実施例29A2の方法に従ってD
NAをライゲーション用に調製した。

実質的に実施例29A2および29A3の方法に従い、得られ
た〜5.9kb BamHI制限フラグメントを連結反応によって
環化し、大腸菌K12 MO（λ⁺）に導入した。大腸菌K12 M
O（λ⁺）/pKC283-LB形質転換体を同定した後、実質的に
実施例29A1の方法に従ってプラスミドpKC283-LB DNAを
調製した。プラスミドpKC283-LBの制限部位および機能
地図を添付の第４図に示す。

6.大腸菌K12 MO（λ⁺）/pL32の構築 使用する出発プラスミド、制限酵素およびリンカーが
異なる以外は、実質的に実施例29A5の方法に従い、プラ
スミドpKC283PX（約10μｇ）を高−塩緩衝液中で制限酵
素SalIにより消化し、クレノウ処理し、EcoRIリンカー
（５′‐GAGGAATTCCTC-3′）に連結させた。制限酵素Ec
oRIで消化して〜2.1kbのDNAを除去し、次いで連結によ
り〜4.0kb EcoRI制限フラグメントを環化し、プラスミ
ドpKC283PRSを得た。この連結したDNAを用い、実質的に
実施例29A3の方法に従って大腸菌K12 MO（λ⁺）を形質
転換した。大腸菌K12 MO（λ⁺）/pKC283PRS形質転換体
を同定した後、実質的に実施例29A1の方法に従ってプラ
スミドpKC283PRS DNAを調製した。プラスミドpKC283PRS
の制限部位および機能地図を添付の第５図に示す。

プラスミドpKC283PRS（約10μｇ）を、高−塩緩衝液
（200μｌ）中、制限酵素PstIおよびSphI（それぞれ約5
0単位）で消化した。反応液を37℃で約２時間インキュ
ベートした後、反応混合物をトリス−酢酸緩衝液中、0.
6％低−ゲル化温度アガロース［FMCコーポレイション
（FMC Corporation,Marine Colloids Division,Rocklan
d,Maine 04841）］ゲルにより、〜130V、〜75mAにおい
て２〜３時間電気泳動した。

ゲルを臭化エチジウムの希溶液で染色し、〜0.85kb P
stI-SphI制限フラグメントを構成するDNAバンドを長波
長のUV光で観察し、これを小さなセグメントとしてゲル
から切り取った。このセグメントの容積をセグメントの
重量と密度とから計算し、それと等容量の10mMトリス−
HCl（pH7.6）をセグメントの入っている試験管に加え
た。次いで、このセグメントを72℃でインキュベートし
て溶融した。プラスミドpKC283PRSの〜0.85kb PstI-Sph
I制限フラグメント（約１μｇ）を約100μｌ容量中に得
た。同様にして、プラスミドpKC283-LBを制限酵素PstI
とSphIで消化し、アガロースゲル電気泳動によって〜3.
0kb制限フラグメントを単離し、連結反応用に調製し
た。

実質的に実施例29A2の方法に従い、プラスミドpKC283
PRSの〜0.85kb PstI-SphI制限フラグメントをプラスミ
ドpKC283-LBの〜3.0kb PstI-SphI制限フラグメントに連
結した。この連結DNAは所望のプラスミドpL32を構成し
ていた。プラスミドpL32の制限部位および機能地図を添
付の第６図に示す。実質的に実施例29A3の方法に従い、
プラスミドpL32を大腸菌K12 MO（λ⁺）細胞に導入し
た。実質的に実施例29A1の方法に従い、大腸菌K12 MO
（λ⁺）/pL32形質転換体からプラスミドpL32 DNAを調製
した。プラスミドpL32 DNAの分析の結果、プラスミドpK
C283PXのクレノウ処理したSalI末端には１以上のEcoRI
リンカーが結合していることが分かった。１以上のEcoR
Iリンカーの存在はプラスミドpL32またはプラスミドpL3
2誘導体の有用性には何ら影響を及ぼさず、またそのこ
とは、２個のEcoRIリンカーが一緒にライゲートした場
合には必ず生成するXhoI制限部位の存在によって検出す
ることができる。別法として、pL32プラスミドは、プラ
スミドpKC283-LBに対して、本実施例の第１パラグラフ
に記載しているSalI-EcoRI削除と連結反応を行うことに
よっても構築することができる。

7.大腸菌K12 MO（λ⁺）/pL47の構築 大腸菌K12 RV308/pNM789は、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・ラボラトリーズから受託番号NRRL B-18216
のもと、凍結乾燥品として入手することができる。pNM7
89の制限部位および機能地図を添付の第７図に示す。イ
ンキュベート温度を37℃としたこと以外は実質的に実施
例１の教示に従って、培養物からプラスミドDNAを抽出
する。pNM789（10μｇ）をPvuII緩衝液［50mMトリス‐H
Cl（pH7.5）;60mM NaCl;および6mM MgCl₂］（200μｌ）
に懸濁させる。PvuII（１単位）を加え、反応混合物を3
7℃で５分間インキュベートする。65℃で10分間加熱す
ることによって酵素を失活させる。次に、10×BamHI緩
衝液［200mMトリス‐HCl（pH8.0）;1M NaCl;および70mM
MgCl₂］（30μｌ）、水（70μｌ）、およびBamHI（10
単位）を加え、この反応液を37℃で１時間インキュベー
トする。これに続いてアルカリホスファターゼ（５単
位）を加え、65℃で１時間インキュベートする。得られ
たDNAフラグメントを１％アガロースゲルで分離し、１
カ所切断フラグメントのサイズのDNAフラグメント（第
８図）を精製した。

平滑末端およびBamHI末端を有するDNAリンカーを、実
質的に実施例29A4の教示に従って合成する。このリンカ
ー（第８図中、118で示されている）は次の構造を有し
ている： 実質的に実施例29A2の教示に従って、このリンカーをキ
ナーゼ処理し、BamHI-PvuII消化のプラスミドpNM789と
連結する。実質的に実施例29A3の教示に従い、この連結
混合物を用いて大腸菌K12 RV308細胞を形質転換し、得
られた形質転換体についてプラスミドの単離を行う。適
切な大きさのPvuIIフラグメント（494bp）およびXbaI-B
amHIフラグメント（628bp）を含むプラスミド数個を選
択する。これらの内の少なくとも２つの配列について、
BamHI部位から１つしかないSmaI部位に向かって配列決
定を行い、所望の配列を有する１つのクローンを選択す
る。この中間体プラスミドをプラスミド120と命名す
る。この方法の工程図、ならびにプラスミド120の制限
部位および機能地図を添付の第８図に示す。

EK-BGH−コード化DNAを単離するため、プラスミド120
（約10μｇ）を、制限酵素XbaIおよびBamHIそれぞれを
約50単位含む高−塩緩衝液（200μｌ）中で消化した。
実質的に実施例29A6の方法に従い、得られた消化産物を
アガロースゲル電気泳動で分離し、EK-BGHをコードして
いる〜0.6kb XbaI-BamHI制限フラグメントを単離して連
結反応に備えた。

プラスミドpL32も制限酵素XbaIおよびBamHIで消化
し、〜3.9kb制限フラグメントを単離し、連結反応用に
備えた。実質的に実施例29A2の方法に従って、プラスミ
ドpL32の〜3.9kb XbaI-BamHI制限フラグメントをプラス
ミド120の〜0.6kb XbaI-BamHI制限フラグメントに連結
し、プラスミドpL47を得た。プラスミドpL47の制限部位
および機能地図を添付の第９図に示す。実質的に実施例
29A3の方法と同様にしてプラスミドpL47を大腸菌K12 MO
（λ⁺）に導入し、得られた大腸菌K12 MO（λ⁺）/pL47
形質転換体を同定した。実質的に実施例29A1と同様にし
て形質転換体からプラスミドpL47 DNAを調製した。

8.大腸菌K12 RV308/pPR12AR1の構築 プラスミドpPR12は、温度感受性pLリプレッサー遺伝
子cI857とプラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性付
与遺伝子を含有している。プラスミドpPR12は米国特許
第4,436,815号（1984年３月13日発行）に開示され、特
許請求されている。プラスミドpPR12の制限部位および
機能地図を添付の第10図に示す。

プラスミドpPR12（約10μｇ）を、高−塩緩衝液（200
μｌ）中、制限酵素EcoRI（約50単位）により、37℃で
２時間消化した。このEcoRI消化プラスミドpPR12 DNA
を、実質的に実施例29A5の方法に従って沈澱させ、クレ
ノウ処理した。クレノウ反応の後、EcoRI−消化してク
レノウ処理したプラスミドpPR12 DNAを、実質的に実施
例29A2の方法に従って連結して再環化した。アンピシリ
ン耐性ではなくテトラサイクリン（５μg/ml）耐性に基
づいて選択を行なうこと以外は、実質的に実施例29A3の
方法に従い、所望のプラスミドpPR12ΔR1を構成してい
る連結DNAを用いて大腸菌K12 RV308を形質転換した。大
腸菌K12 RV308は受託番号NRRL B-15624のもとでNRRLか
ら入手可能である。大腸菌K12 RV308/pPR12ΔR1形質転
換体を同定した後、実質的に実施例29A1の方法に従い、
プラスミドpPR12ΔR1 DNAを得られた形質転換体から調
製した。

プラスミドpPR12ΔR1（約10μｇ）を、中−塩緩衝液
（200μｌ）中、制限酵素AvaI（約50単位）により37℃
で２時間消化した。実質的に実施例29A5の方法に従い、
AvaI消化プラスミドpPR12ΔR1 DNAを沈澱させ、クレノ
ウ処理した。クレノウ反応の後、このAvaI消化してクレ
ノウ処理したプラスミドpPR12ΔR1 DNAとEcoRIリンカ
ー:5′‐GAGGAATTCCTC-3′とを実質的に実施例29A2の方
法に従って連結した。このリンカー連結反応の後、得ら
れたDNAを沈澱させ、次いで約50単位の制限酵素EcoRIを
含む高−塩緩衝液（約200μｌ）に再懸濁した。得られ
た反応液を37℃で約２時間インキュベートした。このEc
oRI消化の後、実質的に実施例29A6の方法に従い、反応
混合物をアガロースゲルに供し、〜5.1kbのEcoRI制限フ
ラグメントを精製した。実質的に実施例29A2の方法に従
い、〜5.1kbのEcoRI制限フラグメントを連結して再環化
した。この連結DNAは所望のプラスミドpPR12AR1を構成
していた。アンピシリン耐性ではなくテトラサイクリン
耐性に基づいて選択する以外は、実質的に実施例29A3の
方法に従い、プラスミドpPR12AR1 DNAを用いて大腸菌K1
2 RV308を形質転換した。大腸菌K12 RV308/pPR12AR1形
質転換体を同定した後、実質的に実施例29A1の方法に従
ってプラスミドpPR12AR1 DNAを調製した。プラスミドpP
R12AR1の制限部位および機能地図を添付の第11図に示
す。

9.大腸菌K12 RV308/pL110の構築 プラスミドpPR12AR1 DNA（約10μｇ）を、制限酵素Ps
tIおよびEcoRI（それぞれ約50単位）を含む高−塩緩衝
液（約200ml）に懸濁し、この消化反応物を37℃で約２
時間インキュベートした。次いで、実質的に実施例29A6
の方法に従い、この反応混合物をアガロースゲルに供
し、プラスミドpPR12AR1の〜2.9kb PstI-EcoRI制限フラ
グメントを単離し、連結反応に備えた。

プラスミドpL47（約10μｇ）を、高−塩緩衝液（200
μｌ）中、制限酵素PstIおよびBamHIにより37℃で２時
間消化した。このPstI-BamHI消化DNAを、実質的に実施
例29A6の方法に従ってアガロースゲルにかけ、複製起点
とアンピシリン耐性付与遺伝子の一部とを含有する〜2.
7kbのPstI-BamHI制限フラグメントを単離し、連結反応
に備えた。別の反応系で、プラスミドpL47 DNA（約10μ
ｇ）を、高−塩緩衝液（200μｌ）中、制限酵素EcoRIお
よびBamHIにより37℃で２時間消化し、実質的に実施例2
9A6の方法に従い、新規な転写および翻訳活性化配列とE
K-BGH−コード化DNAを含有する〜1.03kbのEcoRI-BamHI
制限フラグメントを単離し、連結反応に備えた。得られ
た〜1.03kb EcoRI-BamHI制限フラグメント（〜２μｇ）
をプラスミドpL110の構築に使用した。

アンピシリン耐性の代りにテトラサイクリン耐性を用
いて形質転換体を選択する以外は実質上実施例29A2およ
び29A3の方法に従い、プラスミドpL47の〜2.7kb PstI-B
amHI制限フラグメントおよび〜1.03kb EcoRI-BamHI制限
フラグメントを、プラスミドpPR12AR1の〜2.9kb PstI-E
coRI制限フラグメントに連結してプラスミドpL110を構
築し、この連結したDNAを用いて大腸菌K12RV308を形質
転換した。

EK-BGHコード化領域には、添付図面に示す制限部位お
よび機能地図には表わされていない２つのPstI制限酵素
認識部位が存在する。プラスミドpL110の制限部位およ
び機能地図を添付の第12図に示す。

10.大腸菌K12RV308/pL110Cの構築 a.大腸菌K12RV308/pL110Aの構築 プラスミドpL110DNA約１μｇを、10×高−塩緩衝液
［1.0M NaCl、0.50Mトリス−HClpH7.5、0.10M MgCl₂、
および10mMジチオトレイトール］２μｌおよびNdeI酵素
３単位からなる液（総量20μｌ）中、制限酵素NdeIによ
り37℃で１時間消化した。この反応混合物をフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールでDNAを沈殿させ
た。NdeI消化プラスミドpL110DNAを１×クレノウ緩衝液
［40mM KPO₄pH7.5、6.6mM MgCl₂、1.0mM 2−メルカプト
エタノール、33μM dATP、33μM dCTP、33μM dGTP、お
よび33μM TTP］50μｌに溶解した。クレノウとして知
られている大腸菌DNAポリメラーゼＩの大きなフラグメ
ント２μｌ（〜10単位、ニュー・イングランド・バイオ
ラブス（New England Biolabs））を加え、DNAと混合
し、得られた反応物を16℃で１時間インキュベートし
た。フェノール抽出して反応を止め、常法によりDNAを
精製した。次いで、NdeI消化してクレノウ処理したDNA
をT4DNAリガーゼにより４℃で16時間連結（ライゲー
ト）した。得られたDNAを使用し、大腸菌K12株RV308（N
RRL B-15624）を常法により形質転換した。100μg/mlア
ンピシリンを含有するL-寒天平板上で形質転換体を選択
し、バーンボインら（Birnboim and Doly）により記載
されている急速アルカリ抽出法によって耐性コロニーか
らプラスミドを単離した。NdeI部位を欠いているプラス
ミド（第13図に示すpL110A）を選択した。

b.部位特異的突然変異によるファージpL110Bの構築 部位特異的突然変異によってテトラサイクリン耐性付
与遺伝子内のBamHI部位を削除するためのプロトコール
を添付の第13図の右側に示す。

ｂ（ｉ）ファージM13Tc3の構築 プラスミドpL110をテトラサイクリン耐性付与遺伝子
の供給源として使用した。TE緩衝液50μｌ中、プラスミ
ドpL110（約50μｇ）を10×HindIII緩衝液25μｌおよび
水170μｌに加えた。制限酵素HindIII約５μｌ（〜50単
位）をこのプラスミドpL110 DNAの溶液に加え、得られ
た反応物を37℃で２時間インキュベートした。2Mトリス
−HCl（pH7.4）約13μｌ、および制限酵素EcoRI 5μｌ
（〜50単位）をHindIII消化プラスミドpL110 DNAに加
え、得られた反応物を37℃でさらに２時間インキュベー
トした。この反応混合物をTE−飽和フェノールで抽出
し、反応を停止させた（このフェノールはクロロホルム
抽出で除去した）。次いで、EcoRI-HindIII消化プラス
ミドpL110 DNAを沈殿および遠心によって採取し、１％
アガロースゲルに供し、そして大きな〜4.3kb EcoRI-Hi
ndIII制限フラグメントを単離し、精製した。

ファージm13mp18［ニュー・イングランド・バイオラ
ブス］約５μｇをTE緩衝液50μｌに溶解し、次いで既述
のようにHindIIIとEcoRIで消化した。〜7.25kb制限フラ
グメントを単離して精製する以外はpL110に関して記載
した通りに行い、得られたHindIII-EcoRI切断ファージM
13mp18 DNAを精製した。

プラスミドpL110の〜4.3kb HindIII-EcoRIフラグメン
ト約100ngを、10×リガーゼ緩衝液２μｌ、T4 DNAリガ
ーゼ１μｌ（〜100単位）、および水14μｌ中、ファー
ジM13mp18の〜7.25kb HindIII-EcoRIフラグメント約100
ngと混合した。この連結反応物を15℃で1.5時間インキ
ュベートした（得られた連結DNAは所望のファージm13Tc
3を構成していた）。ファージm13Tc3の制限部位および
機能地図を添付の第13図に示す。

大腸菌K12 JM109（この代わりに、ニュー・イングラ
ンド・バイオラブスから入手可能な大腸菌K12 JM101を
使用することもできる）の一夜培養物1mlをＬブロス50m
lに接種し、O.D.₆₆₀が0.3から0.4の間になるまで通気下
37℃でこの培養物をインキュベートした。得られた細胞
を10mM NaCl25ml中に再懸濁し、氷上で10分間インキュ
ベートし、遠心して採取した。この細胞を75mM CaCl₂1.
25mlに再び懸濁し、200μｌの細胞を取り出し、上記で
調製した連結DNA10μｌに加え、氷上で約40分間インキ
ュベートした。次いで、得られた細胞−DNA混合物を42
℃で２分間インキュベートし、種々の量（１、10、およ
び100μｌ）で取り出し、２％Ｘ−ガル50μｌ、100mM I
PTG 50μｌ、および対数増殖期にある大腸菌K12 JM109
200μｌをさらに含有しているトップ寒天［45℃におい
て融解したままである0.5％寒天を含有するＬブロス］3
mlに加えた。次いで、この細胞−トップ寒天混合物を、
40μg/ml X−ガル（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−チオガラクトシド）および0.1mM IPTG
（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含有す
るＬ−寒天平板上にプレートし、得られた平板を37℃で
一晩インキュベートした。

翌朝、青色とは対照的な幾つかのきれいなプラークを
別々にＬブロス2mlに接種し、得られた培養物を通気下3
7℃で２時間インキュベートした。青色が存在しないこ
とは、所望のDNAの挿入が起こっていることを示唆する
ものである。次いで、この培養物を遠心し、得られた上
清200μｌを、通気下37℃で増殖している大腸菌K12 JM1
09の培養物（O.D.₅₅₀＝0.5）10mlに加えた。これらの培
養物を37℃でさらに30分間インキュベートし、次いで遠
心してペレット化し、それが含有している組換えファー
ジの複製体を調製するために使用した。実施例１に記載
した操作法より小規模な変法により、２本鎖の複製型で
あるファージDNAを細胞から単離した。ファージm13Tc3
DNAを含有する形質転換体をそれらファージDNAの制限酵
素分析によって同定した。

ｂ（ii）１本鎖ファージm13Tc3 DNAの調製 大腸菌K12 JM109/m13Tc3の一夜培養物1.5mlを遠心
し、得られたファージml3Tc3を含有する上清100μｌ
を、O.D.₆₆₀＝0.4-0.5である大腸菌JM109の培養物25ml
に接種した。この培養物を通気下、37℃で６時間インキ
ュベートし、次いで培養物を遠心し、得られた上清約20
mlを新しい試験管に移した。この上清に、20％ポリエチ
レングリコール（PEG）6000および14.6％NaClを含有す
る溶液約2mlを加え、次いで氷上で20分間インキュベー
トした。

上清を7000rpmで25分間遠心し、１本鎖ファージm13Tc
3 DNAを含有する得られたペレットをTE緩衝液500μｌ中
に再懸濁した。このDNA溶液をTE飽和フェノールで２
回、さらにクロロホルムで２回抽出した。次いで、酢酸
ナトリウムおよびエタノールを使用して１本鎖DNAを沈
殿させ、遠心した。得られたペレットを70％エタノール
で洗浄し、乾燥し、次いで水60μｌに溶解した。

ｂ（iii）突然変異 突然変異に使用する１本鎖DNAフラグメントは、自動D
NA合成機によって合成した。このフラグメントは、配
列： ５′‐CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3′ を有しており、これは、プラスミドpBR322由来のテトラ
サイクリン耐性付与遺伝子内においてBamHI部位（５′
‐GGATCC-3′）を取り巻く領域とホモローガスである
が、５′末端から２番目（または３′末端から３番目）
のＡ残基はプラスミドpBR322ではＣ残基である。この変
化は、テトラサイクリン耐性付与タンパク質のアミノ酸
組成を変化させないが、BamHI部位を削除させる。

突然変異プライマーおよびM13普遍プライマー［ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（BRL,Bethesda Resea
rch Laboratories,P.O.ボックス6009,ガイセルスベル
ク,MD 20760）］約10ピコモルを、１×キナーゼ緩衝液
（60mM トリス−HClpH7.8、15mM 2−メルカプトエタノ
ール、10mM MgCl₂、および0.41μM ATP）20μｌ中、個
々にT4ポリヌクレオチドキナーゼ10単位（BRL）で37
℃、30分間処理した。得られたキナーゼ処理DNAを以下
に記載した突然変異誘発操作に使用した。

１本鎖ファージm13Tc3（300ng、1.2μｌ）、普遍プラ
イマー１ピコモル（２μｌ）、突然変異プライマー１ピ
コモル（２μｌ）、10×アニーリング緩衝液［100mMト
リス−HClpH7.5、1mM EDTA、および500mM NaCl］３μ
ｌ、および水12.8μｌを共に混合することによって、ア
ニーリング反応を行った。この反応物を80℃で２分間、
50℃で５分間インキュベートし、次いで室温にまで冷却
した。

10×伸長緩衝液［500mMトリス−HClpH8、1mM EDTA、
および120mM MgCl₂］５μｌ、2mM dATP5μｌ、dGTP、dT
TPおよびdCTPの6mMの各溶液１μｌ、クレノウ酵素１μ
ｌ［〜２単位、ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ
（Pharmacia P−L Biochemicals,800センテニアル・ア
ベニュー，ピスカッタウェイ,NJ 08854）］、T4 DNAリ
ガーゼ１μｌ（100単位）、および水17μｌをアニーリ
ングしたDNAの混合物に加えることによって、伸長反応
を行った。この伸長反応物を室温で１時間、次いで37℃
で2.5時間インキュベートした後、４℃で一夜インキュ
ベートした。

TE飽和フェノールで２回、次にクロロホルムで２回抽
出して反応を停止させた。得られたDNAをエタノールお
よび酢酸ナトリウムで沈殿させた。遠心してDNAを採取
し、水50μｌ中に再懸濁し、次いで10×S1緩衝液６μｌ
をDNAの溶液に加えた。

このDNA溶液を等量づつ３つの試験管に分けた。S1ヌ
クレアーゼ約200単位［ミリス・ラボラトリーズ（Miles
Laboratories）］をこれらのうち２つの試験管に加え
た。１つのS1反応物を室温で５分間インキュベートし、
他方を10分間インキュベートした。得られた反応混合物
をTE飽和フェノールで２回抽出することによって反応を
停止させた。このフェノール抽出の後、クロロホルム抽
出を２回行い、次いで酢酸ナトリウムおよびエタノール
を使用して反応混合物からDNAを沈殿させた。未処置のD
NA試料は、ネガティブ対照として利用した。残りの操作
について、S1処置試料をそれぞれ別々に行ったが、同様
の結果が得られた。

得られたDNAペレットを水20μｌ中に再懸濁し、IPTG
またはＸ−ガルを平板に加えないこと以外はファージm1
3Tc3の構築を行った操作に従い、その溶液10μｌを使用
して大腸菌K12 JM109（大腸菌K12 JM101も使用すること
ができる）を形質転換した。

約48個のプラークから得た２本鎖の複製型であるDNA
を既述のように単離し、BamHI制限部位の存在に関して
スクリーニングした。BamHI部位を欠く単離体を、既述
のように１本鎖DNAを調製することによってさらにスク
リーニングした。ジデオキシ配列決定法［スミス（J.H.
Smith）,Methods in Enzymology 65:560-580（1980）］
によって配列決定を行った。所望の単離体をpL110Bと命
名した（第13図）。

c.プラスミドpL110Cの構築 ファージpL110B DNAの複製型約50μｇを、NheI制限酵
素〜50単位を含有する１×NheI緩衝液［50mM NaCl、6mM
トリス−HClpH7.5、6mM MgCl₂、および6mM β−メルカ
プトエタノール］250μｌ中、37℃で２時間消化した。
次いで、5M NaCl5μｌをNheI消化ファージpL110B DNAに
加え、次いでSalI制限酵素５μｌ（〜50単位）を加え
た。この消化を37℃で２時間続行した。次いで、周知の
標準的な方法に従って、テトラサイクリン耐性付与遺伝
子の突然変異領域を含有する所望の〜422bp NheI-SalI
フラグメントをアクリルアミドゲルから単離した。

ファージpL110BをプラスミドpL110Aと置き換える以外
は同一の条件下で、プラスミドpL110A DNAをNheIおよび
SalIで消化した。プラスミドpL110Aの〜6.1kb NheI-Sal
I制限フラグメントをアガロースから精製した。

所望のプラスミドpL110Cは、pL110AおよびpL110BのNh
eI-SalIフラグメント（それぞれ〜6.1kbおよび〜422b
p）の各々100ngを常法により互いに連結することによっ
て構築した。プラスミドpL110Cの制限部位および機能地
図を添付の第13図に示す。所望のプラスミドpL110Cは、
大腸菌内において10μg/mlテトラサイクリンに対する耐
性を付与するが、テトラサイクリン耐性付与遺伝子内で
BamHI部位を欠いている。

11.プラスミドpCZR111の構築 プラスミドpL110Cは、以下の反応を行うことによって
除去されたClaI制限部位を含有している。制限酵素ClaI
および10×ClaI緩衝液［500mM NaCl、100mMトリス−HCl
pH7.9、および100mM MgCl₂］を使用すること以外は実施
例29A2の教示に実質的にしたがい、プラスミドpL110C約
１μｇをClaIで消化した。次いで、４つのdNTPのすべて
でなくdCTPのみを加えること以外は実施例29A5の教示に
実質的にしたがい、ClaI消化DNAをクレノウ処理した。

次いで、DNAを沈殿させ、ムング・ビーン・ヌクレア
ーゼ（Mung Bean Nuclease）緩衝液［50mM酢酸ナトリウ
ム（pH5.0）、30mM NaCl、および1mM ZnSO₄］50μｌ中
に再懸濁した。ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（ニュー
イングランド・バイオラブスから市販されている）１単
位を加え、得られた反応物を30℃で30分間インキュベー
トした。次いで、試験管を氷中に入れ、NaClを0.2Mにな
るまで加えた後、その混合物をフェノール／クロロホル
ムで抽出し、エタノール沈殿し、10mMトリス−HClpH8.0
に再懸濁した。次いで、実施例29A3および29A4の教示に
実質的にしたがって、DNAを自己連結させ、大腸菌細胞
に導入した。得られたプラスミドをpCZR111と命名し
た。

12.プラスミドpCZR126Sの構築 プラスミドpCZR111約26μｇを以下のようにXbaIで消
化した。10×XbaI緩衝液の組成は、600mMトリス−HCl、
100mM MgCl₂、1M NaCl、および10mM 2−メルカプトエタ
ノールpH7.5（37℃）である。プラスミドpL110約25μｇ
を含有する水250μｌに10×XbaI緩衝液50μｌ、XbaI15
μｌ（10単位／μｌ）、および水185μｌを加えた。消
化反応を37℃で１時間行った。次いで、XbaI消化pL110
をフェノールで抽出し、1/10容量の3M酢酸ナトリウム、
３容量のエタノールを加え、得られた混合物をドライア
イス−エタノール浴中で５分間インキュベートし、次い
で遠心した。沈殿したDNAを水50μｌに再懸濁した。

XbaI消化プラスミドpCZR111を以下のようにしてBamHI
で消化した。上記のようにして得たXbaI消化pL110 50μ
ｌに、BamHI 0.2μｌ（10単位／μｌ）、BamHI緩衝液
［100mMトリス−HCl、50mM MgCl₂、1M NaCl、および10m
M 2−メルカプトエタノール、pH8.0（37℃）］10μｌ、
および水90μｌを加えた。37℃で５分間消化を行った。
消化pCZR111をフェノールで抽出し、1/10容量の酢酸ナ
トリウムを加えた後、３容量のエタノールを加えた。沈
殿したDNAを10mMトリス、1M EDTApH8.0緩衝液50μｌ中
に再懸濁した。

次いで、XbaIおよびBamHI消化pCZR111をアガロースゲ
ルに供し、約5.8kbのDNAバンドを単離した。pCZR111の
〜5.8kbフラグメントを、XbaI-NdeIリンカー、および
５′末端にNdeI部位を含有して３′末端にBamHI部位を
含有するEK−ウシ成長ホルモンをコードしている合成遺
伝子と連結することによって、プラスミドpCZR126Sを調
製した。XbaIからNdeIまでの配列は標準的なオリゴヌク
レオチド配列法により調製し、それは以下の配列を有し
ている： この配列は、両鎖を化学的に合成した後、ハイブリダ
イゼーションするように混合することによって構築し
た。EK bGHをコードしている遺伝子は、全遺伝子の相補
性鎖の両方を一緒に含有している、71から83ヌクレオチ
ドの長さを有する16個の化学的に合成された１本鎖DNA
片から構築した。この合成は、アプライド・バイオシス
テムズ（ABS）機器を使用して行い、それは以下の配列
を有するものである： プラスミドpCZR126Sの構築は、以下の部位成分を連結
することによって行った： XbaIで完全消化してBamHIで部分消化した後のプラスミ
ドpL110から得た5.8kbフラグメント〜0.28μｇ（総量２
μｌ）、XbaI部位に相当する５′末端を有し、BamHI部
位に相当する３′末端を有しているウシ成長因子誘導体
をコードしている合成遺伝子〜0.18μｇ（総量2.5μ
ｌ）、および化学的に合成したXbaI-NdeIリンカー8.75
ピコモル（１μｌ）。これらのプラスミド成分を、５×
連結緩衝液［250mMトリス−HCl、50mM MgCl₂、5mM AT
P、5mM DTT、25％v/vポリエチレングリコール8,000、pH
7.6］６μｌ、リガーゼ２μｌ、および水16.5μｌに加
えた。この連結混合物を16℃で一夜インキュベートし
た。次いで、実施例29A3の方法に実質的にしたがって、
環化したプラスミドpCZR126Sを使用して大腸菌RV308細
胞を形質転換した。プラスミドpCZR126Sの制限部位およ
び機能地図を添付の第14図に示す。

B.ヒト・プロインスリン発現プラスミドpRB172の構築 1.プラスミドpRB145の構築 ヒトプロインスリン遺伝子をまず常法により合成し、
PUC18プラスミド（BRLから市販されている）にクローン
した。この遺伝子の合成は標準的な方法で行い、それは
以下の配列を有している： 正しい配列を有する１つのクローンを選択し、塩化セシ
ウム精製したDNAを調製した。標準的な方法［たとえ
ば、モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・
マニュアル（1982），マニアチスら（Maniatis,T,Frits
ch,E.F.およびSambrook,J.）編，コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー・パブリケイションズ，ニュ
ーヨーク］によってプラスミドを単離した。このプラス
ミドDNA約６μｌ（20μｇ）を10×NdeI緩衝液［150mm N
aCl、10mMトリス−HClpH7.8、6mM MgCl₂、6mM 2−メル
カプトエタノール、100μg/ml BSA］20μｌ、NdeI制限
酵素５μｌ（〜40単位）、および水169μｌに加えた。
混合した後、この反応物を37℃で２時間インキュベート
した。0.3M酢酸ナトリウムの混合物を調製し、３容量の
エタノールを加えて混合することによってDNAを沈殿さ
せ、−70℃に冷凍し、遠心した。得られたDNAペレット
を70％エタノール（1ml）で洗浄し、乾燥し、10×BamHI
緩衝液［150mm NaCl、6mMトリス−HClpH7.9、6mM MgC
l₂、100μg/ml BSA］20μｌ、BamHI制限酵素２μｌ（40
単位）、および水178μｌに溶解した。穏やかに混合し
た後、反応物を37℃で２時間インキュベートした。上記
のようにして３容量のエタノールを使用し、DNAを再び
沈殿させ、１％低融解アガロースゲル［FMC、シー・プ
ラーク・アガロース（sea plaque agarose）］の電気泳
動にかけた。約270bpに相当する所望のDNAフラグメント
をそのゲルから切除した後、本編者によって推奨されて
いる操作にしたがって、アガロースを溶融してElutip-d
カラム［Schleicher ＆ Schuell,Keene,N.H.］に通すこ
とによりDNAを回収した。沈殿させて乾燥した後、得ら
れたDNAを10mMトリス−HCl（pH8.0）30μｌ中で保存し
た。

プラスミドpCZR126S（実施例29A12から入手）約15μ
ｇを10×NdeI緩衝液20μｌ、NdeI制限酵素５μｌ（40単
位）、および水175μｌに懸濁し、穏やかに混合し、37
℃で２時間インキュベートした。インキュベートした
後、上記のようにしてDNAを３容量のエタノールで沈殿
させ、乾燥した後、10×BamHI緩衝液20μｌ、BamHI制限
酵素２μｌ（40単位）および水178μｌ中に再懸濁し
た。穏やかに混合した後、反応物を37℃で２時間インキ
ュベートした。再び、３容量のエタノールを使用してDN
Aを沈殿させ、１％低融解アガロースゲルの電気泳動に
かけた。ベクターDNAに相当する大きい方のフラグメン
トをそのゲルから切除し、既述のようにElutip-dカラム
操作によってDNAを回収した。ベクターDNAを沈殿させて
乾燥した後、10mMトリス−HCl（pH8.0）35μｌ中で保存
した。

このベクターDNA約2.5μｌを、上記で得た精製ヒトイ
ンスリン遺伝子フラグメント12μｌ、10mM ATP4μｌ、1
Mジチオトレイトール0.5μｌ、10×リガーゼ緩衝液［50
0mMトリス−HClpH7.6、および100mM MgCl₂］５μｌ、水
26μｌ、およびT₄‐DNAリガーゼ［ファルマシア、3.5単
位］0.5μｌと混合した。この反応物を４℃で16時間イ
ンキュベートした。得られた連結混合物を10mMトリス−
HClpH7.6（50μｌ）および1M CaCl₂３μｌで希釈し、続
いて実施例29A3の教示に実質的にしたがって大腸菌K12
RV308に導入した。得られた細胞を、５μg/mlテトラサ
イクリンを含有するTY平板上にプレートし、次いで32℃
で一夜インキュベートした。

モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マ
ニュアル［（1982），マニアチスら（Maniatis,T,Frits
ch,E.F.およびSambrook,J.）編，コールド・スプリング
・ハーバー・パブリケイションズ，ニューヨーク］（36
8-369頁）に記載されている急速アルカリ抽出法によっ
てテトラサイクリン耐性コロニーから、培養物3ml中の
プラスミドを単離した。ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を利用したミニスクリーン法によりXbaI/BamHI消化フ
ラグメントを分析し、正しいプロインスリン遺伝子フラ
グメントの存在を見いだした。正しい大きさ（約315b
p）の挿入体を有するプラスミドを選択し、増幅して精
製した。ヒトプロインスリン遺伝子を含有するプラスミ
ドはpRB145であった。プラスミドpRB145の制限部位およ
び機能地図を添付の第16図に示す。

2.プラスミドpRB164Aの構築 プラスミドpRB145（約30μｇ）を10×NdeI緩衝液20μ
ｌ、NdeI制限酵素［ニューイングランド・バイオラブ
ス、40単位］５μｌ、および水175μｌに懸濁し、穏や
かに混合して37℃で１時間インキュベートした。次い
で、BamHI制限酵素２μｌ［ニューイングランド・バイ
オラブス、40単位］を反応混合物に加え、37℃でさらに
２時間インキュベートした。３容量のエタノールおよび
0.3M酢酸ナトリウムを使用してDNAを沈殿させ、１％低
融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。ヒトプロイン
スリン遺伝子をコードしている小さい方のNdeI/BamHI制
限フラグメント（約270bp）をそのゲルから切除した
後、既述のようにしてElutip-dカラムに通すことによっ
てDNAを回収した。沈殿させて乾燥した後、得られたDNA
を10mMトリス−HCl（pH8.0）30μｌ中に保存した。

次いで、このDNA（30μｌ）に、10×AvaII緩衝液［50
mM NaCl、6mMトリス−HClpH8.0、10mM MgCl₂、6mM 2−
メルカプトエタノール、100μg/mlBSA］20μｌ、AvaII
制限酵素５μｌ（ニューイングランド・バイオラブス、
20単位）、および水175μｌを加えた。穏やかに混合し
た後、この反応物を37℃で２時間インキュベートした。
３容量のエタノールおよび3M酢酸ナトリウム（20μｌ）
でDNAを沈殿させた後、1.2％低融解アガロースゲルの電
気泳動にかけた。大きい方のAvaII/BamHI制限フラグメ
ント（約156bp）をそのゲルから切除し、次いで既述の
ようにElutip-dカラムに通してDNAを回収した。沈殿さ
せて乾燥した後、得られたDNAを10mMトリス−HCl（pH8.
0）30μｌ中で保存した。

ヒトプロインスリン遺伝子のNdeI/AvaII制限フラグメ
ントに相当するDNA（〜115bp）を合成的に調製した。最
初の工程は、DNA合成機［アプライド・バイオシステム
ズの380B型］による４つの１本鎖デオキシリボオリゴヌ
クレオチドの合成である。これら４つのオリゴヌクレオ
チドのヌクレオチド配列を以下に示す： 1.TATGCGTATGTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGA
AGCTCTGTACCT（60mer） 2.GGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCAAGCCGACCCGCCGTGA
GGCAGAG（55mer） 3.CACCAGGTACAGAGCTTCCACCAGGTGGGAGCCGCACAGGTGTTGGTT
AACAAACATACGCA（62mer） 4.GTCCTCTGCCTCACGGCGGGTCGGCTTGGTGTAGAAGAAGCCACGTTC
ACCGCA（54mer） ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって各オリゴヌ
クレオチドを精製した後、ブラウンら［Brown,E.L.、Be
lagaje,R.、Ryan,M.J.、およびKhorana,H.G.］のMethod
s in Enzymology,Wu,R.編，アカデミック・プレス，ニ
ューヨーク，68,109-151（1979）の教示にしたがって、
オリゴヌクレオチド２および３をリン酸化した。次い
で、このリン酸化したオリゴヌクレオチド２および３
（各〜715ピコモル）をオリゴヌクレオチド１および２
（〜860ピコモル）と混合してアニーリングし、50mMト
リス−HClpH7.6、10mM MgCl₂、10mM DTT、50μM ATP、
およびT₄DNAリガーゼ（ファルマシア）20単位を含有す
る緩衝液200μｌ中において４℃で16時間連結した。こ
の連結産物を15％ポリアクリルアミドゲルで精製した。
電気泳動によって得られたゲル切片からDNAを回収し、
次いでセファデックスG-50カラムで脱塩化した。所望の
連結産物の収量は485ピモコルであった。

ブラウンらのMethods in Enzymology,68,109-151（19
79）に記載されているように、50mMトリスpH7.6、10mM
MgCl₂、10mM DTTおよびATPを含有する緩衝液50μｌ中に
おいて、このDNA約100ピコモルをリン酸化した。セファ
デックスG-50のカラムで濾過した後、得られたDNAを10m
MトリスpH8.0（50μｌ）中で保存した。

50mMトリスpH7.6、10mM MgCl₂、10mM DTT、800μM AT
P、およびT₄DNAリガーゼ3.5単位を含有する緩衝液50μ
ｌ中で構築したばかりのNdeI/AvaII合成リンカー10μｌ
（10ピコモル）、およびプラスミドpRB145から得たAvaI
I/BamHI制限フラグメント18μｌと、得られたベクターD
NA（NdeI-BamHI消化pCZR126S）約2.5μｌとを混合し
た。この反応物を４℃で一晩インキュベートし、次いで
実施例29A3の操作法にしたがって大腸菌K12 RV308に導
入した。所望の形質転換体である大腸菌K12 RV308/pRB1
64AをそのプラスミドDNAの分析によって同定した。適切
な形質転換体を、５μg/mlテトラサイクリンを含有する
TY培地中、30℃で、O.D.₅₅₀が約0.2（対数期の初期）に
なるまで増殖させ、次いで３から3.5時間かけて42℃に
変更し、ヒトプロインスリンの合成を誘導した。細胞を
ペレット化し、試料緩衝液［0.125Mトリス−HClpH6.8、
２％SDS、30％グリセロール、1M 2−メルカプトエタノ
ール、6M 尿素］を滴加して溶菌した。アクリルアミド
ゲルにかける前に、この試料を97℃に２分間加熱した。
コオマッシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie Bril
liant Blue）色素の染色により、バンドは容易に検知さ
れた。スキャンニング・ゲル密度測定器を使用して細胞
タンパク質の百分率を定量化した。プラスミドpRB164A
の制限部位および機能地図を添付の第17図に示す。

3.プラスミドpRB172の構築 プラスミドpRB145（約25μｇ）を、10×DraIII緩衝液
［200mM NaCl、50mMトリス−HClpH7.5、10mM MgCl₂、1m
M DTT、10μg/ml BSA］15μｌ、DraIII制限酵素［ベー
リンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、27単
位］６μｌ、および水129μｌに懸濁し、穏やかに混合
して37℃で６時間インキュベートした。インキュベート
後、DNAを沈殿させて乾燥し、10×XbaI緩衝液［150mM N
aCl、6mMトリス−HClpH7.9、6mM MgCl₂、7mM 2−メルカ
プトエタノール、100μg/ml BSA］10μｌ、XbaI制限酵
素［ベーリンガー・マンハイム、36単位］３μｌ、およ
び水77μｌ中に再懸濁した。得られた反応物を穏やかに
混合し、37℃で４時間インキュベートした。３容量のエ
タノールおよび酢酸ナトリウムを使用してDNAを再び沈
殿させ、１％低融解アガロースゲルの電気泳動にかけ
た。ヒトプロインスリン遺伝子のXbaI/DraIII制限フラ
グメント（約85bp）に相当する下方のバンドをそのゲル
から切除し、Elutip-dカラム操作によってDNAを回収し
た。沈殿させて乾燥した後、得られたDNAを10mMトリス
−HCl（pH8.0）30μｌ中に保存した。

既述のようにしてプラスミドpRB164A約15μｇを制限
酵素DraIIIおよびXbaIで切断した。Elutip-dカラム操作
法によってアガロースゲルからXbaI/DraIIIベクターフ
ラグメントに相当する上方のバンドを単離した。沈殿さ
せて乾燥した後、得られたDNAを10mMトリス−HCl（pH8.
0）30μｌ中に保存した。

XbaI/DraIII消化pRB164AベクターDNA約５μｌを、50m
Mトリス−HClpH7.6、10mM MgCl₂、10mM DTT、800μM AT
P、およびT₄DNAリガーゼ６単位を含有する緩衝液50μｌ
中、プラスミドpBR145から得たXbaI/DraIII制限フラグ
メント５μｌと混合した。この反応物を４℃で一晩イン
キュベートし、標準的なCaCl₂処置によってコンピーテ
ントにした大腸菌K12/RV308に導入した。

５μg/mlテトラサイクリンを含有するTY寒天平板上で
形質転換体を選択した。急速アルカリ抽出法によってテ
トラサイクリン耐性コロニーからプラスミドを単離し、
XbaIおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼによって分析
した。シークエンスシステム（米国バイオケミカルズ）
を使用し、陽性コロニーから得たDNAの配列決定を行っ
た。正しい所望の配列を有するプラスミドを選択し、増
幅して精製した。このようにして、大腸菌K12/RV308/pR
B172形質転換体を単離した。ヒトプロインスリンの発現
および蓄積を担うこのプラスミドを、15％ポリアクリル
アミドマトリックスの電気泳動分離にかけた後、総細胞
内タンパク質を視覚化することによって分析した。プラ
スミドpRB172の制限部位および機能地図を添付の第18図
に示す。

C.大腸菌RV308/pRB173およびpRB174の構築 プラスミドpRB172またはpRB145（約20μｇ）を10×Xb
aI緩衝液［150mM NaCl、6mMトリス−HClpH7.9、6mM MgC
l₂、7mM 2−メルカプトエタノール、100μg/ml BSA］20
μｌ中に懸濁し、XbaI制限酵素２μｌ（ベーリンガー・
マンハイム、24単位）を加え、穏やかに混合し、37℃で
４時間インキュベートした。インキュベート後、DNAを
沈殿させ、乾燥し、10×BamHI緩衝液［100mM NaCl、10m
Mトリス−HClpH8.0、5mM MgCl₂、1mM 2−メルカプトエ
タノール、100μg/ml BSA］10μｌ、BamHI制限酵素ベー
リンガー・マンハイム５μｌ（40単位）、および水75μ
ｌ中に懸濁した。この反応物を穏やかに混合し、37℃で
４時間インキュベートした。再び、DNAをエタノールお
よび酢酸ナトリウムで沈殿させ、１％低融解アガロース
ゲルの電気泳動にかけた。ヒトプロインスリン遺伝子に
相当するXbaI/BamHI制限フラグメント（約320bp）を、E
lutip-dカラム操作法によってゲルから単離した。沈殿
させて乾燥した後、10×XmaI緩衝液［25mM NaCl、10mM
トリス−HClpH7.5、10mM MgCl₂、10mM 2−メルカプトエ
タノール、100μg/ml BSA］20μｌ、XmaI制限酵素10μ
ｌ（ニューイングランド・バイオラブス、10単位）、お
よび水170μｌ中に再懸濁した。この反応物を穏やかに
混合し、37℃で４時間インキュベートした。インキュベ
ート後、DNAをエタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿
させ、１％低融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。
XbaI/XmaI制限フラグメント約200bpに相当する比較的大
きなDNAをゲルから切除し、既述のようにしてElutip-d
カラムからDNAを回収した。得られたDNAを10mMトリス−
HCl（pH8.0）30μｌ中で保存した。

ヒトプロインスリン遺伝子のXmaI/BmaHI制限フラグメ
ントに相当するDNA（51bp）を以下のようにして合成的
に調製した。アプライド・バイオシステムズDNA合成機3
80B型によって、２つの１本鎖デオキシリボオリゴヌク
レオチド： CCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAG
TAG（51mer）、および GATCCTACTGCAGGGAACCCTCCAGGGCCAGCGGCTGCAGGCTGCCTG
CAC（51mer） を合成し、7M尿素の存在下にポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によって精製した。単離した後、ブラウンら
［Brown,E.L.、Belagaje,R.、Ryan,M.J.、およびKhoran
a,H.G.］のMethods in Enzymology,Wu,R.編集，アカデ
ミック・プレス，ニューヨーク，68,109-151（1979）の
教示にしたがって、この２つのオリゴヌクレオチドをリ
ン酸化してアニーリングし、所望のリンカーを作成し
た。

プラスミドpCZR126S［実施例29A12から得た］約10μ
ｇを、10×XbaI緩衝液［150mM NaCl、6mMトリス−HClpH
7.9、6mM MgCl₂、7mM 2−メルカプトエタノール、100μ
g/ml BSA］20μｌ、XbaI制限酵素［ベーリンガー・マン
ハイム、24単位］２μｌ、および水178μｌに懸濁し
た。この反応物を穏やかに混合し、37℃で２時間インキ
ュベートした。インキュベートした後、5M NaCl 4μ
ｌ、およびBamHI制限酵素［ニューイングランド・バイ
オラブス、20単位］２μｌを加え、37℃でさらに２時間
インキュベートした。次いで、エタノールおよび酢酸ナ
トリウムを用いた標準的な方法によってDNAを沈殿さ
せ、１％低融解アガロースゲルの電気泳動にかけた。Xb
aI/BamHIベクターDNAに相当する上方のバンドをElutip-
dカラムによって単離した。沈殿させて乾燥した後、得
られたDNAを10mMトリス−HCl（pH8.0）30μｌ中に保存
した。

XbaI/BamHI消化したpCZR126SベクターDNA約５μｌ
を、50μＭトリスpH7.6、10mM MgCl₂、10mM DTT、800μ
M ATP、およびT₄DNAリガーゼ６単位を含有する緩衝液50
μｌ中、前記のように調製したキナーゼ処理化XmaI/Bam
HIリンカー４μｌおよびプラスミドpRB145またはpRB172
から得たXbaI/XmaI制限フラグメント10μｌと混合し
た。この反応物を４℃で一晩インキュベートし、これを
用い、実施例29A3の操作法にしたがって大腸菌K12/RV30
8株を形質転換した。所望の形質転換体である大腸菌K12
RV308/pRB173（pRB172ベクターフラグメントから調製
した場合）、および大腸菌K12 RV308/pRB174（pRB145ベ
クターフラグメントから調製した場合）を、それらのプ
ラスミドDNAの分析、および42℃のインキュベートの前
後におけるタンパク質産生によって分析した。プラスミ
ドpRB173の制限部位および機能地図を添付の第19図に示
す。

mini-prepから入手したプラスミドDNA約200ngを大腸
菌L201細胞に導入し、得られた形質転換体を、15μg/ml
テトラサイクリンを含有する２×TY寒天平板上で選択し
た。この形質転換体から発現されたタンパク質を分析
し、ヒトプロインスリンの産生によって所望の形質転換
体を確認した。これにより、大腸菌L201/pRB173および
大腸菌L201/pRB174が単離された。

D.大腸菌K12 RV308/pRB175、pRB176、pRB177、およびpR
B178の構築 プラスミドpRB172（約12μｇ）を、10×NdeI緩衝液
［100mM NaCl、50mMトリス−HClpH7.5、10mM MgCl₂、1m
M DTT、100μg/ml BSA］15μｌ、NdeI制限酵素（20単
位）2.5μｌ、および水133μｌに懸濁した。この反応物
を穏やかに混合して37℃で一晩インキュベートした。イ
ンキュベート後、標準的な操作によってエタノールおよ
び酢酸ナトリウムでDNAを沈殿させ、乾燥し、10×DraII
I緩衝液［200mM NaCl、50mMトリス−HClpH7.5、10mM Mg
Cl₂、1mM DTT］15μｌ、DraIII制限酵素［20単位］５μ
ｌ、および水130μｌに再懸濁した。穏やかに混合した
後、得られた反応物を37℃で一晩インキュベートした。
前記のようにしてエタノールおよび酢酸ナトリウムでDN
Aを再度沈殿させ、１％低融解アガロースゲルの電気泳
動にかけた。所望の比較的大きな制限フラグメントをゲ
ルから切除し、Elutip-dカラム操作によってDNAを回収
した。得られたDNAを10mMトリス−HCl（pH8.0）30μｌ
中で保存した。

アプライド・バイオシステムズDNA合成機（380B型）
によって、以下のDNAリンカーを化学的に合成した： ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって各オリゴ
ヌクレオチドを精製した後、ヒトプロインスリン類似体
遺伝子をコードしているDNAフラグメントを連結して構
築するために、既述の教示にしたがってそれらをリン酸
化し、アニーリングした。上記リンカー（ｉ）から（i
v）を使用し、それぞれプラスミドpRB175、pRB176、pRB
177、およびpRB178を構築した。

NdeI/DraIII消化したpRB172ベクターDNAフラグメント
約３μｌを、50μＭトリス−HClpH7.6、10mM MgCl₂、10
mM DTT、800μM ATP、およびT₄DNAリガーゼ６単位を含
有する緩衝液50μｌ中、キナーゼ処理した別々のリンカ
ー（i-iv）それぞれ４μｌと混合した。この反応物を４
℃で一晩インキュベートし、実施例29A3の操作法に従
い、得られた混合物を使用して大腸菌K12 RV308細胞を
形質転換した。所望の形質転換体である大腸菌K12 RV30
8/pRB175、大腸菌K12 RV308/pRB176、大腸菌K12 RV308/
pRB177、および大腸菌K12 RV308/pRB178を、それらのプ
ラスミドDNAの分析、および42℃においてそれらの細胞
をインキュベートした前後におけるタンパク質産生によ
って分析した。プラスミドpRB175の制限部位および機能
地図を添付の第20図に示す。

E.大腸菌K12 RV308/pRB172のストック・カルチャーの永
久ストック・カルチャーへの変換 単離したコロニーを、以下の表現型平板にスポットす
る：表現型平板−Ｌ−寒天＋５μg/mlTc（テトラサイク
リン）、Ｌ−寒天＋Sm（硫酸ストレプトマイシン）、Ｍ
−９培地寒天（MgSO₄、チアミン、HYCASEおよびグルコ
ースを含有する塩基準培地（salt based medium））、
およびグルコースを含有せずにラクトースを含有するＭ
−９培地寒天。１つのＬ−寒天/Tc平板を42℃でインキ
ュベートし、得られた平板を30℃で24時間インキュベー
トする。30℃Ｌ−寒天/Tc平板から選択した表現型の正
しいコロニーを使用し、５μg/ml Tc培地を加えたＬ−
ブロス（トリプトン、酵母エキス、NaClおよびグルコー
スを含有）50mlのフラスコに接種する。このフラスコを
振盪下に30℃で７時間インキュベートする。フラスコ中
の物質（1.2ml）を生物冷凍バイアルに分散させ、気相
液体窒素中で冷凍させる。次いで、その物質を解凍し、
その1mlを使用して、５μg/ml Tcを含有するＬ−ブロス
50mlを入れたフラスコ中に接種する。そのフラスコを振
盪下に30℃で４時間インキュベートする。その1mlを、B
G-7培地（MgSO₄、チアミン、グルコース、Tcおよび微量
塩を含有する）500mlを入れた２つのフラスコそれぞれ
に接種し、振盪下に30℃で９時間インキュベートする。

クエン酸、硫酸鉄アンモニウム、K₂HPO₄、NH₄Cl、NaH
₂PO₄、CaCl₂、MgSO₄、グルコース、および微量無機塩を
含有する培地80リットルを入れた150リットル容量発酵
槽に、上記で得たBG-7培地ブロス１リットルを接種す
る。この発酵槽は、二酸化炭素の放出速度が1.0mM/L/分
になるまで30℃で操作する。この時点で、ブロス50リッ
トルを生産発酵槽に移し、細胞接種物を得る。

150リットル容量発酵槽で使用したものと同一の培地1
500リットルを含有する2500リットル容量発酵槽を、二
酸化炭素の放出速度が1.0mM/L/分になるまで30℃で操作
し、次いで温度を40℃に上昇させる。この操作をさらに
８時間行う。次いで、得られたブロスを61℃で７時間熱
不活化する。この熱不活化ブロスから以下の収量データ
を得た：細胞収量−13.1g/L乾燥重量、産物効力−デス
−ホルミレート273μg/ブロスml、比活性（たとえば、
産物g/細胞ｇ）−2.1％、ホルミル化産物％−13％。

発酵ブロスをステンレス鋼製保持タンクに移し、温度
を２℃から８℃に維持する。次いで、全ブロスを遠心ま
たは濾過し、大腸菌細胞を採取して固体乾燥重量を約15
から20％にする。この採取した細胞固形物を加工水中で
再度スラリー化する。次いで、高圧ホモジナイズまたは
他の適当な方法によって細胞を粉砕し、細胞の溶菌率を
90から99％にする。ホモジナイズしたスラリーを加工水
で５％乾燥重量にまで希釈する。この希釈粉砕細胞スラ
リーのpHを水酸化ナトリウムを添加して７から10に調節
する。分画遠心によって封入体（顆粒）を細胞残骸から
分離する。得られる濃縮物は15から20％の固形物であ
る。

その封入体をシステインおよび尿素の存在下、アルカ
リ性pHで可溶化する。顆粒物質の固まりから混合ジスル
フォド形態のプロインスリン類似体を分割するため、可
溶化顆粒をSPセファロース−スーパーフローの陽イオン
変換クロマトグラフィーにかける。

プロインスリン類似体のアミノ末端のメチオニル−チ
ロシン伸長は、ジペプチジルアミノペプチダーゼである
カセプシンＣ（cathepsin C）、と共にインキュベート
することによって除去される。このカセプシン開裂反応
は、カリウム・テトラチオネートおよびシステインpH8.
8によるスルフィトリシスによって終止する。セファデ
ックスG-25による溶媒変換を行った後、得られたプロイ
ンスリン類似体のＳ−スルホネートをシステインの存在
下にpH10.6でインキュベートして折り畳む。この折り畳
み反応をpH2.4に調節してクエンチする。適切に折り畳
まれたプロインスリン類似体を、適切に折り畳まれてい
ない物質、およびSP20SS樹脂の疎水性相互作用クロマト
グラフィーによるカセプシンＣ開裂工程により残ってい
る混入物から分割する。アセトンのグラジエントに沿っ
て分離されるので、以後の処理を行う前に留去してその
有機溶媒を主流プールから除去しなければならない。

有機溶媒を留去した後、適切に折り畳まれたプロイン
スリン類似体をトリプシンおよびカルボキシペプチダー
ゼＢと共にインキュベートする。これらの酵素はプロイ
ンスリン類似体のＣペプチドを切除し、Lys（B28）、Pr
o（B29）ヒトインスリンを生成させる。このインスリン
類似体をＳ−セファロースの陽イオン変換クロマトグラ
フィーにかけた後、10μm C−８樹脂の高速逆相クロマ
トグラフィーにかけることによってさらに精製する。セ
ファデックスG-25に溶媒変換を施すことによってアセト
ニトリルをこの逆相の主流から除去し、得られた物質を
らせん巻限外濾過システムによって濃縮する。濃縮した
物質をセファデックスG-50樹脂のサイズ排除クロマトグ
ラフィーにかけ、凍結乾燥する。

以下の第２表に、既述した実施例にかかる化合物のア
ミノ酸分析の結果を示す。

本発明のインスリン類似体の生理学的効果を以下のイ
ンビボ検定システムによって試験した。

カールス・リバー・ラボラトリーズ（Charles River
Laboratories,ポーテイジ,MI）から入手した正常のスプ
ラーク・ダウリー（Sprague Dawley）雄性ラットを試験
動物として使用した。体重は160-180gであり、制御した
照明サイクル［午前７時−午後７時は照射（照明オ
ン）、午後７時−午前７時は暗闇（照明オフ）］の条件
下、75゜Fの動物室で１週間維持した。動物には、食事と
して、プリナ・ラット・チュー（Purina rat chow）500
1を自由に摂らせた。各検定で使用した動物は、使用前1
6時間絶食させた。最初に使用する時、体重は約200gで
あった。絶食させたときの体重が約275g（３週間）の場
合には、その動物を使用しなかった。10匹の雄性ラット
の１群を使用し、毎日、各試験化合物［すなわち、生合
成ヒトインスリン、ブタインスリン、およびヒトインス
リン類似体］を与えた。各群は、１週間に１回だけ使用
した。この10匹をそれぞれ５匹づつの群に分けた。１つ
の群は対照としてビヒクルのみを皮下投与した。他方の
５匹の群には試験すべき化合物を投与した。これらのタ
ンパク質を0.05N塩酸（pH1.6）に溶解し、1ml当たり100
μｇの保存溶液を調製した。この保存溶液から、普通の
生理食塩水中、多くの希釈液を調製し、ラットに皮下注
射する。投与後０時、30分、１時間、３時間、および４
時間の時点に、各ラットの尾静脈から血液試料100μｌ
を採血した。グルコースオキシダーゼ法［シグマ・ケミ
カル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）］によってグ
ルコースを比色分析で測定した。血中グルコースの０時
値に対する変化％を各ラットについて計算し、最終結果
をその試験日における対照群の平均変化について補正し
た各実験群の平均変化％±SEMとして表した。

特定の時間（通常、タンパク質投与後１または２時
間）における最大応答を使用し、試験した化合物の４か
ら７つの異なる濃度で試験した結果から用量作用曲線を
描いた。この曲線から、最大の低血糖性応答の半分を与
えるタンパク質の皮下投与量（μg/kg）をED₅₀値として
求めた。得られた結果を次の第３表に示す。

既述したように、本発明のインスリン類似体は、二量
体化する、またはそうでなくても自己会合して高分子量
体になる傾向が減少されている。したがって、１つまた
はそれ以上の本発明類似体を投与すると、活性が急速に
現れる。本発明のインスリン類似体は、それを必要とし
ている患者に式（Ｉ）で示されるインスリン類似体の有
効量を投与することによって高血糖症を処置する上で有
効である。本明細書中で使用している「有効量」なる用
語は、糖の血中レベルを治療的または予防的に低下また
は維持させるのに必要とされる、１つまたはそれ以上の
本発明のインスリン類似体の量を意味する。この量は通
常、１日当たり約10単位から約60単位であればよい［ま
たは1mg当たり約29単位と推定して約0.3から約2mgであ
る］。しかし、実際投与するインスリン類似体（群）の
量は、処置する状態（すなわち、高血糖症の原因）、投
与する具体的な類似体、選択する腸管外の投与経路、個
々の患者の年令、体重および応答性、ならびに患者の症
状の重篤度など、関連する状況に照らして臨床医によっ
て決定されるものであることは理解すべきである。した
がって、上記投与量の範囲は、あらゆる意味においても
本発明の限定を意図するものでない。

本発明のインスリン類似体はそれを必要としている患
者（すなわち、高血糖症に罹患している患者）に投与す
るに当たり、少なくとも１つの式（Ｉ）で示されるイン
スリン類似体の有効量を１つまたはそれ以上の製薬的に
許容され得る賦形剤、または担体と共に含有している医
薬組成物として投与する。この目的には、通常、有効量
のインスリン類似体（群）を1ml当たり約100単位、また
はそれよりも小さい濃度となるように含有する医薬組成
物を製剤化すればよい。これらの組成物は、必須ではな
いが腸管外投与するのが通常であり、当業界周知の腸管
外製品のための通常の賦形剤または担体を使用する各種
の方法のいずれの方法によっても製造することができ
る。たとえば、Remington′s Pharmaceutical Science
s,17版，マック・パブリッシィング・カンパニー，米
国,PA,イーストン（1985）を参照のこと。たとえば、腸
管外投与のための投与剤形は、少なくとも１つの式
（Ｉ）で示されるインスリン類似体の所望の量を注射に
適した水性媒質などの無毒性の液状ビヒクルに懸濁また
は溶解し、そして得られた懸濁液または溶解液を滅菌す
ることによって調製することができる。あるいは、測定
した化合物の量をバイアルに入れ、そのバイアルおよび
内容物を滅菌して封栓してもよい。ここに付随するバイ
アルまたはビヒクルは、投与前の混合を目的として得る
ことができる。腸管外投与に適した医薬組成物には、水
および水混和性有機溶媒、たとえばグリセリン、ゴマ
油、グランドナッツ油、水性プロピレングリコール、N,
N′−ジメチルホルムアミドなどの希釈剤、賦形剤、担
体を使用する。医薬組成物の例としては、製薬的に許容
され得る緩衝液で緩衝化することのできる、パイロジェ
ン不含の式（Ｉ）で示されるインスリン類似体の滅菌し
た等張性生理食塩水が挙げられる。さらに、この腸管外
医薬製剤には、メタ−クレゾールなどの保存剤、または
水酸化ナトリウムまたは塩酸などの最終製品のpHを調節
するためのその他の活性剤を含有させることもできる。

本発明のインスリン類似体は、鼻腔内投与に適した剤
形に製剤化することもできる。このような組成物は、欧
州特許出願0200383 A3に詳細に開示されている。簡単に
言えば、このような組成物は、１つまたはそれ以上の製
薬的に許容され得る希釈剤、製薬的に許容され得る量の
アルカリ金属塩、アンモニウム塩または実質的に亜鉛を
含まないインスリンの遊離酸、ならびに要すれば、吸収
促進量の（１）オレイン酸またはそのエステルもしくは
塩、（２）液状ソルビタン脂肪酸エステル、（３）ソル
ビタン脂肪酸エステルの液状ポリオキシエチレン誘導体
および（４）液状ヒドロキシポリオキシエチレン−ポリ
オキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合体の中か
ら選択される少なくとも１つの吸収促進剤から製剤化さ
れる。

Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリンのインスリン
類似体と、ヒトナトリウムインスリンとの鼻腔内投与に
おける効能を証明するため、以下に記載の試験を行っ
た。雄性ビーグル犬（体重10-12kg）について身体的状
態を試験前と試験中に良好な状態に維持させた。16時間
絶食させたが、インスリンレベルの予期できない変動に
備えるため水は飲めるようにした。試験の全期間にわた
り、犬をペントバルビタールナトリウムで麻酔し、グル
コース変動を最小にするため足蹠を暖めて体温を維持さ
せた。被検インスリン試料［すなわち、Lys（B28）、Pr
o（B29）ヒトインスリン、およびヒトナトリウムインス
リン］を蒸留水に溶解し、その溶液のpHを水酸化ナトリ
ウムで7.5に調節した。最終的インスリン濃度は、70単
位/mlであった。1kg当たりLys（B28）、Pro（B29）ヒト
インスリン0.8単位の投与量で８匹のビーグル犬にイン
スリンを投与し、同様にして1kg当たりヒトナトリウム
インスリン0.8単位を４匹のビーグル犬に投与した。す
べての投与は、計量投与量ネブライザ（噴霧器）および
改変鼻腔アプリケイタにより鼻孔に１スプレー供給して
行った。投与前30分、15分、および０分時、ならびに投
与後10、20、30、45、60、90、120、180および240分時
に、頚静脈から採血し、血中のグルコース減少を測定し
た。得られた結果を以下の第４表に示す。

上記のプロトコールを使用し、Lys（B28）、Pro（B2
9）ヒトインスリンの鼻腔内投与による血中グルコース
減少のプロフィルを、次のようにその類似体を静脈内投
与および皮下投与した場合と比較した。静脈内投与で
は、Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインスリン類似体を含
有するインスリン溶液をボーラス注射（1kg当たり0.1単
位）により４匹の各ビーグル犬の伏在静脈に投与した。
投与前30分、15分、および０分時、ならびに投与後５、
10、15、20、30、45、60、90、120、180および240分時
に、血液試料を採取した。皮下投与では、Lys（B28）、
Pro（B29）ヒトインスリン類似体を含有するインスリン
溶液を６匹のビーグル犬の各脇腹の外側表皮の下方に投
与した（1kg当たり0.2単位）。既述の鼻腔内投与後に記
載しているプロトコールと同じプロトコールによって血
液試料を採取した。この比較試験の結果を以下の第５表
に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpKC283の制限部位および機能地
図、第２図は、プラスミドpKC283PXの制限部位および機
能地図、第３図は、プラスミドpKC283-Lの制限部位およ
び機能地図、第４図は、プラスミドpKC283-LBの制限部
位および機能地図、第５図は、プラスミドpKC283-PRSの
制限部位および機能地図、第６図は、プラスミドpL32の
制限部位および機能地図、第７図は、プラスミドpNM789
の制限部位および機能地図、第８図は、プラスミド120
の構築の概略を示す模式図、第９図は、プラスミドpL47
の制限部位および機能地図、第10図は、プラスミドpPR1
2の制限部位および機能地図、第11図は、プラスミドpPR
12AR1の制限部位および機能地図、第12図は、プラスミ
ドpL110の制限部位および機能地図、第13図は、プラス
ミドpL110Cの構築の概略を示す模式図、第14図は、プラ
スミドpCZR126Sの制限部位および機能地図、第15図は、
ヒトプロインスリン遺伝子のヌクレオチド配列の模式
図、第16図は、プラスミドpRB145の制限部位および機能
地図、第17図は、プラスミドpRB164Aの制限部位および
機能地図、第18図は、プラスミドpRB172の制限部位およ
び機能地図、第19図は、プラスミドpRB173の制限部位お
よび機能地図、そして第20図は、プラスミドpRB175の制
限部位および機能地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 (72)発明者 ブルース・ヒル・フランク アメリカ合衆国インディアナ46260、イン ディアナポリス、クラリッジ・ロード 8025番 (72)発明者 ジェームズ・エドウィン・シールズ アメリカ合衆国インディアナ46060、ノー ブルズビレ、グラシー・ブランチ・ロード 17808番

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式（Ｉ）： ［式中、A21はアラニン、アスパラギン、アスパラギン
   酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、スレオニ
   ン、またはセリンであり、 B1はフェニルアラニン、アスパラギン酸、または不存在
   であり、 B2はバリン、またはB1が不存在の場合に不存在であって
   もよく、 B3はアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、 B9はセリンまたはアスパラギン酸であり、 B10はヒスチジンまたはアスパラギン酸であり、 B27はスレオニンであり、 B28はリシン、グルタミン又はノルロイシンであり、 B29はプロリンであり、 B30はアラニン、スレオニン、または不存在であり、 Ｚは−OH、−NH₂、−OCH₃、または−OCH₂CH₃であり、 ＸはArg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys、Lys-Arg、
   または不存在であり、 ＹはＸが存在する場合にのみ存在することができ、それ
   が存在する場合は、Glu、または配列： ‐Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-
   Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Al
   a-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- のすべて、もしくはこの配列のＮ末端Gluから始まるそ
   の一部からなるアミノ酸である］ で示されるインスリン類似体、またはその医薬的に許容
   され得る塩。
2. 【請求項２】ＸおよびＹが不存在であり、ＺがOHである
   請求項１に記載のインスリン類似体。
3. 【請求項３】B30がスレオニンである請求項１に記載の
   インスリン類似体。
4. 【請求項４】B28がノルロイシンまたはリシンである請
   求項１から請求項３までのいずれかに記載のインスリン
   類似体。
5. 【請求項５】B28がリシンである請求項１から請求項４
   までのいずれかに記載のインスリン類似体。
6. 【請求項６】B28がリシンであり、B29がＬ−プロリンで
   あり、B30がスレオニンである請求項１から請求項５ま
   でのいずれかに記載のインスリン類似体。
7. 【請求項７】A21がアラニンである請求項１から請求項
   ６までのいずれかに記載のインスリン類似体。
8. 【請求項８】B1が不存在である請求項１から請求項７ま
   でのいずれかに記載のインスリン類似体。
9. 【請求項９】B10がアスパラギン酸である請求項１から
   請求項８までのいずれかに記載のインスリン類似体。
10. 【請求項１０】B2が不存在である請求項１から請求項９
    までのいずれかに記載のインスリン類似体。
11. 【請求項１１】B10がアスパラギン酸である請求項10に
    記載のインスリン類似体。
12. 【請求項１２】B30が不存在である請求項１から請求項1
    1までのいずれかに記載のインスリン類似体。
13. 【請求項１３】B30がアラニンである請求項１から請求
    項12までのいずれかに記載のインスリン類似体。
14. 【請求項１４】A21がアラニンである請求項１または２
    に記載のインスリン類似体。
15. 【請求項１５】B1が不存在である請求項１、２および請
    求項14のいずれかに記載のインスリン類似体。
16. 【請求項１６】B10がアスパラギン酸である請求項１、
    ２、14および15のいずれかに記載のインスリン類似体。
17. 【請求項１７】B2が不存在である請求項１、２、および
    請求項14から16のいずれかに記載のインスリン類似体。
18. 【請求項１８】B10がアスパラギン酸である請求項１、
    ２、および14から17のいずれかに記載のインスリン類似
    体。
19. 【請求項１９】B30が不存在である請求項１、２、およ
    び14から18のいずれかに記載のインスリン類似体。
20. 【請求項２０】B30がアラニンである請求項１、２、お
    よび14から18のいずれかに記載のインスリン類似体。
21. 【請求項２１】A21がアスパラギン、B1がフェニルアラ
    ニン、B2がバリン、B3がアスパラギン、B9がセリン、B1
    0がヒスチジン、B27がスレオニン、B28がリシン、B29が
    Ｌ−プロリン、B30がスレオニン、ＺがOH、Ｘが不存
    在、そしてＹが不存在である請求項１に記載のインスリ
    ン類似体。
22. 【請求項２２】Ａ）A21が請求項１における定義と同意
    義である式（Ｉ）で示される化合物のＡ鎖を、B1、B2、
    B3、B9、B10、B27、B28、B29、B30、Ｘ、Ｙ、およびＺ
    が請求項１における定義と同意義である式（Ｉ）で示さ
    れる化合物のＢ鎖と一緒にし、適当なジスルフィド結合
    を生成させるか、 Ｂ）B23から始まるペプチド配列を欠いており、かつA2
    1、B1、B2、B3、B9、およびB10が請求項１における定義
    と同意義である式（Ｉ）の改変化合物を、式： Gly-Phe-Phe-Tyr-B27-B28-B29-B30-X-Y-Z ［式中、B27、B28、B29、B30、Ｘ、Ｙ、およびＺは請求
    項１における定義と同意義である］ で示される配列を有するペプチドと反応させるか、また
    は Ｃ）A21、B1、B2、B3、B9、B10、B27、B28、B29、B30、
    Ｘ、Ｙ、およびＺが請求項１における定義と同意義であ
    る式（Ｉ）で示される化合物のアミノ酸配列からなる改
    変プロインスリン分子を開裂させ、この改変プロインス
    リンからＣ−ペプチドのすべて、またはその一部を除去
    する ことを特徴とする請求項１から請求項21までのいずれか
    に記載の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法。
23. 【請求項２３】１つまたはそれ以上の医薬的に許容され
    得る担体と共に、活性成分として請求項１から請求項21
    までのいずれかに記載の式（Ｉ）で示される化合物を含
    有する糖尿病を処置するための医薬製剤。