JPH08231423A - エイズワクチン - Google Patents
エイズワクチンInfo
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- JPH08231423A JPH08231423A JP3883595A JP3883595A JPH08231423A JP H08231423 A JPH08231423 A JP H08231423A JP 3883595 A JP3883595 A JP 3883595A JP 3883595 A JP3883595 A JP 3883595A JP H08231423 A JPH08231423 A JP H08231423A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】安全性が高く、かつ種々のＨＩＶ変異株に対し
て高い抗体価を有し、予防効果および治療効果の高いエ
イズワクチンを提供する。 【構成】ＨＩＶエンベロープのｇｐ１２０のＶ３領域ペ
プチドとＨＩＶの表面蛋白由来のＴ細胞抗原エピトープ
（ＣＤ４結合部位）からなるループ状ペプチドを、分枝
リジンオリゴマーに結合させる。ペプチド鎖により分枝
リジンオリゴマー同士を結合させることによって巨大分
子にさせる。
て高い抗体価を有し、予防効果および治療効果の高いエ
イズワクチンを提供する。 【構成】ＨＩＶエンベロープのｇｐ１２０のＶ３領域ペ
プチドとＨＩＶの表面蛋白由来のＴ細胞抗原エピトープ
（ＣＤ４結合部位）からなるループ状ペプチドを、分枝
リジンオリゴマーに結合させる。ペプチド鎖により分枝
リジンオリゴマー同士を結合させることによって巨大分
子にさせる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エイズ（ＡＩＤＳ：Ac
quired Immune Deficiency Syndrome 後天性免疫不全症
候群）ワクチンに関する。さらに詳しくは、本発明はエ
イズウイルス（ＨＩＶ）感染症に対するペプチドワクチ
ンに関する。
quired Immune Deficiency Syndrome 後天性免疫不全症
候群）ワクチンに関する。さらに詳しくは、本発明はエ
イズウイルス（ＨＩＶ）感染症に対するペプチドワクチ
ンに関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスの一種とされるエイズウ
イルス（ＨＩＶ）は、血液を媒介として、例えば感染者
との性交渉あるいは患者の血液輸血などによって感染す
る。そして感染により、血中のＴ細胞が破壊され、免疫
機能が著しく低下し、カポシ肉腫、ニューモシスチスカ
リニ肺炎等に罹患して死に至る。ＨＩＶ感染者数は、近
年、加速度的に増加しており、特にタイ王国、アメリカ
合衆国などの諸国においては、エイズが国民の死亡原因
の上位に位置するといったような事態となっており、そ
の対処策が全世界的に極めて重要なものになっている。
このようなＨＩＶ感染に対する予防および治療法につい
ては、現在数多くの研究がなされており、ＨＩＶに対す
るワクチンの開発についてもいくつかの報告がなさてい
る。
イルス（ＨＩＶ）は、血液を媒介として、例えば感染者
との性交渉あるいは患者の血液輸血などによって感染す
る。そして感染により、血中のＴ細胞が破壊され、免疫
機能が著しく低下し、カポシ肉腫、ニューモシスチスカ
リニ肺炎等に罹患して死に至る。ＨＩＶ感染者数は、近
年、加速度的に増加しており、特にタイ王国、アメリカ
合衆国などの諸国においては、エイズが国民の死亡原因
の上位に位置するといったような事態となっており、そ
の対処策が全世界的に極めて重要なものになっている。
このようなＨＩＶ感染に対する予防および治療法につい
ては、現在数多くの研究がなされており、ＨＩＶに対す
るワクチンの開発についてもいくつかの報告がなさてい
る。
【０００３】その１例として弱毒生ウイルスワクチンが
ある。これは、病原性を持つＨＩＶに遺伝子操作を施
し、病原性を消失させたり、あるいは、ＨＩＶと共通の
抗原性を有するウイルスを免疫原として使用する方法で
ある。弱毒化したウイルスは、接種された宿主に対して
効果的に長期間持続する強い免疫原性を誘導するが、理
論的にはウイルスの病原性が残る等の危険性がともな
う。またＨＩＶの蛋白の一部を合成したペプチドワクチ
ンも報告されている。その多くはＶ３領域のペプチドで
あるが、ＨｏらはＥｎｖ領域のペプチドをＫＬＨに結合
させてワクチンとしている。またタイプの異なるウイル
ス株のペプチド配列を組み合わせたり、高分子ペプチド
にすることによって免疫原性を高める方法が試みられて
きた。しかしながら、一般的には修飾していないペプチ
ドでは免疫原性が乏しく、強い液性，細胞性免疫を誘導
することは、かなり困難である。
ある。これは、病原性を持つＨＩＶに遺伝子操作を施
し、病原性を消失させたり、あるいは、ＨＩＶと共通の
抗原性を有するウイルスを免疫原として使用する方法で
ある。弱毒化したウイルスは、接種された宿主に対して
効果的に長期間持続する強い免疫原性を誘導するが、理
論的にはウイルスの病原性が残る等の危険性がともな
う。またＨＩＶの蛋白の一部を合成したペプチドワクチ
ンも報告されている。その多くはＶ３領域のペプチドで
あるが、ＨｏらはＥｎｖ領域のペプチドをＫＬＨに結合
させてワクチンとしている。またタイプの異なるウイル
ス株のペプチド配列を組み合わせたり、高分子ペプチド
にすることによって免疫原性を高める方法が試みられて
きた。しかしながら、一般的には修飾していないペプチ
ドでは免疫原性が乏しく、強い液性，細胞性免疫を誘導
することは、かなり困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このように従来から、
エイズワクチンとして、各種の報告がなされているにも
拘わらず、安全性が高くしかも予防効果の高い決定的な
ワクチンは未だ報告されていない。従って本発明は、安
全性が高く、かつ種々のＨＩＶの変異株に対して強い液
性，細胞性免疫を誘導することができ、予防効果の高い
エイズワクチンを提供することを目的とする。
エイズワクチンとして、各種の報告がなされているにも
拘わらず、安全性が高くしかも予防効果の高い決定的な
ワクチンは未だ報告されていない。従って本発明は、安
全性が高く、かつ種々のＨＩＶの変異株に対して強い液
性，細胞性免疫を誘導することができ、予防効果の高い
エイズワクチンを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的は以下の本発明
は、ＨＩＶのエンベロープのｇｐ１２０のＶ３領域を含
有するワクチンであって、分枝リジンオリゴマーよりな
る核体の各分枝に、前記Ｖ３領域ペプチド、およびアミ
ノ酸またはＶ３領域を含まないペプチド結合させたこと
を特徴とするエイズワクチンである。
は、ＨＩＶのエンベロープのｇｐ１２０のＶ３領域を含
有するワクチンであって、分枝リジンオリゴマーよりな
る核体の各分枝に、前記Ｖ３領域ペプチド、およびアミ
ノ酸またはＶ３領域を含まないペプチド結合させたこと
を特徴とするエイズワクチンである。
【０００６】また本発明は、前記Ｖ３領域のペプチドの
Ｎ末端部位には、ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピトー
プのペプチドあるいはＣＤ４結合領域のペプチドが結合
されていることを特徴とする上記のエイズワクチンであ
る。
Ｎ末端部位には、ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピトー
プのペプチドあるいはＣＤ４結合領域のペプチドが結合
されていることを特徴とする上記のエイズワクチンであ
る。
【０００７】また本発明は、分枝リジンオリゴマーより
なる核体の分枝に、ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピト
ープのペプチドおよびＶ３領域ペプチドの配列からなる
ペプチド、あるいはＣＤ４結合領域のペプチドおよびＶ
３領域ペプチドの配列からなるペプチドがＣ末端部位に
おいて結合され、かつ前記ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞
エピトープのペプチドおよびＶ３領域ペプチドの配列か
らなるペプチド、あるいはＣＤ４結合領域のペプチドお
よびＶ３領域ペプチドの配列からなるペプチドがループ
を形成している上記のエイズワクチンである。
なる核体の分枝に、ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピト
ープのペプチドおよびＶ３領域ペプチドの配列からなる
ペプチド、あるいはＣＤ４結合領域のペプチドおよびＶ
３領域ペプチドの配列からなるペプチドがＣ末端部位に
おいて結合され、かつ前記ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞
エピトープのペプチドおよびＶ３領域ペプチドの配列か
らなるペプチド、あるいはＣＤ４結合領域のペプチドお
よびＶ３領域ペプチドの配列からなるペプチドがループ
を形成している上記のエイズワクチンである。
【０００８】また本発明は、前記Ｖ３領域のペプチドが
複数株由来のものを用いる上記のエイズワクチンであ
る。
複数株由来のものを用いる上記のエイズワクチンであ
る。
【０００９】また本発明は、分枝リジンオリゴマーより
なる核体の分枝に、ＨＩＶ内部蛋白質ｇａｇ領域のペプ
チドがＣ末端部位において結合されている上記のエイズ
ワクチンである。
なる核体の分枝に、ＨＩＶ内部蛋白質ｇａｇ領域のペプ
チドがＣ末端部位において結合されている上記のエイズ
ワクチンである。
【００１０】また本発明は、複数の分枝リジンオリゴマ
ーよりなる核体が、各々の核体に結合されたペプチドの
Ｎ末端同士で結合されていることを特徴とする上記のエ
イズワクチンである。
ーよりなる核体が、各々の核体に結合されたペプチドの
Ｎ末端同士で結合されていることを特徴とする上記のエ
イズワクチンである。
【００１１】本発明において用いるＶ３領域のペプチド
とは、ＨＩＶのエンベロープタンパク質を構成する分子
量約１２万の糖蛋白ｇｐ１２０のアミノ酸位置の３０３
〜３２２の配列の全部又は一部に対応するペプチドのこ
とである。なお、その配列は株種よってそのアミノ酸番
号が異なる場合があり多くの文献に開示されいる。例え
ばＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ型、ＨＩＶ−１ ＴｈａｉＡお
よびＨＩＶ−１ ＴｈａｉＢなどが例示でき本発明では
特に限定することなく用いることができ、また複数株由
来のものを用いて多価ワクチンとして用いても良い。
とは、ＨＩＶのエンベロープタンパク質を構成する分子
量約１２万の糖蛋白ｇｐ１２０のアミノ酸位置の３０３
〜３２２の配列の全部又は一部に対応するペプチドのこ
とである。なお、その配列は株種よってそのアミノ酸番
号が異なる場合があり多くの文献に開示されいる。例え
ばＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ型、ＨＩＶ−１ ＴｈａｉＡお
よびＨＩＶ−１ ＴｈａｉＢなどが例示でき本発明では
特に限定することなく用いることができ、また複数株由
来のものを用いて多価ワクチンとして用いても良い。
【００１２】また本発明においてＶ３領域のペプチド
は、上記の配列に基づき、固相合成法などの公知のペプ
チド合成方法、より好ましくは自動ペプチド合成装置と
用いた合成方法などにより得られた合成されたものを使
用することが好ましい。
は、上記の配列に基づき、固相合成法などの公知のペプ
チド合成方法、より好ましくは自動ペプチド合成装置と
用いた合成方法などにより得られた合成されたものを使
用することが好ましい。
【００１３】また本発明においてＶ３領域のペプチド
は、その免疫性を高める目的でＮ末端部位にＨＩＶ表面
蛋白由来のＴ細胞エピトープのペプチドあるいはＣＤ４
結合領域のペプチドを結合させても良い。ＨＩＶ表面蛋
白由来のＴ細胞エピトープのペプチドとはＨＩＶのエン
ベロープタンパク質を構成するｇｐ１２０のアミノ酸位
置の４３０〜４４５の配列の全部又は一部に対応するペ
プチドのことである。ＣＤ４結合領域のペプチドとは、
Asn-Met-Trp-Gln-Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Alaの
配列の全部又は一部に対応するペプチドのことである。
は、その免疫性を高める目的でＮ末端部位にＨＩＶ表面
蛋白由来のＴ細胞エピトープのペプチドあるいはＣＤ４
結合領域のペプチドを結合させても良い。ＨＩＶ表面蛋
白由来のＴ細胞エピトープのペプチドとはＨＩＶのエン
ベロープタンパク質を構成するｇｐ１２０のアミノ酸位
置の４３０〜４４５の配列の全部又は一部に対応するペ
プチドのことである。ＣＤ４結合領域のペプチドとは、
Asn-Met-Trp-Gln-Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Alaの
配列の全部又は一部に対応するペプチドのことである。
【００１４】さらに本発明においては、Ｖ３領域のペプ
チドのＮ末端部位とＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピト
ープのペプチドあるいはＣＤ４結合領域のペプチドのＣ
末端部位を結合させ、得られたペプチド鎖のＣ末端部位
を分枝リジンオリゴマーよりなる核体の各分枝に結合さ
せ、さらに得られたペプチド鎖のＶ３領域部位を除く部
位をループさせることにより、より高い免疫性を得るこ
とができる。
チドのＮ末端部位とＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピト
ープのペプチドあるいはＣＤ４結合領域のペプチドのＣ
末端部位を結合させ、得られたペプチド鎖のＣ末端部位
を分枝リジンオリゴマーよりなる核体の各分枝に結合さ
せ、さらに得られたペプチド鎖のＶ３領域部位を除く部
位をループさせることにより、より高い免疫性を得るこ
とができる。
【００１５】また本発明においてはＶ３領域のペプチド
と共に、Ｖ３領域の配列を持たないペプチドを分枝リジ
ンオリゴマーよりなる核体の各分枝に結合させても良
く、例えばＨＩＶ内部蛋白質Ｇａｇ領域のペプチドなど
が挙げられる。このＨＩＶ内部蛋白質Ｇａｇ領域のペプ
チドはＧａｇを構成する分子量約１万７千のタンパク質
と一部同一または類似の配列を有する不変部位ペプチド
である。
と共に、Ｖ３領域の配列を持たないペプチドを分枝リジ
ンオリゴマーよりなる核体の各分枝に結合させても良
く、例えばＨＩＶ内部蛋白質Ｇａｇ領域のペプチドなど
が挙げられる。このＨＩＶ内部蛋白質Ｇａｇ領域のペプ
チドはＧａｇを構成する分子量約１万７千のタンパク質
と一部同一または類似の配列を有する不変部位ペプチド
である。
【００１６】本発明において分枝リジンオリゴマーは、
８個以上、例えば１５個を、リジン分子中の２つのアミ
ノ基を結合に供して複数のアミノ基末端を有するように
分枝状に合成したものであり、公知の方法により製造で
きる。なお、分枝リジンオリゴマーのアミノ基末端の数
を、より多いもの、例えば３２個ないしそれ以上のもの
として分子量を大きくすることで、より高い免疫性を得
ることができる。
８個以上、例えば１５個を、リジン分子中の２つのアミ
ノ基を結合に供して複数のアミノ基末端を有するように
分枝状に合成したものであり、公知の方法により製造で
きる。なお、分枝リジンオリゴマーのアミノ基末端の数
を、より多いもの、例えば３２個ないしそれ以上のもの
として分子量を大きくすることで、より高い免疫性を得
ることができる。
【００１７】さらに本発明においては、複数の上記のペ
プチドを結合させた分枝リジンオリゴマー同士を、互い
のペプチド同士結合させ、より分子量を大きくすること
で、さらに高い免疫性を得ることができる。この際の分
子量は８万〜１２万であることが好ましい。
プチドを結合させた分枝リジンオリゴマー同士を、互い
のペプチド同士結合させ、より分子量を大きくすること
で、さらに高い免疫性を得ることができる。この際の分
子量は８万〜１２万であることが好ましい。
【００１８】本発明のエイズワクチンの製造方法は特に
限定されるものではなく公知の方法を用いることがで
き、例えば上述したペプチドを予め混合しＰＫＡに結合
させることにより得られる。本発明のエイズワクチン
は、必要に応じてアジュバンド等を添加して用いても良
い。
限定されるものではなく公知の方法を用いることがで
き、例えば上述したペプチドを予め混合しＰＫＡに結合
させることにより得られる。本発明のエイズワクチン
は、必要に応じてアジュバンド等を添加して用いても良
い。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。 （実施例１）ループ状ペプチドの合成 コモンコンセンサスＰＮＤペプチド 図１記載の２２４人のＨＩＶ感染者から分離されたウイ
ルスのＶ３領域のアミノ酸配列を解析したアミノ酸の出
現頻度から、最も高頻度に出現する配列は、配列表の配
列番号１に示されるものであり、これをコモンコンセン
サスＰＮＤペプチドとする。
説明する。 （実施例１）ループ状ペプチドの合成 コモンコンセンサスＰＮＤペプチド 図１記載の２２４人のＨＩＶ感染者から分離されたウイ
ルスのＶ３領域のアミノ酸配列を解析したアミノ酸の出
現頻度から、最も高頻度に出現する配列は、配列表の配
列番号１に示されるものであり、これをコモンコンセン
サスＰＮＤペプチドとする。
【００２０】ループ状ペプチドの合成 配列表の配列番号２に示すＣＤ４結合領域のペプチドを
用いて、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosys
tems Inc.）製自動ペプチド合成装置よって、コモンコ
ンセンサスＰＮＤペプチドのうちの２２アミノ酸残基と
ＣＤ４結合領域のうちの１３アミノ酸残基を含む３７ア
ミノ酸残基からなるペプチドを合成した。合成方法を図
２に示す。合成したペプチドは、逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで精製した。しかしながら、
合成の途中においてはペプチドの濃度が高いため、各ペ
プチド間がＳ−Ｓ結合を形成しており、分子内Ｓ−Ｓ結
合（ループ状ペプチド）を形成させるためには、先ず最
初に合成したペプチドを還元する必要がある。１００mg
の合成したペプチドを０.３６Ｍの２−メルカプトエタ
ノール、８Ｍの尿素を含む１００mlの０.０５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８.２）に溶解し、室温で一昼夜反応さ
せ、分子間Ｓ−Ｓ結合を還元させた。その後この溶液を
３０倍希釈し、４℃で８Ｍの尿素で４時間４Ｍの尿素で
４時間、２Ｍの尿素で４時間さらに蒸留水で１４時間透
析し、分子内Ｓ−Ｓ結合を形成させループ状構造を作製
した。
用いて、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosys
tems Inc.）製自動ペプチド合成装置よって、コモンコ
ンセンサスＰＮＤペプチドのうちの２２アミノ酸残基と
ＣＤ４結合領域のうちの１３アミノ酸残基を含む３７ア
ミノ酸残基からなるペプチドを合成した。合成方法を図
２に示す。合成したペプチドは、逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで精製した。しかしながら、
合成の途中においてはペプチドの濃度が高いため、各ペ
プチド間がＳ−Ｓ結合を形成しており、分子内Ｓ−Ｓ結
合（ループ状ペプチド）を形成させるためには、先ず最
初に合成したペプチドを還元する必要がある。１００mg
の合成したペプチドを０.３６Ｍの２−メルカプトエタ
ノール、８Ｍの尿素を含む１００mlの０.０５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８.２）に溶解し、室温で一昼夜反応さ
せ、分子間Ｓ−Ｓ結合を還元させた。その後この溶液を
３０倍希釈し、４℃で８Ｍの尿素で４時間４Ｍの尿素で
４時間、２Ｍの尿素で４時間さらに蒸留水で１４時間透
析し、分子内Ｓ−Ｓ結合を形成させループ状構造を作製
した。
【００２１】ポリＬ−リジンへの重合 合成したループ状ペプチド（約４０００ダルトン）をグ
ルタルアルデヒドを用いてポリＬ−リジン（約８０００
ダルトン）にα−アミノ基同士（モル比で２０：１の割
合）で結合した。すなわち４０mgの再酸化したループ状
ペプチドと１mgのポリＬ−リジンを４mlの０.０６７Ｍ
のＰＢＳに溶解後、０.２％グルタルアルデヒド４mlを
加え、４℃で一夜反応させた。さらに０.１５ＭＮａＨ
ＣＯ3を少量加えｐＨ７.５に調整し、４℃で４時間反応
させた。ｐＨ７.５で反応させることで各ペプチドのα
−アミノ基が主にＮＨ2基になっておりε−アミノ基の
ＮＨ3 +基と区別され、グルタルアルデヒドで主にα−ア
ミノ基を選択的に重合することができる。従って各ペプ
チドの抗原性は保たれることになる。その後、一夜透析
後、凍結乾燥し、これをＡＧ１とした。同様な方法で直
鎖状ペプチドをポリＬ−リジンに重合させ、これをＡＧ
２とした。
ルタルアルデヒドを用いてポリＬ−リジン（約８０００
ダルトン）にα−アミノ基同士（モル比で２０：１の割
合）で結合した。すなわち４０mgの再酸化したループ状
ペプチドと１mgのポリＬ−リジンを４mlの０.０６７Ｍ
のＰＢＳに溶解後、０.２％グルタルアルデヒド４mlを
加え、４℃で一夜反応させた。さらに０.１５ＭＮａＨ
ＣＯ3を少量加えｐＨ７.５に調整し、４℃で４時間反応
させた。ｐＨ７.５で反応させることで各ペプチドのα
−アミノ基が主にＮＨ2基になっておりε−アミノ基の
ＮＨ3 +基と区別され、グルタルアルデヒドで主にα−ア
ミノ基を選択的に重合することができる。従って各ペプ
チドの抗原性は保たれることになる。その後、一夜透析
後、凍結乾燥し、これをＡＧ１とした。同様な方法で直
鎖状ペプチドをポリＬ−リジンに重合させ、これをＡＧ
２とした。
【００２２】（実施例２）ＡＧ１，ＡＧ２のウサギを用
いての免疫原性の検討 １２週令のＪＷ／ＣＳＫウサギ（１２週令静岡実験動物
センター）に体重１Kg当り１００μgのＡＧ１をフロイ
ンドの不完全アジュバントとともに０，２８，５６，８
４，１１２および１４０日目に皮下注射した。ＡＧ２に
ついても同様な方法で接種した。４２，７０，９８，１
２６，１５６日目に採血を行ない、ＥＬＩＳＡにより抗
体価を測定した。ＥＬＩＳＡは、矢野間らの方法（「イ
ムノロジー(Immunology)」６４：１１３−１１９ １９
８８）に従った。抗原は、配列表の配列番号３に示すコ
モンコンセンサスＰＮＤを、また配列表の配列番号４に
示すＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株のＶ３領域を９６穴プレー
トに５μg/１００μl/ｗｅｌｌで固相化した。ブロッキ
ングには１％ＢＳＡを２００μl/ｗｅｌｌで分注し、４
時間インキュベートした。血清の希釈系列を作製し、９
６穴プレートに分注し、３７℃４時間インキュベートし
た。その後、ペルオキダーゼ標識した抗ウサギＩｇＧを
加え１.５時間インキュベートした。Ｏ−フェニレンジ
アミンおよび０.０１％Ｈ2Ｏ2含む０.１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ５.０）を加え発色させた。抗体価は４９０nm
の吸光度が０.２以上となる最大希釈倍数の逆数として
表現した。
いての免疫原性の検討 １２週令のＪＷ／ＣＳＫウサギ（１２週令静岡実験動物
センター）に体重１Kg当り１００μgのＡＧ１をフロイ
ンドの不完全アジュバントとともに０，２８，５６，８
４，１１２および１４０日目に皮下注射した。ＡＧ２に
ついても同様な方法で接種した。４２，７０，９８，１
２６，１５６日目に採血を行ない、ＥＬＩＳＡにより抗
体価を測定した。ＥＬＩＳＡは、矢野間らの方法（「イ
ムノロジー(Immunology)」６４：１１３−１１９ １９
８８）に従った。抗原は、配列表の配列番号３に示すコ
モンコンセンサスＰＮＤを、また配列表の配列番号４に
示すＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株のＶ３領域を９６穴プレー
トに５μg/１００μl/ｗｅｌｌで固相化した。ブロッキ
ングには１％ＢＳＡを２００μl/ｗｅｌｌで分注し、４
時間インキュベートした。血清の希釈系列を作製し、９
６穴プレートに分注し、３７℃４時間インキュベートし
た。その後、ペルオキダーゼ標識した抗ウサギＩｇＧを
加え１.５時間インキュベートした。Ｏ−フェニレンジ
アミンおよび０.０１％Ｈ2Ｏ2含む０.１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ５.０）を加え発色させた。抗体価は４９０nm
の吸光度が０.２以上となる最大希釈倍数の逆数として
表現した。
【００２３】結果を図３及び４に示す。図３はコモンコ
ンセンサスＰＮＤペプチドを固相抗原とした場合の抗体
価の変動を示したものであり、図４は、ＨＩＶ−１ Ｉ
ＩＩＢ株のＰＮＤペプチドを固相抗原とした場合の抗体
価の変動を示している。いずれの場合もＡＧ１を接種し
て得られた血清（●）の方がＡＧ２を接種して得られた
血清（△）よりもＥｎｖ抗原特異的抗体価が高い。
ンセンサスＰＮＤペプチドを固相抗原とした場合の抗体
価の変動を示したものであり、図４は、ＨＩＶ−１ Ｉ
ＩＩＢ株のＰＮＤペプチドを固相抗原とした場合の抗体
価の変動を示している。いずれの場合もＡＧ１を接種し
て得られた血清（●）の方がＡＧ２を接種して得られた
血清（△）よりもＥｎｖ抗原特異的抗体価が高い。
【００２４】（実施例３）ＡＧ１，ＡＧ２を接種して得
られた抗血清を使用してのＨＩＶ特異的細胞融合阻止試
験 ＨＩＶに感染したＣＥＭ細胞を約１４日培養する。その
間に細胞の大多数は死滅するが生き残った分画は安定的
に感染している。これにＨＩＶに感染していないＭＯＬ
Ｔ−４細胞を加えると両者の一部が融合し、巨大細胞を
形成する。ＡＧ１、ＡＧ２を接種したウサギから得られ
た抗血清が、この融合を阻止するか否かをPutneyらが報
告した方法（「サイエンス(Science)」,234,1392-1395
(1986)）を用いて調べた。
られた抗血清を使用してのＨＩＶ特異的細胞融合阻止試
験 ＨＩＶに感染したＣＥＭ細胞を約１４日培養する。その
間に細胞の大多数は死滅するが生き残った分画は安定的
に感染している。これにＨＩＶに感染していないＭＯＬ
Ｔ−４細胞を加えると両者の一部が融合し、巨大細胞を
形成する。ＡＧ１、ＡＧ２を接種したウサギから得られ
た抗血清が、この融合を阻止するか否かをPutneyらが報
告した方法（「サイエンス(Science)」,234,1392-1395
(1986)）を用いて調べた。
【００２５】ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株およびＨＩＶ−１
ＧＵＮ−１株を感染させたＣＥＭ細胞０.２５×１０6
／mlの５０μlを９６穴プレートに分注した。次にＨＩ
Ｖに感染していないＭＯＬＴ−４細胞の１.７５×１０6
／mlの５０μlを分注し、さらに段階希釈した被験血清
１０μlを分注し、３７℃、２４時間インキュベートし
た。巨大細胞（これらの細胞は、最初に分注した細胞の
５倍以上の直径を持つ）の出現数を４０倍の倒立顕微鏡
で計測した。融合阻止活性は、下記の巨大細胞の出現阻
止率の割合によって求めた。出現阻止率＝（１−Ｎｔ／
Ｎｃ）×１００、式中Ｎｔは被験血清中で出現した巨大
細胞の数、Ｎｃは対照の正常血清中で出現した巨大細胞
の数を示す。対照の被験血清はワクチンを接種していな
い正常血清を用いた。ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株のＰＮＤ
ペプチドとＡＧ１、ＡＧ２に用いたコモンコンセンサス
ＰＮＤペプチドのアミノ酸配列のホモロジーは、約７２
％である。ＣＥＭ細胞にＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株を感染
させた場合の融合阻止率を図５に示す。ＡＧ１を接種し
た場合を■、ＡＧ２を接種した場合を□とする。
ＧＵＮ−１株を感染させたＣＥＭ細胞０.２５×１０6
／mlの５０μlを９６穴プレートに分注した。次にＨＩ
Ｖに感染していないＭＯＬＴ−４細胞の１.７５×１０6
／mlの５０μlを分注し、さらに段階希釈した被験血清
１０μlを分注し、３７℃、２４時間インキュベートし
た。巨大細胞（これらの細胞は、最初に分注した細胞の
５倍以上の直径を持つ）の出現数を４０倍の倒立顕微鏡
で計測した。融合阻止活性は、下記の巨大細胞の出現阻
止率の割合によって求めた。出現阻止率＝（１−Ｎｔ／
Ｎｃ）×１００、式中Ｎｔは被験血清中で出現した巨大
細胞の数、Ｎｃは対照の正常血清中で出現した巨大細胞
の数を示す。対照の被験血清はワクチンを接種していな
い正常血清を用いた。ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株のＰＮＤ
ペプチドとＡＧ１、ＡＧ２に用いたコモンコンセンサス
ＰＮＤペプチドのアミノ酸配列のホモロジーは、約７２
％である。ＣＥＭ細胞にＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株を感染
させた場合の融合阻止率を図５に示す。ＡＧ１を接種し
た場合を■、ＡＧ２を接種した場合を□とする。
【００２６】ＡＧ１を接種したウサギから得られた抗血
清では１/８希釈で８１.９％，１/１６希釈で６７.５
％，１/３２希釈で６５.６％，１/６４希釈で２３.９
％，１／１２８希釈で２２．３％であった。同様にＡＧ
２を接種したウサギから得られた抗血清では、３５.２
％，３５.８％，３５.１％，２３.３％，および８.１％
であった。
清では１/８希釈で８１.９％，１/１６希釈で６７.５
％，１/３２希釈で６５.６％，１/６４希釈で２３.９
％，１／１２８希釈で２２．３％であった。同様にＡＧ
２を接種したウサギから得られた抗血清では、３５.２
％，３５.８％，３５.１％，２３.３％，および８.１％
であった。
【００２７】ＨＩＶ−１ ＧＵＮ−１は日本で分離され
た野生株でありＶ３領域のアミノ酸配列は配列表の配列
番号５に示す通りであり、ＧＵＮ−１のＰＮＤペプチド
とコモンコンセンサスＰＮＤペプチドのアミノ酸配列の
ホモロジーは約８０％である。ＣＥＭ細胞にＨＩＶ−１
ＧＵＮ−１株を感染させた場合の融合阻止率は図６に
示す通りであり、ＡＧ１を接種したウサギから得られた
抗血清（■）では１/８希釈で５０％、１/１６希釈で３
０％であったが、ＡＧ２を接種したウサギから得られた
抗血清（□）では融合阻止率はかなり低かった。
た野生株でありＶ３領域のアミノ酸配列は配列表の配列
番号５に示す通りであり、ＧＵＮ−１のＰＮＤペプチド
とコモンコンセンサスＰＮＤペプチドのアミノ酸配列の
ホモロジーは約８０％である。ＣＥＭ細胞にＨＩＶ−１
ＧＵＮ−１株を感染させた場合の融合阻止率は図６に
示す通りであり、ＡＧ１を接種したウサギから得られた
抗血清（■）では１/８希釈で５０％、１/１６希釈で３
０％であったが、ＡＧ２を接種したウサギから得られた
抗血清（□）では融合阻止率はかなり低かった。
【００２８】（実施例４）ループ状ペプチドを含有し、
分枝リジンオリゴマーに結合する大分子ペプチドの合成 図７に示す構造の大分子ペプチドを合成した。ループ状
ペプチドは、実施例１に示した方法で合成した。コモン
日本ＰＮＤペプチド（Ｊａｐａｎ）およびタイ−Ｂペプ
チド（ＴｈａｉＢ）は自動ペプチド合成装置を用いてＭ
ＡＰ法で合成した。Ｇａｇ領域ペプチドも自動ペプチド
合成装置を用いて合成した。さらに、これらのペプチド
をα−アミノ基同士でグルタルアルデヒドを用いて結合
させ大分子ペプチドを合成し、これをＭＣＶ−１とし
た。
分枝リジンオリゴマーに結合する大分子ペプチドの合成 図７に示す構造の大分子ペプチドを合成した。ループ状
ペプチドは、実施例１に示した方法で合成した。コモン
日本ＰＮＤペプチド（Ｊａｐａｎ）およびタイ−Ｂペプ
チド（ＴｈａｉＢ）は自動ペプチド合成装置を用いてＭ
ＡＰ法で合成した。Ｇａｇ領域ペプチドも自動ペプチド
合成装置を用いて合成した。さらに、これらのペプチド
をα−アミノ基同士でグルタルアルデヒドを用いて結合
させ大分子ペプチドを合成し、これをＭＣＶ−１とし
た。
【００２９】（実施例５）ウサギおよび日本ザルを用い
た免疫原性の検討 ウサギに対しては、体重１kg当たり１００μgのＭＣＶ
−１をフロインドの不完全アジュバントとともに０，２
８，５６，８４，１１２および１４０日目に皮下注射し
た。日本ザルに対しては、体重１kg当たり１００μgの
ＭＣＶ−１をフロインドの不完全アジュバントとともに
０，１４，２８日目に皮下注射した。抗体価の測定は、
実施例２と同様な方法で行なった。抗体価の変動を図８
に示した。ＭＣＶ−１はウサギ、日本ザルのいずれに対
しても、強い免疫原性を有していることが示された。
た免疫原性の検討 ウサギに対しては、体重１kg当たり１００μgのＭＣＶ
−１をフロインドの不完全アジュバントとともに０，２
８，５６，８４，１１２および１４０日目に皮下注射し
た。日本ザルに対しては、体重１kg当たり１００μgの
ＭＣＶ−１をフロインドの不完全アジュバントとともに
０，１４，２８日目に皮下注射した。抗体価の測定は、
実施例２と同様な方法で行なった。抗体価の変動を図８
に示した。ＭＣＶ−１はウサギ、日本ザルのいずれに対
しても、強い免疫原性を有していることが示された。
【００３０】（実施例６）ＭＣＶ−１を接種して得られ
た抗血清の抗融合効果 実施例３と同様な方法で抗融合効果を調べた。融合阻止
率は、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株に対して、ウサギにＭＣ
Ｖ−１を接種して得られた抗血清の１/８希釈で８９.６
％，日本ザルにＭＣＶ−１を接種して得られた抗血清の
１/８希釈で８９.５％であった。図９に示すようにウサ
ギ、日本ザルのいずれの抗血清についても１/５１２希
釈までは約５０％の融合阻止率を維持していた。またＳ
Ｆ２株に対してもウサギの抗血清は、高いレベルの融合
阻止率を示していた。
た抗血清の抗融合効果 実施例３と同様な方法で抗融合効果を調べた。融合阻止
率は、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株に対して、ウサギにＭＣ
Ｖ−１を接種して得られた抗血清の１/８希釈で８９.６
％，日本ザルにＭＣＶ−１を接種して得られた抗血清の
１/８希釈で８９.５％であった。図９に示すようにウサ
ギ、日本ザルのいずれの抗血清についても１/５１２希
釈までは約５０％の融合阻止率を維持していた。またＳ
Ｆ２株に対してもウサギの抗血清は、高いレベルの融合
阻止率を示していた。
【００３１】（急性毒性）ＭＣＶ−１を大量に長期間投
与しても、サル、ウサギ、モルモット、マウス等に体重
減少等の副作用は全く認めらず、極めて安全であると考
えられる。
与しても、サル、ウサギ、モルモット、マウス等に体重
減少等の副作用は全く認めらず、極めて安全であると考
えられる。
【００３２】
【発明の効果】以上述べたように、本発明により強力な
液性免疫を強く誘導することが可能である安全なエイズ
ワクチンを提供することができる。また本発明において
は複数株由来のペプチド配列を結合させることにより、
広範な株種のＨＩＶに対して有効な予防および治療効果
が望めるものである。
液性免疫を強く誘導することが可能である安全なエイズ
ワクチンを提供することができる。また本発明において
は複数株由来のペプチド配列を結合させることにより、
広範な株種のＨＩＶに対して有効な予防および治療効果
が望めるものである。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly 1 5 10 15 Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile 20 25 30 Arg Gln Ala His Cyc 35 配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 5 10 15 Thr Thr Gly Glu Ile Ile Gly 20 配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ilg Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala 5 10 15 Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile 20 配列番号：５ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Ile Gly 5 10 15 Pro Gly Arg Ala Phe His Ala Ile Glu Lys Ile Ile Gly Asn Ile 20 25 30 Arg Gln Ala His Cys 35
【図１】 ２２４症例により解析したエイズウイルスの
Ｖ３領域のアミノ酸配列を示す。
Ｖ３領域のアミノ酸配列を示す。
【図２】 ループ状ペプチドの合成方法を示す。
【図３】 コモンコンセンサスＰＮＤペプチドを固相抗
原とする抗体価の変動を示す（●：ＡＧ１（ループ状抗
原）、△：ＡＧ２（線状抗原））。
原とする抗体価の変動を示す（●：ＡＧ１（ループ状抗
原）、△：ＡＧ２（線状抗原））。
【図４】 ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株のＰＮＤペプチドを
固相抗原とする抗体価の変動を示す（●：ＡＧ１（ルー
プ状抗原）、△：ＡＧ２（線状抗原））。
固相抗原とする抗体価の変動を示す（●：ＡＧ１（ルー
プ状抗原）、△：ＡＧ２（線状抗原））。
【図５】 ＣＥＭ細胞にＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株を感染
させ、各免疫血清を投与した場合の融合阻止率を示す
（■：ＡＧ１（ループ状抗原）、□：ＡＧ２（線状抗
原））。
させ、各免疫血清を投与した場合の融合阻止率を示す
（■：ＡＧ１（ループ状抗原）、□：ＡＧ２（線状抗
原））。
【図６】 ＣＥＭ細胞にＨＩＶ−１ ＧＵＮ−１株を感
染させ、各免疫血清を投与した場合の融合阻止率を示す
（■：ＡＧ１（ループ状抗原）、□：ＡＧ２（線状抗
原））。
染させ、各免疫血清を投与した場合の融合阻止率を示す
（■：ＡＧ１（ループ状抗原）、□：ＡＧ２（線状抗
原））。
【図７】 巨大分子の構造を示す。
【図８】 ＭＣＶ−１の抗体価の変動を示す。
【図９】 ＭＣＶ−１のエイズウイルス融合阻止率を示
す。
す。
Claims (6)
- 【請求項１】ＨＩＶエンベロープのｇｐ１２０のＶ３領
域を含有するワクチンであって、分枝リジンオリゴマー
よりなる核体の各分枝に、前記Ｖ３領域ペプチド、およ
び領域を含まないペプチド結合させたことを特徴とする
エイズワクチン。 - 【請求項２】前記Ｖ３領域のペプチドのＮ末端部位に
は、ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピトープのペプチド
あるいはＣＤ４結合領域のペプチドが結合されているこ
とを特徴とする請求項１に記載のエイズワクチン。 - 【請求項３】分枝リジンオリゴマーよりなる核体の分枝
に、ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピトープのペプチド
およびＶ３領域ペプチドの配列からなるペプチド、ある
いはＣＤ４結合領域のペプチドおよびＶ３領域ペプチド
の配列からなるペプチドがＣ末端部位において結合さ
れ、かつ前記ＨＩＶ表面蛋白由来のＴ細胞エピトープの
ペプチドおよびＶ３領域ペプチドの配列からなるペプチ
ド、あるいはＣＤ４結合領域のペプチドおよびＶ３領域
ペプチドの配列からなるペプチドがループを形成してい
ることを特徴とする請求項１乃至２に記載のエイズワク
チン。 - 【請求項４】前記Ｖ３領域のペプチドは複数株由来のも
のを用いることを特徴とする請求項１乃至３に記載のエ
イズワクチン。 - 【請求項５】分枝リジンオリゴマーよりなる核体の分枝
に、ＨＩＶ内部蛋白質ｇａｇ領域のペプチドがＣ末端部
位において結合されている請求項１乃至４に記載のエイ
ズワクチン。 - 【請求項６】複数の分枝リジンオリゴマーよりなる核体
が、各々の核体に結合されたペプチドのＮ末端同士で結
合されていることを特徴とする請求項１乃至５に記載の
エイズワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3883595A JPH08231423A (ja) | 1995-02-27 | 1995-02-27 | エイズワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3883595A JPH08231423A (ja) | 1995-02-27 | 1995-02-27 | エイズワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08231423A true JPH08231423A (ja) | 1996-09-10 |
Family
ID=12536280
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3883595A Pending JPH08231423A (ja) | 1995-02-27 | 1995-02-27 | エイズワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08231423A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016084944A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 国立大学法人 群馬大学 | 熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼタンパク質の部分配列を用いた人工抗原とその製造方法 |
-
1995
- 1995-02-27 JP JP3883595A patent/JPH08231423A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016084944A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 国立大学法人 群馬大学 | 熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼタンパク質の部分配列を用いた人工抗原とその製造方法 |
| US10583184B2 (en) | 2014-11-28 | 2020-03-10 | Shigeyuki Kano | Artificial antigen produced using partial sequence of enolase protein originated from plasmodium falciparum, and method for producing same |
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